TW202400245A - 抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途 - Google Patents

抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202400245A
TW202400245A TW112115991A TW112115991A TW202400245A TW 202400245 A TW202400245 A TW 202400245A TW 112115991 A TW112115991 A TW 112115991A TW 112115991 A TW112115991 A TW 112115991A TW 202400245 A TW202400245 A TW 202400245A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
variant
antibody
cdr
adc
Prior art date
Application number
TW112115991A
Other languages
English (en)
Inventor
胡江江
田強
袁曉曦
汪小蓓
柏雲
李莉容
龍虎
張毅濤
鄭勇
胡瑞斌
蒲鈺芝
黃秀英
宋宏梅
Original Assignee
大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司 filed Critical 大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司
Publication of TW202400245A publication Critical patent/TW202400245A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本申請涉及抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途。具體涉及一種用於治療HER3陽性癌症的抗體藥物偶聯物。本申請提供了全人源的HER3抗體，其對HER3陽性細胞具有優良的結合活性，可將藥物高效遞送至HER3陽性細胞。本申請還提供了用於偶聯至所述抗體的藥物-連接體分子，所述藥物包括DNA拓撲異構酶抑制劑。製得的抗體藥物偶聯物具有較優的藥物抗體偶聯比，對結腸癌，胃癌，乳腺癌，肺癌（例如，非小細胞肺癌，具體如肺腺癌）具有很好的靶向殺傷效果。因此，本申請進一步提供所述抗體藥物偶聯物的製備方法及其在治療HER3陽性癌症中的應用。

Description

抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途
本申請涉及靶向治療領域，具體涉及抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途。
癌症是當代人死亡的主要原因之一。它是由健康細胞的惡性轉化引起的一類疾病，由遺傳改變引起，如染色體易位，腫瘤抑制基因、生長因子受體中的突變，導致細胞惡性增殖。有缺陷的凋亡或程式性細胞死亡進一步促進了導致癌症的細胞惡性轉化。
人表皮生長因子受體3(也稱為HER3和ErbB3)是受體蛋白酪胺酸激酶，屬於受體蛋白酪胺酸激酶的表皮生長因子受體(EGFR)亞家族，該家族還包括HER1(也稱為EGFR)、HER2和HER4。像典型的表皮生長因子受體那樣，跨膜受體HER3由細胞外配體結合結構域(ECD)、ECD內的二聚結構域、跨膜結構域和羧基端磷酸化結構域構成。除這些結構域以外，HER1、HER2和HER4還攜帶胞內蛋白酪胺酸激酶結構域(TKD)，而HER3缺乏該結構域，因而不能自磷酸化。
配體調節蛋白(HRG)與HER3的胞外結構域相結合，並通過促進與其它人表皮生長因子受體(HER)家族成員二聚化及其胞內結構域的轉磷酸作用啟動受體介導的信號傳導途徑。HER3與其它HER家族成員的二聚體形成擴展HER3的信號傳導潛力，而且不僅充當信號多樣化的手段，還用作信號放大的手段。例如，HER2/HER3雜二聚體誘導HER家族成員中最重要的促有絲***信號之一。HER3在多種類型的癌中過表現，例如乳腺癌、腸胃癌和胰腺癌。有趣的是，已顯示出HER2/HER3的表現與從非侵襲階段進展到侵襲階段之間的關係。因此，期望干擾HER3介導的信號傳導的藥劑。
目前臨床在研HER3靶點適應症涵蓋了血液瘤和實體瘤。主要的治療策略集中在單抗、雙抗、抗體偶聯藥物（ADC）等幾個方向。其中Anti-HER3抗體偶聯藥物，目前國際在研2項，1項進入臨床研究階段（第一三共U3-1402）治療NSCLC、MBC和CRC等。
ADC藥物由抗體、生物活性分子及連接體（Linker）組成。生物活性分子通過連接體共價偶聯到抗體上；抗體（例如單克隆抗體）能夠特異性識別腫瘤細胞表面的特異性靶點，進而能夠引導ADC到達癌細胞表面，並使ADC通過細胞內吞效應進入癌細胞；然後生物活性分子在癌細胞內釋放，達到殺滅癌細胞而儘量不損傷正常組織細胞的作用。
U3-1402是由第一三共公司開發，採用GGFG四肽作為酶切linker，細胞毒性藥物為Dxd。據報導，在治療EGFR突變的NSCLC一期劑量擴展（5.6mg/kg，Q3W），ORR 39%，DCR 72% ，mPFS 8.2個月，對腦轉移患者有類似的療效；安全性方面，主要以血液毒性（血小板減少，嗜中性白血球減少等）和間質性肺炎（5~7%）為主 。
本申請涉及一種用於治療HER3陽性癌症的抗體藥物偶聯物，並示例性地公開了以全人源抗體22B6D2-hIgG1作為靶向部分的具有通式Ab-[M-L-E-D] x所示結構的抗體藥物偶聯物。結果顯示所述偶聯物具有較優的藥物抗體偶聯比，並且所述偶聯物對HER3陽性細胞具有優良的結合活性，對HER3陽性的癌症，例如結腸癌，胃癌，乳腺癌，肺癌（例如，非小細胞肺癌，具體如肺腺癌）具有很好的靶向殺傷效果。因此，本申請提供一種用於治療HER3高表現癌症的抗體藥物偶聯物，含有所述抗體藥物偶聯物的藥物組合物，以及它們在治療HER3高表現癌症中的應用。 抗體藥物偶聯物
在一個方面，本申請提供一種抗體藥物綴合物，其具有式Ab-[M-L-E-D] x所示結構，其中： Ab是與人表皮生長因子受體3(HER3，也稱為Erbb3)特異性結合的抗體或其抗原結合片段； M是和抗體或其抗原結合片段的接頭部位； L是連接接頭M和E之間的連接子； E是連接L和D的結構片段； D是細胞毒性藥物片段； x選自1至10。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含： (1) 下述重鏈可變區（VH）和/或輕鏈可變區（VL），其中CDR按Chothia編號系統定義： (1a) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 1或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 2或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:3或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 4或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 5或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 6或其變體的CDR-L3；或， (1b) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 19或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 20或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:21或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 22或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 23或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 24或其變體的CDR-L3；或， (1c) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 36或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 37或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:38或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 45或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO:23或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 52或其變體的CDR-L3； 其中，(1a)、(1b)、(1c)任一項中所述的變體與其所源自的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，或者所述變體與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）；優選地，所述的置換是保守置換； 或者， (2) 下述重鏈可變區（VH）和/或輕鏈可變區（VL），其中CDR按Kabat編號系統定義： (2a) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 7或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 8或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:9或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 4或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 5或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 6或其變體的CDR-L3；或， (2b) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 25或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 26或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:21或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 22或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 23或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 24或其變體的CDR-L3；或， (2c) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 39或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 40或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:38或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 45或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO:23或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 52或其變體的CDR-L3； 其中，(2a) 、(2b)、（2c） 任一項中所述的變體與其所源自的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，或者所述變體與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）；優選地，所述的置換是保守置換； 或者， (3) 下述重鏈可變區（VH）和/或輕鏈可變區（VL），其中CDR按IMGT編號系統定義： (3a) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO:10或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 11或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:12或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 13或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 14或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 6或其變體的CDR-L3；或， (3b) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 27或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 28或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:29或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 30或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO:31或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 24或其變體的CDR-L3；或， (3c) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 41或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 42或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:43或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 44或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO:31其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 52或其變體的CDR-L3； 其中，(3a) 、（3b）、（3c）任一項中所述的變體與其所源自的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，或者所述變體與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）；優選地，所述的置換是保守置換。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含： （a）SEQ ID NO：15所示的VH或其變體，和/或，SEQ ID NO：16所示的VL或其變體； （b）SEQ ID NO：32所示的VH或其變體，和/或，SEQ ID NO：33所示的VL或其變體；或 （c）SEQ ID NO：46所示的VH或其變體，和/或，SEQ ID NO：47所示的VL或其變體； 其中，所述變體與其所源自的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，或者所述變體與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）；優選地，所述的置換是保守置換。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段進一步包含： (a) 人免疫球蛋白的重鏈恆定區（CH）或其變體，所述變體與其所源自的野生型序列相比具有一個或多個胺基酸的置換、缺失或添加（例如，至多20個、至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）；和 (b) 人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CL）或其變體，所述變體與其所源自的野生型序列相比具有一個或多個胺基酸的置換、缺失或添加（例如，至多20個、至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）。
在一些實施方案中，所述重鏈恆定區是IgG重鏈恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區，例如人IgG1重鏈恆定區或人IgG4重鏈恆定區。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）或其變體，所述變體與SEQ ID NO：50相比具有至多20個胺基酸的保守置換（例如至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的保守置換）。
在一些實施方案中，所述輕鏈恆定區是κ輕鏈恆定區。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）或其變體，所述變體與SEQ ID NO：51相比具有至多20個胺基酸的保守置換（例如至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的保守置換）。 在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）和如SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含： （1）包括SEQ ID NO：15所示序列的VH和SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）的重鏈，和，包括SEQ ID NO：16所示序列的VL和SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）的輕鏈； （2）包括SEQ ID NO：32所示序列的VH和SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）的重鏈，和，包括SEQ ID NO：33所示序列的VL和SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）的輕鏈；或 （3）包括SEQ ID NO：46所示序列的VH和SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）的重鏈，和，包括SEQ ID NO：47所示序列的VL和SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）的輕鏈。
在所述抗體藥物綴合物中，所述細胞毒性藥物可通過連接體（如本申請中所示“M-L-E”片段）連接至所述抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，M為 ，其中環A為5-6員脂雜環、或5-20員芳香族環系，所述脂雜環和芳香族環系視情況被一個或多個選自氧基（=O）、鹵素、氰基、胺基、羧基、巰基和C 1-6烷基的基團取代；M 1選自單鍵和C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基或C 2-20伸炔基。
在一些實施方案中，M為 ，其中環A為5員脂雜環、6員雜芳環、或由一個以上的6員芳雜環與苯環通過單鍵連接形成的多環，所述脂雜環視情況被一個或多個選自氧基（=O）、鹵素和C 1-4烷基的基團取代；M 1選自單鍵和C 3-10伸烷基、C 3-10伸烯基或C 3-10伸炔基。
在一些實施方案中，M為 ，其中環A選自 、 、 和 ；M 1選自單鍵和C 5-8伸烷基、C 5-8伸烯基或C 5-8伸炔基。
在一些實施方案中，M選自以下結構： 和 。
在一些實施方案中，M選自以下結構： 。
在一些實施方案中，L選自由下述的一個或多個組成的結構：C 1-6伸烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ；其中R’代表氫、C 1-6烷基或含-(CH 2CH 2O)r-的烷基；r選自1-10的整數；s選自1-20的整數。
在一些實施方案中，L選自由下述的一個或多個組成的結構：C 1-6伸烷基、-NH-、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、 、 、 、 、 、 和 ；其中s選自1-20的整數。
在一些實施方案中，L選自以下結構： ， ， ， ， , ， ， ， ， ， 和 ； 其中s選自1-20的整數。
在一些實施方案中，L選自以下結構： ， ， 和 。
在一些實施方案中，L選自以下結構： ， 和 。
在一些實施方案中，E為單鍵，-NH-CH 2-，-NH-CH 2-O-CH 2-CO-或選自以下結構： ， ， ， 和 。
在一些實施方案中，E為單鍵，-NH-CH 2-、-NH-CH 2-O-CH 2-CO-、 、 或 。
在一些實施方案中，E為-NH-CH 2-O-CH 2-CO-、 或 。
在一些實施方案中，E為-NH-CH 2-O-CH 2-CO-或 。
在一些實施方案中，M選自以下結構： 和 ； L選自以下結構： ， ， 和 ； E為-NH-CH 2-O-CH 2-CO-、 或 。
在一些實施方案中， 選自以下結構： ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， , 和 。
在一些實施方案中， 選自以下結構： ， ， ， ， 和 。
在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物選自在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物選自微管蛋白抑制劑、DNA嵌入劑、DNA拓撲異構酶抑制劑和RNA聚合酶抑制劑。在一些實施方案中，所述微管蛋白抑制劑為奧瑞他汀類化合物或美登素類化合物。在一些實施方案中，所述DNA嵌入劑為吡咯並苯二氮卓(PBD)。在一些實施方案中，所述DNA拓撲異構酶抑制劑為拓撲異構酶I抑制劑（例如，喜樹鹼、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康、拓撲替康、貝洛替康、或盧比替康)或拓撲異構酶II抑制劑（例如，阿黴素、PNU-159682、多卡米星、柔紅黴素、米托蒽醌、鬼臼毒素、或依託泊苷）。在一些實施方案中，所述RNA聚合酶抑制劑為α-鵝膏草鹼（α-amanitin）或其藥學上可接受的鹽、酯或類似物。
本申請中所公開的細胞毒性藥物通常含有多種官能團，例如羥基（-OH）、羧基（-COOH）、巰基（-SH）、一級胺基（-NH 2）、二級胺基（-NR AH）或三級胺基（-NR BR C），其中R A、R B、R C在此僅代表N上的非氫取代基，所述細胞毒性藥物可通過這些官能團與綴合物中的連接體連接。
在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物通過其上的-OH、-SH、一級胺基、二級胺基或三級胺基與所述抗體藥物綴合物中的E連接。
在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物選自以下式I和式II： 其中，R 1，R 2各自獨立地選自C 1-6烷基和鹵素； R 3選自H和-CO-CH 2OH； R 4和R 5各自獨立地選自H、鹵素和羥基；或者R 4和R 5與相連碳原子連接成5-6員含氧雜環； R 6選自氫或-C 1-4伸烷基-NR aR b； R 7選自C 1-6烷基和-C 1-4伸烷基-NR aR b； 其中R a、R b在每次出現時各自獨立地選自H、C 1-6烷基、-SO 2- C 1-6烷基和-CO-C 1-6烷基。
在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物選自以下化合物： 。
在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物選自以下化合物： 。
所述細胞毒性藥物與連接體連接後得到的該細胞毒性藥物相應的片段即為本申請式Ab-[M-L-E-D] x中的D。在一些實施方案中，D為所述細胞毒性藥物上的-OH、-NH 2或二級胺基失掉一個H得到的一價結構。
在一些實施方案中，D選自以下結構： 。
在一些實施方案中，所述抗體藥物綴合物選自下示的ADC A-01~ADC A-25，ADC B-01~ADC B-05： ADC A-01 ， ADC A-02 ， ADC A-03 ， ADC A-04 ， ADC A-05 ， ADC A-06 ， ADC A-07 ， ADC A-08 ， ADC A-09 ， ADC A-10 ， ADC A-11 ， ADC A-12 ， ADC A-13 ， ADC A-14 ， ADC A-15 ， ADC A-16 ， ADC A-17 ， ADC A-18 ， ADC A-19 ， ADC A-20 ， ADC A-21 ， ADC A-22 ， ADC A-23 ， ADC A-24 ， ADC A-25 ， ADC B-01 ， ADC B-02 ， ADC B-03 ， ADC B-04 ， ADC B-05 ， 其中，各抗體藥物綴合物中的HA代表包含如SEQ ID NO:15所示的VH和如SEQ ID NO:16所示的VL的抗體或其抗原結合片段，例如包括SEQ ID NO：15所示的VH和SEQ ID NO：50所示的CH，以及SEQ ID NO：16所示的VL和SEQ ID NO：51所示的CL的抗體或其抗原結合片段； 其中， 表示抗體或其抗原結合片段中的巰基與連接體的具體連接方式。
在一些實施方案中，Ab-[M-L-E-D] x所示抗體藥物綴合物中的x為1-10，例如1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，2-3，2-4，2-5，2-6，2-7，2-8，2-9，2-10，3-4，3-5，3-6，3-7，3-8，3-9，3-10，4-5，4-6，4-7，4-8，4-9，4-10，5-6，5-7，5-8，5-9，5-10，6-7，6-8，6-9，6-10，7-8，7-9，7-10，8-9，8-10或9-10。
在一些實施方案中，Ab-[M-L-E-D] x所示抗體藥物綴合物中的x為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些實施方案中，所述抗體藥物綴合物選自： ， ， 和 ， 其中，各抗體藥物綴合物中的HA選自： （1）代表包含如SEQ ID NO:15所示的VH和如SEQ ID NO:16所示的VL的抗體或其抗原結合片段，例如包括SEQ ID NO：15所示的VH和SEQ ID NO：50所示的CH，以及SEQ ID NO：16所示的VL和SEQ ID NO：51所示的CL的抗體或其抗原結合片段； （2）代表包含如SEQ ID NO:32所示的VH和如SEQ ID NO:33所示的VL的抗體或其抗原結合片段，例如包括SEQ ID NO：32所示的VH和SEQ ID NO：50所示的CH，以及SEQ ID NO：33所示的VL和SEQ ID NO：51所示的CL的抗體或其抗原結合片段；和 （3）代表包含如SEQ ID NO:46所示的VH和如SEQ ID NO:47所示的VL的抗體或其抗原結合片段，例如包括SEQ ID NO：46所示的VH和SEQ ID NO：50所示的CH，以及SEQ ID NO：47所示的VL和SEQ ID NO：51所示的CL的抗體或其抗原結合片段； x為3~8，例如3~4或7~8。
在一些實施方案中，所述抗體藥物綴合物為： 其中，所述HA代表包括SEQ ID NO：17所示的HC和SEQ ID NO：18所示的LC的抗體或其抗原結合片段； x為7~8。
在一些實施方案中，所述抗體藥物綴合物的DAR值（藥物抗體偶聯比）為1-10，例如：1~2，1~3，1~4，1~5，1~6，1~7，1~8，1~9，1~10，2~3，2~4，2~5，2~6，2~7，2~8，2~9，2~10，3~4，3~5，3~6，3~7，3~8，3~9，3~10，4~5，4~6，4~7，4~8，4~9，4~10，5~6，5~7，5~8，5~9，5~10，6~7，6~8，6~9，6~10，7~8，7~9，7~10，8~9，8~10，或9~10，優選為3~9，例如，3.0~3.5，3.0~4.0，3.0~4.5，3.0~5.0，3.0~5.5，3.0~6.0，3.5~4.0，3.5~4.5，3.5~5.0，3.5~5.5，3.5~6.0，3.5~6.5，3.5~7.0，3.5~7.5，3.5~8.0，4.0~4.5，4.0~5.0，4.0~5.5，4.0~6.0，4.0~6.5，4.0~7.0，4.0~7.5，4.0~8.0，4.5~5.0，4.5~5.5，4.5~6.0，4.5~6.5，4.5~7.0，4.5~7.5，4.5~8.0，5.0~5.5，5.0~6.0，5.0~6.5，5.0~7.0，5.0~7.5，5.0~8.0， 5.5~6.0，5.5~6.5，5.5~7.0，5.5~7.5，5.5~8.0，6.0~6.5，6.0~7.0，6.0~7.5，6.0~8.5，6.5~7.0，6.5~7.5，6.5~8.5，7.0~7.5，7.0~9.0或7.5~9.0。 藥物 - 連接體
本領域技術人員應當理解，可模組化製備本申請所述抗體藥物綴合物。例如，先獲得游離形式的“藥物-連接體”（可理解為M’-L-E-D，其中M’為M與抗體或其抗原結合片段共價連接前的結構形式），而後將其與抗體或其抗原結合片段共價連接得到本申請所述抗體藥物綴合物。相應地，抗體或其抗原結合片段上的一個或多個巰基（-SH）、胺基(-NH 2)或羧基（-COOH）與所述游離形式的“藥物-連接體”中M’通過取代反應（例如脫除其上的-SO 2Me或-Br等結構）或者通過加成反應等方式連接。
在另一個方面，本發明提供一種藥物-連接體，其具有式M’-L-E-D所示結構，其中： M’為 ，Lg為親核取代反應的離去基團（例如， 鹵素、甲磺醯基、氟代苯酚基或 ），或為羥基（-OH）、巰基（-SH）或胺基（-NH 2）；或者，Lg與環A上相鄰原子形成不飽和雙鍵；環A為5-6員脂雜環、或5-20員芳香族環系，所述脂雜環和芳香族環系視情況被一個或多個選自氧基（=O）、鹵素、氰基、胺基、羧基、巰基和C 1-6烷基的基團取代；M 1選自單鍵和C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基或C 2-20伸炔基； L、E和D結構如前述抗體藥物綴合物中任一項中所定義。
在一些實施方案中，M’為 ，Lg為甲磺醯基，或者，Lg與環A上相鄰原子形成碳碳雙鍵；環A為5員脂雜環、6員雜芳環、或由一個以上的6員芳雜環與苯環通過單鍵連接形成的多環，所述脂雜環視情況被一個或多個選自氧基（=O）、鹵素和C 1-4烷基的基團取代；M 1選自單鍵和C 3-10伸烷基、C 3-10伸烯基或C 3-10伸炔基。
在一些實施方案中，M’為 ， 選自 、 、 和 ；M 1選自單鍵和C 5-8伸烷基、C 5-8伸烯基或C 5-8伸炔基。
在一些實施方案中，M’選自 和 。
在一些實施方案中，M’為 。
在一些實施方案中，M’選自 和 ； 並且，當M’為 時，E為 ，或者 ，其中s選自1-20的整數。
在一些實施方案中，所述游離形式的“藥物-連接體”選自下示的A-01~A-25，B-01~B-05： A-01： ， A-02： ， A-03： ， A-04： ， A-05： ， A-06： ， A-07： ， A-08： ， A-09： ， A-10： ， A-11： ， A-12： ， A-13： ， A-14： ， A-15： ， A-16： ， A-17： ， A-18： ， A-19： ， A-20： ， A-21： ， A-22： ， A-23： ， A-24： ， A-25： ， B-01： ， B-02： ， B-03： ， B-04： ， B-05： 。 抗體的製備
本文描述的抗體可以通過本領域已知的各種方法製備，例如，通過遺傳工程和重組技術。例如，通過化學合成或PCR擴增獲得編碼本發明所述抗體的重鏈和輕鏈的DNA分子。將得到的DNA分子***到表現載體中，然後轉染到宿主細胞中。然後，轉染的宿主細胞在特定條件下培養，並表現本發明的抗體。 偶聯物
另一方面，本申請提供了一種將本文所述的藥物-連接體綴合至本文所述的抗體以製備本文所述的抗體藥物偶聯物(ADC)的方法。
在某些實施方案中，本文所述的抗體通過與抗體中的離胺酸偶聯而與本文所述的藥物-連接體綴合。
在某些實施方案中，本文所述的抗體通過抗體中的半胱胺酸與本文所述的藥物-連接體綴合。在某些實施方案中，所述半胱胺酸來自所述抗體中還原的鏈內二硫鍵。在某些實施方案中，所述半胱胺酸來自所述抗體中還原的鏈間二硫鍵。
在一些實施方案中，所述抗體通過所述抗體中還原的鏈間二硫鍵而與藥物-連接體綴合。例如，IgG1抗體由四條多肽鏈組成，兩條重鏈包含VH、CH1和Fc(例如鉸鏈、CH2和CH3)結構域，兩條輕鏈包含VL和CL結構域，通過鏈間半胱胺酸二硫鍵(-S-S-)連接(例如兩條重鏈-輕鏈鏈間二硫鍵和兩條鉸鏈重鏈-重鏈鏈間二硫鍵)。在某些實施方案中，當這些二硫鍵在還原條件下斷裂時，產生八(8)個反應性半胱胺酸巰基部分。在某些實施方案中，所述八個反應性半胱胺酸巰基部分中的每一個都是藥物-連接體的連接位點，這樣最多八個(x = 8)藥物-連接體可以連接到還原的抗體上。在某些實施方案中，四個二硫鍵中的任何一個在還原條件下斷裂，產生兩(2)個反應性半胱胺酸巰基部分。在進一步的實施方案中，兩個反應性半胱胺酸巰基部分中的每一個都是藥物-連接體的連接位點，使得兩個(x = 2)藥物-連接體可以連接到還原的抗體上。在某些實施方案中，四個二硫鍵中的任何兩個在還原條件下斷裂，產生四(4)個反應性半胱胺酸巰基部分。在進一步的實施方案中，四個反應性半胱胺酸巰基部分中的每一個都是藥物-連接體的連接位點，使得四個(x = 4) 藥物-連接體可以連接到還原的抗體上。在某些實施方案中，四個二硫鍵中的任何三個在還原條件下斷裂，產生六(6)個反應性半胱胺酸巰基部分。在進一步的實施方案中，六個反應性胱胺酸巰基部分中的每一個都是藥物-連接體的連接位點，使得六個(x = 6) 藥物-連接體可以連接到還原的抗體上。
在一些實施例中，鏈間二硫鍵位於兩個半胱胺酸殘基之間，其在還原條件下斷裂，產生兩個反應性半胱胺酸巰基部分。在進一步的實施方案中，所述抗體中的鏈間二硫鍵位於重鏈和輕鏈之間，例如位於根據EU編號重鏈的C220和κ輕鏈的C214之間，或者位於根據EU編號重鏈的C220和根據Kabat編號λ輕鏈的C214之間。此外，可選地，抗體中的鏈間二硫鍵位於兩條重鏈之間，例如根據EU編號第一條重鏈的C226和/或C229與第二條重鏈的C226和/或C229之間。在一些實施例中，所述半胱胺酸殘基位於抗體的鉸鏈區。在一些實施方案中，根據EU編號，所述半胱胺酸殘基位於重鏈中220、226或229位中的任何一個或多個(在本文中也分別稱為C220、C226或C229)。在一些實施方案中，根據EU和/或Kabat編號，所述半胱胺酸殘基位於輕鏈的214位(本文也稱為C214，例如根據EU和Kabat編號，位於κ輕鏈的214位元，或根據Kabat編號，位於λ輕鏈的214位)。在一個實施方案中，根據EU編號，所述半胱胺酸殘基位於重鏈的第220、226和229位元，根據EU或Kabat編號，位於輕鏈的第214位。在一個實施方案中，根據EU編號，所述半胱胺酸殘基位於重鏈的第220、226和229位元，根據EU和Kabat編號，位於κ輕鏈的第214位。在一個實施方案中，根據EU編號，所述半胱胺酸殘基位於重鏈的第220、226和229位元，根據Kabat編號，位於λ輕鏈的第214位。在一個實施方案中，所述半胱胺酸殘基位於下列任何一個或多個位置： (i)根據EU編號，第一重鏈中220、226和229位中的任一個、或任兩個、或任三個、或全部四個； (ii)根據EU編號，第二重鏈中220、226和229位中的任一個、或任兩個、或任三個、或全部四個； (iii)根據Kabat編號，第一輕鏈中的第214位；和/或 (iv)根據Kabat編號，第二輕鏈中的第214位。
如本文所用，C220、C226和C229指根據EU編號鑒定的免疫球蛋白的胺基酸殘基(半胱胺酸、Cys、C)。如本領域技術人員所理解的，這樣的編號相應地代表多肽的胺基酸殘基，其與免疫球蛋白所確定的胺基酸殘基對齊，如www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/ Hu_IGHGnber.html中所示。
如本文所用，κ輕鏈的第214位半胱胺酸殘基指根據Kabat編號鑒定的免疫球蛋白的胺基酸殘基(半胱胺酸、Cys、C)。如本領域技術人員所理解的，這樣的編號相應地代表多肽的胺基酸殘基，其與免疫球蛋白所確定的胺基酸殘基對齊，如www.imgt.org/IMGTScientificChart/ Numbering/Hu_IGKCnber.html中所示。
如本文所用，λ輕鏈的第214位半胱胺酸殘基指根據Kabat編號鑒定的免疫球蛋白的胺基酸殘基(半胱胺酸、Cys、C)。如本領域技術人員所理解的，這樣的編號相應地代表多肽的胺基酸殘基，其與免疫球蛋白所確定的胺基酸殘基對齊，如www.imgt.org/IMGTScientificChart/ Numbering/Hu_IGLCnber.html中所示。
在某些實施方案中，本文所述的抗體包含鉸鏈區中的四個鏈間二硫鍵，所述鏈間二硫鍵可被還原，從而斷裂，並顯示可與藥物-連接體上的馬來醯亞胺部分(例如本文所述的藥物-連接體上的馬來醯亞胺部分)綴合的反應性巰基部分。
在一個實施例中，本發明提供了一種製備本文所述ADC的方法，包括以下步驟： a)提供包含抗體的溶液； b)將a)的溶液與還原劑接觸； c)將b)的溶液與包含如本文所述的藥物-連接體或其鹽的溶液接觸，以製備所述ADC。
在一個實施例中，還原劑是三(2羧乙基)膦(TCEP)。 組合物
在另一方面，本申請提供了如本文所述的抗體藥物偶聯物(ADC)的組合物。這種組合物可包含多個本文所述的ADC，其中每個ADC包含本文所述的藥物-連接體，其中x獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。換言之，所述組合物中的每個抗體分子可以與1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個藥物-連接體綴合。因此，所述組合物的特徵在於“藥物-抗體”比(DAR)在約1至約10的範圍內。測定DAR的方法是技術人員熟知的，包括使用反相層析或HPLC-MS的方法。
例如，在任意實施方案中，本文所述的ADC組合物具有約1至約10或其間任何子範圍的DAR，例如:約1至2、約1至3、約1至4、約1至5、約1至6、約1至7、約1至8、約1至9、約1至10、約2至3、約2至4、約2至5、約2至6， 約2至7，約2至8，約2至9，約2至10，約3至4，約3至5，約3至6，約3至7，約3至8，約3至9，約3至10，約4至5，約4至6，約4至7，約4至8，約4至9，約4至10，約5至6，約5至7，約5至8， 約5至9、約5至10、約6至7、約6至8、約6至9、約6至10、約7至8、約7至9、約7至10、約8至9、約8至10或約9至10。
在某些實施方案中，本文所述ADC組合物的DAR為約3至9，例如約3.0至3.5、約3.0至4.0、約3.0至4.5、約3.0至5.0、約3.0至6.0、約3.5至4.0、約3.5至4.5、約3.5至5.0、約3.5至5.5、約3.5至6.0、約3.5至6.5至6 約4.0至4.5，約4.0至5.0，約4.0至5.5，約4.0至6.0，約4.0至6.5，約4.0至7.0，約4.0至8.0，約4.5至5.0，約4.5至5.5，約4.5至6.0，約4.5至6.5，約4.5至7.0，約4.5至7.5 約5.0至8.0，約5.5至6.0，約5.5至6.5，約5.5至7.0，約5.5至7.5，約5.5至8.0，約6.0至6.5，約6.0至7.0，約6.0至7.5，約6.0至8.5，約6.5至7.0，約6.5至7.5，約6.5至7.5，約6.5至8.5，約7.0至7.5。 藥物組合物
在另一個方面，本申請提供一種藥物組合物，其含有前文任一項所述的抗體藥物綴合物和任選的前文任一項所述的藥物-連接體，以及一種或多種藥用輔料。
藥用輔料包括，例如，藥用載體和/或賦形劑。
本文所述抗體藥物綴合物通常與藥學上可接受的胃腸外媒介一起以單位可注射形式配製，供胃腸外使用，例如推注、靜脈注射、腫瘤內注射等。視情況，以凍乾劑或溶液劑的形式將具有期望純度的抗體藥物綴合物與藥學上可接受的稀釋劑、載體、賦型劑或穩定劑混合（Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980) 16 thedition, Osol, A. Ed.）。可以通過對於要治療的個體適宜的任何路徑施用本文所述抗體藥物綴合物或含有所述抗體藥物綴合物的藥物組合物。
本文所述的ADC和藥物組合物可以配製成醫學領域已知的任何劑型，例如片劑、丸劑、懸浮液、乳劑、溶液、凝膠、膠囊、粉末、顆粒、酏劑、錠劑、栓劑、注射劑(包括注射劑、注射用無菌粉末和注射用濃溶液)、吸入劑、噴霧劑等。優選的劑型取決於預期的給藥方式和治療用途。本發明的藥物組合物在生產和儲存條件下應該是無菌和穩定的。優選的劑型是注射劑。這種注射劑可以是無菌注射溶液。例如，無菌注射溶液可通過以下方法製備:將必要劑量的本發明抗體摻入合適的溶劑中，並視情況加入其它所需成分(包括但不限於pH調節劑、表面活性劑、佐劑、離子強度增強劑等，滲透劑、防腐劑、稀釋劑或其任意組合)，然後過濾滅菌。此外，為了便於儲存和使用，無菌注射液可以製備成無菌凍乾粉末(例如，通過真空乾燥或冷凍乾燥)。這種無菌凍乾粉末可以在使用前分散在合適的載體中，例如無菌無熱原水中。
此外，本文所述的ADC可以以單位劑量形式存在於藥物組合物中，以便於通過本領域已知的任何合適方法給藥，包括但不限於口服、口服、舌下、眼用、局部、腸胃外、直腸、鞘內、胞質內、腹股溝、膀胱內、局部(例如，粉末、軟膏或滴劑)或鼻內途徑。然而，對於許多治療用途，優選的給藥途徑/方式是非腸道給藥(例如，靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)。技術人員將理解，給藥的途徑和/或方式將根據預期目的而變化。在一些優選的實施方案中，本文所述的ADC和藥物組合物通過靜脈輸注或注射給藥。
在某些實施方案中，所述藥物組合物還可以包含其它藥物活性劑。在某些實施方案中，所述其它的藥物活性劑是具有抗腫瘤活性的藥物。在某些實施方案中，所述其它藥物活性劑選自EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-met或VEGF抑制劑、化療藥物或其任意組合。在某些實施方案中，本文所述的ADC和其它藥物活性劑作為單獨的組分或作為混合的組分提供。因此，本文所述的ADC和其它藥物活性劑可以同時、分別或依次給藥。 使用方法
本文所述的抗體藥物偶聯物、本文所述的藥物-連接體或其藥物組合物可用於治療各種疾病或病症，例如HER3高表現的癌症，包括實體瘤或血液系統惡性腫瘤，例如結腸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌(例如非小細胞肺癌，特別是肺腺癌)或淋巴瘤。
因此，本申請提供了如前述任一實施方案中所述的抗體藥物偶聯物(ADC)、藥物-連接體或包含其的藥物組合物在製備用於治療HER3高表現癌症的藥物中的用途。
同時，本申請還提供了一種治療HER3高表現癌症的方法，該方法包括向有此需要的個體施用治療有效量的如前述實施方案中任一項所述的抗體藥物偶聯物(ADC)、藥物-連接體或包含其的藥物組合物的步驟。
在某些實施方案中，所述抗體藥物偶聯物(ADC)、藥物-連接體或藥物組合物足以(例如，在個體中): (1)抑制細胞(如腫瘤細胞)的增殖； (2)抑制腫瘤生長； (3)誘導和/或增加抗體依賴性細胞毒性活性； (4)抑制HER3介導的信號轉導； (5)預防和/或治療HER3介導的疾病/障礙；或者 (6)上述(1)-(5)的任何組合。
在某些實施方案中，HER3介導的疾病/病症是腫瘤，例如表現HER3的腫瘤。在某些實施方案中，腫瘤選自乳腺癌、胃癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、結腸直腸癌、胰腺癌、頭頸鱗狀細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、***癌、肝癌、腎癌、膀胱癌或其任意組合。 應用
本文所述抗體藥物綴合物或其藥物組合物可以用於治療多種疾病或病症，例如HER3高表現癌症，包括實體瘤或血液系統惡性腫瘤，例如結腸癌，胃癌，乳腺癌，肺癌（例如，非小細胞肺癌，具體如肺腺癌），或淋巴癌。
因此，本申請提供前文任一項所述的抗體藥物綴合物、藥物-連接體、或含有其的藥物組合物在製備治療HER3高表現癌症的藥物中的用途。
同時，本申請還提供一種治療HER3高表現癌症的方法，其包括向由此需要的個體施用治療有效量的前文任一項所述的抗體藥物綴合物、藥物連接體、或含有其的藥物組合物的步驟。 定義
除非在下文中另有定義，本文中所使用的所有技術術語和科學術語的含義意圖與本領域技術人員通常所理解的相同。提及本文中使用的技術意圖指在本領域中通常所理解的技術，包括那些對本領域技術人員顯而易見的技術的變化或等效技術的替換。並且，本文中所用的基因組學、核酸化學、分子生物學等實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。雖然相信以下術語對於本領域技術人員很好理解，但仍然闡述以下定義以更好地解釋本發明。
術語“抗體”是指，通常由兩對多肽鏈（每對具有一條輕鏈(LC)和一條重鏈(HC)）組成的免疫球蛋白分子。抗體輕鏈可分類為κ（kappa）和λ（lambda）輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、γ、α或ε，並且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區通過大約12或更多個胺基酸的“J”區連接，重鏈還包含大約3個或更多個胺基酸的“D”區。各重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。恆定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應子功能，如可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)的結合。VH和VL區還可被細分為具有高變性的區域(稱為互補決定區(CDR))，其間散佈有較保守的稱為構架區(FR)的區域。各VH和VL由按下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4從胺基末端至羧基末端排列的3個CDR和4個FR組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(VH和VL)分別形成抗原結合部位。胺基酸在各區域或結構域的分配可遵循本領域已知的各種編號系統。
術語“互補決定區”或“CDR”是指抗體可變區中負責抗原結合的胺基酸殘基。在重鏈和輕鏈的可變區中各含有三個CDRs，命名為CDR1、CDR2和CDR3。這些CDR的精確邊界可根據本領域已知的各種編號系統進行定義，例如可按照Kabat編號系統（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）、Chothia編號系統（Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia等人 (1989) Nature 342:878-883）、IMGT編號系統（Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003）或AbM編號系統（Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modelling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86:9268–9272）中的定義。對於給定的抗體，本領域技術人員將容易地鑒別各編號系統所定義的CDR。並且，不同編號系統之間的對應關係是本領域技術人員熟知的（例如，可參見Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003）。
在本發明中，抗體或其抗原結合片段含有的CDR可根據本領域已知的各種編號系統確定，例如通過Kabat、Chothia、IMGT或AbM編號系統確定。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段含有的CDR通過Chothia編號系統定義。
術語“構架區”或“FR”殘基是指，抗體可變區中除了如上定義的CDR殘基以外的那些胺基酸殘基。
術語抗體的“抗原結合片段”是指抗體的片段的多肽，例如全長抗體的片段的多肽，其保持特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合，其也被稱為“抗原結合部分”。通常參見，Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 第2版，Raven Press, N.Y. (1989)，其以其全文通過引用合併入本文，用於所有目的。可通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗體的抗原結合片段。抗原結合片段的非限制性實例包括Fab片段、Fab'片段、F(ab)' 2片段、F(ab)' 3片段、Fd、Fv、scFv、di-scFv、(scFv) 2、二硫鍵穩定的Fv蛋白(“dsFv”)、單結構域抗體(sdAb，納米抗體)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部分。工程改造的抗體變體綜述於Holliger等, 2005；Nat Biotechnol, 23: 1126-1136中。
術語“Fd”意指由VH和CH1結構域組成的抗體片段；術語“dAb片段”意指由VH結構域組成的抗體片段（Ward 等人, Nature 341:544 546 (1989)）；術語“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1結構域組成的抗體片段；術語“F(ab’) 2片段”意指包含通過鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段；術語“Fab’片段”意指還原連接F(ab’) 2片段中兩個重鏈片段的二硫鍵後所獲片段，由一條完整的輕鏈和重鏈的Fd片段（由VH和CH1結構域組成）組成。
術語“Fv”意指由抗體的單臂的VL和VH結構域組成的抗體片段。Fv片段通常被認為是，能形成完整的抗原結合位點的最小抗體片段。一般認為，六個CDRs賦予抗體的抗原結合特異性。然而，即便是一個可變區（例如Fd片段，其僅僅含有三個對抗原特異的CDRs）也能夠識別並結合抗原，儘管其親和力可能低於完整的結合位點。
術語“Fc”意指，由抗體的第一重鏈的第二、第三恆定區與第二重鏈的第二、第三恆定區經二硫鍵結合而形成的抗體片段。抗體的Fc片段具有多種不同的功能，但不參與抗原的結合。
術語“scFv”是指，包含VL和VH結構域的單個多肽鏈，其中所述VL和VH通過接頭（linker）相連（參見，例如, Bird等人, Science 242:423-426 (1988)；Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷， Roseburg 和Moore 編，Springer-Verlag，紐約，第269-315頁(1994)）。此類scFv分子可具有一般結構：NH 2-VL-接頭-VH-COOH或NH 2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(GGGGS) 4的接頭，但也可使用其變體（Holliger等人(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448）。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng. 8:725-731，Choi等人(2001)，Eur. J. Immunol. 31: 94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res. 56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J. Mol. Biol. 293:41-56和Roovers等人 (2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情況下，scFv的VH與VL之間還可以存在二硫鍵。在某些實施方案中，VH和VL結構域可以以任何合適的排列彼此相對定位。例如，包含NH 2-VH-VH-COOH、NH 2-VL-VL-COOH的scFv。
術語“單域抗體（single-domain antibody, sdAb）”具有本領域技術人員通常理解的含義，其是指由單個單體可變抗體結構域（例如單個重鏈可變區）所組成的抗體片段，其保持特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力(Holt, L.等人, 生物技術趨勢(Trends in Biotechnology), 21(11):484-490，2003)。單域抗體也稱為納米抗體（nanobody）。
上述各個抗體片段均保持了特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合。
在本文中，除非上下文明確指出，否則當提及術語“抗體”時，其不僅包括完整抗體，而且包括抗體的抗原結合片段。
可使用本領域技術人員已知的常規技術（例如，重組DNA技術或酶促或化學斷裂法）從給定的抗體（例如本發明提供的抗體）獲得抗體的抗原結合片段（例如，上述抗體片段），並且以與用於完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結合片段。
術語“單克隆抗體”和“mAb”具有相同的含義且可互換使用可互換，其是指，來自一群高度同源的抗體分子中的一個抗體或抗體的一個片段，也即，除可能自發出現的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對抗原上的單一表位具有高特異性。多克隆抗體是相對於單克隆抗體而言的，其通常包含至少2種或更多種的不同抗體，這些不同的抗體通常識別抗原上的不同表位。此外，修飾語“單克隆”僅表明該抗體的特徵為從高度同源的抗體群中獲得，不能理解為需要通過任何特定方法來製備所述抗體。
術語“嵌合抗體（Chimeric antibody）”是指，這樣的抗體，其輕鏈或/和重鏈的一部分源自一個抗體（其可以源自某一特定物種或屬於某一特定抗體類或亞類），且輕鏈或/和重鏈的另一部分源自另一個抗體（其可以源自相同或不同的物種或屬於相同或不同的抗體類或亞類），但無論如何，其仍保留對目標抗原的結合活性。例如，術語“嵌合抗體”可包括這樣的抗體，其中抗體的重鏈和輕鏈可變區來自第一抗體（例如鼠源抗體），而抗體的重鏈和輕鏈可變區來自第二抗體（例如人抗體）。例如，通過免疫全人轉基因小鼠產生的抗體可以稱為嵌合抗體，其由全人源的可變區和鼠源的恆定區組成。
術語“鼠源抗體”是指通過下述方法獲得的抗體：融合免疫接種過的小鼠的B細胞與骨髓瘤細胞，篩選出既能無限增殖又能分泌抗體的鼠雜交融合細胞，繼而進行篩選、抗體製備和抗體純化；或者是指，由抗原侵入小鼠體內後B細胞分化增殖而形成漿細胞所分泌產生的抗體。
術語“人源化抗體”是指，經基因工程改造的非人源抗體，其胺基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體（供體抗體），全部或部分的非CDR區（例如，可變區FR和/或恆定區）來自於人源免疫球蛋白（受體抗體）。人源化抗體通常保留了供體抗體的預期性質，包括但不限於，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力、增強免疫應答的能力等。供體抗體可以是有預期性質（例如，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力和/或增強免疫應答的能力）的小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物（例如，食蟹猴）抗體。
術語“同一性”用於指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當兩個進行比較的序列中的某個位置都被相同的鹼基或胺基酸單體亞單元佔據時(例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤佔據，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被離胺酸佔據)，那麼各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分比同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數目除以進行比較的位置數目×100的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那麼這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過電腦程式例如Align程式(DNAstar, Inc.)方便地進行的Needleman等人(1970) J. Mol. Biol.48：443-453的方法來實現。還可使用已整合入ALIGN程式(版本2.0)的E. Meyers和W. Miller (Comput. Appl Biosci.，4:11-17 (1988))的演算法，使用PAM120權重殘基表(weight residue table)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個胺基酸序列之間的百分比同一性。此外，可使用已整合入GCG套裝軟體(可在www.gcg.com上獲得)的GAP程式中的Needleman和Wunsch (J MoI Biol. 48:444-453 (1970))演算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的長度權重來測定兩個胺基酸序列之間的百分比同一性。
術語“保守置換”意指不會不利地影響或改變包含胺基酸序列的蛋白/多肽的預期性質的胺基酸置換。例如，可通過本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入保守置換。保守胺基酸置換包括用具有相似側鏈的胺基酸殘基替代胺基酸殘基的置換，例如用在物理學上或功能上與相應的胺基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸和組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、***酸、甲硫胺酸)、β分支側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)和芳香族側鏈(例如，酪胺酸、***酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。因此，優選用來自相同側鏈家族的另一個胺基酸殘基替代相應的胺基酸殘基。鑒定胺基酸保守置換的方法在本領域內是熟知的(參見，例如，Brummell等人，Biochem. 32:1180-1187 (1993)；Kobayashi等人Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；和Burks等人Proc. Natl Acad. Set USA 94:412-417 (1997)，其通過引用併入本文)。
本文涉及的二十個常規胺基酸的編寫遵循常規用法。參見例如，Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates , Sunderland, Mass. (1991))，其以引用的方式併入本文中。在本發明中，胺基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙胺酸可用A或Ala表示。
術語“藥學上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與個體和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995)，並且包括但不限於：pH調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑，稀釋劑，維持滲透壓的試劑，延遲吸收的試劑，防腐劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液。表面活性劑包括但不限於陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80。離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。防腐劑包括但不限於各種抗細菌試劑和抗真菌試劑，例如對羥苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。維持滲透壓的試劑包括但不限於糖、NaCl及其類似物。延遲吸收的試劑包括但不限於單硬脂酸鹽和明膠。稀釋劑包括但不限於水，水性緩衝液(如緩衝鹽水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐劑包括但不限於各種抗細菌試劑和抗真菌試劑，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，對羥苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。穩定劑具有本領域技術人員通常理解的含義，其能夠穩定藥物中的活性成分的期望活性，包括但不限於麩胺酸鈉，明膠，SPGA，糖類（如山梨醇，甘露醇，澱粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖），胺基酸（如麩胺酸，甘胺酸），蛋白質（如乾燥乳清，白蛋白或酪蛋白）或其降解產物（如乳白蛋白水解物）等。
術語“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它變體形式為包含性的(inclusive)或開放式的，且不排除其它未列舉的元素或方法步驟。
術語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預防疾病（例如，腫瘤）有效量是指，足以預防，阻止，或延遲疾病（例如，腫瘤）的發生的量；治療疾病有效量是指，足以治癒或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其併發症的量。測定這樣的有效量完全在本領域技術人員的能力範圍之內。例如，對於治療用途有效的量將取決於待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其它治療等等。ADC的治療有效量可能因以下因素而異：待治療疾病的嚴重程度，患者自身免疫系統的一般狀態，患者的一般狀況，例如年齡，體重和性別，藥物的給藥方式以及同時進行的其他治療等。
術語“治療”是指，為了獲得有益或所需臨床結果而實施的方法。為了本發明的目的，有益或所需的臨床結果包括但不限於，減輕症狀、縮小疾病的範圍、穩定（即，不再惡化）疾病的狀態，延遲或減緩疾病的發展、改善或減輕疾病的狀態、和緩解症狀（無論部分或全部），無論是可檢測或是不可檢測的。此外，“治療”還可以指，與期望的存活期相比（如果未接受治療），延長存活期。
術語“個體”是指哺乳動物，例如靈長類哺乳動物，例如人。在某些實施方式中，所述個體（例如人）患有腫瘤，或者具有患有上述疾病的風險。
術語“癌症”和“腫瘤”可互換使用，其是指以體內異常細胞的不受控生長為特徵的一大類疾病。不受管制的細胞***可能導致惡性腫瘤或侵入鄰近組織的細胞的形成，並可能通過淋巴系統或血流轉移到身體的遠端部位。癌症包括良性和惡性癌症以及休眠腫瘤或微轉移。癌症也包括血液腫瘤，尤其是血液系統惡性腫瘤。
術語“血液系統惡性腫瘤”包括淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或淋巴惡性腫瘤，以及脾癌和淋巴結腫瘤。示例性淋巴瘤包括B細胞淋巴瘤和T細胞淋巴瘤。B細胞淋巴瘤，包括例如霍奇金淋巴瘤。T細胞淋巴瘤，包括例如皮膚T細胞淋巴瘤。血液系統惡性腫瘤還包括白血病，例如繼發性白血病或急性淋巴細胞性白血病。血液系統惡性腫瘤還包括骨髓瘤（例如多發性骨髓瘤）及其它血液和/或B細胞或T細胞相關的癌症。
術語“烷基”表示直鏈或支鏈烴基去掉1個氫原子得到的基團，例如“C 1-20烷基”、“C 1-10烷基”、“C 1-6烷基”、“C 1-4烷基”、“C 1-3烷基”等，具體實例包括但不限於：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、異己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。
術語“伸烷基”表示直鏈或支鏈烴基去掉2個氫原子得到的基團，例如“C 1-20伸烷基”、 “C 1-10伸烷基”、“C 3-10伸烷基”、 “C 5-8伸烷基”、“C 1-6伸烷基”、“C 1-4伸烷基”、“C 1-3伸烷基”等，具體實例包括但不限於：亞甲基、亞乙基、1,3-亞丙基、1,4-亞丁基、1,5-亞戊基或1,6-亞己基等。
術語“伸烯基”是指含有至少一個碳碳雙鍵的直鏈或支鏈的烴基失去兩個氫原子得到的二價基團，包括例如“C 2-20伸烯基”、“C 3-10伸烯基”、“C 5-8伸烯基”等。其實例包括但不限於：伸乙烯基、1-伸丙烯基、2-伸丙烯基、1-伸丁烯基、2-伸丁烯基、1,3-伸丁二烯基、1-伸戊烯基、2-伸戊烯基、3-伸戊烯基、1,3-伸戊二烯基、1,4-伸戊二烯基、1-伸己烯基、2-伸己烯基、3-伸己烯基、1,4-伸己二烯基等。
術語“伸炔基”是指含有至少一個碳碳三鍵的直鏈或支鏈烴基失去兩個氫原子得到的二價基團。包括例如“C 2-20伸炔基”、 “C 3-10伸炔基”、“C 5-8伸炔基”等。其實例包括但不限於：伸乙炔基、1-伸丙炔基、2-伸丙炔基、1-伸丁炔基、2-伸丁炔基、1,3-伸丁二炔基、1-伸戊炔基、2-伸戊炔基、3-伸戊炔基、1,3-伸戊二炔基、1,4-伸戊二炔基、1-伸己炔基、2-伸己炔基、3-伸己炔基、1,4-伸己二炔基等。
術語“脂雜環”是指含至少一個選自N、O和S的環成員的飽和或部分飽和的環狀結構。具體實例包括但不限於5-6員脂雜環、5-6員含氮脂雜環、5-6員含氧脂雜環等，例如四氫呋喃、吡咯烷、呱啶、四氫吡喃等。
術語“雜芳環”是指含至少一個選自N、O和S的環成員的芳香環狀結構。具體實例包括但不限於5-6員芳雜環、5-6員含氮芳雜環、5-6員含氧芳雜環等，例如呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、異噻唑、噻二唑、噁唑、異噁唑、噁二唑、咪唑、吡唑、1,2,3-***、1,2,4-***、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、1,2,5-噁二唑、1,3,4-噁二唑、吡啶、嘧啶、噠嗪、吡嗪、1,2,3-三嗪、1,3,5-三嗪、1,2,4,5-四嗪等。
術語 “芳香族環系”是指包含至少一個芳環（例如苯環等）或雜芳環（例如嘧啶環等）的單環或多環體系，兩個或更多個芳環和/或雜芳環可以形成稠合環或通過單鍵連接（例如二嘧啶基苯基等），所述芳香族環系可以是二價或更高價態（例如三價或四價），例如5-20員芳香族環系。
如本文中所使用的，術語“大約（about）”或“近似（approximately）”與數值變數結合使用時通常意味著變數的值在實驗誤差範圍內（例如，在平均值的95%置信區間內）或在10%或更寬範圍內。
應當注意，如果所描述的結構和該結構的名稱之間存在差異，則所描述的結構將被賦予更大的權重。
本申請涉及用於治療HER3陽性癌症的抗體藥物偶聯物，並且示例性地公開了具有如通式Ab-[M-L-E-D]x所示的結構並且使用全人抗體22B6D2-hIgG1作為靶向部分的抗體藥物偶聯物。結果表明，該偶聯物具有較好的藥物抗體比，對HER3陽性細胞具有良好的結合活性，對HER3陽性的癌症，如結腸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌(如非小細胞肺癌，特別是肺腺癌)具有很好的靶向殺傷作用。因此，本申請提供了用於治療高表現HER3的癌症的抗體藥物偶聯物、包含該抗體藥物偶聯物的藥物組合物及其在治療高表現HER3的癌症中的應用。
下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。以下對至少一個示例性實施例的描述實際上僅僅是說明性的，絕不作為對本發明及其應用或使用的任何限制。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
本發明涉及的序列的資訊描述於下面的表中：
抗體 編號系統 SEQ ID NO:
CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 VH VL CH CL HC LC
22B6D2-hIgG1 Chothia 1 2 3 4 5 6 15 16 50 51 17 18
Kabat 7 8 9 4 5 6
IMGT 10 11 12 13 14 6
47A3E3-hIgG1 Chothia 19 20 21 22 23 24 32 33 34 35
Kabat 25 26 21 22 23 24
IMGT 27 28 29 30 31 24
100H7D3-hIgG1 Chothia 36 37 38 45 23 52 46 47 48 49
Kabat 39 40 38 45 23 52
IMGT 41 42 43 44 31 52
序列編號 序列資訊 序列名稱
SEQ ID NO:1 GFTFRSY 22B6D2-hIgG1 Chothia CDR H1
SEQ ID NO:2 WYDGSN 22B6D2-hIgG1 Chothia CDR H2
SEQ ID NO:3 YYYDSNGYYDAFDI 22B6D2-hIgG1 Chothia CDR H3
SEQ ID NO:4 RASQGISNYLA 22B6D2-hIgG1 Chothia/Kabat CDR L1
SEQ ID NO:5 AASTLQS 22B6D2-hIgG1 Chothia/Kabat CDR L2
SEQ ID NO:6 QQLNSYPIT 22B6D2-hIgG1 Chothia/Kabat/IMGT CDR L3
SEQ ID NO:7 SYGMH 22B6D2-hIgG1 Kabat CDR H1
SEQ ID NO:8 VIWYDGSNKYYADSVKG 22B6D2-hIgG1 Kabat CDR H2
SEQ ID NO:9 YYYDSNGYYDAFDI 22B6D2-hIgG1 Kabat CDR H3
SEQ ID NO:10 GFTFRSYG 22B6D2-hIgG1 IMGT CDR H1
SEQ ID NO:11 IWYDGSNK 22B6D2-hIgG1 IMGT CDR H2
SEQ ID NO:12 ARYYYDSNGYYDAFDI 22B6D2-hIgG1 IMGT CDR H3
SEQ ID NO:13 QGISNY 22B6D2-hIgG1 IMGT CDR L1
SEQ ID NO:14 AAS 22B6D2-hIgG1 IMGT CDR L2
SEQ ID NO:15 EVHLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDISKNTLYLQMNSLTAEDTAVYYCARYYYDSNGYYDAFDIWGQGTMVTVSS 22B6D2-hIgG1 VH
SEQ ID NO:16 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIFAASTLQSGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLEPEDFATYYCQQLNSYPITFGQGTRLEIK 22B6D2-hIgG1 VL
SEQ ID NO:17 EVHLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDISKNTLYLQMNSLTAEDTAVYYCARYYYDSNGYYDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 22B6D2-hIgG1 heavy chain
SEQ ID NO:18 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIFAASTLQSGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLEPEDFATYYCQQLNSYPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 22B6D2-hIgG1 light chain
SEQ ID NO:19 GDSVSSSQS 47A3E3-hIgG1 Chothia CDR H1
SEQ ID NO:20 FYRSRWY 47A3E3-hIgG1 Chothia CDR H2
SEQ ID NO:21 DTYYYGSGGFDY 47A3E3-hIgG1 Chothia/Kabat CDR H3
SEQ ID NO:22 RASQSLSRWLA 47A3E3-hIgG1 Chothia/Kabat CDR L1
SEQ ID NO:23 KASSLES 47A3E3-hIgG1/100H7D3-hIgG1 Chothia/Kabat CDR L2
SEQ ID NO:24 QQYKNYYS 47A3E3-hIgG1 Chothia/Kabat/IMGT CDR L3
SEQ ID NO:25 SSQSTWN 47A3E3-hIgG1 Kabat CDR H1
SEQ ID NO:26 RTFYRSRWYNDYALSMKS 47A3E3-hIgG1 Kabat CDR H2
SEQ ID NO:27 GDSVSSSQST 47A3E3-hIgG1 IMGT CDR H1
SEQ ID NO:28 TFYRSRWYN 47A3E3-hIgG1 IMGT CDR H2
SEQ ID NO:29 ARDTYYYGSGGFDY 47A3E3-hIgG1 IMGT CDR H3
SEQ ID NO:30 QSLSRW 47A3E3-hIgG1 IMGT CDR L1
SEQ ID NO:31 KAS 47A3E3-hIgG1/100H7D3-hIgG1 IMGT CDR L2
SEQ ID NO:32 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSSQSTWNWIRQSPSRGLEWLGRTFYRSRWYNDYALSMKSRITINPDTSKNQFSLQLNPVTPEDTAVYYCARDTYYYGSGGFDYWGQGSRVTVSS 47A3E3-hIgG1 VH
SEQ ID NO:33 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSLSRWLAWYQQKPEKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISTLQPDDFATYYCQQYKNYYSFGQGTKLEIK 47A3E3-hIgG1 VL
SEQ ID NO:34 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSSQSTWNWIRQSPSRGLEWLGRTFYRSRWYNDYALSMKSRITINPDTSKNQFSLQLNPVTPEDTAVYYCARDTYYYGSGGFDYWGQGSRVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 47A3E3-hIgG1 heavy chain
SEQ ID NO:35 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSLSRWLAWYQQKPEKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISTLQPDDFATYYCQQYKNYYSFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 47A3E3-hIgG1 light chain
SEQ ID NO:36 GFTFSRN 100H7D3-hIgG1 Chothia CDR H1
SEQ ID NO:37 WHDGSN 100H7D3-hIgG1 Chothia CDR H2
SEQ ID NO:38 DRGASDF 100H7D3-hIgG1 Chothia/Kabat CDR H3
SEQ ID NO:39 RNAMH 100H7D3-hIgG1 Kabat CDR H1
SEQ ID NO:40 VIWHDGSNKYYGDSVKG 100H7D3-hIgG1 Kabat CDR H2
SEQ ID NO:41 GFTFSRNA 100H7D3-hIgG1 IMGT CDR H1
SEQ ID NO:42 IWHDGSNK 100H7D3-hIgG1 IMGT CDR H2
SEQ ID NO:43 ARDRGASDF 100H7D3-hIgG1 IMGT CDR H3
SEQ ID NO:44 QSINNW 100H7D3-hIgG1 IMGT CDR L1
SEQ ID NO:45 RASQSINNWLA 100H7D3-hIgG1 Chothia/Kabat CDR L1
SEQ ID NO:46 EVQLVESGGGVVLPGRSLRLSCAASGFTFSRNAMHWVRQAPGKGLEWVAVIWHDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLTAEDTAVYYCARDRGASDFRGQGTLVTVSS 100H7D3-hIgG1 VH
SEQ ID NO:47 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSINNWLAWYQQKPEKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSLTFGGGTKVEIK 100H7D3-hIgG1 VL
SEQ ID NO:48 EVQLVESGGGVVLPGRSLRLSCAASGFTFSRNAMHWVRQAPGKGLEWVAVIWHDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLTAEDTAVYYCARDRGASDFRGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 100H7D3-hIgG1 heavy chain
SEQ ID NO:49 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSINNWLAWYQQKPEKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 100H7D3-hIgG1 light chain
SEQ ID NO:50 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK human IgG1 heavy chain constant region
SEQ ID NO:51 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC human IgG1 light chain constant region
SEQ ID NO:52 QQYNSYSLT 100H7D3-hIgG1 Chothia/Kabat/IMGT CDR L3
本文中所使用的縮寫具有以下含義：
縮寫 含義 縮寫 含義
HATU N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮雜苯並***-1-基)六氟磷酸脲 NBS N-溴代丁二醯亞胺
EDCI 1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 HOBt 1-羥基苯並***
DMTMM 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽 DIPEA 二異丙基乙基胺
DMAP 4-二甲胺基吡啶 Triphosgene 三光氣
Et 3N 三乙胺 Et 2NH 二乙胺
TFA 三氟乙酸 TCEP （三(2-羧乙基)膦
Pd/C 鈀碳 EDTA 乙二胺四乙酸
Na 2HPO 4 磷酸氫二鈉 PB 磷酸鹽緩衝液
DCM 二氯甲烷 THF 四氫呋喃
IPA 異丙醇 DMSO 二甲亞碸
MeOH 甲醇 DMF N,N-二甲基甲醯胺
HPLC 高效液相層析 LC-MS 液質聯用層析
以下的實施例中記載的化合物的結構通過核磁共振( 1H NMR)或質譜(MS)來確定。
核磁共振( 1H NMR)的測定使用Bruker 400 MHz核磁共振儀；氘代試劑為六氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)；內標物質為四甲基矽烷(TMS)。
實施例中使用的核磁共振(NMR)圖譜中的縮寫示於以下。 s：單峰(singlet)、d：二重峰(doublet)、t：三重峰(triplet)、q：四重峰(quartet)、m：多重峰(multiplet)、br：寬峰(broad)、J：偶合常數、Hz：赫茲、DMSO-d6：氘化二甲基亞碸。δ值用ppm值表示。
質譜(MS)的測定使用Agilent (ESI)質譜儀，型號為Agilent 6120B。
實施例一 N-((S)-10-苄基-1-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1-H-吡咯-1-基)己醯胺（A-01） 將化合物A-01-1（0.40 g，640.59 μmol，其合成參考專利申請CN 111936169A）、依喜替康甲磺酸鹽（0.37 g，704.65 μmol）溶於DMF（8 mL）中，加入HATU（0.32 g，832.77 μmol）和DIPEA（0.25 g，1.92 mmol），25℃反應4小時。減壓除去DIPEA並加水冷凍乾燥以除去大部分DMF得到粗品，粗品用製備高效液相層析純化（條件如下）得標題化合物273 mg。 層析柱：Waters XBridge Prep C18 OBD 45 mm×450 mm×8.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%三氟乙酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0.00 30 70 70
5.00 30 70 70
60.00 70 30 70
結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):1034.4[M+H] +.
實施例二 N-((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺和N-((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺（1-8-A和1-8-B） 步驟一：1-氯-3-溴-2-甲基-5-硝基苯的合成（1-8-2） 25℃下，將化合物1-8-1（5.00 g，29.14 mmol）溶於正庚烷（25 mL）中，加入濃硫酸（25 mL），加熱至50℃，50℃下分批次加入NBS（6.22 g，34.97 mmol），保持50℃反應2小時，用薄層層析檢測反應（乙酸乙酯:石油醚=1:10）。將反應液冷卻至室溫，而後滴加入冰水中，甲苯萃取，有機相合併，分別經亞硫酸鈉溶液，水，和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，粗品用製備高效液相層析純化（條件如下），製備液冷凍乾燥得標題化合物4.88 g。 層析柱：C18 ODS 45 mm×450 mm×8.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B[%] 流速[mL/min]
0 60 40 60
10 60 40 60
40 100 0 60
步驟二：3-氯-5-溴-4-甲基苯胺的合成（1-8-3） 25℃下，將化合物1-8-2（4.88 g，19.48 mmol）溶於乙酸乙酯（100 mL）中，加入鉑碳（2.00 g，19.48 mmol，含量5%），氫氣置換後在氫氣保護下60℃反應4 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。反應液經過濾、濃縮，得標題化合物粗品3.68 g，未經進一步純化直接用於下一步反應。 步驟三: N-(3-氯-5-溴-4-甲基苯基)乙醯胺的合成（1-8-4） 20℃下，將化合物1-8-3（3.63 g，14.82 mmol）溶於乙酸乙酯（70 mL），加入三乙胺（4.50 g，44.45 mmol）和醋酸酐（2.27 g，22.23 mmol），保持20℃反應20 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。向反應液加入水，乙酸乙酯萃取，合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得粗品，粗品經乙酸乙酯:石油醚=1:5混合溶劑打漿得到標題化合物2.86 g。 步驟四：(Z) -4-(5-乙醯胺基-3-氯-2-甲基苯基)丁-3-烯酸的合成（1-8-5） 20℃下，將化合物1-8-4（1.80 g，6.86 mmol）溶於THF（20 mL）和水（5 mL）中，加入乙烯基乙酸（708.31 mg，8.23 mmol），DIPEA（1.95 g，15.08 mmol），三(鄰甲基苯基)磷（62.60 mg，0.20 mmol），反應體系經氮氣置換後加熱至70℃反應5 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。向反應液中加入1 N氫氧化鈉溶液調pH=8，加入乙酸乙酯萃取，水相經1 N鹽酸調pH=3，乙酸乙酯萃取，合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，得標題化合物0.82 g，直接用於下一步反應。 步驟五：4-(5-乙醯胺基-3-氯-2-甲基苯基)丁酸的合成（1-8-6） 20℃下，將化合物1-8-5（2.60 g，9.71 mmol）溶於THF（50 mL）中，加入Pd/C （0.52 g，含量10%），體系經氫氣置換後在氫氣球保護下40℃反應2 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。將反應液過濾，濾液濃縮，得標題化合物 2.43 g，未經進一步純化直接用於下一步反應。 步驟六：N-(3-氯-4-甲基-8-氧代-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺的合成（1-8-7） 將化合物1-8-6（2.43 g，9.01 mmol）溶於三氟乙酸（10 mL）中，降溫至5℃，滴加入三氟乙酸酐（3.78 g，18.02 mmol，2.50 mL），保持5℃反應4 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。將反應液加入水中，用10 N氫氧化鈉溶於調pH=9，加入乙酸乙酯萃取，合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，經矽膠柱純化（乙酸乙酯:石油醚=0~20%）得標題化合物1.53 g。 步驟七: (Z)-N-(3-氯-7-(羥基亞胺基)-4-甲基-8-氧代-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺的合成（1-8-8） 5℃下，將叔丁醇鉀（1.50 g，13.37 mmol）溶於THF（16 mL）和叔丁醇（4 mL）中，滴加入化合物1-8-7（1.53 g，6.08 mmol）的THF溶液（16 mL），10分鐘後滴加入亞硝酸戊酯（1.14 g，9.73 mmol），保持5℃反應1 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。用1 N鹽酸將反應液調pH=5，乙酸乙酯萃取，合併有機相經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，粗品經甲基叔丁基醚打漿得標題化合物1.20 g。 步驟八: N-(7-胺基-3-氯-4-甲基-8-氧代-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺的合成（1-8-9） 20℃下，將化合物1-8-8（0.50 g，1.78 mmol）溶於甲醇（8 mL）和2 N鹽酸（8 mL）中，加入Pd/C（0.15 g，含量10%），體系經氫氣置換後在氫氣球保護下保持5℃反應2 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。反應液經過濾、濃縮，得標題化合物的鹽酸鹽0.52 g，未經進一步純化直接用於下一步反應。 步驟九: N,N’-(3-氯-4-甲基-8-氧代-5,6,7,8-四氫萘-1,7-二基)二乙醯胺的合成（1-8-10） 20℃下，將化合物1-8-9（0.52 g，1.70 mmol）溶於吡啶（5 mL）中，加入醋酸酐（2 mL），保持20℃反應2 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。將反應液加入水中，乙酸乙酯萃取，有機相經水洗，合併，經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，經矽膠柱純化（乙酸乙酯:石油醚=0~30%）得標題化合物0.22 g。 步驟十：N-(8-胺基-6-氯-5-甲基-1-氧代-1,2,3,4-四氫萘-2-基)乙醯胺的合成（1-8-11） 20℃下，將化合物1-8-10（450.97 mg，1.46 mmol）溶於甲醇（16 mL）中，加入2 N鹽酸（16 mL），加熱至60℃反應2 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。向冷卻後的反應液中加入飽和碳酸氫鈉溶液調pH=8，乙酸乙酯萃取，合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，得標題化合物230.00 mg，未經進一步純化直接用於下一步反應。 步驟十一：N-((9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺的合成（1-8-12） 將化合物1-8-11（230.00 mg，0.78 mmol）溶於甲苯（10 mL）中，加入(S) -4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃並[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4H)-三酮（230.00 mg，0.87 mmol），對甲基苯磺酸（26.73 mg，0.16 mmol），加熱至140℃反應5 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。將反應液濃縮，粗品經矽膠柱純化（甲醇:二氯甲烷=0~10%）得標題化合物150.00 mg。 步驟十二: (9S)-1-胺基-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯並吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-10,13-二酮的合成（1-2） 將化合物1-8-12（40.00 mg，0.081 mmol）加入濃鹽酸（1 mL）中，加熱至100℃反應5 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。反應液過濾，濾液用製備高效液相層析純化（條件如下），製備液冷凍乾燥得標題化合物1-2的鹽酸鹽。1-2的鹽酸鹽在下述純化條件下分離得到兩個異構體，依據保留時間命名為1-2-A（三氟乙酸鹽5.00 mg，保留時間9.85 min）和1-2-B（三氟乙酸鹽7.00 mg，保留時間10.62 min）。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%三氟乙酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B[%] 流速[mL/min]
0 5 95 28
2 5 95 28
18 50 50 28
結構表徵資料如下： 1-2-A： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.42 (s, 3H), 8.27 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 5.78-5.63 (m, 1H), 5.50-5.36 (m, 3H), 5.10-5.06 (m, 1H), 3.20-3.04 (m, 2H), 2.56 (s, 3H), 2.26-2.13 (m, 2H), 1.93-1.79 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H). ESI-MS (m/z):452.1[M+H] +. 1-2-B： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.42 (s, 3H), 8.27 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.58 (s, 1H), 5.78-5.63 (m, 1H), 5.50-5.36 (m, 3H), 5.10-5.06 (m, 1H), 3.20-3.04 (m, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.26-2.13 (m, 2H), 1.93-1.79 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H). ESI-MS (m/z):452.0[M+H] +. 步驟十三: 2-((叔丁基二苯基矽基)氧基)-N-((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺和2-((叔丁基二苯基矽基)氧基)-N-((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺的合成（1-8-13-A和1-8-13-B） 25℃下，將化合物1-2的鹽酸鹽（40.00 mg，81.91 μmol）溶於N,N-二甲基甲醯胺（1 mL）中，依次加入2-((叔丁基二苯基矽基)氧基)乙酸（30.91 mg，98.29 μmol），HATU（62.25 mg，163.81 μmol）和N,N-二異丙基乙胺（42.34 mg，327.63 μmol），保持25℃反應0.5小時，用高效液相質譜聯用層析監測反應。反應完成後向反應液中加入水，用二氯甲烷/甲醇（v/v=10/1）萃取，有機相合併，經無水硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，粗品經製備薄層層析純化（二氯甲烷:甲醇=20:1）分離得到兩個異構體，依據Rf值將兩個異構體命名為1-8-13-A（15.00 mg，Rf值為0.3）和1-8-13-B（12.00 mg，Rf值為0.35）。 步驟十四: N-((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺和N-((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺的合成（1-8-A和1-8-B） 25℃下，在兩個反應瓶中分別將1-8-13-A（15.00 mg）和1-8-13-B （12.00 mg）溶於四氫呋喃（1 mL）中，滴加入四丁基氟化銨（1M四氫呋喃溶液）/冰醋酸混合液（v/v=13/1）（50 μL），保持25℃反應0.5小時，用高效液相質譜聯用層析監測反應。反應完成後將反應液分別用製備高效液相層析純化，製備液分別凍乾對應得到標題化合物1-8-A（6.94 mg）和1-8-B（4.00 mg）。 層析柱:SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A:乙腈；流動相B:水（0.05%甲酸） 時間[min]     流動相A [%]   流動相B [%]   流速[mL/min]
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 20 80 28
3 20 80 28
18 90 10 28
1-8-A結構表徵資料如下: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.43 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.65−5.36 (m, 4H), 5.21 (q, J = 19.0 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.26−3.11 (m, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.30−2.08 (m, 2H), 1.94−1.79 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ESI-MS (m/z): 510.1[M+H] +. 1-8-B結構表徵資料如下: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.45 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.64−5.35 (m, 4H), 5.19 (q, J = 19.0 Hz, 2H), 3.97 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.27−3.10 (m, 2H), 2.51 (s, 3H), 2.27−2.10 (m, 2H), 1.93−1.80 (m, 2H), 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ESI-MS (m/z):510.1[M+H] +.
實施例三 N-((10S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4';6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺和N-((10S)-10-苄基-1-(((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4';6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺（A-07-A和A-07-B） 步驟一：(S)-10-苄基-23-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷-22-炔羧酸的合成（A-07-3） 25℃下，將化合物A-07-2（30.00 mg，0.07 mmol）溶於DMF（0.2 mL）中，加入2,5-二氧吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸酯（A-07-1，28.00 mg，0.08 mmol），30℃反應1 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。反應液直接用製備高效液相層析純化（條件如下），製備液冷凍乾燥得標題化合物20.00 mg。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):691.0[M+H 2O] +. 步驟二：N-((10S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4';6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺和N-((10S)-10-苄基-1-(((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4';6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺的合成（A-07-A和A-07-B） 25℃下，將1-2的鹽酸鹽（30.00 mg，61.43 μmol）溶於N,N-二甲基甲醯胺（1 mL）中，依次加入A-07-3（49.66 mg，73.72 μmol）、HATU （35.01 mg，92.14 μmol）和N,N-二異丙基乙胺（23.82 mg，184.29 μmol），保持25℃反應0.5小時，用高效液相質譜聯用層析監測反應。反應完成後將反應液用製備高效液相層析純化（條件如下），製備液冷凍乾燥得標題化合物A-07。A-07在下述純化條件下分離得到兩個異構體，依據保留時間命名為A-07-A （11.04 mg，保留時間7.5 min）和A-07-B （19.42 mg，保留時間8.0 min）。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水（0.05%甲酸）
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 30 70 28
3 30 70 28
18 90 10 28
結構表徵資料如下： A-07-A： ESI-MS (m/z):1107.3[M+H] +. A-07-B： ESI-MS (m/z):1107.3[M+H] +.
實施例四 (S)-7-乙基-7-羥基-14-(2-(異丙胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮（2-2） 步驟一：3-(異丙胺基)-1-(6-硝基苯並[d][1,3]二惡英-5-基)丙-1-酮的合成（2-2-2） 0℃下將化合物2-2-1（1.90 g，8.08 mmol）慢慢加入硝酸（8 mL）中，緩慢升至25℃反應1小時。反應液直接經反相柱層析（乙腈/0.5%甲酸水溶液）純化，得標題化合物的甲酸鹽1.50 g。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):281.1 [M+H] +. 步驟二：1-(6-胺基苯並[d][1,3]二惡英-5-基)-3-(異丙胺基)丙-1-酮的合成（2-2-3） 將化合物2-2-2的甲酸鹽（1.25 g，4.46 mmol）加入四氫呋喃（20 mL）中，加入10%鈀碳（125.00 mg），氫氣置換三次後25℃反應16小時。反應液經矽藻土過濾，濾液減壓濃縮乾，得標題化合物粗品895.00 mg，未經純化直接用於下一步反應。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):251.1 [M+H] +. 步驟三：((S)-7-乙基-7-羥基-14-(2-(異丙胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮的合成（2-2） 將化合物2-2-3（23.00 mg，0.09 mmol）和(4S)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃並[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4H)-三酮（21.00 mg，0.09 mmol）用甲苯（4 mL）溶解，加入對甲苯磺酸（1.40 mg，0.009 mmol），140℃反應12小時。減壓抽乾溶劑，得標題化合物的粗品，粗品經HPLC（流動相A：乙腈，流動相B：0.05%的甲酸水溶液）純化，製備液中加入3 M鹽酸3滴後冷凍乾燥，得標題化合物的鹽酸鹽8.70 mg。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z)：478.2 [M+H] +. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.38 (brs, 2H), 7.85 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.30 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 3.57 – 3.45 (m, 2H), 3.40 – 3.25 (m, 1H), 3.22 – 3.06 (m, 2H), 1.95 – 1.77 (m, 2H), 1.27 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 0.87 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
實施例五 4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五烷醯胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(N-異丙基-N-甲基磺醯胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的合成（B-01） 步驟一：(S)-4-乙基-11-(2-(N-異丙基-N-甲磺醯胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-4-基(4-((S)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)胺基)丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧基-3,9-二氮雜三十五烷醯胺基)苄基)碳酸酯的合成（B-01-2） 室溫下，將化合物B-01-1（413.40 mg，0.251 mmol，其合成參考專利CN111295389B） 溶於二甲基亞碸和水（2.0 mL：0.5 mL）中，加入溴化亞銅（72.95 mg，0.503 mmol）和6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)-己-5-炔醯胺(95.10 mg，0.302 mmol)， 攪拌反應1 h後過濾，濾液經製備高效液相層析純化（條件如下），得標題化合物30.00 mg。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0.00 40 60 28
8.00 40 60 28
50.00 90 10 28
結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z): 815.9[(M-273)/2+H] +. 步驟二：4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五烷醯胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(N-異丙基-N-甲基磺醯胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的合成（B-01） 將化合物B-01-2（30.00 mg，0.02 mmol）溶於二氯甲烷（1.0 mL）反應液中加入三氟乙酸（0.2 mL），室溫反應30 min。反應液減壓濃縮後經製備高效液相層析純化（條件如下），得標題化合物的三氟乙酸鹽20.00 mg。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%三氟乙酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0.00 15 85 28
8.00 15 85 28
50.00 60 40 28
結構表徵資料如下：ESI-MS (m/z): 816.0[M/2+H] +. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.18 (s, 1H), 9.10 (s, 2H), 8.38 (t, J = 5.56 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 8.40 Hz, 1H),  8.22 – 8.20 (m, 2H), 8.09 (t, J = 5.68 Hz, 1H), 7.91 – 7.87 (m, 2H), 7.82 – 7.78 (m, 1H)，7.69 (brs, 3H), 7.61 (d, J = 8.56 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.56 Hz, 2H), 7.06 (s, 1H), 5.56 (d, J = 16.96 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 16.96 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 19.28 Hz, 1H), 5.42 (d, J = 19.28 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 12.20 Hz, 1H), 5.07 (d, J = 12.16 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.24 Hz, 2H), 4.46 – 4.43 (m, 1H), 4.29 (d, J = 5.60 Hz, 2H), 4.08 – 3.95 (m, 5H), 3.79 (t, J = 5.28 Hz, 2H), 3.51 – 3.43 (m, 32H), 3.40 (s, 3H), 3.39 – 3.35 (m, 2H), 3.30 – 3.26 (m, 2H), 3.00 (s, 3H), 2.82 – 2.74 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.08 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.36 Hz, 2H), 2.23 – 2.13 (m, 2H), 1.82 (p, J = 7.24 Hz, 2H), 1.78 – 1.63 (m, 2H), 1.61 – 1.49 (m, 2H), 1.42 – 1.27 (m, 2H), 1.15 (d, J = 6.80 Hz, 3H) , 1.13 (d, J = 6.76 Hz, 3H) , 0.90 (t, J = 7.32 Hz, 3H).
實施例六 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧-8,10,11,13-四氫-7H-[1,3]二氧戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(異丙基)胺甲醯基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(2-(2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)乙氧基)乙氧基)乙醯胺基))苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-羧酸（B-03） 步驟一：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(羥甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成（B-03-3） 將化合物(2R,3R,4S,5S,6S)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸三酯（B-03-1，12.32 g，31.02 mmol）和4-羥基-3-硝基苄醇（化合物B-03-2，5.00 g，29.56 mmol）溶於乙腈（200 mL）中，攪拌下加入氧化銀（27.40 g，118.25 mmol），氮氣置換後避光室溫反應12小時。用高效液相質譜聯用層析監測反應；反應液經矽藻土抽濾，濾液減壓濃縮後經矽膠柱層析純化（石油醚:乙酸乙酯=1:3），得標題化合物12.80 g。 結構表徵資料如下： ESI-MS ( m/z):503[M+18] +. 步驟二：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-胺基-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成（B-03-4） 將化合物B-03-3（2.20 g，4.53 mmol）溶於乙酸乙酯和四氫呋喃（各50 mL）中，加入PtO 2（0.20 g），然後用氫氣球置換反應體系三次，並在氫氣氛圍下反應2小時。用高效液相質譜聯用層析監測反應；反應液直接過濾，用乙酸乙酯淋洗濾餅，濾液減壓蒸乾得標題化合物粗品2.02 g，直接用於下一步反應。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):456.1[M+1] +. 步驟三：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(2-(2-(2-(2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基)胺基)乙氧基)乙氧基)乙醯胺基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成（B-03-5） 將化合物B-03-4（456.00 mg，1.00 mmol）和[2-[2-(Fmoc-胺基)乙氧基]乙氧基]乙酸（385.91 mg，1.00 mmol）溶於二氯甲烷（10 mL），攪拌下加入2-乙氧基-1-乙氧碳醯基-1,2-二氫喹啉（495.22 mg，2.00 mmol），攪拌反應2小時。用高效液相質譜聯用層析監測反應；反應液經減壓濃縮後經矽膠柱層析純化（甲醇:二氯甲烷=1:20），得標題化合物507.00 mg。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):823.3[M+1] +. 步驟四：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(2-(2-(2-(2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基)胺基)乙氧基)乙氧基)乙醯胺基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成（B-03-6） 將化合物B-03-5（507.00 mg，616.18 μmol）和二異丙基乙胺（238.91 mg，1.85 mmol）溶於二氯甲烷（20 mL）中，然後將對硝基苯基氯甲酸酯（372.60 mg，1.85 mmol）溶於二氯甲烷（1 mL）中，並緩慢滴入反應液中，加畢，室溫反應15 h。用高效液相質譜聯用層析監測反應；反應液經減壓濃縮後經矽膠柱層析純化（甲醇:二氯甲烷=1:20），得標題化合物496.00 mg。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):988.5[M+1] +. 步驟五：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(2-(2-(2-(2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基)胺基)乙氧基)乙氧基)乙醯胺基)-4-((((2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧基-8,10,11,13-四氫-7H-[1,3]二氧戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(異丙基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成（B-03-7） 將化合物B-03-6（165.51 mg，0.17 mmol）、化合物2-2（40.00 mg，0.084mmol）和1-羥基苯並***（33.96 mg，0.25 mmol）溶於DMF（4 mL），滴入二異丙基乙胺（32.48 mg，0.25 mmol），攪拌反應12 h，用高效液相質譜聯用層析監測反應。加入水和乙酸乙酯攪拌，靜止分液，有機相用飽和食鹽水洗滌後乾燥，經減壓濃縮，得標題化合物粗品100.00 mg，直接進行下一步反應。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):1326.2[M+1] +. 步驟六：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(2-(2-(胺基乙氧基)乙氧基)乙醯胺基)-4-((((2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧基-8,10,11,13-四氫-7H-[1,3]二氧戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基) (異丙基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-羧酸的合成（B-03-8） 將化合物B-03-7（100.00 mg，0.08 mmol）溶於MeOH（5 mL），滴入1滴二氯甲烷，滴入氫氧化鋰一水合物（15.82 mg，0.377 mmol）的水溶液（1 mL），攪拌反應2小時。用高效液相質譜聯用層析監測反應；滴入3 N鹽酸水溶液調節反應液pH=4，減壓濃縮後用製備高效液相層析純化（條件如下），製備液冷凍乾燥得標題化合物27.00 mg。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0.00 20 80 28
2.00 20 80 28
18.00 80 20 28
結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):964.2[M+1] +. 步驟七：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧-8,10,11,13-四氫-7H-[1,3]二氧戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(異丙基)胺甲醯基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(2-(2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)乙氧基)乙氧基)乙醯胺基))苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-羧酸的合成（B-03） 將化合物B-03-8（27.00 mg，0.03 mmol）和2,5-二氧吡咯烷-1-基 6-(2-(甲磺酸磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸酯（A-07-1），11.26 mg，0.03 mmol）溶於DMF（1mL），攪拌下滴入二異丙基乙胺（3.62 mg，0.03 mmol），室溫反應4小時，用高效液相質譜聯用層析監測反應。反應液用製備高效液相層析純化（條件如下），製備液冷凍乾燥得標題化合物11.70 mg。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0.00 20 80 28
2.00 20 80 28
18.00 80 20 28
結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):1214.4[M+1] +.
實施例七  N-((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺和 N-((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺（1-11-A和1-11-B） 步驟一：3-溴-4-氯-5-氟苯胺的合成（1-5-02） 將化合物1-5-01 (2.00 g，10.53 mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(30 mL)中，然後緩慢加入N-氯代丁二醯亞胺 (1.69 g，12.63 mmol)，加畢，室溫反應16小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液經減壓濃縮得粗品，粗品經快矽膠柱純化(乙酸乙酯:石油醚=0-25%)得標題化合物0.95 g。 結構表徵資料如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.77 (dd, J = 2.5, 1.4 Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 11.7, 2.5 Hz, 1H), 5.84 (s, 2H). 步驟二：N-(3-溴-4-氯-5-氟苯基)乙醯胺的合成（1-5-03） 將化合物1-5-02 (0.95 g，4.23 mmol)溶於乙酸乙酯(20 mL)中，氮氣保護下加入乙酸酐(648.13 mg，6.35 mmol)，加畢，升溫至50°C反應15小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液用甲醇 (5 mL)淬滅後，直接經減壓蒸乾得粗品，粗品經快速矽膠柱純化(乙酸乙酯:石油醚=0-40%)得標題化合物1.01 g。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):265.9[M+H] +. 步驟三：(E)-4-(5-乙醯胺基-2-氯-3-氟苯基)-3-丁烯酸的合成（1-5-04） 將化合物1-5-03和3-丁烯酸(387.65 mg，4.50 mmol)溶於1,4二氧六環(24 mL)和水( 8 mL)的混合溶劑中，然後加入N,N-二異丙基乙胺 (1.45 g，11.26 mmol)，三(鄰甲基苯基)磷(114.21 mg，375.24 μmol)和醋酸鈀 (42.12 mg，187.62 μmol)，加畢，反應體系用氮氣置換三次，並在氮氣氛圍下升溫至100°C反應16小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液冷卻至室溫後，加入1 N的氫氧化鈉水溶液(60 mL)和乙酸乙酯(50 mL)振盪分層。分出下層水相後，用4 mol/L鹽酸水溶液調節pH至3左右，然後用乙酸乙酯萃取，合併有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液經減壓蒸乾，得到標題化合物的粗品1.00 g。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):272.0[M+H] +. 步驟四：4-(5-乙醯胺基-2-氯-3-氟苯基)丁酸的合成（1-5-05） 將化合物1-5-04的粗品 (1.00 g，3.68 mmol)溶於四氫呋喃(15 mL)，然後加入10%鈀碳(0.10 g)，加畢，然後用氫氣球置換反應體系三次，並在氫氣氛圍下反應4小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。將反應液過濾，濾液減壓濃縮乾，得標題化合物的粗品1.00 g。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):274.0[M+H] +. 步驟五：N-(4-氯-3-氟-8-氧代-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺的合成（1-5-06） 將化合物1-5-05的粗品 (1.00 g，3.65 mmol)溶於三氟乙酸(5 mL)中，降溫至5°C後，緩慢加入三氟乙酸酐(3.84 g，18.27 mmol，2.54 mL)，加畢，保持5°C反應2小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液緩慢倒入水中，然後用乙酸乙酯萃取，合併有機相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥有機相，然後過濾，濾液經減壓蒸乾得粗品，粗品經快速矽膠柱純化，得標題化合物0.43 g。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):256.1[M+H] +. 步驟六：N-(4-氯-3-氟-7-(羥基亞胺基)-8-氧代-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺的合成（1-5-07） 將四氫呋喃(16 mL)和叔丁醇(4 mL)加入反應瓶中，冰浴降溫至5°C後，加入叔丁醇鉀(415.18 mg，3.70 mmol)，然後將化合物1-5-06(0.43 mg，1.68 mmol)溶於四氫呋喃(1 mL)中，並緩慢滴加入反應液，10分鐘後再加入亞硝酸異戊酯(315.24 mg，2.69 mmol)，加畢，保持5 °C反應1小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液用飽和氯化銨水溶液淬滅後，用乙酸乙酯萃取，合併有機相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥有機相，然後過濾，濾液經減壓濃縮，得標題化合物的粗品455.00 mg。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):285.0[M+H] +. 步驟七：N-(7-胺基-4-氯-3-氟-8-氧代-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺的合成（1-5-08） 將化合物1-5-07的粗品(0.40 g，1.41 mmol)溶於甲醇(10 mL)中，然後加入3 mol/L的鹽酸水溶液(1 mL)和10%鈀碳(40.00 mg)，加畢，用氫氣置換反應體系三次，並在氫氣氛圍下室溫反應1小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。將反應液過濾，濾液經減壓濃縮乾，得標題化合物的鹽酸鹽粗品0.43 g。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):271.0[M+H] +. 步驟八：(9H-芴-9-基甲基) (8-乙醯胺-5-氯-6-氟-1-氧代-1,2,3,4-四氫萘-2-基)胺基甲酸酯的合成（1-5-09） 將化合物1-5-08的鹽酸鹽粗品(0.43 g，1.19 mmol)溶於1,4-二氧六環(15 mL)中，然後加入碳酸氫鈉(400.35 mg，4.77 mmol)、水(5 mL)和9-芴甲基-N-琥珀醯亞胺基碳酸酯(481.81 mg，1.43 mmol)，加畢，室溫下攪拌反應2小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。將反應液倒入水中，然後用乙酸乙酯萃取，合併有機相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾，濾液經減壓濃縮得粗品。粗品經C18反相柱純化(乙腈：0.05%甲酸水=20%-100%)，得標題化合物301.00 mg。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):493.2[M+H] +. 步驟九：(9H-芴-9-基甲基) (8-胺基-5-氯-6-氟-1-氧代-1,2,3,4-四氫萘-2-基)胺基甲酸酯的合成（1-5-10） 將化合物1-5-09 (300.00 mg，608.61 μmol)溶於二氧六環(5 mL)中，加入12 mol/L的濃鹽酸(1 mL)，加畢，升溫至60 °C反應2小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。將反應液倒入水中，然後用乙酸乙酯萃取，合併有機相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾，濾液經減壓濃縮得粗品。粗品經快速矽膠柱純化(乙酸乙酯:石油醚=0-50%)，得標題化合物198.00 mg。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):451.1[M+H] +. 步驟十：(9H-芴-9-基甲基) ((9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸酯的合成（1-5-11） 將(S)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃並[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4H)-三酮(138.72 mg，526.96 μmol)和化合物1-5-10(198.00 mg，439.13 μmol)加入甲苯(10 mL)中，然後再加入對甲苯磺酸(75.53 mg，439.13 μmol)，加畢，升溫至140°C反應4 小時，反應液直接140°C下減壓蒸乾得粗品，粗品經快速矽膠柱純化(甲醇:二氯甲烷=0-5%)，得標題化合物256.00 mg。 結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):678.1[M+H] +. 步驟十一：(1S,9S)-1-胺基-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-10,13-二酮和(1R,9S)-1-胺基-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-10,13-二酮的合成（1-5-A和1-5-B） 將化合物1-5-11 (201.18 mg，296.67 μmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(4 mL)中，然後加入二乙胺(108.49 mg，1.48 mmol)，加畢，室溫反應0.5小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液經減壓蒸出乙二胺後，用1 mol/L鹽酸水溶液調pH至2-3後，反應液直接用製備高效液相層析純化，得標題化合物1-5-A (44.00 mg)，1-5-B(43.00 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 10 90 28
3 10 90 28
18 70 30 28
1-5-A(6 min LCMS出峰靠前，保留時間：1.276 min) 結構表徵資料如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.00 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.33 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.62 (d, J = 19.3 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.38 (d, J = 19.3 Hz, 1H), 4.43−4.38 (m, 1H), 3.28−3.10 (m, 2H), 2.22−2.12 (m, 1H), 2.12−2.02 (m, 1H), 1.93−1.80 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ESI-MS (m/z):456.1[M+H] +. 1-5-B (6 min LCMS出峰靠後，保留時間：1.300 min)結構表徵資料如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.98 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 5.61 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.32 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 4.44−4.36 (m, 1H), 3.33−3.25 (m, 1H), 3.22−3.11 (m, 1H), 2.23 - 2.13 (m, 1H), 2.11−2.03 (m, 1H), 1.96 −1.82 (m, 2H), 0.89 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ESI-MS (m/z):456.1[M+H] +. 6 min LCMS條件： 層析柱：Waters SunFire C18 OBD 4.6 mm×50 mm×5.0 μm 流動相A：0.05%乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 90 10 2
4.2 10 90 2
5.7 10 90 2
5.71 90 10 2
6.70 90 10 2
步驟十二：N-((S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺和 N-((S)-10-苄基-1-((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己基-5-醯胺的合成（1-5-12-A和1-5-12-B） 將單一構型的化合物1-5-A(36.00 mg，79.70 μmol)和化合物A-07-3(64.43 mg，95.64 μmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(2 mL)中，然後加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(46.98 mg，159.40 μmol)和三乙胺(24.19 mg，239.10 μmol)，加畢，室溫反應1小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液直接經高效液相層析純化，得到單一構型的標題化合物1-5-12-A (51.00 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 30 70 28
3 30 70 28
18 90 10 28
結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):1111.0[M+H] +. 將單一構型的化合物1-5-B(36.00 mg，79.70 μmol)和化合物A-07-3(64.43 mg，95.64 μmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(2 mL)中，然後加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(46.98 mg，159.40 μmol)和三乙胺(24.19 mg，239.10 μmol)，加畢，室溫反應1小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液直接經高效液相層析純化，得到單一構型的標題化合物1-5-12-B(52.00 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 30 70 28
3 30 70 28
18 90 10 28
結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):1111.0[M+H] +. 步驟十三：N-((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺和 N-((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺的合成（1-11-A和1-11-B） 稱取化合物1-5-12-A(40.00 mg，35.99 μmol)溶於二氯甲烷(2 mL)和甲醇(1 mL)的混合溶劑中，然後加入4 mol/L 鹽酸的乙酸乙酯溶液(1 mL)，加畢，室溫反應0.5小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液直接經減壓濃縮乾得粗品，粗品經高效液相層析純化，得單一構型的標題化合物1-11-A (4.75 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 15 85 28
3 15 85 28
18 90 10 28
結構表徵資料如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.50 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.33 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.67−5.60 (m, 1H), 5.49 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.21 (s, 2H), 3.96 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 3.32−3.22 (m, 2H), 2.28−2.15 (m, 2H), 1.93−1.80 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ESI-MS (m/z):514.0[M+H] +. 稱取化合物1-5-12-B(40.00 mg，35.99 μmol)溶於二氯甲烷(2 mL)和甲醇(1 mL)的混合溶劑中，然後加入4 mol/L 鹽酸乙酸乙酯(1 mL)，加畢，室溫反應0.5小時，用高效液相質譜聯用層析檢測反應。反應液直接經減壓濃縮乾得粗品，粗品經高效液相層析純化，得單一構型的標題化合物1-11-B (8.24 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 15 85 28
3 15 85 28
18 90 10 28
結構表徵資料如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.52 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.68−5.58 (m, 1H), 5.53 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 5.20 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.97 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.31−3.21 (m, 2H), 2.26−2.15 (m, 2H), 1.92−1.82 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ESI-MS (m/z):514.0[M+H] +.
實施例八 N-((10S,19S)-23-(6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)-10-苄基-1-(((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷-19-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-醯胺 或 N-((10S,19S)-23-(6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)-10-苄基-1-(((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷-19-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-醯胺（A-17-A） 步驟一：(2S)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-醯胺基)-6-(N-(9H-芴-9-基甲氧基羰基)胺基)己酸的合成（A-17-03） 將化合物A-17-02的鹽酸鹽 (389.68 mg，962.45 μmol) 溶於二氯甲烷 (8 mL) 中，加入DIPEA (518.28 mg，4.01 mmol，713.88 μL)和化合物A-17-01 (550.00 mg，802.04 μmol) ，25℃反應 1.5小時。用稀鹽酸調節反應液pH至中性，減壓抽乾溶劑。濃縮物用製備高效液相層析純化，得標題化合物A-17-03 (450.00 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 10 90 28
2 10 90 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 939.3[M+H] +. 步驟二：2-((2-((2S)-2-(2-(2-((2S)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-醯胺基)-6-(N-(9H-芴-9-基甲氧基羰基)胺基)己醯胺基)乙醯胺基)乙醯胺基)-3-苯基丙醯胺基)乙醯胺基)甲氧基)乙酸的合成（A-17-04） 將化合物A-17-03 (50.00 mg，118.09 μmol) 用DMF (2.5 mL) 溶解，加入HATU (49.39 mg，129.89 μmol) 、化合物A-07-2 (133.07 mg，141.70 μmol) 和DIPEA (45.78 mg，354.26 μmol，63.06 μL) ，25℃反應1小時。減壓抽乾溶劑，濃縮物用製備高效液相層析純化，得標題化合物A-17-04 (40.00 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 10 90 28
2 10 90 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 1344.4[M+H] +. 步驟三：(9H-芴-9-基甲基) ((40S)-40-(((10S)-10-苄基-1-(((9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)胺甲醯基)-38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,35-十二氧雜-39-氮雜-44-基)胺基甲酸酯的合成（A-17-05） 將化合物A-17-04 (29.86 mg，59.50 μmol) 用DMF (3 mL) 溶解，加入HATU (27.15 mg，71.40 μmol) 、化合物1-5-A (80.00 mg，59.50 μmol) 和DIPEA (38.45 mg，297.51 μmol，52.96 μL) ，25°C 反應1小時。減壓抽乾溶劑，濃縮物用製備高效液相層析純化，得標題化合物A-17-05 (50.00 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 10 90 28
2 10 90 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 1781.6[M+H] +. 步驟四：N-((10S,19S)-23-胺基-10-苄基-1-(((9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷-19-基)-2,5,8,11,14,17,20,23, 26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-醯胺的合成（A-17-06） 將化合物A-17-05 (20.00 mg，11.22 μmol) 用DMF (2.5 mL) 和二乙胺 (0.5 mL) 溶解，25℃反應2小時。減壓抽乾溶劑，濃縮物用製備高效液相層析純化，得標題化合物A-17-06的甲酸鹽 (10.00 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 15 85 28
2 15 85 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 1559.7[M+H]+. 步驟五：N-((10S,19S)-23-(6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)-10-苄基-1-(((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷-19-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-醯胺 或 N-((10S,19S)-23-(6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)-10-苄基-1-(((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4:6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷-19-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-醯胺的合成（A-17-A） 將化合物A-17-06的甲酸鹽 (7.00 mg，4.49 μmol) 和化合物A-07-1 (3.28 mg，8.97 μmol) 用DMF (1 mL) 溶解，加入DIPEA (1.74 mg，13.46 μmol，2.40 μL) ，25℃反應2小時。減壓抽乾溶劑，濃縮物用製備高效液相層析純化，得標題化合物A-17-A (5.60 mg)。 層析柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0 20 80 28
2 20 80 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 1809.8[M+H] +.
實施例九 N-((S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13, 15-六氫-1H，12H-苯並[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚利嗪[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧基-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2-(甲基磺基)嘧啶-5-基)己-5-醯胺（A-05） 氮氣保護下，將2,5-二氧吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酸酯(A-07-1, 0.66 g, 1.80 mmol)和A-07-2 (0.75 g, 1.77 mmol)加入DMF (19 mL)中，升溫至35℃反應16小時，向該體系中加入(1S, 9S)-1-胺基-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯並[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(1-4（即1-2-A）, 1.00 g, 1.77 mmol)，冰水降溫至5~15℃，加入DMTMM (0.98 g, 3.53 mmol)，再滴入DIPEA (1.14 g, 8.84 mmol)，25℃反應16小時。將反應液倒入DCM(600 mL)、IPA(60 mL)、水(100 mL)混合液中攪拌10分鐘，分出DCM相，鹽水(100ml)洗，濃縮得到粗品，用製備高效液相層析純化後冷凍乾燥得A-05（即為實施例三的A-07-A）化合物0.98 g。 A-05分離純化方法如下： 層析柱：Waters SunFire Prep C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 流動相A：乙腈；流動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0.00 30 70 24
2.00 30 70 24
18.00 80 20 24
A-05結構表徵資料如下： MS m/z (ESI): 1107.3 [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.10 (s, 2H), 8.66 - 8.63 (m, 1H), 8.51 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.34 - 8.31 (m, 1H), 8.21 - 8.19 (m, 1H), 8.17 – 8.09 (m, 2H), 8.08 - 8.04 (m, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.26 – 7.15 (m, 5H), 6.55 (s, 1H), 5.56 - 5.55 (m, 1H), 5.48 – 5.35 (m, 2H), 5.25 – 5.10 (m, 2H), 4.64 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 4.45 - 4.44 (m, 1H), 4.06 - 3.98 (m, 2H), 3.77 – 3.52 (m, 6H), 3.41 (s, 3H), 3.25 - 3.12 (m, 2H), 3.03 - 3.00 (m, 1H), 2.83 – 2.72 (m, 1H), 2.58 - 2.56 (m, 2H), 2.48 (s, 3H), 2.33 - 2.30 (m, 2H), 2.21 - 2.13 (m, 2H), 1.91 – 1.76 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H). 採用以下HPLC條件檢測實施例三製備的化合物A-07-A和A-07-B；以及實施例三製備的化合物A-07-A和實施例九製備的化合物A-05： 儀器：Agilent 1260高效液相層析 VWD檢測器 層析柱：  Waters Xbridge C18 4.6*100 mm*3.5μm 流動相A：0.01M 磷酸銨水溶液/乙腈 = 90/10；流動相B：乙腈
時間（min） 流動相A（%） 流動相B（%）
0 100 0
6 22 78
11 22 78
如附圖8A所示，化合物A-07-A以及化合物A-07-B的保留時間分別為6.6min以及6.8min，說明上述HPLC條件對異構體具有較好的分離度； 如附圖8B所示，實施例三製備的化合物A-07-A以及實施例九製備的化合物A-05在HPLC中顯示為一個峰，保留時間為6.6min，說明化合物A-07-A即為化合物A-05。
實施例十 4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己基-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺基)苄基((1S,9R)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[d]吡喃並[3',4':6,7]中氮茚並[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯（B-04） 步驟一: 2-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[d]吡喃並[3',4':6,7]中氮茚並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-氧代乙酸乙酯(B-04-1)的製備 將(1S,9S)-1-胺基-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯並[d]吡喃並[3',4':6,7]中氮茚並[1,2-b]喹啉-10,13-二酮 (2 g, 3.65 mmol) 溶於DMF (50 mL) ,滴入DIPEA (1.18 g, 9.12 mmol, 1.59 mL) ,冰浴冷卻攪拌下滴入乙醯氧基乙醯氯(548.12 mg, 4.01 mmol, 431.59 μL)，繼續攪拌反應1小時。將反應液加入0.1M稀鹽酸水溶液中析出固體，過濾。將濾餅溶於二氯甲烷和甲醇中，無水硫酸鈉乾燥後過濾濃縮得粗品，經矽膠柱純化(甲醇/二氯甲烷 = 0%~5%)再次濃縮得標題化合物（1.7g，3.077mmol） 其結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):552.2[M+1] +. 步驟二:2-(((1S,9S)-9-(((4-((S)-35-疊氮基-2-(4-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基)胺基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮雜五苯並三醯胺基)苄基)氧基)羰基)氧基-5-氯-9-乙基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲唑嗪[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-氧代乙酸乙酯(B-04-2)的製備 將2-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[d]吡喃並[3',4':6,7]中氮茚並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-氧代乙酸乙酯(500 mg, 0.905mmol)和DMAP (885.33 mg, 7.25 mmol)溶於乾燥二氯甲烷(5mL)中，氮氣保護下冷卻至0℃，滴入三光氣(268.81 mg, 0.905mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)，保溫攪拌反應0.5小時。緩慢滴入(S) -2-(32-疊氮基-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-壬氧基-6-氮雜三硝基胺基)-N-(4-(羥甲基)苯基)-6-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)胺基)己醯胺(1.44 g, 1.36 mmol)的二氯甲烷溶液，自然恢復室溫反應4小時。加水淬滅反應，用二氯甲烷萃取3次（100ml x 3）後合併有機相，飽和食鹽水洗滌後乾燥濃縮。矽膠柱純化(MeOH/DCM = 0% ~ 5%)得標題化合物（498mg，0.304mmol） 其結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):1352.8[M+1] +. 步驟三: 4-((S)-35-疊氮基-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)胺基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺基)苄基((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]氮茚並[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-04-3)的製備 將2-(((1S,9S)-9-(((4-((S)-35-疊氮基-2-(4-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基)胺基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮雜五苯並三醯胺基)苄基)氧基)羰基)氧基-5-氯-9-乙基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]吲唑嗪[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-氧代乙酸乙酯(200 mg, 0.122mmol) 溶於THF (3 mL) 和MeOH (3 mL)中，攪拌下滴入碳酸鈉(25.88 mg, 0.224mmol) 水溶液(1 mL) ，滴加完畢後繼續攪拌1小時。向反應液中滴入稀鹽酸中和反應，減壓濃縮後直接進行下一步。 其結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):1596.7[M+1] +. 步驟四: 4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-疊氮基-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮雜五苯並三醯胺基)苄基((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]中氮茚並[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-04-4)的製備 將4-((S)-35-疊氮基-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)胺基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18, 24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺基)苄基((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]氮茚並[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(190 mg, 119.04 μmol) 溶於二氯甲烷 (5 mL) ，加入三氟乙酸 (0.5 mL)後繼續反應1小時。向反應液中滴入飽和碳酸氫鈉水溶液中和後分液，將有機相濃縮得粗品。經反相柱層析(乙腈/1%甲酸水溶液=0%~50%)純化後冷凍乾燥得標題化合物（95 mg, 69.35 μmol）。 其結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):1323.6[M+1] +. 步驟五:4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己基-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺基)苄基((1S,9R)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[d]吡喃並[3',4':6,7]中氮茚並[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-04)的製備 將4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-疊氮基-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮雜五苯並三醯胺基)苄基((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4':6,7]中氮茚並[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(90 mg, 0.066mmol)和6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔醯胺(24.07 mg, 0.079mmol) 溶於DMSO(2mL) 和水(0.2mL)中，加入溴化亞銅 (9.42 mg, 0.066mmol)後繼續攪拌2小時。將反應液直接過濾，將反應液直接過濾濃縮的粗品，經製備高效液相層析純化後冷凍乾燥得標題化合物（42.2 mg，24.69 μmol）。 其結構表徵資料如下： ESI-MS (m/z):1628.7[M+1] +. 其製備高效液相層析方法如下： 層析柱:SunFire Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0μm 流動相A:乙腈；流動相B:水(0.05%甲酸)
時間[min] 流動相A [%] 流動相B [%] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
二、抗體的製備 前期通過免疫H2L2小鼠（由和鉑醫藥提供，該小鼠產生的抗體是由全人源的可變區和鼠源的恆定區組成的嵌合抗體），通過融合瘤篩選獲得人鼠嵌合抗體22B6D2（重鏈可變區，SEQ ID NO:15；輕鏈可變區，SEQ ID NO:16）、47A3E3（重鏈可變區，SEQ ID NO:32；輕鏈可變區，SEQ ID NO:33）和100H7D3（重鏈可變區，SEQ ID NO:46；輕鏈鏈可變區，SEQ ID NO:47），將上述重鏈可變區序列分別與人IgG1重鏈恆定區（SEQ ID NO:50）組合、上述輕鏈可變區序列分別與人IgG1輕鏈恆定區（SEQ ID NO:51）組合，形成3個完整的全人源抗體（見表1），並進行密碼子優化後構建到pTT5質體中，將每一個抗體重鏈和輕鏈對應的pTT5質體同時轉染到CHO-S細胞中，採用蛋白A對上清中的表現抗體進行純化，從而獲得相應抗體。 HER3對照抗體來源專利申請CN200680049887中的U1-59，進行密碼子優化後，抗體重、輕鏈核苷酸序列分別合成克隆到pTT5載體，按上述方法表現純化。 表1：22B6D2-hIgG1、47A3E3-hIgG1、100H7D3-hIgG1的序列資訊
抗體 編號系統 SEQ ID NO:
CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 VH VL CH CL HC LC
22B6D2-hIgG1 Chothia 1 2 3 4 5 6 15 16 50 51 17 18
Kabat 7 8 9 4 5 6
IMGT 10 11 12 13 14 6
47A3E3-hIgG1 Chothia 19 20 21 22 23 24 32 33 34 35
Kabat 25 26 21 22 23 24
IMGT 27 28 29 30 31 24
100H7D3-hIgG1 Chothia 36 37 38 45 23 52 46 47 48 49
Kabat 39 40 38 45 23 52
IMGT 41 42 43 44 31 52
三、包含細胞生物活性分子和連接體的化合物與抗體的偶聯 以下實施例所製備得到的抗體藥物綴合物中所涉及的抗體22B6，47A3，100H7即分別為上述第二部分中所述的22B6D2-hIgG1、47A3E3-hIgG1、100H7D3-hIgG1抗體。 樣品的偶聯製備如下： 分別取0.46ml 22B6，47A3，100H7，U1-59，hIgG1抗體（均調整濃度至11.0mg/mL），用0.1M依地酸二鈉的溶液（pH 7.7）稀釋，然後用1M Na 2HPO 4溶液調pH至7.7，加入10 mM TCEP（三(2-羧乙基)膦）溶液混勻，室溫放置90 min。向上述溶液體系加入4.0-10倍物質的量的溶解在二甲基亞碸的“藥物-連接體”化合物，混勻，室溫靜置2h，完畢後採用NAP-5凝膠柱（Cytiva）將緩衝液置換為pH 6.0的10 mM組胺酸緩衝溶液，然後添加蔗糖和吐溫20，混勻，得到抗體藥物綴合物（即ADC），見表2。 ADC藥物/抗體比值（DAR值）的測定如下： LC-MS測定ADC樣品分子量，計算藥物/抗體比DAR值 對ADC 樣品進行LC-MS分子量分析。 層析測定條件： 液相層析柱：Thermo MAbPac RP 3.0*100mm； 流動相A：0.1%FA/H 2O；流動相B：0.1%FA/ACN； 流速：0.25 ml/min；樣品室溫度：8 oC；柱溫：60 oC；進樣量：2 μl；
時間(分鐘) 2 20 22 25 26 30
流動相A (體積%) 75 60 5 5 75 75
流動相B (體積%) 25 40 95 95 25 25
質譜測定條件： 質譜型號：AB Sciex Triple TOF 5600+； GS1 35；GS2 35；CUR 30；TEM 350；ISVF 5500；DP 250；CE 10；Accumulation time 0.5 s； m/z 600-4000；Time bins to sum 40。 表2  ADC 編號以及DAR
藥物-連接體 編號 ADC編號 藥物-連接體與抗體 摩爾比 DAR
A-07-A 22B6-A-07-A-1 10：1 7.99
A-07-A 22B6-A-07-A-2 5：1 3.56
A-07-A 47A3-A-07-A 10：1 6.27
A-07-A 100H7-A-07-A 10：1 8.01
A-07-A U1-59-A-07-A 10：1 8.02
A-07-A hIgG1-A-07-A 10：1 8.03
A-01 22B6-A-01 10：1 7.93
A-01 U1-59-A-01 10：1 7.89
B-03 22B6-B-03-1 10：1 8.0
B-03 22B6-B-03-2 5：1 3.14
B-03 hIgG1-B-03-1 10：1 7.90
B-03 hIgG1-B-03-2 5：1 4.20
B-01 22B6- B-01 10：1 8.07
B-01 hIgG1-B-01 10：1 8.06
A-01 hIgG1-A-01 10：1 7.98
1. LC-MS測定ADC 22B6-A-07-A-1分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC 22B6-A-07-A-1進行LC-MS分子量分析見表3。 表3：ADC 22B6-A-07-A-1實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23333.66 24361.55 N/A N/A N/A
HC 實測值 51311.72 52343.85 53371.29 54398.35 55424.24
表4：ADC 22B6-A-07-A-1的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 17.76 0.002 7.99
LC-DAR1 11714.79 0.998
HC-DAR0 2.19 0.001
HC-DAR1 5.33 0.002
HC-DAR2 38.61 0.014
HC-DAR3 2632.83 0.966
HC-DAR4 45.32 0.017
計算得ADC 22B6-A-07-A-1的藥物/抗體比值為DAR=7.99見表4。 2. LC-MS測定ADC 22B6-A-07-A-2分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC 22B6-A-07-A-2進行LC-MS分子量分析見表5。 表5：ADC 22B6-A-07-A-1實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23333.90 24361.22 N/A N/A N/A
HC 實測值 51315.83 52342.63 53369.65 54396.95 N/A
表6：ADC 22B6-A-07-A-2的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 4913.02 0.548 3.56
LC-DAR1 4053.08 0.452
HC-DAR0 621.45 0.239
HC-DAR1 885.02 0.341
HC-DAR2 707.16 0.272
HC-DAR3 382.56 0.147
HC-DAR4 0.00 0.000
計算得ADC 22B6-A-07-A-2的藥物/抗體比值為DAR=3.56見表6。 3. LC-MS測定ADC 47A3-A-07-A分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC 47A3-A-07-A進行LC-MS分子量分析見表7。 表7：ADC 47A3-A-07-A實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23564.32 24591.76 N/A N/A N/A
HC 實測值 51443.47 52469.07 53498.19 54525.66 55555.34
表8：ADC 47A3-A-07-A的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 777.53 0.180 6.27
LC-DAR1 3542.16 0.820
HC-DAR0 336.77 0.222
HC-DAR1 1.70 0.001
HC-DAR2 25.97 0.017
HC-DAR3 1154.30 0.760
HC-DAR4 0.20 0.000
計算得ADC 47A3-A-07-A的藥物/抗體比值為DAR=6.27見表8。 4. LC-MS測定ADC 100H7-A-07-A分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC 100H7-A-07-A進行LC-MS分子量分析見表9。 表9：ADC 100H7-A-07-A實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23459.14 24487.82 N/A N/A N/A
HC 實測值 50140.37 51168.90 52193.09 53221.86 54248.08
表10：ADC 100H7-A-07-A的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 0.22 0.000 8.01
LC-DAR1 6088.44 1.000
HC-DAR0 1.94 0.001
HC-DAR1 0.00 0.000
HC-DAR2 0.98 0.000
HC-DAR3 1957.89 0.989
HC-DAR4 18.43 0.009
計算得ADC 100H7-A-07-A的藥物/抗體比值為DAR=8.01見表10。 5. LC-MS測定ADC U1-59-A-07-A分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC U1-59-A-07-A進行LC-MS分子量分析見表11。 表11：ADC U1-59-A-07-A實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 24290.64 25318.79 N/A N/A N/A
HC 實測值 N/A 51531.74 52561.59 53587.44 54614.36
表12：ADC U1-59-A-07-A的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 4.51 0.000 8.02
LC-DAR1 9409.93 1.000
HC-DAR0 0.00 0.000
HC-DAR1 0.00 0.000
HC-DAR2 17.27 0.008
HC-DAR3 2247.34 0.977
HC-DAR4 36.06 0.016
計算得ADC U1-59-A-07-A的藥物/抗體比值為DAR=8.02見表12。 6. LC-MS測定ADC hIgG1-A-07-A分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC hIgG1-A-07-A進行LC-MS分子量分析見表13。 表13：ADC hIgG1-A-07-A實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23356.43 24384.30 N/A N/A N/A
HC 實測值 50171.46 51198.30 52226.14 53254.03 54280.32
表14：ADC hIgG1-A-07-A的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 0.01 0.000 8.03
LC-DAR1 6859.36 1.000
HC-DAR0 0.64 0.000
HC-DAR1 0.15 0.000
HC-DAR2 0.81 0.000
HC-DAR3 2656.39 0.985
HC-DAR4 39.69 0.015
計算得ADC hIgG1-A-07-A（8）的藥物/抗體比值為DAR=8.03見表14。 7. LC-MS測定ADC 22B6-A-01分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC 22B6-A-01進行LC-MS分子量分析見表15。 表15：ADC 22B6-A-01實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23333.84 24367.86 N/A N/A N/A
HC 實測值 51315.60 52350.27 53383.32 54417.88 55452.52
表16：ADC 22B6-A-01的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 63.87 0.010 7.93
LC-DAR1 6265.77 0.990
HC-DAR0 3.26 0.002
HC-DAR1 7.83 0.005
HC-DAR2 16.62 0.010
HC-DAR3 1621.08 0.981
HC-DAR4 4.30   
計算得ADC 22B6-A-01的藥物/抗體比值為DAR=7.93見表16。 8. LC-MS測定ADC U1-59-A-01分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC U1-59-A-01進行LC-MS分子量分析見表17。 表17：ADC U1-59-A-01實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23881.57 25325.29 N/A N/A N/A
HC 實測值 N/A 50720.49 52160.53 53606.48 55055.42
表18：ADC U1-59-A-01的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 0.15 0.000 7.89
LC-DAR1 5937.79 1.000
LC-DAR2 0.16 0.000
HC-DAR0 0.00 0.000
HC-DAR1 15.59 0.007
HC-DAR2 102.06 0.045
HC-DAR3 2139.31 0.946
HC-DAR4 4.81 0.002
計算得ADC U1-59-A-01的藥物/抗體比值為DAR=7.89見表18。 9. LC-MS測定ADC 22B6-B-03-1分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC 22B6-B-03-1進行LC-MS分子量分析見表19。 表19：ADC 22B6-B-03-1實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23333.71 24468.53 N/A N/A N/A
HC 實測值 N/A 52452.66 53586.81 54719.16 N/A
表20：ADC 22B6-B-03-1的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 0.55 0.000 8.0
LC-DAR1 7491.47 1.000
HC-DAR0 0.00 0.000
HC-DAR1 0.16 0.000
HC-DAR2 1.77 0.002
HC-DAR3 986.79 0.998
HC-DAR4 0.00 0.000
計算得ADC 22B6-B-03-1的藥物/抗體比值為DAR=8.0見表20。 10. LC-MS測定ADC 22B6-B-03-2分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC 22B6-B-03-2進行LC-MS分子量分析見表21。 表21：ADC 22B6-B-03-2實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23333.86 24467.90 N/A N/A N/A
HC 實測值 51315.63 52449.47 53583.27 54717.13 N/A
表22：ADC 22B6-B-03-2的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 4458.58 0.594 3.14
LC-DAR1 3053.31 0.406
HC-DAR0 564.55 0.296
HC-DAR1 684.51 0.359
HC-DAR2 446.79 0.234
HC-DAR3 212.83 0.112
HC-DAR4 0.00 0.000
計算得ADC 22B6-B-03-2的藥物/抗體比值為DAR=3.14，見表22。 11. LC-MS測定ADC hIgG1-B-03-1分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC hIgG1-B-03-1進行LC-MS分子量分析見表23。 表23：ADC hIgG1-B-03-1實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23356.96 24491.30 N/A N/A N/A
HC 實測值 50170.43 51302.49 52441.17 53574.55 54707.63
表24：ADC hIgG1-B-03-1的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 221.82 0.027 7.90
LC-DAR1 7905.94 0.973
HC-DAR0 13.64 0.008
HC-DAR1 0.55 0.000
HC-DAR2 1.35 0.001
HC-DAR3 1644.22 0.990
HC-DAR4 1.51 0.001
計算得ADC hIgG1-B-03-1的藥物/抗體比值為DAR=7.90見表24。 12. LC-MS測定ADC hIgG1-B-03-2分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC hIgG1-B-03-2進行LC-MS分子量分析見表25。 表25：ADC hIgG1-B-03-2實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 23357.18 24491.24 N/A N/A N/A
HC 實測值 50172.72 51306.68 52440.51 53574.02 N/A
表26：ADC hIgG1-B-03-2的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 968.46 0.395 4.20
LC-DAR1 1480.74 0.605
HC-DAR0 163.15 0.148
HC-DAR1 432.71 0.392
HC-DAR2 302.86 0.275
HC-DAR3 204.00 0.185
HC-DAR4 0.00 0.0        
計算得ADC hIgG1-B-03-2的藥物/抗體比值為DAR=4.20見表26。 13. LC-MS測定ADC 22B6-B-01分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC 22B6-B-01進行LC-MS分子量分析見表27。 表27：ADC 22B6-B-01實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 N/A 24884.55 26438.34 N/A N/A
HC 實測值 N/A N/A 54418.55 55967.73 57516.65
表28：ADC 22B6-B-01的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 0.00 0.000 8.07
LC-DAR1 6812.74 0.999
LC-DAR2 4.37 0.001
HC-DAR0 0.00 0.000
HC-DAR1 0.00 0.000
HC-DAR2 30.50 0.017
HC-DAR3 1656.42 0.933
HC-DAR4 88.88 0.050
計算得ADC 22B6-B-01的藥物/抗體比值為DAR=8.07見表28。 14. LC-MS測定ADC hIgG1-B-01分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC hIgG1-B-01進行LC-MS分子量分析見表29。 表29：ADC hIgG1-B-01實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
LC 實測值 N/A 24907.44 26456.26 N/A N/A
HC 實測值 50171.01 N/A 53272.32 54823.15 56372.21
表30：ADC hIgG1-B-01的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 0.00 0.000 8.06
LC-DAR1 7209.28 0.999
LC-DAR2 5.25 0.001
HC-DAR0 2.83 0.001
HC-DAR1 0.00 0.000
HC-DAR2 35.43 0.013
HC-DAR3 2610.46 0.940
HC-DAR4 127.17 0.046
計算得ADC hIgG1-B-01的藥物/抗體比值為DAR=8.06見表30。 15. LC-MS測定ADC hIgG1-A-01分子量，計算藥物/抗體比DAR值。對ADC hIgG1-A-01進行LC-MS分子量分析見下表。 表31：ADC hIgG1-A-01的DAR值
名稱 最大信號強度 比率 DAR
LC-DAR0 0.16 0.000 7.96
LC-DAR1 6021.53 1.000
LC-DAR2 0.18 0.000
HC-DAR0 0.00 0.000
HC-DAR1 15.60 0.007
HC-DAR2 102.06 0.045
HC-DAR3 2145.21 0.951
HC-DAR4 4.82 0.002
16.ADC 22B6-B-04-1的製備實施例 取0.854ml 22B6抗體(23.43 mg/mL)，用42.68uL 20mM PB + 0.1M EDTA（pH 7.60）稀釋，然後用1M Na2HPO4溶液調pH至7.57，加入20mM TCEP（三(2-羧乙基)膦，73.68 uL，pH 7.60）溶液混勻，室溫放置1.5 小時。再緩慢加入12倍物質的量的溶解在二甲基亞碸的B-04（164 uL，10 mM）溶液混勻，室溫靜置過夜，完畢後採用NAP-5凝膠柱（Cytiva）將緩衝液置換為pH 6.0的20 mM組胺酸緩衝溶液，得到ADC 22B6-B-04-1。質譜法測定DAR值為8.62。 17. ADC 22B6-B-04-2的製備實施例 取2.667ml 22B6抗體（18.75 mg/mL），用133.35uL 20mM PB + 0.1M EDTA（pH 7.60）稀釋，然後用1M Na 2HPO 4溶液調pH至7.63，加入10mM TCEP（三(2-羧乙基)膦，184.19 uL，pH 7.60）溶液混勻，室溫放置1.5 h。再緩慢加入10倍物質的量的溶解在二甲基亞碸的B-04（341.73 uL，10 mM）溶液混勻，室溫靜置2h，完畢後採用NAP-5凝膠柱（Cytiva）將緩衝液置換為pH 6.0的20 mM組胺酸緩衝溶液，得到ADC 22B6-B-04-2，質譜法測定DAR值為6.87。 將抗體替換為hIgG1抗體，用同樣方法製備hIgG1-B-04-2樣品，質譜法測定DAR值為7.02。
四、檢測抗體藥物偶聯物活性 1. 抗人HER3抗體及其藥物偶聯物細胞親和力檢測 用流式儀（Beckman，型號Cytoflex）檢測抗人HER3 抗體及其藥物偶聯物（ADC）與MDA-MB-453、NCI-H358、KPL-4、A431細胞的親和力。 用Tryple（廠家Gibco）溶液消化貼壁生長的MDA-MB-453、NCI-H358、KPL-4、A431細胞，計數並取適量細胞 ，用1xPBS洗滌兩次，重懸於含1% BSA 的PBS溶液中，然後將細胞轉移到96孔尖底盤中，50µl 每孔；用含1% BSA 的PBS溶液分別稀釋候選抗體及ADC，5µg/mL起始，3倍或2.5倍梯度稀釋，然後取50µl 稀釋好的抗體或ADC加入到含有細胞的尖底盤中，4度孵育40min；PBS 洗滌細胞兩次，然後每孔加入50 µl 稀釋好的二抗，混勻，4度孵育30min；PBS 洗滌細胞兩次，然後將細胞重懸於400 µl  PBS中，流式上機檢測。 資料處理：匯出平均螢光信號值，然後導入GraphPad Prism 6軟體，計算EC50，結果如表32和圖 1A、1B、1C、1D所示。上述結果說明，本發明的抗體（例如22B6、47A3及100H7）偶聯成ADC後，細胞親和性明顯高於對照抗體U1-59偶聯所形成的ADC；且本發明的裸抗（例如22B6）的細胞親和力明顯高於對照裸抗U1-59。並且，裸抗偶聯成ADC後，細胞親和力變化較小，22B6偶聯成ADC的親和力仍然最高。 表32 抗人HER3 抗體及ADC細胞親和力測定結果
　藥物　    EC50(ng/ml)
MDA-MB-453 NCI-H358 KPL-4 A431
U1-59-A-07-A ∕ 938.8 567.8 710.6
100H7-A-07-A ∕ 427.4 274.4 265.9
47A3-A-07-A ∕ 157.6 124.6 65.6
22B6-A-07-A-1 55.98 32.91 32.51 28.36
U1-59-A-01 572.7 356.5 236 716.1
22B6-A-01 ∕ 44.55 38.68 30.74
22B6-B-01 ∕ 29.79 51.9 32.78
U1-59 426.4 ∕ ∕ ∕
22B6 39.19 ∕ ∕ ∕
注：“/”表示未檢測。 2. 抗人HER3抗體偶聯藥物體外細胞毒性 用TrypLE（廠家Gibco）溶液消化MDA-MB-453、HCC1569、HEK293T-h HER3細胞，計數並取適量細胞，用生長培養基稀釋後，5000cells或3000cells（100µl）/well鋪到96孔盤，37℃、5%CO 2培養過夜；第二天用生長培養基稀釋ADC，150µg/ml起始，2.5倍梯度稀釋，然後取100µl 稀釋好的ADC加入含有細胞的96孔盤中，將盤子放入培養箱，37℃、5%CO 2培養6天后，每孔加入20µl  CCK8，37℃孵育2-5h，酶標儀讀取OD450nm吸光值；將原始資料導入Graph Prism 6計算IC 50值。如表33和圖2A、2B、2C所示，本發明的抗體所形成的ADC（例如22B6-A-01、22B6-A-07-A-1）有靶點特異的殺傷活性，其中22B6-A-07-A-1對腫瘤細胞的IC 50與hIgG1-A-01或hIgG1-A-07-A的相差6-8倍，hIgG1-A-01和hIgG1-A-07-A對過表現細胞（HEK293T-h HER3）無明顯殺傷，22B6-A-01、22B6-A-07-A-1等ADC與hIgG-A-01或hIgG-A-07-A的IC 50差距更大。 表33 抗人HER3 ADC體外細胞毒性結果
　 IC 50(nM)
藥物　 MDA-MB-453 HCC1569  HEK293T-hHER3
hIgG1-A-01 88.07 54.87 ＞10000
U1-59-A-01 10.95 9.74 0.0038
22B6-A-01 ∕ ∕ 0.0014
hIgG1-A-07-A 141.6 106.9 ＞10000
22B6-A-07-A-1 19.04 15.61 0.0038
注： “/”表示未檢測。 3. 抗人HER3抗體偶聯藥物旁觀者效應 用0.25%Trypsin-EDTA（廠家Gibco）消化HEK293T和HEK293T-h HER3細胞，分別計數並取適量細胞， PBS洗滌兩次後，調整細胞密度至1*10 6cells/ml，然後加入終濃度為5µM的 Cell Trace Violet 進行標記，混勻並放入培養箱孵育20min，之後用生長培養基洗滌並計數，按HEK293T-labled ：HEK293T=4000 ：12000 cells /well ， HEK293T-labled：HEK293T-h HER3= 4000：12000cells /well， HEK293T-h HER3-labled： HEK293T-h HER3= 4000：12000 cells /well，分別鋪到24孔盤（500µl /孔），37℃、5%CO 2培養過夜； 第二天用生長培養基稀釋ADC至濃度為20nM、4nM、0.8nM，然後取500µl 稀釋好的ADC分別加入對應含有細胞的24孔盤中，將盤子放入培養箱，37℃、5%CO 2培養4天； 用0.25%Trypsin-EDTA消化HEK293T和HEK293T-h HER3細胞，加入含有終濃度為3µM的PI的生長培養基混勻，室溫孵育15min後，流式（Thermo，型號 Attune NxT）上機檢測。結果如圖3A、3B、3C所示，22B6-A-07-A-1和U1-59-A-01對陰性細胞HEK293T基本沒有殺傷，對HEK293T-HER3有顯著的特異性殺傷，在陰性細胞HEK293T和陽性細胞HEK293T-HER3同時存在的條件下，22B6-A-07-A-1和U1-59-A-01對陰性細胞有明顯殺傷作用，說明22B6-A-07-A-1和U1-59-A-01有旁殺活性。 4. 抗人HER3抗體偶聯藥物血漿穩定性檢測 精密量取3.59 μl 20.9 mg/ml 22B6-A-07-A-1 ADC樣品至EP管中，分別加入496 μl 人、食蟹猴及小鼠空白血漿，混合均勻分別獲得含22B6-A-07-A-1 ADC樣品的人、食蟹猴及小鼠血漿樣品。將樣品放置在恒溫孵育箱中37℃孵育，於1、3、6、24、48、96和168 h取出樣品50 μl，加入200 µl 0.5%甲酸-乙腈沉澱蛋白，於4 ℃，13,000 rpm離心10 min後取上清液，置於-80 °C保存，待收集所有樣品後採用LC-MS/MS檢測細胞毒性藥物濃度。結果如圖4所示，細胞毒性藥物脫落不超過5%，說明本發明的抗人HER3抗體偶聯藥物（例如22B6-A-07-A-1）在不同種屬血漿中穩定。 5. 抗人HER3抗體偶聯藥物H358模型體內藥效檢測 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，在37℃，5% CO 2的條件下培養NCI-H358細胞。收集指數生長期的NCI-H358細胞，PBS重懸至適合濃度，接種於雌性Balb/c-nu小鼠皮下建立非小細胞肺癌模型。待腫瘤平均體積約130~150mm 3時，根據腫瘤大小隨機分為11組，依次為：溶媒對照組（即陰性對照組），hIgG1-A-01 1mg/kg組，U1-59-A-01 1mg/kg組， 22B6-A-01 1mg/kg組，hIgG1-B-01 1mg/kg組， 22B6-B-01 1mg/kg組，hIgG1-A-07-A 1mg/kg組， 22B6-A-07-A-1 1mg/kg組和3mg/kg組，hIgG1-B-03-1 1mg/kg組， 22B6-B-03-1 1mg/kg組。均通過尾靜脈注射，在Day0、Day1、Day4、Day10給藥，共給藥3次。給藥後每週2次用遊標卡尺測量腫瘤直徑，並按如下計算公式計算腫瘤體積：V = 0.5 a × b 2，其中a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑，每天觀察記錄動物死亡情況，具體結果見表34，圖5A、圖5B。 採用以下公式計算腫瘤生長抑制率TGI (%)，用於評價抑瘤療效： TGI (%) = [1-(VT末-VT始)/(VC末-VC始)]*100% 其中  VT末：處理組實驗結束時腫瘤體積均值 VT始：處理組給藥開始時腫瘤體積均值 VC末：陰性對照組實驗結束時腫瘤體積均值 VC始：陰性對照組給藥開始時腫瘤體積均值 由試驗結果可知，本發明ADC對NCI-H358非小細胞肺癌移植瘤模型的腫瘤生長抑制作用顯著。與溶媒對照組相比，3次給藥後，Day32資料顯示， 22B6-A-01 1mg/kg組和22B6-B-01 1mg/kg組的腫瘤生長抑制率（TGI）分別為79.80%和64.68%，22B6-A-07-A-1 1mg/kg組、3mg/kg組的TGI分別為81.22%、111.53%，22B6-B-03-1 1mg/kg組TGI為121.45%；陽性對照U1-59-A-01 1mg/kg組TGI為44.51%。Day32各治療組無動物死亡及顯著動物體重降低，未見明顯的藥物毒性反應，治療期間小鼠對本發明ADC耐受性良好。 表34  人非小細胞肺癌細胞NCI-H358 CDX模型
分組 組別 Day32
腫瘤體積(mm 3) （ ±SEM） TGI （%） T/C （%） P值 （vs.1組）
1 溶媒對照組 523.79±75.33 - - -
2 hIgG1-A-01 1mg/kg 485.69±72.91 9.68 93.02 0.724
3 U1-59-A-01 1mg/kg 350.75±58.99 44.51 66.92 0.101
4 22B6-A-01 1mg/kg 213.68±24.79 79.80 40.70 0.003
5 hIgG1-B-01 1mg/kg 481.61±30.05 10.89 91.83 0.614
6 22B6-B-01 1mg/kg 271.94±60.53 64.68 52.02 0.026
7 hIgG1-A-07-A 1mg/kg 422.70±66.85 26.04 80.57 0.339
8 22B6-A-07-A-1 1mg/kg 208.35±42.59 81.22 39.63 0.004
9 22B6-A-07-A-1 3mg/kg 118.71±29.81 111.53 22.77 0.003
10 hIgG1-B-03-1 1mg/kg 537.77±117.56 0.05 92.90 0.920
11 22B6-B-03-1 1mg/kg 117.40±20.09 121.45 20.22 0.003
注：TGI為腫瘤生長抑制率，T/C為相對腫瘤增殖率，下同。（本實驗中，組1-組9為Day0分組給藥，腫瘤體積（TV）≈135mm 3，組10和組11為Day1分組給藥，腫瘤體積（TV）≈149mm 3；之後Day4、Day10所有組別一同給藥） 6. 抗人HER3抗體偶聯藥物N87模型體內藥效檢測 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，在37℃，5% CO 2的條件下培養NCI-N87細胞。收集指數生長期的NCI-N87細胞，PBS重懸至適合濃度，接種於雌性Balb/c-nu小鼠皮下建立人胃癌模型。待腫瘤平均體積約120mm 3時，根據腫瘤大小隨機分組，分別為：溶媒對照組，hIgG1-A-07-A 3mg/kg組，22B6-A-07-A-1 3mg/kg組， 47A3-A-07-A 3mg/kg組， 100H7-A-07-A 3mg/kg組。均通過尾靜脈注射，在Day0、Day4、Day7給藥，共給藥3次。給藥後每週2次用遊標卡尺測量腫瘤直徑，並按如下計算公式計算腫瘤體積：V = 0.5 a × b 2，其中a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑，每天觀察記錄動物死亡情況，具體結果見表35，圖6A、6B。 由試驗結果可知，與溶媒對照組相比，3次給藥後，Day32資料顯示， 22B6-A-07-A-1 3mg/kg組、47A3-A-07-A 3mg/kg組和100H7-A-07-A 3mg/kg組的腫瘤生長抑制率（TGI）分別為66.59%、47.24%和36.04%； 22B6-A-07-A-1和47A3-A-07-A 3mg/kg對NCI-N87胃癌移植瘤模型的腫瘤生長抑制作用顯著。Day32各治療組無動物死亡及顯著動物體重降低，未見明顯的藥物毒性反應，治療期間小鼠對本發明ADC耐受性良好。 表35 人胃癌細胞NCI-N87 CDX模型
分組 組別 Day32
腫瘤體積(mm 3) （ ±SEM） TGI （%） T/C （%） P值 （ vs.1組）
1 溶媒對照組 779.52±150.34 - - -
2 hIgG1-A-07-A 3mg/kg 574.78±52.79 31.21 73.40 0.228
3 22B6-A-07-A-1 3mg/kg 342.37±37.22 66.59 43.61 0.018
4 47A3-A-07-A 3mg/kg 468.82±36.48 47.24 60.12 0.072
5 100H7-A-07-A 3mg/kg 542.62±58.59 36.04 69.52 0.173
7. 抗人HER3抗體偶聯藥物MDA-MB-453模型體內藥效檢測 用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，在37℃，5% CO 2的條件下培養人乳腺癌細胞MDA-MB-453。收集指數生長期的MDA-MB-453細胞，加入PBS和終濃度50%的基質膠重懸至適合濃度，接種於雌性NCG免疫缺陷小鼠皮下建立人乳腺癌移植瘤模型。待腫瘤平均體積約150mm3時，根據腫瘤大小隨機分組，分別為溶媒對照組，hIgG1-A-07-A 3mg/kg， 22B6-A-07-A-1 1 mg/kg組、3 mg/kg組和10 mg/kg組，hIgG1-A-01 3mg/kg 組，U1-59-A-01 3 mg/kg組和10mg/kg組，hIgG1-B-03-2 3mg/kg組， 22B6-B-03-2 3 mg/kg組。分組後尾靜脈注射，Day0單次給藥。給藥後觀察並定期測量小鼠腫瘤體積及體重，具體結果見表36，圖7A、7B。 本發明ADC對皮下移植人乳腺癌MDA-MB-453的NCG小鼠的腫瘤生長均有顯著抑制作用。單次給藥後Day32資料顯示，與溶媒對照組相比，22B6-A-07-A-1 1 mg/kg、3 mg/kg組和10 mg/kg組TGI分別為62.07%、118.30%和200.00%，其中10 mg/kg組小鼠腫瘤從Day19完全消退，至Day32未見生長；22B6-B-03-2 3 mg/kg組TGI為148.58%；陽性對照U1-59-A-01 3 mg/kg組和10mg/kg組TGI分別為76.11%和180.65%。治療期間小鼠對本發明ADC耐受性良好。 表36 人乳腺癌細胞MDA-MB-453 CDX模型
分組 組別 Day32
腫瘤體積(mm 3) （ ±SEM） TGI （%） T/C （%） 腫瘤消退 CR/PR (n=6) P值 （ vs.1組）
1 溶媒對照組 528.12±27.78 - - 0/0 -
2 hIgG1-A-07-A 3mg/kg 375.13±51.92 40.13 71.44 0/0 0.027
3 22B6-A-07-A-1 1 mg/kg 291.74±18.54 62.07 55.64 0/0 0.000
4 22B6-A-07-A-1 3 mg/kg 120.03±25.22 118.30 23.05 0/3 0.000
5 22B6-A-07-A-1 10 mg/kg 0.00±0.00 200.00 0.00 6/0 0.000
6 hIgG1-A-01 3mg/kg 290.74±23.06 62.42 55.32 0/0 0.000
7 U1-59-A-01 3 mg/kg 238.41±42.09 76.11 45.50 0/1 0.000
8 U1-59-A-01 10 mg/kg 28.59±2.19 180.65 5.46 0/6 0.000
9 hIgG1-B-03-2 3mg/kg 283.75±47.85 64.12 54.18 0/1 0.001
10 22B6-B-03-2 3 mg/kg 75.87±13.04 148.58 14.51 0/6 0.000
8. 抗人HER3抗體及其藥物偶聯物細胞親和力檢測 用流式儀（Beckman，型號Cytoflex）檢測抗人HER3 ADC與MDA-MB-453細胞的親和力。 用Tryple（廠家Gibco）溶液消化貼壁生長的MDA-MB-453細胞，計數並取適量細胞 ，用PBS洗滌兩次，重懸於1% BSA(PBS配製)溶液中，然後將細胞轉移到96孔尖底盤中，50µl 每孔；用1% BSA 分別稀釋候選抗體及其藥物偶聯物，15µg/mL起始，3倍梯度稀釋，然後取50µl 稀釋好的抗體或抗體偶聯藥物加入到含有細胞的尖底盤中，4度孵育40min； PBS 洗滌細胞兩次，然後每孔加入50 µl 稀釋好的二抗，混勻，4度孵育30min；PBS 洗滌細胞兩次，然後將細胞重懸於200 µl  PBS中，流式上機檢測。 資料處理：匯出平均螢光信號值，然後導入GraphPad Prism 6軟體，計算EC50，結果如表37和圖 9所示。上述結果說明，本發明的抗體（例如22B6）偶聯成ADC後，細胞親和性明顯高於對照抗體U1-59偶聯所形成的ADC。 表37 抗人HER3 抗體及ADC細胞親和力測定結果
　藥物　 EC50(ng/ml)
MDA-MB-453
22B6-A-07-A-1 146.9
22B6-B-04-2 194.9
U1-59-A-01 1014
U1-59 684.2
22B6 85.39
9. 抗人HER3抗體偶聯藥物內吞活性測試 用流式儀（Beckman，型號Cytoflex）檢測抗人HER3 ADC在MDA-MB-453、HCC1569細胞上的內吞活性。 用Trypsin-EDTA (0.25%，上海源培)溶液消化貼壁生長的細胞並計數，用完全培養基調整細胞密度至1×10 5個/ml，每孔加入100 µl細胞懸液到96孔盤中（細胞數目為1×10 4個/孔），將96孔盤放置於37℃，CO 2恒溫培養箱孵育培養24 h。取出96孔盤，吸棄培養基，每孔加入50 µl新鮮完全培養基；採用完全培養基梯度稀釋雙特異抗體及對照抗體，終濃度為0.55、1.64、4.94、14.81、44.44、133.33、400、1200 ng/ml ，共計8個濃度點；完全培養基稀釋PHrodo試劑（Thermo）至12 µg/ml（PHrodo的終濃度為3 µg/ml）；將梯度稀釋的待測抗體與稀釋後的PHrodo試劑 1:1混合均勻（30 µl:30 µl），在室溫避光孵育30 min；取50 µl待測抗體和PHrodo試劑混合物加入96孔盤中，37℃、5%CO 2培養24 h; 取出96孔盤，吸棄培養基，無菌PBS洗滌1次，每孔加入100 µl的Trypsin-EDTA (0.25%)消化細胞，再加入100 µl完全培養基中和；將孔裡細胞吹打分散後，FACS上機檢測。資料處理：匯出平均螢光信號值，然後導入GraphPad Prism 6軟體，計算EC 50，結果如表38所示和圖 10、圖11所示，22B6及偶聯後的ADC內吞活性優於或者不劣於對照抗體U1-59及其偶聯所形成的ADC。 表38 抗人HER3 抗體及ADC內吞活性測定結果
　藥物　 EC50(ng/ml)
MDA-MB-453 HCC1569
22B6-A-07-A-1 12.22 36.91
22B6-B-04-2 7.76 20.43
U1-59-A-01 36.69 38.97
U1-59 21.81 34.72
22B6 9.98 28.77
10. 抗人HER3抗體偶聯藥物體外細胞毒性 用TrypLE（廠家Gibco）溶液消化MDA-MB-453細胞，計數並取適量細胞，用生長培養基稀釋後，5000cells（100µl/well）鋪到96孔盤，37℃、5%CO 2培養過夜；第二天用生長培養基稀釋ADC，150µg/ml起始，2.5倍梯度稀釋，然後取100µl 稀釋好的ADC加入含有細胞的96孔盤中，將盤子放入培養箱，37℃、5%CO 2培養6天后，每孔加入20µl  CCK8，37℃孵育2-5h，酶標儀讀取OD450nm吸光值；將原始資料導入Graph Prism 6計算IC50值。如表39和圖12所示，MDA-MB-453細胞上22B6-A-07-A-1與22B6-B-04-2均表現出明顯的細胞殺傷活性。 表39 抗人HER3 ADC體外細胞毒性結果
   IC50(nM)
藥物　 MDA-MB-453
hIgG1-A-07-A 29.4
22B6-A-07-A-1 4.0
hIgG1-B-04-2 0.18
22B6-B-04-2 0.07
注： “/”表示未檢測。
儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解，根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部範圍由所附請求項及其任何等同物給出。
此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本申請的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中： 圖1A顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物與MDA-MB-453細胞親和力檢測結果。 圖1B顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物與NCI-H358細胞親和力檢測結果。 圖1C顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物與KPL-4細胞親和力檢測結果。 圖1D 顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物與A431細胞親和力檢測結果。 圖2A顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在MDA-MB-453細胞上的體外細胞毒性檢測結果。 圖2B顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在HCC1569細胞上的體外細胞毒性檢測結果。 圖2C顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在HEK293T-h HER3細胞上的體外細胞毒性檢測結果。 圖3A-C顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在HEK293T 和HEK293T-h HER3細胞上的旁觀者效應檢測結果。 圖4 顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物血漿穩定性檢測結果。 圖5A顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在NCI-H358 CDX模型中各組小鼠腫瘤體積的變化情況結果。 圖5B顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在NCI-H358 CDX模型中各組小鼠體重的變化情況結果。 圖6A顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在NCI-N87 CDX模型中各組小鼠腫瘤體積的變化情況結果。 圖6B顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在NCI-N87 CDX模型中各組小鼠體重的變化情況結果。 圖7A顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在MDA-MB-453 CDX模型中各組小鼠腫瘤體積的變化情況結果。 圖7B顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在MDA-MB-453 CDX模型中各組小鼠體重的變化情況結果。 圖8A顯示了實施例三製備的化合物A-07-A和A-07-B的HPLC圖譜。 圖8B顯示了實施例三製備的化合物A-07-A和實施例九的化合物A-05的HPLC圖譜。 圖9顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物與MDA-MB-453細胞的親和力的檢測結果。 圖 10顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在MDA-MB-453細胞的內吞活性測試結果 圖11顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物在HCC1569細胞的內吞活性測試結果。 圖12顯示了抗人HER3抗體偶聯藥物的細胞殺傷活性檢測結果。
TW202400245A_112115991_SEQL.xml

Claims (20)

  1. 一種抗體藥物綴合物，其具有式Ab-[M-L-E-D] x所示結構，其中： Ab是與人表皮生長因子受體3特異性結合的抗體或其抗原結合片段； M是和抗體或其抗原結合片段的接頭部位； L是連接接頭M和E之間的連接子； E是連接L和D的結構片段； D是細胞毒性藥物片段； x選自1至10。
  2. 如請求項1之抗體藥物綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段包含： (1) 下述重鏈可變區（VH）和/或輕鏈可變區（VL），其中CDR按Chothia編號系統定義： (1a) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 1或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 2或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:3或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 4或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 5或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 6或其變體的CDR-L3；或， (1b) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 19或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 20或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:21或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 22或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 23或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 24或其變體的CDR-L3；或， (1c) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 36或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 37或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:38或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 45或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO:23或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 52或其變體的CDR-L3； 其中，(1a)、(1b)、(1c)任一項中所述的變體與其所源自的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，或者所述變體與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）；優選地，所述的置換是保守置換； 或者， (2) 下述重鏈可變區（VH）和/或輕鏈可變區（VL），其中CDR按Kabat編號系統定義： (2a) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 7或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 8或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:9或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 4或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 5或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 6或其變體的CDR-L3；或， (2b) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 25或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 26或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:21或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 22或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 23或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 24或其變體的CDR-L3；或， (2c) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 39或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 40或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:38或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 45或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO:23或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 52或其變體的CDR-L3； 其中，(2a)、(2b)、(2c)任一項中所述的變體與其所源自的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，或者所述變體與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）；優選地，所述的置換是保守置換； 或者， (3) 下述重鏈可變區（VH）和/或輕鏈可變區（VL），其中CDR按IMGT編號系統定義： (3a) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO:10或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 11或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:12或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 13或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO: 14或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 6或其變體的CDR-L3；或， (3b) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 27或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 28或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:29或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 30或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO:31或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 24或其變體的CDR-L3；或， (3c) 包含如下3個CDR的重鏈可變區（VH）：序列為SEQ ID NO: 41或其變體的CDR-H1，序列為SEQ ID NO: 42或其變體的CDR-H2，序列為SEQ ID NO:43或其變體的CDR-H3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區（VL）：序列為SEQ ID NO: 44或其變體的CDR-L1，序列為SEQ ID NO:31或其變體的CDR-L2，序列為SEQ ID NO: 52或其變體的CDR-L3； 其中，(3a)、(3b)、(3c)任一項中所述的變體與其所源自的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，或者所述變體與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）；優選地，所述的置換是保守置換。
  3. 如請求項1或2之抗體藥物綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段包含： （a）SEQ ID NO：15所示的VH或其變體，和/或，SEQ ID NO：16所示的VL或其變體； （b）SEQ ID NO：32所示的VH或其變體，和/或，SEQ ID NO：33所示的VL或其變體；或 （c）SEQ ID NO：46所示的VH或其變體，和/或，SEQ ID NO：47所示的VL或其變體； 其中，所述變體與其所源自的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，或者所述變體與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）；優選地，所述的置換是保守置換。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體藥物綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段進一步包含： (a) 人免疫球蛋白的重鏈恆定區（CH）或其變體，所述變體與其所源自的野生型序列相比具有一個或多個胺基酸的置換、缺失或添加（例如，至多20個、至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）；和 (b) 人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CL）或其變體，所述變體與其所源自的野生型序列相比具有一個或多個胺基酸的置換、缺失或添加（例如，至多20個、至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）； 優選地，所述重鏈恆定區是IgG重鏈恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區，例如人IgG1重鏈恆定區或人IgG4重鏈恆定區；優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）或其變體，所述變體與SEQ ID NO：50相比具有至多20個胺基酸的保守置換（例如至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的保守置換）； 優選地，所述輕鏈恆定區是κ輕鏈恆定區；優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）或其變體，所述變體與SEQ ID NO：51相比具有至多20個胺基酸的保守置換（例如至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的保守置換）； 優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）和如SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體藥物綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段包含： （1）包括SEQ ID NO：15所示序列的VH和SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）的重鏈，和，包括SEQ ID NO：16所示序列的VL和SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）的輕鏈； （2）包括SEQ ID NO：32所示序列的VH和SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）的重鏈，和，包括SEQ ID NO：33所示序列的VL和SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）的輕鏈；或 （3）包括SEQ ID NO：46所示序列的VH和SEQ ID NO：50所示的重鏈恆定區（CH）的重鏈，和，包括SEQ ID NO：47所示序列的VL和SEQ ID NO：51所示的輕鏈恆定區（CL）的輕鏈。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體藥物綴合物，M為 ， 其中，環A為5-6員脂雜環、或5-20員芳香族環系，所述脂雜環和芳香族環系視情況被一個或多個選自氧基（=O）、鹵素、氰基、胺基、羧基、巰基和C 1-6烷基的基團取代；M 1選自單鍵和C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基或C 2-20伸炔基； 優選地，M為 ，其中環A為5員脂雜環、6員雜芳環、或由一個以上的6員芳雜環與苯環通過單鍵連接形成的多環，所述脂雜環視情況被一個或多個選自氧基（=O）、鹵素和C 1-4烷基的基團取代；M 1選自單鍵和C 3-10伸烷基、C 3-10伸烯基或C 3-10伸炔基； 優選地，M為 ，其中環A選自 、 、 和 ；M 1選自單鍵和C 5-8伸烷基、C 5-8伸烯基或C 5-8伸炔基； 優選地，M選自 和 ； 優選地，M為 。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體藥物綴合物，L選自由下述的一個或多個組成的結構：C 1-6伸烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ；其中R’代表氫、C 1-6烷基或含-(CH 2CH 2O)r-的烷基；r選自1-10的整數；s選自1-20的整數； 優選地，L選自由下述的一個或多個組成的結構：C 1-6伸烷基、-NH-、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、 、 、 、 、 、 和 ；其中s選自1-20的整數； 優選地，L選自以下結構： ， ， ， ， ， , ， ， ， ， ， 和 ；其中s選自1-20的整數； 優選地，L選自以下結構： ， ， 和 ； 優選地， L選自以下結構： ， 和 。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體藥物綴合物，其中E為單鍵，-NH-CH 2-，-NH-CH 2-O-CH 2-CO-或選自以下結構： ， ， ， 和 ； 優選地，E為單鍵，-NH-CH 2-、-NH-CH 2-O-CH 2-CO-、 、 或 ； 優選地，E為-NH-CH 2-O-CH 2-CO-、 或 ； 優選地，E為-NH-CH 2-O-CH 2-CO-或 。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體藥物綴合物， 選自以下結構： ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， , 和 。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗體藥物綴合物，所述細胞毒性藥物選自微管蛋白抑制劑、DNA嵌入劑、DNA拓撲異構酶抑制劑和RNA聚合酶抑制劑；優選地，所述微管蛋白抑制劑為奧瑞他汀類化合物或美登素類化合物；優選地，所述DNA嵌入劑為吡咯並苯二氮卓(PBD) ；優選地，所述DNA拓撲異構酶抑制劑為拓撲異構酶I抑制劑（例如，喜樹鹼、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康、拓撲替康、貝洛替康、或盧比替康)或拓撲異構酶II抑制劑（例如，阿黴素、PNU-159682、多卡米星、柔紅黴素、米托蒽醌、鬼臼毒素、或依託泊苷）；優選地，所述RNA聚合酶抑制劑為α-鵝膏草鹼（α-amanitin）或其藥學上可接受的鹽、酯或類似物； 優選地，所述細胞毒性藥物選自式I和式II所示化合物： 其中，R 1，R 2各自獨立地選自C 1-6烷基和鹵素； R 3選自H和-CO-CH 2OH； R 4和R 5各自獨立地選自H、鹵素和羥基；或者R 4和R 5與相連碳原子連接成5-6員含氧雜環； R 6選自氫或-C 1-4伸烷基-NR aR b； R 7選自C 1-6烷基和-C 1-4伸烷基-NR aR b； 其中R a、R b在每次出現時各自獨立地選自H、C 1-6烷基、-SO 2- C 1-6烷基和-CO-C 1-6烷基； 優選地，所述細胞毒性藥物選自以下化合物： ； 所述細胞毒性藥物與連接體連接後得到的該細胞毒性藥物相應的片段即為通式中的D；優選地，D為所述細胞毒性藥物上的-OH、-NH 2或二級胺基失掉一個H得到的一價結構； 優選地，D選自下述結構： 。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體藥物綴合物，選自下示的ADC A-01~ADC A-25，ADC B-01~ADC B-05： ADC A-01 ， ADC A-02 ， ADC A-03 ， ADC A-04 ， ADC A-05 ， ADC A-06 ， ADC A-07 ， ADC A-08 ， ADC A-09 ， ADC A-10 , ADC A-11 , ADC A-12 ， ADC A-13 ， ADC A-14 ， ADC A-15 ， ADC A-16 ， ADC A-17 ， ADC A-18 ， ADC A-19 ， ADC A-20 ， ADC A-21 ， ADC A-22 , ADC A-23 , ADC A-24 , ADC A-25 , ADC B-01 ， ADC B-02 ， ADC B-03 ， ADC B-04 ， ADC B-05 ， 其中，各抗體藥物綴合物中的HA代表包含如SEQ ID NO:15所示的VH和如SEQ ID NO:16所示的VL的抗體或其抗原結合片段; 其中， 表示抗體或其抗原結合片段中的巰基與連接體的具體連接方式。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體藥物綴合物，其中 各抗體藥物綴合物中的HA代表包括SEQ ID NO：15所示的VH和SEQ ID NO：50所示的CH，以及SEQ ID NO：16所示的VL和SEQ ID NO：51所示的CL的抗體或其抗原結合片段。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗體藥物綴合物，選自： ， ， 和 ， 其中，各抗體藥物綴合物中的HA選自： （1）代表包含如SEQ ID NO:15所示的VH和如SEQ ID NO:16所示的VL的抗體或其抗原結合片段，例如包括SEQ ID NO：15所示的VH和SEQ ID NO：50所示的CH，以及SEQ ID NO：16所示的VL和SEQ ID NO：51所示的CL的抗體或其抗原結合片段； （2）代表包含如SEQ ID NO:32所示的VH和如SEQ ID NO:33所示的VL的抗體或其抗原結合片段，例如包括SEQ ID NO：32所示的VH和SEQ ID NO：50所示的CH，以及SEQ ID NO：33所示的VL和SEQ ID NO：51所示的CL的抗體或其抗原結合片段；和 （3）代表包含如SEQ ID NO:46所示的VH和如SEQ ID NO:47所示的VL的抗體或其抗原結合片段，例如包括SEQ ID NO：46所示的VH和SEQ ID NO：50所示的CH，以及SEQ ID NO：47所示的VL和SEQ ID NO：51所示的CL的抗體或其抗原結合片段； x為3~8，例如3~4或7~8； 優選地，所述抗體藥物綴合物為： 其中，所述HA代表包括SEQ ID NO：17所示的HC和SEQ ID NO：18所示的LC的抗體或其抗原結合片段； x為7~8。
  14. 一種藥物-連接體，其具有式M’-L-E-D所示結構，其中： M’為 ，Lg為親核取代反應的離去基團（例如，鹵素、甲磺醯基、氟代苯酚基或 ），或為羥基（-OH）、巰基（-SH）或胺基（-NH 2）；或者，Lg與環A上相鄰原子形成不飽和雙鍵；環A為5-6員脂雜環、或5-20員芳香族環系，所述脂雜環和芳香族環系視情況被一個或多個選自氧基（=O）、鹵素、氰基、胺基、羧基、巰基和C 1-6烷基的基團取代；M 1選自單鍵和C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基或C 2-20伸炔基； L、E和D結構如請求項1-13任一項中所定義。
  15. 如請求項14之藥物-連接體，其中M’為 ，Lg為甲磺醯基，或者，Lg與環A上相鄰原子形成碳碳雙鍵；環A為5員脂雜環、6員雜芳環、或由一個以上的6員芳雜環與苯環通過單鍵連接形成的多環，所述脂雜環視情況被一個或多個選自氧基（=O）、鹵素和C 1-4烷基的基團取代；M 1選自單鍵和C 3-10伸烷基、C 3-10伸烯基或C 3-10伸炔基； 優選地，M’為 ， 選自 、 、 和 ；M 1選自單鍵和C 5-8伸烷基、C 5-8伸烯基或C 5-8伸炔基； 優選地，M’選自 和 ； 優選地，M’為 。
  16. 如請求項14或15之藥物-連接體，選自下示的A-01~A-25，B-01~B-05： A-01： ， A-02： ， A-03： ， A-04： ， A-05： ， A-06： ， A-07： ， A-08： ， A-09： ， A-10： , A-11： , A-12： ， A-13： ， A-14： ， A-15： ， A-16： ， A-17： ， A-18： ， A-19： ， A-20： ， A-21： ， A-22： , A-23： , A-24： , A-25： , B-01： ， B-02： ， B-03： , B-04： ， B-05： 。
  17. 一種藥物組合物，其含有如請求項1至13中任一項之抗體藥物綴合物和視情況如請求項14至16中任一項所述的藥物-連接體，以及一種或多種藥用輔料。
  18. 一種如請求項1至13中任一項之抗體藥物綴合物、如請求項14至16中任一項之藥物-連接體、或請求項17之藥物組合物在製備治療HER3高表現癌症的藥物中的用途； 優選地，所述HER3高表現癌症包括實體瘤或血液系統惡性腫瘤，例如結腸癌，胃癌，乳腺癌，肺癌（例如，非小細胞肺癌，具體如肺腺癌），或淋巴癌。
  19. 如請求項1至13中任一項之抗體藥物綴合物、如請求項14至16中任一項之藥物-連接體、或如請求項17之藥物組合物，其用於治療HER3高表現癌症； 優選地，所述HER3高表現癌症包括實體瘤或血液系統惡性腫瘤，例如結腸癌，胃癌，乳腺癌，肺癌（例如，非小細胞肺癌，具體如肺腺癌），或淋巴癌。
  20. 一種治療HER3高表現癌症的方法，其包括向有此需要的個體施用治療有效量的如請求項1至13中任一項之抗體藥物綴合物、如請求項14至16中任一項之藥物-連接體、或如請求項17之藥物組合物的步驟； 優選地，所述HER3高表現癌症包括實體瘤或血液系統惡性腫瘤，例如結腸癌，胃癌，乳腺癌，肺癌（例如，非小細胞肺癌，具體如肺腺癌），或淋巴癌。
TW112115991A 2022-04-29 2023-04-28 抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途 TW202400245A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2022104677896 2022-04-29
CN202210467789 2022-04-29
CN202310444522X 2023-04-23
CN202310444522 2023-04-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202400245A true TW202400245A (zh) 2024-01-01

Family

ID=88517908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW112115991A TW202400245A (zh) 2022-04-29 2023-04-28 抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202400245A (zh)
WO (1) WO2023208216A1 (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
PT2719708T (pt) * 2009-11-13 2018-01-16 Daiichi Sankyo Europe Gmbh Material e métodos para tratamento ou prevenção de doenças associadas a her-3
US11185594B2 (en) * 2014-04-10 2021-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited (Anti-HER2 antibody)-drug conjugate
US20190336615A1 (en) * 2017-01-27 2019-11-07 Silverback Therapeutics, Inc. Tumor targeting conjugates and methods of use thereof
JPWO2020059772A1 (ja) * 2018-09-20 2021-08-30 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ３抗体−薬物コンジュゲート投与によるｈｅｒ３変異がんの治療
CN116133694A (zh) * 2020-10-14 2023-05-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗her3抗体和抗her3抗体药物偶联物及其医药用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023208216A1 (en) 2023-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111018992B (zh) Trop2阳性疾病治疗的化合物及方法
AU2010302250B2 (en) Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor
TW202134284A (zh) 抗cd123抗體以及其結合物及衍生物
CN106188293A (zh) 抗c-Met抗体和抗c-Met抗体-细胞毒性药物偶联物及其医药用途
KR20230145038A (ko) 생물활성 물질 접합체, 이의 제조방법 및 이의 용도
CN103333246B (zh) 一种抗egfr受体的肿瘤生长抑制剂及其制备方法和用途
CA3027046A1 (en) Anti-cd98 antibodies and antibody drug conjugates
JP2019521975A (ja) 抗ｅｇｆｒ抗体薬物コンジュゲート
JP2019521114A (ja) 抗ｅｇｆｒ抗体薬物コンジュゲート
JP2022533215A (ja) 親水性基を含むリンカーを有する抗体薬剤コンジュゲート
JP2024520674A (ja) 薬物コンジュゲート及びその使用
JP2023549935A (ja) 抗ｃｄ２７６抗体、抗体薬物複合体、及びその使用
US20230372519A1 (en) Anti-c-met antibody drug conjugates
WO2022253035A1 (zh) 抗体药物偶联物及其制备方法和用途
TW202400245A (zh) 抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途
WO2024078586A1 (en) Antibody-drug conjugate binding to human ptk7 and method for preparation and use thereof
WO2024114318A1 (zh) 药物连接子化合物及其制备方法和用途
WO2024114523A1 (zh) 抗体药物偶联物及其制备方法和用途
JP2024521629A (ja) 抗体薬物コンジュゲート、及びその調製方法及びその使用
WO2023104188A1 (en) Anti-cdh6 antibodies and antibody-drug conjugates thereof
WO2023102875A1 (en) Anti-cdh6 antibody drug conjugate
WO2024114667A1 (zh) 抗cldn18.2抗体药物偶联物及其药物组合物和用途
WO2024012523A1 (zh) 抗体药物偶联物及其制备方法和用途
WO2024114531A1 (zh) 杂环化合物及其制备方法和用途
WO2023046202A1 (zh) 一种抗体及其药物偶联物和用途