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五、發明説明α) 本發明係有關多肽及其製法。多肽係分離自水蛭 Hirudinaria mani I lensis〇此等多肽具有抗凝血_性質。 最常見的抗凝血劑多肽可能屬於水姪族群。水姪素是一 種眾所遇知且明確特擻化的多肽類凝血_抑制劑i，2,凝血II 抑制劑最初係分離自醫用水挂H i r u d 〇 medicinal is〇更恃 定而言，凝血_抑制劑經由離子交互作用與凝血誨結合， 因而防止缕維蛋白元被裂解成锇維蛋白，及進而防止生成 纖維蛋白凝塊。於動物研究中，水蛭素被驗證可有效用於 預防靜脈血栓、血管分流阻塞，及凝血誨誘生之瀰漫性血 管内凝血。此外，水蛭素之毒性低，抗原性少或無及由循 環中廓淸時間極短。 曽經自不同種水經Hirudinaria mani 1 1 e n s i s中分離出 具有抗凝血性質之多肽（EP-A-0347376及WO 90/05143)。 此種水捉就發生學而言，比H i r u d 〇 medicinal is更為進化 水 與 像 列 序 酸 基 胺 之。 狀同 等不 此型 , 異 肽變 劑素 血姪 凝水 抗之 成知 合 已 可它 ，其 此及 因素 ，蛭

Tk 7t 閲 背 而 之 注 意- 事 項 # Λ®' % 本 Τι 訂 線 經濟部中央榣準局！3：工消伢合作杜印51 性 活 ：气肽 血多 凝之 抗列 有序 具酸 肽基 多胺 穎下 自新如 得種括 析三 包 分現種 曽發一 等果供 吾結提 〇 明 劑 製 之 蛭 水 發 本 此 如 本紙張尺度逍用中困H家標準（CHS)肀4規格（2丨0x29/公;¢) 81. 2. 20,000 Α6 Β6 五、發明説明（2

(i) PI

Val*Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu 1 5 10 15

Cys Val Gly Gly Asn (Levi Cys Gly .Gly Gly Ly-φ His Cys Glu Met . ' 、、... .. 20 25 30 ，~~ !

Asp Gly^ Ser Gly Asn Cys Val Asp ,fily Glu Gly Thr Pro Lys 35 !40 45

Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu lie Pro Asp Glu 50 55 60

Yaa lie Leu Asn Zaa; 65 (ii) P2

Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu 1 5 10 , 15 · 厂

Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn cys Gin /Leu + i 20 25 1 \ 30

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Pro Lys Ser ,Aln Thr Glu "bly Asp Phe Glu Glu lie Pro Asp Glu 50 55 60

Yaa lie)Leu Asn [^aa;或 '(iii) P3

Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu 經濟部中央橾準局印u {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 5 10 15

Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gin Leu 20 25 30

Ser Ser Ser Gly Asn Gin Cys Val His Gly Glu Gly; 35 40 甲 4(210X297 公爱） 經濟部屮央標準局β工消奸合作社印3i 五、發明説明（3 ) 及其藥學可接受性鹽。 依據三字碼，可提供胺基酸殘基（Eur.J.Biochen.138， 9 -37,1 984 )。殘基 Yaa 代表 Asp 或 Tyr 殘基；及 Zaa 為-OH, 鹽可為加成鹽。鹽可為與下列酸所生成之 鹽：無機酸如氫鹵酸、如氩氛酸；硫酸；磷酸；或焦磷酸 。鹽可為與下列有機酸所生成之鹽，例如苯磺酸、對甲苯 磺酸、甲磺酸、乙酸、乳酸、棕櫊酸、硬脂酸、蘋果酸、 酒石酸、抗壊血酸或檸檬酸。多肽也可含有游離羧基，因 此，可呈銷、鈣、鉀、鎂或銨鹽，或呈與生理可耐受性有 機含氮鹼所生成之鹽。多肽也可呈内鹽型式。 因此，本發明之多肽主要像由胺基酸序列（i)至（iii)所 組成。天然單離自Hirudinaria mani llensis水經之多肽 ，具有胺基酸序列（i)或（ii),[其中Yaa為Asp,及Zaa為 -0H]或為部分胺基酸序列（iii)。本發明之多肽可經分離 及純化用做抗凝血_劑。 所生成之多肽前方可帶有全醱或部分前導子序列。前導 子序列，就獲得多肽之細胞而言，可為天然或外來前導子 序列。前導子序列可指導細胞分泌多肽。二種本發明之天 然多肽被表現呈具有前導子序列，該前導子序列隨後被割 裂。因此，存在有此前導子序列之全部或一部分，該序列 為：

Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys lie Cys Val Ser Gin Ala. 依本發明之天然多肽或其鹽，可經由從H_irud.inar ia 本紙张尺度边用中國Η家楳準（CNS) 規格（210x297公犮） 81. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注良事項#_婿窍本頁^ 裝· 4 Λ 6 η 6 本年朽丨 補充 五、發明説明（4 ) man i 1 1 ens i sg水蛭之組織或分泌液中分離所述多肽或其 藥學可接受性鹽而製備。特別，本發明之多肽可經由依 W0 90/05143獲得一製劑，及隨後，令該製劑接受高壓液 相層析而得。 依本發明之多肽或其鹽，也可藉下述方式製備： (a) 提供一寄主，以包括编碼該多肽之DNA序列之表現媒 介將其轉形，轉形之條件為能使多肽被表現於該寄主内者 ;及 (b) 分離如此所得之多肽或其藥學可接受性鹽。 此種方法基本上傜先製得编碼所欲多肽之核哲酸序列， 及於重組生物體内表現該多狀。培養遣傳上經改質的有機 髏，可生産具有完整生物學活性之期望産物。因此，本發 明又提供 -包括编碼本發明多狀之DNA序列之表現媒介； -使用本發明之可相容表現媒介轉形之寄主；及_ -编碼本發明多肽之DNA序列。 可表現本發明多肽之寄主傺藉本發明可相容表現媒介轉 形寄主而製得。表現媒介可藉下述方式製備： (a) 化學合成编碼本發明多肽之DNA序列；及 (b) 將該DHA***表現媒介内。 此外，表現媒介可藉下述方式製備： (a )由 Hirudinaria m a n i 1 1 e n s i s 水桂之 ibRNA 生産及分離 编碼本發明多狀之cDHA;及 (b)將分離得之cDNA***表現媒介内。 結果，經由於可表現多肽之條件下提供經轉形的寄主可 本紙張尺度遑用中國ΒΙ家標準(CNS)甲4規格(210x297公*)嫌··^ (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫木页) 裝· 線. 經濟部中央檁準局貝工消费合作社印製 2. Θ 5 5 Λ 66 ΛΒ 經濟部屮央標準局Α工消奸合作社印5i 五、發明説明（5) 製備依本發明之多肽。當使用真核寄主時，多肽可以糖基 化之形式獲得。多肽可以此形式被分離，或以藥學可接受 性鹽之形式被分離。如此，依本發明之多狀或鹽可以純質 形式獲得。 本發明之多狀可經由於任一端或兩端藉胺基酸延長而改 質。由此種延長的序列所組成的多肽，當然仍然具有抗凝 血_活性。例如，至多30胺基酸殘基之短序列，可提供於 任一端或兩端。 本發明之多肽可接受一種或多種轉譯後修改，例如多肽 鏈之硫酸化，-COOH醯胺化，醛基化，或化學修改。舉例 言之，於羧端具有甘胺酸殘基之多肽可使用肽基甘胺酸ct -醛胺化單氣化誨（PAM誨）進行誨醛胺化。 欲求藉重組DNA技術生産抗凝血誨多肽，因此製備编碼 本發明多肽之基因。DNA编碼序列典型地不含内作用子。 DNA序列經分離及純化。基因***表現媒介内可驅使生産 重組産物。DNA序列可為cDNA序列。DNA序列可為合成DNA 序列。合成基因典型地像經由以化學方式合成寡核苷酸， 而其全體相當於期望之基因者而製備。隨後，將寡核苷酸 組配而獲得該基因。 因此，基因可由六個化學合成的寡核甘酸組成，各寡核 苷酸代表雙股DNA基因中之各股之1/3。寡核甘酸經接合及 配對而得期望的.基因。若有所需，基因序列可藉位址>導引 之突變改質，而引進一個或多個字碼子的變化。典型地， 基因構成於兩端具有限剪址，俾便隨後操作之用。 請 先 閲 讀 背 而· 之 注 意_ 項 堝 % 本 本紙張尺度边用中81國家樣準（CNS) ^規格（210X297公货) 81. 2. 20,000 9.1 五、發明説明（6 ) 可提供一 DNA序列，其尚编碼前述前導子肽者。前導子 肽可指導表現該多肽之細胞分泌該多狀。編碼剪導子肽之 序列通常一與编碼多肽之DNA序列之5,端融合。 當箱要於細菌寄主，例如大腸捍睫内表現時，前導子肽 可為ΟπρΑ前導子狀。當於昆II細胞内表現時，前導子狀可 為水経性口炎病毒G蛋白質（+VSV G蛋白質）之前導子肽。编 碼OnpA與VSV G蛋白質前導子序列之適當DNA序列為：

OmpA前導子 : ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT 42 TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC 63 裝· VSV G蛋白質前導子： ATG AAG TGC CTT TTG TAC TTA GCC TTT TTA TTC ATT GGG GTG 42 AAT TGC 48 經濟部屮央楳準而貝工消设合作杜印32. .可提供一種编碼融合蛋白質之DHA序列，此蛋白質可經 割裂而釋放出本發明之多肽。可使用一種DH A序列，其编 碼一種載體多肽序列，此序列傺經由可割裂的鍵聯而與本 發明之多肽之N-端融合者。可割裂的鍵聯為可藉溴化氣割 裂者。 欲表現多肽，可構築一種表現媒介，其包括编碼多肽之 DN A序列，及當提供於適當寄主體内時，其可表現該多肽 者。提供適當轉錄一及轉譯控制之元體，包括DNA序列之起動 子，轉錄終結址，及轉譯起始與中止字碼子。DNA序列提 供於正確譯讀區内，因此多肽可於與該媒介相容的寄主體 内表現。 81. 2. 20,000 本紙》尺度边用中國a家標準(CNS) Ή規怙(210x297公：¢) Λ 6 Π 6 五、發明説明（7 ) 表現媒介典型地包括一複製起點，及若有所需亦可包括 一選擇性標記基因，如抗生素抗藥性基因。起動子以可蓮 t 作方式與编碼與該多肽之DNA序列聯結。表現媒介可為質 體。該種情況下，以將選自Ptrp與Plcc/lac起動子之任一 起動子與DNA序列以可蓮作方式聯结為較佳。另外，表現 媒介可為病毒。病毒可為重組體桿病毒，於其中，多面蛋 白起動子與编碼該多肽之DNA序列以可蓮作方式聯結。 可表現該多肽之表現媒介，可以任何便利之方式製備。 编碼多肽之DNA序列可***表現媒介，如質體媒介，之適 當限剪址。重組體桿病毒可藉下述方式製備： (i) 將编碼多狀之基因選殖入桿病毒轉移媒介内，殖入 位置位在多面蛋白起動子下游之一限剪址；及 (ii) 使用得自步驟U)之重組轉移媒介及完整的野生型 桿病毒DNA共同穿染對桿病毒感染敏感的昆蟲細胞条。 (請先閲讀背而之注意事項#.構寫本^ 象 現 組 2 源 同 現 出 桿 組 重 3 之 因 基 肽 多 有 帶蛋 撝面 游多 下在 子為 動可 起介 白媒 蛋移 面轉 多毒 在病 得桿 獲。 而毒 ，病 1; Γ 組 重 得 所 ο 者 址 殖 選 待 獨 有 具 游 下 子 碼 字 始 起 G T A 白 經濟部屮央標準局员工消赀合作杜印製 N 提 質頭 白接 蛋合 面融 多於 中可 其 ， ’示 質所 白 前 蛋如 合 〇 融合 為融 物-¾ 産 Ν ο 的之聯 現肽鍵 表多的 後與裂 隨偽割 毒分可 病部一 桿端供 驟 步 e t 一 P ο d ο ρ sj yfv 蟲 粘 地 草 為 地 型 典 胞 細 蟲 毘 之 用 所 娥 夜 紋 艮 金 蓿 苜 為 地 型 典 毒 病 桿 型 生 野 ο 胞 細 \»/ a d ρ 多 以 胞 )ο細 V ρ ο CN内 (Α主 毒寄 病當 髏適 面一 多於 核供 丨提 介 媒 現 表 之 肽 多 碼 编 將 本紙張尺度逍用中困ffl家標準（CNS)肀4規格（2〗0父297公龙) 81. 2. 20,000 9Λ _._nj_ 五、發明説明（s) 肽基因轉形。於可表現多狀之條件下提供經轉形之寄主。 舉例言之，培育經轉形之細胞，以使其表現。任何可相容 之寄主-媒介条統皆可被使用。 * 經轉形寄主可為原核或真核寄主。可使用細菌或酵母寄 主，如大腸桿菌或啤酒酵母。可使用革蘭氏陽性菌。較佳 細菌寄主為大腸桿菌B型種糸。另外，可使用昆蟲細胞， 該種情況下，適合使用捍病毒表現条統。昆蟲細胞典型地 為岸地粘蟲細胞。另一取代之道，可將哺乳動物細胞糸之 細胞轉形。可提供於其中可生産多肽之轉移基因動物，例 如非人動物。 表現出之多肽經分離及純化。可得具有前述胺基酸序列 (i)、 （ i i)或（i i i)中之任一者，且前方帶有來自轉譯起始 字碼子Met殘基的一種多肽。另外如前所述，可得一種融 合蛋白質，其中包括本發明之多肽之胺基酸序列，亦即如 内 ),質 *1 ( 白 列蛋 序 合 上融 或 於體 當載 〇 與 列i) 序(ii 0 ( 載 之11 /IV 合 融） • 1 Λ ( 與列 及序 ，酸 i)基 • 1 .1 胺 /ίν 於 介 或 經濟部+央標準局貝工消伢合作社印製 割 備 切 製 劑。式 學肽方 化多述 當之下 適i)藉 用11可 使 i1t & 或 S 經il性 可{受 -),接 時(i可 聯列學 鍵序藥 當酸其 適基或 1 胺肽 供有多 提具之 , 出 明 間釋發 列而本 序 ， 鹽 性 受 接 可 學 藥 其 及或 肽 肽多 多之 述得 所所 成此 合如 學離 化分 列多 及序得 酸肽所 基多 ， 胺之需 一 望所 單期有 由呈若 > » ο 成偽法 合肽液 學之溶 化成或 藉生法 可先相 肽預固 多酸用 , 基使 此胺可 因上 。 以成 二 或 二 或 而成 積轉 堆可 者肽 本紙法尺度边用中a Η家楳準（CHS) T4規怙（210X297公；a·) 81. 2. 20,000 214556 A 6 Π 6 經濟部中央櫺準而EX工消份合作社印製 五、發明説明（9) 藥學可接受性鹽。 於固相合成中，期望之多肽之胺基酸序列，可依次由與 不溶性樹脂結合的C -端胺基酸接績構築而成。當生成期望 之多肽後，將該多肽由樹脂上裂離。當使用溶液相合成時 ,期望之多肽再度可由C-端胺基酸構築而成。此酸之羧基 於整髏過程中藉適當保護基所封阻，保護基於合成結束時去 除。 無論採用固相或溶液相技術，加至反應条統之各胺基酸 ，典型地具有經保護之胺基與活化羧基。官能側鏈基也經 保護。各步驟完成後，去除胺基保護基。側鏈官能保護基 通常於合成全部結束時去除。 多肽可被轉成藥學可接受性鹽。多肽可與有機酸或無機 酸形成酸加成酸。適當的酸含乙酸、丁二酸及鹽酸。另外 ，肽可轉成羧酸鹽，如銨鹽；或鹼金屬鹽，如鈉或鉀鹽。 多肽或其藥學可接受性鹽，連同其藥學可接受性載劑或 賦形劑可以藥學組成物型式使用。此種調配劑典型地僳供 靜脈投藥用（該例中，載劑通常為無菌鹽水或具有可接受 純度之水）。依本發明之多肽可對抗凝血_，適用於治療 血栓栓塞病情，例如典型地用於病人治療血液凝固。因此 ,多肽可用於治療及預防血栓及血栓栓塞，含預防手術後 血栓，用於急性休克治療（例如敗血病性休克或多外傷性 休克），用於治療消耗性凝血病變，用於血液滲析、血液 分離，及髏外血循環。於本發明之一具體例中，多肽或其 鹽可與胞質素原活化劑，如組織胞質素活化劑一起投藥。 (請先閲讀背而之注意事項砰碼寫本一^ 裝- *?r_ 線· 本紙张尺度边用中a困家楳準（CNS)T4規格（210X297公及） S1. 2. 20,000 Λ 2 6 6 ΛΒ 五、發明説明（υ)) 劑量待別依據待定投藥型式及治療或預防目的而定。各 別劑量大小及用法用量，最好經由各別判斷待定病例而決 定；決定此目的所需之相關血液因素之方法為業界人士所 習知。以注射治療有效量之本發明化合物為例，劑量範圍 通常係由約0.005至約0.1mg/kg醱重。以約0.01至約0.05 mg/kg髏重之範圍為較佳。可經由靜脈、肌肉或皮下注射 途徑投藥。如此，依投藥模式而定，以單一劑量供非經腸 道投藥之藥學組成物於每劑中含有約0.4至約7. 5ϋ®本發明 之化合物。除活性成分外，此等藥學組成物通常也含有緩 衝劑，例如磷酸鹽緩衝劑，俾將Ρ Η值維持於約3 . 5至7間， 同時也含有供調整等張度用之氣化鈉、甘露糖醇或山梨糖 醇。藥學組成物可呈凍乾或溶解型式，有利地，溶液劑可 含有具抗菌活性的保藏劑，例如由0.2至0.3%4_羥苯甲酸 甲酯或乙酯。 經濟部屮央標準局Α工消伢合作社印製 局部施用組成物可呈水溶液劑、洗劑或膠漿劑、油溶液 劑或油懸浮液劑或含脂肪，或特別經乳化，軟資劑型式。 水溶液劑型式之組成物，例如可經由依本發明之活性成分或 其治療可接受性鹽，於例如由ΡΗ4至ρΗ6.5之含水緩衝液内 ,若有所需，加入其它活性成分例如消炎劑，及/或聚合 物粘合劑，如聚乙烯吡咯啶酮及/或保藏劑而得。活性成 分之濃度為由約0.1至約1.5呢，較好由0.25至1.0mg,於 10uil溶液劑或10S膠漿劑。 供局部施用之含油型式，例如可經由依本發明之活性成 分或治療可接受性鹽溶解於油，且非必要地添加膨脹劑， 81. 2. 20,000 (請先閲請背而之注意事項/}:填寫本|4 本紙張尺度逍用中a困家楳準（CNS) τ4規怙（210x297公及) 214556 Λ 6 Β 6 經濟部Ψ央標準局貝工消奸合作社印驭 五、發明説明（U) 如硬脂酸鋁，及/或H L Β值（”親水-親油平衡"）低於1 0之界 面活性劑（tensides),例如多羥基醇之脂肪酸-酯，如甘 油-硬脂酸酯、聚山梨糖醇-月桂酸酯、聚山梨糖醇-硬脂 酸酯，或聚山梨糖醇-油酸酯而得。含脂肪之軟資劑，例 如經由依本發明之活性成本或其鹽懸浮於可展佈之脂肪基 劑内，且非必要地添加H L B值低於1 0之界面活性劑而得。 乳化軟蕾劑可經由將依本發明之活性成分或其鹽之水溶液 ，於軟性可展佈之脂肪基劑内，藉添加HLB值低於10之界 面活性劑研製而得。所有此等局部施藥之劑型也含有保藏 劑。活性成分之濃度由約0.1至約1.5mg,較好由0.25至 1 . 0 η®於約1 0 g基劑。 除前述組成物及其意欲直接供人體或哺乳動物體醫療用 之藥學組成物外，本發明也傷關於供人體或哺乳動物活體 外藥用之藥學組成物及製劑。此等組成物及製劑待別可用 做血液之抗凝血劑添加劑，此等血液偽接受體外循環或處 理者（如於人工腎臓之體外循環或滲析）；用於保藏或改質 (如血液分離）。此等製劑，如備用溶液劑或另外單一劑型 製劑之組成類似前述注射劑；然而活性成分數量或濃度有 利地係基於有待處理之血液容積，或更精確而言，基於凝 血豳含量。就此方面而言，需記住依本發明之活性成分 (呈游離形式）可使約5倍重量比之凝血_完全去活化，甚 至於相當大童時對生理也無害，卽使於高濃度也可快速由 循環血液中清除，因此並無用藥過量之危險，即使例如於 輸血當中亦如此。依持定目的而定，適當劑量像由約0.01 (請先閲讀背而之注悫事項孙砥寫本一^ 裝- ，?τ_ 線· 本紙張尺度逍用中因因家楳準（CNS) 規格（210X297公址) 31. 2. 20,000 Λ 6 η 6 -- 五、發明説明（12) 至約1.0mg活性成分/义血液，但仍可毫無危險地超過上限。 下列實施例示例說明本發明。 附圖中： 第1圖為顯示例1.HPLC分析結果之層析圖。P1至P3代表 由依例1之製劑所得的三不同峰，FT為流經之流；而4-AB 為4-胺苯甲脉。 第2圖顯示例2 (b)對經胰蛋白_消化所得之PE-P1 (A)及 P E - P 2 ( B )所得之溶離圖。 第3圖顯示编碼對應於峰2(P2)之大多數蛋白質（其中位 置bl之胺基酸殘基為Asp,而多肽鏈之最末胺基酸為Asn64 )之六寡核苷酸之核苷酸序列。粗體字所示序列代表供進 一步構築用之Ball址。圖中下部顯示組配六寡核苷酸之模 式。含括HUdn及Pst I址俾允許随後之操作用。 第4圖顯示中間質體M13-P2之構築圖，質體M13-P2為所有 進一步P2構築用之Ball-BaraHI DHA 段之來源。 (請先閲讀背而之注意事項寫本頁^ 訂_ 體 組 歐 2 穎 新 示 顯 解 圖 以 圖 5 經濟部中央標準而兵工消奸合作社印(|1'|4 , 子 劃 築導方 構前下 之 。則 P2因端 P-基粘 Μ 2 ο ρ Π in整 c 亦完Hi , 的及 13結端 1聯鈍 肽II 子Ba 導而 前 ， PA示 ΟΠ1顯 與字 有體 帶粗 擄以 P2列 第P-序 OM肽 線 示 顯 式 方 解 圖 以 圖 6 第 捍 腸 大 於 用 係 其 築 構 之 體 質 之 質 白 蛋 體 質 之 2 P 産 生 菌 桿I 腸 大 於 用 示 顯 P 9 圖 産 7 生第 菌_ 般 1 之 , 下 體之 質制 穎控 新錄 種轉 此之 備 C a 製/1 來PP 術P1 技子 作動 操起 因髏 基交 統雜 傳於 用處 使係 等因 吾基 2 ο P 造中 構其 81. 2. 20,000 本紙ft尺度遑用中a困家標华（CNS)，丨，4規岱（210><297公龙） CC Γ9 66 ΛΠ 菌 3 用 二R«--|此I*®顯 .vt 於夕 5Θ Ϊ使核8 、卽之第 桿 Μ 大I 至 泌 分 2 Ρ 使 gg 留 可 仍 肽 子 導 前 A P B ο 中 成 合 及 列 序 酸 甘 核 之 2 Ρ 泌 分 胞 細 蟲 昆 由 以 表 代 列 序 之 示 顯 體 粗 ο 配 組 之 酸 苷 〇 核肽 寡子

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之轉 介待 媒有 移將 轉做 之用 組泛 因廣 基 ， 毒體 病質 桿始 做起 用為 SYMI 曾 C A , P 示 〇 顯築 解構 圖之 圖P2 0 -1A C 第PA 列 序 酸 “甘 核 之 酸 苷 核 寡 成 0 合 體碼 受编 接之 之點 列起 序鍵 源P2 異示 的顯 毒圖 病11 至第 移 示 表 體 粗 以 子 碼 現 表 内 胞 於 用 P 體 ^ Μ AT此 碼 ， 编築 之構 基之 殘T1 酸CF 胺PA 蛋示 外顯 額解 〇 圖 配圖 組12 其第 及 介 媒 移 轉 穎 新 為 圖 3 第 T F C A P sn 亦 圖 表 代 解 圖 之 酸 基 〇 胺組 18因 首基 之毒 質病 白桿 蛋至 面移 多轉 與列 而序 , 源 列異 序將 P2於 整用 完曾 帶體 搛質 體此 質 〇 此結 ，聯 (請先閲讀背而之注悫亊項再'项寫本5- 經濟部屮央標準局貝工消坨合作杜印製 第 * *

中 圖 Ο 圖 表 代 解 圖 之 鏊 οΜ ? thl°_ E 弓 Ac頭 R接 之 7 1 用 T JJ 端 3 增 擴； 供 一 圖 T 表 代 被 圖 意 示 中 驟 步 各 〇 各 用中 α 利圖子 以 。引 加圖頭 何表接 如代及 物解子 産圖引 穎之頭 新畫接 計 1 E T 成 c d 生RA表 所之代 驟 用 t 步端 *151 前增 = 明擴 一 說供」 僅圖ττ 成15ΤΤ 化第** 簡 f 産 穎 新 的 成 生 所 驟 步 一 前 明 說 僅 成 化 簡 被 0 圖用 意利 示以 ，加 1 中何例 驟如施 步物實 本紙張尺度逍用中國Η家楳準（CN5) Ή規格（2丨0x297公；¢) S1. 2. 20,000 經濟部屮央標準局A工消设合作杜印製 9.1JLLl5_& 五、發明説明（Μ) 遵照如下a)及b)所示程序，依據WO 90/05143由 Hirudinaria mani 1 lensis水搜製備抗凝血_製劑： a )丙酮抽取 經乙醇乾燥的水姪頭（2920s)經剁成小Η及以混合物40 :60丙酮/水（7.5义）處理。於室溫藉攪拌均化後，混合物 於2,700γρπ離心15分離，及傾析上清液；九粒再度懸浮於 40: 60丙酮：水混合物内，攪拌30分鐘，及混合物於 2 , 7 0 0 r p m離心1 5分鐘。上清液與初次上清液匯集，及以冰 醋酸（體積8.5义）酸化至PH4.5。混合物於2,700γ·ριβ離心15 分鐘，然後，傾析上清液，及藉加入30¾氛將溶液之pH調 整至P Η 6 . 0。於3 5 旋轉蒸發後，濃溶液之p Η降至1 . 8 ;藉 離心去除沉澱污染物及使用9倍過量之丙酮由混合物中沉 澱抗凝血_原料。然後，將混合物離心，將丸粒再度懸浮 於丙酮，及再度離心。隨後凍晶乾燥沉澱的物料。 b )離子交換純化作用 抗凝血誨原料於水中重新調製，對PH4.0之10mM乙酸銨 缓衝液滲析，及填充至預先以該緩衝液平衡的羧甲基西伐 羅斯（Sepharose)柱（CM西伐羅斯，Pharniacia，2.6x 30cm ) 上。以起始缓衝液洗滌100®义後，以20πιΜ乙酸銨PH4.5溶 離抗凝血_活性部份，經收集及匯集（1.3义）。供進一步 純化作用之用，匯集之溶離分於MUitan裝置（Millipore) 内濃縮成0.5JL ;濃溶液以HaOH中和，然後施於以20ΠΜ Tris-HCil ΡΗ7.0平衡的Q西伐羅斯柱上。結合物料以0-1Μ NaCJL於起始缓衝液之線性梯度溶離。匯集含抗凝血誨活

Th 先 Ml it： 背 而 之 注 意* 事 項 再 塥· 寫 本 訂 線 本紙张尺度逍用中a B家標準（CNS) 規格（210x297公：!!：> 81. 2. 20,000 Λ 6 ^^- 五、發明説明（15) 度之溶離分，經濃縮，及於Superdex S-200柱上脱鹽，使 用20nM Tris-HC儿.PH7.5以4m义/min之流速溶離。藉 Minitan濃縮凝膠過濾所得之活性匯集物，且進一步藉微 弱陰離子交換層析（DEAE FPLC)純化。活性物料填充至蛋 白質Pak DEAE-5PW柱（Waters)上，及使用含0-1M NaC义之 20inM Tris-HC 儿（pH6.5)以 1.0raJL / min之流速梯度溶離。 匯集活性溶離分，將蛋白質含量及活度（比活度：800ATU/ mg)予以待徽化，及於SpeedVac濃缩機（Savant)内凍晶乾 燥。 裝- 然後，如此所得之部分純化物料（比活度：-S04ATll/fflg ) 又接受二次層析步驟，俾獲得均勻多肽，如下c)及d)·所述： c)凝血_ -西伐羅斯 線- 經濟部屮央榣準局A工消赀合作杜印製 商用牛凝血_ (Sigma)依據Lundblad(S〇所述程序進一步 純化，然後遵照製造商指示，附著於經活化的西伐羅斯C L 6B(Phar*niacia)上。柱（1.7mJL)以 50raM Tris-HCJL pH8.3 平衡，及得自DEAE-FPLC之凍乾物料（於缓衝液内重新調製 )填充於柱上。柱以起始缓衝液，隨後以含3.0M NaC儿之 相同缓衝液，然後，再度以起始緩衝液洗滌三次（每次洗 滌液為柱之三倍髏積）。流速為0.3 m义/min。结合物料以 1 0 it文 0 . 1 Μ 4 -胺基苯甲）^於2 5 m Μ H C义溶離。匯集活性溶 離分及於50raM Tris-HC文 ΡΗ8.3交換缓衝液至PD-10柱 (Pharmacia)上 〇 經由以起始缓衝液洗滌，但仍含有抗凝血iS活性之由柱 中溶離出之未結合物料，再度填充於柱上，直到所有活度 81. 2. 20,000 本紙张尺度边用中8 8家榣準仰5)?4規格（210父297公货) 2 Λ 6 B (5 五、發明説明（16) 皆已結合且被層析為止。 先 閲 ih 背 而 之 注 項 填 寫 本

U)Lundblad，R.L., 1971,生物化學，10: 2501-2506。 d) RP-HPLC 經親和層析所得物料最終藉反相高效層析（RP-HPLC)純 化，此層析係於 C4 Vydac 柱（4.6\ 250111111.5«)使用201!^磷 酸鈉PH7.5做第一溶離劑及50¾乙腈於水（如經修改者）進行 。抗凝血_多肽偽於室溫下使用5¾至55¾溶離劑B以1.0Π!儿 /mi η之流速線性梯度溶離45分鐘。所得層析示於第1圖。 以人工收集蛋白質峰（於2 2 0 n m測得），經真空濃縮，及 於相同條件下再度層析。 C4 HPLC後所得純抗凝血«多肽將蛋白質含量、胺基酸 組成、N -端序列、C -端加以特激化，及藉試管試驗檢定法 (A T I) / N I Η試驗及”凝血_時間”試驗）測其活度。發現蛋白 質三峰各別賦予抗凝血痴活性。 經濟部屮央櫺準局貝工消伢合作社印製 第1圖中，標上Ρ1及Ρ2之多肽完整胺基酸序列，像藉得 自胰蛋白_及V8蛋白_消化之肽做Ν -端定序列而測定。序 列係報告於如上U)及（丨ί)。另一多肽（Ρ3)之部分胺基酸 序列葆報告於如上（i Π )。 實施例2 -吡啶乙基化（PE)P1及P2之胰蛋白_消化作用及肽 圖譜 a)還原/烷基化作用-匯集於凝血_ -西伐羅斯（例lc)上 進行親和層析所純化之活性溶離分，及缓衝液於1 0 π> Μ Tris-HC儿 ρΗ8.3交換至PD-10柱上。於Speed-Vac離心機 (Savant)内離心活性匯集物（約50u g);及於氮下於暗處 本紙张尺度边用中S困家楳準（CNS) 規格（2】0χ297公；¢) 31. 2. 20,000 马1.1讲 Λ 6 Π 6 五、發明説明（L7) 於室溫，使用100«文含1¾ b-氫硫基乙醇之6Μ胍-HCiL/50 nM Tris-HC义（PH8.5)處理2小時。然後，加入4wiL4 -乙 烯-吡啶（淨），及混合物再度如前述培育2小時4。 首先，由反應混合物中回收吡啶乙基化多肽，其回收方 法為於 C4 Vydac 柱（4.6x 250mm，5/jtin)上，藉 RP-HPLC 由 反應混合物中回收，使用含5-65¾乙睛之0.UTFA以1.0UJL /rain之流速線性梯度溶離90分鐘。此等情況下，抗凝血_ 多肽混合物之離析不良，因此必須使用溶離条統磷酸鈉/ 乙腈，以例Id所述之條件再度層析。 b)PE-Pl及PE-P2之胰蛋白誨消化與肽圖譜--純PE-P1及PE-P2(分別為10及20« s)使用經TPCK處理的胰蛋白誨（Sigma) 於200w义之1¾磺酸氫銨pH8.0内，於0.2M磔酸鈉存在下消 化。以_對受質比為1 : 2 0 ( w / w )之比例加入胰蛋白_及於 37t培育4小時。於Savant内進行凍晶乾燥而中止消化作 線. 經沭部中央標準局员工消合作社印利4 用。 經由胰蛋白誨消化所得之肽，於wBondapak C18柱（3.9 X 3 0 0 ηπη , 1 0 // Waters)或 C4-V ydac(4.6x 250_， 5w πι)柱 上分離，分離傑使用5-65¾乙睛於0.UTFA之60niiri。線性 梯度，以1.0niiL / rain之流速溶離（第2圖）。以人工收集溶 離峰，於S a v a n t内濃縮，然後進行胺基酸分析，及於加脈 衝之液相型號477A定序列儀（應用生物条統公司）進行N -端 序列分析。 的 〇 化下 消如 0 示 白顯 蛋 ， 胰果 經結 0 及 之 圖 狀 本紙ft尺度边用中SH家楳準（CNS)T4規格（210X297公龙） 81. 2. 20,000 五、發明說明（18) ’ .A 1-13 14-26 27-36 37-47 37-47(*) 48-64 A 6 Π 6

胺基酸序列 VSYTDCTESGQNY CLCVGGNLCGGGK HCEMDGSGNK CVDGEGTPKPK CVDGEGX^PKPK SQTZGDFEEIPDEDILN (請先閲請背而之注1事哨#^,寫本頁^

1· -13 VSYTDCTESGQNY 14- -26 CLCVGSNVCGEGK 27_47 NCQLSSSGNQCVHGEGX*PKPK 48_ -64 SQTEGDFEEIPDEDILN 裝. 訂* 線- 經濟部中央梂準局ci：工消ff合作社印5i (★) X =藉決定胺基酸序列，無法檢測之殘基； 义經由胺基酸分析c P1及P2之完整胺基酸序列因而爲： £1 Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn.Tyr Cys Leu Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu Met Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu lie Pro Asp Glu Asp lie Leu Asn •本紙ft尺度逍用中國H家標毕(CNS)TM規怙(210X297公货） 81. 2. 20,000 Λ 6 Π 6 五、發明説明（19)Έ2. Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr cys Leu Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gin Leu Ser Ser Ser Gly Asn Gin Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu lie Pro Asp Glu Asp lie Leu Asn 實施例3 : P2基因之化學合成 基於大腸桿菌之較佳字碼子5，設計核哲酸编碼序列。 此外，Ball限剪址經逋傳工程處理而極為接近合成基因之 5’端，俥將此序列***不同的表現媒介内。確實，欲於細 菌與昆蟲細胞内表現重組證P2蛋白質，係使用相同的合成 基因。以昆蟲細胞為例，開發出一種可呈分泌産物或胞質 産物型式獲得蛋白質P2之方法。 所.有質體DNA之操作係如Maniatis等人所述進行6。 六合成互補寡核甘酸傺使用自動化DNA合成儀（應用生物 糸統公司）製備，而其序列示於第3圖。進行·_學磷酸化作 (請先閱讀背而之注意事項ΐφ艰窍本頁( 經濟部屮央標準局貝工消1V-合作社印製 用Ρ1 核體 菌 1噬 1A , Μ 後入 用插 列示 序其 股 ， 雙F2 得3-所Ml 而體 ，質 配髏 nu RU Μ Μ % 重 合得 接獲 圖 4 入 第加 於也. 及 介 媒 3 1A Μ 入 tim 插 因 基 2 P 将 欲 瘥 8B 菌 噬 股 單 於 0 址 I t S P 及 1 d η 列 序 酸 # 核 的 確 正 得 獲 實 證 已 法 驩 質 體 組 3 内 酸 “甘ge 核an 寡 成 合 於 進 方 Γ 來 因 基 2 Ρ 之 介 媒 現 表 用 所 中 例 各 作 用 2 Ρ 源 本紙張尺度逍用中a Η家標iMCNS)甲4規格（2】0χ297公龙） 81. 2· 20,000 Λ 6 Η 6 經濟部屮央榣準局只工消奸合作杜印製 五、發明説明（2U) 實施例4:由大腸捍菌細胞表現及分泌Ρ2 欲使重組産物分泌至胞外質内，需要以原蛋白質形成合 成Ρ2分子。特別於Ρ2之端必須存在有負貴有效分泌之 胺基酸序列，名為”前導子肽” 8,9。然後，此額外序列於 分泌過程中，於活體内藉待定大腸捍菌前導子肽痗割裂去 除，獲得正確的成熟肽1Q。 文獻中曾經敘述多種分泌糸統之例n，12。其中，吾等基 於先前公開的大腸桿菌外膜蛋白質（0 m P A )分泌信號，選擇 条統13。因此，吾等設計出另外二種編碼ΟπιρΑ前導子肽之互 補寡核甘酸，但前方肽已知負責有效轉譯信使RNA之OmpA 1厶 Shine Dalgarno序列 。 如第5圖所示，其序列也含编碼首10個胺基酸之P2基因 起始序列。Ball址之存在使得此合成段與其餘P2编碼序列 得以接合，同時，上游HindM址之存在使得其可與M13媒 介接合。如此，合成的HindM-Ball段與得自M13-P2之 Ball-BanHI段接合，及***M13mpl8内，獲得新穎質體， 各為0MP-P2。此新穎質體構築之示意代表圖，亦示於第5 圖。 自0I4P-P2中，P2基因可以Hindl-BaaHI段被切下，此段 介質 媒白 現蛋 表源 當異 適造 IgaA製 I插量 被大 ne將中 h 段菌 S剪細 PA限於 om該可 碼。統 编列糸 (請先閲請背而之注意事項#堝寫本贾〕

a D Γ 肽 子 導 前 及 序 碼 编 2 P 以 之 繼 現之 表rp 干pt 若子 , 勤 上起 論於 理基 待 用 使 使 即 。 . 平 者水 再現 。表 用之 使肽 地多 功定 成特 被期 曾預 室法 驗無 實也 本 ， 在子 去動 過起 統的 条 0 本紙張尺度边用中a國家樣準（CNS) T4規格（2】0χ297公龙) 31. 2. 20,000 21455ο Λ 6 η 6 經濟部屮央櫺準^A工消"合作社印製 五、發明説明（21) 如第6圖所示，質體PFC33,已述於文獻14。此質體搛帶 有抗生素安比西林抗藥性，及可驅使原載脂蛋白質Α1 (proapolipoprotein Α1)表現之細菌起動子Ptrp。以 Hindi及BamHI消化PFC33後，攜有抗生素抗藥性基因及起 動子fUndlE -BaaiHI大段，經分離且與得自0MP-P2编碼P2基 因之Hindi! -BamHI段接合。此構築細節示於第6圖。吾等 分離出新穎質體，定名為PFC-P2,此乃於大腸桿菌内生成 P 2用之最终質體。 本發明之一目的，偽使用大腸桿菌B型種糸，表現及分 泌P2及本發明之其它抗凝血誨多肽至核外質。確實，吾 等發現將質體PPC-P2***大腸捍菌B型種条内可高度生産 P2。令人感興趣的，不同種条的大腸桿菌無法有效發揮作 用，因此似乎寄主種糸對成功的生成佈夫吉（bufru din)具 有關鍵重要性。 數種大腸桿菌β型種条可取得，且可用於生産P 2。較佳 種条為 ATCC12407, ATCC11303, NCTC10537。以下為使用 質體PFC-P2轉形種糸NCTC10537及隨後.培育轉形髏之一例。 種条NCTC10537之勝任細胞偽使用Mandel與Higa之氯化 鈣程序製備15。約200w文之此等細胞製劑（lx 109細胞/ 毫升）以質體DNA (約略滠度5Wg/mJL)轉形。於含 100U s/mil安比西林之L -瓊脂平板上選出轉形體。二小菌 落以木製牙簽劃線接種（各劃三條線約1 〇»長）。於3 7 Ό培 育1 2小時後，部分劃線經由接種1 0 m儿於L Β培養基（含濃度 150Mg/aJl安比西林），及於37¾培育隔夜，試驗P2蛋白

Tk 先 閲 ifi 背 而 之 注 意 事* 項 % 本 裝 線 本紙張尺度边用中國困家楳準(CNS)T4規格（210x297公:《:) SI. 2. 20,000 磉

經濟部中央#準局A工消奸合作杜印製 五、發明説明（22) 質産量。此培養物以1: 100稀釋於M9培養基内，此培養基 含有等濃度之安比西林，及於37T培育6小時。 20π义之此培養物於12000Xg, 4C離心10分鐘。細菌九 粒再度懸浮於2ιη义之33niM HCil Tris pH8内；然後加入等 髏積之第二溶液33mM EDTA, 40¾蔗糖，全體混合物於37¾ 及溫和振搖條件下培育10分鐘。離心後，經滲透的細胞再 度懸浮於2 m文冷水内，及於冰内放置1 0分鐘。藉離心分離 所得上清液，代表細菌細胞之胞外質部分。 使用發色原檢定，此檢定法基於抑制凝血痴割裂合成受 質S-2238 16之能力，吾等測得Ρ2生産性細胞之胞外質部分 内，存在有抗凝血_活度；但對照胞外質部分内，則否。 使用相同方法，吾等也構築Ρ2之新穎表現/分泌質體， 其中存在有起動子P lpp/la(；而非起動子P t]rp。此不同質體 ，定名P0MP-P2,示於第7圖。此質體***大腸桿菌B型種 糸後，也得高水平活性P2。關於構築P0MP-P2之起始質鼸 ，吾等使用G h r a y b等人所述之質體P I N - I I I - ο m p A317。培育 之條件，及使用異丙基-/9 -D -硫基半乳糖吡喃糖苷（IPTG) 誘導表現之條件，係如前述17。 簧施例5:由昆蟲細胞表現及分泌蛋白質P2 欲從重組體昆蟲細胞獲得分泌之蛋白質P 2 ,吾等將P 2编 碼序列與可由昆蟲細胞有效辨認的前導子肽接合。吾等使 用水疤性口炎病毒（VSV)G蛋白質之前導子肽18。類似於如 前所述，業己製備编碼VSV G蛋白質前導子肽之合成DN A序 列，繼以P 2基因起點，而核苷酸序列击於第8圖。同時於 本紙張尺度遑用中國國家楳準（CNS) Ή規格（210x297公龙） 81. 2. 20,000 Λ 6 Π 6 五、發明説明（23) 本例中，吾等提供便利的限剪址（Hindi, BaniHI及Ball) ，俥允許接合至其餘P2基因上，及接合至表現媒介。 合成HindM -Ball段與得自攜帶有P2基因之M13-P2之純 Ball-BauHI段接合，及***事先以Hindi及BamHI切割的 M13 mpl8内。此種構築獲得一種新穎質髏，定名為VSV-P2 ，示意示於第9圖。由VSV-P2,吾等切下搛帶有與VSV前導 子肽融合的P2基因之BaniHI-BamHI DNA段，其隨後***媒 介pAcYMI19,如第10圖所示。所得質體定名為pAc-P2。 欲於昆蟲細胞内表現，V S V - P 2编碼序列必須於多面蛋白 起動子轉錄控制之下轉移至桿病毒基因組。欲達成此目的 ，吾等同時以野生型桿病毒DNA,及轉移媒介pAc-P2穿染 昆蟲細胞。至於昆蟲細胞，係選用草地粘蟲細胞做寄主細 胞。實驗細節如下： 經由S u m m e r s等人所述程序之修改程序，以代表個別重 組體轉移媒介之感染性AcMPV DHA及質體DNA之混合物，穿 染草地粘蟲細胞2Q。一徽克病毒DNA與25-100«g質蘐DNA 混合，及於20jbM HEPES緩衝液，pH7.5, lmM正磷酸氫二鈉 (請先閲請背而之注意事項#堝寫木頁^ 裝· 訂 線· 經濟部屮央標準杓员工消赀合作社印51 下 在

Hr- t 鋰 b /Ml 氛 及 鈉 化 氯 存 \)/ 文 B 1 積 證 總 /1\ 糖 萄 0 Μ Β 層 〇 單 澱之 沉皿 鈣養 化培 氛織 5M組 12咖. - 0 5 ) 3 度於 濃種 J 接 ί液 浮 懸 用 使 蟲 粘 地 草 附 吸 溫 室 於 胞育 細培 與 P 液28 浮於 懸 。 令換 , 置 上基 胞養 細培 後 曰 JI其 1 將 以 ， 後體 然流 , 液 辱 青 υ «VI 小上 L獲 收 蟲 粘 地 草 於 ， 用斑 顯 學 光 藉 菌 〇 溶定 之鑑 毒.以 病加 體質 組白 重蛋 含面 C 多 斑缺 菌用 溶利 産 -生時 層査 單檢 胞鏡 細微 本紙张尺度逍用中8 S家樣準（CNS) Ή規格（210X297公货) 81. 2. 20,000 ^ 五、發明説明（24) 多 産 生 來 用 後 化 純 斑 步 1 進 經 毒40 =3 料 病 之 斑 菌 溶 等 此白 收蛋 回面 備 毒 病 性 陰 毒 病 桿 醱蛋 且蛋 紹 G-3 V 隹 S 翔 V 分及 可子 序動 程起 述白 前蛋 面 多 於 處 有 帶 撕 組 因 基 其 因 基 2 P 的 下 制 控 肽 子 導 前 質 白 層 程單 的於 立或 確中 已養 據培 依機 ，心 0 1 離 為於 數後 複然 重 〇 染胞 感細 以蟲 毒粘 病地 種 >草I 此染 用感 使 ， 等20 吾序 1 胞 於細 , 的 内染 20 法 方 的 開 公 己 據 依 下 在 存 清 血 牛 胎 下 況 情 if*-種 二 内 液 青 •yf 上 養 培6: 之例 胞施 細實 受 育 培 感 於 示 顯 皆 法 定 檢 色 發 性 活 0 血 凝 抗 有 在 存 質_ 白I 蛋 現一 表 内I 質一 胞 之 胞 細一 蟲 昆 於 惑染 (請先閲請背而之注|事項^.艰寫本一;4 裝. 法屬 v J 此種 ο 1 積用 堆使 與法 産此 生於 内因 質歸 胞 ， 胞率 細産 蟲佳 粘較 地之 草質 於白 可蛋 it源 P2異 質得 白獲 蛋常 通 合 融 現 表 於 基 傜 0 » 號法 信 方 現之 表P2 白質 蛋白 面蛋 多體 之組 白重 蛋童 毒大 病得 泌獲 分等 非吾 於 内 構 架 於 偽 酸NH 基之 胺白 8 I 1 窪 首 面 之多 白有 蛋在 面存 多 〇 中者 其合 - 接 肽酸 多基 之 胺 訂 線 列 序 端 度 高 做 許 允 經濟部屮央標準局只工消赀合作杜印製 置質 安白 等蛋 吾體 ,交 間雜 列理 序處 2 r p B 4 N "C 分用 部使 白許 蛋允 面基 多殘 於此 介 ， , 基 rh S 夕殘 此酸 0 胺 21白 現蛋 表 一 。法 Η 者方 m 分述Ba 部前 I 2 ί 1 p s a 出似 放類 而 之 Μ 之 自示 得所 許圖 允11 其第 » ο 段 合 ΝΑ接 ly 介 媒 移 轉 當 適 與 段 成 合 備 Μ 等 吾 及 P/列 介序 媒酸 移甘 轉核 ΠΙΗ的之 Ba同酸 含不基 也種胺一 3 , I 1 段得首 成獲之 合已白 穎業蛋 新 面 多 碼 ， 编之 !0有言 帶簡 其 操 圖 '· , 2 後 1 1 随FT第 供 址

C 本紙張尺度边用中困Η家楳準（CNS) 規格（210X297公;¢) 81. 2. 20,000 經濟部屮央楳準局A工消"合作社印製 4 _ 五、發明説明（25) pAcYMl19之EcoRV-BamHI段己經由含多面蛋白基因序列由 核苷酸-92至核苷酸+ 55之，合成寡核苷酸所置換。此序 列後方存在有一方便的BamHI址，此址依據第13圖所説明 之計劃用以***完整P 2编碼序列。經由此構築，吾等獲得 一種新穎質體，定名為pAcFT1-P2,其用以將雜交體基因 轉移至桿病毒基因組。 重組體捍病毒偽如實施例5所獲得。草地粘蟲之感染偽 依標準程序進行2()。培養經感染的昆蟲細胞，導致融合 蛋白質堆積於胞質。此雜交體蛋白質為重組證蛋白質P2來 源。文獻中可得多種方法用來以CNBr割裂雜交體22>23 。 應用Olson等人之方法23,可得P2之正確多肽序列。此分 子具有抗凝血_活度。 實施例7 欲獲得P2蛋白質之Ty「61變異體，如上例3所述及第3圖 所示之寡核甘酸5號及6號分別取代以下列寡核苷酸： oligo 5-Tyr 5 f CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAATACATCCTG AACTAGTAACTGCA 3' oligo 6-Tyr 5 *-GTTACTAGTTCAGGATGTATTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3 於寡核甘酸5-Tyr中，下方劃線的三聯碼TAC编碼酪胺酸 殘基，取代原先存在编碼天冬胺酸之三聯碼GAC。寡核苷 酸6-Tyrtt依此校正，俾於二股内獲得完整互補性。以下 於昆蟲細胞或大腸桿菌表現及/或分泌變異體之步驟係與 Λ 6 Π 6 (請先閲讀背而之注兔事項孙處寫本頁^ 裝· 訂 本紙张尺度遑用中a Η家樣準(CNS) 規格（2】0X297公没) S1. 2. 20,000

H6 五、發明説明（26) 例4至6所述者相同。 實施例8 欲獲得P2蛋白質之甘胺酸延長衍生物，如上例3所述及 第3圖中所示之寡核苷酸5及6分別取代以下列寡核甘酸： oligo 5-Gly 5 T CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAAGACATCCTGAAC-GGTTAGTAACTGCA 3' " oligo 6-Gly 5' GTTACTAACCGTTCAGGATGTCTTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3' 裝· 經濟部屮央楛準局ο：工消伢合作杜印5i 於寡核苷酸5-Gly中，下方劃線且编碼甘胺酸之三聯碼 GGT***中止字碼子之前。寡核苷酸6-Gly據此校正，俾於 二股間獲得完整互補性。以下於昆蟲細胞或於大腸桿菌表 現及分泌Gly-延長衍生物之步驟僳與如上例4至6所述者相 同。 實施例9: P1及P2之cDHA選殖 (a) 得自 Hirudinaria raanillensis頭部之總 RNA像依 Catha U等人所述製備24 。 (b) 反錄反應偽如下述進行： 1 0 w g得自水蛭頭之總〇 A 1 w g dT17接頭引子 8w儿 5niMdlUPs混合物 8 /i文 A Μ V缓衝液5 X Η 2〇 至 4 0 /i 义 線- 本紙张尺度边用中囲a家*?^MCNS)T4規格（210X297公货） 81. 2. 20,000 ΡΟ U3 Λ 4 Gp 6 6 ΛΠ 五、發明説明（27) .於冰上組配、混合，混合物於6 5 C加熱2分鐘，繼置於冰 上以終止反應。加入10單位RNA(Promega)及20單位AMV反 錄誨（Boehringer Mannheim),接箸於42Ϊ：培育2小時。然 後反應混合物經酚-氣仿抽取及異丙酮沉 (c)然後，進行聚合_連鎖反應（PCR)。各PCR反應之槪 略計割摘述如下·· PCR混合物： 5 ；u文反錄RNA 10// 义 10X PCR缓衝液（Cetus/Perkin Elmer) 16w 义 dNTPsMix(1.25nM各 dNTP) 2 u SL MgCJl, 0 . 1M 25-500praol各引子 H 2 〇 至 100wJL 反應混合物於95υ變性5分鐘，隨後加入2.5單位Taq聚合 _(Cetus/perkin-Elmer),然後上方舖上 80wA_ 礦油。反 應於Cetus/PerkU-EUer DNA熱循環機内循環。 循環方式為： (請先閲讀背而之注意事項洱堝寫本^ 裝. 線· 經濟部屮央標準局貝工消奸合作杜印製 3分 94 ΐ： 2分 60Ό 2分3 0秒 72Ϊ： 1週期 1分 9410 2分 60t： 3分30秒 72V 30週期 1分 94 t： 本紙*尺度边用中S Η家標準(CNS)甲4規怙（210x297公龙） 81. 2. 20,000 A 6 Π 6 五、發明説明（28) 2 分 601 5分 7 2 °C 1週期

7 分 721C 保持於 25 υ 裝· 殘餘Taq聚合誨以酚-氛仿使之失活，及以乙醇沉澱；樣品 可貯存於- 20t：。欲獲得P1及P2 cDNA之完整序列，進行三 回合PCR擴增。所用各引子序列顯示如下。簡併性引進寡 核苷酸序列之位置，以引子序列下方所示之其它核苷酸表 示（N代表所用全體四核苷酸）。加入其中俥方便擴增産物 選殖之限剪址之下方亦被劃線。 dT 17接頭引子： 5' GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'

Xhol Sail 線· 接頭引子： 5' GAC TCG AGT CGA CAT CG 3'

Xhol Sail 引子 3-8 經濟部屮央標準局A工消价合作社印製 5' ATC GAA GCT TTA TAC CGA TTG TAC NGA 3'

Hindlll C A C C

T 引子 52-56 5' CTA AGG ATC CTT CTT CGA AGT CNC C 3'

BamHI C A A 81. 2. 20,000 本紙张尺度边用中國Η家楳準（CNS) T4規格（210X297公龙） Λ β Π 6 經濟部屮央標準局Α工消奸合作杜印製 五、發明説明（29) 引子 32 - 37 5f ATC GGA ATT CAG TTC TGG AAA TCA GTG CGT 31 EcoRI 引子 5*1 5' CTA. AGA ATT CTT CGC AAC TTA TAT GCG TT 3' EcoRI 引子 5，II 5' ATC GGA ATT CTT AAT TCA ATA TAT CTT CAT 3' EcoRI 第一回合擴增 5 0 0 p m ο 1全然簡併的引子，由P 2胺基酸序列的殘基3跨至 8及由殘基56跨至52者，用做PCR反應之相對引子。 cDNA 3'端之擴增（RACE方案），Frohman等人25。 由殘基32跨至37之基因特異性引子，基於第一回合擴增 所決定的P2核苷酸序列而設計。此引子連同dT接頭引子共 同用來擴增cDNA (第14圖）。 cDNA 5’端之擴增（RACE方策），Frohman等人25。 10/ig得自水蛭頭之總RNA如前述進行反錄，但使用lwg 基因待異性引子（5’1)取代dT17接頭引子（參見第15圖）。 然後使用異丙醇沉澱反應混合物，第一股cDNA産物使用末 端去氯核苷酸基轉移《 (TdT)於其5’端，進行聚腺甘基反 應如下： 22uJL cDNA · 裝· .Is _ 本紙張尺度边用中as家楳準（CNS)T 4規格（210x297公放) 81. 2. 20,000 1?214556 經濟部屮央櫺準局员工消设合作杜印製 五、發明説明（30) \ u λ. 6 πι M d A Τ Ρ 6 w文 5Χ TdT缓衝液（BRL) 1.1 Μ 义 TdT (BRL) 樣品於37t：培育10分鐘，及於65¾加熱16分鐘。然後，反 應混合物於蒸餾水中稀釋至500w义。 10M义聚腺苷基化産物使用10praol dT17接頭引子，25 pmol接頭引子及25ρπιο1位在用於轉錄之第一特異性引子上 方的第二基因-特異性引子（5’ I,參見第15圖）擴增。 d)PCR産物之分析 於各引子内存在的限剪址割裂擴增産物。消化後産物藉 凝膠純化及次選殖入PUC13媒介，此媒介事先使用相同限 剪誨消化者。藉限剪分析，鑑定擄帶有感興趣之插子之質 體。採用供應商之推荐方法，以定序列誨（USB)決定質體 D N A之序列。如此所得之Ρ 1及P 2之c D Η A序列及演繹得自胺 基酸序列如下。前導子序列之下方被劃線。 閲 背 而 之 注 意-事 項 填 % 本 線 本紙*尺度边用中as家媒準（CNS)T4規怙（210x297公；?t) 31. 2. 20,000 2ΐ4δ5ο A6 ________B6

五、發明説明（3 L i PI CDNA

tea aaa ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT Met Phe Ser Leu Lvs Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val TGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA

Cvs lie Cys Val Ser Gin Ala Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu

TCA GGC CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA GGT AAT CTC TGC GGT

Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly

GGA GGC AAA CAT TGT GAA ATG GAC GGT TCT GGA AAT AAA TGC GTC

Gly Gly Lys His Cys Glu Met Asp Gly Ser Gly .Asn Lys Cys Val

GAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT

Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp

TTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA

Phe Glu Glu lie Pro Asp Glu Asp lie Leu Asn 結束

P2 cDNA

aaa ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGC

Met Phe Ser Leu Lvs Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cvs 經濟部中央搞準局印裝 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA Tie Cvs Val Ser Gin Ala Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser GGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGA Gly Gin Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu GGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CAT Gly Lys Asn Cys Gin Leu Ser Ser Ser Gly Asn Gin Cys Val His GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA cgaacgcatataagt Glu Glu lie Pro Asp Glu Asp lie Leu Asn 結束 甲 4(210X297公沒） A6 B6 五、發明説明（32) tgcgaataattctgattttaagacattcccatcgcagctatggctatttacagtatatta ttataaataaagaattgaacgtttacgttgattgta 經 濟 部 中 央 揉 準 局 印 製 參考文獻 1) Markwardt, F. 1970, Methods in Enzymology, 12., ρ· 924 2) Harkwardt, F. 1985, Biomed. Biochim. Acta. 44. p. 1007 3) Mar3cwardt, F. Hauptmann, J., Nowak, G. , Klessen, C., and Walsmann, P. 1982. Thromb. Haemostasis 47. p. 226. 4) Dupont D., Keim P., Chui A., Bello R. and Wilson K., Derivatizer-Analyser User Bulletin No. 1, Applied Biosystems Inc., 1987 5) Grosjeans H. and Fiers W. 1982. Gene, 18. p. 199 6) Maniatis T., Fritsch E.F. and Sambrook J. 1982. Cold Spring Harbor, NY 7) Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA H, p. 5463. 8) Blobel G. and Dobberstain B. 1975. J. Cell Biology, 67. p. 83 9) Pages J.M. 1983, Biochimie, §5, p. 531 10) Wolfe P.B. 1983. J. Biol. Chem. 258. p, 12073 11) Talmadge K., Stahl S. and Gilbert W. 1980. Proc. Natl. Acad. sci. USA, 77, p. 3369 12〉 Oka T., Sakamoto S., Miyoshi K., Fuwa T., Yoda K., Yamasaki M., Tamura G. and Miyake K. 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82., p. 7212 13) Henning V., Royer H.D., Teather R.M., Hindermach·工· and Hollenberg C.P. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, p. 4360

{請先閲讀背面之注意事項再填穹本頁) .¾. •ir· 綠- A6 B6

經 濟 部 中 央 揉 準 Μ 印 $L 五、發明説叨 14) 工sacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti R. and Soria M. 1989,. Gene ai, p. 129 15) Mandel m. and Higa A.J. 1970. J. Mol. Biology, 52, p. 154 16) Krstenansky, J.K., and Mao, S.J.T. 1987. FEBS Lett. 211. p. 10 17) Ghrayeb J., Kiaura H., Takahara H., Hsiung H., Masui Y. and Inouye M. 1984. EMBO Journal 2., p. 2437 18) Bailey, M.J., McLeod, D.A., Kang, C., and Bishop, D.H.L. 1989. Virology 169. p. 323 19) Matsuura, Y., Possee, R.D., Overton, H.A. and Bishop. D.H.L. 1987. J. Gen. Virol. 6^, p. 1233 20) Summers, M.D., and Smith, G.E. 1987, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 21) Luckow, V.A. and Summers, H.D. 1988, Virology, 167. p.56 22} Gross E. 1967. Methods in Enzymology, 11. p. 238 23) Olson H., Lind P., Pohl G., Henrichson C., Mutt V., Jornvall H., Josephson S., Uhlen M. and Lake M. 1987, Peptides, £, p. 301 24) Cathala, G., Savouret, J.-F., Mendez, B., West, B.L., Karin, M., Martial, J.A. and Baxter, J.D. (1983) DNA, 2,4: 329-335 25) Frohman, M.A., Dushf M.K. and Martin, G.R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85： 8998-9002 甲 4 (210X297公沒） {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .¾..

Claims (1)

1. ^ 7. I 本年月曰 丨d _ U A7 B7 r.7 D7 32. 7. -1 i£. ^ I 绶 濟 部 中 標 準 局 貝 工 消 費 合 作 社 印 製 六、申請專利範園 1. 一種具有選自下列胺基酸序列之抗凝血_活性多狀及其蕖學上可接受鹽： (i) P1 Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu 1 5 10 15 Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys GLu Met 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys 35 40 45 Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu lie Pro Asp Glu 50 55 60 Yaa lie Leu Asn Zaa; 65 (ii) P2 Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu 1 5 10 15 cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gin Leu 20 25 30 . · Ser Ser Ser Gly Asn GLn Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys 35 40 45 Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu He Pro Asp Glu 50 55 60 Yaa lie Leu Asn Zaa; or (iii) P3 Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu L 5 10 15 cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gin Leu 20 25 30 Ser Ser Ser Gly Asn Gin Cys Val His GLy Glu Gly; 35 40 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝. 訂. ’乂. 木纸張尺度適用中aa家捺準（CNS>甲4规格（210_ X 297公；ί ) A7 B7 C7 D7 缦濟部中央櫺準局8工消費合作·社印焚 六、申請專利範園 其中 Yaa為 Asp或 Tyr,及 Zaa為-OH、 -ΝΗ2» 或 Gly-OH。 2. 如申請專利範圍第1項之多肽.其具有如申請專利範 圍第1項所示之任一胺基酸序列且前方帶有一 Met殘基。 3. 如申請專利範圍第1項之多肽.其具有如申請專利範 围第1項所示之任一胺基酸序列且前方帶有全體或部分前 導子序列。 4 .如申請專利範圍第3項之多肽，其中存在有金腥或部 分下列前導子序列： Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys lie Cys Val Ser Gin Ala. 5. 如申請專利範園第1項之多肽.其為一種融合蛋白質 ,其中申請專利範圔第1項所示之任一胺基酸序列係與多 面蛋白之胺基端片段融合。 6. —種裂備如申請專利範圍第1至5項中任一項之多狀及 其藥學上可接受鹽之方法，該方法包括： (a)提供一蛮自大腸桿菌種系或草地粘蟲細胞糸之寄主 ，以包含下列任一 DN A序列之表現媒介將其轉形； GTT TCT TAC ACC GAC TGC ACC GAA TCT GGC CAG AAC TAC TGC CTG TGC GTT GGT TCT AAC GTT TGC GGT GAA GGT AAA AAC TGC CAG CTG TCT TCT TCT GGT AAC CAG TGC GTT CAC GGT GAA GGT ACC<GCG ΛΑΑ CCG.AAA TCT CAG ACT GAA GGT GAC TTC GAA GAA ATT CCG GAC GAA GAC ATC CTG AAC; GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA GGC CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA GGT AAT CTC TGC GGT GGC AAA CAT TGT GAA ATG GAC GGT TCT GGA AAT AAA TGC GTC GAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT; and GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA GGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGA GGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT; (誇先閲f面之注意事項再填寫本頁) -襄_ 訂· d· -本紙張又度逷用中闽困家诈莘（CNS)甲4視格（210 x ‘297公^) A7 C7 D7 六、申請專利範園 其各個之前方視情況可结合有下列序列中之任一者： ATC ATG GAG ΑΤΑ ATT AAA ATG ΑΤΑ ACC ATC TCG CAA ΑΤΑ AAT AAG TAT TTT ACT GTT TTC GTA ACA GTT TTG TAA TAA' AAA AAC CTA TAA ATA TGC CGG ATT ATT CAT ACC GTC CCA CCA TCG GGC GTA CCT ACG TGT ACG ACA ACA CCG; ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC; ATG AAG TGC CTT TTG TAC TTA GCC ΤΤΓ TTA TTC ATT GGG GTG AAT TGC; 及 ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA； 以及其各値之後方視情況可结合有密碼子GGT,被轉形之 寄主於所述多肽可被表現之條件下培育；以及 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •丨装- 訂. ο 鹽 性 受 接 RI項括 學S法； _第方肜或範，述 狀flj@法所 .之專j合 万申鹽b f f接f iw製可Ξ 離薄上固 \—/ 1 β, \»/ b •曝 a (70( 其 或 肽 多 之 項 1 任 中 得 所 此 如 離 分 經濟部中央標準局貝工消費合作社印发 (*或 列 ， 序呔 。 酸多 鹽基之 受胺0H 接有· 可具 上之 學 藥 其 或 肽 多 之 "% 中 其 β 0 I S 团 A 範表 利代 a a 請ί φ 如且 備)i • lb 製 .- 種(i 1 或 ♦ )/ 8 i 項 1 及 表 代 a 物 泌 分 或 織 組 .之 :S3 括水 包種 法is 方ns 0 該 1 IX 9 ·1 法an - m 方 之pla 鹽 a 受in 接ud 可1Γ Η 上 令 學一 藥(a 其 質 物 血 凝 抗 製 粗 到 得 此 如 取 萃 酮 丙 受 接 質 物 0 血 凝 抗 製 粗 化 純 份 部 析 層 換 交 子 離 由 經 一張 4 I準 $ " 囡 a 用 適 -VI/ 1*3 公 97 1455¾ A7 1455¾ A7 绫濟部中央標準曷员工消费合作杜印製 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 (c) 經由親和層析進一步純化抗凝血酶物質； (d) 最後令抗凝血_物質在中性介質中進行逆相高效液 相層析，以分離出所述多肽。 9. 一種做為抗凝血_劑之藥學組成物，其包活藥學上可 接受載劑或稀釋劑，及作為活性成分之如申請專利範圍第 1至5項中任一項之多肽或其藥學上可接受鹽。 10. -種编碼如申請專利範園第1項之多肽之DNA序列， 其選自： GTT TCT TAC ACC GAC TGC ACC GAA TCT GGC CAG AAC TAC TGC CTG TGC GTT GGT TCT AAC GTT TGC GGT GAA GGT AAA AAC TGC CAG CTG TCT TCT TCT GGT AAC CAG TGC GTT CAC GGT GAA GGT ACC CCG AAA CCG AAA TCT CAG ACT GAA GGT GAC TTC GAA GAA ATT CCG GAC GAA GAC ATC CTG AAC TAG; GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA GGC CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA GGT AAT CTC TGC GGT GGC AAA CAT TGT GAA ATG GAC GGT TCT GGA AAT AAA TGC GTC GAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT;及 GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA GGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGA GGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CAT GGG GAA GGT ACT.CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT. 11. 如申請專利範圍第10項之DNA序列，其為合成之DNA 序列。 12. 如申請專利範園第10項之DNA序列，其為cDNA。 13. 如申讅專利範圍第10至12項中任一項之DNA序列，其 尚與编碼前導子肽之DNA序列連結，該前導子肽可指導所 述多肽由表現該多肽之細胞中分泌。 1 4 .如申請專利範圍第1 0至1 2項中任一項之D H A序列，其 未纸張尺度通用中囤囷家標準（CNS)乎4規格（210 X 297公货） ---------— ll·----(-------裝------訂——U% (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7 C7 D7__ 六、申請專利範圍 尚與编碼多面蛋白之胺基-终端片段之DNA序列連結。 15. —種製備可表現如申請專利範困第1至5項中任一項 之多肽之寄主之方法，該方法包括以相容性表現媒介轉形 選自大腸捍菌種条或草地粘蟲細胞糸之寄主，其中該相容 性表現媒介包括编碼如申請專利範圍第1至5項之任一項之 多肽之DN A序列。 16. 如申請專利範匾第15項之方法，其中所述表現媒介 僳經由下述步驟裂備者： (a) 化學合成编碼所述多肽之DNA序列；及 (b) 將所述DNA序列***表現媒介内。 17. 如申請專利範圍第15項之方法，其中所述表現媒介 偽經由下述步驟裂備者： (a )由得自 Hirudinaria nanillensis 種屬水桂之 uRNA, 生産及分離编碼所述多肽之cDNA;及 (b)將所述之CDNA***表現媒介内。 18. 如申請專利範圍第10項之DNA序列，其主要由下列序 列组成為： GTTTCTTACACCGACTGCACCGAATCTGGCCAGAACTACTGCCTGTGCGTTGGTTCTAAC GTTTGCGGTGAAGGTAAAAACTGCCAGCTGTCTTCTTCTGGTAACCAGTGCGTTCACGGT GAAGGTACCCCGAAACCGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAA GACATCCTGAACTAG. 19. 如申諳專利範圍第10項之dna序列，其主要由下列序 列組成為： I 本紙張尺/t適用中raa家彳ί準（CN'S) T 4叹格（210 X 297么'货) : (諳先W讀背面之注意事項再填寫本頁) ••装· 訂· 線- A7 B7 C7 D7 六、申請專利範困 GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA GGC CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA GGT AAT CTC TGC GGT GGA GGC AAA CAT TGT GAA ATG GAC GGT TCT GGA AAT AAA TGC GTC GAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA. 20.如申請專利範園第10項之DHA序列，其主要由下列序 列組成為： ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GA^T TGT ACG GAA TGA GGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGA GGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA. 21.如申請專利範園第19或20項之DNA序列，其中所示序 列前方緊連著下列序列： ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA. (請先閲讀背面之注意事项再填寫木頁} —装 訂 線 經濟部中央標準局S工消费合作社印¾ 本纸张只-t適用中sa?作::MCNS)甲4现格（210 X 297 H )、