TW386878B - Novel glycoforms of soluble complement receptor 1 - Google Patents

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A6 B6 五、發明説明（1 ) 請 先 一閱 讀 背 -之 意 事 項 再 填 寫 本 頁 葙明iff騸 本發明有黼於新穎糖型式之可溶性補體受體第1型 (sCRl)，W及用於診斷及治療涉及補備活性之病症Μ及各 種發炎及免疫病症之用途。本發明亦提供生產，偵測，及 纯化此類耱型之方法。 搿明夕茜昼 辅備枭铱 構成約10炻正常血濟球蛋白，補SS糸統由許多不同蛋白 質姐成•這些蛋白質對於外來抗原的免疫系铳反應方面具 重要性。當補體***的主要成份成為片段時，糸统變活化 •這些片段，單獨或與其他蛋白質一起，活化另外的補體 蛋白質，造成一連串蛋白質溶解。補體***之活化導致血 管通透性增加，呑喵细胞之趨化性，發炎细胞之活化，外 來粒子的調理作用，直接殺死细胞Μ及姐嫌傷害。補體系 统之活化作用可由抗原-抗體複合體（傳统途徑）或例如， 由病原菌细胞壁中存在的脂多糖類（另一種途徑）制發。 繼结合的袖艏等艚箪1 铟 經濟部令央標準局Η工消费合作社印製 補髑受賵第1型（CR1)存在於紅血球，單核血球/巨噬 细胞，顆粒細胞，Β细胞•一些Τ细胞，脾濾泡樹突细胞 ，及小球足细胞之膜上。CR1與補體姐份C3b及C4b结合 *亦稱之為C3b/C4b受體。已知CR1之结構姐嫌及其原始 次序[克利斯坦（Klickstein)等人，1987, J. Exp.

Med. 165:1095-1112，克利斯坦等人，1988， J. Exp. M e d . 1 6 8 : 1 6 9 9 - 1 7 1 7 1 奥卡得（Η 〇 u r c a d e )等人，1 9 8 8，

本紙張尺度適用中圉國家搮準（CNS)T 4规格（210x297公釐I 緵濟郝中央橒準局貝工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（2 ) J. Exp. Med. 168:1255-1270)。它由 30個含 60-70 個胺 基酸，短且一致的重複單位（SCRs)姐成。各SCR中，保留 平均65届胺基酸中之29個。各SCR已透邊雙碕連接（雙疏 鐽中之第三與第一儷·K及第四個與第二僩一半胱胺_> 形成一種三方位的參環構造。CR1進一步安排為4届長的 均霣複單位（LHRs)，各有7個SCRs。前導次序（此前導_ 序於轉譯後去除）後，CR1分子由大多數含有C4b結合匾 域的N-末端LHR-A ，接下來兩個重複單位，含C3b结合區 域的LHR-B及LHR-C ，Μ及大部C-端的LHR-D ，後接2俚 其他的SCRs，一届25殘基的假定的膜區及一個43殘基的细 胞質尾端姐成。 CR1是特點為此種SCR同種性的蛋白質亞目 (superfamily)之一個成員。一些具有C3/C4结合功能的 亞目成員包括CR2 ，C4结合蛋白質，因子Η *因子B ，及 C2，而缺乏此種功能的蛋白質包括介白素-2(interleu-1^11-2)受18，/32-糖蛋白質1，（：1「，肝球蛋白〇(鏈，及 因子XI I lb。 已知CR1為一種糖蛋白，推演其胺基酸次序於细胞外區 域具有25俚供連接糖基化作用（胺基酸一致次為fJXS或 NXT)的可能部位。僅其中6-8届可用部位經報告與寡糖連 接（S i * ,〗9 8 5，Β ί 〇 c h e m . J · 2 3 2 : 8 8 3 )。已於迢尼卡嫌素 (tunicamycin)之存在下產生CR1之非糖基化形式，並顯 示減少與iC3之结合[路布林（Lublin)等人，1986, J. Β ιοί. Chen». 261 : 57 36]糖蛋白宵之N-端顯然被胆斷。 -4 - 本纸張尺度適用中圉國家標準（CNS)甲4規格（210x297公龙> .丨H I..........,.......................................C...........................裝......................訂..............W:線........................... (請先¾讀背面之注意事項再填窝本頁一 ·, A6 B6 五、發明説明（3 ) {請先龙讀背面之注意事項再填寫本頁} 至今’已認證出四種不同的CR1對偁型或倒錯型，其大 小不同，M30-50 kDa增加。人類群中此等倒錯型之基因 頻率不同[霤勒（Holer)等人，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2459-2463]。卩（或 A)倒錯型由 4 倨 LHR 姐 成，分子摄約250 kDa ;較大•的S (或B)倒錯型，分子悬 約290 kDa ，含有一個第5 LHR ，是LHR-B之5,端一半與 LHR-A之3’端一半之雜體（chinera)，預測具有第3個 C 3 b 结合部位[王（y a n g)等人，1 9 8 9 , J . E X p . M e d . 169:847]。最小的F’（或C)倒錯型，最可能來自LHR-B之 缺失及一假C3b结合部位，在患有全身紅斑性狼瘡（SLE) 之患者中盛行率增加[凡德因（Van Dyne)等人，1987, Clin， Exp. Inmuno丨.68:570;代克門（Dykman)等人， 1983, Proc. Katl.Acad. Sci. USA 80：1698) ° 可溶補髑勞腰笛1型 經濟部中央標準局KK工消费合作社印製 已於正常個體及某些SLE俚體中偵测出一種天然發生的 CR1 可溶型（雍（Y〇on)等人，1985, J. iBBunol. 134:3332-3338)。它的特性與紅血球（细胞表面）CR1结構 及功能方面的特性相似。郝卡德（Hourcade)等人* 1988, J. Exp. Hed. 168:1255-1270亦於人類CR1轉錄單位中見 到另一種聚腺嗓呤Ybipolyadenylation)位置，預测會產 生CR1之分泌形式。由此種切短的次序所編碼的nRHA包含 CR1之第一個8.5 SCRs，並編碼一個包括C4b結合區域的 約80 kDa之蛋白質。當對應於此種切短次序的cDH A轉形感 染成COS细胞並表現持，證實C4b结合活性，但不與C3b -5 - i纸張尺度適—用中國國家標準（CNS >甲4规格（210 X297公 經濟部中央楞準局員工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（4 ) 结合[克利許（JUych)等人，1989，FASEB J. 3:A368]?克 利許等人亦於數僩人類细胞条中見到類似於預測的·Ι?ΗΑ， 並認為此種具有C4b结合活性的切短的CU可溶形式可於 人‘類中合成。 亦已經由重組DNA步驟，去除正被表現的DN As穿膜區域 ，產生數種可溶CR1片段[非爾饈（Fearon)等人· Inti. Patent Publ. W0 89/09220, 10/5/89 ;非爾篛等人，

Inti. Patent Publ. WO 91/05047， 4/18/91]。此類可溶 CR1 H段具功能性•结合C3b及/或Cb4 *並依據它們所 包含區域顬露因子I _因子活性。此種構造在活體外抑制 補鵂活化作用之结果•如瞎中性血球氧化性猝發（burst) •補體中介的溶血，及C3a與C5a產生。可溶性構造， sCRI/pBSCRIc，亦於活體外顯露在逆被動亞瑟氏 (Arthus)反應方面之活性[非爾龍（Fearon)，1989* 1911，前文；第（Yeh)等人 * 1991，J. Immunol . 1 46 :250]，壓制缺血後心肌發炎及壤死[非爾龍等人•前 文：魏思曼（Weisnan)等人，Scicene， 1990, 249:146-151]M及移植後增大存活率[布魯特（Pruitt)與百《吉 (Bollinger), 1991，J，Surg. Res 50:350;布魯特等人 ，1991, Transplantation 52; 868]。此外，載體 sCR1/pBSCR1c與對-茴香醯基化的人類雄維蛋白溶梅原-鍵激酶-活性因子複合體（APSAC)共同調配，造成類似單 獨sCRl/pBSCRlc產品的抗溶血活性，顧示補體抑制劑 sCRl與一種血栓溶解劑之姐合是可行的[前述非爾龍等人 -6 - 本纸張尺度適用TW國家標準（CNST甲4规格（210X 2974» ) ...............................................................................裝......................訂..............ί:線 (請先¾讀背面之注意事项再填寫本頁} A6 B6 五、發明説明（5 ) )〇 國際專利案公告號«WO 89/09220, 1989, 10.5公布* Μ及W0 91/05047, 1991, 4, 18日公佈，其全文併人本文 作參考。 發明總論 本發明有閫可溶補艏受禮1蛋白質（sCRl)之新穎可溶糖型 式，及其治療涉及補體活性之病症及各種免疫及發炎病症 的用途。 本發明者已發現，在某些生產條件下，可獲得新穎的 sCRl糖型式，其具有所需延長血中澝除並同時保有具意義 功能性之特性。長的功能半衰期使能行簡化的，一次大量 的投藥，並提供活體內效力。. 本發明者已應用各棰純化法解決並增多特定的sCRl，糖 塑式。因此，本發明提供一種可溶性補體受體】（sCR1)糖 蛋白分子，此種分子含一種或多種複合寡糖構造，其一或 多個構造K平均一或多個唾液酸殘基终止。 一項具體實例提供sCRl糖蛋白之製備，其中分子含—或 多個寡糖構造，至少其中40%寡耱構造含平均至少一届末 端唾液酸殘基。以分子含一或多個寡糖構造•其中至少 70%含平均至少一個末端唾液酸殘基較佳。 經濟部中央櫺準局員工消費合作社印製 —項具艏實例中，sCRl製劑含sCRl糖蛋白分子，其中主 要的糖型式具等雷酤· Pi，少於或等於5. 1(由層析調焦測 定），用神經肢酸梅（neuraminidase)處理後pi增加。 另一項镧實例中，sCRl製劑含一個sCRl糖蛋白，其中唾 -7- 本纸張尺度逯用t S國家搮準（CXS)甲4规格（210父297公釐） (請先谰讀背面之注意事項再填寫本頁} 鳆濟部中夬標準局Μ工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（6 ) 液酸對甘H糖之莫耳比大於或等於0.25。 依撺本發明之sCRl製劑以具有至少25¾去耱基sCRl的功 能性補體抑制活性較佳。 本發明分子或製劑的較佳具體S例中，sCRl糖蛋白之蛋 白質脅架含 L H R - A , L H R - B , L H R - C , L H R - D , S C R 2 9 ，及 SCR30區域達到（並包括）穿膜區域的第一個丙胺酸。 本發明亦有闢含治療有效最sCRl糖蛋白分子（如上述）及 «蕖合用載劑或賦形劑之《藥姐合物。一個具體實例中* «蕖姐合物另含治療有效S的血栓溶解劑。 血栓溶解劑以由下列各物中摆出較佳： <a) 纖維蛋白溶酶原活化因子或其突變蛋白質 f m u t e i η )； <b) 茴香醢化的纖維蛋白溶酶原-_激_ -活化因子裉 合體（APSAC); (c) 單鍵尿激酶（urokinase); <d) 雙鐽尿激海； (e> _ 檄 _ ; <f) 一種具纖維蛋白溶解活性的雜《蛋白質，其含第一 種雙鏈蛋白酶之一鏈，連接於第二個雙鐽蛋白W之 —鐽，該第一或第二蛋白酶至少其中之一具有纖維 蛋白溶解性，使該雜體蛋白具有提供«維蛋白溶解 活性必備的觸媒部位，此部位視情況由可去除的阻 斷基阳斷；及 ® —種活體内受可逆性阻斷的纖維蛋白溶解_ •其中 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210x297公釐） ί請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁} 裝 訂 A6 B6 五、發明説明（7 ) 該酶中嫌維蛋白溶解所必須的催化部位受一届基因 阻醱，此基因可由水解去除*水解速率使得水解的 偽第一因次速率常數其範是“-«秒-1至ίο-3秒( 於等張水溶液中，37*0 * fH7.4)。 本發明亦提供治療由發炎或不逋當補體活化引起的病症 之方法，此法包含將上述治療有效量sCRl«藥姐合物投槩 至需要此種治療的僩體。 亦提供治療血栓狀況之方法•包含將有效量sCRlB藥姐 合物（或如前述包括血栓溶解劑之》藥姐合物較佳）投藥至 需要此種治療的個體。 上述方法中，倕體以人類較佳。 本發明另有闞製備如前述sCRl糖蛋白或sCRl製劑之方法 ，包含： (a) 在其中细胞生長不受營養供應限制Μ及其中宿主细 胞能夠唾液醯基化寡糖鐽的條件下，在培養中的哺 乳類宿主细胞中表現編碼sCRl蛋白質骨架的DNA分 子；及 (b) 自培«物中分離sCRl糖蛋白。 較佳具體實例中，方法進一步包含下個步驟： <〇 自步《(b)所得的物質中分離含唾液酸分子。 經濟部中夬樑準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事项再填寫本頁) 上述方法中*較佳的培養條件包括流動床生物反應器， 中空嫌維生物反應器，滾動瓶培兼或攪拌槽生物反應*** *後兩個***中，具或不具细胞微小載體。 上述細胞培養物之sCRl糖蛋白產物可由親和，大小排除 -9- 本纸張尺度適用中國國家標準（CXS)甲4规格（210X297公*) A6 B6 經濟部中央標準局KK工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) ，饑子交換及/或疏水***互作用層析。増多含唾液酸分 子K由_子交換軟明鏐曆析或使用隈離子-或除雕子交換 樹脂之HP LC達成較佳，收集較酸性鎇份。含唾液酸之分子 亦可由色曆調焦或外源凝集素層析分麯。 哺乳類宿主细胞Μ能夠表現唾液基轉移_ *其程度足以 保證在表琨sCRl耱蛋白中有增多的唾液醯基化之寡糖較佳 。«當之宿主细胞包括CHO系，MDUX B11细胞糸較佳。 錨宜甜宙義. APSAC= 茴香醯基化的嫌維蛋白溶_原-鐽激_ -活 化因子複合體 PI= 等電點 HPLC= 高功效液體色層分析 IH50% = 產生抑制50%溶血的漘度 SRBC= 羊紅血球 EIA= 酵素免疫檢測 w/v= 重量對體積比 v/v= 體積對髖積比 kDa= 千道爾頓 ELISA= 酵素連接的免疫吸附檢測 gu 葡萄糖單位 SDS-PAGE=十二基碕酸納聚丙烯釀胺膠電泳 糖型式= 糖蛋白物種，如本發明之可溶CR1糖蛋白， 特徴為它們的碳水化合物含量，靨析行為， 及/或電荷 -10- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNSi甲4规格（210x297公釐1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 訂 .線 五、發明説明（9 A6 B6 經濟部"央標準局員工消費合作社印製 一種特定的可溶CR1構造，含LHR-A ， LHR-B, LHR-C, LHR-D, SCR29, SCR30區域 多至（且包括）穿膜區域的第一俚丙胺酸殘 基；TP10HD對應於質艚pBSCRlc中CR1字碼 次序[非爾龍（Fearon等人，Int’l. Patent Publication No. WO 89/09220 (1989, 10, 5)]。 由培養於潦動床灌注生物反應器中的细 胞所產生的TP10HD，並如文中所述由合 併磨析法純化 TP10HD-CC之弱陽離子形式，由製備性 HPLC陽離子交換層析分離 TP10HD-CC之強隈離子形式，由製儀性 HPLC陽雕子交換暦析分離 由培養於中空孅維生物反應器中的细胞 所產生之TP10HD，由HPLC陽離子交換層 析纯化（前述非爾龍等人） TP10HD-CXD= 用正-聚葡萄糖 _ U-g lycanase)將 TP10HD-CX脫去糖基 鼸之簡介 圖1是於280 nm處一系列吸收描圖*顯示以不同方式纯 化的TP10HD製劑之分析性HPLC的结果。使用水孔-SCX (Hydropore-SCX) HPLC純化法的一種修飾法證明TP10HD糖 型式之存在。

TP10HD

TP10HD-CC

TP10HD-CCV

TP10HD-CCS

TP10HD-CX -11 本纸張又度適用中國國家標準（CXS; 374規格（210x297公發丨 一請先閱讀背面之注意事項再填窵表頁一 -_ _ A6 B6 五、發明説明（10 A蹰：由親和性層析鈍化的TP 10HD物質•含多種糖型* 主要的糖型式為強隈離子性（即於約125 bM HaC丨溶離）。 B國：由姐合曆析纯化的TP10HD物質含多種糖型；弱限 離子糖型式對強限離子糖型式之比例·範圃自70: 30至 80:20。 C鬮：由HPLC陽離子交換曆析鈍化的TP10HD僅含強隈離 子糖型式。 圈2顯示TP10HD從一 fiS-西法洛斯柱（S-Sepharose column)，用50-2 50 bM NaCl梯度之溶雇廓画。顧示對應 於池1 (Pool 1)與池2 (Pool 2)之尖端。流速為2奄升/ 分鐘。製圈速度為0.25公分/分鐘。敏感度於280 nM處全 計量（full scale)為0.2吸收單位。 圖3顔示自圈2之S-西法洛注溶離的SDS-PAGE明膠型態 。路徑1 :高分子量欏準；路徑5及8 :S-西法洛斯池1 (各為2.4微克）；路徑6與9 :S -西法洛斯池2 (分別為 5 · 0及6.7微克）。 圈4顬示來自TP10HD-CCy(右_)及TP10HD-CCS (左鼷）之 四種寡糖鍵放射電泳画。底下二園顯示神經胺酸_捃理後 之型態。 圈5是顬示來自TPIOHD-CCS(A)及TPIOHD-CCW(B)之寡 鵪鍵大小與相對比例的層析圃。 經濟部中央標準A員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) -- 圖6為來自對TP10HD-CC(上部）及TP10HD-CX(下部）之色 層調焦柱之描圖。 較住县艏酋俐乏註油說明 -12- 本纸張尺度適用中國國家標準（CXS)f 4规格（210x297公釐） 經濟部中央標芈局員工消15·合作社印製 A6 _B6_ 五、發明説明（11) 本發明有翮可溶性補體受體第1型蛋白霣（sCRl)之新類 耱型式及其於診斷或治療涉及補體活性之病症以及各種發 炎及免疫病症。 可溶性補艚受體第1型（SCR1)於此處定義為含所有30個 细胞外SCR領域的人類CR1之可溶型式。 .sCRl及其製備法揭述於願際專利公告案W0 8 9/09 22 0 (1989, 10, 5)及 W0 91/05047 (1991, 4， 18) 。 Μ 將中 國蒼鼠卵巢（CHO) DUX Β1丨细胞培養在流動床灌注生物反 應器中製備sCRl物質較佳（見W0 91/050 47，見前文）。較 i 佳範園中，可使用CH0细胞系DUX B11潛伏質體 pBSCRlc/pTCSgpt, ATCC 登記號碼 CRL 10052。 本發明之sCRl耱型式Μ它們的碳水化合物含量，層析圖 行為及/或電荷為特點。因此，本發明提供： (1) sCRl，含有一個由一或多個唾液酸殘基終止的複 合寡糖； (2) sCRl，具有等鼬點，由層析調焦測得的PIS 5. 1 ，其中經神經胺酸海處理後Pi增加； (3) sCRl製劑，其中至少40%寡糖含有由一或多個唾 液酸殘基终结的複合寡糖； (4) sCRl製劑，Μ含寡糖構造較佳*其中至少70%此 種结構為唾液酸终止的分子； (5) sCRl製劑，其中唾液酸對甘兹糖之莫耳比》 0.25 ;及 (6) 較佳的sCRl糖型式及製劑，具有至少25%非糖基 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁> :Γ._ .裝 .、ΤΓ -13-

本纸張尺度適用中國國家標準（CXS)甲4規格1.210x297公；SM A6 B6 五、發明説明（彳2 ) 化sCRl之官能性抗補體性。 較佳的耱蛋白為含有之寡糖類似於，或等於人類糖蛋白 中天然發生的寡糖。具有此種寡糖之sCRl製劑的儍點包括 投用至人類時成為免疫原的危險較低。 本發明之sCRl糖型式及製劑其特點為其功能性。以具有 任何一種或多種與CR1分子有闞的活性較佳，包括但不限 於： (2) (3) (4) (5) 請 先 背 面 -之 注 意 事 項 再 蜞 寫 本 頁 (1) 结合於單體及/或多體C3b及/或C4b或C4ma ; 預防補備活化的血漿中產生C3a或C5a ; 因子I輔因子活性； 抑制補體誘發的嗜中性血球氧化猝發；及 抑制補體中介的溶血。 IM鑰型忒夕怯着，妹化及Μ多 本發明之sCRl糖型式及製劑可由表現重姐sCRl-編碼 DNA之细胞培養在各種细胞培養條件下產生，培養條件包 括但不限於流動床生物反應器，中空嫌維生物反應器，滾 筒培養或攪拌槽生物反應器糸统，最後兩種系統中，具或 不具有微載劑。 經濟部中夬標準局Μ工消費合作社印製 本發明之sCRl糖型式可由將編碼sCRl或編碼sCRl片段的 DN A表現於哺乳宿主细胞產生。_乳類宿主细胞Μ能表現 功能性唓液基轉移梅較佳，其造成產生含寡糖鍵之sCRl糖 型式，此鐽Μ具一或多個终端唾液酸殘基較佳。依據本發 明之遘當宿主细胞包括CHO糸· MDUX Β丨丨细胞系較佳。 選惲细胞培兼條件Κ達到所需程度的唾液基化作用。影 14- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公 A6 __B6_ 五、發明説明（13 ) 礬唾液基化程度的過程參數包括氧與葡萄糖漘度。细胞密 度，時間，及貯存狀況如溫度，亦影響唾液基化作用。 每個複合寡糖構造含2或多涸唾液酸殘基之sCRl糖型式 具有較長的活體内清除率。因此製劑的清除率可由製劑的 總唾液基化之程度在宽限中善理。碳水化合物含量對血清 (或血漿）清除率的作用與功能活性間之闞係不強，但會極 少最增加活體外功能性。 於此等掊養物中所產生表規的sCRl糖型式可由習用法纯 化，例如，親和，大小去除，離子交換及/或疏水***互 作用醑析（HIC)。可取數種CR1-專一的抗體用於親和性層 析[陳吉林（C h a n g e 1 i a η }等人· 1 9 8 5 , J . I m u η ο 1 . 134: 1851]。 許多母姐嫌可用於製備Η I C柱，最廣泛使用的是瓊腊。 可使用二氧化矽及有楗聚合物。有用的疏水性配位基包括 ，但不限於，約2至約10個碳原子之烷基，如丁基，丙基 ，或辛基；或芳基如苯基。供明膠及柱使用的習用HIC產 品可購用商品名稱為丁基-西法洛斯（butyl-SEPHAROSE® 控濟部中央標準局3工消"合作社印製 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _J__< )，苯基-西法洛斯® (Pheny 卜 SEPHAROSE*®) CL-4B，辛 基-西法洛斯 ^FF (octyl-SEPHAROSE® FF);笨基-西 法洛斯 ®»(Pheny 卜 SEPHAROSE*®) FF [Pharda KLB AB, Uppsala, Sweden);托又皮爾（T0Y0PEARL) 丁基 650M [Fractogel TSK Buty卜650)或 TSK-GEL 苯基-5PW [Tosoh Corporation, Tokyo， Japan ];焼基瓊脂，其 中烷基含 2-10 個碳原子[Miles-Yeda, Rehovot, Israel] -15- 本纸張尺度適用中國國家標準（CXS)甲4規格1210 X 297公釐） 經濟部中央桴準局员工消費合作社印製 A6 ____B6 五、發明説明（14 ) ;及貝克邦（Bakerbond) WP-HI 丙基[J. T. Baker, Phillipsburg, NJ] 0 亦可利用習用化學製備所需之HIC柱。見例如， E r _ e 1 , Z .等、' Β ι o c h e m . B i o p h v s . R e «=； . Cobb. i5_:383 (1972) ; Ulbrich, V.等人，Co 1 1 Γ 7·ρρ h ▲ Che·. Cqubub . 9_: 4566(1964)。特定明膠之選擇可由本 技藝中固有技術之一測定。通常，蛋白質與HIG配位基間 交互作用的強度随烷基配位基鍵長度增加•但具有約4至 約8個碳原子之配位基逋於大部份之分離作用。高鹽濃度 有利蛋白質吸附於HIC柱，但是S際澹度可在某一大範圏 內改變，依據蛋白質性質及所選擇特定HIC配位基而定。 通常，使用鹽濃度為硫酸銨約0.75與約2M間，或NaCl約1 至4M間。 溶離作用，不論是分步或呈梯度形式，可Μ由許多方法 完成：改變鹽濃度，⑸改變溶劑的極性或⑵加清潔劑。 當與其他蛋白質纯化技術併用時K HIC特別有用。 如本技藝中热知，作雕子交換層析，各種陰離子或陽離 子取代基可附著於母姐嫌上Μ形成陰離子或陽離子載體。 陰離子交換取代基包括二乙胺基乙基（DEAE)，四级胺乙基 (QAE)及四級胺（Q)基團。陽離子交換取代基包括羧基甲 基（CM)，磺基乙基（SE)，磺基丙基（SP)，磷酸根（Ρ)及磺 酸根（S)。市售離子交換物質包括：孅維離子交換樹脂如 DR23, DE32， DE52， CM-23. CM-32及 CM-52 (Whatman Ud. Maidstone, Kent, UlO; SEPHADEXr-為基且交連的 ί請先閲讀背面之注意事項再Μ寫本頁} ο. 裝 .訂 線· -1 6 - 本纸張尺度逋用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） A6 B6 五、發明説明（1予 請 先 •閱 讀 背 面 •之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 鼸子交換劑，例如，D E A E - , Q A E - , C Μ -，及 S P - S E P H A D E X 及 DEAE-，Q-, CM-及 S-西法洛斯（SEPHAROSE)®* [Pharmacia AB]; DEAE-及CM-衍生的乙二酵-甲基丙烯 酸共聚物如托又皮爾迪（TOYOPEARL DEAE)-650S及托又皮 爾 CM-650S (Toso Haas Co., Philadelphia, PA)。 大小去除或明膠過濾磨析是依據分子大小分離。較佳的 母姐嫌物質為化學鈍性，堅硬且高度多孔。為作大量處理 ，在建立整體流速上剛度最重要。Μ最近發展的明膠較佳 ，它的剛度增加，例如，西法克爾® (SEPHACR YLe )，勿 撮吉爾® (ULTR0GEL®)，速皮洛斯® (SUPEROSE®)及托又 皮爾（TOYOPEARL) HW 系列母姐嫌（Toso Haas)。 由離子交換软明膠層析或使用陽離子或陰離子交換樹脂 之HPLC使本發明所需之sCRl糖型富含含唾液酸之分子，收 集其中較酸之皤份。用以分離sCRl糖型之母組嫌MS -西法 洛斯（S-Sepha「ose)較佳。S-西法洛斯層析步驟可早早於 總餚蛋白質纯化方法中施用。此時•可自其他糖型式分離 所需的sCRl糖型式*其餘的純化步驟對此耱型式進行。另 外，可於多步驟蛋白質纯化步驟结束後進行另一個S -西法 洛斯纯化步嫌，此步软設計成溶解糖型式，如下文實例V 中所舉例說明的。 經濟部中夬櫺準局負工消費合作社印製 經由外源凝集素層析或色層調焦亦可選擇特定的sCRl糖 型式。 若需要，sCRl糖型式之碳水化合物部份可立即由習用的 破水化合物分析技術分析。因此，例如，如技藝中熟知的 -17- 本纸張尺度適用中國國家標準（CXSi甲4规格（210x297公釐） A6 B6 五、發明説明（ι6 ) 外源凝集素墨點法，顯示低比例的終端甘露糖或其他糖類 如半乳耱。亦可使用無水胼或酵素法Μ及離子交換或大小 棑除廣析或其他本技蕤中巳知之方法自蛋白質中釋出糖， Μ確定由唾液酸終止單-，二-*三-或四觴角狀之寡糖。 在認證糖型式的進一步試驗中，在用神經胺酸_處理以去 除唾液酸的前後，测量Pi。神經胺酸_處理後Pi之增加顳 示糖型式上唾液酸之存在。 C R 1鮪型忒夕製備 本發明sCRl耱型式及製備可用治療或診斷許多補體中介 的或與補鵂有闢的疾病症，包括但不限於列於表1中者。 請 先 一聞 讀 背 * -之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 裝 丄 进及滅鵂之疾病及病症 神铒疠症 多發性硬化 中規 病毒性瞬炎癥侯蔟 削傷性腦受傷 桕金森氏症 术谪省成名餘的袖髂％仆作用之病症 溶血性併發症 極急性同種異體移植排斥 異種移植排斥 於IL-2治療期間介白素-2( interleukin-2)誘發的毒性 18

本紙張尺度適用中國國家標準〖CNS)甲4規格（210X 297公盆J 訂 經濟部令央標準局員工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（) 菥炎病症 自醣免疫疾病之發炎 孔羅病（Chron’s Disease) 成人呼吸壓迫癥侯蔟 熱傷害包括燒傷或凍傷 缺血後苒通沣病況 心肌梗塞 氣球血管造形術 心肺鳙道或眘臓血液透析後之抽唧後（post-pump)癥侯 蔟 蹵缺血 搿悉庙痣成时ιήτ症 龟埒嫌会痣症》S斷免塔病 風湄性心臟病 全身紅斑性狼瘡 SLE腎炎 增生性厣炎 腎小球腎炎 溶血性貧血 爾症肌無力 <請先《讀背面之注意事項再蜞寫本頁一 •裝 •可 ..線 經濟部t央楞準局員工消合作社印製 治療不逋當的補體活化作用或發炎所引起之疾病或病之 方法中，將治療有效量之sCRl糖型式或製劑投藥至霹要此 棰治療之個體。較佳之個體是人。 -19- 本纸張尺度適用中國國家標準（CXS;甲4規格（210X 297公釐） A6 B6 五、發明説明（18) 治療疾病或病症之sCRl糖型式之有效悬劑童範圍為 0.01-100奄克/公斤；M0. 1-10毫克/公斤較佳。 為投槩用* sCRl糖型式及製劑懕調配成適當的»藥或治 療姐合物。此種組合物一般含治療有效量之sCRl糖型式或 製劑及《藥合用賦形劑或載劑如食鹽水，緩街食鹽水，右 旋葡萄糖，或水。組合物亦可含特定安定劑如糖，包括甘 ®糖及甘孩酵，及注射用組合物之局部麻醉劑，包括，例 如，利多卡因（lidocaine)。 經濟部中央標準局ΜΪ工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) .裝 線 為抑制補贈活化，以及同時提供血栓溶解治療*本發明 提供另含治療活性量之血栓溶解劑之組合物。血栓溶解劑 有效最劑最範圍0.01-10毫克/公斤；以〇.1-5毫克/公 斤較佳。較佳之血栓溶解劑包括，但不限於，鏈激酶，人 類姐嫌型纗維蛋白溶酶原活化劑及尿激酶分子與衍生物， Η斷及其輛合物。血栓溶解劑可含一或多鐽*可融合或可 逆地連结至其它物劑，形成雜體分子（ΕΡ-Α-0297882與 ΕΡ 15 537 8)，例如，尿檄_連结至纗維蛋白溶海 (ΕΡ-Α-015 2736)，嫌維蛋白溶解酶連結至水溶性聚合物 (ΕΡ-Α-0 183 50 3)。血栓溶解劑亦可含纖維蛋白溶酶原活化 _之突變蛋白質（mUteinS)(EP-A-02 07 589)。較佳具體實 施例中*血栓溶解劑可含活體中被可逆性阻斷的嫌維蛋白 溶解酶，如美國專利第4,285,935號所揭述。_以對-茴 番醯基-纖維蛋白溶梅原-鍵激酶活化劑複合體最佳，如 美_專利第4,808,405中所揭述，由5«1丨1^1(丨丨《^

Beecham Pharmaceuticals 上市，商名為 EMIMASE[例如， -20- 本纸張尺度適用t國國家標準（CXSlf 4規格（210x297公釐） 經濟部中央桴準扁员工消费合作社印製 A6 __________B6_ 五、發明説明（19 ) 俗名為茴麵！ IS(anistreplase) *亦稱為APSAC ;蒙克 (Monk)等人，1987, Drug 34:25-49]。 抑制補《活化或作合併治療用之較佳治療姐合物，如上 述，含有本發明之新穎sCRl糖型式及製劑，其具備血中清 除時間延長並同時保留明顯的功能活性。此種功能半衮期 的延長，使產生簡化，大量靜注的投藥，並造躭活體內效 力。治療姐合物中較佳的補體活化抑制劑包括上述sCRl糖 型式及製劑，例如： (1) sCRl耱型式，包含由一或多個唾液酸殘基終止之複 合寡耱； (2) 製劑，具有一個等電點· PIS5.1，（由色層調焦測 定），其中Pi對神經胺酸酶之處理敏感； (3) sCRl製劑，包含複合寡耱，其中至少40%寡糖由一 或多個唾液酸殘基終止；或 (4) sCRl製劑，具有唾液酸對甘露糖之莫耳比》0.25。 治療活性的sCRl糖型式及製劑以應包含至少70%唾液酸 終止之分子，且具有至少25%非耱基化sCRl之抗補體活性 較佳。另一種較佳的治療活性補體活化抑制劑應包含與人 類糖蛋白中天然發生的寡糖類似或相同的寡糖。 本發明個別的或合併的治療姐合物，其投藥途徑包括檷 準途徑，例如，靜脈滴注或大最靜注。活性補體阻斷劑及 血栓溶解劑可一起或以任何次序依序投藥。 本發明亦提供治療人類或非人類動物血栓病況（特別是 {請先閲讀背面之注意事項再填寫衣頁) 裝 _訂 :線 -21- 本紙張尺度適用中II國家標準id严4規格（210x297公釐） A6 B6 五、發明説明（20 請 先 讀 背 面 *之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 急性心肌《塞）之方法。此法包含將有效量依據本發明之 sCRl耱塑式或製莆及有效最血栓溶解劑投用至需要此棰治 療之人類或動物。 亦提供使用本發明sCRl糖型式或製劑Μ及血栓溶解劑製 造用於人類或勖物血栓病況之藥物之用途。此方法及用途 可如稍早所述進行（國際専利申謫案W0 91/0 50 47 ，併入 此處作參考）。 本發明另搮供於人類或非人類動物治療成人呼吸壓迫癥 侯蔟（ARDS)之方法。此法包含將有效量依據本發明之 sCRl糖型式或製劑投藥至患者。 本發明亦提供於接受移植之人類或非人類動物延堪槿急 件同種異體移植排斥或異種移植排斥之方法*即投用有效 晕依撺本發明之sCRl糖型式或製劑。 現概栝的揭述本發明，透遇參考下列S例，利用舉例說 明，更能快速了解，但除非另有說明，無意限制本發明。

當俐T TP〗0HD郸割之奋牛及鈍化 由調理遇的組織培養基製得的TP10HD，由親和性層析， HP LC (或非HPLC)陽離子交換層析，以及陽離子交換，疏水 ***互作用及大小排除之姐合純化。 豳捆碘的姐嫌掊着基之來湄 .¾濟部t央橒準局！®工消費合作杜印製 A.中空纖維生物反應器 表琨sCRl基因產物TP10HD (前文所述菲爾龍等人， 1 989，1991)的重組CHO DUX B11细胞利用一種模式 -22- 本纸張尺度適用t國國家標準（CXS)?4規格{210X297公釐.) A6 _____B6_ 五、發明説明（21 ) IV-L，30000道爾頓分子量切斷筒[CeH-Pharn Cell Culture System I, CD Medical, Midical, Miami Lales, FL)接種至迪當生長培養基[例如CH0-1完全培養 基糸统（Vent「ex Laboratories, Inc. Poryland, ME)， 補充有麩胺酸（GIBCO, Grand Island, NY)及卜10%胎兒 牛血濟（HyClone Laboratories, Inc- Logan, ϋΤ)]中之 中空嫌維生物反應器，並依據製造者指示搡作。合成的 TP10HD分泌進入生長培養基中，因為其大分子量，約200 kDa ，留在反應简之细胞成份中。隔1-3天，取出细胞成 份内調理遇的培養基*由離心去除污染的细胞及细胞殘屑 *將澄清的，調理過的培養基綢配入用過即丟的塑膠實驗 器内，保存在2-8 t：直至純化。此棰情況下，調理遇的培 養基含高至500微克/毫升之TP10HD。 B.滾轉瓶细胞培養基 將表現TP10HD之重姐CH0 D丨丨X B11细胞接種至在適當生 長培兼基[例如自Hams F12與DHEM混合物製得之無血清調 S 物（JHR Biosciences, Inc., Denver, PA)，補充有魅 胺酸（GIBC0, Grand Island, NY)及牛血清白蛋白，人類 輸血蛋白及牛胰島素（Pentex-Miles Inc., Kankakee， M濟部中夬橒準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意赛项再場寫本頁} _2_I_._I__ TL，Intergen, Purchase, NY)]中之滾轉瓶內。建立培養 後，約3天，由培養基顔色改變顯示•自粉魟色變成黃色 ，随新鲜培養基添加約10毫克膠原微載體（Ver ax

Corporation, Lebanon, NH) 。W3 天間隔’更換一半培 #蓽（約丨50毫升）。調整遇的培養基遇濾去除细胞及细胞 -23- 本纸張尺度通用中國國家標準（CXSi甲4规格（210X297公釐） Α6 Β6 經濟部中央桴準局W工消t合作社印製 五、發明説明（22 ) 殘盾*將澄清的，調理遇的培養基調配入用過即丟的塑膠 S驗容器內，保存在-70*C直至純化。此種吠況下，調理 過的培餐基含約15微克/毫升TP10HD。 C.流動床灌注生物反應器 表現TP10HD之重姐CHO DUX B11细胞接種至在適當培養 基[例如自Ha«s F12與DMEM混合物製得之無血清調K物 (JHR Biosciences, Inc., Denver, PA)，補充有挺胺酸 (GIBCO, Grand Island, NY)及牛血清白蛋白，人類輸血 蛋白及牛勝島素（Pentex-Miles Inc·, Kankakee, IL, Intergen, Purchase, NY)]中之流動床灌注生物反應器[ ***S200及***S20000, Verax Corporation, Lebanon, NH]內，生物反應器依槭製造者指示揲作。約2天間隔， 自生物反應器收獲貯存槽中取出所收集烴調理過之培«基 ，過《去除細胞及细胞殘屑，通過50 kDa或100 kDa分子 鐶切斷超遇滹 _ (Mill ipore Corp., Bedford, MA)濃縮 至100倍。將此濟的，經調理遇的培養基調配入塑膠瓶 内，保存在 -70或低於此溫，直至鈍化。此種狀況下· 調理遇的培養基含>900微克/毫升TP10HD。 A .親和性層析 中空嫌維維生物反應器所得調理過的培養基接受使用單 株抗鵲UAb)親和樹脂之纯化作用。單株抗體認證出天生 人類CR1之细胞外部份上的表位[張吉林（Changelian) PS 等人· 1 985, .i . T b b u η ο 134 : 1851,王（Wong)等人， -24-

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS;甲4規格（210x297公釐I (請先閲讀背面之注意事項再瑱寫本頁> -VI; •c .裝 訂............線. A6 B6 五、發明説明（23 ) 1985, J. ImBunoI. Methods， 82:303-313]。此 mAb 依據 製造者指示共轤於親和膠-10 (AffUel-10)(BioRad Corporation, Richmond, CA)，產生一種母组嫌*此母组 嫌能夠自含牛血清污染物之調理過的培養基中分離 TP10HD，如先前所述[前文，雍（Yoon)等人]。簡言之， 調理《的培養*與親和母姐孅培養於4Ό，隔夜.，同時溫 和攢涓。此混合物倒至醑析柱內，用10 He He pes, 0.1 M NaC丨pH 7緩衝廣泛清洗，以自母姐嫌去除所有非特定 性结合之物質。用20 bM璘酸納，0.7 M NaCl, pH 12緩 衝液自母組嫌釋出TP10HD，利用一種市售檢测（BioRad Corporation., Richmond, CA)檢査柱想份中蛋白質存在與 否。收集含蛋白質之餾份，於4Ό，對磷酸鹽壤衝食鹽水 (出7.20-7.4)透析。用TP10HD專一的免疫檢測確定製劑 中TP10HD之存在。此步驟產生一種TP10HD製劑，此製劑經 4-20%嫌性梯度SDS-PAGE估計，纯度 >90%。 B .姐合層析 來自滾瓶培養或流動床灌注生物反應器之調理過的培兼 華通遇一系列層析步驟處理。用IN HC1酸化調理遇的培養 箪，出降至5.2-5.5 。酸化期間，培養基變混湖*接著通 校濟祁t夬楞準局员工消合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _-· 過0.45及0.2微米膜遇漶使澄清。酸化且澄清的調理過之 培養基施用於陽離子交換柱，S-西法洛斯（Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ)，此柱用战酸納 * 0.02M ，氛化納，0.06M, pH 5.5緩衝液平衡。施用試樣 後•将縝用起始緩銜液清洗柱直至其吸收性回復基線止。 本纸張尺度逯用中國國家標準（CNS丨甲4規格（210父297公龙| A6 B6 五、發明説明（24 ) 在此種狀況下•所有TP10HD皆结合至樹脂，而大多數來自 姐嫌培養基之污染蛋白霣保持未结合狀通過柱。用磷酸納 • 0.02M ，氯化納，0.05M ，pH 8.0緩衝液將TP10HD自柱 中溶離。含TP10HD貯池之溶雕由280 處吸收測定。 S-西法洛斯溶麯物與硫酸胺混合至終濃度〇.8-0.9 Μ , 並豳用至疏水***互作用柱，丁基-西法洛斯 (Pharmacia Fine Chenicals, Piscataway， HJ)，此柱用 «I酸納’0.1 Μ ，硫酸銨，0.9 Μ， εΗ 7.0鍰銜液平衡。 嫌用試樣後，持績用起始緩銜液清洗柱直至其吸收性回復 至基線止。在此種狀況下，所有ΤΡ10HD糖型式皆结合至樹 脂，而大多數來自姐嫌培養基之污染蛋白質保持未结合狀 通過柱。用磷酸納，0.1 Μ，出7.0緩銜液將TP10HD自柱 中溶離；將溶離緩銜液中之磙酸銨去除後，TP10HD自樹胞 釋出。由280 η·處之吸收監測含池（P〇〇l)的TP10HD之溶維。 經濟部中央標準局εκ工消費合作社印製

(請先閲讀背面之注意事项再場寫本頁J I 丁基-西法洛斯溶離物施用至大小排除柱，西法克爾 S-300 (Sephacryl S-300) (Pharnacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ)，此柱用销酸緩衝食嫌水 [0.01 Μ磷酸納，0.15 Μ氯化納]，fH 7.2-7.4平衡。腌 用試樣後，由吸收監測TP10HD之溶雠。收集恰於柱排除柱 髑稽後溶離之物質，用對TP10HD專一的酵素免疫檢測定纯 化的TP10HD之最。分成整份貯存於- 70T或低於-701。此 方案紊生一種TP10HD製劑，此製劑經4-20%線性梯度 SDS-PAGE估計，纯度>90炻。 mJiL· -26- 本紙張尺度遴用中國國家標準（CXS) f 4規格（210x297公龙） A6 B6 五、發明説明（25 請 先 it 背 面 -之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 表現修飾sCRl DKA並產生稱為TP10HD之sCRl蛋白質之重 姐CHO DUX ΒΠ细胞可於實驗室條件下培養’例如，使用 中空纖維生物反應器或滾轉瓶，或大董培養狀況，例如， 潦動床灌注生物反應器，產生含TP10HD之調理過之組嫌培 養箪。可用數種方法分離分泌出的重組蛋白。特別是親和 醑析，陽離子交相HPLC，或離子交換，疏水***互作用及 大小排除脣析之姐合，Μ產生鈍化的製劑。 窖例11 TP10HD製麵的分子弟黄特株之或證. 於不同條件下產生並由多重步驟鈍化之TP10HD製劑包含 一俩多狀骨架，此多肽骨架，此多肽贵架有不同程度之糖 蓽化。 當由4-20%SDS-PAGE檢査時*由陽離子交換HPLC及由姐 合釅析所分離出之TP10HD製劑（如實例I所述）’產生不同 之分子最。由陽離子交換HPLC製備之物質比由姐合層析製 備之物質其分子最較低，約30 kDa。當各製劑由正-葡聚 辋梅消化時，如製造者所揭述（Genzym Corporation, Boston, ΜΑ;見下列實例6)，分子最減低至一個數值’相 當於多狀鍵貢獻予TP10HD分子之理論分子量，約200 kDa 沒濟部中央標爭局員工消費合作社印製 .结論，- 此结果證實在不同钿胞培養條件下產生且由多種纯化策 略分離的TP10HD分子係由不同程度糖基化之類似多肽鏈組 -27- 本纸張尺度適用中國國家搮準（CXSj甲4规格<210x297公*) A6 B6 五、發明説明（26 ) 成，造成分子最上可見上之差異。此作為第一儷指示：存 在具有不同碳水化合物组成之TP10HD糖型式。

S_SLLLL TP10HD艢型式fe#之其它箝明 HPLC分析顯示，在數種不同條件組之一，包括⑻中空纖維 生物反應器中；（b>含微載體之滾動瓶中；或⑵流動床灌注 生物反應器，調理的细胞培養基所產生，並由賜離子交換 ，疏水***互作用及大小排除層析之組合，或由親和性層 析純化時，TP10HD由糖型混合物姐成。 分析法 由數稱不同方式純化之TP10HD試樣相對磷酸納’ 20 bM ，氛化納，30 mM ，pH 7.0緩衝液透析*通過0.2微米膜 過嫌。一種水孔-SCX(Hydropore-SCX) HPLC柱，10 X 100 毫米 iRainin Istrument Conpany, Eneryville, CA)，用相同的緩衝液平衡，試樣K2毫升/分鐘施用， 柱持績用起始緩衝液清洗直至吸收回復至基線止。緩衝液 中HaCl濃度增加至50 i»M ，呈弱陽鷂子性糖型式之 TP10HD自樹腊中溶離。吸收回復基線後，用線性NaCl梯度 * 50至250 mM溶離高度陽離子性糖型式。結果示於圖1中 〇 經濟部中夬標準局β工消#合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 在此稱施用條件下，所有TP10HD糖型式皆結合於樹脂。 直接通過杵而未被吸附之物質顯示為一種非蛋白質，非-TP 1 0 Η I)之污染物，根據下列準則，最可能是细胞DN A :⑻其 吸收紫外線光譜處之光；（b>在偵測蛋白質之化學檢测中不 -28- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐丨 經濟部中夬楞準局sc工消费合作社印製 A6 ____B6_ 五、發明説明（2?) 具反應性；（〇其與一種使SDS-PAGE上物質成為可見的蛋白 質專一性染點不反應；及（d)於TP10HD -專一性免疫檢測中 不具反應性。 施用後*緩街液中之NaC丨漘度増加至50 ιβΜ ，定為弱賜 離子性之TP10HD分子自樹脂中溶離。所有呈弱陽難子糖型 式溶離之物質在一種特定免疫檢測中認證為TP10HD。最後 •Μ線性方式增加NaCl濃度，將结合較緊密之蛋白質溶離 。在NaCl漘度-125 mM ，定為強陽離子糖型式之TP10HD分 子溶離出（圖1 )。所有圼強陽離子型式溶離之物質在一種 特定免疫檢测中認證為TP10HD。

由親和醑拼妹化TP1 0HD 由親和廣析纯化之TIM0HD物質，當由HPLC陽離子交換步 驟分析時，含多重糖型式。示於圖1A中之吸收軌跡證實主 要的糖型為強陽離子性（即，於約125 »>M NaC丨溶離）。 由組合匾枏妹仆TP10 Ht) 當由HPLC陽離子交換步驟分析時，得自流動床灌注生物 反應器之物質顯示含多重TP10HD糖型式。弱陽離子糖型式 對強陽離子糖型式之比例範圍自70:30至80:20(圖1B)。得 自滾動瓶培養基之物質亦顳示含多種TP10HD糖型式，其弱 陽離子糖型式對強陽離子糖型式之比例為76: 24。

由艫平夺抱蘑析妹化TP10HD 本物質顯示俥含TP10HI)強陽離子型式（鬮1C)。如先前揭 述（闕際專利公告案W089/09220及W091 /05047;魏斯曼 (Weisman) H F 等人，1990。S ς i e n c e 249 : 146 ;葉（Yeh〉 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填冩本頁) '装 .訂 A6 B6 五、發明説明（28 ) CG 等人，1991，J_,__Imauno ) 146:250) ，Μ 本法分離之物 質，證實有活體外及活體内人類SCR1蛋白質之功能特性。 结論 此结果證實可由陽饑子交換層析區分的多重TP10HD型式 存在於得自流動床灌注生物反應器，滾桶瓶培養物以及中 空嫌維生物反應器之調理過培養基中，唯不同來源介質中 不同糖型式之比例明顬不同。

窖例TV 弱及強賜離子件耥型式之純彳h郸割的分鯡 弱及強陽離子性糖型式由HPLC製備。 卞法 在21. 4毫米X 100毫米礒基丙基取代之離子交換樹脂柱 [水孔-S C X (H y d r ο P 〇 r e - S C X ) R a i η ί η I s t r u m e n t Company, Emeryville，CA]上進行製備性HPLC。此柱經 20 inM磷酸納，30 niM NaCl, pH 7.0緩衝液平衡。由上述 姐合曆析纯化的TP 10HD試樣*在使用前對相同鍰衝液透析 。施用試樣後，持續柱的展延，一般是20分鐘’使用相同 緩衝液，K自樹腊清洗非特定性结合之蛋白質。緩衝液改 桷成20 «Μ磷酸納，50 bM NaCl pH 7.0 ，鐵鑛展延，一 .¾濟部中央標準局Η工消1S·合作社印製 <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝 ..線 般再20分鐘，直至所有弱陽離子性糖型自柱中溶離為止。 最後，用一種線性’ 50-250 mM HaCl梯度（20 酸納’ 出7.0)完成展延。一般用~125 «"Μ NaCl將強陽離子糖型式 自柱中溶離。 _ 3 0 _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS丨甲4规格（210x297公釐t 五、發明説明（29 ) A6 B6 經濟部中央橒準局S工消贽合作社印製 结果 —般製劑中*將125奄升試樣（含100毫克TP10HD)施用 至柱。如指示收集對應於弱（TP10HD-CCV)及強（TP10HD-CCS)陽醎子糖型式之鎇份，用TP10HD專一免疫檢测測定 TP10HD之最。结i 分難足量多重TP10HD之糖型式Μ能作活體外及活體內的功 能研究及詳细的生化分析。 窖俐V TP10HD鈍化後由使用S-西法洛斯夕隖艫；夺楢篇栴浓解 TPT QHD 上述HPLC陽離子交換纯化方案將TP10HD之糖型式溶解成 兩個皤份（見，例如，鬭1Β)，一僑尖鋒稱為"尖峰2"(糖 基化較深之物質），為左邊數來第2尖鋒，"尖鋒3”（糖基 化較淺物質），是最右邊的尖鋒。最初方案使用一種 HPLC陽離子交換柱，水孔- SCX (Hydropore-SCX)，購自 Rain in Instrument 。観察一段長時間後見到，層析步驟 之结果變得易變。此不定性歸因於H PLC柱在其使用及貯存 條件下可用期受限制。 本發明人因此尋求另一種純化法溶解sCRl糖型式，此法 較能於一段時間後可恆定的再製。不評估取自各棰其它供 應商之HPLC柱，而選揮S-西法洛斯快速流動樹脂 (S-Sepharose Fast Flow resin)(Pharmacia)作試驗。選 揮此樹脂主要是因S-西法洛斯柱上之官能基與水孔-sex -31 本纸張尺度適用中國國家標準（0沾）肀4規格（210><297公釐） 請 先 -閲 讀 背 面 *之 意 事 項 再 填 寫 本 頁

C 裝 玎 線 .¾濟却中夬橒準局Μ工消费合作社印製 A6 __B6_ 五、發明説明（3〇 ) (Hydropore-SCX)上之官能基相同。此等樹脂間之唯一差 異是於載體母姐嫌上：瓊胞（S-西法洛斯）相對於Μ親水聚 合物暦覆蓋的矽石基填料（SCX)。 用填裝大小為2.5 X 1.8公分之S -西法洛斯’尽及一届 連線丨丨6-6 1^監測器（13<;〇)製備2.5公分空特-弗雷斯 fKontes-Flex)柱0 本研究所試驗之TP10HD物質係使用流動床灌注生物反應 器（Verax System S200 ;見上述）產生，其蛋白質濃度為 5.5奄克/毫升◊由濃縮的調理過的细胞培養基獲得之 TP10HD，在本研究之前，已先接受一条列纯化步驟[見美 阚專利申請案，蓋爾符蘭納-瓦塞門（Gail Folena-Wassernan 等人，”Protei iv Purification”，1992，3, 24歸楢，序號07/857022 *其全文併人此處作參考）° 首先*粗培養基接受S-西法洛斯上之陽離子交換層析， 用20mM磷酸納，500 mMNaCl ，由7.0溶離。溶離的蛋 白質經用碲酸銨析出*再溶解•吸附至一個疏水***互作 用暦析載體上，此載體為一種丁基-托又皮爾（butyl-T0Y0PEARL)柱，此柱經過 0.8 M (NH4)2S〇4 之 100 ibH 磷酸 納溶液平衡。所需之物質用0.7 M (NH4)2S04之100 mM磷 酸納溶液，cH 7.0溶離。溶離物吸附至陰離子交換載體迪 -托又皮爾（DEAE-T0Y0PEARL) *溶離，接受第二次陽離子 交換屏析步躱，此步驟使用托又皮爾（T0Y0PEARL) CM 65 0S作為載體。用5個柱體積線性梯度的0-250 mM “(：丨之50«^>^5/»<£5.“溶液，由5.5溶離，用1/10體 -32- 本纸張尺度逯用t國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公；¢) <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) '裝 .訂 .線 經濟部中夬桴準局3工消费合作社印製 A6 __B6_ 五、發明説明（31 ) 積0.5 Μ二元磷酸納中和。然後托又皮爾CM (TO YOP EARL CM)產物於托又皮爾HW65S (TOYOPEARL HW65S)柱上接受 大小排除層析，此柱先經10 inM磷酸納，0.9 % w/v NaCl，出7平衡。收集所有產物尖鋒，濃縮貯存。現在 TP10HD準備作本研究中之試驗。 使用下列緩衝液作S-西法洛斯分豳：平衡與清洗緩衝液 -20 mM璘酸納，30 mM NaCl，pH 5.2;第2清洗緩衡液及 鋳衡液Α-20 ιπΜ磷酸納* 50 mM NaCl*出 7.0;緩衝液 B - 2 0 m Μ 磷酸納，2 5 0 m Μ N a C 1，由 7.0。 1 · 5毫升纯化的TP 10HD之試樣（8.25毫克蛋白質）施用至 預先平衡成出5.2之S-西法洛斯柱。然後清洗柱直至流出 物得到基線讖值（A28〇)止。此柱然後用2.5底體積之清洗 緩衝液2清洗。施用緩衝液A之線性梯度（1〇底體積）與 緩衝液B (50至250 mM NaC丨）。根撺（JV吸收性收集 TP10HD。各皤份之蛋白質濃度由使用消光係數之A280對等 於10cm-1之1 %溶液E (1 % / 280)測定。 结果 结果示於_2與3中。圖2中所示之小尖鋒，定名為池 1 (Pool 1)，對應於BilB之”尖鋒2” ，代表所施用試樣之 2 %。鬮2中所示之主尖鋒，定名為池2 (ρ〇〇ι 2)，對應 於阃1B之”尖鋒3” ，代表所施用試樣之約89%。 於上述兩揷池（pool)上完成sds page。结果示於圖3中 。常於SDS-P AGE時，池1中之物宵比池2之物質有較大分 子最。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} C: 裝 π -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CN—S)甲4規格（210><297公;^) A6

五、發明説明（32 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} Ε_ϋ_ 根捶上述结果结論出，非HP LC陽離子交換樹脂層析法， 使用S-西法洛斯，是可再生性分離TP10HD主要糖型式豳份 之有用方法，且優於上述HP LC SCX柱法。此純化步软可於 TP10HI)自經調理培養基多步驟純化後完成。另外，多步驟 纯化法中最初的S-西法洛斯步驟可用Μ分離不同糖型式， 且可獨立完成此等辘型式之另外的纯化作用。 啻俐V Τ snm赖型式夕箱動研究 測定不同糖型式製劑之血漿藥動半衰期及/或清除率。 弱陽離子糖型式與強陽離子糖型式比較，前者血半衮期增 加及/或總清除率較低•兩種糖型式皆比經酶去糖基的糖 型式製劑產生明顯較大的血中半衰期及/或較低的缌清除 率〇 材料及方法 A. 研究材料之來源 見上述對各種 TP10HD 製劑（TP10HD-CX, TP10HD-CC, TP10HD-CCW, TP10HD-CCS，及 TP10HD-CXD)作定義之定義 段。試驗材料如實例1中所述純化。 B. 蕖動研究 下表2中列出9種不同之藥動研究。 Μ濟部令央櫺準局負工消費合作社印製 -34- i纸張尺度逋用中國國家標準（cxs;甲4規格丨210X297公変) A6 B6 五、發明説明（33 ) 研究林 物 質 宪 __Ζ. 動物種 1 TP10HD-CX 老鼠 2 TP10HD-CX 兔子 3 TP10HD-CC 豬 4 TP10HD-CC 老鼠 5 TP10HD-CCW 老鼠 6 TP10HD-CCW 兔子 7 ΤΡ10HD-CCS 老鼠 8 TP10HD-CCS 兔子 9 TP10HD-CXD 老鼠 ί請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁} 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 C.研究材料之碘化 研究1，2,4,5,7及9中，由氯肢-T(chloramine-T)步陳 進行碘化作用。將磷酸納緩衝液，0.5 Μ ’出7.6 > 50微 升 * 加至提供的 1 m C i N a - 1 2 5 I ( N e w E n g 1 a n d N u c 1 e a r， Boston, MA)內。加TP10HD試樣，一般是100徴克於 微升（研究5 = 69微克；研究7 = 34微克；研究9 = 91微克）内 ，接著加50微升15毫升新鲜製得之氛胺-T溶液。反應混合 物_列振搖60秒。將偏贰亞硫酸納（50微升，15毫克/毫 升）及碘化納（100微升* 10毫克/毫升）連績滴量至反應 小瓶内。反應涓合物通至PD1.0柱上（Pharmacia Fine -35** 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x 297公釐） A6 B6 經濟亦t央桴準局工消t合作社印製 五、發明説明（34 ) Chenica Is, Piscatovay NJ)，此柱先用含 0. 1 % 牛血濟 白蛋白（Sigma Chemical Co.npany , St. Louis, M0)之 磷酸鹽緩衝食鹽水（pH 7.2-7.4)平衡。收集10個0.5牽升 鏞份，與100微升0.1 %牛血锖蛋白溶液及1毫升20%三 氣乙酸合併後直接計數2微升整份。於0 t：培養1小時後 ，1000 X g離心10分鐘，收集與放射活性有翮的酸可析出 蛋白質，由閃爍計數定量。收集含酸析出物中總放射活性 >90%之餾份作另外之用途。 研究6與8中，由生碘（iodogen)法完成碘化[富類克 (Fraker)等人，1978 ， Biochem Βίophys Res Commun 80:849]; 12ST取代作用之平均程度，研究6為0.56原子 /蛋白質分子，造成特定活性22. 7 kBq/毫克，12SI取代 作用之平均程度*研究8為0.76原子/蛋白質分子，造成 特定活性29.5 kBq/毫克。 D.劑量溶液之製劑 研究1 :放射碘化的TP10HD-CX與未標記的TP10HD-CX 混合物產生適於投用含16-25 X 10e cpm放射標記的 TP10HD-CX之1毫克/公斤總TP10HD劑量之劑量溶液。 研究2 :放射碘化的TP10HD-CX ，，與純化的 TP10HD-CX混合W產生含1毫克/毫升TP10HD-CX於0.1 ><&063,〇.15><»|3(：1，由7.4緩衡液之劑量溶液。 研究3 : TP10HD-CC K成為终劑最1毫克/公斤投用。 研究4 :放射碘化的TP10HD-CC與純化未標記的 TP10HD-CC混合，產生適於投用含-20 X l〇e cpm之1奄 -36~ 本纸張尺度適用中S國家標準！CJiS)甲4規格1210x297公釐.1 (請先閱讀背面之注意事項再蜞寫本頁) Γ. .裝 C: A6 B6 五、發明説明（55 克/公斤或3毫克/公斤的總TP10HD劑鼉之劑量溶液。 研究5 :放射醮化的TP10HD-CCW與纯化未檷記的 TP10HD-CCV混合，產生適於投用-20 X 10e CPB之1毫克 /公斤的總TP10HD劑量之劑量溶液。 研究6與8 :如研究2中所述，但添加放射標記的 TP10HD-CCW至-1 % w/v。 研究7 :放射碘化的TP10HD-CCS與純化未標記的 TP10HD-CCS混合，產生適於投用含~20 X 10e cpn之1罨 克/公斤缌TP10HD劑量之劑鼉溶液。 研究9 :放射碘化的TP10HD-CXD與純化未標記的 TP10HD-CXD混合，產生班於投用含-20 X 10e CPm之1毫 克/公斤總TP10HD劑量之劑量溶液。 E.方案 研究1,4,5,7與9中試驗物質由靜脈注射Uv)進入四隻 司布格-道威（Sprague-Dawley)鼠（2雄，2雌）。於注射 後1, 3, 5,10,20,30,45與60分鐘，自眼眶後靜脈叢採血 樣，测定放射活性。其它的注射後血樣是於注射後2,3,4 小時（研究4 )與120分鐘（研究5 )採樣。保留剌餘的血漿 餱份作進一步之分析。 测最下列事項K分析血漿試樣之殘餘試驗物質： (1) 總殘餘放射活性； (2) 由TC A析出的放射標記物質之百分比； (3) 在SDS之存在下的殘餘的酸可析出物之放射活性 ;及 37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公爱） 請 先 *聞 讀 背 面 •之 注 意 事 項 再 寫 本 頁 裝 可 Μ濟部中央標準局sΗ消费合作社印製 經濟部中央桴箏局Μ工消費合作社印^ A6 B6 五、發明説明（36 ) (4) 於酵素免疫檢測中可如TP10HD免疫認證之物質。 放射同位素數據定最為结!cPm/奄升血液或血漿Μ及理論 上零時間數值之百分比。藥動半衰期從放射度量數搣計算。 研究2中，試驗物質纆iv注射進入兩组各5隻雄性荷 蘭兔（約〗公斤）内，劑量1毫克/奄升。恰於給藥前，及 於5，10，20，45. 60，120 180分鐘時自耳酚脈採血樣， 與肝素混合（終濃度25微克/毫升）。於一個整份中由閃 爍計數測定放射活性，於2000 X g離心5分鐘所得之血漿 貯存於-40 t：。 由活體外功能檢測，人類補體抑制包被羊紅血球 (SRBC)之抗贈溶血作用，Μ分析血漿試樣中殘餘試驗物質 。從殘餘功能活性之/標記值計算藥動半衰期。 研究3中，試驗物質由ίν注射，通過頭靜脈管進入體重 範阐4. 5-6.1公斤之小豬體內。經由預先植入的靜脈管採 血放入含肝素鋰（終澹度為15單位/毫升）之針管内。於零 時間時採輸注前試樣10毫升•於5，10，15，30，45，60 ，120，180 * 240，300，360分鐘及24小時採输注後試樣 。抗凝血血樣於-300 rpm，4 "C，離心5分鐘，將含少量 血板之血漿分成整份，貯存於- 70t：或低於-70 t：。 由上述活體外功能檢测分析血漿試樣中殘餘試驗物質* 使用豬而非人類補體。從殘餘功能活性之標記值計算藥動 半衰期。 研究6與8中•試驗物經iv注射進入一姐5隻荷蘭兔（ -38- 本纸法尺度適用中囷國家.樣準（CN’S) 4規格丨210χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再蜞寫本頁一 Ϊ/. C. 裝 Α6 Β6 五、發明説明（37 ) 約1公斤）内，劑量為1毫克/奄升。恰於給藥前*及於 5 ，1〇，20，45，60，120及180分鐘時自耳動脈採血樣1 毫升，與肝素混合，用三氯乙酸析出後，於一個整份中由 閃鑠計歎測定放射活性。 由一種TP10HD專用的酵素免疫檢测（EIA)分析血樣中殘 餘試驗物質。從放射度量及免疫檢測數撺計算藥動半衰期 〇 F.葡聚糖酶處理 研究9中，由正-聚匍萄糖_消化作用去除H -連结之寡 糖鍵，依據製造者指示完成（Genzyme Corportaion, Biston, ΝΑ)。通常，58 微克 TP10HD-CX 與 l0.5單位正-聚葡萄糖酶於371C，0.2M磷酸納，cH8·6緩衝液中培養 1 8小時。 G .酸析出作用 如下進行三氛乙酸析出作用：依序添加450微升0.13 |^丁「丨5“1，4%505*10%甘油，出6.8之緩衝液，接 著30微升胎兒牛血清及500微升20%三氯乙酸析出血漿 (20微升）。各次添加後*試管刺烈混合，於4 Ό培養72小 時；於1000 X g離心10分鐘收集可析出蛋白質之小九，取 出上濟液並丟粟，由閃爍計數测量殘餘的放射活性。 Η .酵素免疫檢測 .¾濟部中央標準局員工消t合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 /..線 利用一種市售檢測（Cellfree® CD35，T Cell Diagnostics, Icn. Cambridge, ΜΑ)。簡言之，用多株兔 子抗-TP10HD抗體塗裝之聚苯乙烯小珠與稀釋試樣及择菜 -39- 本纸張尺度適用中國國家標準（CXS)甲4規格!210X297公釐） A6 __________B6_ 五、發明說明（38 ) 過氧化酶-共_的多株兔子抗-TP10HD抗體同時培養。培 «後，自反應混合物中移走小株，洗去未特定结合之物質 *接著在存在適當稀釋受質條件下培養。添加硫酸终止顔 色開展，測定吸收性（光密度）作為TP10HD濃度之評量。 I ·溶血檢測

兔子血漿試樣，在甲基胺（12.5 之存在下，於56*C *加熱1小時Μ胺基化碲基酯基因並使内生的補體成份 C 3與C4失去活性。此步软排除試樣中內生性兔補體活性而 未明顯影響TP10HD活性。試樣然後用0.1 Hepes, 0.15 Μ N a C： 1，出7 . 4緩衝液稀釋成1 : 5 0，並檢測。 用兔子抗S R B C抗體（D i a m e d i X，M i a π i，F L )展現之 SRBC，於一個 V -底微滴定小井（Costar，Cambridge, HA) 中，與逋當稀釋度之試驗血漿及一份作為補體來源之稀釋 的人類血漿混合。於37¾，培養1小時後，離心，將未溶 解的紅血球作成小九，將上清液轉送至對應平底微滴定小 并（Costar, Cambridge)內，测量於415 η·處之吸收。試 驗化合物存在下吸收之減少’作為測量抑制補體中介的’ 塗裝SRBC杭體的溶解作用。可以使用已知量TP10HD的標準 曲線校準檢測，故结果可表示為相對於時間留於血獎中之 毫克/毫升TP1 0HD ° 研究3溶血檢測 ®濟部中央桴準局員工消費合作社印製 滴注TP10HD-CC前’自每一"隻猪隻收集血額作為試樣稀 釋物及補鵂來源以供溶血檢测使用。用ο.1 M Hepes ’ 0. 15 M NaCI，由7.4煖衝液稀釋成最小1 :5〇 °為得更大 -40* 本纸張尺度迷用中國國家標準（CNSi甲4规格（210X297公龙） {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} _·_S_____ A6 B6 五、發明説明（39 ) 中。研究1,4,5,7,及9 ，分 CX ， 125I-TP10HD-CC ， 0HD-CCS ，及 。自各老鼠眼眶後靜脈叢收 取雙份100微升試樣計數， 升。來自各時間點之試樣， ，計數，各姐平均，正常化 質之總TCA可析出計數及由 3中，各研究顧示兩期清除 的/S期半衰期。 稀釋度，試樣用滴注前的血獎 液稀釋1:50)，由此保持终血 ，溶血程度等於如上述使用人 方式如上述。可Μ使用已知量 ，故结果可表示為相對於時間 TP10HD °

结A 藥動研究之结果示於表3-7 別於老鼠中潮定12BI-TP10HD-125T-TP10HD-CCW * 12ΒΙ-ΤΡ1 125I-TP10HD-CXD血中清除率 集全血（~300微升）。各時間點 由各姐平均，正常化'成cnp/毫 在SDS之存在下，用TCA沉澱 成cpm/毫升。由125I-標記物 El A測定清除率。结果示於表 横式，短的α期半衰期及較長 稀釋（此血漿已用相同锾銜 漿濃度於1:50。於此稀釋度 類補備之溶血◊其它之處置 TP10HD的標準曲線校準檢测 留於血槳中之微克/奄升 請 先 .閲 讀 背 面 ^之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部中央桴準局工消f合作社印1i 本紙張尺度適用中國國家標準（CXS)甲4規格（210x297公釐） A6 B6 五、發明説明U〇 ) 表_3_ 画朗漕除蛤廓醣 究《 動物種 物質 α期 /9期 (分鐘） (分鐘） 1 老鼠 TP10HD-CX 4.3 167 2 兔子 TP10HD-CX 9-11 3 豬 TP10HD-CC 8.3 360 4 老鼠 TP10HD-CC (1毫克/公斤） 9.2 181.1 (3毫克/公斤） 9.8 267.1 5 老鼠 TP10HD-CCW 12.21 100 6 兔子 TP10HD-CCV 8 216 7 老鼠 TP10HD-CCS 6.64 133 8 兔子 TP10HD-CCS 6 216 9 老鼠 TP10HD-CXD <1 6.1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) * >__ 經濟部中央標準局Μ工消费合作社印製 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CN’Si甲4規格（210x297公釐） A6 B6 力（gff究

五、發明説明（41 ) τριΟΗη-ίτχ於免平φ予 m a_望份 血中半衰期 分鐘 分佈體稹 毫升/公斤 尖鋒（t = o)湄度微克/毫升 總濟除率 奄升/分鐘/公斤 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) TPIOHD-CC^ m §s ^ ^ 中 _ 血中半衰期，α -期 血中半衮期，期 分佈照積 «-期 分佈體積 厶-期 尖鋒（t = 0)濃度 缌清除率 表

毫升/公斤 微克/毫升 毫升/分鏟/公斤 (研究：〇 (8售_物） 8 . 3 363 36 73 29.3 0.24 .裝 .線 經濟部中央標準局员工消¢合作社印製 給藥後24小時採的血樣，得到之tpiqhd-cc濃度與控姐 漘度無法區分。將各豬之數據配成二至三個區格模式，得 到清除率，區格體積，速率常數及半褒期之藥動參數。统 43 本紙張尺度適用中國國家標準（CXS)甲4規格（210父297公梦丨 A6 B6 五、發明説明（42 ) 計分析顯示*對某些豬•三區隔棋式更逋合，而對其它豬 隻，二區格横式較佳；為避免所有豬隻之複雜性數掸，使 用二區格模式處理豬隻。發現平均半衰期在α -期為8.3 小時，而β -期為6小時。此二期分別代表某劑董之69% 與31¾，使約三分之一劑最緩慢清除。 本研究證實TP10HD-CC製劑顯示一種顯著的兩期清除模 式，其中期比α-期慢很多。此等结果符合糖型式群之 差異清除率，有些種類極慢去除。 研究6之结果總结於下表6中。 6 TPlOHD-CCtf於龟；中之血中链物動力（研究ft) 測费_ m位:_ 請 先 讀 背 Q& r之 注 意 事 項 再 蜞 寫 本 血中半衰期 期 分鐘 歿濟部中央櫺準局S工消费合作社印製 %清除的劑最，α-期 血中半衰期，/3-期 分鐘 %清除的劑虽* /3-期 分佈體積 α -期 分佈體積 Θ -期 尖鋒（t = 0)澹度 總清除率 毫升/公斤 奄升/公斤 微克/毫升 .8士 0.5 30.9士 1.5 216.&± 18.8 69. 1 士 1.9 56.2士 1 . 0 22.6 士 1.9 17.8土 0. 3 30 3?6 7〇 毫升/分鐘/公斤 〇 . 26 土 0.02

本紙張尺度適用中國國家標準（CXSfT 4规格（210x297公爱

6 6 A B 五、發明説明（43 ) 由放射度酱分析澜定之TP10HD-CCV之藥動半衮期，（X-期約8分鐘，/9 -期約216分鐘。在快速之α -期期間清 除約30%總削最*在較長之/9 -期期間清除約70%總劑最 。此耩型式之總濟除率為0.26奄升/分鐘/公斤’ /3 -期 之區格賴積為—23奄升/公斤。 研究8之结果總结於下表7中。 {請先閲讀背面之注意事項再堆窝本頁~ m_L TP10Hf)-f：f：S於龟芊> rfn中藹物勒力（研究8) 灌__最 舅位 並射It 數據 置 免疫檢潮 數據 血中半衰期，α -期 分鐘 6.0 土 0.4 10 %清除的劑虽* α - 期 74.5 士 1.4 73 血中半衰期，尽-期 分鎗 216.6 土 36.8 76 %清除的劑最，/9 - 期 25 . 5 士 1 . 5 27 分佈鵂積 毫升/公斤 69 · 8 士 4 . 8 α -期 分佈鶼積 奄升/公斤 162·0 士 13.9 /3 -期 尖鋒（t = 0)濃度 微克/奄升 1 4 . 6 土 1.0 總清除率 毫升/分鐘/公斤〇.85士 0.12 1.24 .裝 .訂 /s\ .線 經濟部中央櫺準局Μ工消費合作社印製 由放射度最分析測定TP10HD-CCS之藥動半衰期’ 《 -期 約6分鎗，/?-期約216分鐘。在快速之α -期期間清除 -45- 本纸法尺度適用中國國家標準<C.VS)<f 4规格（210父297公釐） 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 A6 ______B6____ 五、發明説明（) 約75%總劑最，在較長之；9 -期期間清除約25%缌劑量。 此糖型式之總清除率為0.85毫升/分鐘/公斤，/3 -期之 區格體積為-162毫升/公斤。 研究9中，由放射度最分析測定TP10HD-CXD之藥動半衮 期，α -期約<1分鍺，/3 -期約6.1分鐘。 结i 上述结果證實純化的TP 10HD製劑含清除率不同之糖型式 。此揷差異乃因於糖基化不同之结論符合下列结果： JD 纯化的TP10HD製劑之去糖基作用產生一種平常分 子量分子•證明所有TP10HD製劑之多肽鐽相等； (2) 脫除糖基的TP10HD快速被清除；及 (3) 特徴為因糖基化增加而分子量較大之TP10HD製劑 (例如TP10HD製萷CC與CCW)，證實比特激為因糖 基化較低而分子虽較小之製劑（例如製劑CX與 CCS)血中半衰期較長及/或缌清除率較低。 比較研究6與8结果顯示TP10HD-CCW與TP10HD-CCS製劑 間之主要差異不在特微為兩期清除作用之半衰期，但在鍰 慢被清除物質之比例（在TP10HD-CCW中比例較高）。 如下所示，詳细的碳水化合物分析說明TP10 HD糖型式間 之差異是因於糖基化之程度，寡糖鏈之姐成，末端寡糖碳 水化合物殘基之相同性。 · g 俐 V Τ Τ 蒯宙ΤΡ10ΗΠ名簠插型式之紡端寞埔箱某 -46 - 本纸張尺度適用中國國家標準甲4規格（21〇χ 297公釐） ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} .裝 .訂 .線 A6 B6 五、發明説明{ 45 ) 請 先 -閱 讀 背 ，之 注 意 事 項 再 蜞 % 本 頁 TP10HD耱型式終端寡糖殘基之測定，證實弱陽離子糖型 式之唾液基化程度較高。 方 評估TP10HD製劑之終端碳水化合物構造。各製劑試樣， 1微克，使用市售多-布洛特（Dot-Blot) (Bio-Rad, Richarmond, CA>裝置固定於硝基嫌維素之上。依據製造 者栴示使用市售聚葡萄糖區分套姐（G丨yean Differential Kit，） ’認 證糖 蛋白 上之寡 糖殘基 （B〇eh「inger Mannheim Biocheroicals, Indianapolis, IN)0 此套姐含 五樺洋地黃素-外源凝集素（dig〇x〗genin-lectin)探子： G a 1 a n ti> υ s . η i y a 1 i s.凝集素（GHA) ; Samhucus nigra 凝集 素（SH A ) ; M_aacJii a amurens i s凝集素（MAA);花生凝集素 (P H A)；及 Datura stramonium 凝集素（DSA)。 簡言之，用生洋地黃素-外源凝集素 (cHgoxigenin-lecUn)複合物探測各TP10HD製劑之雙重試 樣；改變外源凝集素，探子之專一性改變成允許偵測多種 碳水化合物殘基。结合後，由酴性磷酸_輛合的羊抗生洋 地黃素Fab'試劑檢澜生洋地黃素表位観察探子；添加受質 後5分銪內發生顏色展開。 结果總结於表8中。 控濟部申央標準局工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐）

表 請 先 閱 讀 背

TP10HD多重糖型式之終端寡糖殘基 LECTIN (LM. SNA ns A HAA 碳水化合物 終端 N e u Ac G a 1 Na u Ac 專一性 Man α (2-6) β (1-4) a (2- Gal G 1 c N A c Gal TPl0HD-CX + - - - TP10HD-CC - - + + TPl0HD-CXD - - - - TP10HD-CCW - - 土 + TP10HD-CCS + - 士 土 镰寫：G a丨， 半乳辘 ；Man ， 甘荛糖；G IcNAc 葡糖胺；NeuA c，5 - N -乙醢基神纆胺糖酸 =唾液 PN A Gal β (1-3 G 1 c Ν a c 意 事 項 再 蜞 寫 本 頁 〇 裝 玎 線 經濟部中央標準局員工消ff合作社印製 TP10HD-CX僅與GNA外源凝集素反應，顯示此製劑產生 終端甘孩糖殘基。TP10HD-CXD，如預期，與所有探子皆未 反應，顯示N-聚葡萄糖酶處理巳去除寡糖鏈。 TP10HD-CCW與MAA強力反應，但與DSA微弱反應，顯示終 端曄液酸rt (2,3 )半乳糖K及半乳糖/3 (1,4 ) N -乙醯基葡 糖胺檐造。TP丨0HD-CCS與GNA強力反應，顯示終端甘荛糖 殘*佔大多数，支持與了？1〇110-(：^#交叉污染之說法。 48- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x 297公;S·) 經濟部中夬標準局Μ工消費合作社印製 A6 ____B6_ 五、發明説明（47 ) 结 1 此等结果證實纯化的TP10HD展現不同寡糖構造，具有弱 陽皤子糖型式，TP10HD-CCW，特激為終端唾液酸殘基及強 陽離子耱型式1 TP10HD-CX及TP10HD-CCS*特微為终端甘 露糖殘基。此等發現支持終端唾液酸殘基之存在造成血中 清除率較慢或终端甘兹糖殘基之存在造成TP10HD與细胞碳 水化合物受照姐合程度較高，導致較快速血漿濟除率。

官例V T T T 蒯宙TP10HD真埔碳水化会物姐成及纒诰 TP10HD之寡糖碳水化合物姐成及構造（如上述實例II中 製備）之測定，顯示，較強陽離子TP10HD糖型式之唾液酸 含最比弱陽雠子糖型式低。快速血漿清除率與寡糖鐽上很 少或無唾液酸Μ及（推斷）萑白質對甘兹糖或半乳耱受體的 接近性有闞。慢速血漿清除與一或多個終端唾液酸殘基有 關。 TP10HD糖型式少璽纊钿成 A .試除物I皙少枣湎 如上述實例I與V中所述分離TP10HD，並溶解成弱陽離 子糖型式，TP10HD-CCW，及強陽離子糖型式* TP10HD-CCS 〇 B ·友皮 使用下列步驟完成分析·- 1 . 試樣（約270-280毫克）對去離子水透析，以去除所 有緩衝液鹽，接著凍乾。 -49 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公茇） ...........<.......................................c..............................................裝......................訂............ί 線 (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) _£_I___________ A6 B6 2 . 3 . 5 · 6 . 8 五、發明説明（48 用無水肼釋出完整的寡糖鐽。 用無水甲酵HC1處理完整寡糖鐽，放出呈〇 -甲基衍 生物之個別單糖。 H -乙醸化任何一級胺基基B。 衍生化得到過-0-三甲基矽烷基甲基糖苷° 由CP-SIL8柱上毛细GLC(氣體-液體層析）分離此等 衍生物。 由GLC的滯留時間及質譜，與已知標準比較，認證 出飼別糖脊。 由FID ，用內在標準（13-0-甲基-D-葡萄糖）定量個 刖衍生物。 (：.结1 兩揷糖型式中各單糖之相對莫耳含量示於下表9中。 請 先 •閱 讀 背 面 *之 意 事 項 再 場 寫 本 頁 經濟部中夬標準局Η工消費合作社印製 50- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格〖210X297公釐） A6 B6 五、發明説明（49 ) 表 兩種TP10HD耱型式中各單糖之相對莫耳含量 單糖 TP10HD-CCS TP10HD-CCW 巖薄糖 1 . 0^ 1.0 半乳糖 3 . 0 3.4 甘霣糖 5.4 4.1 Ν-乙醢基葡萄糖胺 8 . 2 7.5 唾液酸 0.9 1.3 葡萄糖 HD ND Ν-乙醯基半乳耱胺 ND ND 木糖 ND ND »數值以相對於巌薄糖 (=1 . 0)展現。ND =未偵测得。 <請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) ο. .裝 .訂 Μ濟部中央標準工消#合作社印製 D . IB TP1 QHn-rnfch » 為對簞耱姐成中之任何差異定出特性（此差異可能存在 於如前述中空纖維生物反應器中所生之TP10HD (TP10HD-CX)，經分餾的糖型式TP10HD-CCW與TP10HD-CCS，流動床 生物反應器中產生的#經分餾之物質（TP10HD-CC)間]使用 另一揷方法比較多枇次此等物質。 中性及胺基糖由高功效陰離子交換層析合併脈動電流偵 測（ΗΡΑE-PAD Carbohydrate System, Dionex Corp.)测定 〇於100 *n，20%(v/v)三氟乙酸中水解6小時釋出糖。 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210><297公釐1 A6 B6 _ 五、發明説明（5〇 ) 水解物由凍乾或用加速- Vac(Speed-Vac) (Savant Instruments)乾燥。殘餘物溶於1 %乙酸納三水合物溶液 中，並於HPLC-AS6柱上如安幂勒（Anmula)等人分析* iAna丨.Biochem. 195:269-280 (1991))。試樣分析四次 〇 由堯（Yao)等人之直接比色法（Anal Biochem. 179:332-335 U989))，在三份試樣分別测定唾液酸。 结果示於下表10中。

轰_ISL TP10HD各批次及糖型式中各單糖之相對莫耳含最

TP10HD-CX TP10HD-CCS TP10HD-CC TP10HD-CCW (請先閱讀背面之注意事項再蜞寫本頁) ___Γ ^ 批次號

R

V G020 KOQ2 H115 H118 0 甘葡 甘 於之 胺/對中 糖糖糖糖酸酸例 相湳 1薄乳霣萄液液比 Μ檢 SLH半甘葡唾唾 _本 0.7* 0.9 0.5 0.4 0.6 0.7 0.6 0.5 0.9 1.3 1.6 1·9 2.1 2.3 2.2 2.1 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.5 4.1 3.5 3.9 4.3 4·1 4.0 4.0 0.2 0-4 Ό.Ί 1.7 1.6 1.3 1.1 1.6 糖 0.08 0.15 0.24 0·56 0.54 0.42 0.38 0·53 a濟部中央標準局β工消"合作社印製 SSiHSli中所使用之n-z<ie基葡萄糖胺 结 _5§__ TP10HD-CCW與TP10HD-CC糖型式之單糖姐成一般為唾液 本纸張尺度適用中國國家標準（CXS)甲4規格（210X 297公釐） A6 B6 五、發明説明（51 醃终lh的單-，雙-，及三觸角狀複合糖寡糖，此寡糖在接 近N-Ji接的蛋白質取代部位處經巖藻糖基化，並含三甘兹 糖核心。可结論出，糖型TP10HD-CCV物質比糖型TP10HD-CCS含明顯較高的唾液酸比例及/或較低之甘露糖比例。 半乳糖及（N -乙醢基）-半乳糖胺含量之差異可能不明顯。 TP10HD-CX之唾液酸/甘®糖比例顯示此物質（前文，由 菲爾龍等人接述）擬似TP10HD-CCS，而與TP10HD-CCW及 TP10HD-CC不同。後者顯然主要由弱陽離子糖型式姐成， 符合上述數據。 结果顯示，較低的血漿清除率（TP10HD-CCS)與較高唾液 酸含最或唾液酸/甘兹糖比例（>0.25)有關。相對低甘露 糖含最亦反應出此物質有較高程度的分支（即更多的雙-，及三觸角狀構造Γ。

窗俐 TX 自TP10HD糖型式中釋出的寡糖之電荷與大小分佈分析 自各糖型式試樣（0.6牽克），由肼解作用釋出複合寡糖 。用堪原氚化作用加放射標記於寡糖鐽。荷電的寡糖在驗 性條件下接受高電位紙電泳，偵測尖鋒，由氚放射照相定 最。寡糖鍵络Arrhrobacter .ureafajLi£jLS-^f烴胺酸酶處理 M去除唾液酸，重複作電泳。 放射標記的去唾液基（即中性的）寡糖鏈，於BioGel Ρ4 ，400 篩號，2 米 X 15 公分（BioRad Corporation, Richard, C A)上接受大小去除層析，如下述。層析，於水 中.55 Τί進行，流速為〇·2笔升/分鐘。試樣與未標記的 53- 請 先 .閲 讀 背 *之 注 意 事 項 再 壤 寫 本 頁 裝 訂 經濟部中夬棵準局W工消费合作社印製 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210父297公愛』 五、發明説明（52 葡聚糖之部份酸水解物混 型寡糖鐽由一種連線流動 準钼則由一種連線差式折 糖之流艚動力體積Μ顯現 寡糖醛酵之葡萄糖寡合物 spline interpolation) _4比較神經胺酸處理 放射霉泳臟。二例中，神 糖鐽呈中性，顯示負電荷 糖型式TP10HD-CCS，約 具有對應於唾液酸單位之 T P 1 0 Η I) - C C W之寡糖鍵，有 中40-50 %具有對應於二 。儀有約31%來自糖型式 處理前是中性。 由大小輪廊分析偵測的 表11中。 A6 B6 合作為内在標準。 放射同位素監測器 射計偵測。在下列 的葡萄糖單位（gu) 間Μ立方栓内推法 測定數值。 前後 TP10HD-CCW與 經胺酸酶處理使所 完全歸因於唾液酸 64%寡糖鏈最初為 流動性。對於來自 較高比例，69%之 或多個唾液酸單位 TP10HD-CCW之寡糖 放射標記的糖 偵澜，寡糖檷 結果中個別寡 表示*緊鄰於 (cubic TP10HD-CCS之 有經標記的寡 Ο 中性，其餘的 糖型式 酸性寡糖*其 流動性的殘基 鏈在神經胺酸 請 先 •閱 讀 背 Φ *之 意 事 项 再 寫 頁

C 裝 ΤΓ 去糖基糖型式寡糖之大小示於下 經濟部中央桴準局sc工消f合作杜印製 _ 5 4 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CXS;甲4規格（210X297公浼） A6 B6 五、發明説明（53) 11 去唾液基糖型式寡糖鐽之大小輪廓分析 TP 1 OHD-mu 21.0* 17.3 15.0 14.0 12.8 11.5 10.4 9.3 3.0 ' ΤΡΤΟΗΠ-r.rS20.0 17.3 15.0 14.0 12.7 11.6 10.5 9.3 3.0 請 先 *閱 讀 背 面 •之 意 事 项 再 填 寫 本 頁 經濟部中夬橒準局員工消費合作社印製 數倌K葡萄糖單位表示（g 因此，得自耱型式之寡糖大小極類似。但是，如圖5所 示，各棰大小之相對比例不同。TP10HD-CCW比TP10HD-CCS含有較高比例的大小較大的寡糖鐽，尤為區域15 gu 寡糖ϋ，Μ及較低比例之14 gu種類。 结一 雷荷分佈數撺進一步確莩由TP10HD-CCW所證賁高唾液酸 含最與緩慢的血漿清除率間之關連。兩種糖型式（見實例 VT)，其酸性與中性寡糖鍵間之相對比例類Μ自血漿中快 -55- 本纸張尺度逯用中國國家標準（C.\s)甲4规格1.210x297公釐） A6 B6 S濟部中央標準局KK工消费合作社印製

五、發明説明（5砵） 速或鍰慢清除的物質之比例。此支持下列觀點：其中主要 N-連接之寡糖具有一或多個唾液酸殘基之糖型式分子.自 血漿中濟除較慢，而中性寡糖鏈與呈尚未知的機轉之快速 清除有闞。 寡糖鐽大小輪廊單獨無法清晰認證出複合寡糖鏈之準確 構造。但是，姐成及大小數據一起，與含具有可變的唾液 蓽化终端半乳糰及可變的巖薄糖基化之三甘兹糖核心（即 二《角狀）的主要構造符合。其它的可能性包括進一步分 支得到具有三個Gel單位之三觸角狀構造。顯然，大小輪 睇本身無法支持任何與低血漿清除率有關的主要構造類型 Ο 緩慢血漿清除率僅與少數上述類型核心構心構造的唾液 基化程度有鼷。 g例 X 弱暍驢孑袢TPi〇H»«sy式：之DTt~h強腸艫罕埔型式：飪 窜度唾液基化糖型式之Pi低於輕度唾液基化糖型式之 P T ° 醑析調焦是一稗依據等霄點pi分離蛋白質異構型之方法 •使用離子交換柱及不同pH之兩性游子產生之fH梯度.。本 研究中•使用pH梯度7.1至4.0完成TP10HD製劑之分析。 肩析樹脂為 Mono P, Hr5/5 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ);起始緩衝液是 0.025 Μ Bis/Tris，此緩衝液經飽和的亞胺基二乙酸滴定成pH (請先別讀背面yji意事項再填寫本頁} 裝 、盯 .線 _ 5 6 - 本纸張尺度適用中3國家標準（CXSI甲4规格（210><297公釐)~~ A6 B6 Μ濟部中央標準局員工消1Ϊ-合作社印製 五、發明説明（55 ) 7.1 ;溶離麵是多緩銜液7-4 (polybuffer 7-4) (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) ’ 經水稀 釋成1:10 (v/v)，用HC1調整成pH 4.0;清潔緩衝液為2 M NaCl之水溶液。選擇實驗條件以產生一種7.1至4.0單 位之線性梯度。 结果 W6總结本實驗之结果。TP10HD-CX中重要異構型具有 ρΤ約6.0及5.7 ，少最Pi為5.0及Μ下之物質。 下{>1(^|)_(：(：中，1»15.7異構型為小量姐份；主要異構型具 有ΡΪ為5.1及4.8 。整合這些尖鋒’提出，.約40% TP10HD-CC 製劑具有 ρΙ<4.9。因為 TP10HD-CX 中 ρΙ<4·9之 物質數最太小，無法正確估計此製劑中低Pi物質之比例。 發現TP10HD-CX比TP10HD-CC之平均pI較高，與轉譯後 衍得的基團含最低一致。但是，兩種TP10HD製劑間，異構 型方面有一些重*。具低ρΙ(ρΙ<4·9)之TP10HD-CC之百分 比與自豬血漿中慢慢清除之物質之百分比有關（見實例 VT)。結果符合實例VIIJ中所述之發現，具有較高程度終 端曄液酸殘基之糖型式證實其Pi較低。 〆__5LL 各禅TP10HI)糖型式具有可相比的活體外抗溶血功能性· 颳檢測的信任間隔（confidence interval)内*如下列结 果所示。 方法—— -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS}甲4規格（210x297公釐） 請 先 ，閲 讀 背 面 *之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 裝 π 線 經濟部中夬桴準局Μ工消费合作社印製 A6 _B6__ 五、發明説明（56 ) 溶血檢测是根據TP10HD溶液抑制SRBC溶血之能力而定’ fcSRBCM兔子多株抗髑在作為補體來源之人類血清存在下 致敏化•如上述賁例VI所述。 活性Μ檷準檢澍下得到抑制50%溶血之濃度表示’ TP10HD，或TP10HD糖型式產生5 0%抑制作用之濟度 較低，製劑之強度越大。各試樣檢査範圍為7.8至1〇〇〇毫 微克/毫升稀釋度之TP10HD或TP10HD糖型式。 结果 TP10HD-CX證實具有一般之IHs〇，為20 士 7毫微克/毫 升，而TP10HD-CC之此種數值較高•約50±3毫微克/亳 升，支持含明顬量弱陽離子*深度唾液基化的糖型式之製 劑，其效力約低於強陽離糖子型式之2-倍之說法。 TP10HD-CCW具有一般_1}15〇，為44奄微克/毫升，而 TP10HD-CCS具有一般IHs。，為27毫微克/奄升。结果符合 未分皤的TP10HD-CS及TP10HO-CC製劑之數值。去耱基作 用使IH50自TP10HD-CX之80奄微克/毫升降至 TP10HD-CXD之40毫微克/奄升。 结铪 本檢測之檢测内可變性其範圃為15-20 %，故難K解釋 IHs〇值之兩倍差異，而四倍或更大之改變則被認為有意義 。因此本檢測無基礎對TP10HD-CC ，TP10HD-CCW及 TP10HD-CCS其效力不同作出结論。此等糖型式糖基化或唾 液基化增加（顯著增加活體内血漿半衮基）•對於活體外 抑制溶血之作用沒有重大影響。

中固蒼鼠（Chinese hamster)卵巢（CH0)畑胞系DUX -58- 本纸張尺i適用中國國家橒準ICXS)甲4規格（210x297公釐 一請先Μ讀背面I注意事項再填寫本頁一 .裝 、ΤΓ .線 A6 B6 五、發明説明（57) B1I ，擁帶有質體 PBSCRlc/PTCSgpt ，於 1989， 3, 23 由 馬黾蘭（Maryland)，洛克菲爾（RockvilleO之美國種類培 着物收集處[Amer丨can Type Culture Collection (ATCC)]存放，登記號碼為CRL 1 0052。 前述所述之參考文，不論是否有明定併入與否，皆併入 本文作參考。 規已充份揭述本發明，精於本技藝者將會了解，在相等 參數，濃度，及條件下寬廣範圍内可K作出相同物，而不 偏離本發明之精神輿範圖，且無不當之實驗。 雖然已Μ其特定具體實例掲述本發明，應了解它能作進 一步之修飾。本申請案意欲涵蓋一般言遵循發明原璀並包 栝離開本發明揭述之部份，如本發明所包含技藝中β知或 習用之應用，Μ及適用於下文所附申請專利部份的範賴中所 列的前述基本特點的本發明任何變異*用途，或改換。 <請先閱讀背面之注意事项再填窝本頁> .裝 經濟部中夬標準局Μ工消赀合作社印敗

Claims (1)

1. 第82108937號專利申請案 中文申請專利範圍修正本(88年12月） A8 B8 C8 D8 眨圍 眨圍 年月a修正 产以29補充 1 . 一種包含sCRl糖蛋白質分子之組合物，其中該sCRl含有 30個CR1之細胞外短小一致重複部位，而該sCRl糖蛋白 質分子含有一種或多種複合寡糖構造，該一或多種複合 寡糖構造以平均每構造一或多個唾液酸殘基終止，其中 該組合物中所有sCRl糖蛋白質分子形成一種具有唾液酸 對甘露糖之莫耳比大於或等於0.25之sCRl糖蛋白質分子 群。 2 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中於該組合物中 之sCRl糖蛋白質分子形成一種具有唾液酸對甘露糖之莫 耳比大於或等於0.38之sCRl糖蛋白質分子群。 3 .根據申請專利範圍 '第1項之組合物，其中於該组合物中 之sCRl糖蛋白質分子形成一種具有唾液酸對甘露糖之莫 耳比大於或等於0.42之sCRl糖蛋白質分子群。 4 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其中於該組合物中 之sCRl糖蛋白質分子形成一種具有唾液酸對甘露糖之莫 耳比大於或等於0.53之sCRl糖蛋白質分子群。 5 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該组合物存有 經濟部中央標準局肩工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注f項再填寫本頁) 主要之sCRl糖型式，該主要糖型式具有由層析ϊ周焦測量 之等電點低於或等於約5.1。 6 .根據申請專利範圍第1項之組合物’其中該組合物中實 質上所有之sCRl糖蛋白質分子备一或多種複合寡糖構 造，且至少約40%之該寡糖構造以每寡糖構造一或多個 Ο \33\33β5β-1 DOC\en 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 第82108937號專利申請案 中文申請專利範圍修正本(88年12月） A8 B8 C8 D8 眨圍 眨圍 年月a修正 产以29補充 1 . 一種包含sCRl糖蛋白質分子之組合物，其中該sCRl含有 30個CR1之細胞外短小一致重複部位，而該sCRl糖蛋白 質分子含有一種或多種複合寡糖構造，該一或多種複合 寡糖構造以平均每構造一或多個唾液酸殘基終止，其中 該組合物中所有sCRl糖蛋白質分子形成一種具有唾液酸 對甘露糖之莫耳比大於或等於0.25之sCRl糖蛋白質分子 群。 2 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中於該組合物中 之sCRl糖蛋白質分子形成一種具有唾液酸對甘露糖之莫 耳比大於或等於0.38之sCRl糖蛋白質分子群。 3 .根據申請專利範圍 '第1項之組合物，其中於該组合物中 之sCRl糖蛋白質分子形成一種具有唾液酸對甘露糖之莫 耳比大於或等於0.42之sCRl糖蛋白質分子群。 4 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其中於該組合物中 之sCRl糖蛋白質分子形成一種具有唾液酸對甘露糖之莫 耳比大於或等於0.53之sCRl糖蛋白質分子群。 5 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該组合物存有 經濟部中央標準局肩工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注f項再填寫本頁) 主要之sCRl糖型式，該主要糖型式具有由層析ϊ周焦測量 之等電點低於或等於約5.1。 6 .根據申請專利範圍第1項之組合物’其中該組合物中實 質上所有之sCRl糖蛋白質分子备一或多種複合寡糖構 造，且至少約40%之該寡糖構造以每寡糖構造一或多個 Ο \33\33β5β-1 DOC\en 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 申請專利範圍 年月曰 修正補充 A8 B8 C8 D8 33. —種製備根據申請專利範圍第1至9項中任一項之组合物 中之sCRl糖蛋白質之方法，其包含： (a) 在細胞生長不限制營養供應的條件下，培養含質體 pBSCRlc之重组中國倉鼠卵巢細胞DUX Bl 1於流動床 灌注反應器中或中空纖維反應器中；及 (b) 自該培養物中分離該sCRl糖蛋白質。 34. 根據申請專利範圍第33項之方法，其另包含： ⑹自步驟(b)中所得之物質分離含唾液酸之分子。 ---------- (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央樣準局貞工消費合作社印製 6 :\33\33856-l,DOC\en 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 經 央 橾 準 局 % 工 消 费 合 作 社 印 製 '申請專利範圍 唾液酸殘基終止。 7，：據申請專利範圍第1项之组合物，其中該组合物中實 :上::一蛋白質分子含-或多種複合寡2 k，且至少約70%之該寡糖構 構 唾液酸殘基終止。 彳寒糖構造一或多個 8.:據申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物中所 =職蛋白質分-子之至少40%具有由層析調 又♦電點低於或等於.約5卜 1 Λ根據申請專利範圍第Η之組合物，其中該組合物中 有孩㈣糖蛋白質分子之至少7〇%具有由層析調焦測 之等電點低於或等於約5.1 β _ 1〇:根據申請專利範圍第項中任一項之組合物，具有 少25%去糖基SCR1之功能性補體抑制活性。 11. 根據申請專利範圍第項中任一項之組合物，其中… sCRl为子之蛋白質骨架含有sCR1之全部細胞外功能部 位’包括LHR-A，LHR-B，LHR-C, LHR-D，SCR29，SCR30 區域達到且包括穿膜區域之第一個丙胺酸殘基區域。 12. —種用於治療受體發炎或不當補體活化有關疾為或病 之醫藥組合物’其包含治療有效量之根據申請專利範θ 第1至9項中任一項之組合物及醫藥可接受之載劑或賦形 劑。 ： 13.—種用於治療受體成人呼吸壓迫癥候群之醫藥組合物， 所 量 至 該 及 症 圍 本紙铢尺度適用中ββ家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A8 B8 C8 D8 申請專利範囷 其包含治療有效量 < 根據申請專利範衝哲 祀圍第1至9項中任一 項之组合物及醫藥可接受之載劑或騎形劑。 -種用於治療受禮移植排斥之醫藥組;物。，其包含 有效量之根據申請專利範圍第丨至9項 ·、 月τ任一項之组人物 及醫藥可接受之載劑或賦形劑。 ’" 15. 根據申請專利範圍第1 4項之醫藥组人私 ^ σ物，其中移植是一 種同種異體移植或一種異種移植。 16. —種用於治療受體血栓病症之醫藥 頁 采、.且合物，其包含治療 有效量之根據申請專利範圍第1至9項中& _ 焉宁任—項之組合物 及醫樂可接受之載劑或賦形劑。 17. 根據申請專利範调'第16項之醫.藥組合物其中該血栓溶 訂 解劑係由下列組.成之群選出： ^ ⑻纖維蛋白溶酶原活化因子及其突變蛋白質（赠㈣； (b) 茴香醯化的纖維蛋白溶酶原_鏈激酶活化因子複合 體； ° (c) 單鍵尿激酶（urokinase); (d) 雙鏈尿激酶； 經濟部中央榡準局貝工消費合作社印簟 (e) 鏈激酶； ⑴一種具纖維蛋白溶解活性之雜體蛋白質，此蛋白質含 第一個雙鏈蛋白酶之-鏈，連接於第二個雙鍵蛋白^ 之鏈至少一個之具有纖維·蛋白溶解活性之該第〜 或第二個蛋白酶，使得該雜體蛋白質具有一個纖維蛋

   本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公痊） A、申請專利範固 白溶解活性所必需之催化部位’此部位視情況由可去 除之阻斷基所阻斷；及 ⑻一種活體内可逆性阻斷之纖維蛋白溶解酶，其中該酶 中纖維蛋白溶解活性所必需的催化部位由一個基困阻 斷’此基困可水解去除，水解速度使得在等張水性溶 液中，pH 7_4，37。(：時水解的偽第一因次速速常數乂 pseud〇 first order rate constant)範圍為 10-6 秒-丨至 1〇-3秒-1。 18· —種用於治療受體與.發炎或不當補體活化有關之疾病或 病症之醫藥组合物，包括治療有效量之根據申請專利範 圍第I至9項中任一項之組合物，治療有效量之血栓溶解 劑’及醫藥可接受之載劑或賦形劑& 19二一種用於治療受體成人呼吸壓迫癥候群之醫藥組合物， 包括治療有效量之根據申請專利範圍第1至9項任一項之 組合物，治療有效量之血栓溶解劑，及醫藥可接受之載 劑或賦形劑。 經濟部t央標牟局WK；工消費合作社印製 20. —種用於治療受體移植排斥之醫藥組合物，包括治療有 效量之根據申請專利範圍第丨至9項任一項之組合物，治 療有效量之血栓溶解劑’及醫藥可接受之載劑或滅形 劑。 · 21 根據申請專利範圍第20項之醫藥组合物，其中移植是— 種同種異體移植或一、種異種移植 22.根據申請專利範圍第1至9項中任一項之組合物，係用於

   經濟部中央棣率局貝工消費合作社印«. A8 B8 s___ g8g 、申請專唧範圍 冶療受體發炎或不當補體活化有關之疾病或病症、成人 呼吸壓迫癥候群、血栓症狀或移植排斥。 .根據申請專利範圍第12項之醫藥組合物，其中該個體為 人類。 24·根據申請專利範圍第13項之醫藥組合物，其中該個體為 人類》 25. 根據申請專利範圍第14項之醫藥組合物，其中該個體為 人類。 26. 根據申請專利範圍第15項之醫藥組合物，其中該個體為 人類。 27_根據申請專利範圍、第16項之醫.藥組合物，其中該個體為 人類。 28. 根據申請專利範圍第17項之醫藥組合物，其中該個體為 人類。 29. 根據申請專利範圍第18項之醫藥组合物，其中該個體為 人類。 30. 根據申請專利範圍第19項之醫藥組合物，其中該個體為 人類。 31. 根據申請專利範圍第20項之醫藥組合物，其中該個體為 人類。 % 32. 根據申請專利範圍第22之醫藥組·合物，其中該個體為人 類》 、 ——_ 5 — 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) M規格（2ΐ〇χ297公釐） ---------- (請先«讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 訂 申請專利範圍 年月曰 修正補充 A8 B8 C8 D8 33. —種製備根據申請專利範圍第1至9項中任一項之组合物 中之sCRl糖蛋白質之方法，其包含： (a) 在細胞生長不限制營養供應的條件下，培養含質體 pBSCRlc之重组中國倉鼠卵巢細胞DUX Bl 1於流動床 灌注反應器中或中空纖維反應器中；及 (b) 自該培養物中分離該sCRl糖蛋白質。 34. 根據申請專利範圍第33項之方法，其另包含： ⑹自步驟(b)中所得之物質分離含唾液酸之分子。 ---------- (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央樣準局貞工消費合作社印製 6 :\33\33856-l,DOC\en 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐）