TW323284B - - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 c —οI===ρIΗ ο==

OCH3 -°l=pIH 0= CN IOIPIH 0= 或 323284 五、發明説明（) 本發明有關一個製備天然或合成之核苷、核苷相似體 或寡核苷酸之方法（用至少兩個相同或相異之此種核苷單 體）。 序列已定之許多核苷酸現在都是利用亞磷酸三酯製程 來合成。在本方法中，-1個寡核苷酸之合成是由其3'端開 始逐步進行至5'之方向。合成之第一步是將^端之核苷酸 (其在5'羥基和（如有必要之話）在其核苷鹼基上帶有一 個保護基）鍵結到一個化學惰性之固相上。在5’之羥基上 之保護基隨後被除去。接著將其與一個有適當保護之核苷 之3'-胺基磷酸酯反應產生一內核苷酸鍵結，即所形成之亞 磷酸三酯其後被氧化成所要之核苷酸間之鍵。下一個合成 循環是開始於去除囿定在固相上之二核苷酸之5’-端保護 基。重覆此合成循環直到寡核苷酸鍵結到固相爲止。合成 之最後步驟是除去在核苷鹼基、羥基和核苷酸間鍵上之保 護基(Camthers，M.H·，Science 230: 281 - 285, 1985)。依據所使用之胺 基磷酸酯種類，典型上，合成時所使用之核苷或寡核苷酸 應含有如下列化學式之基 這個合成方法所遭遇到之問題是在胺基磷酸酯與固定 在固相上之核苷或寡核苷酸之自由羥基間之縮合反應。在 二^這個反應步驟中，#須不容許水份之存在。然而即使是使 用絕對溶劑亦無法完全保證不含任何水份。由於溶劑中之 水份無法完全去除，因此在固相寡核苷酸合成之耦合步驟 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2Ι0Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝· 訂 線- 經濟部中央標準局員工消费合作社印掣 S23284 A7 B7 五、發明説明（） 中大量核苷胺基磷酸酯被轉化成核苷胺基磷酸酯水解產 物，例如核苷氰乙基膦酸氫酯。然而上面最後提及之這個 化合物並不參與耦合反應。雖然如此，爲了得到高耦合產 率，仍然必須使用大過量之胺基磷酸酯。在現代之DNA合 成器中，相對於固定在固相上之羥基化合物使用量，要使 用高到2到20倍過量之核苷胺基磷酸酯。反應後，核苷酸間 之鍵結最大產率爲所使用之胺基磷酸酯之20%。最少有8〇% 之核苷會以核苷胺基磷酸酯水解產物之型態被丟棄。這個 問題並不能經由改良所用之設備而完全獲得解決，例如使 用特殊之計量裝置（參照 Chemische Rundschau Nr. 37, Seite 11 (1992))。 柏令格（Bohringei:，M.P.，doctoral thesis of the Eidgenossische Technische Hochschule，ETH No. 9377, 1"1)將一個核苷相似體之甲 基胺基磷酸酯水解產物與氫氧化鈉溶液反應，得到包含一 個自由羥基之核苷相似體。然而，在他所使用之反應條件 下，核苷鹼基上之保護基會被除去。 由 Predvoditelev 等人（Predvoditelev，D.A·，Tyrganova^ M.A.， Nifant'ev, E.E., Rogovin, Z.A., Zh. Prikl. Khim. 40: 171 - 177, 1967) > Nifiit'ev 等人{^5^丫，£丑，？比(1¥〇(1如16丫，0人，？1^^11(1〇，1.\^，乙11.05811· Khim. 51: 2435 - 2441，1981)，Troev 和 Simeonov (Troev，K·，Simeo-nov， M.，Phosphorusand SulfUr 19: 363 367, 1984)和 Westheimer 等人 (Westheimei, F.H., Huang, S., Covitz, F., J. Am. Chem. Soc. 110: 181 - 185, I988)所提出有關於非核苷酸二烷基亞磷酸酯之轉酯化反應 中都有一個共同缺點，即當應用於受保護之核苷時，核鹼 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 17 n J I— m」1 I m 1 - = —1 I I I n n l 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印^ S232S4 A7 _____B7____ 五、發明説明（） 基之保護基會輕易地被除去。在這些方法中，因爲熱分解 反應之緣故（例如保護基之熱去除，特別是去三苯甲基 化），反應中所需之高溫妨礙這些方法廣泛應用。 另外一個方法是用四苯甲氧基鈦之路易士酸催化轉酯 化，這個反應在40°C下進行72小時後，可得到中等產率， 而鈦酸鹽水解之敏感度是其特別之缺點(Frcmeman，M.，Modfo, T.A.，Synthesis 201 - 204, 1991)。 令人驚訝之是，本發明提供一個方法可將核苷膦酸氫 酯或核苷亞膦酸氫酯轉化成帶有一個自由羥基之核苷，而 所形成之自由羥基曾帶有膦酸氫根或亞膦酸氫根官能。在 本發明之方法中，膦酸氫根或亞膦酸氫根官能以選擇性高 於其中醯基保護基選擇性地轉移到一個醇上。在所給予之 反應條件下，即使經過了許多天，這種去除之選擇性依然 很高使得核苷鹼基之保護基不會被去除。更進一步說，這 個方法可以得到高產率。本新穎方法將可在第一次就回收 過量之核苷（產生於人工或自動化寡核苷酸耦合反應）。 本發明特別提供一種製備天然或合成之核苷、核苷相 似體或寡核苷酸之方法，該方法係由至少兩個這樣的核苷 及/或核苷相似體，其在鹼性分子含有一未被取代或已取 代之核鹼基B自由基及一化學式爲RrO-之被保護羥基（¾ 中之心爲保護基），或其直接鍵結到一羥基之氧原子上或 經由一連接菡鍵結到一固相撐體上，由核苷單體或由在鹼 性分子上，除了上述自由蕋外，還附加一式I、la或lb 木紙怅尺度適川中丨MU?:冬（（:NS ) A4IU4 ( 2ΐοκ2^公兑） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 -6 - 經濟部中央標準局貝工消於合作社印製 32^284 A7 B7 五、發明説明（）

I I I 〇 〇 〇 0=4—〇-CH2CH2-CN (I) , 0=P—0CH3 (la)或 0=y—CH3 ⑽ Η Η Η 基之寡核苷酸，使該核苷或寡核苷酸與一過量之脂醇 '環 脂醇 '芳脂醇或含1-3〇個碳原子之芳醇、含2-5〇個碳原子 之多元醇或聚合多元醇，在有或無惰性溶劑存在下，在至 少一催化量之無機鹼或有機氮鹼（該鹼之ΡΚ値爲4-1〇者） 存在下反應，將式I、la或lb之基轉化成羥基-0Η而製備。 化學式I、la或lb之官能基可以接在核苷或寡核苷酸之 %或5’啦置，而Κ〇-官能基或固相撐體被接在5’_或位置。 化學式I之官能基較適合接在5^位置，化學式lb之官能基較 適合接在3HS置，而化學式la之官能基則接在3’-或5’啦置。 用於連接核苷酸鍵結並且適用於本發明方法之大多數 較適合帶有一個第二〇H基之核苷、核苷相似體或寡核苷酸 已經知道並且被詳細描述，例如參考Townsend之文獻 (Townsend, L.B., Hrsg., Chemistry of Nucleosides and Nucleotides 1, Plenum

Press, New York, 1988)或其可由已知之方法製備而得。一般而 言，它們可以是一個被或打斷之開鏈C結構或一個環 烴或一個具有一個核鹼基B之〇-或S-雜環結構。 '典型上，開鏈碳結構可能含有3到12個碳原子，而較適 合是含有3到6個碳原子。環烴或雜環結構可以是含有3到I2 (較適合者爲3到8，而最適合爲4或5)個碳原子之單環 系。它們也可以是含有5到I6 (較適合爲8到I6)個碳原子 之雙環或三環系。這些結構可進一步包含取代避，典型上 爲被保護之〇H越。 I- - - - Γ— - - 1 · 1 - » .1 .1 1 ^ I— I: I nf I m τ» (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙ίϋ尺度適用屮國阀家壮枣（CNS ) Λ4现格（210X297公;) 3^ό284 A7 B7 五、發明説明（） 若核鹼基B是一個嘌呤殘基或其相似體，則它可能是 一個如化學式11、Ha、Hb、lie、lid或lie之自由基

R7 N N R9

(Ila) (lie) (He) t I HJ n^— I- I 1— ) mi ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 其中117是11、Cl、Br、1^2或011，而R*、仏和111()是各自獨立 之 Η、OH、SH、NH2、NHNH2、ΝΗΟΗ、含 1至 12 個碳原子之 ΝΗΟ-院基、F、Cl、Br、烷基或羥烷基或胺烷基或含1至12個 碳原子之烷硫基，其中羥基和胺基可不被取代或被一個保 護基或苯基、苯甲基、含1至20個碳原子之第一胺基或含2 至30個碳原子之第二胺基所取代，而R„是Η或CrC4院基。 較適宜之第一胺基包含1至12個碳原子，而最適宜者包 含1至6個碳原子，較適宜之第二胺基包含2至12個碳原 子，而最適宜者包含2至6個碳原子。 烷基、烷氧基、烷硫基、羥烷基和胺烷基（較適宜之 碳原子數爲1至6個）中具有代表性者例如爲甲基、乙基和 丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基 '癸基、十 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 線- 經濟部中央標準局員工消费合作社印策 S232S4 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 一基和十二基等之異構物，和相當之烷氧基、烷硫基、羥 烷基和胺烷基。烷基、烷氧基、烷硫基'羥烷基和胺烷基 最適宜者爲包含1至4個碳原子。較適宜之烷基、烷氧基、 烷硫基、羥烷基和胺烷基爲甲基、乙基、正-及異丙基、正_、 異-及第三丁基、甲氧基、乙氧基、甲硫基和乙硫基 '胺甲 基、胺乙基、羥甲基和羥乙基。 第一胺基和第二胺基典型上，可以是如化學式 之自由基，其中Rm是Η或具有如R15之意義，但不相干，而 R15是烷基、胺烷基或羥烷基（含有1至2〇,較適宜者爲1至 12,最適宜者爲1至6個碳原子）；羧烷基或碳烷氧烷基、 含有2至8個碳原子之碳烷氧基且其烷基部份含有1至6,較 適宜者爲1至4個碳原子；烯基含有2至20,較適宜者爲2至 12,而最適宜者爲2至6個碳原子；苯基、單或二-(CrC4院基 苯基或CrC4院氧基）苯基、苯甲基、單或二-(Q-Q院基苯甲 基或CrC4烷氧基）苯甲基；或1，2-、1，3-或1，4-咪唑基-CrC6烷 基，或Rh及R15合在一起爲四或五亞甲基、3-氧雜-1,5-亞戊 基、-CH2-NR16-CH2CH2-或-CH2CH2-NR16-CH2CH2-，其中 Rlel 是 Η 或

CrC4院基。胺烷基中之胺基可以被一個或兩個CrC4烷基或 CrC4羥烷基所取代。羥烷基中之羥基可以與CVQ院基反應而 被醚化。 在前面已例舉了烷基之實例。有代表性之胺烷基實例 爲胺甲基、胺乙基、1-胺丙-2-基或基、1-胺-丁-2-基或-3-基 或-4-基、N-甲基-或N，N-二甲基-或N-乙基•或N，N-二乙基或N-2-經乙基-或N，N-Z>2-羥乙基胺甲基或-胺乙基或-胺丙基或胺 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1.17 — - is Η - - I - —w I i^i t I n 0— I - I..... i^i L: (請先閱讀背面之注意事項再填寫本 -9- 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 A7 __ B7___ 五、發明説明（） 丁基。羥烷基之實例爲羥甲基、1-羥-乙_2_基、1-羥-丙-2-或_3_ 基、1-羥-丁-2-基、-3-基或-4-基。羧烷基之實例爲羧甲基、羧 乙基、羧丙基和羧丁基；而碳烷氧烷基之實例爲該碳烷氧 烷基，其與甲基或乙基反應而被酯化。烯基典型上爲烯丙 基、丁-1-烯-3-基或-4-基、戊-3-或-4-烯-1-基或-2-基、己_3_或-4-或-5-稀-1-基或-2-基。烷苯基、烷氧苯基和烷苯甲基典型實例 爲甲苯基、二甲苯基、乙苯基、二乙苯基、甲苯甲基、二 甲苯甲基、乙苯甲基、二乙苯甲基、甲氧苯基、二甲氧苯 基、乙氧苯基、二乙氧苯基、甲氧苯甲基、二甲氧苯甲 基、乙氧苯甲基、二乙氧苯甲基。咪唑烷基（其中之烷基 部份較適宜含有2至4個碳原子者）典型上爲1，2-、1,3-或I，4-咪唑-乙基或-正丙基或-正丁基。〜較適宜爲H、甲基或乙 基。 第一胺基和第二胺基較適宜之例子爲甲胺基、乙胺 基、二甲胺基、二乙胺基、烯丙胺基、單或二-(1-羥烯-2-基) 胺基、苯胺基和苯甲胺基、乙醯胺基和苯甲酿胺基。 在本發明之較適宜之具體實施例中，心是氫。本發明 在另外較適宜之具體實施例中，是氫。本發明在更適宜 之具體實施例中，R8和心是互不相干之H、F、C1、BΓ、 OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲胺基、二甲胺基、苯甲醯 胺基、甲氧基、乙氧基和甲硫基。 嘌呤系列之相似體之代表實例，除了嘌呤以外，還有 腺嘌呤、N-甲基腺嘌呤、N-苯甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、 2-甲硫基腺嘌呤、2-胺基腺嘌呤、3-碳基腺嘌呤、7-碳基腺嘌 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠）

In <|^1 n (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 .線 -10- 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 B2^284 A7 B7 五、發明説明（） 呤、卜碳基腺嘌呤、6-羥基嘌呤、2-胺基-6-氯嘌呤、2_胺基-6-甲硫基嘌呤、2-胺基-6_羥基嘌呤、3_碳基-6-氯嘌呤、鳥嘌 呤、2-甲基鳥嘌呤。其中，腺嘌呤、2_胺基腺嘌呤和鳥嘌呤 是特別適宜者。 若核鹼基是一個嘧啶自由基相似體，則該自由基較適 宜是一個如化學式ΙΠ、Ilia和Illb之尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧 陡，

其中，R„是Η或CVC4院基，R12、R13和R3()爲各自獨立和前面 已提過之R8有相同之意義（包括較適宜之意義），化學式 Illb中之NH2基上之氫原子可以被CVQ烷基或苯甲醯基及化 學式III、Ilia和Illb之自由基之二氫衍生物所取代。較適宜之 R12是H、CVC6烷基或羥烷基' F' Cl、Br、NH2、苯甲醯胺 基、單或二-CrC6院胺基，而R13較適宜是H、CVQ烷基或CrC6 烷氧基或&-(：6經烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲醯胺基、單或 二《6院胺基。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

I IV— In adr 1^1 In n mJI 訂 線· -11 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（）

Ru較適宜是Η或甲基。R12較適宜是11、？、<：卜：61：、 NH2、NHCH3、N(CH3)2 或 CrC4烷基。R13 較適宜是 Η、（：「(：4烷 基，特別是甲基、或NH2、NHCH3或(CH3)2N。 嘧啶相似體之代表實例爲尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧 啶、5_氟尿嘧啶、氯尿嘧啶、5·溴嘧啶、二氫尿嘧啶、假 尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。 在本發明之範圍內，保護基之定義和化學上常見之保 護基之定義一樣。此種保護基之典型例子爲CrC8烷基；單 或二環(：7-(：12芳烷基；單或二環C7-C12芳烷氧基；單或二環C7-C12鹵芳烷基；二苯基甲基；被1至4個甲基或甲氧基所取代 之二苯基甲基；三苯基甲基；被1至6個甲基或甲氧基或1 至3個第三丁基所取代之三苯基甲基；被苯基或萘基所取代 之汕基；-Si^X^Xig，其中队）、（R5)和阢)是互不相干之CV C20院基、苯甲基或苯基；R_C(0)-，其中R是C「C6院基、苯甲 基、被甲基、甲氧基或鹵素所取代之苯甲基，CrC12烷氧 基、被苐基所取代之CrC12烷氧基、苯氧基、被甲基、甲氧 基或鹵素所取代之苯氧基；苯甲氧基或被甲基、甲氧基或 鹵素所取代之苯甲氧基；R17-S02-，其中R17是CrC12烷基、C5-Q環烷基、苯基、被Q-Cu烷基或鹵素所取代之苯基、苯甲 基或被^-(^烷基或鹵素所取代之苯甲基；CH：12烷氧乙醯基 或苯氧乙醯基（未被取代或可被一個或超過一個之相同或 不同之官能基所取代者，這些官能基係由包括直鏈或有支 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 丨_.---,----L丨裝——；——„——訂-----丨線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -12- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 — - - --- -·— 五、發明説明（) 鍵之CrC6院基、CrC6齒院基、鹵素、CrC6院氧基、CrC6院硫 基、硝基和氰基之一組中選出者）。 Q-C8烷基典型實例爲甲基、乙基、正-和異丙基、正-、 異-和第三丁基；單環C7-C12#烷基典型上爲苯甲基、甲苯甲 基、二甲苯甲基；單或二環C7-C12芳烷氧基典型上爲甲氧苯 甲基、二甲氧苯甲基；單或二環C7-C12鹵烷基之實例爲溴苯 甲基；被取代之二苯基甲基典型上爲二（甲苯基）甲基、二 (二甲苯基)甲基、二（甲氧苯基）甲基和二(二甲氧苯基)甲基； 被取代之三苯基甲基典型上爲三（甲苯基）甲基、三（二甲苯 基）甲基、三（甲氧苯基）甲基、三(二甲氧苯基)甲基、單甲氧 三苯甲基、二甲氧三苯甲基和三-對第三丁基苯基甲基；矽 烷基典型上爲三苯矽烷基、三甲矽烷基、三乙矽烷基、三 正丙矽烷基、異丙基二甲矽烷基、第三丁基二甲矽烷基、 第三丁基二苯矽烷基、正辛基二甲矽烷基、（U，2,2-四甲基 乙基）二甲矽烷基；R-C(O)-官能基之實例爲乙醯基、三氟乙 醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、己醯基、苯甲醯基、甲 苯甲醯基、甲氧苯甲醯基、氯苯甲醯基、溴苯甲醯基、甲 氧·、乙氧羰基、正-或異丙氧羰基或正-、異-或第三丁氧羰基 或苯氧羰基、苯甲氧羰基、甲-或甲氧-或氯苯氧羰基或氯苯 甲氧羰基或9-蒹基甲氧羰基；R17-S02-官能基典型上爲甲基 苯楓基、乙基苯砜基、丙基苯砜基、丁基苯砜基 '苯基苯 砜基、苯甲基苯碱基、對溴苯砜基、對甲氧基苯楓基和對 甲基苯砜基；烷氧乙醯基和苯氧乙醯基典型上爲甲氧乙醯 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） n · n —L VI m. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -13 - A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 基、乙氧乙醯基、苯氧乙醯基、（對甲苯氧基）乙醯基、（對 第三丁苯氧基)乙醯基。脒保護基也常被使用在核鹼基上。 核苷和寡核苷酸能夠以共價鍵方式’經由一個連接基 鍵結到一個固體撐體上。適合之撐體典型上爲矽膠、精密 孔玻璃、聚苯乙烯、聚丙醯胺、聚胺甲酸酯、聚烯、三聚 氰胺、聚醯胺、聚酯、聚醚、聚醇、環糊精、纖維素和醚 化或醯化之纖維衍生物、肝糖、澱粉、殼糖和聚葡萄胺 糖。視所選用之撐體而定，連接基可以爲二羧酸、二胺甲 酸酯或烷氧矽烷基胺甲酸酯。 本發明之方法可以在一個附加之溶劑下進行。若沒有 附加之溶劑，本新穎方法中所使用之液態醇、多元醇或聚 合多元醇即是溶劑。適宜之附加溶劑之條件爲在反應槽中 不會和醇、多元醇或聚合多元醇競爭。它們可以單獨使用 或至少與兩種溶劑混合在一起使用。在多元醇之例子中， 可以使用溶劑或溶解化劑（使得由於多元醇之膨脹，醇可 用於方法中）。這種溶劑之具代表性例子可從由醚、鹵化 烴、羧醯胺、內醯胺、亞砜、砜、芳烴、腈、脂烴和環脂 烴所組成之族群中選取，而較適宜者是醚、鹵化烴、腈、 羧醯胺和內醯胺。在本發明之範圍內，溶解化劑適合使用 鹽類，典型上爲醋酸銨和碳酸氫銨。 特別適宜之醚爲二丁醚'四氫呋喃、二喟烷、乙二醇 二***和二甲醚、二甘醇二甲醚、二甘醇二***或三甘醇 二甲醚，較適宜者是四氫呋喃、甲基第三丁基醚、二丁 I I - - 1*—I! I - 1^ 1 ^^1 ^1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨ox297公釐） • 14- 32S234 A7 B7 五、發明説明（） 醚、二異丙醚或二Df烷。特別適合之鹵化烴是二氯甲烷、 氯仿、1，2-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷和1，1，2,2-四氯乙烷。 有用之醯胺爲N-烷化或N-二烷化醯胺。典型上爲N，N-二 甲基甲醯胺、N，N-二乙基甲醯胺、N，N-二甲基乙醯胺、四甲 脲和六甲基磷酸三醯胺。 較適宜之內醯胺可由γ-丁內醯胺、ε-己內醯胺、N-甲妣 咯啉酮、Ν-乙醯吡咯啉酮和Ν-甲基己內醯胺所組成之族群中 選取。在本發明之範圍內，更進一步適合之溶劑包括二甲 亞砜、二甲砜 '二乙諷、三亞甲楓、四亞甲楓、苯、有取 代基之苯（較適宜者是氯苯、鄰二氯苯、三氯苯、硝 苯、甲苯和二甲苯、乙腈、丙腈、苯甲腈、苯乙腈、戊 烷、石油醚、己烷、環己烷和甲基環己烷）^ 在本發明之方法中所使用之脂醇、環脂醇、芳脂醇或 芳醇、多元醇或聚合多元醇都是被當作受體。 經濟部中央樣準局負工消費合作社印裝 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本貰) 一個含1至20個碳原子之烷醇是適合被使用的，較適宜 者是含1至12個碳原子，而最適宜者是含1至6個碳原子之 烷醇，典型上一個有代表性之群體是由甲醇、乙醇、正-和 異丙醇、正-、異-和第三丁醇、戊醇、己醇、乙二醇、二甘 醇單甲醚和單***所組成。在本發明之方法中，一個較適 宜之醇類副族群包括CrC4院醇。特別適宜之醇是甲醇。 另外，含有5至12(較適宜爲5至8)個環碳原子之帶有 烷基取代基之環烷醇也是適合使用之醇類。典型上可由環 戊醇、環己醇、甲基環己醇、環庚醇和環辛醇所組成之族 群中選取。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15· 經濟部中央橾隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 更進一步適合之受體之實例爲含有7至3〇 (較適宜爲7 至20)個碳原子之芳脂醇（較適宜從由未被取代或被烷基 或烷氧基所取代之苯甲基醇和β_苯乙醇所組成之族群中選 取）；含有6至30(較適宜爲6至12)個碳原子之芳醇（較 適宜從由酚和未被取代或被烷基或烷氧基取代之萘酚所組 成之族群中選取）；含有2至20個碳原子之多元醇（較適宜 從由乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、環己二 醇、二羥基甲基環己醇、二甘醇、三甘醇、多甘醇、三羥 甲基丙烷、異戊四醇、二異戊四醇、甘油和醣類所組成之 族群中選取）；聚合多元醇（較適宜從由聚乙烯醇、聚醣 和羥烷基聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯所組成之族群中選 取）。烷基和烷氧基取代基較適宜含有1至4個碳原子。 在本發明之範圍內，醣類受體，典型上是指單醣和寡 醣類，例如單、雙、三、四和五醣類。在本發明之較適宜 之具體實施例中，單醣和寡醣類爲醛醣或酮醣。在本發明 之特別適宜之具體實施例中，單醣類爲醛戊醣、醛己醣、 酮戊醣或酮己醣。 典型上醛戊醣爲D-核糖、D-***糖、D-木糖、D-來蘇 糖；醛己醣典型上爲D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘 露糖、D-異葡萄糖、D-艾杜糖、D-半乳糖或D-太洛糖；酮戊 醣爲D-核酮糖、D-木酮糖；酮己糖爲D-阿洛酮糖、D-果糖、 D-山梨糖或D-塔格糖。 雙醣類典型上爲繭糖、麥芽糖、異麥芽糖、纖維雙 糖、龍膽貳糖、蔗糖或乳糖。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -L---8-----1 i 裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 -16- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印聚 A7 ________ B7五、發明説明（) 三醣類典型上爲棉子糖。 多醣類典型上爲纖維素、澱粉、聚葡萄糖、肝糖、聚 果糖、菊糖、聚甘露糖、聚木糖和聚***糖。 一 /在本發明之方法中所使用之無機鹼較適宜由鹼金屬氧 化物、重金屬氧化物和氫氧化物（較適宜者是Si02或鹼錦） 所組成之族群中選取0 更ϋ一步適合之無機鹼必須爲在親核催化反應之條件 下可與其進行轉酯反應，而且它們可能是一個緩衝系中之 成份。它們較適合爲金屬或銨之氟化物、金屬或銨之醛后 酸鹽、酮肟酸鹽、羥肟酸鹽、硫酸鹽'磷酸鹽、膦酸鹽、 焦硫酸鹽、磺胺酸鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽和砜鹽，爲可溶 解於醇類或反應混合物中者。較適宜之金屬是指鹼金屬離 子，例如Na、Li+、κ+、邮和以。金屬之醛肟酸鹽、酮肟酸 鹽'羥Β酸鹽、磺胺酸鹽、砜鹽和膦酸鹽可包含氫原子或 crc：6院基或未被取代之苯基或被鹵素、Ci_c4院基、CrC4院氧 基、氰基或硝苯基所取代之苯基。氟化銨較適宜爲四(Crc6 烷基)氟化銨，典型上爲四(正丁基)氟化銨.HF。更進一步之 實例爲 CsF ' KF、CH3-C(0)-NH-0·和 Mg(CF3CO)2。硏究結果發現 將這些親核鹼和有機氮鹼以催化量放在一起使用是特別有 用的。 特別有用之有機氮驗爲由芳胺、芳族N-雜環和N-Q-Q院 基嗎啉所組成之族群中選取者。典型上代表性之化合物爲 咪唑、吡啶、N-甲基嗎啉、苯胺和鄰苯二胺與聚乙烯吡 啶。在本發明之方法中鹼之使用量可從一個催化量到較高 丨----r----厂裝------訂-----卜線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -17- A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（) 之量，典型上可高到相當量或過量。在本發明之範圍內， 一個催化量之定義是（以1莫耳核苷或寡核苷酸爲準）介於 0.01至20%莫耳之間，較適宜者是介於0.1至10%莫耳之間， 更適宜者是介於0.1至5%莫耳之間。 在本發明之方法中，每莫耳當量化學式I之官能基，較 適宜使用不低於100莫耳當量且高至1000莫耳當量或更高過 量受體之羥基。 本新穎方法之反應速率可藉由路易士酸之添加而顯著 地加快，基於1莫耳之核苷或寡核苷酸，路易士酸之用量爲 0.01至20%莫耳，較適宜者是0.1至10%莫耳，最適宜者是0.1 至5%莫耳。這個高反應速率是本方法之一大優點。較適合 使用之路易士酸爲金屬鹽類(Lici)、硼酸鹽或有機金屬錯合 物。在本新穎方法中，將有機氮鹼、親核無機鹼和路易士 酸一起使用是特別有利的，可得到一高選擇性。 反應在溫度範圍-2〇°C至+55°C間進行，較適宜之範圍是 15°C至35°C，且最適宜之溫度爲室溫。 反應時，可適當地將一個含有化學式I、la和lb自由基 之核苷或寡核苷酸加入由醇和鹼所組成之溶液或混合物 中，並且讓其反應完全。爲了單離所需之化合物，任何不 溶解之成份可利用過濾之方式除去，然後溶劑亦被除去。 殘留物可藉由傳統方法加以純化，例如結晶或層析法。在 本新穎方法之特別有利之具體實施例中，從寡核苷酸合成 過程所產生之廢液直接流入一由醇和鹼所組成之溶液或混 合物中，以便回收大過量使用之核苷酸成份。在這個方法 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -18- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 中，將一個含有化學式I、la或lb自由基之化合物之廢液流 回反應溶液或混合物中，而廢液中之酸成份會被反應一開 始即存在於溶液或混合物中之大量過量之鹼所中和。在反 應期間，鹼之濃度會降低，而有必要之話，可以再補充。 這些酸成份較可能爲四唑或其它會影響亞磷酸三酯法中核 苷酸縮合反應之酸類。 對於反應混合物之處理，所形成之亞磷酸酯可以用傳 統氧化劑（例如Ι2/Η20/吡啶或S8/吡啶）加以處理而再得 到相當之磷酸酯或硫磷酸酯。將反應溶液蒸發後，將不再 有逆反應會發生，而所要之產物常常以萃取法分離而得， 且避免使用層析法。 硏究結果發現，使用萃取法時，可用檸檬酸鹽緩衝溶 液（pH約3-4)有效地去除有機氮鹼，例如咪唑。當在水溶 液介質中處理時，可得到幾乎完全之分離及良好之相分 離。 在本新穎方法之一個特別具體實施例中，若含有一個 H-膦酸根或H-亞膦酸根之核苷或寡核苷酸附著在一個固相撐 體上，並且在一有機氮鹼存在下被反應時，氰乙醇即被當 成一個受體使用。在本方法之具體實施例中，一個雙氰乙 基亞磷酸酯或氰乙基甲基亞膦酸酯會形成，而其與一弱鹼 性之聚合離子交換劑會進行不可逆反應。由於鹽之形成， 反應所得之磷化合物仍然連接在離子交換劑上而形成鹽 類，在此同時所形成之丙烯膪會被離子交換劑所吸附住。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Μ規格（210X297公釐） -19- 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 本方法之具體實施例可避免在轉酯化期間逆反應之發生， 特別是可以避免使用大量過量之受體。 本發明可以下列實例更詳細地說明。在實例2、5及7中 所使用之流出液可以下述方法得到： 從一固相寡核苷酸合成反應器中產生之廢液可依照Gao 等人（Gao, H·，Gaffhey，B丄.,Jones，R.A.，Tetrahedron Lett·，1991)之方法 收集。從反應器中流出之廢液，將核苷分離後即直接個別 流進一個50毫升之甲醇/乙腈(2··1)溶液中。 實施1 :從二甲氧三苯甲基胸苷-3'-基-β-氰乙基二異丙基胺基 磷酸酯製備5'_二甲氧三苯甲基胸苷 在2〇-30°C下，將270毫克（3.86毫莫耳）四唑和9微升 (〇·5毫莫耳）水加入一 4毫升乙腈溶液（含有360毫克（0.4S 毫莫耳）二甲氧三苯甲基胸甘-3··基·β-氰乙基二異丙基胺基磷 酸酯）中。5分鐘後，胺基磷酸酯水解完成而得到5'-二甲氧 基三苯甲基胸苷_3’_氰乙基膦酸氫酯。 將4毫升甲醇和350毫克咪唑加入此溶液中。24小時 後，利用眞空蒸發法將反應溶液加以濃縮。將所得到之白 至微黃色固體溶入50毫升二氯甲烷。 使用50毫升水和50毫升碳酸氫鈉溶液萃取後，將有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。鹽和任何殘留之咪唑以過濾方式 去除。利用蒸發法將粗產物濃縮並且利用急驟層析法（Still， \V.C·，Kahn, M·，Mitri A., J. Org. Chem. 43:2923, 1978)加以分離。將 產物部份合倂在一起濃縮後，溶入50毫升二氯甲烷中，然 I ^-'裝 n I ^ I I一 線 - »--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -20- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^23284 B7五、發明説明（） 後用50毫升之1M碳酸氫三乙銨溶液萃取。將有機相在硫酸 鈉上予以乾燥。利用過濾方式除去鹽並且在眞空狀態下將 其濃縮至1毫升。加入200毫升正戊烷後將溶液冷卻到-20°C 後，沉澱即可完成。利用過濾方式將沉澱物分離出來後， 用50毫升正戊烷淸洗後在眞空狀態下，放在Ρ401(/Κ0Η上予 以乾燥。所得到之產物即爲5’_二甲氧三苯甲基胸苷（51-二甲 氧三苯甲基胸苷：431毫克，純度82·5%(乾基））。 實例2 ：從廢液（得自一寡核苷酸合成反應器）製備5'-二甲 氧三苯甲基胸苷 在20-30°C下，將含有0.24毫莫耳5’-二甲氧三苯甲基胸甘 -3'-基-β-氰乙基膦酸酯之1〇〇毫升廢液（得自一DNA合成反應 器）流進5〇毫升含有1克咪唑之甲醇溶液中。反應一週後， 將反應溶液在眞空狀態下予以乾燥而得到白至微黃色之固 體，再溶入1〇〇毫升二氯甲烷中。經三次1〇〇毫升之1Μ NaH2P04/NaHP04(pH5.5)溶液萃取後，所有收集之水相再用50 毫升二氯甲烷予以萃取。將所有有機相合倂，二次用100毫 升碳酸氫鈉飽和水溶液加以萃取。碳酸氫鈉相再用50毫升 二氯甲烷加以萃取後，收集所有之有機相。將合倂之有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。隨後在5毫升苯中進行再結晶，並 且將溶液冷卻至-2〇°C以便再結晶完全。加入50毫升正己烷 後繼續在_2〇°C下再結晶20小時。利用過濾方式將產物分離 出來後用50毫升正己烷淸洗，然後在眞空狀態下，放在 Ρ4〇η/ΚΟΗ上予以乾燥。得到之產物即爲5’-二甲氧三苯甲基 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2ΙΟΧ297公釐） -21 - 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 ____B7_____ 五、發明説明（) 胸苷（5'-二甲氧三苯甲基胸苷：1W毫克，純度"％乾燥固 體中，含有100%核苷酸間耦合（在合成器中））。 實例3 :從2·異丁基二甲氧三苯甲基_2·-去氧鳥苷-3'-基-β-氰乙 基二異丙基胺基磷酸酯製備2-異丁基-5·-二甲氧三苯甲基-2·-去 氧鳥苷 在20 - 30°C下，將350毫克（5毫莫耳）四唑和1S微升 (1毫莫耳）水加入8毫升含有839毫克（1毫莫耳）2_異丁基 _5’_二甲氧三苯甲基-2'-去氧鳥苷氰乙基二異丙基胺基磷 酸酯之乙腈溶液中。5分鐘後，胺基磷酸酯水解完成而得到 5’_二甲氧三苯甲基鳥甘-3·-氰乙基隣酸氫酯。 將4毫升甲醇和350毫克咪唑加入此溶液中。24小時 後，利用眞空蒸發法將反應溶液加以濃縮。將所得到之白 至微黃色固體溶入5〇毫升二氯甲烷中。 使用50毫升水和50毫升碳酸氫鈉溶液萃取後，將有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。鹽和任何殘留之咪唑以過濾方式 去除。利用蒸發法將粗產物濃縮並且利用急驟層析法加以 分離。將產物部份收集在一起濃縮後溶入50毫升二氯甲烷 中，然後用5〇毫升之1Μ碳酸氫三乙銨溶液萃取。將有機相 在硫酸鈉上予以乾燥。利用過濾方式除去鹽並且在眞空狀 態下將其濃縮至1毫升。在室溫下，將濃縮後之產物溶液放 入5〇毫升正戊烷中予以沉澱。加入450毫升正戊烷後將溶液 冷卻到-2〇°C後，沉澱即可完成。利用過濾方式將沉澱物分 離出來後，用1〇〇毫升正戊烷淸洗後在眞空狀態下，放在 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂- -22- 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（) P4O10/KOH上予以乾燥。所得到之產物即爲異丁基_5·_二甲氧 三苯甲基-2-去氧鳥苷（2_異丁基-5·-二甲氧三苯甲基-2’-去氧鳥 苷：577毫克，純度9〇.3% (乾基））。 實例4 :從6-苯甲醯基-51-二‘甲氧三苯甲基_2'-去氧腺苷-3'-基-β-氰 乙基二異丙基胺基磷酸酯製備6-苯甲醯基-5'-二甲氧三苯甲基-2'_去氧腺苷 在20 - 30°C下，將350毫克（5毫莫耳）四唑和1S微升 (1毫莫耳）水加入8毫升含有857毫克（1毫莫耳）6-苯甲 醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2’-去氧腺甘-3’雀-β-氰乙基二異丙基胺 基磷酸酯之乙腈溶液中。5分鐘後，胺基磷酸酯水解完成而 得到5'-二甲氧三苯甲基腺芽-31-氰乙基膦酸氫酯。 將4毫升甲醇和350毫克咪唑加入此溶液中。24小時 後，利用眞空蒸發法將反應溶液加以濃縮。將所得到之白 至微黃色画體溶入5〇毫升二氯甲烷中。 使用50毫升水和50毫升碳酸氫鈉溶液萃取後，將有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。鹽和任何殘留之咪唑以過濾方式 去除。利用蒸發法將粗產物濃縮並且利用急驟層析法加以 分離。將產物部份收集在一起濃縮後溶入5〇毫升二氯甲烷 中，然後用50毫升之1Μ碳酸氫三乙銨溶液萃取。將有機相 在硫酸鈉上予以乾燥。利用過濾方式除去鹽並且在眞空狀 態下將其濃縮至1毫升。在室溫下，將濃縮後之產物溶液放 入50毫升正戊烷中予以沉澱。加入450毫升正戊烷後將溶液 冷卻到-20°C後，沉澱即可完成。利用過濾方式將沉澱物分 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 — -„---r----^—裝----,--訂------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -23 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印簟 A7 B7 _ 五、發明説明（） 離出來後，用1〇〇毫升正戊烷淸洗後在眞空狀態下，放在 P4O10/KOH上予以乾燥。所得到之產物即爲6-苯甲醯基-5'-二甲 氧三苯甲基-2’·去氧腺苷（6_苯甲醯基-5L二甲氧三苯甲基-2’-去 氧腺苷：5泣毫克，純度85.5% (乾基））。 實例5 :從廢液（得自一寡核苷酸合成反應器）製備6_苯甲 醯基-5·-二甲氧三苯甲基_2'_去氧腺苷 在20-30°C下，將含有0.82毫莫耳6-苯甲醯基-5·-二甲氧三 苯甲基_2’_去氧腺苷基-P-氰乙基膦酸酯之300毫升廢液（得 自一DNA合成反應器）流進5〇毫升含有1克咪唑之甲醇溶液 中。反應一週後，將反應溶液在眞空狀態下予以乾燥而得 到白至微黃色之固體，再溶入1⑻毫升二氯甲烷中。利用三 次100毫升之1M NaH2P〇VNaHP04 (pH 5.5)溶液萃取後，所有收 集之水相再用50毫升二氯甲烷予以萃取。將有機相收集後 用二次100毫升碳酸氫鈉飽和水溶液加以萃取。碳酸氫鈉相 再用50毫升二氯甲烷加以萃取後，收集所有之有機相。將 * 收集之有機相在硫酸鈉上予以乾燥。利用蒸發法將粗產物 濃縮並且利用急驟層析法加以分離。將產物部份收集在一 起濃縮後溶入50毫升二氯甲烷中，然後用5〇毫升之1M碳酸 氫三乙銨溶液萃取。將有機相在硫酸鈉上予以乾燥。利用 過濾方式除去鹽並且在眞空狀態下將其濃縮至1毫升。在室 溫下，將濃縮後之產物溶液放入50毫升正戊烷中予以沉 澱。加入200毫升正戊烷後將溶液冷卻到-2〇°C後，沉澱即可 完成。利用過濾方式將沉澱物分離出來後，用5〇毫升正戊 ( CNS ) A4^ ( 21〇 X297^Jt ) ' -24- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ B7 _______ 五、發明説明（) 烷淸洗後在眞空狀態下，放在P4〇h/K〇H上予以乾燥。所得 到之產物即爲6-苯甲醯基士二甲氧三苯甲基-2'-去氧腺苷（6-苯甲醯基-5·-二甲氧三苯甲基-2'-去氧腺苷：3δΟ毫克，純度 75·5%乾燥固體，含有100%核苷酸間耦合（在合成器 中））。 實例6 :從4-苯甲醯基-5'-二甲氧三苯甲基-2'-去氧胞甘-3'-基-β-氰 乙基二異丙基胺基磷酸酯製備4-苯甲醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2’-去氧胞苷 在20 - 30°C下，將350毫克（5毫莫耳）四唑和18微升 (1毫莫耳）水加入8毫升含有幻3毫克（1毫莫耳）4_苯甲 醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2·-去氧胞甘Α^-β-氰乙基二異丙基胺 基磷酸酯之乙腈溶液中。5分鐘後，胺基磷酸酯水解完成而 得到4-苯甲醯基-5·-二甲氧三苯甲基胞苷-3·-氰乙基膦酸氫酯。 將4毫升甲醇和350毫克咪唑加入此溶液中。24小時 後，利用眞空蒸發法將反應溶液加以濃縮。所得到之白至 微黃色固體溶入5〇毫升二氯甲烷中。 使用50毫升水和50毫升碳酸氫鈉溶液萃取後，將有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。鹽和任何殘留之咪唑以過濾方式 去除。利用蒸發法將粗產物濃縮並且利用急驟層析法加以 分離。將產物部份收集在一起濃縮後溶入5〇毫升二氯甲烷 中，然後用50毫升之1Μ碳酸氫三乙銨溶液萃取。將有機相 在硫酸鈉上予以乾燥。利用過濾方式除去鹽並且在眞空狀 態下將其濃縮至1毫升。在室溫下，將濃縮後之產物溶液放 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -------„-----< 1裝--^--,--訂-----一線-I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -25 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（） 入5〇毫升正戊烷中予以沉澱。加入45〇毫升正戊烷後將溶液 冷卻到-2〇°C後，沉澱即可完成。利用過濾方式將沉澱物分 離出來後，用100毫升正戊烷淸洗後在眞空狀態下，放在 P401Q/K0H上予以乾燥。所得到之產物即爲4_苯甲醯基-5'-二甲 氧三苯甲基-2’-去氧胞苷（4-苯甲醯基_5'-二甲氧三苯甲基_2’-去 氧胞苷：527毫克，純度S3.2% (乾基））。 實例7 ·‘從廢液（得自一寡核苷酸合成反應器）製備4-苯甲 醯基_5'-二甲氧三苯甲基_2'-去氧胞苷 在2〇-3〇°C下，將含有0.27毫莫耳4·苯甲醯基-5'·二甲氧三 苯甲基-2'-去氧腺苷-3’-基-β-氰乙基膦酸酯之100毫升廢液（得 自一 DNA合成反應器）流進50毫升含有1克咪唑之甲醇溶液 中。反應一週後，將反應溶液在眞空狀態下予以乾燥而得 到白至微黃色之固體，再溶入1〇〇毫升二氯甲烷中。利用三 次1〇〇毫升之1Μ NaH2P〇4/NaHP04 (pH 5.5)溶液萃取後，所有收 集之水相再用50毫升二氯甲烷予以萃取。將有機相收集後 用二次100毫升碳酸氫鈉飽和水溶液加以萃取。碳酸氫鈉相 再用5〇毫升二氯甲烷加以萃取後，收集所有之有機相。將 收集之有機相在硫酸鈉上予以乾燥。利用蒸發法將粗產物 濃縮並且利用急驟層析法加以分離。將產物部份收集在一 起濃縮後溶入5〇毫升二氯甲烷中，然後用50毫升之1M碳酸 氫三乙銨溶液萃取。將有機相在硫酸鈉上予以乾燥。利用 過濾方式除去鹽並且在眞空狀態下將其濃縮至1毫升。在室 溫下，將濃縮後之產物溶液放入50毫升正戊烷中予以沉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- 經濟部中央樣準局貝工消費合作杜印製 A7 ____B7___ 五、發明説明（) 澱。加入200毫升正戊烷後將溶液冷卻到-20°C後，沉澱即可 完成。利用過濾方式將沉澱物分離出來後，用5〇毫升正戊 烷淸洗後在眞空狀態下，放在PAo/KOH上予以乾燥。所得 到之產物即爲4-苯甲醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2-去氧胞苷（4_ 苯甲醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2'-去氧胞苷：163毫克，純度 91.5%乾燥固體，含有1〇〇%核苷酸間耦合（在合成器 中））。 實-例8 :從廢液（得自一寡核苷酸合成反應器）製備N-甲基-N-(5’-z：甲氧三苯甲基·3'_去氧胸苷_3'_基)·(5·_去氧胸苷-5·-基)乙醯 胺 將含有160毫克Ν-甲基-Ν-(5'-二甲氧三苯甲基-3'-去氧胸苷· 3'-基)-(3'_氰乙基-Η-膦醯基-5’-去氧胸基)乙醯胺之5毫升廢液 (得自一DNA合成反應器）流進50毫升含有1克咪唑之甲醇 溶液中。在20-25°C下，持續反應3天後，用5毫升水將反應 混合物稀釋<然後將包含30克碘、20毫升水、2〇〇毫升吡啶 及750毫升四氫呋哺之溶液加入反應混合物中，溶液加入之 量必須足夠使得碘之棕色至少能保留5分鐘。然後利用眞空 蒸發法將反應混合物濃縮成微黃色之固體，再溶入一由100 毫升之4〇%NaHS03水溶液及5〇毫升乙酸乙酯所組成之乳液 中。利用萃取法將水相分離出來後，再經二次50毫升碳酸 氫鈉水溶液萃取有機相。將萃取後之水相收集起來，再用 毫升乙酸乙酯萃取一次。將萃取後之有機相收集起來， 再用二次5〇毫升之1MMgS〇4水溶液萃取之。然後在2·克乾之 l»K— ^^^1 m> ^^^1 HI (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線l· 本紙張尺度it财關家標準（CMS ) A4規格（210X2^^"y -27- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（） 硫酸鈉上予以乾燥。將鹽類過濾出來後，在眞空狀態下將 濾液濃縮至乾燥爲止。將乾燥後之固體溶入5毫升CH-C13/ 甲醇（9:1)溶液後，利用矽膠管柱予以層析分離。將產物部 份收集後，在高眞空狀態下予以乾燥。最後之產物，N-甲基 善(5'-二甲氧三苯甲基-3'-去氧胸苷I基)-(5'-去氧胸苷_5'-基)乙醯 胺以白色泡沬之形式沉澱出來，產量爲40毫克（爲理論値 之 31%) 〇 ^-NMR: (CDC13,標準=丁1^，(1[??111]):8.8:23，1^;7.7:3,111，116;7.45-7.2: DMTr; 7.09: s, 1H, Η6; 6.82: 2m, 4H, DMTr; 6.33: t, 1H, Γ; 6.15: t, 1H, 1'; 5.26 - 4.95: m，1H，3, atNRCH3,二種轉動異構物 3:1; 4.25 - 4: m，2H; 3.75: s，6H，DMTr; 3.63, 3.4, 3.25: 3m，4H; 2.9, 2.85: 2s，3H，CH3 of NRCH3,二種 轉動異構物：3:1; 2.65 - 2: m; 1.88: 2H，1.8: 1H，2s, CH35, 2 rotamers: 3:1; 1.5: 1H，1.45:2H，2s，CH35,二種轉動異構物：1:3。 實例9 ：從廢液（得自一寡核苷酸合成反應器）製備5’-二甲 氧三苯甲基-N6-三甲基乙醯基-2’-(l-(2-氟苯基)-4-甲氧六氫吡啶-4-基)-腺苷 將含有160毫克N-甲基-N-(5’-二甲氧三苯甲基_3'-去氧胸苷-3'-基)-(3'-氰乙基-H-膦醯基-5’-去氧胸甘_5’-基)乙醯胺之5毫升廢液 (得自一 DNA合成反應器）流進50毫升含有1克咪唑之甲醇 溶液中。在20-25°C下，持續反應3天後，用5毫升水將反應 混合物稀釋。然後將包含3〇克碘、20毫升水、200毫升吡啶 及75〇毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中，溶液加入之 量必須足夠使得捵之棕色至少能保留5分鐘。然後利用眞空 裝 訂 線 (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） -28- 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印策 A7 _ 五、發明説明（） 蒸發法將反應混合物濃縮成微黃色之固體，再溶入一由100 毫升之40% NaHS03水溶液及5〇毫升乙酸乙酯所組成之乳液 中。利用萃取法將水相分離出來後，再經二次5〇毫升碳酸 氫鈉水溶液萃取有機相。將萃取後之水相收集起來，再用 10毫升乙酸乙酯萃取一次。將萃取後之有機相收集起來， 再用二次50毫升之lMMgS04水溶液萃取之。然後在2克乾之 硫酸鈉上予以乾燥。將鹽類過濾出來後，在眞空狀態下將 濾液濃縮至乾燥爲止可得到320克之粗產物。將乾燥後之固 體溶入5毫升CH-C13/甲醇(9:1)溶液後，利用矽膠管柱予以 層析分離。將產物部份收集後，在高眞空狀態下予以乾 燥。最後之產物5'·二甲氧三苯甲基-N6-三甲基乙醯基-2'-(l-(2-氟苯基>4-甲氧六氫吡陡_4·基)-腺苷會以黃色油之形式沉殿出 來，產量爲223毫克（爲理論値之58%)。 iH-NMR: (CDC13,標準= TMS，d [ppm]): 8.69: s，1H，腺嘌呤;8.48: s，1H，腺 嘌玲；8.2: s，1H，腺曝玲;7·5 - 7.2: m，9H，DMTr; 7.12 - 6·88: m，4H，2-氟苯 基；6.83: 2m，4H，DMTr; 6.25: d，1H，Γ; 5.35: m; 4.43: m，1H; 4.3: m，1H; 3.76: s，6H; 3.5, 3.38; 2m，2H，5'; 3.15: m，1H，Fpmp; 2.96: m，2H; Fpmp; 2.78: s, 3H, CH3 of Fpmp, m, 1H, FPMP; 2.15 - 1.75: m, 4H, Fpmp; 1.4: 9H:piv 〇 實例10 :從5’·二甲氧三苯甲基-2HK2-氟苯基H-甲氧六氫吡陡-4-基)尿苷-3^基氰乙基二異丙基胺基磷酸酯水解產物製備5’-二 甲氧三苯甲基-2'-(l-(2-氟苯基)_4·甲氧六氫吡陡基)尿苷；與甲 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4说格（21〇Χ297公釐） r I 1· I 、裝 I I I -τ- I 訂*~ 」·^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -29- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 2B284 A7 ____B7_五、發明说明（） 醇及KF進行轉酯化反應；在操作時，Ι2/Η20當作驟***液而 無12受體 將10毫升含有0· 138毫莫耳5'-二甲氧三苯甲基-2’-(l-(2-氟苯 基)-4-甲氧六氫吡啶-4-基)尿苷-3’-基-氰乙基-H-膦酸酯和0.694毫 莫耳四唑之乙膪溶液加入50毫升之0.1MKF之甲醇溶液中。 在20-25°C下，反應在2天內完成。用5毫升水稀釋反應混合 物。然後將一含有3〇克碘、20毫升水、200毫升吡啶及750 毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中，溶液加入之量必 須足夠使得碘之棕色至少能保留5分鐘。然後利用眞空蒸發 法將反應混合物濃縮成微黃色之固體，再溶入一由50毫升 水及50毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。收集所有之有機相 並且用四次50毫升水萃取之。收集所有之水相並且再一次 用10毫升乙酸乙酯萃取之。收集所有之有機相，用50毫升 NaCl飽和溶液萃取後，在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利用過 濾方式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-10毫升 乙酸乙酯中，然後慢慢地將溶液流進2〇〇毫升正戊烷中。產 ^ 物以白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後，用5〇毫升 正戊烷淸洗，然後在眞空狀態下，在P4〇10/KOH上乾燥24小 時，即可得到67.7毫克（理論値之69%)之5’-二甲氧三苯甲基 -2'-(1-(2·氟苯基)-4-甲氧六氫吡陡_4_基)尿苷（理-値之75%)。 ^-NMR: (CDC13,標準=TMS，d [ppm]): 7.75: d，1H，H6; 7.45 - 7_15: m, 9H， DMTr; 7.1 - 6.75: m, 4H, Fpmp, 2m, 4H, DMTr; 6.15: d, 1H, 1'; 5.2: d, 1H, H5; 4.74: m, 1H, 2'; 4.33: m, 1H, 3'; 4.15: m, 1H, 4'; 3.76:s, 6H, DMTr; 3.38: m, 2H, 5'; 3·12; s，3H，CH3 ofFpmp; 3.2 - 2.8: m, 4H，Fpmp; 2.15 - 1.8: m，4H。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標隼（CMS ) A4洗格（2丨0X297公釐） -30- 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 實例11 :從5'-二甲氧三苯甲基-N4-苯甲醯基_2'-(1-(2-氟苯基)-4-甲 氧六氫吡陡-4-基)胞苷-3'-基氰乙基二異丙基胺基磷酸酯水解產 物製備5_-二甲氧三苯甲基-N4-苯甲醯基-2'-(l-(2-氟苯基)-4-甲氧 六氫吡啶_4·基)胞苷 將10毫升含有0.129毫莫耳5'-二甲氧三苯甲基-N4-苯甲醯 基-2'-(l-(2-氟苯基)-4-甲氧六氫吡啶-4-基)胞苷基-氰乙基-H-膦酸 酯和0.645毫莫耳四唑之乙腈溶液加入50毫升之0.1MKF之甲 醇溶液中。在2〇-25°C下，反應在2天內完成。用5毫升水稀 釋反應混合物。然後將一含有30克碘、20毫升水、200毫升 吡啶及75〇毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中，溶液加 入之量必須足夠使得碘之棕色至少能保留5分鐘。利用眞空 蒸發法將反應混合物濃縮成微黃色之固體，再溶入一由50 毫升水及50毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。收集所有之有 機相並且用四次50毫升水萃取之。收集所有之水相並且再 一次用1〇毫升乙酸乙酯萃取之。收集所有之有機相，用50 毫升NaCl飽和溶液萃取後，在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利 用過濾方式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-1〇 毫升乙酸乙酯中，然後慢慢地將溶液流進200毫升正戊烷 中。產物以白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後，用 5〇毫升正戊烷淸洗，然後在眞空狀態下，在Ρ4〇η/Κ〇Η上乾 燥24小時，即可得到S3毫克（理論値之09%)之义二甲氧三 苯甲基-Ν4-苯甲醯基·2’·(1-(2-氟苯基)-4-甲氧六氫吡啶-4-基)胞苷 (理論値之80%)。 -----------{ 1 裝---------J--計-----^ ^ L— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公釐） -31 - 五、發明説明（ A7 B7 iH-NMR: (CDC13,標準=丁]\^，(1帥111]):8.28:(1，1氏7.82:(1，2氏62;7.6-7.23: m, 14H, Bz, DMTr; C; 7.03 - 6.77: d, 4H, DMTr, 2d, 4H, Fpmp; 4.66: 6, 1H, Γ; 4.38: 6, 1H, 2'; 4.17: m, 1H, 3', 3.74: s, 6H, DMTr; 3.48: m, 2H, 5'; 3.25 - 2.85: s, 3H, CH3, Fpmp, m, 4H, Fpmp; 2.18 - 1.95: m, 4H, Fpmp « I9F-NMR: (CDC13,標準=TFA, d [ppm]): -123.5。 經濟部中央樣隼局貝工消費合作社印裝 實例12 :從5’_二甲氧三苯甲基-N4-(4-第三丁苯氧乙醯基-r-去氧 胞基氛乙基二異丙基胺基磷酸酯水解產物製備5'-二甲氧 三苯甲基-N4-(4-第三丁苯氧乙醯基·2·_去氧胞苷 將4毫升含有200毫克5'-二甲氧三苯甲基_ν4-(4-第三丁苯 氧乙醯基-2’-去氧胞苷（得自5'-二甲氧三苯甲基-ν4·(4-第三丁 苯氧乙醯基-2'-去氧胞苷_3'-基氰乙基-η-膦酸酯水解產物）和2 毫莫耳四唑之乙腈溶液加入40毫升之〇.2M KF之甲醇溶液 中。在20-25°C下，去亞磷醯化反應在4小時內完成。在反 應混合物中加入1毫升卩比啶後再加入5〇毫克硫。在20- 25°C 下’將反應混合物攪拌60分鐘’過濾，然後倒入毫升水 中。所形成之乳液用三次30毫升乙酸乙酯萃取之。收集所 有之有機相，用50毫升NaCl飽和溶液萃取之，然後放在2克 乾之硫酸鈉上乾燥。利用過濾方式將鹽去除並在眞空狀態 下將濾液濃縮至全乾。將固體溶入1〇毫升乙酸乙酯中，然 後慢慢地將溶液流進3〇0毫升正戊烷中。產物以白色非結晶 狀沉澱出來。將沉澱物過濾後，用5〇毫升正戊烷淸洗，然 後在眞空狀態下，在P4〇10/K〇H上乾燥24小時，即可得到 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. ---訂 線 -32- 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 ___ 五、發明説明（） 112.8毫克（理論値之72.1%)之5，-二甲氧三苯甲基-N4-(4-第三 丁苯氧乙釀基_2'-去氧胞甘。 實例13 ：在裝有12/水之驟冷器中，伴隨檸檬酸緩衝劑，與 咪哩之轉酯化反應：從廢液（得自一寡核甘酸合成器）製 備5'-二甲氧三苯甲基-(3·Ν-三氟乙酿基胺丙基)-2'-去氧尿有r 將5毫升含有120毫克5’-二甲氧三苯甲基-(3·Ν-三氟乙酿基 胺丙基>2·-去氧尿甘-3’-基氰乙基—Η·膦酸酯之廢液（得自一 DNA 合成器中）流進8〇毫升甲醇溶液（每50毫升甲醇中含有1克 咪唑）中。在2〇 - 25°C下，讓反應持續進行3天。用8毫升水 稀釋反應混合物。然後將一含有30克碘、20毫升水、200毫 升n比啶和75〇毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中。溶液 加入量必須使得碘之棕色能維持至少5分鐘。利用眞空蒸發 法將反應混合物濃縮成一微黃色固體，而後溶入由50毫升 ρΗ:3·4之緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。緩衝劑 之成份爲：每升水溶液中含有24克Na0H、117克檸檬酸和35 克氯化鈉。將含有咪唑之水相分離出來，然後用二次50毫 升緩衝劑再將有機相萃取一次。然後所得之有機相再先後 用碳酸氫鈉飽和水溶液及50毫升氯化鈉飽和溶液萃取之。 將所得之有機相放在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利用過濾方 式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-10毫升乙酸 乙酯中，然後慢慢地將溶液流進25〇毫升正戊烷中。產物以 白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後，用50毫升正戊 烷淸洗’然後在眞空狀態下，在P401Q/K0H上乾燥24小時， 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS〉从規格（210x297公釐） --L---i-----1 1裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -33 - B7五、發明説明（） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 即可得80毫克（理論値之86%) A二甲氧三苯甲基-(3_N-三氟 乙醯基胺丙基>2'-去氧尿苷。 iH-NMR: (CDC13,標準=TMS，d [ppm]): 7.45 - 6.9: m，9H，DMTr; 6.73: 2m, 4H, DMTr; 6.48: 6, 1H, 1'; 4.56: m, 1H, 3'; 4.04: m, 1H, 4'; 3.7: s, 6H, DMTr; 3.5 - 3.4: 2m, 3.35 - 3.25: 2m, 2H, 5'; 2.97: s, 2H, NH2; 2.47 - 2.37: m, 1H, 2'; 2.35 - 2.2: m，1H, 2'; 1.82: m, m, 1H; 1.45 - 1_15: m, 4H,胺丙基。 實例14:從廢液（得自一寡核苷酸合成器）製備5’-二甲氧三 苯甲基_5_(丙炔-1-基)-2’-去氧尿苷 將5毫升含有250毫克(5'-二甲氧三苯甲基-5-(丙炔-1-基)-2'-去氧尿苷-3'-基)-氰乙基-H-膦酸酯之廢液（得自一 DNA合成器 中）流進67毫升甲醇溶液（每5〇毫升甲醇中含有1克咪唑） 中。在20-25°C下，讓反應持續進行3天。用8毫升水稀釋反 應混合物。然後將一含有3〇克碘、20毫升水、2〇0毫升吡啶 和750毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中。溶液加入量 必須使得碘之棕色能維持至少5分鐘。利用眞空蒸發法將反 應混合物濃縮成一微黃色固體，而後溶入由50毫升pH:3-4之 緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。緩衝劑之成份 爲：每升水溶液中含有24克NaOH、117克檸檬酸和35克氯化 鈉。將含有咪唑之水相分離出來，然後用二次50毫升緩衝 劑再將有機相萃取一次。然後所得之有機相再先後用碳酸 氫鈉飽和水溶液及50毫升氯化鈉飽和溶液萃取之。將所得 之有機相放在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利用過濾方式將鹽 去除並將濾液予以濃縮。將固體溶人5 -10毫升乙酸乙酯 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 -34- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 中，然後慢慢地將溶液流進25〇毫升正戊烷中。產物以白色 非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後，用50毫升正戊烷淸 洗，然後在眞空狀態下，在P/VKOH上乾燥24小時，即可 得I25毫克（理論値之6S%) 5'-二甲氧三苯甲基_5_(丙炔-1-基)-2'-去氧尿I。 ^-NMR: (CDC13,標準=TMS，d [ppm]): 7.95: s，1H，NH; 7.4 _ 7.15: m，10H， DMTr; 6.78: 2s, 4H, DMTr; 6.24: t, 1H, Γ; 4.5: m, 3'; 4.06: m, 4'; 3.75: s, 6H, DMTr; 3.28: m，2H，5’： 2.43: m，1H, 2'; 2.22: m，1H, 2’； 1.61: s，3H，丙炔基之 CH3。 實例15 :從廢液（得自一寡核苷酸合成器）製備5'-二甲氧三 苯甲基-5-(3-三氟胺丙炔-1-基)-2'-去氧尿苷 將5毫升含有200毫克51-二甲氧三苯甲基-5-(3-三氟胺丙炔-1-基K•去氧尿苷-3’-基氰乙基-H-膦酸酯之廢液（得自一 DNA合 成器中）流進78毫升甲醇溶液（每50毫升甲醇中含有1克咪 唑）中。在2〇-25°C下，讓反應持續進行3天。用7.8毫升水 稀釋反應混合物。然後將一含有3〇克碘、2〇毫升水、200毫 升吡啶和750毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中。溶液 加入量必須使得碘之棕色能維持至少5分鐘。利用眞空蒸發 法將反應混合物濃縮成一微黃色固體，而後溶入由50毫升 pH: 3-4之緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。緩衝劑 之成份爲：每升水溶液中含有24克NaOH、117克檸檬酸和35 克氯化鈉。將含有咪唑之水相分離出來，然後用二次50毫 升緩衝劑再將有機相萃取一次。然後所得之有機相再先後 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） -35- S2S284 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（） 用碳酸氫鈉飽和水溶液及50毫升氯化鈉飽和溶液萃取之。 將所得之有機相放在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利用過濾方 式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-10毫升乙酸 乙酯中，然後慢慢地將溶液流進250毫升正戊烷中。產物以 白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後，用50毫升正戊 烷淸洗，然後在眞空狀態下，在PA〇/KOH上乾燥24小時， 即可得113毫克（理論値之73%) 5'-二甲氧三苯甲基-5-(3-三氟 乙醯胺丙炔-1-基)·2'·去氧尿苷。 ^-NMR: (CDC13,標準=TMS，d [ppm]): 8.15: s，1H，NH; 7.4 - 7_15: 10H， DMTr, Η6; 6.26: t, 1Η, Γ; 4.53: m, 1H, 3'; 3.97: m, 2H, 5'; 3.73: s, 6H, DMTr; 3.3·· m, 2H，丙炔基之 CH3 ; 2.48: m，1H，2，； 2.25: m，1H, 2,。 實例16 :從廢液（得自一寡核苷酸合成器）製備N_(5'_二甲 氧三苯甲基_3'-去氧胸苷-3'-基)-N-丙基_(5’-去氧胸苷-5'-基)乙醯胺 將5毫升含有200毫克N-(5'-二甲氧三苯甲基-3’-去氧胸苷-3’-基)-N-丙基-(5’-去氧胸苷-3’-基氰乙基-H-膦醯-5’-基）乙醯胺之廢 液（得自一DNA合成器中）流進7S毫升甲醇溶液（每5〇毫 升甲醇中含有1克咪唑）中。在20 -25°C下，讓反應持續進 行3天。用7.8毫升水稀釋反應混合物。然後將一含有30克 碘、20毫升水、200毫升吡啶和750毫升四氫呋喃之溶液加 入反應混合物中。溶液加入量必須使得碘之棕色能維持至 少5分鐘。利用眞空蒸發法將反應混合物濃縮成一微黃色固 體，而後溶入由50毫升ρΗ··3-4之緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混 合成之乳液中。緩衝劑之成份爲：每升水溶液中含有24克 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 .線_ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -36- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 _五、發明説明（） NaOH、1Π克檸檬酸和％克氯化鈉。將含有咪唑之水相分離 出來，然後用二次5〇毫升緩衝劑再將有機相萃取一次。然 後所得之有機相再先後用碳酸氫鈉飽和水溶液及50毫升氯 化鈉飽和溶液萃取之。將所得之有機相放在2克乾之硫酸鈉 上乾燥之。利用過濾方式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將 固體溶入5-1〇毫升乙酸乙酯中，然後慢慢地將溶液流進600 毫升正戊烷中。產物以白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物 過濾後，用50毫升正戊烷淸洗，然後在眞空狀態下，在 PPi。/KOH上乾燥24小時，即可得107毫克（理論値之66%) N-(5·-二甲氧三苯甲基-3’-去氧胸苷基)-N-丙基-(5'-去氧胸苷-5·-基) 乙醯胺。 W-NMR: (CDC13,標準=TMS，d [ppm]): 7.65: s，1H，H6; 7.4 - 7.15: m，9H， DMTr; 7.1: s, 1H, H6; 6.77: 2s, 4H, DMTr; 6.53: t, 1H, 1'; 6.13: t, 1H, Γ; 4.28: m, 1H, 3'; 4.1: m, 2H, 3', 4'; 3.72: s, 6H, DMTr, Μ, 1H; 3.52: m, 4', 1H; 3.5: d, 1H; 3.15 · 2_85: m，3H，5’，乙醯胺之CH2; 2.56: m，1H，2'; 2.45 - 2.25: m，3H， 2，，丙基之CH2; 2.2 - 2.1: 2H，2，； 1.83: s，3H，CH35; 1.45: s，3H，CH35; 1.22: m, 2H，丙基之CH2; 0.73: t 3H,丙基之CH3。 實例17:從廢液（得自一寡核苷酸合成器）製備5’-二甲氧三 苯甲基-2’·丙基-5-甲尿苷 將5毫升含有400毫克(5·-二甲氧三苯甲基-2'-丙基_5·•甲尿 苷)-3·-氰乙基-N，N-二異丙基胺基磷酸酯之廢液（得自一DNA 合成器中）流進100毫升甲醇溶液（每50毫升甲醇中含有1 克咪唑）中。在20-25°C下，讓反應持續進行7天。用20毫 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I 1. I - -II _ -I L: I -1 __·I — I—- i . 訂 丨線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -37- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（） 升水稀釋反應混合物。然後將一含有3〇克碘、20毫升水、 2〇〇毫升吡啶和75〇毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物 中。溶液加入量必須使得碘之棕色能維持至少5分鐘。利用 眞空蒸發法將反應混合物濃縮成一微黃色固體，而後溶入 由5 0毫升pH: 3 -4之緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混合成之乳液 中。緩衝劑之成份爲：每升水溶液中含有24克NaOH、117克 檸檬酸和35克氯化鈉。將含有咪唑之水相分離出來，然後 用二次50毫升緩衝劑再將有機相萃取一次。然後所得之有 機相再先後用碳酸氫鈉飽和水溶液及50毫升氯化鈉飽和溶 液萃取之。將所得之有機相放在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。 利用過濾方式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-1〇毫升乙酸乙酯中，然後慢慢地將溶液流進600毫升正戊烷 中。產物以白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後，用 5〇毫升正戊烷淸洗，然後在眞空狀態下，在P4〇10/KOH上乾 燥24小時，即可得258毫克（理論値之86%)黃色油狀之5'-二 甲氧三苯甲基_2'-丙基_5_甲尿苷。 W-NMR: (CDC13,標準=TMS，d [ppm]): 8_45: s，1H, NH; 7.57: s，1H，H6; 7.45 - 7.15: m, 9H, DMTr; 6.75: 2s, 4H, DMTr; 5.9: d, 1H, 1'; 4.38: m, 1H, 3'; 4.0: m, 1H，4'; 3.95: m，1H，2，； 3.72: s, 6H，DMTr; 3.8 - 3.4: m, 2H，丙基；3.6 -3.3: 4m，2H，5’； 1.56: m，2H，丙基；1.88: t 3H，丙基。 實例18 :亞磷酸酯在一聚合物上之轉酯化反應（以甲醇爲 受體） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝·

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 323284 經濟部中央標準局貝工消費合作社印袋 A7 B7 五、發明説明（） 在20-30°C下，將685毫克控制孔玻璃(CPG)(其與胸苷-5'-氰乙基-H-膦酸酯衍生而得，且載負著核苷，密度爲％毫莫 耳/克）與1〇毫升含有2%N-甲基嗎啉之甲醇溶液反應。核 苷經由一琥珀醯基以共價鍵方式鍵結在控制孔玻璃上之3'_ 羥基。一小時後，137毫克之固體樣品從反應混合物中取 出。撐體用四次2毫升乙腈淸洗後，與含有30克碘、20毫升 水、200毫升吡啶及75〇毫升四氫呋喃之溶液反應一小時。 所得之固體依序用十次2毫升乙腈及十次2毫升***淸洗。 將撐體乾燥後，在55-60°C下，用一濃氨水溶液加以處理， 然後將固體（已無核苷存在）過濾掉。濾液先凍乾並且溶 入0.1M，pH7之乙酸三乙銨中，然後用HPLC分析其成份。結 果檢測出一個含有胸苷-單磷酸酯 '胸苷和胸苷_5'-甲基磷 酸酯之混合物。胸苷_5'_單磷酸酯是由碘氧化及氨解反應後 之抽出物所產生的。胸苷-5’-甲基磷酸酯是在氧化及水解反 應操作中，由胸I·5-甲基膦酸酯在去亞磷醯基化過程中之 一個中間體所產生的。胸苷是在琥珀醯基連接基良化後， 由與聚合物鍵結之胸苷在去亞磷醯基化後之產物中所產生 的。剩下之撐體再進行％小時上述之氧化及氨解反應條 件。胸苷全然在撐體之濾液中得到，總產率約爲80%。 實例19 :亞磷酸酯在一聚合物上之轉酯化反應（以氰乙醇 爲受體） 在2〇-30°C下，將毫克控制孔玻璃(CPG)(其與胸苷-5'-氰乙基-H-膦酸酯衍生而得，且載負著核苷，密度爲％毫莫 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝. 訂 線l· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X 297公釐） -39- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 ___ 五、發明説明（） 耳/克）與10毫升含有10%N-甲基嗎啉之氰乙醇溶液反應。 核苷經由一琥珀醯基以共價鍵方式鍵結在控制孔玻璃上之 3'-羥基。100分鐘後，撐體用四次2毫升乙腈淸洗後，與含 有30克碘、20毫升水、200毫升吡啶及75〇毫升四氫呋喃之 溶液反應一小時。所得之固體依序用十次2毫升乙膪及十次 2毫升***淸洗。將撐體乾燥後，在55 - 60°C下，用一濃氨 水溶液如以處理，然後將固體（已無核苷存在）過濾掉。 濾液先凍乾並且溶入〇.1Μ，ρΗ7之乙酸三乙銨中’然後用 HPLC分析其成份。結果檢測出一個含有5·-胸苷-單磷酸酯和 胸苷之混合物（比例爲3:97)。胸苷·5’_單磷酸酯是由碘氧化 及氨解反應後之抽出物所產生的。胸苷是在琥珀醯基連接 基皂化後，由與聚合物鍵結之胸苷在去亞磷醯基化後之產 物中所產生的。總產率約爲80%。 實例20 ：亞磷酸酯在一聚合物上之轉酯化反應（在二-三氟 醋酸鎂存在下，以甲醇爲受體） 在20_3(TC下，將B9毫克控制孔玻璃(CPG)(其與胸苷_5’-氰乙基-H-膦酸酯衍生而得，且載負著核苷，密度爲36毫莫 耳/克）與10毫升含有0.1M Mg(OTf)2之N-甲咪唑/甲醇（1:9) 溶液反應。核苷經由一琥珀醯基以共價鍵方式鍵結在控制1 孔玻璃上之3'-羥基。3〇分鐘後，撐體用四次2毫升乙膪淸洗 後，與含有30克碘、20毫升水' 200毫升吡啶及750毫升四 氫呋喃之溶液反應一小時。所得之固體依序用十次2毫升乙 腈及十次2毫升***淸洗。將撐體乾燥後，在55_6〇°C下’ ----------；_ 裝-- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2IOX297公楚） -40- 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 32 扣 84 A7 B7 五、發明説明（） 用一濃氨水溶液加以處理，然後將固體（已無核苷存在） 過濾掉。濾液先凍乾並且溶入〇.1Μ，ρΗ7之乙酸三乙銨中， 然後用HPLC分析其成份。結果檢測出一個含有胸苷和胸苷-甲基磷酸酯之混合物。胸¥4-甲基磷酸酯是在碘氧化及水 解反應操作中，由胸甘-5-甲基-H-膦酸酯在去亞磷醯基化過程 中之一個中間體所產生的。胸苷是在琥珀醯基連接基皂化 後，由與聚合物鍵結之胸苷在去亞磷醯基化後之產物中所 產生的。胸苷與胸苷-5’-甲基磷酸酯之比例爲97:3。總產率約 爲 80%。 實例21 :亞磷酸酯在一聚合物上之轉酯化反應（在氯化鋰 存在下，以氰乙醇爲受體） 在20-3〇°C下，將139毫克控制孔玻璃(CPG)(其與胸苷_5'-氰乙基-H-膦酸酯衍生而得，且載負著核苷，密度爲36毫莫 耳/克）與1〇毫升含有0.1MUC1之N-甲嗎啉/氰乙醇(1:9)溶 液反應。核苷經由一琥珀醯基以共價鍵方式鍵結在控制孔 玻璃上之3’-羥基。30分鐘後，撐體用四次2毫升乙腈淸洗 後，與含有3〇克碘、20毫升水、2〇0毫升吡啶及*750毫升四 氫呋喃之溶液反應一小時。所得之固體依序用十次2毫升乙 腈及十次2毫升***淸洗。將撐體乾燥後，在55-6〇°C下’ 用一濃氨水溶液加以處理，然後將固體（已無核苷存在） 過濾掉。濾液先凍乾並且溶入0.1M，PH7之乙酸三乙銨中’ 然後用HPLC分析其成份。結果檢測出一個含有胸甘和胸1-5'-磷酸酯之混合物。胸苷-5'-磷酸酯是在碘氧化及氨解反應操 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---1, 1 裝----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線l· -41 - ^28284 Μ Β7 五、發明説明（) 作中，由胸苷-5-甲基-Η-膦酸酯在去亞磷醯基化過程中之一個 中間體所產生的。胸苷是在琥珀醯基連接基皀化後，由與 聚合物鍵結之胸苷在去亞磷醯基化後之產物中所產生的。 胸苷與胸甘_5'_磷酸酯之比例爲98:2。總產率約爲80%。 L —裝--J I 1 1_ -訂------^線 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -42-

Claims (1)

1. 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 π、申請專利範圍 1· 一種製備天然或合成之核苷、核苷相似體或寡核苷酸之 方法（該寡核苷酸含至少兩天然或合成之核苷及/或核 苷相似體，該天然或合成之核苷或核苷柑似體之鹸性分 子含一未被取代或被取代之一核鹼基Β之自由基，該天 然或合成之核苷、核體或寡核苷酸在5’-位或在3’· 位帶有一式RrO"之保其中艮爲一保護基，在其它 位置爲一自由羥基，或該天然或合成之核苷、核苷相似 體或寡核苷酸係經由一羥基上之氧原子（位於5’-位或3’· 位）直接或經由一連結基鍵結在一固體撐體上，並在其 它位置帶有一自由羥基），該方法包括將式(0、（la)或 〇b)，i J> + 0-CH2CH2-CN(I)，0=4—0CH3 (la)或 Η Η H 之基（式(I)、（la)或(lb)之基係附在天然或合成之核苷、 核苷相似體或寡核苷酸之3啦而在5·-位有一式Rr〇之保 護之羥基，其中私爲一保護基，或一固體撐體，或式 0)、（la)或(lb)之基附在天然或合成之核苷、核苷相似體 或寡核苷酸之5，-位而在3’-位有一式Rr〇-之保護之羥基’ 其中禺爲一保護基，或一固體撐體）轉化成一羥基 -0H，該轉化反應係利用天然或合成之核苷、核苷相似 體或寡核苷酸（帶有式(I)、（la)或〇b)之基者）在有或無 自酸、鹵化烴、騰、竣酿胺及內酸胺一組中選出之惰性 溶劑存在下，與至少100莫耳當量且高達100°莫耳當量過 量之醇（選自含1-20個碳原子之烷醇、含5-12個碳原子之 --------一裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本萸) 訂- i 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） -43 - 3 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製 3284 i! C8 ’ D8六、申請專利範圍 環烷醇、含7-30個碳原子之芳脂醇及含6·30個碳原子之芳 醇）之羥基（每募耳當量之式(I)、（la)或〇b)之基）反 應，反應係在至少一催化量之無機鹸或有機氮鹼存在下 (無機鹸係選自鹼性金屬氧化物、重金屬氧化物及氫氧 化物、金屬氟化物及氟化銨，有機氮鹼之pK値爲‘10, 且係選自芳胺、芳族Ν-雜環及Ν·垸基嗎啉，鹼之催化量 在0.01至20%莫耳範圍內），在-20°C至+55°C之溫度範圍 內進行。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中之溶劑爲四氫呋喃 或二Df烷。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中之溶劑係由乙_、 丙腈、苯甲膪及苯乙腈組成之一組中選取者。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中反應係在15°C至35Ϊ 之溫度範圍內進行。 5·如申請專利範圍第4項之方法，其中反應係在室溫下進 行。 &如申請專利範圍第1項之方法，其中之醇係含1至20個碳 原子之烷醇。 I I— I— I— I— n HIL· 訂 n-^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） -44 - A8 B8 C8 D8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^、申請專利範圍 7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中之醇係含1至6個碳 原子之烷醇。 8. 如申請專利範圍第6項之方法，其中之醇係由甲醇、乙 醇、正-及異丙醇、正-、異-及第三丁醇、戊醇、己醇、 乙二醇、二甘醇單甲-及單***組成之一組中選取者》 9·如申請專利範圍第7項之方法，其中之醇係含1至4個碳 原子之烷醇。 10. 如申請專利範圍第8項之方法，其中之醇爲甲醇。 11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中之醇係含5至8個碳 原子之環烷醇。 12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中之醇係由環戊醇、 環己醇、甲基環己醇、環庚醇及環辛醇組成之一組中選 取者。 13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中之醇係含7至20個碳 原子之芳脂醇。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中之醇是由未被取代 或被烷基或烷氧基取代之苯甲醇及屮苯乙醇組成之一組 中選取者。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 .——絲 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） _ 45 - 323284 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A8 § -D8六、申請專利範圍 15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中之醇係含6至12個碳 原子之芳醇。 16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中之醇係由酚、萘酚 及未被取代或被烷基或烷氧基取代之酚或萘酚組成之一 組中選取者。 17·如申請專利範圍第1項之方法，其中之無機鹸係由鹼性 氧化鋁、鹸性二氧化矽及氟化鉀(KF)組成之一組中選取 者。 18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中之有機氮鹸是由咪 唑、吡啶、聚乙烯吡啶、N-甲基嗎啉、苯胺及鄰二胺基 苯組成之一組中選取者。 19. 如申請專利範圍第1項之方法，其中使用親核性催化反 應之額外催化量之無機鹸。 20. 如申請專利範圍第1項之方法，其中使用額外催化量之 路易士酸。 21. 如申請專利範圍第1項之方法，其中之醇爲氰乙醇。 --------1 裝----訂-------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐〉 -46-