TW202400638A - 用於治療胃腸發炎病症之方法的抗btn3a抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示用於治療諸如發炎性腸病之胃腸發炎病症的BTN3A抑制性抗體。本發明更具體而言係關於特異性結合至BTN3A且抑制Vγ9/Vδ2 T細胞之脫粒化的特異性抗BTN3A抗體，及其在製造用於治療諸如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病(Crohn's disease)之胃腸發炎病症之新穎藥物中的用途。

Description

用於治療胃腸發炎病症之方法的抗BTN3A抗體
胃腸病症係指涉及胃腸道，即食道、胃、小腸、大腸及直腸，及輔助消化器官，肝臟、膽囊及胰臟之疾病。術語涵蓋急性、慢性、復發性或功能性病症且覆蓋各種不同來源之疾病，亦即先天性、環境性、代謝性、功能性、中樞神經系統處理、細菌性、自體免疫性……已進行若干大規模全球研究，且經顯示全世界24%至40%的人患有胃腸病症，其影響生活品質及健康照護的使用及成本(Sperber AD等人, Gastroenterology, 2021年1月;160(1):99-114.e3；Mathews C等人, Clin Gastroenterol Hepatol, 2021年7月1日:S1542-3565(21)00711-4)。
在彼等胃腸發炎病症中，發炎性腸病(IBD)為最具影響力及主要的公共健康問題之一。IBD係一種使人虛弱的胃腸道慢性發炎病症，發病高峰年齡在***及青年期。其包含兩種特發性GI病症，稱為潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)及克羅恩氏病(Crohn's disease，CD)。儘管進行了大量研究工作，但仍未完全理解疾病的病原學。然而，似乎遺傳及環境因素兩者均涉及IBD的病因，影響腸道黏膜與內腔細菌之間的相互作用，破壞對腸細菌的黏膜免疫反應之調節限制，換言之，亦即免疫(發炎)反應太容易觸發及/或不必要延長。UC及CD均為緩解性及復發性類型的慢性病症。正因IBD之初始發病之原因為未知的，這導致亦不明確緩解及復發(Tavakoli P等人, Public Health Rev, 2021, Public Health Rev. 2021年5月5日;42:1603990)。
IBD之發病率在全球範圍內逐漸上升且在2019年，IBD之報導最高發病率值係在歐洲、北美及澳大利亞(Tavakoli P等人, Public Health Rev, 2021, 參見上文)。CD之發病率已增加70%且UC之發病率已增加60%。2017年估計全球6至8百萬人受到影響。
UC之特徵在於大腸之慢性發炎，伴隨免疫系統之異常活化。其影響結腸及直腸之最內層。CD可影響自口至肛門之任何水平的腸道及腸壁之所有層，但主要影響下段小腸(迴腸)及結腸。IBD之最常見症狀包括腹瀉、直腸出血、間歇性噁心及嘔吐及腹痛或壓痛(Baumgart DC, 及Sandborn, WJ, The Lancet, 2007年5月12日;369(9573):1641-57；Strober, W, Fuss, I, 及Mannon, P, J Clin Invest, 2007年3月;117(3):514-21)。該等症狀係由於過度發炎反應引起之腸損傷。此等免疫介導疾病之併發症包括貧血、營養不良、腸阻塞、瘺管、感染及大腸癌(colon cancer)風險增加。亦可出現腸外表現，諸如關節問題(關節痛、關節炎及僵直性脊椎炎)、皮疹及皮膚病狀(結節性紅斑、牛皮癬)、慢性肝病(原發性硬化性膽管炎)及眼睛病狀(諸如葡萄膜炎)。臨床管理重點在於使患者保持緩解及無症狀，其主要目的在於減少復發期間的發炎且次要目的為延長在內視鏡緩解及黏膜癒合中停留的時間，但目前不存在治癒IBD患者之方法。目前管理選擇方案係基於不同治療類別：(i)抗炎藥物，如胺基水楊酸鹽或類固醇；(ii)免疫抑制劑，如阿茲托平(aziathropine)、環孢素、JAK抑制劑；或(iii)生物製劑(抗TNFa、抗IL-12/23、抗a4b7單株抗體)。儘管健康照護有所改良，但IBD仍影響患者之壽命且近期估計表明IBD使女性之預期壽命降低6.6至8.1年且男性之預期壽命降低5.0至6.1年(Kuenzig Me等人, CMAJ, 2020年11月9日;192(45):E1394-E1402)。因此，仍存在顯著未滿足之醫療需求(Danese S等人, Dig Dis, 2019, 37(4): 266-83)。
在人類及非人類靈長類動物(NHP)中，主要周邊γδ T細胞亞群表現由Vγ9及Vδ2鏈組成的T細胞受體(TCR)。此Vγ9Vδ2 T細胞亞群代表周邊血液中約5%之CD3+細胞及健康成人中之大於80%之周邊γδ T細胞。(Bonneville M等人, Nat Rev Immunol, 2010；Poggi A及Zocchi MR, Front Immunol, 2014)。活體外研究表明，Vγ9Vδ2 T細胞能夠偵測來自感染及惡性細胞之應激信號，該等應激信號與稱為磷酸抗原(pAg)之含有有機焦磷酸鹽分子的細胞內積聚有關。將pAg鑑別為Vγ9Vδ2 T細胞之有效及特異性活化劑使人們理解BTN3A在Vγ9Vδ2 T細胞之抗原活化中起強制作用，此為理解Vγ9Vδ2 T細胞生物學之重要進展。BTN3A為1型跨膜蛋白之嗜乳脂蛋白家族的成員，而1型跨膜蛋白又屬於Ig超家族。已描述BTN3A之三種同功異型物(BTN3A1、BTN3A2及BTN3A3)，其區別在於其細胞內域(例如存在或不存在B30.2/SPRY域)，以及其細胞外域內之少量胺基酸差異。pAg之細胞內積聚經由pAg與細胞內B30.2域之相互作用誘導BTN3A1發生構形變化。此相互作用引起隨後活化之Vγ9Vδ2 T細胞特異性識別BTN3A1(Gu S等人, Semin Cell Dev Biol, 2018年12月; 84:65-74 12月; 84:65-74)。BTN3A1同功異型物為能夠將細胞內pAg積聚信號傳導至細胞表面且觸發Vγ9Vδ2 T細胞識別及活化的唯一分子(Gu S等人, Semin Cell Dev Biol, 2018, 參見上文)。
BTN3A表現限於人類及非人類靈長類動物(NHP)。此外，BTN3A直系同源物不在嚙齒動物中表現且嚙齒動物亦缺乏Vγ9Vδ2 T細胞，由此使其不適合用於測試BTN3A/Vγ9Vδ2之療法)。
McCarthy實驗室之先前研究已確定，人類腸道含有藉由「組織駐存」標記物CD103之不同表現鑑別之兩個不同的Vδ2 T-細胞亞群。在健康結腸中，黏膜主要由僅對微生物PAg表現出微弱細胞介素反應的CD103+ Vδ2 T-細胞填充，而來自克羅恩氏病(Crohn's disease，CD)患者的結腸實際上由在PAg活體外暴露後表現出增強發炎性細胞介素產生的CD103- Vδ2 T-細胞主導。此外，對來自CD患者之血液Vδ2 T-細胞之分析表明，其在循環中之頻率及腸歸巢潛能與包括CD69及CD27之TRM標記物的差異表現相關，表明腸中之細胞募集/保留可能在塑形黏膜Vδ2T-細胞活性方面起主要作用。另外，其他組顯示，循環γδ T細胞在活性IBD (CD及UC)及腸活檢體中更豐富，尤其Vd2 T細胞在晚期IBD患者之活檢體中比早期IBD患者更多，此等Vδ2 T細胞產生更多IFNδ、TNFα及IL-17 (Giacomelli R等人, Clin Exp Immunol, 1994；Mc Carthy NE等人, J Clin Invest, 2015；Mc Carthy Ne等人, J Immunol, 2013；Markovits N等人, Inflammopharmacology, 2017；Lo Presti E等人, J Crohns Colitis, 2019)。因此，藉由抗BTN3A單株抗體阻斷其功能靶向Vδ2群體可能具有潛在治療意義。目前尚無針對IBD開發的γδ靶向療法且未滿足的醫療需求仍然較高。
WO2012080769描述一種稱為mAb 103.2的特異性鼠類單株抗體，其具有抑制Vγ9Vδ2 T細胞之細胞溶解功能、產生及增殖的能力。因此，此類鼠類抗體mAb 103.2及其相應嵌合及人源化形式或其片段經提出可能適用於治療發炎病症。
WO2020136218進一步報導mAb 103.2之Fab片段表現出活化特性，該等活化特性具有活化Vγ9Vδ2 T細胞之細胞溶解功能、產生及增殖的能力。
本發明現在依賴於以下發現：某些人源化抗BTN3A1抗體可在健康供體活體外、在IBD患者離體及在食蟹獼猴胃腸炎症動物模型活體內強有力地抑制Vγ9Vδ2 T細胞功能，且因此可有利地用於治療諸如IBD之胃腸發炎疾病。
本發明係關於一種經分離之抗BTN3A抗體，其係用於治療有需要之人類個體之諸如發炎性腸病之胃腸發炎病症，其中該抗BTN3A抗體特異性結合BTN3A1且該抗BTN3A抗體係選自活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤(Daudi Burkitt's lymphoma)細胞株共同培養之γδ T細胞之脫粒化的抗BTN3A抗體，其中IC50為10 nM或更低，較佳1nM或更低，例如經藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定。
本發明亦係關於治療有需要之人類個體之諸如發炎性腸病之胃腸發炎病症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之經分離之抗BTN3A抗體，其中該抗BTN3A抗體特異性結合BTN3A1且該抗BTN3A抗體係選自活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株共同培養之γδ T細胞之脫粒化的抗BTN3A抗體，其中IC50為10 nM或更低，較佳1nM或更低，例如經藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定。
本發明進一步係關於一種經分離之抗BTN3A抗體在製備用於治療有需要之人類個體之諸如發炎性腸病之胃腸發炎病症之藥物的方法中的用途，其中該抗BTN3A抗體特異性結合BTN3A1且該抗BTN3A抗體係選自活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株共同培養之γδ T細胞之脫粒化的抗BTN3A抗體，其中IC50為10 nM或更低，較佳1nM或更低，例如經藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定。
在以上抗BTN3A抗體之特定實施例及其使用方法中，該抗體係選自由以下組成之群： (i)        具有SEQ ID NO: 21之重鏈及SEQ ID NO: 22之輕鏈的抗體mAb1， (ii)      具有SEQ ID NO: 7之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO: 8之輕鏈可變區(VL)但具有不同恆定區的mAb1變異體， (iii)    具有SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2及SEQ ID NO: 6之LCDR3但具有不同構架區的mAb1變異體，或 (iv)     與mAb1結合相同抗原決定基之mAb1變異體，其中該抗原決定基包含SEQ ID NO: 20或基本上由其組成，更佳其至少結合BTN3A1之殘基53、62、66，且其中該變異體不具有SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 23之LCDR2及SEQ ID NO: 6之LCDR3。
在更特定實施例中，依本文所揭示之選定的經分離之抗BTN3A抗體為mAb1之變異體，其具有SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2及SEQ ID NO: 6之LCDR3，其中VH胺基酸序列與SEQ ID NO：7具有至少90%一致性但小於100%一致性，較佳至少95%一致性，且VL胺基酸序列與SEQ ID NO:8具有至少90%一致性但小於100%一致性，較佳至少95%。
在特定實施例中，根據本發明所使用之經分離抗BTN3A抗體結合人類BTN3A1同功異型物，其中K D為10 nM或更小，較佳K D為1 nM或更小，經藉由表面電漿子共振所量測，通常在1.10 -11與1.10 -9M之間，經藉由表面電漿子共振(SPR)分析所量測，及/或結合人類周邊血液單核細胞(PBMC)，其中EC50為0.1 µg/mL或更小，較佳EC50為0.05 µg/mL或更小，例如在0.1 µg/mL與0.005 µg/mL之間，諸如約0.02 µg/mL。
在特定實施例中，根據本發明所使用之經分離抗BTN3A抗體為mAb1之功能變異體，其保留至少相當大比例之mAb1親和力，較佳至少90%之親和力，經藉由SPR分析所量測，且具有以下特性中之至少一或多者： (i)        其活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株共同培養之γδ T細胞之脫粒化，其中EC50為10 nM或更低，較佳1nM或更低，例如經藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定； (ii)      其實質上抑制來自患者之周邊Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力，例如經用自罹患發炎性腸病之患者分離之周邊血液單核細胞(PBMC)進行的離體分析所測定；及/或 (iii)    其實質上抑制來自發炎性腸病患者之腸活檢體的腸Vδ2+ T細胞之磷酸抗原介導之活化及/或增殖，例如在離體分析中，使用出走細胞(walked out cell)，藉由CD25或HLA-DR表現所測定。
在特定實施例中，根據本發明所使用之經分離抗BTN3A抗體為人類或人源化抗體。
在特定實施例中，根據本發明所使用之經分離抗BTN3A抗體包括IgG Fc區，較佳突變型或化學修飾之IgG1恆定區，其中該突變型或經化學修飾之IgG1恆定區在與具有野生型IgG1之相應抗體，例如具有以下胺基酸取代L247F L248E及P350S之突變型IgG1恆定區相比時，不賦予或降低與Fcγ受體之結合及/或ADCC介導活性。
在特定實施例中，該胃發炎病症為發炎性腸病，例如潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病(Crohn's disease)。
通常，依本文所描述之本發明所使用之經分離抗BTN3A抗體係以1至100 mg之劑量向個體靜脈內投與。
在特定實施例中，本發明所使用之經分離抗BTN3A抗體係與較佳選自抗細胞介素抗體(抗IL-12、抗IL-23、抗TNFα)、抗a4b7整合素抗體及JAK抑制劑之抗炎治療組合、同時或分別投與。
定義為了使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。在通篇[實施方式]中，闡述其他定義。
依本文所使用，術語「BTN3A」在此項技術中具有其一般含義，且除非另外規定，否則其係指包括SEQ ID NO: 17之BTN3A1、SEQ ID NO: 18之BTN3A2或SEQ ID NO: 19之BTN3A3的人類BTN3A多肽。
「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用且廣泛地係指任何長度之胺基酸殘基之聚合物，與修飾(例如磷酸化或醣基化)無關。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸之人工化學模擬物，以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。多肽可例如藉由添加醣基以形成醣蛋白來修飾。術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」明確地包括醣蛋白以及非醣蛋白。在特定實施例中，術語「多肽」及「蛋白質」係指可由基因編碼且使用細胞表現系統諸如哺乳動物宿主細胞藉由重組方式轉譯的任何多肽或蛋白質，包括具有胺基酸聚合物轉譯後修飾或化學修飾的任何多肽。
依本文所使用，術語「重組蛋白」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之蛋白質，諸如(a)自融合瘤分離之抗體(下文進一步描述)、(b)自經傳染以表現該等抗體之相應重鏈及輕鏈之產生細胞株，例如自轉移瘤等分離的抗體。
依本文所使用，術語「抗體」係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有特異性結合抗原之抗原結合部位的分子。
在嚙齒動物及靈長類動物之天然抗體中，兩條重鏈藉由二硫鍵彼此連接，且各個重鏈藉由二硫鍵與輕鏈連接。存在兩種類型之輕鏈，λ(1)及κ(k)。存在決定抗體分子之功能活性的五種主要重鏈類別(或同型)：IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。各鏈含有不同序列域。在典型IgG抗體中，輕鏈包括兩個域：可變域(VL)及恆定域(CL)。重鏈包括四個域：一個可變域(VH)及三個恆定域(CH1、CH2及CH3，統稱為CH)。輕鏈(VL)及重鏈(VH)二者之可變區決定對抗原之結合識別及特異性。輕鏈(CL)及重鏈(CH)之恆定區域賦予重要生物特性，諸如抗體鏈締合、分泌、反-胎盤遷移性、補體結合及與Fc受體(FcR)之結合。
Fv片段為免疫球蛋白之Fab片段的N端部分，且由一個輕鏈及一個重鏈之可變部分組成。抗體之特異性存在於抗體結合部位與抗原決定子之間的結構互補。抗體結合部位由主要來自高變區或互補決定區(CDR)之殘基構成。間或地，來自非高變區或構架區(FR)之殘基可參與抗體結合部位或影響總體域結構，且因此影響結合部位。互補決定區或CDR係指一起限定天然免疫球蛋白結合部位之天然Fv區之結合親和力及特異性的胺基酸序列。免疫球蛋白之輕鏈及重鏈各自具有三個CDR，分別稱為L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3及H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原結合部位通常包括六個CDR，六個CDR包含來自重鏈及輕鏈V區中之各者的CDR集合。構架區(FR)係指***於CDR之間的胺基酸序列。相應地，輕鏈及重鏈之可變區通常包含以下序列之4個構架區及3個CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
抗體可變域中之殘基習知地根據Kabat等人所設計的系統進行編號。此系統闡述於Kabat等人，1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services, NIH, USA (Kabat等人, 1992，下文「Kabat等人」)中。此編號系統用於本說明書中。Kabat殘基名稱並不始終直接與SEQ ID序列中之胺基酸殘基的線性編號對應。對應於基本可變域結構的縮短或***結構組分、是否為構架或互補決定區(CDR)，實際線性胺基酸序列含有的胺基酸可比嚴格Kabat編號少或含有其他胺基酸。對於給定抗體，可藉由比對抗體序列與「標準」Kabat編號序列之同源殘基來確定殘基之正確Kabat編號。根據Kabat編號系統重鏈可變域之CDR位於殘基31至35 (H-CDR1)、殘基50至65 (H-CDR2)及殘基95至102 (H-CDR3)。根據Kabat編號系統輕鏈可變域之CDR位於殘基24至34 (L-CDR1)、殘基50至56 (L-CDR2)及殘基89至97 (L-CDR3)。
依本文所使用之術語「K 締合」或「K a」意欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而依本文所使用之術語「K 解離」或「K d」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。
依本文所使用，術語「K D」意欲指解離常數，其係自K d與K a之比率(亦即K d/K a)獲得且以莫耳濃度(M)表示。抗體之K D值可使用此項技術中沿用已久之方法測定。一種測定蛋白質或抗體K D之方法係藉由使用表面電漿子共振，例如藉由使用諸如Biacore ®系統之生物感測器系統進行。藉由表面電漿子共振(SPR)之簡單結合相互作用分析需要將配位體固定至感測器晶片表面，隨後將相關分析物添加至在配位體表面上流動之緩衝液中。配位體與分析物之相互作用藉由SPR儀器(通常為Biacore®系統)量測為折射率隨時間推移之變化。由此，可得到締合(K a)或解離(K d)及平衡解離(K D)常數。
依本文所使用，術語「抗BTN3A抗體」或「BTN3A抗體」係指與BTN3A具有結合特異性的抗體。
依本文所使用，術語「結合特異性」係指抗體可偵測地結合抗原重組多肽，諸如重組BTN3A1多肽之能力，其中K D為100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小，經藉由表面電漿子共振(SPR)量測所量測，例如經實例中所測定(參見表3)。在一些實施例中，抗體以經藉由SPR所量測包含於10 -3pM與100 nM之間、尤其包含於10 pM與100 nM之間、尤其10 pM與100 nM之間或10 -3pM與10 nM之間、尤其1 pM與10 nM之間、尤其10 pM與10 nM之間或1 pM與5 nM之間、尤其10 pM與5 nM或100 pM與5 nM之間的K D結合人類BTN3A1同功異型物。
「與除BTN3A之外的抗原進行交叉反應」之抗體意欲指結合除人類BTN3A之外的抗原之抗體，其中K D為10nM或更小、1 nM或更小或100 pM或更小。「不與特定抗原進行交叉反應」之抗體意欲指結合彼抗原之抗體，其中K D為100 nM或更大，或K D為1 µM或更大，或K D為10 µM或更大，該親和力係例如使用依實例中所揭示之類似表面電漿子共振(SPR)量測所量測。在某些實施例中，在標準結合檢驗中此類抗體不與抗原進行交叉反應，呈現針對此等蛋白之基本上不可偵測的結合。
抗BTN3A抗體可與其他抗原，諸如來自其他物種之相關BTN3A分子，通常食蟹獼猴BTN3A1具有交叉反應性。此外，經分離之抗BTN3A抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學物質。
片語「識別抗原之抗體」及「對於抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「與抗原特異性結合之抗體」互換使用。
特異性可進一步藉由例如約10:1、約20:1、約50:1、約100:1、10,000:1或更大之與特定抗原結合對比與其他不相關分子之非特異性結合(在此情形下特定抗原為BTN3A多肽)的親和力/親合力之比值來展現。依本文所使用，術語「親和力」意謂抗體與抗原決定基結合之強度。親和力通常藉由對BTN3A1之抗體之K D值評估。
依本文所使用，「人源化抗體」廣泛地係指包括藉由非天然細胞產生之重組抗體，例如生產細胞株，其具有可變區及恆定區，該等可變區及恆定區已經改變以更近似於藉由人類細胞產生之抗體。例如，藉由改變非人類抗體胺基酸序列以併入人類生殖系免疫球蛋白序列中發現之胺基酸。本發明所使用之人源化抗體可例如在CDR中包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或部位特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。
在特定實施例中，依本文所使用，術語「人源化抗體」亦包括其中來源於另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。
在其他特定實施例中，依本文所使用，術語「人源化抗體」亦包括其中SEQ ID NO: 1之H-CDR1、SEQ ID NO: 2之H-CDR2、SEQ ID NO: 3之H-CDR3、SEQ ID NO: 4之L-CDR1、SEQ ID NO: 5之L-CDR2及SEQ ID NO: 6之L-CDR3已移植至人類構架序列上的抗體。
依本文所使用，術語「抑制性抗體」係指能夠直接或間接抑制效應細胞之免疫功能，例如抑制增殖及擴增、產生促炎分子、針對應激細胞之細胞溶解功能、遷移及移行特性及/或包括抗原呈遞之免疫調節反應的抗體。在較佳實施例中，抑制性BTN3A抗體至少具有活體外抑制與癌細胞(諸如道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株)共同培養之γδ T細胞(通常為Vγ9Vδ2 T細胞)脫粒化的能力(儘管可使用已轉化或受損的其他細胞)，其中較佳IC 50為10 nM或更低，更佳1 nM或更低，例如0.1 nM或更低，經在CD107脫粒化分析中藉由流動式細胞量測術所測定，例如依下文實施例中所描述。IC 50(半數最大抑制濃度)可在劑量反應曲線中建立且表示其中觀測到50%最大抑制作用(亦即：活化Vγ9Vδ2 T細胞之最大抑制)的抑制性BTN3A抗體濃度。依實例中所示，藉由流動式細胞量測術評估CD107分子在其膜表面之表現來進行Vγ9Vδ2 T細胞細胞毒性之評估。劑量反應曲線通常藉由在37℃下在抗體片段存在下與道迪細胞共同培養4小時後量化CD107陽性Vγ9Vδ2 T細胞來建立。在一些實施例中，IC 50包含於10 -4nM與10 nM之間，尤其在10 -4nM與1 nM之間，尤其在10 -4nM與0.1 nM之間，或在10 -3nM與10 nM之間，在10 -3nM與1 nM之間或在10 -3nM與0.1 nM之間。
依本文所使用，術語「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
依本文所使用，在考慮為達成兩個序列之最佳比對而需要引入之空隙數目及各空隙之長度的情況下，兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共有之一致位置之數目的函數(亦即，一致性%=一致位置之數目/位置總數×100)。序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比測定可使用數學演算法實現，依下文所描述。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用尼德曼及翁施演算法(Needleman and Wunsch algorithm) (NEEDLEMAN及Wunsch)測定。
兩個核苷酸或胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用例如諸如EMBOSS Needle (成對比對；可在www.ebi.ac.uk獲得)之演算法測定。例如，EMBOSS Needle可與BLOSUM62矩陣、10之「空隙開放罰分」、0.5之「空隙擴展罰分」、錯誤「末端空隙罰分」、10之「末端空隙開放罰分」及0.5之「末端空隙擴展罰分」一起使用。通常，「一致性百分比」為匹配位置之數目除以比較位置之數目且乘以100的函數。例如，若在比對後，在兩個比較序列之間10個序列位置中之6個序列位置一致，則一致性為60%。%一致性通常在進行分析的查詢序列之全長上測定。具有相同一級胺基酸序列或核酸序列的兩個分子係相同的，與任何化學及/或生物修飾無關。
根據本發明所使用之抑制性 BTN3A 抗體本發明係關於抑制性BTN3A抗體，其用於治療有需要之人類個體之胃腸發炎病症，諸如IBD，其中該抑制性BTN3A抗體特異性結合至BTN3A且抑制γδ T細胞之細胞溶解功能，依在活體外脫粒化分析中所測定；例如在依實例中所描述之道迪細胞存在下之CD107脫粒化分析中所測定。
在特定實施例中，抑制性BTN3A抗體藉由表面電漿子共振所量測，以10 nM或更小的K D，較佳1 nM或更小的K D，藉由表面電漿子共振(SPR)分析所量測，以通常在1.10 -11與1.10 -9M之間的K D結合至人類BTN3A1同功異型物，及/或其以0.1 µg/mL或更小的EC50，較佳0.05 µg/mL或更小的EC50，諸如約0.02 µg/mL的EC50結合至人類周邊血液單核細胞(PBMC)。
較佳地，本發明所使用之抑制性BTN3A抗體為嵌合、人源化或人類抗體。通常，將非人類抗體人源化以降低對人類之免疫原性，同時至少具有親本非人類抗體之相同或類似親和力(或更優越親和力)。
通常，人源化抗體包含一或多個可變域，其中CDR (或其部分)來源於非人類抗體，例如鼠類mAb 103.2，視情況在一個CDR中具有一個胺基酸取代以降低免疫原性，尤其在L-CDR2中，諸如SEQ ID NO: 5之L-CDR2中，其中SEQ ID NO: 24之鼠類L-CDR2之異白胺酸已由丙胺酸置換；且FR (或其部分)來源於具有降低免疫原性之突變的鼠類抗體序列。
根據本發明所使用之人源化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分或全部。
在特定實施例中，根據本發明所使用之抑制性BTN3A抗體包括IgG Fc區，較佳突變或經化學修飾之IgG1或IgG4恆定區，其中該突變或經化學修飾之IgG1或IgG4恆定區在與具有野生型IgG1或IgG4同型恆定區之相應抗體相比時，不賦予或降低與Fcγ受體之結合及/或ADCC介導活性，例如具有以下胺基酸取代：L247F L248E P350S之突變IgG1恆定區。
在特定實施例中，抑制性BTN3A抗體進一步選自BTN3A抗體，其抑制周邊Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力，例如經用自IBD患者分離之PBMC進行的離體分析所量測。此類離體分析之方案更詳細地描述於實例中。簡言之，磷酸抗原介導之周邊Vδ2+ T細胞離體活化之抑制可藉由離體分析確定，該離體分析由例如以下構成：在(i) IL2 (20 IU/ml) /IL5 (20 ng/ml)、(ii) 1 nM至10 nM HDMAPP (磷酸抗原)及(iii) 1 µg/ml該抑制性BTN3A或對照同型物存在下，將自克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎患者之血液或腸活檢體分離，且用1µM CTV染料染色的PBMC培養4天。活化可藉由量測若干標記物，諸如CD25、HLA-DR、b7整合素或CD49b來確定。對於Vδ2+及Vδ2- T細胞，增殖可藉由流動式細胞量測術量測CTV稀釋來測定，且脫粒化可藉由流動式細胞量測術測定CD107a表現來測定。
在特定實施例中，抑制性BTN3A抗體進一步選自BTN3A抗體，其實質上抑制來自IBD患者之腸活檢體之腸Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化及/或增殖，例如離體分析中，使用出走細胞，由CD25或HLA-DR表現所測定，依以下實例中所描述。
在較佳實施例中，該抑制性BTN3A抗體亦與食蟹獼猴BTN3A交叉反應。
用於治療胃腸發炎病症之參考抗體在較佳實施例中，用於治療有需要之人類個體之胃腸發炎病症(諸如IBD)的該抑制性BTN3A抗體為具有SEQ ID NO: 21之全長重鏈及SEQ ID NO: 22之全長輕鏈的mAb1抗體。
在其他特定實施例中，用於治療有需要之人類個體之胃腸發炎病症(諸如IBD)的該抑制性BTN3A抗體為具有SEQ ID NO: 7之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO: 8之輕鏈可變區(VL)但具有不同恆定區的mAb1抗體之變異體。在此實施例中，mAb1之變異體與mAb1相比具有不同恆定區，例如不同同型或相同同型，但與mAb1相應Fc區相比具有一或多個胺基酸突變。
依本文所使用，變異體抗體為與參考抗體mAb1相比具有不同一級胺基酸序列的抗體，例如藉由一或多個胺基酸添加、缺失及/或取代。較佳地，變異體抗體係藉由一或多個胺基酸取代，例如mAb1之重鏈及/或輕鏈中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代而具有不同重鏈或輕鏈之一級胺基酸序列的抗體。
在特定實施例中，mAb1之變異體與mAb1相比具有不同恆定區，例如與mAb1不同同型或相同同型，但與mAb1相比具有一或多個胺基酸突變，例如與mAb1相比Fc區中之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。
在其他特定實施例中，用於治療人類個體之胃腸發炎病症(諸如IBD)之該抑制性BTN3A抗體為mAb1之變異體，其具有SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2及SEQ ID NO: 6之LCDR3，但與mAb1相比具有不同構架區。
本發明之抑制性BTN3A抗體之CDR區係使用Kabat編號(Kabat等人, 1992, 下文稱為「Kabat等人」)定界。為易於閱讀，H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3係指VH區之3個CDR且L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3係指VL區之3個CDR。
在其他特定實施例中，根據本發明所使用之該抑制性BTN3A抗體為mAb1抗體之變異體，其具有SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2及SEQ ID NO: 6之LCDR3，其中該VH區具有與SEQ ID NO: 7至少90%一致性，較佳至少95%一致性，且該VL區具有與SEQ ID NO: 8至少90%一致性，較佳至少95%。
較佳地，該抑制性BTN3A抗體為人源化BTN3A抗體，其包含： (i)        具有SEQ ID NO: 7之VH之IgG抗體的重鏈，及 (ii)      具有SEQ ID NO: 8之VL之IgG抗體的輕鏈。
在某些實施例中，具有VH及VL序列之根據本發明之抑制性BTN3A抗體可用於藉由修飾VH及/或VL序列或與其連接之恆定區而分別產生新的BTN3A抗體。
因此，在根據本發明之至少一些實施例之另一態樣中，抑制性BTN3A抗體之結構特徵用於產生至少保留參考抑制性BTN3A抗體mAb1之抑制特性的結構相關之BTN3A抗體。
例如，mAb1之6個CDR區或具有SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之H-CDR2及SEQ ID NO: 3之H-CDR3；SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2及SEQ ID NO: 6之LCDR3的抗體可與已知構架區重組組合以產生根據本發明之至少一些實施例之額外的、重組工程改造的、抑制性BTN3A抗體，依上文所論述。用於工程改造方法之起始物質為具有SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8的VH及/或VL序列中之一或多者。
改變的抗體之功能特性可使用此項技術中及/或本文所描述之可用之標準分析來評估。在根據本發明之至少一些實施例之工程改造抗體之方法的某些實施例中，突變可沿全部或部分抑制性BTN3A抗體編碼序列隨機或選擇性引入且所得經修飾之抑制性BTN3A抗體可針對結合活性及/或其他所需功能特性進行篩選，諸如脫粒化分析中之活體外抑制特性，或抑制自IBD患者分離的周邊Vδ2+ T細胞之離體活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力(依先前章節所描述)。
突變方法已描述於此項技術中。例如，Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和突變誘發、合成連接組裝或其組合來產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用計算篩選方法使抗體之生理化學特性最佳化的方法。
同型及 Fc 工程改造在較佳實施例中，根據本發明所使用之抑制性BTN3A抗體包括免疫球蛋白，較佳IgG抗體之恆定區。
依本文所使用，術語「恆定區」或「Fc區」可互換使用以限定免疫球蛋白重鏈之C端區，包括天然序列Fc區及變異體Fc區。人類IgG重鏈Fc區一般定義為包含自IgG抗體之位置C226或自P230至羧基端的胺基酸殘基，其中編號係根據EU編號系統。Fc區之C端離胺酸(殘基K447)可例如在缺失該抗體或其對應密碼子之重組構築體之生產或純化期間移除。因此，本發明之抗體的組成可包含移除所有K447殘基之抗體群、未移除K447殘基的抗體群及具有帶有或不帶有K447殘基之抗體之混合物的抗體群。
根據本發明所使用之抑制性BTN3A抗體之恆定區可具有任何同型。同型之選擇通常將藉由所要效應子功能(諸如ADCC沉默)來引導。例示性同型為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。可使用人類輕鏈恆定區κ或λ中之任一者。視需要，本發明之抗體的類別可藉由已知方法進行切換。通常，類別切換技術可用以將一種IgG子類轉化為另一種，例如自IgG1轉化為IgG2。因此，本發明抗體之效應功能可藉由同型轉換為例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗體而變化，以用於各種治療用途。在一些實施例中，本發明之抗體為全長抗體。在一些實施例中，全長抗體為IgG1抗體。
根據本發明所使用之抑制性BTN3A抗體可經工程改造以包括Fc區內之修飾，通常以改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性，更具體而言IgG1同型之Fc區之修飾，且通常藉由胺基酸取代。
在另外其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。例如，一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換以使得該抗體具有改變之針對效應子配位體的親和力，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，以使得抗體具有改變之C1q結合及/或減弱或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變以從而改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在其他實施例中，藉由修飾一或多種胺基酸對Fc區進行修飾以降低抗體介導抗體依賴性細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)之能力及/或減小抗體對Fcγ受體的親和力。此類具有降低的效應功能且尤其降低的ADCC之抗體包括沉默抗體。
在某些實施例中，使用IgG1同型之Fc域。在一些特定實施例中，使用IgG1 Fc片段之突變變異體，例如降低或消除融合多肽介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或結合Fcγ受體之能力的沉默IgG1 Fc。
在某些實施例中，使用IgG4同型之Fc域。在一些特定實施例中，使用IgG4 Fc片段之突變變異體，例如減小或消除融合多肽介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或結合Fcγ受體之能力的沉默IgG4 Fc。
沉默效應功能可藉由抗體之Fc恆定部分中之突變而獲得，且已描述於此項技術中(Baudino等人, 2008；Strohl, 2009)。沉默IgG1抗體之實例包含三重突變變異體IgG1 L247F L248E P350S。沉默IgG4抗體之實例包含雙重突變變異體IgG4 S241P L248E。
在其他特定實施例中，本發明所使用之抗體包括不選自雙重突變變異體IgG4 S241P L248E及/或三重突變變異體IgG1 L247F L248E P350S中之恆定區。
在某些實施例中，Fc域為防止Fc域之位置314處醣基化的沉默Fc突變。例如，Fc域在位置314處含有天冬醯胺之胺基酸取代。此類胺基酸取代之一實例為由甘胺酸或丙胺酸置換N314。
在一些實施例中，本發明之全長抑制性BTN3A1抗體為IgG1抗體。在一些實施例中，本發明之全長抑制性BTN3A1抗體為具有三重突變L247F L248E P350S之IgG1抗體。
此外，根據本發明所使用之抑制性BTN3A抗體可經化學修飾(例如一或多個化學部分可連接至抗體)或可經修飾以改變其醣基化，再次改變抗體之一或多種功能特性。此等實施例中之各者進一步詳細描述於下文中。
本發明涵蓋的對本文中之抗體的修飾為聚乙二醇化或聚羥乙基澱粉化或相關技術。抗體可經聚乙二醇化以例如增加抗體之生物(例如血清)半衰期。為使抗體發生聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG) (諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在其中使一或多個PEG基團連接至抗體或抗體片段的條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷化反應來進行。依本文所使用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白之PEG形式中的任一種，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在一些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為去醣基化抗體。用於聚乙二醇化蛋白之方法為此項技術中所已知，且可應用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
本發明所涵蓋之抗體的另一修飾為本發明之抗體的至少抗原結合區與血清蛋白(諸如人類血清白蛋白或其片段)之結合物或蛋白融合物以增加所得分子的半衰期。
功能變異體抗體在又一實施例中，本發明之功能變異體抗體具有全長重鏈及輕鏈胺基酸序列；或可變區重鏈及輕鏈胺基酸序列，或與依上文所描述之參考抗體mAb1之對應胺基酸序列同源或更具體地一致的所有6個CDR區胺基酸序列，且其中此類功能變異體抗體表現出該參考抗體mAb1之所需功能特性，較佳達到實質上相同水平。
參考mAb1抗體之功能變異體，尤其在本發明之上下文中使用的VL、VH或CDR之功能變異體，仍允許抗體保留至少相當大比例(至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%)的親和力(通常藉由經藉由SPR分析所量測之K D，及/或親本抗體(例如mAb1)之特異性/選擇性進行評估)，且在一些情況下，本發明之此類單株抗體可具有比親本Ab (例如mAb1)更高的親和力、選擇性及/或特異性。
參考mAb1之所需功能特性可選自以下特性中之一或多者(較佳全部)： (i)        結合人類BTN3A1同功異型物，較佳K D為10 nM或更小，較佳K D為1 nM或更小，經藉由表面電漿子共振所量測，通常在1.10 -11與1.10 -9M之間，經藉由SPR分析所量測；例如經Biacore分析所測定，依以下實例中所描述； (ii)      結合人類PBMC，較佳EC50為0.1 µg/mL或更小，較佳EC50為0.05 µg/mL或更小，例如約0.02 µg/mL；例如0.1 µg/mL與0.005 µg/mL之間，經PBMC結合分析所測定，依以下實例中所描述； (iii)    活體外抑制與諸如道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株之癌細胞共同培養的γδ T細胞(通常為Vγ9Vδ2 T細胞)之脫粒化，較佳IC 50為10 nM或更低，較佳1 nM或更低，例如0.1 nM或更低，例如經CD107脫粒化分析所測定，依以下實例中所描述； (iv)     實質上抑制來自患者之周邊Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力，例如經用自之IBD患者分離之PBMC進行的離體分析所測定，依以下實例中所描述，及/或 (v)       實質上抑制來自IBD患者之腸活檢體的腸Vδ2+ T細胞之磷酸抗原介導之活化及/或增殖，例如在離體分析中，使用出走細胞，藉由CD25或HLA-DR表現所測定，依以下實例中所描述。
在特定實施例中，根據本發明所使用之經分離抗BTN3A抗體為mAb1之功能變異體，其保留至少相當大比例之mAb1親和力，較佳至少90%之親和力，經藉由SPR分析所量測，且具有以下特性中之至少一或多者： (i)        其活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株共同培養之γδ T細胞之脫粒化，其中IC50為10 nM或更低，較佳1nM或更低，例如經藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定； (ii)      其實質上抑制來自患者之周邊Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力，例如經用自IBD患者分離之PBMC進行的離體分析所測定，及/或； (iii)    其實質上抑制來自IBD患者之腸活檢體的腸Vd2+ T細胞之磷酸抗原介導之活化及/或增殖，例如在離體分析中，使用出走細胞，藉由CD25或HLA-DR表現所測定，依以下實例中所描述。
例如，本發明係關於mAb1之功能變異體抗體，其包含可變重鏈(V H)及可變輕鏈(V L)序列，其中CDR序列，亦即6個CDR區；HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3與mAb1之相應CDR序列具有全部至少80%、90%或100%序列一致性，其中該功能變異體抗體特異性結合BTN3A1，且該抗體表現出以下功能特性中之至少一者： (i)        其結合人類BTN3A1同功異型物，其中K D為10 nM或更小，較佳K D為1 nM或更小，經藉由表面電漿子共振所量測，通常在1.10 -11與1.10 -9M之間，經藉由SPR分析所量測；例如經Biacore分析所測定，依以下實例中所描述； (ii)      其結合人類PBMC，其中EC50為0.1 µg/mL或更小，較佳EC50為0.05 µg/mL或更小，例如約0.02 µg/mL；例如經PBMC結合分析所測定，依以下實例中所描述； (iii)    其活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株共同培養之γδ T細胞之脫粒化，其中IC50為10 nM或更低，較佳1nM或更低，例如經藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定； (iv)     其實質上抑制來自患者之周邊Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力，例如經用自IBD患者分離之PBMC進行的離體分析所測定； (v)       其實質上抑制來自IBD患者之腸活檢體的腸Vδ2+ T細胞之磷酸抗原介導之活化及/或增殖，例如在離體分析中，使用出走細胞，藉由CD25或HLA-DR表現所測定，依以下實例中所描述；及/或 (vi)     其與食蟹獼猴BTN3A1交叉反應。
其進一步係關於mAb1之功能變異體抗體，其包含與mAb1之相應重鏈及輕鏈可變區至少80%、90%或至少95%或100%一致的重鏈可變區及輕鏈可變區；功能變異體抗體特異性結合BTN3A1，且表現出以下功能特性中之至少一者(較佳全部)： (i)        其結合人類BTN3A1同功異型物，其中K D為10 nM或更小，較佳K D為1 nM或更小，經藉由表面電漿子共振所量測，通常在1.10 -11與1.10 -9M之間，經藉由SPR分析所量測；例如經Biacore分析所測定，依以下實例中所描述； (ii)      其結合人類PBMC，其中EC50為0.1 µg/mL或更小，較佳EC50為0.05 µg/mL或更小，例如約0.02 µg/mL；例如經PBMC結合分析所測定，依以下實例中所描述； (iii)    其活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株共同培養之γδ T細胞之脫粒化，其中IC50為10 nM或更低，較佳1nM或更低，例如經藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定； (iv)     其實質上抑制來自患者之周邊Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力，例如經用自IBD患者分離之PBMC進行的離體分析所測定； (v)       其實質上抑制來自IBD患者之腸活檢體的腸Vδ2+ T細胞之磷酸抗原介導之活化及/或增殖，例如在離體分析中，使用出走細胞，藉由CD25或HLA-DR表現所測定，依以下實例中所描述；及/或 (vi)     其與食蟹獼猴BTN3A1交叉反應。
在某些實施例中，CDR功能變異體之序列可主要經由保守取代不同於mAb1之親本/參考抗體序列之CDR序列；例如變異體中之至少10個、諸如至少9、8、7、6、5、4、3、2或1個取代為保守胺基酸殘基置換。在本發明之上下文中，保守取代可由以下所反映之胺基酸類別內的取代來定義： 脂族殘基I、L、V及M 環烯基相關殘基F、H、W及Y 疏水性殘基A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W及Y 帶負電殘基D及E 極性殘基C、D、E、H、K、N、Q、R、S及T 帶正電殘基H、K及R 小型殘基A、C、D、G、N、P、S、T及V 極小殘基A、G及S 轉而涉及A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P及形成T之殘基 可撓性殘基Q、T、K、S、G、P、D、E及R 更保守取代分組包括：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、***酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸及天冬胺酸-麩醯胺酸。與mAb1之CDR相比，就親水/親水性特性及殘基重量/尺寸而言之保守亦在變異體CDR中實質上保留。
親水胺基酸指數在對蛋白賦予相互作用生物功能上之重要性為此項技術中一般所理解。公認胺基酸之相對親水性促成所得蛋白質之二級結構，該二級結構又界定蛋白質與其他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及其類似物)之相互作用。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特性而分配親水指數，此等胺基酸為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；***酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。類似殘基之保留亦可或可替代地藉由相似性得分來量測，經藉由使用BLAST程式所測定(例如BLAST 2.2.8可經由NCBI使用標準設定BLOSUM62獲得，Open Gap=I I，且Extended Gap=I)。
合適的變異體通常呈現與親本多肽VH及VL序列至少約90%，例如95%之一致性。根據本發明，與第二胺基酸序列具有至少90%之一致性的第一胺基酸序列意謂第一序列與第二胺基酸序列具有90%；91%；92%；93%；94%；95%；96%；97%；98%；99%；或100%之一致性。根據本發明，與第二胺基酸序列具有至少50%之一致性的第一胺基酸序列意謂第一序列與第二胺基酸序列具有50；51；52；53；54；55；56；57；58；59；60；61；62；63；64；65；66；67；68；69；70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98；99；或100%之一致性。
在一些實施例中，功能變異體為人源化抗體。在特定實施例中，本發明之抗體為人源化抗體，其包含mAb1參考抗體之6個CDR及與mAb1之人源化構架區相比之替代人源化構架區。
具有突變型胺基酸序列之功能變異體抗體可藉由編碼核酸分子之突變誘發(例如定點或PCR介導性突變誘發)，隨後使用本文中所描述之功能檢定針對保留功能(亦即上文所闡述之功能)測試經編碼改變之抗體而獲得。
至少與 mAb1 交叉競爭及 / 或與 mAb1 結合相同抗原決定基之抗體與依本文所揭示之參考抗體mAb1具有類似有利特性的額外抗體可基於其在標準BTN3A1結合分析中以統計顯著方式與依上文所描述之mAb1交叉競爭(例如競爭性抑制結合)或結合與mAb1相同之抗原決定基的能力進行鑑別。
測試抗體可首先針對其與BTN3A1之結合親和力進行篩選，例如使用例如噬菌體呈現技術自人類重組抗體庫或自表現用BTN3A1抗原免疫之人類可變區抗體的轉殖基因小鼠進行篩選。
測試抗體與人類BTN3A1交叉競爭或抑制本發明抗體與人類BTN3A1之結合的能力表明測試抗體可與該抗體競爭結合人類BTN3A1；根據非限制性理論，此類抗體可與其競爭之抗體結合人類BTN3A1上之相同或相關(例如結構上類似或空間上鄰近)抗原決定基。
mAb1之抗原決定基已經確定且已顯示mAb1至少結合BTN3A1之殘基53、62及66 (參見例如圖1)，且因此抗原決定基包括BTN3A1之SEQ ID NO: 20或基本上由其組成。
在特定實施例中，本發明提供抑制性BTN3A抗體，其與至少依本文所描述之參考抑制性BTN3A1抗體mAb1結合相同抗原決定基。
為了篩選抗BTN3A1抗體與mAb1參考抗體中之一者結合相同抗原決定基的能力，例如經人類BTN3A1轉染之BTN3A-KO HEK293細胞在4℃下用飽和濃度(10 µg/mL)之參考抗體mAb1中之一者染色30分鐘。在2次洗滌後，測試不同劑量之測試抗BTN3A1 mAb與mAb1參考抗體中之任一者之競爭潛能(在4℃下30分鐘)。與參考抗體競爭相同結合部位之mAb將不能夠在此類參考抗體之存在下識別BTN3A1。資料可表述為平均螢光強度。或者，競爭分析可在分箱實驗中使用生物層干涉術(BLI)，藉由將重組人類BTN3A1固定在生物感測器上且藉由添加參考抗體，隨後添加潛在競爭抗體來進行。
可進一步測試選定抗體之mAb1的有利特性，尤其在抑制磷酸抗原介導之Vγ2 T細胞活化方面的特性。
因此，在一個實施例中，本發明提供一種經分離抗體，其競爭mAb1與BTN3A1之結合或結合mAb1之相同抗原決定基(通常包括BTN3A1之胺基酸52、62及66)，其中該抗體表現出以下特性中之至少一者： (i)        其結合人類BTN3A1同功異型物，其中K D為10 nM或更小，較佳K D為1 nM或更小，經藉由表面電漿子共振所量測，通常在1.10 -11與1.10 -9M之間，經藉由SPR分析所量測；例如經Biacore分析所測定，依以下實例中所描述； (ii)      其結合人類PBMC，其中EC50為0.1 µg/mL或更小，較佳EC50為0.05 µg/mL或更小，例如約0.02 µg/mL；例如經PBMC結合分析所測定，依以下實例中所描述； (iii)    其活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株共同培養之γδ T細胞之脫粒化，其中IC50為10 nM或更低，較佳1nM或更低，例如經藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定； (iv)     其實質上抑制來自患者之周邊Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力，例如經用自IBD患者分離之PBMC進行的離體分析所測定；及/或 (v)       其實質上抑制來自IBD患者之腸活檢體的腸Vd2+ T細胞之磷酸抗原介導之活化及/或增殖，例如在離體分析中，使用出走細胞，藉由CD25或HLA-DR表現所測定，依以下實例中所描述。
通常，與mAb1競爭結合BTN3A1或結合與mAb1相同之抗原決定基的抗體之根據上文第(iii)、(iv)及/或(v)點的功能特性實質上等於或優於mAb1之相應功能特性，依上文所描述。實質上相等在本文意指功能變異體保留該參考mAb1之相應功能特性的至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
通常，與mAb1競爭結合BTN3A1或結合與根據本發明之mAb1相同之抗原決定基的抗體仍具有參考抗體之親和力的至少相當大比例(至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%)，且在一些情況下，可具有比參考抗體mAb1更高的親和力、選擇性及/或特異性。
在一特定實施例中，本發明提供抗體，較佳嵌合、人源化或人類重組抗體，其結合或交叉競爭與抑制性BTN3A抗體mAb1相同的抗原決定基。
醫藥組合物在另一態樣中，本發明提供一種組合物，例如醫藥組合物，其含有與醫藥學上可接受之載劑一起調配的依上文所揭示之抑制性BTN3A抗體。
在另一態樣中，本發明提供一種組合物，例如醫藥組合物，其含有與醫藥學上可接受之載劑一起調配的本文所揭示之一種抗體，例如mAb1或其變異體或抗原結合片段，或其組合。此類組合物可包括依上文所描述之一種抗體或(例如兩種或更多種不同)抗體之組合。
依本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。載劑應適用於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。在一個實施例中，載劑應適用於皮下途徑或靜脈內注射。
無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水為醫藥學上可接受之載劑之一個實例。其他適合之載劑為此項技術中所熟知。包含此類載劑之組合物藉由熟知習知方法(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, A. Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990；及Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Mack Publishing, 2000)調配。調配物可進一步包括一或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩衝劑、防止小瓶表面上之蛋白損失的白蛋白等。
醫藥組合物之形式、投與途徑、劑量及方案自然視待治療之病狀、疾病之嚴重程度、患者之年齡、體重及性別等而定。
本發明之醫藥組合物可經調配以用於局部、經口、非經腸、鼻內、靜脈內、肌內、皮下或眼內投與及類似投與方式。
較佳地，醫藥組合物含有用於能夠注射之調配物的醫藥學上可接受之媒劑。此等媒劑尤其可為等張無菌生理食鹽水溶液(磷酸單鈉或磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂及其類似者或此類鹽之混合物)，或乾燥，尤其冷凍乾燥的組合物，其在視情況而添加除菌水或生理食鹽水時，准許構成可注射溶液。
用於投與之劑量可隨各種參數而調適，且尤其隨所用投與模式、相關病理學或者所需治療持續時間而調適。
為製備醫藥組合物，可將有效量之抗體溶解或分散於醫藥學上可接受之載劑或水性介質中。
適用於可注射使用之醫藥形式包括無菌水溶液或分散液；調配物，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；及用於無菌可注射溶液或分散液之臨時製備的無菌粉末或凍乾物。在所有情況下，形式必須係無菌的且必須係流體以達到易於注射之程度。形式必須在製造及儲存之條件下穩定，且必須經保存免遭諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。
可在水中適當地與諸如羥丙基纖維素之界面活性劑混合製備呈游離鹼或藥理學上可接受之鹽形式之活性化合物的溶液。亦可在甘油、液態聚乙二醇及其混合物中及在油中製備分散液。在一般儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。
本發明之抗體可調配成呈中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽(由蛋白質之游離胺基形成)且其由無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸及類似者)形成。用游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；及有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因(procaine)及其類似鹼。
載劑亦可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇及液態聚乙二醇及其類似物)、其適合的混合物及植物油。例如，可藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、藉由維持就分散液而言所需的粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當之流動性。微生物作用之預防可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物來實現。在許多情況下，將較佳包括等張劑，例如糖或氯化鈉。延長可注射組合物之吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。
無菌可注射溶液係如下製備：將所要量之活性化合物視需要與上文列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌。一般而言，藉由將各種滅菌活性成分併入含有鹼性分散介質及來自上文列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，由其先前無菌過濾溶液產生活性成分加任何額外所需成分之粉末。
亦涵蓋用於直接注射之更多或高度濃縮溶液之製備，其中設想使用DMSO作為溶劑產生極快的滲透，將高濃度活性劑遞送至小的發炎組織區域。
在配製時，溶液將以與劑量配製物相容之方式且以諸如治療有效之量投與。調配物易於以各種劑型(諸如上文所描述之可注射溶液之類型)投與，但亦可採用藥物釋放膠囊及其類似劑型。
對於以水溶液形式非經腸投與，例如，溶液必要時應經適當緩衝且先用足夠生理食鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑具有等張性。此等特定水溶液尤其適於靜脈內、肌內、皮下及腹膜內投與。在此方面，根據本發明，可採用之無菌水性介質將為熟習此項技術者已知的。例如，一次劑量可溶解於1 ml等張NaCl溶液中，且添加至1000 ml皮下灌注流體，或在建議之輸注部位注射，(參見例如「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版, 第1035-1038頁及第1570-1580頁)。視所治療個體之病狀而定，將必然產生一些劑量變化。在任何事件中，負責投與之人員將判定個別個體之適當劑量。
本發明之抗體可在治療性混合物內調配以包含約1至100 mg/劑量。亦可投與多次劑量。
用於輸注或皮下注射抗體之溶液的適合調配物已在此項技術中描述，且例如綜述於Cui等人(Drug Dev Ind Pharm 2017, 43(4): 519-530)中。
在某些實施例中，涵蓋使用脂質體及/或奈米粒子將抗體引入宿主細胞中。脂質體及/或奈米粒子之形式及用途為熟習此項技術者已知。
本發明之 BTN3A 抑制性抗體之用途及方法本發明之抑制性BTN3A抗體具有活體外及活體內診斷及治療效用。
上文所揭示之抑制性BTN3A抗體實際上適用於製備用於治療有需要之人類個體之胃腸發炎，諸如IBD之藥劑的方法。
尤其，抑制性BTN3A抗體可活體內抑制由磷酸抗原介導之Vδ2 T細胞的細胞溶解功能、細胞介素產生及/或增殖，依活體外或離體使用來自IBD患者之經分離免疫細胞所表明。
因此，本發明之抑制性BTN3A抗體可用於抑制有需要之個體之Vδ2 T細胞活化的方法，尤其在遷移、抗原呈遞、細胞介素分泌或細胞溶解功能方面，該等方法包含向有需要之個體投與抑制有效量之本發明之該抑制性BTN3A抗體，例如依本文所揭示之mAb1。
因此，本發明之另一目的係關於一種抑制有需要之個體之免疫反應，尤其抑制有需要之個體之活化Vδ2 T細胞之細胞溶解特性的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本發明之該抑制性BTN3A抗體，例如依本文所揭示之mAb1。
在特定實施例中，有需要之個體係選自罹患胃腸病症，例如IBD，且與對照相比，在用該抑制性BTN3A抗體治療之前展現更高的活化δ2 T細胞之血細胞計數的個體。此類對照可為例如健康個體中之活化δ2 T細胞的平均血細胞計數。
在其他特定實施例中，有需要之個體係選自罹患胃腸病症，例如IBD，根據腸中之BTN3A表現量，與對照相比，通常在腸中展現高水平之BTN3A表現的個體。此類對照可為例如健康個體中之平均BNT3A表現。
在特定實施例中，本發明之抑制性BTN3A抗體尤其適用於治療、預防或診斷諸如IBD之胃腸發炎病症，尤其涉及活化δ2 T細胞之胃腸發炎病症，例如潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病。
可用抑制性BTN3A抗體有利地治療之涉及活化δ2 T細胞的其他胃腸發炎病症包括但不限於：消化性潰瘍病、胃炎、胃腸炎、乳糜瀉、闌尾炎、胰臟炎、惠普爾氏病(Whipple's disease)、肝炎、腸炎、小腸結腸炎、十二指腸炎、空腸炎及迴腸炎、膽管炎。
本發明亦關於製造用於治療胃腸發炎病症，諸如IBD，例如潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病之藥劑的方法，該藥劑包含依前述部分中所描述之本發明之抑制性BTN3A抗體，例如依本文所揭示之mAb1。
本發明之抗體可作為唯一活性成分投與或與其他藥物結合投與，例如作為對其他藥物(例如免疫抑制劑或免疫調節劑或其他抗炎劑)或與其他藥物組合(同時或依次)之佐劑，例如用於治療或預防上述疾病。
通常，該抗炎劑可包括但不限於抗炎細胞介素，該細胞介素視情況選自介白素(IL)-12、IL-22、IL-23、腫瘤壞死因子(TNF) α。在其他實施例中，該抗炎劑可包括但不限於類固醇，例如糖皮質激素、潑尼松、氫皮質酮、5-ASA、環孢素A (CsA)或免疫調節劑，包括抗a4整合素、抗a4b7整合素、JAK抑制劑、硫唑嘌呤、巰基嘌呤或甲胺喋呤。
依本文所使用，術語「治療(treatment)」或「治療(treat)」係指防治性或預防性治療以及治癒性或疾病改善性治療兩者，包括治療有感染疾病之風險或疑似已感染疾病的個體以及患病或已診斷為罹患疾病或醫學病狀之個體，且包括抑制臨床復發。可向患有醫學病症或最終可能獲得該病症之個體投與該治療，以便預防、治癒病症或復發病症、延遲其發病、減小其嚴重強度或減輕其一或多種症狀，或以便將個體生存期延長超過在不存在此治療之情況下所預期的生存期。
依本文所使用，「治療有效量」係指在必要劑量下且持續必要時間有效達成所要治療結果的量。本發明之抗體的治療有效量可根據諸如以下各者之因素而變化：個體之疾病病狀、年齡、性別及體重，以及本發明之抗體在個體中引發所要反應的能力。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益作用超過任何毒性或有害作用的量。本發明之抗體的有效劑量及給藥方案視待治療之疾病或病狀而定，且可由熟習此項技術者決定。一般熟習此項技術之醫師可易於確定及開處方所需醫藥組合物之有效量。例如，醫師可以低於為達成所要治療效果所需之含量的醫藥組合物中所採用之本發明抗體的劑量開始，且逐漸增加劑量直至達成所要效果為止。一般而言，本發明之組合物的合適劑量將為有效產生根據特定給藥方案之治療作用之最低劑量的彼化合物量。此有效劑量將一般視上述因素而定。例如，用於治療用途之治療有效量可藉由其使疾病進展穩定的能力來度量。通常，例如可在預測治療發炎病症之功效的動物模型系統中評估化合物治療發炎病症之能力。可替代地，組合物之此特性可藉由利用熟習此項技術者已知的活體外檢定來檢查化合物抑制免疫反應誘導之能力來評估。治療有效量之治療化合物可減少個體中之免疫或發炎反應或以其他方式減輕症狀。一般熟習此項技術者將能夠基於諸如個體之體格、個體之症狀之嚴重程度及所選特定組合物或投與途徑之因素來確定該等量。本發明之抗體之治療有效量的例示性非限制性範圍為約0.1 mg/kg至100 mg/kg，諸如約0.1 mg/kg至50 mg/kg，例如約0.1 mg/kg至20 mg/kg，諸如約0.1 mg/kg至10 mg/kg，例如約0.5，約諸如0.3、約1、約3 mg/kg、約5 mg/kg或約8 mg/kg。本發明之抗體之治療有效量的例示性非限制性範圍為0.01-100 mg/kg，諸如約0.01-30 mg/kg，諸如約0.05-10 mg/kg或0.1-3 mg/kg，例如約0.5-2 mg/kg。
根據前述內容，本發明在又另一態樣中提供：
一種依上文所定義之方法，其包含例如同時或依次共投與治療有效量的本發明之抑制性BTN3A抗體(例如mAb1)及至少一種第二藥物物質，該第二藥物物質為例如依上文所指示之抗病毒劑、抗炎劑或抗微生物劑。
在一個實施例中，本發明之抗體亦可用於偵測BTN3A表現細胞之水平。此可例如藉由在允許抗體與BTN3A (在例如血液樣品中之細胞表面表現)之間形成複合物的條件下將樣品(諸如活體外樣品)及對照樣品與抗BTN3A抗體一起培育來實現。在樣品及對照中偵測且比較在抗體與BTN3A之間形成的任何複合物。例如，可使用本發明之組合物執行此項技術中熟知的標準偵測方法，諸如ELISA及流動式細胞量測術檢定。
因此，在一個態樣中，本發明進一步提供用於偵測樣品中BTN3A或BTN3A表現細胞(例如人類BTN3A抗原)之存在，或量測BTN3A之量的方法，該方法包含在允許抗體與BTN3A之間形成複合物的條件下，將樣品及對照樣品與特異性結合BTN3A之本發明之抗體一起培育。隨後偵測複合物之形成，其中樣品與對照樣品相比的複合物形成差異指示樣品中存在BTN3A。
此外，在本發明之範疇內的為由本文所揭示之組合物(例如mAb1)及使用說明書組成之套組。套組可進一步含有至少一種額外試劑，或一或多種額外抗體或蛋白。套組通常包括指示套組之內容物之預期用途的標籤。術語標籤包括在套組上或與套組一起供應或以其他方式伴隨套組之任何書面或記錄材料。套組可進一步包含用於診斷患者是否屬於將對依上文所定義之抑制性BTN3A抗體治療起反應之組的工具。
本發明將藉由以下圖式及實例進一步予以說明。然而，此等實例及圖式不應以任何方式解譯為限制本發明之範疇。
實例 選擇具有 γδ 抑制特性用於其治療胃腸發炎病症之用途的候選 BTN3A 抗體之功能分析。 SPR Biacore 分析 可使用Biacore T200 (序列號1909913)儀器運行Biacore T200評估軟體V2.0.1 (Uppsala, Sweden)，對候選BTN3A進行多循環動力學分析。
將經純化候選物在2% BSA/PBS中稀釋至2 μg/ml之濃度。在每次循環開始時，在蛋白A上捕捉各個抗體，密度(RL)為約146.5 RU (得到約50 RU之Rmax時之理論值)。在捕捉之後，在注射BTN3A1抗原(Sino Biological目錄號15973-H08H)之前使表面穩定化。於0.1% BSA/HBS-P+ (操作緩衝液)中，在介於25至0.78 nM之兩倍稀釋度範圍內滴定BTN3A1。監測締合期持續400秒且監測解離期持續35分鐘(2100秒)。使用50 μl/min之流動速率以使任何可能的質量轉移效應降至最低，來獲得動力學資料。在每次循環結束時使用兩個10 mM甘胺酸-HCl pH 1.5之注射液進行蛋白A表面之再生。對於各個測試抗體進行兩次空白(無BTN3A1)及重複一次單一濃度分析物，以檢查表面及分析物在動力學循環中之穩定性。自Fc2、Fc3及Fc4之信號減去來自參考通道Fc1之信號以校正非特異性結合與參考表面之差異。另外，從各Fc減去空白操作值，以校正任何非抗原依賴性信號變異，諸如偏移。使用一對一結合數學模型，使用整體RMax參數且沒有總體信號(常數RI = 0 RU)來擬合感測圖譜(Sensorgrams)。
PBMC 結合分析 人類PBMC係自健康團體捐血者的白血球層(在24小時內抽取之血液)，使用淋巴細胞分離劑(Lymphoprep)(Axis-shield, Dundee, UK)密度離心法分離。食蟹獼猴全血係獲自Envigo (Huntingdon, UK)。實驗當天，冷凍PBMC經回溫復甦且計數。按照製造商說明書，藉由使用LIVE/DEAD® Far Red Dead Cell染色套組(ThermoFisher, Paisley, UK)在黑暗中培育30分鐘對細胞，進行活細胞及死細胞染色。在此染色期間，在96孔稀釋盤中之流動緩衝液(0.5% BSA、2mM EDTA、1×DPBS，pH 7.4)中製作測試抗體之1:3滴定曲線。在活力染色後，收集細胞，洗滌兩次，且以1×10 6個細胞/mL再懸浮於流動緩衝液中。將1×10 6個細胞/mL之100 µL細胞轉移至新鮮U形底96孔盤之各孔。將盤離心，丟棄上清液且將細胞再懸浮於50 µL先前製備之經稀釋之測試抗體滴定系列中。在4℃下在黑暗中培育30分鐘後，將盤離心，洗滌兩次且再懸浮於50 µL之標記PE (Sigma, Poole, UK)及在流動緩衝液中稀釋1/100之山羊抗人類抗體中。在4℃下在黑暗中培育15分鐘後，將盤離心、洗滌，且將細胞再懸浮於200 µL流動緩衝液中。隨後在Attune NxT聚焦細胞計數器(ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK)上分析細胞，使用兩個雷射通道收集每個樣品10,000個事件：RL1用於活細胞/死細胞且BL2用於PE。使用儀器統計工具或FlowJo軟體(第10版, FlowJo, LLC, Ashland, USA)對活的淋巴球細胞群進行門控分析資料。隨後計算來自BL2通道(PE信號)之X-中位數且針對濃度繪圖。
CD107 脫粒化分析 分析由以下組成：量測BTN3A候選抗體對道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株之γδ T細胞脫粒化能力的抑制作用(Harly C等人, Blood, 2012, 第120卷第11期第2269-79頁)。γδ T細胞藉由用唑來膦酸(1 µM)及IL2 (200 IU/ml)將其培養11至13天自健康供體之PBMC擴增。在第5天、第8天及其後每2天添加IL2。γδ T細胞之百分比在培養開始時測定且藉由流動式細胞量測術評估培養時間直至達到至少80%。隨後將冷凍γδ-T細胞用於針對道迪細胞株(E:T比率為1:1)之脫粒化分析，由此將該等細胞在增加濃度之候選抗體或對照形式存在下在37℃下共同培養4小時。由PMA (20 ng/ml)加離子黴素(1µg/ml)產生之活化充當γδ T細胞脫粒化之陽性對照，且單獨培養基充當陰性對照。在4小時培育結束時，藉由流動式細胞量測術分析細胞以評估對於CD107a (LAMP-1，溶酶體相關膜蛋白-1) + CD107b (LAMP-2)呈陽性的γδ T細胞之百分比。在活化誘導之顆粒胞外分泌之後將CD107移動至細胞表面，由此表面CD107之量測為用於識別最近脫粒化之細胞溶解T細胞的敏感標記物。
來自 PBMC 之 Vδ2+ T 細胞活化的離體分析 分離來自克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎患者血液之PBMC，用1µM CTV染料染色且在IL-2 (20IU/ml) /IL-15 (20ng/ml)、1nM HDMAPP或HMBPP (磷酸抗原)及1µg/ml對照同型物或候選BTN3A抗體存在下培養4天。
以下T細胞活化標記物之表現：CD25、HLA-DR、β7整合素、CD49b可藉由流動式細胞量測術評估Vδ2+及Vδ2 -細胞。
增殖可藉由量測CTV稀釋來評估且脫粒化能力可藉由量測Vδ2+及Vδ2-之CD107a表現來評估，亦可藉由流動式細胞量測術來評估。
來自腸活檢體之 Vδ2+ T 細胞活化的離體分析 將來自克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎患者之腸活檢體置於培養物中，進行「出走」隔夜培養。第二天移出活檢體，且隨後將出走細胞用1µM CTV染料染色。隨後將CTV染色細胞在IL-2 (20IU/ml) /IL-15 (20ng/ml)、10 nM HDMAPP或HMBPP (磷酸抗原)及1µg/ml對照同型物或候選BTN3A抗體存在下培育7天。以下T細胞活化標記物之表現：CD25、HLA-DR可藉由流動式細胞量測術評估Vδ2+細胞。增殖可藉由量測CTV稀釋來評估且脫粒化能力可藉由量測Vδ2+之CD107a表現來評估，亦可藉由流動式細胞量測術來評估。
實例 1 ： 產生適用作人類個體之藥物的抑制性 BTN3A1 Composite Human Antibody TM 可變區序列之設計 鼠類103.2抗體V區(WO201280351)之結構模型係使用Swiss PDB產生且進行分析以識別V區中可能為抗體結合特性所必需之重要「限制性」胺基酸。
CDR內所含有之大部分殘基(使用Kabat及Chothia定義)以及若干構架殘基被視為重要的。鼠類103.2 mAb之VH及Vκ序列含有典型構架殘基且CDR 1、2及3模體與許多鼠類抗體類似。
基於結構分析，選擇可用於產生103.2人源化變異體之較大初步序列片段集，且使用用於電腦模擬分析肽與人類MHC II類對偶基因之結合的iTope™技術(Perry等人, 2008, Drugs R D 9 (6): 385-396)，且使用已知抗體序列相關T細胞抗原決定基之TCED™ (Bryson等人, 2010, Biodrugs 24 (1):1-8)進行分析。丟棄經鑑別為人類MHC II類的顯著非人類生殖系結合物或針對TCED™得到顯著命中的序列片段。此使得片段集減小，且此等之組合再次如上進行分析，以確保片段之間的連接點不含有可能的T細胞抗原決定基。將選定序列片段組裝成預計不含顯著T細胞抗原決定基之完整V區序列。
隨後選擇五條重鏈(VH1至VH5)及四條輕鏈(Vκ1至Vκ4)序列用於基因合成及哺乳動物細胞中之表現。
人源化變異體質體的構築  合成將5個VH區中之各者與4個Vk區中之各者組合的20種人源化變異體，其中具有側接限制酶部位，以選殖至針對人類IgG4 (S241P，L248E)重鏈及κ輕鏈之表現載體系統中。藉由定序確認所有構築體。
為評估全部Composite Human Antibody™變異體之結合且選擇與原始鼠類抗體相比對BTN3A具有適合親和力的抗體，使用運行Biacore T200評估軟體V2.0.1 (Uppsala, Sweden)之Biacore T200 (序列號1909913)對來自經轉染細胞培養物之上清液進行單循環動力學分析。
結果提供於下文表1中：
變異體 K D(M) 與 103.2 嵌合之相對 K D
VH0/Vκ0 4.03 x10 -11 1.0
VH0/Vκ1 1.93 x10 -11 0.5
VH1/Vκ0 6.86 x10 -11 1.7
VH1/Vκ1 4.69 x10 -11 1.2
VH1/Vκ2 4.05 x10 -11 1.0
VH1/Vκ3 5.36 x10 -11 1.3
VH1/Vκ4 3.58 x10 -11 0.9
VH2/Vκ1 7.11 x10 -11 1.8
VH2/Vκ2 5.88 x10 -11 1.5
VH2/Vκ3 4.27 x10 -11 1.1
VH2/Vκ4 6.07 x10 -11 1.5
VH3/Vκ1 5.35 x10 -11 1.3
VH3/Vκ2 5.64 x10 -11 1.4
VH3/Vκ3 4.87 x10 -11 1.2
VH3/Vκ4 4.66 x10 -11 1.2
VH4/Vκ1 7.92 x10 -11 2.0
VH4/Vκ2 5.56 x10 -11 1.4
VH4/Vκ3 7.72 x10 -11 1.9
VH4/Vκ4 5.40 x10 -11 1.3
VH5/Vκ1 5.53 x10 -11 1.4
VH5/Vκ2 8.09 x10 -11 2.0
VH5/Vκ3 5.68 x10 -11 1.4
VH5/Vκ4 7.58 x10 -11 1.9
表 1 ：藉由單循環動力學分析所測定的人源化抗體變異體之概述結合資料。藉由將人源化變異體之K D除以在相同實驗中分析的嵌合抗體之K D來計算人源化變異體之相對K D值。
基於Biacore計算之親和力，以及各人源化變異體之iTope™評分及人源化百分比，選擇與嵌合抗體親和力最接近且iTope™評分最佳的六種人源化變異體用於進一步分析。
對選定之人源化變異體以及其嵌合形式及最保守人源化變異體(VH1/Vκ1)進行純化以用於進一步分析測試。抗體在蛋白A瓊脂糖管柱上自細胞培養物上清液純化，隨後使用10 mM乙酸鈉，100 mM NaCl，pH 5.5作為移動相及最終調配緩衝液進行尺寸排阻層析(SEC) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)。基於預測之胺基酸序列，使用消光係數(Ec(0.1%))藉由OD 280nm定量樣品。
使用SDS-PAGE藉由在凝膠上負載2 µg之各抗體來分析抗體且觀測對應於典型抗體概況的條帶。
熱穩定性分析  為評估六種選定的Composite Human Antibody™變異體之熱穩定性，使用基於螢光之熱位移分析測定熔化溫度(50%蛋白域展開之溫度)。
所有六種經純化人源化抗體以及嵌合(VH0/Vκ0)抗體及人源化變異體(VH1/Vκ1)在含有SYPRO® Orange (ThermoFisher, Loughborough, UK)之調配緩衝液(10 mM乙酸鈉，100 mM NaCl，pH 5.5)中以1:1000稀釋度稀釋至0.1 mg/ml之最終濃度且在StepOnePlus即時PCR系統(ThermoFisher, Loughborough, UK)上經歷25℃至99℃之溫度梯度，持續56分鐘。使用10 mM乙酸鈉，100 mM NaCl，pH 5.5作為陰性對照。使用蛋白質熱穩定性軟體(1.2版)分析熔化曲線。
所有抗體變異體顯示兩個不同展開事件，其中T m隨著人源化程度增加而增加，依表2中所呈現。
變異體 單 / 雙峰 T m1 平均值 ( ℃ ) T m2 平均值 ( ℃ )
VH0/Vκ0 (嵌合) 雙 61.4 71.3
VH1/Vκ1 雙 61.4 72.5
VH4/Vκ2 雙 61.4 76.5
VH4/Vκ3 雙 61.4 76.9
VH4/Vκ4 雙 61.6 77.6
VH5/Vκ2 雙 61.4 78.5
VH5/Vκ3 雙 61.5 78.7
VH5/Vκ4 雙 61.3 79.5
表2：嵌合抗體、人源化變異體VH1/Vκ1及六種103.2 Composite Human Antibody™變異體之熔化溫度。
多循環動力學分析  使用運行Biacore T200評估軟體V2.0.1 (Uppsala, Sweden)之Biacore T200 (序列號1909913)儀器對六種選定的人源化103.2變異體(VH4/Vκ2、VH4/Vκ3、VH4/Vκ4、VH5/Vκ2、VH5/Vκ3、VH5/Vκ4)以及嵌合抗體及人源化變異體VH1/Vκ1進行多循環動力學分析。
在2% BSA/PBS中將純化抗體稀釋至2 μg/ml之濃度。在各循環開始時，在蛋白A上以約146.5 RU (理論值，獲得約50 RU之RMax)之密度(RL)捕捉各抗體。在捕捉之後，在注射BTN3A1抗原(Sino Biological目錄號15973-H08H)前使表面穩定化。將BTN3A1在0.1% BSA/HBS-P+ (操作緩衝液)中以自25至0.78 nM之兩倍稀釋範圍滴定。監測締合期持續400秒且監測解離期持續35分鐘(2100秒)。使用50 μl/min之流動速率以使任何可能的質量轉移效應降至最低來獲得動力學資料。在各循環結束時使用兩個10 mM甘胺酸-HCl pH 1.5之注射液進行蛋白A表面之再生。對於各個測試抗體進行兩次空白(無BTN3A1)及一次單一濃度分析物之重複以檢查在動力學循環內表面及分析物之穩定性。自Fc2、Fc3及Fc4之信號減去來自參考通道Fc1之信號以校正非特異性結合至參考表面中之差異。另外，將空白運行減去各Fc以校正任何抗原非依賴性信號變量，諸如偏移。使用一對一結合數學模型用整體RMax參數且無主體信號(常數RI = 0 RU)來擬合感測圖譜。
藉由用103.2 Composite Human Antibody™變異體之K D除以在同一晶片上嵌合之K D計算與103.2嵌合(VH0/Vκ0)相比之相對K D。所有選定的Composite Human Antibody™變異體均顯示出嵌合抗體之兩倍以內的親和力(表3)。
變異體 k a (1/Ms) k d (1/s) K D (M) 與嵌合之相對 K D R 最大 (RU) Chi ² (RU ² )
VH0/Vκ0 (嵌合) 8.45 x10 5 8.98 x10 -5 1.06 x10 -10 1.0 65.6 0.466
VH1/Vκ1 7.74 x10 5 8.80 x10 -5 1.14 x10 -10 1.1 59.0 0.279
VH4/Vκ2 6.53 x10 5 9.71 x10 -5 1.49 x10 -10 1.4 72.9 0.367
VH4/Vκ3 7.36 x10 5 9.51 x10 -5 1.29 x10 -10 1.2 56.1 0.232
VH4/Vκ4 7.70 x10 5 8.33 x10 -5 1.08 x10 -10 1.0 57.8 0.245
VH5/Vκ2 7.27 x10 5 9.42 x10 -5 1.30 x10 -10 1.2 65.4 0.293
VH5/Vκ3 7.70 x10 5 1.03 x10 -4 1.33 x10 -10 1.3 53.3 0.260
VH5/Vκ4 7.72 x10 5 9.55 x10 -5 1.24 x10 -10 1.2 55.2 0.250
表3：使用Biacore T200測定的六種選定BT3.1-103.2 Composite Human Antibody™變異體以及嵌合(VH0/Vκ0)抗體及人源化變異體VH1/Vκ1與CD277之結合的多循環動力學資料。藉由用BT3.1-103.2 Composite Human Antibody™變異體之K D除以在同一晶片上分析之BT3.1-103.2嵌合之K D計算與嵌合(VH0/Vκ0)相比之相對K D。
活體外功能性功效：γδ-T細胞脫粒化分析  分析由以下組成：量測103.2人源化變異體及其嵌合形式對道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株之γδ T細胞脫粒化能力的抑制作用(Harly等人, 2012，參見上文)。γδ T細胞藉由用唑來膦酸(1 µM)及IL2 (200 IU/ml)將其培養11至13天自健康供體之PBMC擴增。在第5天、第8天及其後每2天添加IL2。γδ T細胞之百分比在培養開始時測定且藉由流動式細胞量測術評估培養時間直至達到至少80%。隨後將冷凍γδ T細胞用於針對道迪細胞株(E:T比率為1:1)之脫粒化分析，由此將該等細胞在增加濃度之103.2人源化變異體及其嵌合及小鼠形式存在下在37℃下共同培養4小時。由PMA (20 ng/ml)加離子黴素(1µg/ml)產生之活化充當γδ T細胞脫粒化之陽性對照，且單獨培養基充當陰性對照。在4小時培育結束時，藉由流動式細胞量測術分析細胞以評估對於CD107a (LAMP-1，溶酶體相關膜蛋白-1) + CD107b (LAMP-2)呈陽性的γδ T細胞之百分比。在活化誘導之顆粒胞外分泌之後將CD107移動至細胞表面，由此表面CD107之量測為用於識別最近脫粒化之細胞溶解T細胞的敏感標記物。
與嵌合及小鼠抗體相比，所有經測試之人源化變異體在脫粒化分析中保持其抑制作用(參見表4)。
出乎意料地，與鼠類mAb 103.2之初始鼠類CDR2相比，在CDR2中包括胺基酸突變之VH4Vκ4在此分析中仍然非常有效。
   m103.2 H0K0 H1K1 H4K2 H4K3 H4K4 H5K2 H5K3 H5K4
IC50 (µg/ml) 0.0056 6.29x10 -10 1.77x10 -7 0.0036 1.087x10 -7 0.0121 0.00483 0.0015 0.0062
跨度 27.60 不穩定 不穩定 21.65 2447 12.11 24.58 35.43 22.76
表4：來源於mAb 103.2之各種BTN3A抑制性抗體之IC50
人源化候選物之選擇 總而言之，出乎意料地注意到，在脫粒化分析中，與其他人源化候選物相比，VH4Vκ4人源化變異體呈現最高Biacore親和力以及對人類PBMC之最高結合親和力且在濃度為10µg/ml之脫粒化分析中抑制特性最有效。
另外，與具有鼠類VH及VL區之嵌合抗體相比，VH4Vκ4之熱穩定性甚至得到改良。
因此，選擇人源化候選物VH4Vκ4以用於進一步活體內及活體外評估其用於治療IBD之適用性。
對人類及食蟹獼猴 PBMC 之交叉反應 人類PBMC係自商業供應商同意下獲得之健康團體供體白血球層(來自24小時內抽取之血液)中分離的。食蟹獼猴全血係獲自Envigo (Huntingdon, UK)。PBMC係使用淋巴細胞分離劑(Axis-shield, Dundee, UK)密度離心分離的。隨後冷凍PBMC且儲存於氮氣之氣相中直至需要。
將冷凍的PBMC複溫，添加至預溫熱之AIM-V (ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK)培養基且計數。收集細胞，藉由以500 x g離心10分鐘洗滌，且隨後再懸浮於1×DPBS，pH 7.4中。重複此步驟一次且將細胞以1×10 6個細胞/mL再懸浮於1×DPBS，pH 7.4中。按照製造商說明書，藉由使用LIVE/DEAD® Far Red Dead Cell染色套組(ThermoFisher, Paisley, UK)在黑暗中培育半小時對細胞進行活細胞及死細胞染色。包括在70℃下加熱十分鐘之細胞等分試樣作為死細胞對照。在此染色期間，測試抗體之三點、1:3滴定曲線(對於選定抗體，自0.063 μg/mL開始)係在96孔稀釋盤中之流動緩衝液(0.5% BSA、2mM EDTA、1×DPBS，pH 7.4)中製作。在活力染色後，收集細胞，依先前所描述洗滌兩次，且隨後以1×10 6個細胞/mL再懸浮於流動緩衝液中。將1×10 6個細胞/mL之100 µL細胞轉移至新鮮U形底部96孔盤之各孔(第1至12欄)。將盤離心，丟棄上清液且將細胞再懸浮於50 µL先前製備之經稀釋之測試抗體滴定系列中。在4℃下在黑暗中培育30分鐘後，將盤離心，用150 µL/孔流動緩衝液洗滌兩次，且將細胞再懸浮於50 µL山羊抗人類抗體，PE標記(Sigma, Poole, UK)在流動緩衝液中稀釋1/100。在4℃下在黑暗中培育15分鐘後，將盤離心，用150 µL/孔流動緩衝液洗滌一次，且將細胞再懸浮於200 µL流動緩衝液中。隨後在Attune NxT聚焦細胞計數器(ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK)上分析細胞，使用兩個雷射通道收集每個樣品10,000個事件：RL1用於活細胞/死細胞且BL2用於PE。使用儀器統計工具或FlowJo軟體(第10版, FlowJo, LLC, Ashland, USA)對活的淋巴球細胞群進行門控分析資料。隨後計算來自BL2通道(PE信號)之X-中位數且針對濃度繪圖。
隨後用測試抗體之11點、1:3完整滴定曲線進行完全滴定(自5 μg/mL開始)。
下表5顯示觀測到兩種測試抗體與人類及食蟹獼猴PBMC之結合。兩種物種之間以及不同供體之間的結合模式為一致的。
EC50 人類 PBMC 供體 1 食蟹獼猴 PBMC 供體 1 食蟹獼猴 PBMC 供體 2 食蟹獼猴 PBMC 供體 3
103.2 VH0/Vκ0 0.019 0.014 0.012 0.013
103.2 VH4/Vκ4 0.017 0.013 0.011 0.012
理論最大結合 (MFI) 人類 PBMC 供體 1 食蟹獼猴 PBMC 供體 1 食蟹獼猴 PBMC 供體 2 食蟹獼猴 PBMC 供體 3
103.2 VH0/Vκ0 19640 8950 5942 5146
103.2 VH4/Vκ4 19783 8560 5821 4968
表5：嵌合及相應先導人源化抗體與人類或食蟹獼猴PBMC之結合的EC50值(μg/mL)及基於理論預測曲線之理論最大結合的彙總表。
抗原決定基定位 為用高解析度確定抗體/抗原複合物之抗原決定基，將蛋白質複合物與氘化交聯劑一起培育且進行多酶催化裂解。在交聯肽富集後，藉由高解析度質譜分析(nLC-Q Exactive MS)分析樣品且使用XQuest及Stavrox軟體分析所產生之資料。
BTN3A1/mAb1之混合物係以以下濃度製備：
   BTN3A1 抗體 BTN3A1/抗體
混合物 體積 濃度 體積 濃度 體積 濃度
BTN3A1/mAb1 10µl 4.48µM 10µl 2.12µM 20µl 2.24µM/1.06µM
為了還原烷基化，在室溫下培育180分鐘之前將20μL所製備之抗體/抗原混合物與2 μL DSS d0/d12 (2mg/mL；DMF)混合。在培育後，在室溫下培育1小時之前，藉由添加1μL碳酸氫銨(20 mM最終濃度)停止反應。
隨後，在H 2O 8M尿素懸浮液(20 μL)之前使用真空離心蒸發濃縮器乾燥溶液。混合後，向溶液中添加2μl DTT (500 mM)。隨後在37℃下培育混合物1小時。培育後，在暗室中，在室溫下1小時培育時間之前，添加2 μl碘乙醯胺(1M)。在培育後，添加80 μl蛋白分解緩衝劑。胰蛋白酶緩衝液含有50mM Ambic pH 8.5、5%乙腈。胰凝乳蛋白酶緩衝液含有Tris HCl 100mM、CaCl 210mM pH 7.8。ASP-N緩衝液含有磷酸鹽緩衝液50mM pH 7.8。彈性蛋白酶緩衝液含有Tris HCl 50mM pH 8.0，且嗜熱菌蛋白酶緩衝液含有Tris HCl 50mM、CaCL2 0.5mM pH 9.0。
對於胰蛋白酶蛋白分解，將100µl還原/烷基化抗體/抗原混合物與0.9 μl胰蛋白酶(Roche Diagnostic)以1/100 (w/w)之比率混合。將蛋白分解混合物在37℃下培育隔夜。
對於胰凝乳蛋白酶蛋白分解，將100μl還原/烷基化之抗體/抗原混合物與0.45 μl胰凝乳蛋白酶(Roche Diagnostic)以1/200 (w/w)之比率混合。將蛋白分解混合物在25ºC下培育隔夜。
對於ASP-N蛋白分解，將100µl還原/烷基化抗體/抗原混合物與0.45 μl AspN (Roche Diagnostic)以1/200 (w/w)之比率混合。將蛋白分解混合物在37℃下培育隔夜。
對於彈性蛋白酶蛋白分解，將100µl還原/烷基化抗體/抗原混合物與0.9 μl彈性蛋白酶(Roche Diagnostic)以1/100 (w/w)之比率混合。將蛋白分解混合物在37℃下培育隔夜。
對於嗜熱菌蛋白酶蛋白分解，將100µl還原/烷基化抗體/抗原混合物與1.8 μl嗜熱菌蛋白酶(Roche Diagnostic)以1/50 (w/w)之比率混合。將蛋白分解混合物在70℃下培育隔夜。在消化後，將甲酸(最終1%)添加至溶液中。
在抗體/抗原蛋白質複合物與氘化d0d12進行胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、ASP-N、彈性蛋白酶及嗜熱菌蛋白酶蛋白分解後，nLC-orbitrap MS/MS分析偵測到BTN3A1 (蛋白質2)與mAb1 (蛋白質1)之間的五個交聯肽。交聯之序列及位置呈現於下表6中。
序列 酶 序列蛋白質1 序列蛋白質2 XL型 nAA1 nAA2 在StavroX上鑑別
                       
VINPRSGDSHYNEKFKDR-ADLPCHLFPT-a9-b6 嗜熱菌蛋白酶 50-67 48-57 蛋白質間xl 58 53 是
AFTSYL-ADLPCHLFPTMS-a3-b6 嗜熱菌蛋白酶 28-33 48-59 蛋白質間xl 30 53 是
INPRSGDSHYNEKFKDRVT-MSAETME-a10-b5 嗜熱菌蛋白酶 51-69 58-64 蛋白質間xl 60 62 是
VINPRSGDSHYNEKFKDR-MELKW-a10-b4 嗜熱菌蛋白酶 50-67 63-67 蛋白質間xl 59 66 是
表6：BTN3A1與mAb1之間偵測到之交聯肽。
使用化學交聯、高質量MALDI質譜分析及nLC-Orbitrap質譜分析，吾人能夠表徵BTN3A1上mAb1之抗原決定基。
依圖1所示，抗原決定基包括抗原BTN3A1上之以下胺基酸：53、62、66，依SEQ ID NO: 20中所包含。
脫靶 細胞微陣列技術(Retrogenix)用於篩選Fc-沉默人源化103.2 IgG1 (稱為mAb1，其靶向人類BTN3A蛋白)之特異性脫靶結合。
在細胞固定之前或之後，對測試抗體與未轉染HEK293細胞及過度表現BTN3A1之細胞之結合水平的研究顯示，在固定細胞上之2 µg/ml為適合之篩選條件。在此條件下，篩選測試抗體結合人類HEK293細胞，該等細胞分別表現5528種人類蛋白質，包含細胞表面膜蛋白及細胞表面繫栓分泌蛋白。此展現十一個主要命中。各主要命中與兩個對照受體(CD20及EGFR)一起重新表現且用2 µg/ml測試抗體、2 µg/ml同型對照抗體及其他陽性及陰性對照處理進行重新測試。移出一個極弱強度、不可再現之命中及五個非特異性命中後，測試抗體仍存在五種特異性相互作用。此等為BTN3A1之兩種同功異型物、BTN3A2之兩種同功異型物及BTN3A3之一種同功異型物，即其主要目標。
未識別mAb1之脫靶相互作用，表明mAb1對其主要目標具有高度特異性(資料未示出)。
實例 2 ： 活體外藥理學 評估微生物活化後周邊 Vγ9V δ2 T 細胞的輔助功能及 mAb1 之調節 Vγ9V δ2 T 細胞「輔助」功能之能力
已知Vγ9Vδ2 T細胞在磷酸抗原刺激後表現若干標記物，尤其在IBD中(Mann ER等人, Clin Exp Immunol, 2012年11月;170(2):122-30；Tyler CJ等人, J Immunol, 2017年5月1日;198(9):3417-3425；McCarthy NE等人, J Clin Invest, 2015年8月3日;125(8):3215-25)。為了發現人源化103.2 Fc沉默IgG1 (下文稱作mAb1)是否可影響Vγ9Vδ2 T細胞以及其他免疫群體之表型)，來自6名健康供體之PBMC在存在增加濃度之人源化103.2或相應對照同型物的情況下，用0.5µM +/- 50 IU/ml IL-2之磷酸抗原(Hmbpp)刺激2天。共刺激標記物(CD40、CD80及CD86)、成熟APC標記物(CD83)、抗原呈遞分子(HLA-DR)、黏附分子(CD11a、CD11b、CD11c及CD54)、腸及淋巴結歸巢分子(α4及β7整合素、CCR9及CCR7)及B細胞共刺激分子(OX40、ICOS及CD70)之表現係藉由流動式細胞量測術在Vγ9Vδ2 T細胞及其他免疫細胞(B細胞、單核球及Vδ2 T細胞)上評估且計算IC50。
mAb1以劑量依賴性方式抑制所評估之所有標記物(在陽性細胞頻率及中值螢光強度上觀測到類似抑制)，表明mAb1具有抑制來自用磷酸抗原刺激之健康供體的周邊Vγ9Vδ2 T細胞之APC功能、腸歸巢潛能及黏附潛能的能力。
結果在培養基中不存在或存在IL-2之情況下相當。表7顯示經由S形4PL方程計算的各標記物之MFI的不同IC50。
功能 標記物 IC50 (µg/ml)
HmBPP HmBPP+IL-2
抗原呈遞及共刺激 HLA-DR 0.006 0.003
CD40 0.004 0.005
CD80 0.002 0.004
CD83 0.002 0.004
CD86 0.005 0.003
腸及淋巴結歸巢 α4整合素 0.002 0.003
β7整合素 0.003 0.005
CCR7 0.002 0.003
CCR9 0.006 0.005
黏著分子 CD54 0.002 0.003
CD11a 0.006 0.005
CD11b 0.02 0.01
CD11c 0.006 0.005
B 細胞共刺激 OX40 0.001 0.005
CD70 0.005 0.005
ICOS 0.002 0.002
表7：IC50值
mAb1之影響對Vδ2+ T細胞具有特異性而在其他免疫細胞群體：Vδ2+ T細胞、B細胞、單核球中尚未觀測到。此為安全使用mAb1作為抗炎治療提供良好前景，尤其在涉及活化δ2 T細胞之胃腸發炎病症中。
mAb1 對磷酸抗原介導之 V γ9Vδ2 T 細胞活化的活體外作用的動力學 來自3名健康供體之PBMC在10 µg/ml mAb1或相應對照同型物存在下，在指定時間點用0.5 µM + 50 IU/ml IL-2下之磷酸抗原(Hmbpp)刺激。藉由流動式細胞量測術評估相同標記物。
結果顯示mAb1自活體外處理開始後24小時直至第6天培養結束期間能夠抑制評估之所有標記物的表現，表明抗體具有長效活體外作用。
mAb1 對具有或不具有刺激之不同周邊免疫區室的潛在影響的評估 將來自3名健康供體之PBMC或來自8名健康供體之紅血球耗盡的全血與10 µg/ml Hu103.2或相應對照同型物在具有或不具有不同刺激物的情況下培養2天及5天。所用刺激物為已知活化Vγ9Vγ2 T細胞之磷酸抗原(HmBPP)；已知活化Vγ9Vδ2 T細胞、NK細胞及CD8+ αβ T細胞之IL-15；已知活化淋巴球之植物血球凝集素、已知活化B細胞之抗IgA/G/M、TLR促效劑(已知活化單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞及B細胞之脂多醣、已知活化骨髓細胞、漿細胞樣樹突狀細胞及B細胞之R848、已知活化B細胞及單核球之CpGB)。在針對標記物表現培養2天及針對增殖能力培養5天後，藉由流動式細胞量測術評估HLA-DR (抗原呈遞分子)、共刺激分子(CD40及CD86)、活化標記物(CD69及CD25)、CCR9 (腸歸巢受體)、CD11c (黏附分子)之表現及不同周邊免疫細胞區室(Vγ9Vδ2 T細胞、B細胞、單核球、NK細胞、CD8+及CD8- αβT細胞)之增殖能力。使用CTV染色之PBMC評估增殖。
結果顯示mAb1僅在回應於磷酸抗原時抑制所評估之所有標記物之表現及Vγ9Vδ2 T細胞之增殖能力。有趣地，觀測到之抑制對Vγ9Vδ2 T細胞具有特異性，因為mAb1不回應於任何所測試刺激物影響評估的任何其他免疫細胞區室之活化標記物或增殖能力。
此等結果表明mAb1能夠特異性抑制磷酸抗原驅動之Vγ9Vδ2 T細胞活化。使用來自8名健康供體之紅血球耗盡的全血確認此等結果。
實例 3 ： 活體外及活體內功效 mAb1 抑制磷酸抗原誘導之 IBD 患者的 Vγ9V δ2 T 細胞活化表型、增殖及脫粒化 分離來自克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎患者血液之PBMC，用1 µM CTV染料染色且在IL-2/IL-5、1 nM HDMAPP (磷酸抗原)及1 µg/ml對照同型物或人源化103.2 mAb存在下培養4天。藉由流動式細胞量測術評估若干標記物(CD25、HLA-DR、β7整合素、CD49b)之表現、Vδ2+及Vδ2-之增殖及脫粒化能力(分別藉由CTV稀釋及CD107a表現所量測)。Vδ2+ T細胞之頻率在非IBD與IBD個體之間類似(資料未示出)。來自非IBD及IBD患者之周邊Vδ2+ T細胞以類似方式回應於磷酸抗原，此在培養物中添加同型對照物時不受影響。
相比之下，mAb1之添加以類似方式抑制來自非IBD及IBD患者之Vδ2+ T細胞磷酸抗原介導的活化(圖2A及圖2B)。此表明mAb1可抑制來自IBD患者之周邊Vδ2+ T細胞的離體活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力。
因此 mAb1 具有減少周邊 Vδ2+ T 細胞向腸遷移且因此減少周邊 Vδ2+ T 細胞之發炎可能性的潛力。 此等結果在來自非IBD及IBD患者之腸活檢體中確認。將腸活檢體置於培養中，進行「出走」隔夜培養。第二天移出活檢體，且將出走細胞用1 µM CTV染料染色。隨後將CTV染色細胞在IL-2/IL-5、10 nM HDMAPP (磷酸抗原)及1 µg/ml對照同型物或mAb1存在下培育7天。
mAb1亦能夠抑制來自IBD患者之腸活檢體的Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化，其可能使得腸發炎減少，從而抑制疾病(圖3)。
mAb1 活體內抑制食蟹獼猴中與 DSS 誘導之結腸炎相關之臨床徵象 已知非人類靈長類動物中DSS誘導之結腸炎模型類似於諸如人類潰瘍性結腸炎之胃腸病症之特徵，使得此模型成為研究重要免疫機制及新穎治療功效之工具(Takahashi N等人, 2020, Heliyon, 6(1): e03178；McQueen P等人, 2019, Mucosal Immunol, 12(6): 1327)。
BTN3A直系同源物及Vγ9Vδ2 T細胞存在於非人類靈長類動物中。因此在食蟹獼猴之急性DSS誘導之結腸炎模型中測試mAb1之治療功效。
在此研究中，總共14名原始(naïve)雄性食蟹獼猴(3-5 kg)參與，分為兩組。將DSS溶解於生理食鹽水中至濃度為40 mg/mL，避光。自第0天，各猴每日兩次經口投與0.65 g DSS (溶解於水中)，持續7天。mAb1或其相應同型對照物在第3、10及17天以0.6 mg/kg之劑量靜脈內投與。在整個研究中每天監測體重減輕及疾病活動指數(DAI)。結腸炎臨床嚴重程度藉由腹瀉(0，正常糞便稠度；1，軟糞便；2，糊狀糞便；及3，水樣糞便)、腸出血(0，無出血；1，陽性隱血；2，可見出血糞便；3，大量直腸出血)及體重減輕(0，≤1%；1，1-5%；2，5-10%；3，10-15%；及4，＞15%)評估。為計算DAI，隨後將以上得分之總和除以3。在指定時間點收集血清樣品且儲存直至細胞介素分析。使用MSD技術及V-Plex NHP Cytokine 24Plex套組進行細胞介素分析。研究持續直至第21天(圖4)。
依圖5所示，與注射相應同型對照物之猴相比，在注射mAb1後與DSS誘導之結腸炎相關之臨床徵象(腸出血、腹瀉、體重減輕、疾病活動指數)減少，表明mAb1在IBD治療中具有潛在治療益處。
此外，依圖6所示，與用同型對照物處理之動物相比，用mAb1處理之動物中促炎細胞介素IL-6及IL-8之循環含量降低。同時，與用同型對照物處理之動物相比，用mAb1處理之動物中循環免疫保護性IL-17及VEGF之含量增加，證實mAb1可產生IBD中發炎性較小的環境。
序列表 表 8 及表 9 ：用於實踐本發明之適用胺基酸及核苷酸序列的簡要說明。
SEQ ID NO: 類型 序列之描述
1 aa mAb1之HCDR1
2 aa mAb1之HCDR2
3 aa mAb1之HCDR3
4 aa mAb1之LCDR1
5 aa mAb1之LCDR2
6 aa mAb1之LCDR3
7 aa mAb1之VH
8 aa mAb1之VL
9 nt mAb1之HCDR1
10 nt mAb1之HCDR2
11 nt mAb1之HCDR3
12 nt mAb1之LCDR1
13 nt mAb1之LCDR2
14 nt mAb1之LCDR3
15 nt mAb1之VH
16 nt mAb1之VL
17 aa 人類BTN3A1
18 aa 人類BTN3A2
19 aa 人類BTN3A3
20 aa 人類BTN3A1上mAb1之抗原決定基
21 aa mAb1之全長重鏈
22 aa mAb1之全長輕鏈
23 aa 鼠類103.2之LCDR2
24 aa 食蟹獼猴BTN3A1
25 aa 依圖1所示之人類BTN3A1上之抗原決定基區
表8
SEQ ID NO: 類型 序列之描述
1 aa SYLIH
2 aa VINPRSGDSHYNEKFKD
3 aa SDYGAY
4 aa RASQSISNNLH
5 aa YASQSAF
6 aa QQSNSWPHT
7 aa QVQMQQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTSYLIHWIKQRPGQGLEWIGVINPRSGDSHYNEKFKDRVTMTADQSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDYGAYWGQGTLVTVSS
8 aa EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSAFGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKLEIK
9 nt AGTTACTTGATACAC
10 nt GTGATTAATCCTAGAAGTGGTGATAGTCACTACAATGAGAAGTTCAAGGAC
11 nt TCAGATTACGGGGCTTAC
12 nt AGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACAC
13 nt TATGCTTCCCAGTCCGCTTTT
14 nt CAACAGAGTAACAGCTGGCCTCACACG
15 nt CAGGTCCAGATGCAGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACGCCTTCACTAGTTACTTGATACACTGGATTAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGTGATTAATCCTAGAAGTGGTGATAGTCACTACAATGAGAAGTTCAAGGACAGGGTCACAATGACTGCAGACCAGTCCATCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGATGACACGGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCAGATTACGGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCCTCA
16 nt GAAATTGTGTTGACTCAGTCACCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGAGAAAGAGCCACCCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCAAGGCTTCTCATCAAATATGCTTCCCAGTCCGCTTTTGGCATCCCCGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCTCACACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
17 aa MKMASFLAFLLLNFRVCLLLLQLLMPHSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHVDVKGYKDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNNKGENIPTVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCTIRSSLLGLEKTASISIADPFFRSAQRWIAALAGTLPVLLLLLGGAGYFLWQQQEEKKTQFRKKKREQELREMAWSTMKQEQSTRVKLLEELRWRSIQYASRGERHSAYNEWKKALFKPADVILDPKTANPILLVSEDQRSVQRAKEPQDLPDNPERFNWHYCVLGCESFISGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVQRKGWVKMTPENGFWTMGLTDGNKYRTLTEPRTNLKLPKPPKKVGVFLDYETGDISFYNAVDGSHIHTFLDVSFSEALYPVFRILTLEPTALTICPA
18 aa MKMASSLAFLLLNFHVSLLLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNAKGENIPAVEAPVVADGVGLYEVAASVIMRGGSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPILLLLLAGASYFLWRQQKEITALSSEIESEQEMKEMGYAATEREISLRESLQEELKRKKIQYLTRGEESSSDTNKSA
19 aa MKMASSLAFLLLNFHVSLFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIKWSDTKGENIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGGGVSCIIRNSLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPISLLLLAGASYFLWRQQKEKIALSRETEREREMKEMGYAATEQEISLREKLQEELKWRKIQYMARGEKSLAYHEWKMALFKPADVILDPDTANAILLVSEDQRSVQRAEEPRDLPDNPERFEWRYCVLGCENFTSGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVERKKGWVKMTPENGYWTMGLTDGNKYRALTEPRTNLKLPEPPRKVGIFLDYETGEISFYNATDGSHIYTFPHASFSEPLYPVFRILTLEPTALTICPIPKEVESSPDPDLVPDHSLETPLTPGLANESGEPQAEVTSLLLPAHPGAEVSPSATTNQNHKLQARTEALY
20 aa HLFPTMSAETMELK
21 aa QVQMQQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTSYLIHWIKQRPGQGLEWIGVINPRSGDSHYNEKFKDRVTMTADQSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDYGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
22 aa EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSAFGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
23 aa YASQSIF
24 aa QFAVVGPPGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSNLRQVVNVYADGKEVEDRQSAAYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIDVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIRWSNDKGENIPAVEAPVFVDGVGLYAVAASVILRGSSGEGVSCTIRSSLLGLEKTTSISIAGPFFRRAQSWIAALAGTLPVLLLLLGGAGYFLWRQQEEKKTLFRKKKREQELRELAWSTVKQEKSTREKLLEEIRWRSMQYTVLGERPSAYNEWKKALFKPADVILDPKTANPILLVSEDQRSVQRAKEPQDLPDNPERFDWHYCVLGCESFMSGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVQRKGWVKMTPENGSHIHTFLDVSFSEPLYPVFRILTLEPTALTICPAPKEEESS   
25 aa LPCHLFPTMS AETMELKWVS S
表9
圖 1 ：a-藉由103.2殖株之人源化選定變異體識別的抗原決定基；b-相互作用BTN3A/殖株103.2。BTN3A PDB結構4F80在抗原決定基部位上呈深灰色。呈深灰色之BTN3A胺基酸對應於53-66 (HLFPTMSAETMELK)。A、B、C、D、E：正視圖(A)之帶狀/表面表示；後視圖(B)、側視圖1 (C)、側視圖2 (D)及俯視圖(E)。F、G、H、I、J：正視圖(F)、後視圖(G)、側視圖1 (H)、側視圖2 (I)及俯視圖(J)之帶狀表示。
圖 2 ：mAb1抑制來自IBD患者血液之Vδ2+ T細胞的活化表型、增殖(CTV)及脫粒化(CD107)能力。(A)左側圖表顯示非IBD患者及IBD患者(各組n=9)血液中Vδ2+ T細胞之頻率。右側圖表顯示在非IBD患者(CD25為n=5，HLA-DR為6，灰條)及IBD患者(CD25為n=7，HLA-DR為8，空心條)血液中所評估之CD25+ (頂部)或HLA-DR+ (底部) Vd2+ T細胞之百分比回應於細胞介素(「IL-2/IL-15」)、細胞介素+磷酸抗原(「HDMAPP」)、細胞介素+磷酸抗原+同型對照物(「hIgG1」)、細胞介素+磷酸抗原+ mAb1 (「mAb1」)。表示平均值+/- SEM。(B)各圖表表示在非IBD患者(n=7，灰條)及IBD患者(n=8，空心條)血液中所評估之各標記物之Vδ2 T細胞陽性百分比回應於細胞介素(「IL-2/IL-15」)、細胞介素+磷酸抗原(「HDMAPP」)、細胞介素+磷酸抗原+同型對照物(「hIgG1」)、細胞介素+磷酸抗原+ mAb1 (「mAb1」)。表示平均值+/- SEM。
圖 3 ：mAb1抑制來自IBD患者之腸之Vδ2+ T細胞的活化表型、增殖(CTV)及脫粒化(CD107)能力。在非IBD患者(CD25及CTV為n=10，HLA-DR及CD107為n=11，灰條)及IBD患者(空心條)之腸中所評估之相應標記物之Vδ2+ T細胞頻率回應於細胞介素(「IL-2/IL-15」)、細胞介素+磷酸抗原(「HDMAPP」)、細胞介素+磷酸抗原+同型對照物(「hIgG1」)、細胞介素+磷酸抗原+ mAb1 (「mAb1」)。表示平均值+/- SEM。
圖 4 ：急性DSS誘導之食蟹獼猴結腸炎模型之研究設計。
圖 5 ：iv投與mAb1抑制與DSS誘導之食蟹獼猴結腸炎相關的臨床症狀。研究中包括每組7隻動物。虛線指示給藥天數。*p＜0.05，未配對t檢驗。
圖 6 ：iv投與mAb1降低DSS誘導之食蟹獼猴結腸炎中促炎細胞介素IL-6及IL-8之循環水準(圖6A)且增加保護性IL-17及VEGF-A之循環水平(圖6B)。研究中包括每組7隻動物。虛線指示給藥天數。熱圖(上圖)表示在指定時間點對比基線(d-3)定量之濃度倍數變化。每隻猴之個體資料表示於中間圖表中。各組之平均濃度+/-平均值之標準誤差表示在下圖中。
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Claims (11)

  1. 一種經分離之抗BTN3A抗體，其用於治療有需要之人類個體之諸如發炎性腸病之胃腸發炎病症，其中該抗BTN3A抗體特異性結合至BTN3A1且該抗BTN3A抗體係選自如下抗BTN3A抗體：例如藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定，以10 nM或更低，較佳1 nM或更低的IC50，在活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤(Daudi Burkitt's lymphoma)細胞株共同培養的γδ T細胞之脫粒化。
  2. 一種經分離之抗BTN3A抗體，其用於治療有需要之人類個體之發炎性腸病，其中該抗體係選自由以下組成之群： (i)    具有SEQ ID NO: 21之重鏈及SEQ ID NO: 22之輕鏈的抗體mAb1， (ii)   具有SEQ ID NO: 7之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO: 8之輕鏈可變區(VL)但具有不同恆定區的mAb1變異體， (iii)  具有SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2及SEQ ID NO: 6之LCDR3但具有不同構架區的mAb1變異體，或 (iv)   與mAb1結合至相同抗原決定基之mAb1變異體，其中該抗原決定基包含SEQ ID NO: 20或基本上由其組成，其中該變異體不具有SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 23之LCDR2及SEQ ID NO: 6之LCDR3。
  3. 如請求項2之經分離之抗BTN3A抗體，其為具有SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2及SEQ ID NO: 6之LCDR3的mAb1變異體，其中VH胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 7至少90%一致性但小於100%一致性，較佳至少95%一致性，且VL胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 8至少90%一致性但小於100%一致性，較佳至少95%。
  4. 如請求項1至3中任一項之經分離之抗BTN3A抗體，其藉由表面電漿子共振所量測，以10 nM或更小的K D，較佳1 nM或更小的K D，藉由表面電漿子共振(SPR)分析所量測，以通常在1.10 -11與1.10 -9M之間的K D結合至人類BTN3A1同功異型物，及/或其以0.1 µg/mL或更小的EC50，較佳0.05 µg/mL或更小的EC50，例如在0.1 µg/mL與0.005 µg/mL之間，諸如約0.02 µg/mL的EC50結合至人類周邊血液單核細胞(PBMC)。
  5. 如請求項1至4中任一項之經分離之抗BTN3A抗體，其為mAb1之功能變異體，該功能變異體藉由SPR分析所量測，保留至少相當大比例之mAb1親和力，較佳至少90%之親和力，且具有以下特性中之至少一或多者： (i)    其例如藉由流動式細胞量測術在CD107脫粒化分析中所測定，以10 nM或更低，較佳1 nM或更低的EC50，於活體外抑制與道迪伯基特氏淋巴瘤細胞株共同培養的γδ T細胞之脫粒化； (ii)   其實質上抑制來自患者之周邊Vδ2+ T細胞的磷酸抗原介導之活化、腸歸巢潛能、增殖及脫粒化能力，例如經由使用來自罹患發炎性腸病之患者分離之周邊血液單核細胞(PBMC)進行的離體分析所測定；及/或 (iii)  其實質上抑制來自發炎性腸病患者之腸活檢體的腸Vδ2+ T細胞之磷酸抗原介導之活化及/或增殖，例如在離體分析中，使用出走細胞(walked out cell)藉由CD25或HLA-DR表現所測定。
  6. 如請求項1至5中任一項之經分離之抗BTN3A抗體，其中該抗BTN3A抗體為人類或人源化抗體。
  7. 如請求項1至6中任一項之經分離之抗BTN3A抗體，其中該抗BTN3A抗體包括IgG Fc區，較佳為突變或經化學修飾之IgG1恆定區，其中該突變或經化學修飾之IgG1恆定區在與具有野生型IgG1之相應抗體相比時，不賦予或降低與Fcγ受體之結合及/或ADCC介導活性，例如具有以下胺基酸取代L247F L248E及P350S之突變IgG1恆定區。
  8. 如請求項1至7中任一項之經分離之抗BTN3A抗體，其中該胃發炎病症為發炎性腸病。
  9. 如請求項1至8中任一項之經分離之抗BTN3A抗體，其中該胃發炎病症為潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病(Crohn's disease)。
  10. 如請求項1至8中任一項之經分離之抗BTN3A抗體，其中向該個體靜脈內投與1至100 mg之劑量。
  11. 如請求項1至10中任一項之經分離之抗BTN3A抗體，其中該抗BTN3A抗體與較佳選自抗細胞介素抗體(抗IL-12、抗IL-23、抗TNFα)、抗a4b7整合素抗體及JAK抑制劑之抗炎治療組合、同時或分開投與。
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