205069 A6 B6 五、發明説明（） 發明^領城 經 濟 部 中 央 標 準 印 裝 本發明僳有關從轉形細胞獲得名為神經生長因子（/3-HGF)之多肽之方法，特別傜有關使用可***適當真核細胞 条之基因構成體，經由重組DHA技術獲得生物活性人成熟 型（/3 -亞單位）之方法。 發明背卺 A、神經生長因子（NGF) 神經生長因子（NGF)首先傺於小鼠肉瘤内發現（1^“_ Montalcini, R. et al., J. Exp. Zool. 116*321, 1951 ),然後被純化及從雄小鼠下頷唾液腺（Varon, S. et al .，生物化學6:2202, 1967)及從蛇血清Ungeletti, R. H .,P r o c . N a 11. A c a d . S c i . U S A 6 5 : 6 6 8 , 19 7 0)生成均 質物。曾經指出多種其他NGF含量相當豐富的來源，包含 天竺鼠***（Harper, G.P. et ai.,自然 279:160， 1979)及人胎盤（Goldstein, L.D. et al.，Heurochem, Res. 3:175，1978, Walker, P. et al.,生命科學 26:195 ，1980, Fidia專利案47745A88)。其它組織曾經發現小 量NGF例如哺乳動物中樞神經条統（Var〇n，S.,神經科學 討論，Vol. II，No. 3, 1985; Hefti, F. et al.，神經 科學14: 55, 1985)。此等NGF之可能來源及其顯箸作用 部位間之生理學關係並不明顯，但通常提議（需要從NGF 之反應細胞接受神經支配的）.多種周遴组織可分泌HGF。 從小鼠頷下腺所得NGF為試管試驗及活體試驗中最常 用來研究NGF活性者。NGF之試管試驗生物活性範圍可於 {請先閲讀背面之注意事項再瑱寫本頁) .裝. •打· •線· 甲 4(210X 297公发） 205069 A6 _ B6 五、發明説明（） 初级神經細胞及擇殖細胞条測定。於試管試驗中對NGF有 反應的初级神經細胞包括得自脊椎神經節根之胚胎感覺神 經元（胎龄8-12日），得自交感神經元之自主新腎上腺素 激性胚胎神經元，得自發展期間之中隔及親鉻腎上腺細胞 之膽鹼檄性胚胎神經元。雖然感凳及交感神經元依賴HGF 來活命及發生，但膽驗激性神經元似乎不需要NGF來活命 而僅於分化時需要，換言之，欲求表現與神經傳遞物質有 鼸的表現型持性。第一發生期中將NGF加入親鉻醫上腺細 胞（從神經脊衍生而得）可使得神經表現型表現。如文獻 所述，於試管試驗中對NGF有反應的細胞糸含括從神經脊 腫瘤衍生而得之親絡腎上腺細胞，稱之為親鉻細胞瘤細胞 (PC12)及人神經母細胞瘤細胞。使用/S-NGF處理後，細胞 之行為改變，從強力增生期改成有絲***後情況。 從小鼠頷下腺所得神經生長因子為最具有特徽者，同 時也具有化學及免疫化學特徽輪廓。從鼠腺髏所得之NGF 作用類似由三値亞單位（ct, /3, 7)與Zn+原子配位所形 成的7S型蛋白質複合體〔分子量約為140,000道爾頓）。 經濟部中央揉準局印裝 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 就生物活性而言，7S分子最令人感興趣之部分傺由二 多肽鏈組成，各別具有分子量13,250且傜由11,8胺基酸 組成。各鍵或各單體具有3個硫橋，此硫橋於二半胱胺酸 殘基間生成共價鍵而對蛋白質之JL體結構提供強力穩定性 。二NGF單體彼此藉著徹弱鍵結連接而生成分子量26,500 之二元體。曾經顯示生物活性係與稱之為2.5S或習稱為 -亞單位之二元體有關。但未知此二元體是否也存在於單 平 4 (210X297 公发） 經濟部中先標準局印製 205069 A6 ___B6_ 五、發明說明（） 體内。 基因工程技術使得吾人可以鑑別NGF /3-亞單位（/3-NGF)之编碼基因（Scott, J. et al.,自然 302:538, 1983 ;Ullrich, A. et al.,自然 303 : 821, 1983 ; £1>專利 Publn. Ho.0 121 338)。該分子之人编碼基因位於染色 體I之短臂上且编碼可合成比較構成生物活性分子之分子 量26,500分子遠更大的分子。因此，基因最初指導尺寸較 大的HGF母質或ργο-NGF合成。進一步驗證NGF /3-亞單位 之编碼基因高度保存於不同種内，從鳥類至人類（Meier, R. et al.， EMBO J. 5:1489, 1986)〇 瞭解鼠，人，牛及雞/3 -NGF之核苜酸序列，因此可比 較此等分子之保留部分及非保留部分，及其與生物活性及 抗原性間之關係。演化期間/3 -NGF之整髏保留出人意外地 高。從雄小鼠頷下唾液腺純化之成熟型NGF 118胺基酸中 與牛-NGF僅有16胺基酸不同，雞々-NGF為19及人；3 -HGF 為11,牛與人/3 -NGF僅有6個胺基酸不同。所有半胱胺酸 殘基皆相當保留於各種體内。/3 -HGF之三個S-S橋還原使 莫生物活性完全喪失。胺基酸序列整體高度保留及免疫化 學型交叉反應性低中間的差異顯著，係歸咎於各種胺基酸 之變化位於特定“簇”。使用水療術可瞭解此等變化幾乎 完全出現於稱之為可能抗原定子的親水部位。至目前為止 ,所研究之各種動物中僅有一値親水區簌格保留於NGF分 子内。 R、重甜DHA坊旃 甲 4(210X 297 公发） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) •装· .線· 205069 A6 B6 五、發明説明（ 經 濟 部 中 央 揉 準 局 印 裂 重组DNA技術可構成載體条列，該等載體可大量表現 令人感興趣的蛋白質。此種技術使得分子生物學家能夠組 裝DNA条列，因而産生能夠表現令人感興趣的蛋白質的雜 交體分子。此種方法使用多種反應例如使用約束_切割， 使用接合酶接合如此所得各段，化學合成有待組裝的寡核 苜酸及其他實驗室有用菝術（Mariatis, T.等人，分子擇 殖.實驗室手册.冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1982) 。欲獲得高度表現有待組裝之DNA元體，必須提供必要資 訊。例如複製起點，抗生素之選擇，表現起動子，感興趣 基因轉錄之活化子，及其他對此種材料之培養人而言已知 的特性。此等元體以多種方式組合可獲得質.體，只要感興 趣的基因以天然方式相對於轉錄及轉譯之調節序列***且 所生成之質體係定義屬於表現範圍内即可。如此質體或表 現載髖可於寄主細胞内表現蛋白質。然後藉箸純化糸統可 得蛋白質。可天然控制多種基因例如生長因子表現之元體 (起動子）其表現力並不強，僅能於天然適當條件（通常 未知）下被活化。用於此目的，僅使用其活性已知的起動 子。例如papova病毒条列病毒或其他已知起動基因序列。 因此，用於高度表現之元體為各種來源（真核生物，細胞 ，病毒等）DNA之組合於不同基因部分末端接合而生成雜 交體。基因之轉錄及轉譯活性傜與調節序列與编碼序列間 之適常距離有關。 藉著此種引入，調節序列適當工作之最佳模式為當被 引進的基因位在天然基因的相同位置。一種有用条統為調 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) .装· •訂· •線· 甲 4(210X 297公潑） 一 b- 205069 A6 B6 五、發明説明（ 經 濟 部 中 央 標 準 局 印 裝 節序列也包括编碼序列之若干胺基酸。然後與所引入之基 因結合可獲得融合蛋白質。另一方面，若去除融合部分， 則可獲得更高生物價值。若未使用融合蛋白質技術，則獲 得位在調節序列緊密附近的基因之習知技術，偽與是否存 在有可進行擇殖的適當約束位置有關，若相容位置不存在 附近，反而存在於不同位置，則可獲得各段组合，合成含 有期望的約束址之寡核苜酸或聯結子。若約束址允許使用 附近不存在的聯結子，則可使用以Bal 31或SlBi失DNA之 技術。此種可能性不僅允許作精確的刪失，同時也可藉著 決定各傾純株之序列來檢査哪一純株最適宜。此種糸統對 分子生物學家而言用途有限，因此必須開發，代方略，以 便順應新技術的發展，例如聚合酶鐽反應（PCR)(Saiki et al.,科學 239:487, 1988; Scharf, S. J.，科學 233:1076 ,1986) 〇 藉著此種技術可將基因段擴增至10s。其原理傜基於 使用可配對之二寡核苜酸，各別位於有待擴增之DNA —股 上。二寡核苜酸相對於受檢基因序列間之距離可決定將生 成的分子尺寸。構成此二寡核苜酸，因而序列内部有一約 束址允許隨後進行擇殖。此種約束址傜天然存在，或由最 少數目之鹼基變性所構成。此種方法可定義為址指導的突 變發生，因此，可於分子生物學家以理論方式決定的位置 構成約束址。另一方面，與其他基因段相容的址構成體可 方便進行擇殖，但特別開啓以目標方式結合多値基因段的 可能。此種技術可定義為藉著直接突變進行擇殖。事賁上 {請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) .裝. •打· .線· f 4(210X 297公发） 205069 A6 B6 五 '發明説明（ 經 濟 部 中 揉 準 局 印 裂 ，藉著重組DNA技術可經由直接表現表現完整昀異源多肽 ,或另外可表現與類似的多肽之胺基酸序列部分融合的異 源多肽。概略而言，藉此方式所得産物具有生物活性（英 國專利申請公開案第2007676A號；Wenzel,美國科學家68 ，664, 1980)。 單離神經生長因子/9 -亞單位人基因之能力對吾人提 供一種最主要的可能性。藉著重組DNA技術可生成足量此 種罕見蛋白質。事實上，神經生長蛋白質可於臨床上用來 治療多種神經變性疾病。就此意義而言，有多種文獻傜有 關藉重組DNA技術獲得NGF /3-亞單位（歐洲專利公開案 第0121388號；Bruce, G. et al.,老化神經丰物學10: 89 ,1989; Hu, G. et al.，核酸研究 70:57, 1988; Edwards ,R.H,, Mol. Cell. Biol. 8:2456， 1988; Emfors, P., Proc. Hatl. Acad. Sci. 86:4756，1989)。用於生産時 ，當無法於微生物細胞内進行較廉價的表現時，則選用哺 乳動物細胞而不選用細薗。事實上，於細菌細胞条例如大 腸捍菌生産某些蛋白質較為經濟，但通常此種寄主/載體 条統僅能忠實的生産组成蛋白質的胺基酸直線序列，於細 菌體内獲得一種不可溶之質塊，推定以經濟學有利方式從 此種物質可製得特定産物，則·大腸捍菌為上選糸統，如同 某些較小分子例如干擾素及若干勤物生長蛋白質一般，其 中可於試管試驗中獲得分子之正確摺《者。此種糸統用於 具有單-雙硫鍵及肽之蛋白質，或其用途不需要特殊界定 的構造之蛋白質（作為診斷抗原或疫苗組分）時，最具有 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •訂· .線· 甲 4(210X 297公沒） 205069 A6 B6 五、發明说明（ 經 濟 部 中 央 橾 準 局 印 裝 生産力。 神經生長因子（/3 -HGF)所靥於之治療性蛋白質需要有 正確構造才能具有活性及有用，同時也須不含抗原反應。 對於從重組DHA所得之蛋白質，其製法包括糖基化反應， 生成正確的雙硫鍵及其他轉導後修飾。細菌糸的大 不符合此種要求，而晡乳動物真核細胞及酵母則符合。藉 著生物技術獲得人-NGF用作藥劑之可能用途必須將此等 問題列入考慮。 NGF之活性係與二元體形式有關，換言之，具有118 胺基酸之二類似多肽之組裝有關。使用氩硫基乙醇還原使 得生物活性實際降至零。嘗試再生三雙硫鍵$統計學觀點 看來，可使得半胱胺酸重新組裝而生成具有正確構造之分 子，等於對應於天然分子，機率為十五分之一。結果，於 大腸桿菌體内獲得分子無法確保結構同源及其用於人體作 藥劑的用途。事實上，純化至均質後，從大瞄捍蘭生成之 人NGF藉著鼠/3 -NGF之特異性多株抗體可於免疫墨點技術 中顯示出一糸列不可歸諸生物活性二元體形式之帶。此外 ,此種結構及形式之混合體之生物活性比較從天然來源例 如胎盤組織純化之類似人體型之活性低10倍。 此種於大_腸桿蘭體内擇殖及獲得神經生長因子之方法 ，一方面可産生高的表現水平的令人感興趣的蛋白質，另 一方面産生一条列不正確的分子，該等分子於活體試驗投 藥時將引起二次影镨，例如抗體會辨別及阻隔天然分子的 生物活性。同時，成熟分子於大腸捍鍤擇铕具有無法去除 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •訂· •線· 甲 4(210X297公沒） 205069 A6 B6 五、發明説明（ 經 濟 部 中 央 揉 準 局 印 裝 的初蛋胺酸，該蛋胺酸確實具有免疫原性，歸因於其位於 分子之暴露部分之故。 另一種技術俗有關於真核細胞擇殖前原-HGF,該技術 包括利用天然存在於真核細胞内之特定肽酶進行攻擊/而獲 得成熟分子。特定言之，於中國倉鼠卵巢細胞（CH0)進行 擇殖。從現有文獻得知，人NGF之全體基因組擇殖仍然未 決定序列，但己經顯示基因長度超過lOkda (Ullrich, A. et al.,自然303:821, 1983)。如此延長的基因不允許 由此整體基因組序列進行習知擇殖。該技術傜擇殖僅含蛋 编碼部分之一部分cDNA。此時，人NGF之完整cDNA尚 k單離（5·位置缺某些条.列），但已知其他來源（鼠， 牛，雞，等）HGF信使基因之更多訊息（Meie「，R. et al,, EMBO J. 51489, 1986; Selby，H.J.,神經元研究期 刊18 : 293, 1987),因而獲得令人感興趣的演繹。小鼠 NGF基因以單套存在，可生成具有不同尺寸的至少4傾信 使基因（Selby, M.J. et al., Mol. Cell. Biol. 7:3057 ,1987)。此種不同尺寸特別反應在不同的起始AUG字碼 子，最主要地位在相對於成熟蛋白質的位置-187及-121。 此等信使基因以不同含量存在於各種組織。始於-187者於 頷下腺之存量比始於-121者多10倍。然而，不同的證據顯 示與腦中表現之HGF信使基因最為符合一致的百分率，傜 精確地使用位於-121的AUG。 發明夕總给 因此，本發明條有關一種藉表現載體獲得人NGFyS- % 甲 4(210X297 公发） 10- {請先閔讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. •線， A6 B6 205069 五、發明説明（ 亞單位之方法，因此，介於址與蛋白質编碼址間存 在有天然距離，載體用於真核1"胞条例如CH0上，因而可 於培育時，於不存在有一或多與多肽融合的胺基酸之下獲 得成熟型人神經生長因子/3-亞單位（h/3 -NGF),此乃與 天序列不同。如此所得多狀用於適當標的細胞時顯示生物 活性。 本發明所述之h/S -NGF可用於維持或防止神經功能喪 失，用於恢復慢性或急性病變情況，用於神經退化病情， 甚至用於急性病變之遲發期，例如腦血管，感染，發炎， 壓迫，代謝缺陷及用於調控免疫糸统。所得多肽又不含其 他人體來源之污染蛋白質，其可能具有不期_望的生物活性 者。 本發明又旨在可用於細胞穿染之基因構成體，包含可 於活體試驗植入者。若干構成體可於局部層面生成，特別 隨著攝取飲食生成人生長因子活性型，換言之，可將基因 保持於控制之下。 本發明又旨在含有所述載體之轉形細胞糸，及可産生 h/3 -NGF之培養。本發明之目的也有關藥物製劑，其中包 括一種或多種親神經因子/3 -單位與天然神經節苜之新穎 複合體，或其衍生物或半合成類似物或其鹽作活性物質。 圖式籀塱說明 第1圖為人來源之神經生長因子/S-亞單位之多肽之 水療圖。 第2圖為pMSGphNGF表現載體構成體之示意代表圖。 甲 4(210X 297公发） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· .線· 經 濟 部 中 央 標 準 印 裝 11· 205069 A6 B6 五、發明説明（ 桷充 第3圖為pMSGphNGF表現載體之示意代表圖。 第4圖為pSV40MTphNGF表現載體構成體之示意代表圖 經 濟 部 中 央 揉 準 局 印 第5圖為pSV40MTphNGF表現載體之示意代表圖。 第6圔為pSV4GphNF表現載體構成體之示意代表圖。 第7圖為pSV40phNGF表現載鹾之示意代表圖。 第8圖為pSV40hNGF表現載體構成體之示意代表圖。 發明_细説明 由此等證據.願始準確地從位於-121之蛋胺酸•跟始 擇殖本發明之人/3 -NGF。分析水療圖顯示介於-121與-104 間之胺基酸可作為前導子肽，指示可分泌蛋#質。此圖顯 示於第1圖，顯示依據所述方法之人醱來源之神經生長因 子亞單位多犹之輯水性分析（Hop.p,et al.，Proc.. .Na.tl,. Ac.d .Sci. USA 78:3824，1981)。表示為-121/ -104之位置 代表前導子肽，而以+1/+118指示之位置代表人體來源之 神經生長因子；3 -亞單位多肽之胺基酸序列（Ullrich et al.,自然303:821，1983)。欲求獲得成熟蛋白質，存在 有一種特定肽酶可獲得從+1及位於+118之胺基酸序列對應 於生物活性肽。此種肽酶含於通常可合成NGF之細胞内也 顯示含於AT-20細胞内。事實上，藉著將由鼠來源之牛痘 病毒前原-NGF所組成的載體引進此等細胞内，可分泌成熟 NGF ,因此可於凝膠内於變性及還原條件下生産14Kda分 子（Edwards, R. H.， Mol. Cell. Biol. 8:2456, 1988) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .装· •綵· 甲 4(210X297公沒） 205069 A6 B6 五、發明説明（） 經由前述獲得神經生長因子/9-亞單位之绛驗，發明 人以一種創新之方式比較可用於真核細胞的一種或多種載 體構成體。使用PCR技術來進行前原-NGF之擇殖，就該技 術生成可與多種表現載髏相容之址，此等約束址之位置儘 可能維持調節序列與编碼序列間之天然距離，此種情況與 先前參考文獻中敘述用來表現卢-NGF亞單位之基因構成體 相當不同。部分前原-NGF與從英國技術公司（英國，牛津 )獲得的經修飾之成熟人NGF(h/S-NGF)序列接合，其中産 生約束址，因此可進行随後之突變。供本發明目的之用， 存在有此等約束址不得視為限制性，如同·基因來源不可視 為限制性一般。 由此種假定開始，發明人随後於不同起動子SV40 (猴 病毒40)，MTTV (小鼠乳腫瘤病毒），hMTIIa (人金屬硫 新質Ila )控制之下擇殖前原-/S-NGF。然後被引進質體 内之此等基因序列穿染於CH0細胞，顯示此等細胞即使於 培養介質中也可産生呈生物活性形式之h-NGF多肽。證實 此種前原-NGF為分子組裝所必須，因而可僅表現/3 -亞單 位，且顯示金體基因構成體被視為正確者。 A、所用槪略方法： 使用約束酶攻擊DHA鍵偽依據製造商之規格進行。概 略而言，lw g質體於20；u 1溶液中以1U酶切割；溫度及培 經 $ 育時間依據所用酶而定，通常為於37C1小時。培育後，
X 央 於瓊脂糖膠LMP瓊脂糖（BRL,美國）於40mM tris/HCl, 揉 % 20mM乙酸納，ImM EDTA純化質體及基因段，然後使用組包 印 裂 甲 4(210X297公寿） -13- {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) •装· .線. 經濟部中央揉準局印裝 205069 A6 B6 五、發明説明（） GENECLEA^^iBIO 101 公司，美國，加州，La Jolla市） 從瓊脂糖膠上溶離。欲於5’端進行複製反應，DNA於15它 使用10U聚合酶（Klenov)處理15分鐘。欲進行接合，接合 梅T4以1U / 0.5 // gDNA之濃度以20 w g於13¾反應12小時。 藉著於HB101細胞内轉形，證實質體内之序列正確； 於含有安比西林抗生素5〇wg/ml之LB (Luria Bertani)介 質内，於瓊脂糖膠板上選出轉形體。HB101内所含之質髖 於LB, 100Wg/ml安比西林中生長及純化，使用QuUgen組 包（DIAGEN GmbH, Duesseldorf,德國）純化成大或小製 劑。使用Quiagen方法從細菌細胞製得表現載體。 PCR反應用之DNA像以如下方式從足月的胎盤製得。 使用剪刀剪下一塊0.4cm3絨毛膜絨毛及懸浮於700 w 1 50 mH tris/HCl pH 7.8, lOOmM EDTA, lOOmM NaCl, USDS 内。随後於其中加入35w 1蛋白酶（KlOOwg/ml)及於55Ό 培育隔夜。.然後將20w 1溶液加入13w g/ml RHAase内及又 培育2小時。使用酚進行兩次抽取，及於氣仿抽取兩次。 然後藉著添加一倍體積異丙醇將DNA沈澱於玻璃毛細管上 。此時使用70%及100%乙醇進行數次世代交替及乾燥。 DNA 溶解於缓衝液（lOmM tris/HCl pH7.4，lmM EDTA)内 ，於試管内維持缓慢攪動。若干小時後，溶解後之DNA準 備供基因擴增之用。通常，O.lwg DNA足夠進行PCR。 遵照製造商G IBC0之程序使甩脂小體或使用璘酸鈣於 CH0細胞（CCL61)及不存在有去氫葉酸化還原酶基因（ DHFR-)修改之CH0上進行穿染。 甲 4(210X 297公发） 1A- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) •裝. •線· 205069 A6 B6 五、發明說明（） A、2脂小鵲^窃染 細胞於cc- MEM内與5¾牛胎血清一起生長，穿染之前 使用胰蛋白酶消化，及再度鋪皿，因而次日逹到70-80% 融合。有待穿染之質體DNA稀釋至濃度10« g DNA於50w 1 Η*0 ,然後於其中加入 50wl LipofectintM(GIBCO),金 體置於聚苯乙烯管内，等候15分鐘後，將此混合物加入事 先使用介質OPTIMAM (GIBC0)洗滌之細胞上。細胞以此方 式培育8小時，然後加入含括胎牛血清之正常介質繼缠生 長。 A、3伸用磋酴鈣窀染而耩错擦宙餹形：>方法 此法用於穿染之缓衝液為：BBS濃縮雙倍（2XBBS)及 0.25M CaCls。 2X BBS傜如下述製備：50 mM N , N-貳-2-(羥乙基）-2-胺基乙烷磺酸（Calbiochem); 280mM HaCl 及1.51!^«32卟〇4溶解於水中及將？11調整至6.5,然後全 體以0.45wm過濾，同時將l〇xCaC8製備成2.5M CaCU之 溶液。 經 濟 中 央 橾 準 印 裂 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 瑱 本 頁 打 線 細胞以5X 10β細胞/ 10cm平板/ 10ml生長介質播種， 及於351C培育隔夜。20 w g質體與0.5/z 1 0.25M 〇3(：12及 0.5ml 2XBBS混合；混合物於周圍溫度培育15分鐘。然 後將混合物注於介質内及金體於35T於3S!C〇3培育。欲求 使用吾等之載體獲得穩定轉形的細胞，藉箸將pSVaNeo載 體以10比1之比例加入可表現h/9 -NGF之載體而進行共同 穿染。穿染後2日，細胞以胰蛋白酶消化及以比穿染低10 倍之濃度播種於平板，且立刻使用lmg/nil G418新徽素硫 甲 4 (210X 297 公釐) -15- 205069 A6 B6 經濟部中央橾準局印製 五、發明説明（） 酸盥（Gibco)進行穩定轉形。然後於南方墨點分析轉形體 是杏整合入基因構成體。 A、4·弟斑 全部細胞介質維持於含有15nM Hepes及10%胎牛血清 之漢氏F12/DME H-21内表現。每3天更換介質及以新鮮介 質但不含血清者取代，以便純化h/3-NGF。 R、齡住羼鵲俐 R、1丟現戧體饞成鵲夕說明 作成三種不同載體；第一及第二為其中可藉化學方式 誘生表現元體之二載體，分別為MMTV (鼠乳腫瘤病毒）及 hMTIIA (人金屬硫新質Ila)。藉此方式以ψ控制之方式 表現h/9-NGF基因。相反地，於第彐載體中，h/3-HGF於起 動子SV40 (猴病毒40)之下擇殖。 R、2於現黻體内擇箝 PMSG載體係從Pharmacia (瑞典，烏普沙拉）獲得。 根據該公司之規格，所引進之基因必須***介於Nhel及 Sail約束址間之多數擇殖址。基因藉著第一 AUG轉譯；此 例中，神經生長因子處於MMTVLTR (鼠乳腫瘤病毒長端重 複子）起動子之控制之下。此種起動子之活性可藉著投予 糖皮質固醇例如dexamethasone而誘生。於轉錄中，利用 SV40小t -抗原進行剪接及利用SV40大t -抗原進行聚腺 苜化。此種質體同時也含有可用來選擇穩定轉形的CHO KI 細胞的黃喟B令鳥糞瞟B令磷酸核糖基轉移酶（xgpt)之細胞基 因。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. .打· _線· 甲 4(210X ‘297公沒） -16- 205069 A6 B6 五、發明説明（ 經 濟 ίρ 中 央 搮 準 印 裝 欲求於此種質賭内擇殖前原-NGF,可使用PCR技術， 藉此可恰於初AUG前方産生約束址，因而維持前原-NGF之 調節序列與编碼序列間距儘可能正常。合成二寡核苜酸： 介於鹾基 9122 及 9147 (Ullrich, A.,自然 303:821, 1983 )間之第一者具有如下序列： Met Ser Met Leu Phe e，GCATAGCGTA ATG TCC ATG TTG TTC T3 如前述，位於初AUG前方之鹾基可經突變，然後合成 的寡核苜酸具有如下序列： Xbai Met Ser Mer Leu Phe B'TGT CTAG AGT ATG TCC ATG TTG TTC T3 此種寡核苜酸稱為（Xba I)。包括介於9521與9342間之鹾基 的第二寡核苜酸（Ullrich, A.，自然303:821，1983)係 與此序列互補，因而可進行PCR ,第二寡核苜酸具有如下 序列： — EC0RI e，GGCGG AATT CTCGGTGGTGGAC3 此種寡核苜酸於内部含有ECOR I址可允許前原-NGF與成熟 NGF接合。此種寡核苜酸稱為（EC0RI)。 遵照330B DNA合成儀（應用生物条統公司，美國）之標 準程序，使用磷酸亞脒酸鹽方法可於寡核苜酸合成儀上， 以固相合成此二種寡核苜酸。該方法為：（a)於55t：於NH3 處理12小時；（b)於真空離心機内調整至乾；（c)再度懸 浮於乙酸銨2.5M; (d)使用3倍體積冷乙醇（-20Ό)沈澱 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •^. .訂· .線. 甲 4 (210X297 乂发） -17. A6 B6 205069 五、發明説明（） ;及㈠）再度以80%冷乙醇洗滌及再度懸浮於水中。使用 分光光度計評估兩種寡核苜酸濃度。於Perkin Elmer Cetus DHA熱循環擴增儀上進行擴增程序，而用於擴增之 試劑為相關組包 AMplyfer(Perki Elmer-Cetus)。'主 要使用一種混合物含有各200 izm之寡核苜酸，各0.5w in之 dATP, dTTP, dCTP, dGTP寡核苜酸及O.lwg人DNA及反應 缓衝液，全鱧混合物為lOOwl且含有0.5U TAQ聚合酶， 全體皆覆蓋石蠟油以防揮發。擴增反應以人DNA為例，偽 將整體儀器蓮轉35週。兩種情況之週期如下：於94XM分 鐘，於45t!2分鐘，於72ΐ：3分鐘。300bP擴增後之段藉 著使用GENECLEAN*1^組包（ΒΙ0 101公司，善國，加州，
La Jolla市）溶解瓊脂糖膠。而於低熔點瓊脂糖（NuSieve )凝膠中純化。使用Xbai及EcoRI約束酶切下DNA且如前 述再度純化。如此純化後之段於PGEM4載體（Promega)之 Xbai及EcoRI址擇殖。所得質體稱之為pGEM4Xba-HGF。 此質體（pGEN4Xba-NGF)於 Hindlll-EcoRI 切割，純化 後，300bP段於PUC18BBG26載體（英國生物技術公司，英 國，牛津）之Hindlll-EcoRI址擇殖。PUC18BBG26含有卡 匣構成的h/3-NGF基因，換言之，其内部生成非天然的約 束址，因而可取代預定領域，換言之，允許突變。所得載 體稱之為pUCIShHGFC。此載體使用BamHI切割及使用klen-ow聚合酶於5’複製延長體。延長體於Xbai切割及760l^|y 藉瓊脂糖膠純化。此段介於pMSG表現載體之Nhel及 擇殖。獲得此種載體名為pMSGphNGF之概略圖示於第2画 {請先閲讀背面之注意事項再填3?本页) •裝. .線· 經濟部中央標準局印裴 甲 4(210X 297公发） -18- 205069 A6 B6 五'發明説明（） 經 濟 部 中 央 揉 準 局 印 ，而相同載體之示意代表圖示於第3圖。 R、2於金鼷硫斩皙捽制：> 卞律箝NGF 由於使用Ζη η或Cd^或其他重金颶離子可誘生金屬硫 新質IIa(MTIIa)作成此種載體，因此可控制其表現。此外 ,欲求增強此種起動子之表現，於MTIIa起動子5’端加入 SV40促進子，同時經常使用小t-抗原及SV40之P〇lyA進行 剪接及聚腺苜化。首先金羼硫新質之起動子接合於前原-h/3-NGF如下：藉著使用約束酶Hindlll及BamHI切割（ Karin, H.,自然 299:797, 1982)從質體（phMTIIA)單離金 靥硫新質起動子，包括起動子之841bP段於PGEM4載體之址 Hindlll-BamHI擇殖（Promega Madison,美國，威斯康辛 卅）。此載體定名為pGEM4hMTIIA。此起動子部分延長至 3’，具有數個天然字碼子，含有AUG蛋胺酸第一字碼子且 恰於其後發現BamHI約束址。欲求使用hMTIIa起動子之初 蛋胺酸於此種起動子之下擇殖前原-h/3-HGF,介於鹼基 9133 及 9160 (Uiirich, A.,自然 303:821, 1983)間構成 寡核苜酸産生BamHI約束址恰位於最初AUG之後，如此允 許將基因帶入相中。合.成寡核苜酸具有如下序列： Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu lie B'TG TCC ATG TTG TTC TAC ACT CTG ATC AC3 被突變成如下序列： BamHI B，TGG ATCC ATTGTTCTACACTCTGATCACs 此種赛核苜酸稱之為BamHI。改變的鹼基也包括胺基酸序 {請先閑讀背面之注意事項再填寫本页) •裝· .線· 甲 4(210X297公沒） 19· 205069 A6 B6 經濟部中央揉準局印製 五、發明説明（） 列改變；事實上，第二及第三胺基酸分別從Asp改成Ser 及從Pro改成Met。然而，此種變化對水療圖並無什麼影 堪，仍然可正常分泌分子。 此種寡核苜酸連同EcoRI寡核苜酸月來如前述擴增前 原-NGF。純化後之段於BamHI及EcoRI切割，然後介於 PGEM4hMTIIa載體之BamHI與EcoRI約束址間擇殖。此載體 稱之為 pGhMTphHGF。 欲求獲得SV40之促進子（活化子），從PMSGphNGF質 體取出促進子如下：PMSGphHFG載體使用BamHI切割，然後 使用Klenow聚合酶於5·複製延長體。然後使用Hindlll切 割及500bp段於PGEM3内介於Nael與HindIII_束址間擇殖 。所得載體稱之為PGSV40。 欲求獲得表現載體，前述各段以Η段之三重結合如下 :PMSGphNGF載體使用EcoRI及BamHI約束酶切割及純化 1500bp段。pGhHTphNGF載體使用 Hindlll-EcoRI酶切割及 純化1100bp段。二段共同於pGSV40載體内介於HindIII與 BamHI約束址間擇殖，獲得此種名為pSV40MTphHGF之表現 載體之摘要圖見第4圖，而該載體之示意代表圖見第5圖 Ο 此載體pSV40MTphNGF可連同PSV2Neo質體共同以雙重 穿染引入CH0KI細胞内，及如前述藉箸新徽素G418(GIBC0 ,BRL)lmg/ral選擇。此種質體與phMT質體共同穿染而選出 含有高套數之群落。此例中，CH0KI細胞於50mN硫酸鋅中 暴露24小時而誘使金颶硫新質合成，及使用氣化鎘選擇， 甲 4 (210X297 公发） -20- ( { ......................................................¾...............................訂..............................#?, {請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) 205069 A6 B6 五、發明說明（） 以2.5«m之濃度開始至20wb。含高套數hNGF之細胞用來 表現分子。
B、4於SV40fe動子促准芊控制：> 下槿箝NfiF pGEM4XbaNF質體使用HindIII及EcoRI約束_切割，及 300bp段取代於pSV40 MT phNGF質體内介於Hindlll與 EcoRI約束址間。定名為PSV40phNGF之含有此種載體之摘 要圖見第6圖，而該載體之示意代表圖見第7圖。 此乃標準之構成載體，其中調節序列定名為SV40起動 子/促進子。此種載體與pSV2Neo質體共同穿染於CH0KI細 胞及分析可産生神經生長因子/3-多肽之純株。 於CHO KT dhfr細朐内截摆 欲求獲得先前載體於CHO KI Dfhr-之基因擴增，將載 體修改，隨後擇殖hNGF基因上游之DHFR+基因。DHFR +之编 碼？$卩2补卜載體於11丨1^111切割，然後使用聚合酶於5’複 製延長體。隨後於BamH切割及1800bp段於Xhol約束址擇殖 ,如前述使用聚合酶變成鈍端，及於pSV40hNGF載體内使 用BaniHI處理。藉此方式生成PSV40hNGF表現-選擇質體。 獲得此種載體之摘要圖見第8圖。 此種質體正常穿染於CHO KI細胞内，於2 MEM介質内 不含有核苜而含有10%胎牛血清。二日後，細胞使用胰蛋 白酶處理及諏整為先前濃度之1/10,使用l〇wm MTX( 經 $ methotrexate)至500 /i m進行擴增。通過最高濃度MTX仍 J 然可倖存之細胞用來表現hNGF。 標 準 牛物活袢測亩 局 印 裂 T4(210X297 公沒） -21- {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .装· •訂· .線· 205069 A6 B6 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項吞填寫本頁) CH0細胞条於穩定後，於***前述三個載犛之任一者 後，研究其於培養介質之生物活性偽於親鉻細胞瘤胚胎細 胞 PC-12,進行（Greene L.A. et al., Rev. Meurosci. 3: 353, 1982)。反應特異性俱使用可生長未轉形CHO糸之培 養介質檢査，或使用鼠來源或牛來源之NGF之特異性多株 抗體阻斷培養介質中h/3-NGF之活性而檢査。使用前述値 別載體轉形及穩定化之三細胞条可産生呈生物活性型之人 NGF /8 -亞單位。 雈物紺成物 .訂. -線* 本發明之h/S -NGF可依據已知方法調配而生成藥物有 用之組成物。含有從重組DNA衍生而得之人]SPF分子（卢-亞單位）（就此方面而言，不含也可能含有神經節苜及磷 脂質）之藥物組成物之調配，包括可供藥物用途之組成物 之已知製法，該組成物可投予病人，因此，有效量之hNGF 分子與藥物可接受之載媒劑混合。適當載媒劑及其包括其 他蛋白質之配方，例如述於“雷明頓藥物科學”（雷明頓 藥物科學，Mack出版公司，美國，賓州，伊頓市，1985) 。此種載媒劑包括注射用“長效調配劑”。 基於前述，雖然並非排他地，藥物調配劑包括神經生 長因子溶液或其凍乾粉末連同一種或多種藥物可接受性載 媒劑或稀釋劑，容纳於缓衝至適當PH且與生理液體等張之 經 ^ 器件内。以凍乾製劑為例，可使用支載賦形劑，例如但非 t 限於，甘露糖醇或甘油，及適當體積之缓衝液可供獲得具 搮
| 有適當PH之等張缓衝液。類似溶液可用來製成從重組DNA 印 裂 甲 4(210X297公沒） _22~ 205069 A6 B6 經濟部中央揉準局印裂
五'發明説明（） 所獲得之神經生長因子分子於具有期望體積的等張溶液内 之藥物組成物用之藥物溶液，其中包含，但非絶對包含， 使用含有磷酸鹽或檸樣酸鹽呈適當濃度的生理缓衝溶液而 每次獲得具有期望PH例如中性PH之等張藥物製劑。 藥物調配劑又包括，但非限於，具有凍乾賦形劑供直 腸投藥用之栓劑，例如水溶性，自動乳液糖明膠型或其他 。此等製劑中，從重組DHA所得之神經生長因子可以介於 0.01%至1/U重量比整體賦形劑間改變之數量存在。栓劑 可含有適當數量之乙醯基水楊酸鹽，但非僅限於此。 此等藥物製劑像供口服，直腸，非經胃腸道，局部， 吸入，腦内使用。因此，可呈固體或半固體P式，例如糖 衣錠，錠劑，含明膠之蓋，膠囊，栓劑，軟明膠膠囊。供 非經胃腸道及腦内使用，可使用供肌肉，皮下投藥或靜脈 或腦用輸注或注射用之劑型，因此，可為活性化合物溶液 及活性化合物凍乾粉末連同一種或多種藥物可接受性賦形 劑或稀釋劑，適合供前述用途且具有與生理液體相容的滲 透度者。供局部使用，可使用箱劑或軟蕾劑型；供吸入用 ;可考慮使用噴蓀例如鼻噴霧劑型。 本發明之製劑可供人體或動物體使用。較好，溶液劑 ，噴霧劑，軟莆劑及霜劑含有0.01%至10%活性組分；及 固體劑型含有1%至100%,較好5%至50%活性化合物。 投藥劑量傺依據適應症，期望之功效及所選用之投藥模式 而定。 本發明也包括神經節苜或衍生物與神經生長因子NGF (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •蛑· .打. •線· 甲 4(210X 297公潑） -23· 205069 A6 B6 五、發明說明（） /3 -亞單位之所有新穎複合體用於前述適應症之治療用法 。人體每日注射劑量（皮下或肌肉或腦内）為〇.〇5mg至5 mg活性物質/· kg體重。 業己如前述説明本發明，顯然易知此等方法可以多種 方式修改。此等修改不得視為背離本發明之精魅及特點， 對業界技藝精湛人士而言顯然易知之所有此等修改皆含括 於附随之申請專利範圍内。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .装· ，打. •線· 經 濟 部 中 央 揉 準 印 裂 肀 4(210X 297父发） -24-