CN1064968C - 重组蛋白提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物制药领域。凡由基因工程菌(大肠杆菌)表达,以包涵体形式存在,并从包涵体中提取纯化重组蛋白的均可适用此工艺。本工艺的特征在于采取两种变性溶解剂体系,进行两次变性溶解、纯化,及先复性后纯化的程序,因而本发明比已有技术可使重组蛋白的溶解度增加500-600倍,变性剂的用量减少100倍左右,工作效率相应提高上百倍,重组蛋白纯度提高30%左右,而产品总收率增加24%以上,因此本发明是工艺简单、产品纯度及收率均明显提高、成本则显著降低、经济效益甚高的提取纯化新工艺。
Description
本发明属于生物制药领域。
许多基因工程菌(大肠杆菌)所表达的重组蛋白多(均)以包涵体形式存在,如:白介素-2,人粒细胞集落刺激因子,白介素2-粒巨细胞集落刺激因子融合蛋白……等,因此从包涵体中提取纯化重组蛋白的工艺引起高度重视,因为纯化工艺的优劣直接影响产品的质量及效率,从而直接影响经济效益。
在重组蛋白提取纯化工艺中,必须先用蛋白变性剂(溶解剂)将包涵体中的重组蛋白变性溶解,以便纯化除去杂质,这是关键技术之一。然后于适宜条件下进行复性,以重获天然活性。因此重组蛋白由变性到复性是其关键技术之二。上述两个关键技术主要影响产品的纯度及效率。
目前已有技术对提取纯化蛋白存在以下问题。
1.重组蛋白在盐酸胍或尿素单一变性剂中溶解度有限,在降低变性剂<4mol/L时,重组蛋白不能与杂蛋白、核酸解离而被析出,严重影响产品回收率。
2.为了提高重组蛋白的纯度,采取先纯化后复性的工艺程序,然而,由于变性剂的浓度高,粘稠度大、用量也大,因而操作难度很大,成本高。
3.由于重组蛋白长时间与高浓度变性剂作用,导致变性剂及其产物对重组蛋白的共价修饰,致使重组蛋白复性率降低,产品收率随之降低。
鉴于已有技术存在上述问题。其结果是:工艺复杂操作难度大,产品的纯度及收率均低,进而导致成本高,不利于工业化生产。
本发明的目的就是寻找一条工艺简单,产品的纯度及收率均高,而成本低的提取纯化工艺。
本发明内容:附工艺流程示意图
凡由基因工程菌大肠杆菌表达的重组蛋白,是以包涵体形式存在,并从包涵体中提取纯化重组蛋白的。均可按本发明的提取纯化工艺流程进行生产。提取纯化程序是将工程菌破碎,包涵体洗涤,重组蛋白变性纯化,重组蛋白二次变性纯化,重组蛋白复性,离子交换层析,分子筛层析,即得重组蛋白,其具体工艺如下:
一、工程菌破碎
1.取工程菌,按每克湿菌加5-10倍缓冲液(1)(20mmol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸),pH8.0),洗涤细菌,于4℃离心,7000(rpm)×10min(分钟),弃上清液。
2.按每克湿菌加溶菌酶5毫克,同时加5-10倍量的缓冲液(2)(50mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠),pH8.0),于4℃搅拌1.5-2.5小时,在-20℃放置过夜。
3.将过夜菌化冻后,用超声破碎,30秒×10次,每次间隔1-2min,至液体变稀薄、起泡为止,镜检细菌破碎率为98%以上。
二、包涵体洗涤
1.取超声破碎菌液,离心4000rpm×5min4℃,留沉淀。
2.将沉淀物(包涵体)用以下缓冲液(3)(4)(5)(6)(7)(8)依次分别进行充分搅拌洗涤,于4℃离心12000rpm×20min,洗1-2次,留沉淀物(包涵体)备用。分别洗涤的目的在于除弃混合在包涵体的质脂体、脂多糖、核酸及杂蛋白等杂质。
各缓冲液成分如下:
缓冲液(3):20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,pH8.0
缓冲液(4):20mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,2mmol/L 2-ME
(二巯基乙醇),0.5%曲通X-100,pH8.0
缓冲液(5):与缓冲液(3)相同
缓冲液(6):2mol/L尿素,20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,pH8.0
缓冲液(7):70%异丙醇,20mmol/L Tris-HCl,pH8.0
缓冲液(8):20mmol/L Tris-HCl,pH8.0
三、重组蛋白变性纯化
1.将洗涤后的包涵体按湿重加5-10倍量的盐酸胍缓冲液(9)(6-8mol/L盐酸胍,10mmol/L DTT(二硫苏糖醇),1mmol/L EDTA,20mmol/L Tris-HCl,pH7.0-8.5),充分搅拌25-35分钟后,此时重组蛋白变性溶解,于4℃离心12000rpm×30min,取上清液得重组蛋白溶液。
取盐酸胍溶解液,加入缓冲液(10)(10mmol/L DTT,1mmol/L ED-TA,20mmol/L Tris-HCl,pH8.0)将盐酸胍缓冲液浓度稀释到4-5mol/L,搅拌,于4℃离心12000rpm×20min,弃沉淀物。上清液继续再加缓冲液⑩将盐酸胍浓度稀释到2-3mol/L搅拌,于4℃离心12000rpm×20min,留沉淀物(此沉淀物为重组蛋白),然后将沉淀物用缓冲液(11)(20mmol/L Tris-HCl,10mmol/L DTT,1mmol/L EDTA,pH8.0)冲洗,离心10000rpm×10min,冲洗1-2次留沉淀物。
四、重组蛋白二次变性纯化
取第一次纯化的沉淀物用尿素缓冲液(12)(6-8mol/L尿素,1mmol/L EDTA,100mmol/2-ME,20mmol/L NaAc(醋酸钠),pH3.5-7.0)变性溶解,于4℃离心12000rpm×20min,离心弃不溶物,留上清液调整蛋白浓度为8-10mg/克备用。在此工艺程序上,本发明与已有技术质的区别,在于对重组蛋白采取了两种变性溶解体系,进行交替变性溶解纯化处理,可显著地提高重组蛋白的溶解度(500-600倍),并充分利用其溶解度大大增加这一特性,刻意降低(稀释)变性剂的浓度(0.1mol/L),其目的在于使重组蛋白与杂蛋白、核酸自行解离,以达纯化,提高收率。而已有技术采取单一变性剂的处理,只能将变性剂的浓度降到>4mol/L,此浓度不能使重组蛋白与杂蛋白、核酸等有效地自行解离,因而重组蛋白与杂质一起析出,弃掉,故收率显著降低。
五、重组蛋白复性
将尿素液调整蛋白浓度为8-10mg/ml溶液,缓慢加入复性缓冲液(13)(1mmol/L EDTA,1mmol/L还原型谷胱苷肽,0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽,20mmol/L醋酸钠,pH4.0),即在80-100分钟内将6-8mol/L尿素缓冲液的浓度逐步(梯度)稀释到0.1mol/L,于4℃过夜,然后用缓冲液(14)(10mmol/L醋酸钠,pH4.0)透析,或经超滤平衡去除复性缓冲液,得重组蛋白。
本发明在此工艺环节上的重大技术特征,在于采用复性缓冲液梯度稀释变性剂的同时,进行逐步还原复性的方法,其结果:
1.简化了整个后续的纯化工艺。
2.极大地减少了变性剂的用量,从而减少了在变性剂条件下进行色谱分离的麻烦。
3.在整个操作中重组蛋白与变性剂作用时间很短,因而可避免变性剂及其产物对重组蛋白的共价修饰馁,重组蛋白复性率可达95%以上。
六、离子交换层析(去除核酸热原)
1.将CM Sepharose FastFlow(一种阳离子交换层析填料)装入玻璃层析柱,用2倍柱床体积的0.5mol/L氢氧化钠洗脱一次,用无热原水洗涤层析柱,以除去氢氧化钠,至流出液的pH7.0止,然后用2-3倍柱床体积的20mmol/L醋酸钠-醋酸,pH4.0缓冲液平衡层析柱。
2.取复性的重组蛋白加入缓冲液(15)(20mmol/L醋酸钠-醋酸,pH4.0),然后以每小时50-70毫升的流速上层析柱。再用2倍柱体积的缓冲液(15)洗脱,流速为25-30ml/小时,最后用氯化钠缓冲液(16)(0.3mol/L氯化钠,20mmol/L醋酸钠-醋酸,pH4.0)洗脱,在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集。
七、分子筛层析(去除异构体、热原)
1.将凝胶排阻层析填料(Sephacryl S-200)装玻璃层析柱,用0.5mmol/L氯氧化钠冲洗进行去热原处理。然后用2倍柱体积的缓冲液(17)(0.004%吐温-80,10mmol/L醋酸钠-醋酸,pH4.0)平衡层析柱。
2.取经离子交换层析处理的重组蛋白,加入缓冲液(17),按10%柱体积上样并洗脱,流速为50-60ml/小时,收集蛋白峰,在紫外监测仪的紫外吸收为零时停止收集,即可获得重组蛋白。
本发明与已有技术比较具有以下优点见下表
本发明与已有技术比较
变性剂用量变性剂作用时间重组蛋白纯度OD280/260成品
(ml) (小时) (%) (吸光度)*(%)已有技术 1500 85 60 1.0 1本发明 150 2 >90 1.5 3差异 100倍 80以上 30 0.5 2*OD280/260值越大,产品纯度越高,含核酸等杂质越少。
从上表可以看出
1.本发明比已有技术,在使用变性剂量少100倍,而清除变性剂的工作效率将提高100倍,其成本显著降低。
2.本发明比已有技术变性剂与重组蛋白作用时间少80小时以上,导致重组蛋白共价修饰大大减少,因而产品总收率提高。
3.本发明比已有技术对重组蛋白在纯度上提高30%。
4.本发明与已有技术在重组蛋白总收率分别为34%,10%,若将纯度计算在内,则分别为30.6%和6%,就产品收率而言,其经济效益本发明比已有技术增加25%,或降低成本25%以上。
实施例一、重组人粒细胞集落刺激因子的提取纯化工艺
1.菌体破碎
(1)取工程菌100克加1000ml 20mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸),pH8.0,洗涤细菌,于4℃离心7000rpm×10min(分钟),弃上清。
(2)湿菌加入溶菌酶500mg,50mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠),pH8.0缓冲液1000ml,于4℃搅拌2h(小时),在-20℃放置过夜。
(3)将上述细菌化冻后超声,30sec(秒)×10次,每次间隔1min,至液体变稀薄、起泡为止。镜检细菌破碎率>98%。
2.包涵体的洗涤
(1)取菌体破碎液离心4000rpm×5min,4℃,留沉淀。
(2)用20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,pH8.0液洗涤。
(3)用20mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,2mmol/L2-ME(2-巯基乙醇),0.5%Tritonx-100(曲通X-100,一种去垢剂),pH8.0液洗1次,去脂质。
(4)用20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,pH8.0液洗2次,以去除Tritonx-100。
(5)用2mol/L尿素,20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,pH8.0液洗1次,去除杂蛋白。
(6)70%异丙醇,20mmol/L Tris-HCl,pH8.0洗一遍,去除脂多糖。
(7)用20mmol/L Tris-HCl,pH8.0洗2次去除异丙醇。
以上步骤加缓冲液500ml,于4℃离心12000rpm×20min后,弃上清。
3.重组蛋白变性纯化
(1)包涵体溶于变性剂:取包涵体沉淀物,加入7mol/L盐酸胍,10mmol/L DTT(二硫苏糖醇),1mmol/L EDTA,20mmol/L Tris-HCl,pH8.0,浓度为20%。充分搅拌溶解30min后,于4℃离心12000rpm×30min,取上清,得到重组蛋白初提物,并将其稀释到50μg/ml。
(2)向7mol/L盐酸胍溶解的包涵体中加入含10mmol/L DTT,1mmol/L EDTA,20mmol/L Tris-HCl,pH8.0缓冲液,将盐酸胍浓度分两次降低,至重组蛋白全部析出,4℃离心12000rpm×20min,弃上清,沉淀用20mmol/LTris-HCl,10mmol/L DTT,1mmol/L EDTA,pH8.0的缓冲液洗2次,10000rpm×10min离心得沉淀。
4.重组蛋白二次变性纯化
8.0mol/L尿素,1mmol/L EDTA,100mmol/L2-ME,20mmol/LNaAc,pH4.0溶解上述沉淀,离心(12000rpm×20min)去不溶物,调整蛋白浓度为8-10毫克/毫升。
5.重组蛋白复性
在尿素缓冲液中缓慢加入复性液(1mmol/L EDTA,1mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH),0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽(CSSG)、20mmol/L NaAc,pH4.0),即在80min内降低尿素浓度至1.0mol/L,再一次稀释到0.1mol/L,复性物4℃过液,然后用10mmol/L NaAc pH4.0中透析或超滤平衡去除复性剂。
6.离子交换层析(去核酸、热源)
(1)装CM Sepharose FF(一种阳离子交换层析填料)层析柱,用2倍柱床体积0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)洗脱一次(无热原处理),以无热原水洗至流出液的pH7.0,然后用20mmol/L NaAc-HAC(醋酸钠-醋酸)pH4.0平衡。
(2)60ml/h将样品上于层析柱,再用2倍柱体积的20mmol/LNaAc-HAC pH4.0洗脱,流速30ml/h,再用含1.0mol/L NaCl(氯化钠)的20mmol/L NaAc-HAC,pH4.0梯度洗脱,收集主蛋白峰。在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集。
7.分子筛层析(去除异构体、热原,换体系)
(1)Sephacryl S-200(一种凝胶排阻层析填料)层析柱去热原处理。
2)用2倍柱体积0.004%Tween-80,10mmol/L NaAc-HAC,pH4.0平衡层析柱。
(3)按10%柱体积在上述缓冲体系中上样并洗脱,流速60ml/h。收集蛋白峰,在紫外监测仪的紫外吸收值为零时,停止收集。
实施例二、rhIL2-PE66(基因重组人白细胞介素Ⅱ-绿脓杆菌外毒素66,分子量80KD)提取纯化工艺
1.菌体破碎
(1)取工程菌100克加1000毫升20mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液),pH8.0,洗涤细菌,于4℃离心7000rpm×10min(分钟),弃上清。
(2)加入溶菌酶500mg,50mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠),pH8.0缓冲液1000ml,于4℃搅拌2h,在-20℃放置过夜。
(3)将上述细菌化冻后超声,30sec(秒)×10次,每次间隔1min,至液体变稀薄、起泡为止。镜检细菌破解率>98%。
2.包涵体的洗涤
(1)上清离心4000rpm×5min,4℃,留沉淀。
(2)用20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,pH8.0液洗涤。
(3)用20mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,2mmol/L2-ME(2-巯基乙醇),0.5%Tritonx-100(曲通X-100,一种去垢剂),pH8.0液洗1次,去脂质。
(4)用20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,pH8.0液洗2次,以去除Tritonx-100。
(5)用2mol/L尿素,20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,pH8.0液洗1次,去除杂蛋白。
(6)70%异丙醇,20mmol/L Tris-HCl,pH8.0洗一遍,去除脂多糖。
(7)用20mmol/L Tris-HCl,pH8.0洗2次去除异丙醇。
以上步骤均加500ml缓冲液洗涤,于4℃离心12000rpm×20min后弃上清。
3.重组蛋白变性纯化
用8mol/L盐酸胍溶解包涵体,然后加入含10mmol/L DTT,1mmol/LEDTA,的20mmol/L Tris-HCl,pH8.0缓冲液,将盐酸胍浓度分两次降至2mol/L,搅拌10min后离心12000rpm×20min,重组蛋白全部析出,12000rpm×20min,弃上清,沉淀用20mmol/L Tris-HCl(含10mmol/LDTT,1mmol/L EDTA),pH8.0的缓冲液洗2次,10000rpm×10min离心得沉淀。
4.重组蛋白二次变性纯化
用8.0mol/L尿素,1mmol/L EDTA,100mmol/L2-ME,20mmol/LTris-HCl,pH8.0溶解,离心(12000rpm×20min)留上清液,并调整蛋白浓度为8-10mg/ml备用。
5.重组蛋白的复性
将上述重组蛋白2次变性溶解液缓慢加入复性液(1mmol/LEDTA,1mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH),0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG),20mmol/L Tris-HCl,pH8.0),在90min内降低尿素浓度至1.0mol/L,再一次稀释到0.1mol/L,复性物4℃过夜,然后用20mmol/L Tris-HCl,pH8.0透析或超滤平衡去除复性剂。
6.离子交换层析(去核酸、热源)
(1)将CM Sepharose FastFlow(一种阳离子交换层析填料)装入玻璃层析柱,记录装填体积,用2倍柱床体积的0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)洗脱一次(去除体系内的热原质污染),以无热原水洗涤层析柱(去除NaOH)至流出液的pH7.0,然后用2-3倍柱床体积的20mmol/L NaAc-HAC(醋酸钠-醋酸)pH4.0缓冲液平衡层析柱。
(2)以60ml/h的流速将样品于20mmol/L NaAc-HAC pH4.0缓冲液上于层析柱,再用2倍柱体积的20mmol/L NaAc-HACpH4.0洗脱,流速30ml/h,再用含0.3mol/L NaCl(氯化钠)的20mmol/L NaAc-HAC,pH4.0洗脱,目的是用具有相当离子强度的NaCl置换被吸附于阳离子层析柱上的hG-CSF重组蛋白。在紫外监测条件下,收集蛋白峰于0.3mol/L NaCl洗脱时呈一对称的单一峰,紫外吸收值为零时停止洗脱。
7.分子筛层析(去除异构体、热原、换体系)
(1)将凝胶排阻层析填料(Sephacryl S-200),同上述方法装入玻璃层析柱层析柱,并经0.5mol/L NaOH进行去热原质处理。
(2)用2倍柱体积0.004%Tween-80,10mmol/L NaAc-HAC,pH4.0平衡层析柱。
(3)按10%柱体积在上述缓冲体系中上样并洗脱,流速60ml/h。收集蛋白峰,紫外监测吸收零时停止洗脱。
Claims (8)
1.一种基因工程菌所表达的重组蛋白的纯化方法,其特征在于将工程菌破碎,包涵体洗涤,重组蛋白变性纯化,重组蛋白二次变性纯化,重组蛋白复性,离子交换层析,分子筛层析即得纯化的重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于将工程菌用缓冲液洗涤、离心,留沉淀,加溶菌酶缓冲液于4℃搅拌,放置-20℃过夜,化冻后用超声破碎至镜检细菌破碎率大于98%,可得包涵体混合液。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于将包涵体混合物于4℃离心,其沉淀物用多种缓冲液依次进行洗涤,4℃离心1-2次,得包涵体沉淀物。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于将包涵体溶于6-8mol/L盐酸胍缓冲液(9)中,缓冲液(9)是6-8mol/L盐酸胍,10mmol/L DDT,1mol/L EDTA,20mmol/L Tris-HCt pH7.0-8.5,然后离心,取上清液加缓冲液(10)将盐酸胍浓度稀释到4-5mol/L,缓冲液(10)是10mmol/LDTT,1mmol/L EDTA,20mmol/L,Tris-HCt,pH8.0,然后离心,取上清液,再加缓冲液(10)将盐酸胍稀释至2-3mol/L,离心,沉淀物用缓冲液(11)冲洗两次,留沉淀物,缓冲液(11)是20mmol/L Tris-HCt,10mmol/LDTT,1mmol/L EDTA,pH8.0。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于将重组蛋白的沉淀物加6-8mol/L尿素缓冲液(12)变性溶解,离心留上清液,缓冲液(12)是6-8mol/L尿素,1mmol/L EDTA,100mmol/L,2-ME,20mmol/L醋酸钠,pH3.5-7.0。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于将变性重组蛋白溶于尿素缓冲液,调正浓度为8-10毫克/毫升,然后缓慢加入复性缓冲液,即在80-100分钟内,将尿素浓度稀释至0.1mmol/L,最后于4℃用缓冲液透析或超滤平衡除去复性缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于将复性重组蛋白加入缓冲液,上层析柱,然后用缓冲液洗脱,最后用缓冲液洗脱至紫外吸收值零时为止。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于将经离子交换层析的重组蛋白加入缓冲液后上柱并洗脱,至紫外吸收值零时即停止。
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