TW202339806A - ８—磺醯基—苯并氮呯免疫結合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供式I之免疫結合物，其包含藉由與一或多個8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯衍生物結合而鍵聯之抗體。本發明亦提供8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯衍生物中間物組合物，其包含反應性官能基。此類中間物組合物為適用於透過連接子或鍵聯部分形成該等免疫結合物之基質。本發明進一步提供用該等免疫結合物治療癌症之方法。

Description

8-磺醯基-苯并氮呯免疫結合物及其用途
本發明一般而言係關於一種免疫結合物，其包含結合至一或多個8-磺醯基-苯并氮呯分子之抗體。
為了達至不可及之腫瘤及/或擴大癌症患者及其他個體之治療選擇，需要用於遞送抗體及免疫佐劑之新組合物及方法。本發明提供此等組合物及方法。
本發明一般而言係關於一種免疫結合物，其包含選自抗-PD-L1、抗-HER2、抗-CEA及抗-TROP2之抗體，該抗體藉由連接子共價連接至一或多個具有下式之8-磺醯基-苯并氮呯TLR促效劑部分： 其中R 1、R 2、R 3及R 4中之一者連接至L。各個取代基如本文所定義。
本發明之另一態樣為一種藉由將一或多個 8-磺醯基-苯并氮呯-連接子化合物與選自抗-PD-L1、抗-HER2、抗-CEA及抗-TROP2之抗體結合來製備免疫結合物的方法。
本發明之另一態樣為一種醫藥組合物，其包含治療有效量之免疫結合物，該免疫結合物包含選自抗-PD-L1、抗-HER2、抗-CEA及抗-TROP2之抗體，該抗體藉由連接子共價連接至一或多個 8-磺醯基-苯并氮呯部分；及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、媒劑、載劑或賦形劑。
本發明之另一態樣為一種 8-磺醯基-苯并氮呯-連接子化合物。
本發明之另一態樣為一種用於治療癌症之方法，該方法包含投與治療有效量之免疫結合物，該免疫結合物包含選自抗-PD-L1、抗-HER2、抗-CEA及抗-TROP2之抗體，該抗體藉由連接子共價連接至一或多個 8-磺醯基-苯并氮呯部分。
本發明之另一態樣為一種免疫結合物用於治療疾病、尤其癌症之用途，該免疫結合物包含選自抗-PD-L1、抗-HER2、抗-CEA及抗-TROP2之抗體，該抗體藉由連接子共價連接至一或多個 8-磺醯基-苯并氮呯部分。
相關申請案之交叉引用
本非臨時申請案主張2022年2月9日申請之美國臨時申請案第63/308,275號之優先權益，該美國臨時申請案以引用方式整體併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以XML格式以電子方式提交且由此以引用之方式整體併入。該XML拷貝創建於 2023年1月24日，命名為17019.023WO1-TW1，大小為13,070位元組。
現將詳細參照本發明之某些實施例，該等實施例之實例以所附結構及式予以說明。雖然本發明將聯合所列舉之實施例來描述，但應理解其不意欲將本發明局限於彼等實施例。相反地，本發明意欲涵蓋可包括在如由申請專利範圍限定的本發明之範疇內的所有替代、修改、及等效物。
熟習此項技術者應認識到與本文所述之彼等相似或相等之多種方法及材料，其可能用於本發明之實踐。本發明決不限於所述方法及材料。 定義
術語「免疫結合物」或「免疫刺激性抗體結合物」係指經由連接子共價鍵結至佐劑部分之抗體構築體。術語「佐劑」係指能夠在暴露於佐劑之個體中引發免疫反應之物質。
「佐劑部分」係指如本文所述例如透過連接子共價鍵結至抗體構築體之佐劑。佐劑部分可在鍵結至抗體構築體時或在向個體投與免疫結合物後自抗體構築體裂解(例如酶促裂解)後引發免疫反應。
「佐劑」係指能夠在暴露於佐劑之個體中引發免疫反應之物質。
術語「類鐸受體(Toll-like receptor)」及「TLR」係指識別病原體相關分子模式且在先天免疫中充當主要傳訊元件之高度保守哺乳動物蛋白質家族之任何成員。TLR多肽共享一特徵結構，該特徵結構包括具有富白胺酸重複之細胞外結構域、跨膜結構域及參與TLR信號傳導之細胞內結構域。
術語「類鐸受體7」及「TLR7」係指與公眾可獲得之TLR7序列共享至少約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列一致性之核酸或多肽，該公眾可獲得之TLR7序列例如人類TLR7多肽之GenBank登錄號AAZ99026或鼠類TLR7多肽之GenBank登錄號AAK62676。
術語「類鐸受體8」及「TLR8」係指與公眾可獲得之TLR7序列共享至少約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列一致性之核酸或多肽，該公眾可獲得之TLR7序列例如人類TLR8多肽之GenBank登錄號AAZ95441或鼠類TLR8多肽之GenBank登錄號AAK62677。
「TLR促效劑」為直接或間接結合至TLR (例如，TLR7及/或TLR8)以誘導TLR傳訊之化合物。任何可偵測之TLR傳訊差異均可表明促效劑刺激或活化TLR。信號傳導差異可表現為例如以下各項之改變：目標基因之表現、信號轉導組分之磷酸化、下游元件(諸如核因子-κB (NF-κB))之細胞內定位、某些組分(諸如IL-1受體相關激酶(IRAK))與其他蛋白質或細胞內結構之締合或諸如激酶(諸如促***原活化之蛋白激酶(MAPK))之組分的生化活性。
「抗體」係指包含來自免疫球蛋白基因或其片段之抗原結合區(包括互補決定區(CDR))的多肽。術語「抗體」特定而言涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及展現所需生物活性之抗體片段。示範性免疫球蛋白(抗體)結構單元包括四聚體。各四聚體主要由兩對相同的多肽鏈組成，每一對具有藉由二硫鍵連接之一個「輕鏈」(約25 kDa)及一個「重鏈」(約50-70 kDa)。各鏈由結構域組成，該等結構域稱為免疫球蛋白域。此等域根據大小及功能分類為不同類別，例如輕鏈及重鏈上之可變域或可變區(分別為V L及V H)及輕鏈及重鏈上之恆定域或恆定區(分別為C L及C H)。各鏈之N端界定主要負責抗原識別(亦即，抗原結合域)的具有約100個至110個或更多個胺基酸之可變區，其稱為互補位。輕鏈歸類為κ或λ。重鏈被分類為γ、μ、α、δ或ε，其又分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。IgG抗體為約150 kDa之大分子，由四條肽鏈組成。IgG抗體含有兩條約50 kDa之一致γ類重鏈及兩條約25 kDa之一致輕鏈，因此為四聚四級結構。兩條重鏈彼此鍵聯且各自藉由二硫鍵鍵聯至輕鏈。所得四聚體具有一致之兩半，其一起形成Y樣形狀。叉形物之各末端含有一致之抗原結合結構域。人類中存在四個IgG子類(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)，以其在血清中之豐度順序命名(亦即，IgG1最豐富)。典型地，在結合於癌細胞之特異性及親和力中抗體之抗原結合域將最為關鍵。
「雙特異性」抗體(bsAb)為結合癌症之兩個不同表位之抗體(Suurs F.V.等人(2019) Pharmacology & Therapeutics201: 103-119)。雙特異性抗體可接合免疫細胞以破壞腫瘤細胞、將有效負荷遞送至腫瘤且/或阻斷腫瘤傳訊途徑。靶向特定抗原之抗體包括具有靶向該特定抗原之至少一個抗原結合區之雙特異性或多特異性抗體。在一些實施例中，靶向性單株抗體為具有靶向腫瘤細胞之至少一個抗原結合區之雙特異性抗體。此類抗原包括但不限於：間皮素、***特異性膜抗原(PSMA)、HER2、TROP2、CEA、EGFR、5T4、Nectin4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD70、B7H3、B7H4 (亦稱為08E)、蛋白酪氨酸激酶7 (PTK7)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3)、RG1、岩藻糖基-GMl、CTLA-4及CD44 (WO 2017/196598)。
在一些實施例中，抗體構築體為抗原結合抗體「片段」，其至少包含單獨或與一起構成抗體構築體之其他組分一起的抗體之抗原結合區。許多不同類型之抗體「片段」為此項技術中已知的，包括例如(i) Fab片段，其為由V L、V H、C L及CH 1結構域組成之單價片段；(ii) F(ab') 2片段，其為包含在鉸鏈區藉由二硫鍵鍵聯之兩個Fab片段的二價片段；(iii) Fv片段，其由抗體之單一臂之V L及V H結構域組成；(iv) Fab'片段，其由使用適度還原條件破壞F(ab') 2片段之二硫鍵產生；(v)二硫化物穩定之Fv片段(dsFv)；及(vi)單鏈Fv (scFv)，其為由藉由合成連接子連接之Fv片段之兩個結構域(亦即，V L及V H)組成之單價分子，該兩個結構域藉由合成連接子連接使得能夠將兩個結構域合成為單一多肽鏈。在一些實施例中，抗體構築體為包含(i)抗原結合域及(ii) Fc域之抗體或融合蛋白。
抗體或抗體片段可為較大構築體(例如抗體片段與其他區域之結合物或融合構築體)之一部分。舉例而言，在一些實施例中，抗體片段可融合至如本文所描述之Fc區。在其他實施例中，抗體片段(例如Fab或scFv)可為例如藉由融合至跨膜域(視情況具有中間連接子或「莖」(例如鉸鏈區))及視情況存在之細胞間傳訊域而得到的嵌合抗原受體或嵌合T細胞受體之一部分。舉例而言，抗體片段可融合至T細胞受體之γ及/或δ鏈，以便提供結合PD-L1之T細胞受體樣構築體。在另一實施例中，抗體片段為包含CD1或CD3結合域及連接子之雙特異性T細胞接合器(BiTE)之一部分。
在一些實施例中，抗體構築體包含Fc域。在某些實施例中，抗體構築體為抗體。在某些實施例中，抗體構築體為融合蛋白。抗原結合域可為單鏈可變區片段(scFv)。單鏈可變區片段(scFv)為包括經由合成肽鍵聯至抗體輕鏈之可變(V)結構域的抗體重鏈之V結構域的截短Fab片段，可使用常規重組DNA技術產生。類似地，二硫化物穩定之可變區片段(dsFv)可藉由重組DNA技術製備。抗體構築體或抗原結合域可包含抗CEA抗體之抗原結合域之一或多個可變區(例如兩個可變區)，各可變區包含CDR1、CDR2及CDR3。
「半胱胺酸突變抗體」為其中抗體之一或多個胺基酸殘基經半胱胺酸殘基取代之抗體。半胱胺酸突變抗體可藉由抗體工程化方法由母體抗體製備(Junutula等人, (2008b) Nature Biotech., 26(8):925-932；Dornan等人(2009) Blood114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；US 2012/0121615；WO 2009/052249)。半胱胺酸殘基提供佐劑諸如TLR促效劑於抗體透過工程化之半胱胺酸位點處之反應性半胱胺酸硫醇基團進行之位點特異性結合，但不會干擾免疫球蛋白折疊及組裝或改變抗原結合及效應功能。半胱胺酸突變抗體可以免疫結合物之均勻化學計量結合至TLR促效劑-連接子化合物(例如在具有單一工程化之突變半胱胺酸位點之抗體中每個抗體至多兩個TLR促效劑部分)。TLR促效劑-連接子化合物具有反應性親電基團，以與半胱胺酸突變抗體之遊離半胱胺酸硫醇基團特異性反應。
「表位」意指抗原之與抗原結合域(亦即，在抗原結合域之互補位處)結合的任何抗原決定位或表位決定位。抗原決定位通常由化學活性表面成組之分子(諸如胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定三維結構特徵，以及特定電荷特徵。
術語「Fc受體」或「FcR」係指結合於抗體之Fc區的受體。存在三種主要類別之Fc受體：(1) FcγR，其結合於IgG，(2) FcαR，其結合於IgA，及(3) FcεR，其結合於IgE。FcγR家族包括若干成員，諸如FcγI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16A)及FcγRIIIB (CD16B)。Fcγ受體對IgG之親和力不同且亦對IgG子類(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)具有不同親和力。
如本文所提及，核酸或胺基酸序列「一致性」可藉由將相關核酸或胺基酸序列與參考核酸或胺基酸序列相比較來確定。一致性百分比為最佳比對之相關序列與參考序列之間相同(亦即，一致)之核苷酸或胺基酸殘基數目除以最長序列之長度(亦即，相關序列或參考序列之長度，以較長者為準)。序列之比對及一致性百分比之計算可使用可獲得之軟體程式來進行。此等程式之實例包括CLUSTAL-W、T-Coffee及ALIGN (用於比對核酸及胺基酸序列)、BLAST程式(例如BLAST 2.1、BL2SEQ、BLASTp、BLASTn及類似程式)及FASTA程式(例如FASTA3x、FASTM及SSEARCH) (用於序列比對及序列相似性檢索)。序列比對算法亦揭示於例如Altschul等人, J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990)；Beigert等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009)；Durbin等人編, Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005)；Altschul等人, Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997)；及Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997))。序列一致性百分比(%)亦可例如經計算為100 x [(一致位置)/min(TG A、TG B)]，其中TG A及TG B為在使TG A及TG B最小化之比對中肽序列A及B中之殘基及內部空隙位置之數目的總和。參見例如Russell等人, J. Mol Biol., 244: 332-350 (1994)。
「抗體構築體」或「結合劑」包含一起形成抗原結合位點之Ig重鏈及輕鏈可變區多肽。重鏈及輕鏈可變區中之每一者為包含藉由構架區連接之三個互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)的多肽。抗體構築體可為此項技術中已知的包含Ig重鏈及輕鏈之多種類型結合劑中之任一者。舉例而言，結合劑可為抗體、抗原結合抗體「片段」或T細胞受體。
「生物類似物」係指經批准之抗體構築體，其活性特性類似於例如先前經批准之靶向PD-L1之抗體構築體，諸如阿特珠單抗(atezolizumab) (TECENTRIQ™，Genentech, Inc.)、德瓦魯單抗(durvalumab) (IMFINZI™，AstraZeneca)及阿維單抗(avelumab) (BAVENCIO™，EMD Serono, Pfizer)；先前經批准之靶向HER2之抗體構築體，諸如曲妥珠單抗(trastuzumab) (HERCEPTIN™，Genentech, Inc.)及帕妥珠單抗(pertuzumab) (PERJETA™，Genentech, Inc.)；或靶向CEA之抗體，諸如拉貝珠單抗(labetuzumab) (CEA-CIDE TM、MN-14、hMN14，Immunomedics) CAS登記號219649-07-7)。
「生物改良物(biobetter)」係指經批准之抗體構築體，其為諸如阿特珠單抗、德瓦魯單抗、阿維單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗及拉貝珠單抗之先前批准之抗體構築體的改良。生物改良物可相較於先前批准之抗體構築體具有一或多個修飾(例如改變之聚醣型態，或獨特表位)。
「胺基酸」係指可併入肽、多肽或蛋白質中之任何單體單元。胺基酸包括天然存在之α-胺基酸及其立體異構物，以及非天然(非天然存在之)胺基酸及其立體異構物。給定胺基酸之「立體異構物」係指分子式及分子內鍵相同但鍵及原子之三維排列不同之異構物(例如L-胺基酸及對應D-胺基酸)。胺基酸可經醣基化(例如 N-連接之聚醣、 O-連接之聚醣、磷酸聚醣、 C-連接之聚醣或糖基磷脂醯肌醇化(glypication))或去醣基化。在本文中可藉由通常已知之三字母符號或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會建議之一字母符號提及胺基酸。
天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼之彼等胺基酸，以及隨後經修飾之彼等胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及 O-磷酸絲胺酸。天然存在之α-胺基酸包括但不限於丙胺酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、***酸(Phe)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、天冬醯胺(Asn)、脯胺酸(Pro)、麩醯胺(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)及其組合。天然存在之α-胺基酸之立體異構物包括但不限於D-丙胺酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬胺酸(D-Asp)、D-麩胺酸(D-Glu)、D-***酸(D-Phe)、D-組胺酸(D-His)、D-異白胺酸(D-Ile)、D-精胺酸(D-Arg)、D-離胺酸(D-Lys)、D-白胺酸(D-Leu)、D-甲硫胺酸(D-Met)、D-天冬醯胺(D-Asn)、D-脯胺酸(D-Pro)、D-麩醯胺(D-Gln)、D-絲胺酸(D-Ser)、D-蘇胺酸(D-Thr)、D-纈胺酸(D-Val)、D-色胺酸(D-Trp)、D-酪胺酸(D-Tyr)及其組合。
天然存在之胺基酸包括在蛋白質中藉由轉譯後修飾形成之彼等胺基酸，諸如瓜胺酸(Cit)。
非天然(非天然存在之)胺基酸包括但不限於呈L-組態或D-組態之胺基酸類似物、胺基酸模擬物、合成胺基酸、 N-取代甘胺酸及 N-甲基胺基酸，其以類似於天然存在之胺基酸的方式發揮功能。舉例而言，「胺基酸類似物」可為非天然胺基酸，其與天然存在之胺基酸具有相同基本化學結構(亦即，鍵結至氫、羧基、胺基之碳)，但具有經修飾之側鏈基團或經修飾之肽骨架，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸及甲硫胺酸甲基鋶。「胺基酸模擬物」係指結構不同於胺基酸之一般化學結構，但以類似於天然存在之胺基酸的方式發揮功能的化合物。
「連接子」係指共價鍵結化合物或材料中之兩個或更多個部分之官能基。舉例而言，連接部分可用以在免疫結合物中使佐劑部分共價鍵結至抗體構築體。
「連接部分」係指共價鍵結化合物或材料中之兩個或更多個部分的官能基。舉例而言，連接部分可用以在免疫結合物中使佐劑部分共價鍵結至抗體。適合用於將連接部分連接至蛋白質及其他材料之鍵包括但不限於醯胺、胺、酯、胺基甲酸酯、尿素、硫醚、硫代胺基甲酸酯、硫代碳酸酯及硫脲。
「二價」係指含有用於連接兩個官能基之兩個連接點的化學部分；多價連接部分可具有用於連接進一步官能基之額外連接點。二價基團可用後綴「二基」表示。舉例而言，二價連接部分包括二價聚合物部分，諸如二價聚(乙二醇)、二價環烷基、二價雜環烷基、二價芳基及二價雜芳基。「二價環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基」係指具有用於共價連接分子或材料中之兩個部分之兩個連接點的環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基。環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基可經取代或未經取代。環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基可經選自以下之一或多個基團取代：鹵基、羥基、胺基、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基。
波浪線(「 」)表示指定化學部分之連接點。若指定化學部分有兩個波浪線(「 」)存在，則應瞭解該化學部分可雙向使用，亦即，如自左至右或自右至左讀取。在一些實施例中，指定部分有兩個波浪線(「 」)存在被視為如自左至右讀取進行使用。
「烷基」係指具有所指示之碳原子數目的直鏈(線性)或分支鏈、飽和、脂族基。烷基可包括任何數目之碳，例如一個至十二個。烷基之實例包括但不限於甲基(Me，-CH 3)、乙基(Et，-CH 2CH 3)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH 2CH 2CH 3)、2-丙基(i-Pr，異丙基，-CH(CH 3) 2)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH 2CH 2CH 2CH 3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，異丁基，-CH 2CH(CH 3) 2)、2-丁基(s-Bu，第二丁基，-CH(CH 3)CH 2CH 3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，三級丁基，-C(CH 3) 3)、1-戊基(正戊基，-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 3)、2-戊基(-CH(CH 3)CH 2CH 2CH 3)、3-戊基(-CH(CH 2CH 3) 2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH 3) 2CH 2CH 3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH 3)CH(CH 3) 2)、3-甲基-1-丁基(-CH 2CH 2CH(CH 3) 2)、2-甲基-1-丁基(-CH 2CH(CH 3)CH 2CH 3)、1-己基(-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 3)、2-己基(-CH(CH 3)CH 2CH 2CH 2CH 3)、3-己基(-CH(CH 2CH 3)(CH 2CH 2CH 3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH 3) 2CH 2CH 2CH 3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH 3)CH(CH 3)CH 2CH 3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH 3)CH 2CH(CH 3) 2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH 3)(CH 2CH 3) 2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH 2CH 3)CH(CH 3) 2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH 3) 2CH(CH 3) 2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH 3)C(CH 3) 3、1-庚基、1-辛基及類似基團。烷基可經取代或未經取代。「經取代之烷基」可經選自以下之一或多個基團取代：鹵基、羥基、胺基、側氧基(=O)、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基。
術語「烷基二基」係指二價烷基。烷基二基之實例包括但不限於亞甲基(-CH 2-)、伸乙基(-CH 2CH 2-)、伸丙基(-CH 2CH 2CH 2-)及類似基團。烷基二基基團亦可稱為「伸烷基」。
「烯基」係指具有所指示之碳原子數目及至少一個碳-碳雙鍵( sp2)之直鏈(線性)或分支鏈、不飽和、脂族基。烯基可包括兩個至約12個或更多個碳原子。烯基為具有「順式」及「反式」取向或者「E」及「Z」取向之基團。實例包括但不限於乙烯基(ethylenyl/vinyl) (-CH=CH 2)、烯丙基(-CH 2CH=CH 2)、丁烯基、戊烯基及其異構物。烯基可經取代或未經取代。「經取代之烯基」可經選自以下之一或多個基團取代：鹵基、羥基、胺基、側氧基(=O)、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基。
術語「伸烯基」或「烯基二基」係指直鏈或分支鏈二價烴基。實例包括但不限於伸乙烯基(ethylenylene/vinylene) (-CH=CH-)、烯丙基(-CH 2CH=CH-)及類似基團。
「炔基」係指具有所指示之碳原子數目及至少一個碳-碳三鍵( sp)之直鏈(線性)或分支鏈、不飽和、脂族基。炔基可包括兩個至約12個或更多個碳原子。舉例而言，C 2-C 6炔基包括但不限於乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基，-CH 2C≡CH)、丁炔基、戊炔基、己炔基及其異構物。炔基可經取代或未經取代。「經取代之炔基」可經選自以下之一或多個基團取代：鹵基、羥基、胺基、側氧基(=O)、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基。
術語「伸炔基」或「炔基二基」係指二價炔基。
術語「碳環(carbocycle)」、「碳環基」、「碳環(carbocyclic ring)」及「環烷基」係指含有3至12個環原子或所指示之原子數目的飽和或部分不飽和、單環、稠合雙環或橋接多環組件。飽和單環碳環包括例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環辛基。飽和雙環及多環碳環包括例如降莰烷(norbornane)、[2.2.2]二環辛烷、十氫萘及金剛烷。碳環基亦可為部分不飽和的，環中具有一或多個雙鍵或三鍵。代表性部分不飽和之碳環基包括但不限於環丁烯、環戊烯、環己烯、環己二烯(1,3-異構體及1,4-異構體)、環庚烯、環庚二烯、環辛烯、環辛二烯(1,3-異構體、1,4-異構體及1,5-異構體)、降冰片烯及降冰片二烯。
術語「環烷基二基」係指二價環烷基。
「芳基」係指藉由自母體芳族環系統之單一碳原子移除一個氫原子衍生而來之6-20個碳原子(C 6-C 20)的單價芳族烴基。芳基可為單環，經稠合形成雙環或三環基團，或由鍵連接形成二芳基。代表性芳基包括苯基、萘基及聯苯基。其他芳基包括苯甲基，其具有亞甲基連接基團。一些芳基具有6至12個環成員，諸如苯基、萘基或聯苯基。其他芳基具有6至10個環成員，諸如苯基或萘基。
術語「伸芳基」或「芳基二基」意謂藉由自母體芳族環系統之兩個碳原子移除兩個氫原子衍生而來之6-20個碳原子(C 6-C 20)的二價芳族烴基。一些芳基二基在示範性結構中表示為「Ar」。芳基二基包括包含稠合至飽和、部分不飽和環或芳族碳環之芳族環的雙環基團。典型芳基二基包括但不限於衍生自苯之基團(苯基二基)、經取代苯、萘、蒽、伸聯苯基、伸茚基、伸茚滿基、1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫萘基及類似基團。芳基二基亦稱為「伸芳基」，且視情況經本文所描述之一或多個取代基取代。
術語「雜環(heterocycle)」、「雜環基」及「雜環(heterocyclic ring)」在本文中可互換使用且係指3至約20個環原子之飽和或部分不飽和(亦即，環內具有一或多個雙鍵及/或三鍵)碳環基團，其中至少一個環原子為選自氮、氧、磷及硫之雜原子，剩餘環原子為C，其中一或多個環原子視情況獨立地經下文所描述之一或多個取代基取代。雜環可為具有3至7個環成員(2至6個碳原子及1至4個選自N、O、P及S之雜原子)之單環或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至6個選自N、O、P及S之雜原子)之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。雜環描述於Paquette, Leo A.; 「 Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」 (W.A. Benjamin, New York, 1968), 尤其第1、3、4、6、7及9章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs」 (John Wiley & Sons, New York, 1950至現在)，特別為第13、14、16、19及28章；及J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566。「雜環基」亦包括雜環基團與飽和、部分不飽和環或芳族碳環或雜環稠合之基團。雜環之實例包括但不限於嗎啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯啶-1-基、硫代嗎啉-4-基、S-二側氧基硫代嗎啉-4-基、氮雜環辛烷-1-基、氮雜環丁烷-1-基、八氫吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮雜環庚烷-1-基、吡咯啶基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫哌喃基、二氫哌喃基、四氫噻喃基、N-哌啶基、N-嗎啉基、N-硫代嗎啉基、噻噁烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基、硫雜環丁烷基、高哌啶基、氧雜環庚烷基、硫雜環庚烷基、氧氮呯基、二氮呯基、噻氮呯基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、2H-哌喃基、4H-哌喃基、二氧雜環己烷基、1,3-二氧雜環戊烷基、吡唑啉基、二硫雜環己烷基、二硫雜環戊烷基、二氫哌喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑啶基咪唑啉基、咪唑啶基、3-氮雜雙環[3.1.0]己基、3-氮雜雙環[4.1.0]庚基、氮雜雙環[2.2.2]己基、3H-吲哚基喹嗪基及N-吡啶基脲。螺雜環基部分亦包括在此定義之範疇內。螺雜環基部分之實例包括氮雜螺[2.5]辛基及氮雜螺[2.4]庚基。其中2個環原子經側氧基(=O)部分取代之雜環基之實例為嘧啶酮基及1,1-二側氧基-硫代嗎啉基。本文之雜環基團視情況獨立地經本文所描述之一或多個取代基取代。
術語「雜環基二基」係指3至約20個環原子之二價、飽和或部分不飽和(亦即，環內具有一或多個雙鍵及/或三鍵)碳環基團，其中至少一個環原子為選自氮、氧、磷及硫之雜原子，剩餘環原子為C，其中一或多個環原子視情況獨立地經如所描述之一或多個取代基取代。5-員及6-員雜環基二基之實例包括嗎啉基二基、哌啶基二基、哌嗪基二基、吡咯啶基二基、二氧雜環己烷基二基、硫代嗎啉基二基及S-二側氧基硫代嗎啉基二基。
術語「雜芳基」係指5-員、6-員或7-員環之單價芳族基團，且包括5-20個原子之稠環系統(其中之至少一者為芳族環)，其含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子。雜芳基之實例為吡啶基(包括例如2-羥基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如，4-羥基嘧啶基)、吡唑基、***基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、四氫異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚嗪基、酞嗪基、噠嗪基、三嗪基、異吲哚基、喋啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋吖基、苯并呋吖基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喏啉基、萘啶基及呋喃并吡啶基。雜芳基視情況獨立地經本文所描述之一或多個取代基取代。
術語「雜芳基二基」係指5-員、6-員或7-員環之二價芳族基團，且包括5-20個原子之稠環系統(其中之至少一者為芳族環)，其含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子。5-員及6-員雜芳基二基之實例包括吡啶基二基、咪唑基二基、嘧啶基二基、吡唑基二基、***基二基、吡嗪基二基、四唑基二基、呋喃基二基、噻吩基二基、異噁唑基二基、噻唑基二基、噁二唑基二基、噁唑基二基、異噻唑基二基及吡咯基二基。
雜環或雜芳基可在可能之情況下為碳(碳連接)或氮(氮連接)鍵結的。舉例而言且不限於，碳鍵結之雜環或雜芳基係鍵結於吡啶之位置2、3、4、5或6；噠嗪之位置3、4、5或6；嘧啶之位置2、4、5或6；吡嗪之位置2、3、5或6；呋喃、四氫呋喃、硫呋喃(thiofuran)、噻吩(thiophene)、吡咯或四氫吡咯之位置2、3、4或5；噁唑、咪唑或噻唑之位置2、4或5；異噁唑、吡唑或異噻唑之位置3、4或5；氮雜環丙烷之位置2或3；氮雜環丁烷之位置2、3或4；喹啉之位置2、3、4、5、6、7或8；或異喹啉之位置1、3、4、5、6、7或8。
舉例而言且不限於，氮鍵結之雜環或雜芳基係鍵結於氮雜環丙烷、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氫吲哚、1H-吲唑之位置1；異吲哚或異吲哚啉之位置2；嗎啉之位置4；及咔唑或β-咔啉之位置9。
術語「鹵基」及「鹵素」單獨或作為另一取代基之一部分係指氟、氯、溴或碘原子。
術語「羰基」單獨或作為另一取代基之一部分係指C(=O)或-C(=O)-，亦即，碳原子雙鍵鍵結至氧且結合於具有羰基之部分中之兩個其他基團。
如本文所用，片語「四級銨鹽」係指已經烷基取代基(例如C 1-C 4烷基，諸如甲基、乙基、丙基或丁基)四級化之三級胺。
術語「治療(treat/treatment/treating)」係指成功治療或改善損傷、病變、疾患(例如癌症)或症狀(例如認知損傷)之任何標誌，包括任何客觀或主觀參數，諸如消除；緩和；症狀減少或使症狀、損傷、病變或疾患對患者而言更可容忍；症狀進展速率降低；症狀或疾患之頻率降低或持續時間縮短；或者在一些情況下，防止症狀發作。症狀之治療或改善可基於任何客觀或主觀參數，包括例如身體檢查之結果。
術語「癌症」、「贅瘤」及「腫瘤」在本文中用於指如下細胞，該等細胞展現自發、不受調控的生長，使得細胞展現以明顯失去對細胞增殖之控制為特徵的異常生長表型。在本發明之情形中用於偵測、分析及/或處理之相關細胞包括癌細胞(例如來自患有癌症之個體的癌細胞)、惡性癌細胞、轉移前癌細胞、轉移性癌細胞及非轉移性癌細胞。幾乎每個組織之癌症皆為已知的。片語「癌症負荷」係指個體中癌細胞之量或癌症體積。因此，降低之癌症負荷係指個體中降低之癌細胞數目或癌細胞體積。如本文所用之術語「癌細胞」係指作為癌細胞(例如來自可對個體進行治療之癌症中之任一者的癌細胞，例如自患有癌症之個體分離的癌細胞)或衍生自癌細胞(例如癌細胞純系)的任何細胞。舉例而言，癌細胞可來自已建立之癌細胞株，可為自患有癌症之個體分離的原代細胞，可為來自自患有癌症之個體分離的原代細胞之後代細胞，及類似情況。在一些實施例中，該術語亦可指癌細胞之一部分，諸如亞細胞部分、細胞膜部分或癌細胞之細胞溶解產物。許多類型之癌症為熟習此項技術者已知的，包括實體腫瘤，諸如癌瘤、肉瘤、膠質母細胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤及骨髓瘤；及循環癌症，諸如白血病。
如本文所用，術語「癌症」包括任何形式之癌症，包括但不限於實體腫瘤癌症(例如皮膚癌、肺癌、***癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、膠質母細胞瘤、神經管母細胞瘤、平滑肌肉瘤、頭頸鱗狀細胞癌、黑色素瘤及神經內分泌癌)及液體癌(例如血液癌)；癌瘤；軟組織腫瘤；肉瘤；畸胎瘤；黑色素瘤；白血病；淋巴瘤；及腦癌，包括微小殘留病，且包括原發性腫瘤與轉移性腫瘤兩者。
「PD-L1表現」係指在細胞表面上具有PD-L1受體之細胞。如本文所用，「PD-L1過表現」係指與對應非癌細胞相比具有更多PD-L1受體之細胞。
「HER2」係指蛋白質人類表皮生長因子受體2。
「HER2表現」係指在細胞表面上具有HER2受體之細胞。舉例而言，細胞可在細胞表面上具有約20,000至約50,000個HER2受體。如本文所用，「HER2過表現」係指具有多於約50,000個HER2受體之細胞。舉例而言，與對應非癌細胞(例如約1或2百萬個HER2受體)相比，細胞具有2、5、10、100、1,000、10,000、100,000或1,000,000倍數目之HER2受體。據估計，在約25%至約30%之乳癌中HER2過表現。
癌症之「病變」包括損害患者健康之所有現象。此包括但不限於異常或不可控制之細胞生長；轉移；干擾相鄰細胞之正常功能；細胞因子或其他分泌產物之異常水準之釋放；炎性或免疫反應之抑制或加重；瘤形成；癌前病變；惡性腫瘤；及侵入周圍或遠處組織或器官，諸如淋巴結。
如本文所用，片語「癌症複發」及「腫瘤複發」及其語法變化型式係指在癌症診斷之後贅生性細胞或癌性細胞之進一步生長。特定而言，當癌組織中發生進一步癌性細胞生長時可發生複發。類似地，當腫瘤細胞播散至局部或遠處組織及器官中時，發生「腫瘤擴散」，因此，腫瘤擴散涵蓋腫瘤轉移。當腫瘤生長局部擴散從而藉由壓制、破壞或阻止正常器官功能損害累及組織之功能時，發生「腫瘤侵入」。
如本文所用，術語「轉移」係指不直接連接至原始癌性腫瘤器官之器官或身體部位中之癌性腫瘤生長。轉移將被理解為包括微轉移，其為在不直接連接至原始癌性腫瘤器官之器官或身體部位中存在不可偵測量之癌性細胞。轉移亦可定義為若干步驟之過程，諸如癌細胞偏離原始腫瘤位點及癌細胞遷移至及/或侵入身體之其他部位。
片語「有效量」及「治療有效量」係指諸如免疫結合物之物質產生投與所要達成之治療效應的劑量或量。確切劑量將視治療目的而定，且將可由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar, Dosage Calculations(1999)； Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第11版(McGraw-Hill, 2006)；及Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版, (Pharmaceutical Press, London, 2012))。在癌症之情況下，治療有效量之免疫結合物可降低癌細胞數目；減小腫瘤尺寸；抑制(亦即，在某種程度上減慢且較佳阻止)癌細胞浸潤至外周器官中；抑制(亦即，在某種程度上減慢且較佳阻止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上緩解與癌症相關之症狀中之一或多者。在免疫結合物可阻止生長及/或殺死現有癌細胞之情況下，其可為細胞抑制性的及/或細胞毒性的。在癌症治療中，可例如藉由評估疾病進展時間(TTP)及/或確定反應率(RR)來量測功效。
「接受者」、「個體(individual/subject)」、「宿主」及「患者」可互換使用且係指需要診斷、治療或療法之任何哺乳動物個體(例如人類)。用於治療目的之「哺乳動物」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家養動物及農場動物以及動物園動物、運動動物或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬、駱駝等。在某些實施例中，哺乳動物為人類。
片語「協同佐劑」或「協同組合」在本發明之背景下包括兩種免疫調節劑(諸如受體促效劑、細胞介素及佐劑多肽)之組合，該兩種免疫調節劑相對於單獨投與任一者而言在組合中引發對免疫性之協同效應。特定而言，本文所揭示之免疫結合物包含所主張之佐劑及抗體構築體之協同組合。例如相對於當在不存在另一部分之情況下投與抗體構築體或佐劑時，此等協同組合在投與後對免疫性引發更大的效應。另外，與單獨投與抗體構築體或佐劑時相比，可投與降低量之免疫結合物(如藉由作為免疫結合物之一部分而投與之抗體構築體的總數目或佐劑的總數目所量測)。
如本文所用，術語「投與」係指向個體非經腸、靜脈內、腹膜內、肌內、瘤內、病損內、鼻內或皮下投與、經口投與、作為栓劑投與、局部接觸、鞘內投與或植入緩釋裝置，例如微型滲透泵。
如本文用於修飾數值之術語「約」及「大約」表示數值周圍近距離之範圍。因此，若「X」為該值，則「約X」或「大約X」指示0.9X至1.1X，例如0.95X至1.05X或0.99X至1.01X之值。提及「約X」或「大約X」特定而言至少表示值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X及1.05X。因此，「約X」及「大約X」旨在教示且為例如「0.98X」之請求項限制提供書面描述支持。 抗體
在一示範性實施例中，本發明之免疫結合物包含抗體構築體，該抗體構築體包含特異性識別及結合PD-L1之抗原結合域。
程式化死亡配體1 (PD-L1、分化簇274、CD274、B7-同源物1或B7-H1)屬於B7蛋白質超家族，且為程式化細胞死亡蛋白1 (PD-1、PDCD1、分化簇279或CD279)之配體。PD-L1亦可與B7.1 (CD80)相互作用且該相互作用咸信抑制T細胞啟動。PD-L1/PD-1軸在抑制適應性免疫反應中發揮巨大作用。更特定而言，咸信PD-L1與其受體PD-1之接合遞送抑制T細胞活化及增殖之信號。結合於PD-L1且防止配體結合於PD-1受體之劑防止此免疫抑制，且因此，可在需要時(諸如在癌症或感染之治療中)增強免疫反應。PD-L1/PD-1途徑亦促進阻止自體免疫且因此針對PD-L1之促效劑或遞送免疫抑制性有效負荷之劑可幫助治療自體免疫病症。
已研發若干靶向PD-L1之抗體用於治療癌症，包括阿特珠單抗(TECENTRIQ TM)、德瓦魯單抗(IMFINZI TM)及阿維單抗(BAVENCIO TM)。然而，持續需要新的PD-L1抗體構築體，包括以高親和力結合PD-L1且有效阻止PD-L1/PD-1傳訊之劑及可將治療有效負荷遞送至表現PD-L1之細胞之劑。此外，對用於治療自體免疫病症及感染之新的PD-L1結合劑存在需要。
提供一種將TLR促效劑有效負荷遞送至表現PD-L1之細胞的方法，該方法包括向該細胞或包含該細胞之哺乳動物投與免疫結合物，該免疫結合物包含共價連接至連接子之抗PD-L1抗體，該連接子共價連接至一或多個TLR促效劑部分。
亦提供一種用於增強或降低或抑制哺乳動物中之免疫反應的方法，及一種用於治療哺乳動物之對PD-L1抑制有反應之疾病、病症或疾患的方法，該等方法包括向哺乳動物投與其PD-L1免疫結合物。
本發明提供一種包含免疫球蛋白重鏈可變區多肽及免疫球蛋白輕鏈可變區多肽之PD-L1抗體。PD-L1抗體特異性結合PD-L1。抗體之結合特異性允許靶向表現PD-L1之細胞，例如將治療有效負荷遞送至此等細胞。在一些實施例中，PD-L1抗體結合於人類PD-L1。然而，亦涵蓋結合於任何PD-L1片段、同源物或旁系同源物之抗體。
在一些實施例中，PD-L1抗體結合PD-L1而不實質上抑制或阻止PD-L1結合於其受體PD-1。然而，在其他實施例中，PD-L1抗體可完全或部分阻斷(抑制或阻止) PD-L1結合至其受體PD-1，使得抗體可用於抑制PD-L1/PD-1傳訊(例如出於治療目的)。抗體或抗原結合抗體片段可對PD-L1具單特異性，或可為雙特異性或多特異性的。舉例而言，在二價或多價抗體或抗體片段中，結合域可為不同的，靶向相同抗原之不同表位或靶向不同抗原。構築多價結合構築體之方法為此項技術中已知的。雙特異性及多特異性抗體為此項技術中已知的。此外，可提供雙抗體、三抗體或四抗體，其為多肽鏈之二聚體、三聚體或四聚體，其各自包含藉由肽連接子連接至V L之V H，該肽連接子太短而不允許相同多肽鏈上之V H與V L之間配對，由此驅使不同V H-V L多肽鏈上之互補域之間配對，從而產生具有兩個、三個或四個功能性抗原結合位點的多聚分子。另外，可產生作為具有兩個不同可變域之小scFv片段的雙scFv片段，以產生能夠結合兩個不同表位之雙特異性雙scFv片段。Fab二聚體(Fab2)及Fab三聚體(Fab3)可使用基因工程化方法形成基於Fab片段之多特異性構築體來產生。
PD-L1抗體可為或可獲自人類抗體、非人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體或對應抗體片段。「嵌合」抗體為典型地包含人類恆定區及非人類可變區之抗體或其片段。「人類化」抗體為典型地包含人類抗體支架但在至少一個CDR (例如1、2、3、4、5或所有六個CDR)中具有非人類來源胺基酸或序列之單株抗體。
PD-L1抗體可為內化的，如WO 2021/150701中所述且以引用方式併入本文中，或PD-L1抗體可為非內化的，如WO 2021/150702中所述且以引用方式併入本文中。
在一示範性實施例中，本發明之免疫結合物包含抗體構築體，該抗體構築體包含特異性識別及結合HER2之抗原結合域。
許多抗-HER2單株抗體已獲批准且正在臨床開發中(Costa, RLB等人(2020) Breast Cancer6(10):1-11。
在某些實施例中，本發明之免疫結合物包含抗HER2抗體，諸如藉由實例201之方法製備之彼等者。在本發明之一個實施例中，本發明之免疫結合物之抗HER2抗體包含如US 5821337之表3中所描述的人類化抗HER2抗體，例如huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7及huMAb4D5-8，該專利特定地以引用之方式併入本文中。彼等抗體含有人類構架區與結合於HER2之鼠抗體(4D5)之互補決定區。人類化抗體huMAb4D5-8亦稱為曲妥珠單抗，可以商標名HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.)商購獲得。
曲妥珠單抗(CAS 180288-69-1、HERCEPTIN®、huMAb4D5-8、rhuMAb HER2，Genentech)為重組DNA衍生之IgG1κ單株抗體，其為在基於細胞之檢定中以高親和力(Kd = 5 nM)選擇性結合至HER2之細胞外域的鼠抗HER2抗體(4D5)之人類化型式(US 5677171；US 5821337；US 6054297；US 6165464；US 6339142；US 6407213；US 6639055；US 6719971；US 6800738；US 7074404；Coussens等人(1985) Science 230:1132-9；Slamon等人(1989) Science 244:707-12；Slamon等人(2001) New Engl. J. Med. 344:783-792)。
在本發明之一實施例中，抗體構築體或抗原結合域包含曲妥珠單抗之CDR區。在本發明之一實施例中，抗HER2抗體進一步包含曲妥珠單抗之構架區。在本發明之一實施例中，抗HER2抗體進一步包含曲妥珠單抗之一個或兩個可變區。
在本發明之另一實施例中，本發明之免疫結合物之抗HER2抗體包含如US 7862817中所描述之人類化抗HER2抗體，例如人類化2C4。示範性人類化2C4抗體為帕妥珠單抗(CAS登記號380610-27-5)，PERJETA™ (Genentech, Inc.)。帕妥珠單抗為HER二聚化抑制劑(HDI)且用以抑制HER2與其他HER受體(諸如EGFR/HER1、HER2、HER3及HER4)形成活性異二聚體或均二聚體之能力。參見例如Harari及Yarden, Oncogene 19:6102-14 (2000)；Yarden及Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol2:127-37 (2001)；Sliwkowski Nat Struct Biol10:158-9 (2003)；Cho等人 Nature421:756-60 (2003)；及Malik等人 Pro Am Soc Cancer Res44:176-7 (2003)。PERJETA™經批准用於治療乳癌。
在本發明之一實施例中，抗體構築體或抗原結合域包含帕妥珠單抗之CDR區。在本發明之一實施例中，抗HER2抗體進一步包含帕妥珠單抗之構架區。在本發明之一實施例中，抗HER2抗體進一步包含帕妥珠單抗之一個或兩個可變區。
馬吉妥昔單抗(Margetuximab) (MGAH22, MARGENZA™, MacroGenics, Inc.)，CAS登記號1350624-75-7，為經FDA批准之抗HER2單株抗體。馬吉妥昔單抗之Fc區經最佳化以增加與活化性FcγR之結合，但降低與免疫效應細胞上之抑制性Fc.γ.R之結合(Nordstrom, JL等人(2011) Breast Cancer Res.13(6):R123；Rugo, HS等人 (2021) JAMA Oncol.;7(4):573-584；Markham, A. (2021) Drugs81:599–604)。馬吉妥昔單抗經FDA批准用於治療患有複發性或難治性晚期乳癌之患者，該患者藉由免疫組織化學被確定其腫瘤表現2+水準之HER2且藉由FISH被確定缺乏HER2基因擴增證據。
HT-19為另一種抗HER2單株抗體，其結合至人類HER2中與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗之表位不同之表位。HT-19已顯示與曲妥珠單抗相當地抑制HER2傳訊且與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗組合增強HER2降解。XMT-1522為包含HT-19抗體之抗體-藥物結合物(Bergstrom D. A.等人, (2015) Cancer Res.; 75:LB-231)。
在一示範性實施例中，本發明之免疫結合物包含抗體構築體，該抗體構築體包含特異性識別及結合CEA之抗原結合域。癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5)亦稱為CD66e (分化簇66e)，為癌胚抗原(CEA)基因家族之成員。
在瘤形成之各種生物態樣中已涉及癌胚抗原(CEA、CD66e、CEACAM5)之表現升高，尤其腫瘤細胞黏附、轉移、阻斷細胞免疫機制及具有抗凋亡功能。CEA亦用作許多癌瘤之血液標記物。拉貝珠單抗(CEA-CIDE TM，Immunomedics，CAS登記號219649-07-7)亦稱為MN-14及hMN14，為人類化IgG1單株抗體且已針對治療結腸直腸癌進行了研究(Blumenthal, R.等人(2005) Cancer Immunology Immunotherapy 54(4):315-327)。結合至喜樹鹼類似物之拉貝珠單抗(拉貝珠單抗戈維替康(labetuzumab govitecan)，IMMU-130)靶向癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5)且正在患有複發性或難治性轉移性結腸直腸癌之患者中進行研究(Sharkey, R.等人, (2018), Molecular Cancer Therapeutics 17(1):196-203；Cardillo, T.等人(2018) Molecular Cancer Therapeutics 17(1):150-160)。在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含如US 6676924中揭示之hMN-14/拉貝珠單抗之可變輕鏈(VL κ)，該專利出於此目的以引用方式併入本文。
在一示範性實施例中，本發明之免疫結合物包含抗體構築體，該抗體構築體包含特異性識別及結合TROP2之抗原結合域。腫瘤相關鈣信號轉導蛋白2 (TROP-2)為經TACSTD2基因編碼之跨膜醣蛋白 (Linnenbach AJ等人(1993) Mol Cell Biol. 13(3):1507–15；Calabrese G等人 (2001) Cytogenet Cell Genet.92(1–2):164–5)。TROP2係一種細胞內鈣信號轉導蛋白，在許多癌症中差異表現並向細胞發自我更新、增殖、侵入及存活之信號。TROP2 被視為一種幹細胞標記物且在許多正常組織中表現，儘管相比之下，其在許多癌症中過表現 (Ohmachi T等人, (2006) Clin.Cancer Res., 12(10), 3057-3063；Muhlmann G等人, (2009) Pathol., 62(2), 152-158；Fong D等人, (2008) Br. J. Cancer, 99(8), 1290-1295；Fong D等人, (2008) Mod. Pathol., 21(2), 186-191；Ning S等人, (2013) Neurol. Sci., 34(10), 1745-1750)。TROP2之過表現具有預後意義。已提出與TROP2相互作用之若干配體。TROP2藉由不同途徑向細胞發信號且其藉由若干轉錄因子之複雜網絡來轉錄調控。
人類TROP2 (TACSTD2：腫瘤相關性鈣信號轉導蛋白2，GA733-1，EGP-1，M1S1；在下文中稱為hTROP2)為由323個胺基酸殘基組成之單次跨膜1型細胞膜蛋白。雖然先前已表明存在參與免疫抗性且為人類滋養層及癌症細胞常見之細胞膜蛋白(Faulk W P等人, Proc.Natl. Acad.Sci.75(4):1947-1951 (1978))，但鑑定了在人類絨毛膜癌細胞株中由針對細胞膜蛋白之單株抗體識別之抗原分子並將其指定為TROP2作為在人類滋養層中表現的分子之一 (Lipinski M等人, Proc.Natl. Acad.Sci. 78(8), 5147-5150 (1981))。該分子亦經指定為經藉由用胃癌細胞株免疫來獲得之小鼠單株抗體GA733識別的腫瘤抗原GA733-1 (Linnenbach A J等人, Proc. Natl. Acad. Sci.86(1), 27-31 (1989))或經藉由用非小細胞肺癌細胞免疫來獲得之小鼠單株抗體RS7-3G11識別的上皮醣蛋白(EGP-1；Basu A等人, Int. J. Cancer, 62 (4), 472-479 (1995))。然而，在1995年，對TROP2基因進行選殖，且確認所有此等分子為相同分子(Fornaro M等人, Int. J. Cancer, 62(5), 610-618 (1995))。hTROP2之DNA序列及胺基酸序列在公共資料庫上可獲得且可例如以登錄號NM_002353及NP_002344 (NCBI)提及。
回應於表明與癌症相關之此類資訊，迄今已建立多種抗hTROP2抗體且研究了其抗腫瘤作用。在此等抗體中，揭示了例如一種本身在裸小鼠異種移植物模型中表現出抗腫瘤活性之未經結合抗體(WO 2008/144891；WO 2011/145744；WO 2011/155579；WO 2013/077458)以及一種作為具有細胞毒性藥物之ADC表現出抗腫瘤活性的抗體(WO 2003/074566；WO 2011/068845；WO 2013/068946；US 7999083)。然而，其活性之強度或覆蓋率仍不足，且對於作為治療標靶之hTROP2存在尚未滿足之醫學需求。
癌細胞中之TROP2表現已與藥物抗性相關聯。若干策略靶向癌細胞上之TROP2，該等策略包括抗體、抗體融合蛋白、化學抑制劑、納米粒子等。使用此等各種治療性治療進行之活體外研究及臨床前研究導致在小鼠中腫瘤細胞生長在活體外及活體內均受到顯著抑制。臨床研究已探索TROP2作為預後生物標誌物及作為逆轉抗性之治療性標靶二者的潛在應用。
戈沙妥組單抗(Sacituzumab govitecan，TRODELVY®，Immunomedics，IMMU-132)為包含連接至拓樸異構酶抑制劑藥物之TROP2定向抗體的抗體-藥物結合物，經指示用於治療已接受至少兩種先前療法之成人患者之轉移性三陰性乳癌(mTNBC)。戈沙妥組單抗中之TROP2抗體結合至伊立替康(irinotecan)之活性代謝物SN-38 (US 2016/0297890；WO 2015/098099)。
在本發明之一實施例中，靶向TROP2之抗體構築體或抗原結合域包含hRS7 (人類化RS7)之輕鏈CDR (互補決定區) (US 7238785，其以引用方式併入本文)。
在本發明之一實施例中，靶向TROP2之抗體構築體或抗原結合域包含選自SEQ ID NO. 1-7之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列 殘基(Kabat) 長度 SEQ ID NO.
LFR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 1-23 23 1
CDR-L1 KASQDVSTAVA 24-34 11 2
LFR2 WYQQKPGKAPKLLIY 35-49 15 3
CDR-L2 SASYRYT 50-56 7 4
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYC 57-88 32 5
CDR-L3 QQHYITPLT 89-97 9 6
LFR4 FGQGTKLEIK 98-107 10 7
在本發明之一實施例中，靶向TROP2之抗體構築體或抗原結合域包含選自SEQ ID NO. 8-14之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列 殘基(Kabat) 長度 SEQ ID NO.
HFR1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 1-30 30 8
CDR-H1 TAGMQ 31-35 5 9
HFR2 WVRQAPGQGLEWMG 36-49 14 10
CDR-H2 WINTHSGVPKYAEDFKG 50-66 17 11
HFR3 RVTISADTSTSTAYLQLSSLKSEDTAVYYCAR 67-98 32 12
CDR-H3 SGFGSSYWYFDV 99-110 12 13
HFR4 WGQGTLVTVSS 111-121 11 14
在一些實施例中，免疫結合物中之抗體含有經修飾之Fc區，其中該修飾調節Fc區與一或多個Fc受體之結合。
在一些實施例中，藉由包括能夠結合轉型生長因子β1 (TGFβ1)之TGFβ1受體或其片段來修飾Fc區。舉例而言，受體可為TGFβ受體II (TGFβRII)。在一些實施例中，TGFβ受體為人類TGFβ受體。在一些實施例中，如併入本文中之US 9676863中所描述，IgG具有融合至TGFβRII細胞外域(ECD)之C端。「Fc連接子」可用於將IgG連接至TGFβRII細胞外域。Fc連接子可為允許分子之適當三維摺疊同時維持對靶標之結合特異性的短撓性肽。在一些實施例中，TGFβ受體之N端融合至抗體構築體之Fc (在存在或不存在Fc連接子之情況下)。在一些實施例中，抗體構築體重鏈之C端融合至TGFβ受體(在存在或不存在Fc連接子之情況下)。在一些實施例中，抗體構築體重鏈之C端離胺酸殘基突變為丙胺酸。
在一些實施例中，免疫結合物中之抗體為醣基化的。
在一些實施例中，免疫結合物中之抗體為半胱胺酸工程改造之抗體，其提供佐劑、標記或藥物部分在經工程改造之半胱胺酸可用於結合但不擾亂免疫球蛋白摺疊及組裝或改變抗原結合及效應功能之位點藉由半胱胺酸取代與抗體之位點特異性結合(Junutula等人, 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932；Dornan等人 (2009) Blood114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；US 2012/0121615；WO 2009/052249)。半胱胺酸工程改造之抗體可以均勻化學計量結合至作為8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯佐劑部分(例如在具有單一經工程改造半胱胺酸位點之抗體中每個抗體至多兩個8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯部分)。 8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯佐劑化合物S
本發明之免疫結合物包含8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯佐劑部分。本文所描述之佐劑部分為引發免疫反應之化合物(亦即，免疫刺激劑)。通常，本文所描述之佐劑部分為TLR促效劑。TLR為在脊椎動物中負責起始先天免疫反應之I型跨膜蛋白。TLR識別來自細菌、病毒及真菌之多種病原體相關分子模式且充當防禦入侵病原體之第一線。TLR歸因於細胞表現及其起始之信號傳導路徑的差異而引發重疊又獨特之生物反應。在接合(例如藉由天然刺激或合成TLR促效劑)後，TLR起始信號轉導級聯反應，引起經由銜接子蛋白骨髓分化主要反應基因88 (MyD88)對核因子-κB (NF-κB)之活化及IL-1受體相關激酶(IRAK)之募集。IRAK之磷酸化然後導致TNF-受體相關因子6 (TRAF6)之募集，這導致NF-κB抑制劑I-κB之磷酸化。因此，NF-κB進入細胞核且起始啟動子含有NF-κB結合位點之基因(諸如細胞介素)之轉錄。其他TLR信號傳導調控方式包括TNF-受體相關因子6 (TRAF6)之含TIR結構域銜接子誘導干擾素-β (TRIF)依賴性誘導及經由TRIF及TRAF3對MyD88獨立路徑之活化，從而引起干擾素反應因子3 (IRF3)之磷酸化。類似地，MyD88依賴性途徑亦活化若干IRF家族成員，包括IRF5及IRF7，而TRIF依賴性途徑亦活化NF-κB途徑。
典型地，本文所描述之佐劑部分為TLR7及/或TLR8促效劑。TLR7及TLR8均在單核球及樹突細胞中表現。在人類中，TLR7亦在漿細胞樣樹突細胞(pDC)及B細胞中表現。TLR8主要在髓系來源之細胞(亦即，單核球、顆粒球及髓系樹突細胞)中表現。TLR7及TLR8能夠偵測細胞內「外來」單股RNA之存在，作為對病毒入侵作出反應之手段。用TLR8促效劑處理表現TLR8之細胞可使得產生高水準之IL-12、IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6及其他炎性細胞介素。類似地，用TLR7促效劑刺激表現TLR7之細胞(諸如pDC)可使得產生高水準之IFN-α及其他炎性細胞介素。TLR7/TLR8接合及產生所得細胞因子可活化樹突細胞及其他抗原呈遞細胞，驅動各種先天及後天性免疫反應機制，從而引起腫瘤破壞。
對本發明之示範性8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯化合物(8SO2Bz)進行合成、純化且藉由質譜法表徵且顯示具有所指示之質量。其他實驗程序可在實例中找到。根據實例202量測針對表現人類TLR7或人類TLR8之HEK293 NFKB報導細胞之活性。某些8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯化合物展示了令人驚訝且出乎意料之TLR8促效劑選擇性特性，其可預測可用於治療癌症及其他病症之治療劑活性。 表1：8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯化合物(8SO2Bz)
8SO2Bz編號 結構 MW HEK293 hTLR7 EC50 (nM) HEK293 hTLR8 EC50 (nM)
8SO2Bz-1 485.6 ＞9000 1056
8SO2Bz-2 509.6 395 ＜2.3
8SO2Bz-3 380.5 ＞5000 202
8SO2Bz-4 394.5      
8SO2Bz-5 552.7      
8SO2Bz-6 564.7      
8SO2Bz-7 484.5      
8SO2Bz-8 440.5      
8SO2Bz-9 460.6      
8SO2Bz-10 424.5      
8SO2Bz-11 438.5      
8SO2Bz-12 483.5      
8SO2Bz-13 482.6      
8SO2Bz-14 481.6      
8SO2Bz-15 438.5      
8SO2Bz-16 440.5      
8SO2Bz-17 440.5      
8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物S
本發明之免疫結合物藉由使抗體與8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物8SO2Bz-L結合來製備。8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物包含共價連接至連接子單元之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯 (8SO2Bz)部分。連接子單元包含影響免疫結合物之穩定性、滲透性、溶解度及其他藥物動力學、安全性及功效特性之官能基及次單元。連接子單元包含聚伸乙基氧基(PEG)基團。連接子單元包括與抗體之反應性官能基反應(亦即結合)之反應性官能基。舉例而言，抗體之親核基團(諸如離胺酸側鏈胺基)與8SO2Bz-L化合物之親電反應性官能基反應以形成免疫結合物。另外，舉例而言，抗體之半胱胺酸硫醇與8SO2Bz-L-連接子化合物之順丁烯二醯亞胺或溴乙醯胺基團反應以形成免疫結合物。
適用於8SO2Bz-L連接子化合物之反應性親電官能基(式II中之Q)包括但不限於N-羥基丁二醯亞胺基(NHS)酯及N-羥基磺基丁二醯亞胺基(磺基-NHS)酯(胺反應性)；碳二亞胺(胺及羧基反應性)；羥甲基膦(胺反應性)；順丁烯二醯亞胺(硫醇反應性)；鹵化乙醯胺，諸如 N-碘乙醯胺(硫醇反應性)；芳基疊氮化物(一級胺反應性)；氟化芳基疊氮化物(經由碳-氫(C-H)***之反應性)；五氟苯基(PFP)酯(胺反應性)；四氟苯基(TFP)酯(胺反應性)；亞胺酸酯(胺反應性)；異氰酸酯(羥基反應性)；乙烯碸(硫醇、胺及羥基反應性)；吡啶基二硫化物(硫醇反應性)；及二苯基酮衍生物(經由C-H鍵***之反應性)。其他試劑包括但不限於Hermanson, Bioconjugate Techniques 第 2 版, Academic Press, 2008中所描述之彼等試劑。
本發明提供對設計、製備及使用免疫結合物之限制及挑戰的解決方案。一些連接子在血流中可為不穩定的，由此在靶細胞中內化之前釋放不可接受量之佐劑/藥物(Khot, A.等人(2015) Bioanalysis 7(13):1633–1648)。其他連接子可在血流中提供穩定性，但細胞內釋放有效性可能受到負面影響。提供所需細胞內釋放之連接子典型地在血流中具有不良穩定性。或者陳述為，血流穩定性與細胞內釋放典型地逆相關。此外，在標準結合方法中，加載於抗體上之佐劑/藥物部分之量(亦即藥物加載量)、結合反應中形成之聚集物之量及可獲得之最終經純化結合物之產率為相互聯繫的。舉例而言，聚集物形成通常與結合至抗體之佐劑/藥物部分及其衍生物之當量數目正相關。在高藥物加載量下，必須移除所形成之聚集物以用於治療應用。因此，藥物加載介導之聚集物形成降低免疫結合物產率且可使得方法難以放大。
示範性實施例包括式II之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物： 其中 R 1、R 2、R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：H、C 1-C 12烷基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基、C 2-C 9雜環基及C 1-C 20雜芳基，其中烷基、烯基、炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基獨立地且視情況經選自以下之一或多個基團取代： -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 12烷基二基)-OR 5； -(C 3-C 12碳環基)； -(C 3-C 12碳環基)-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 3-C 12碳環基)-NR 5-C(=NR 5)NR 5-*； -(C 6-C 20芳基)； -(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-C(=NR 5a)N(R 5)-*； -(C 2-C 20雜環基)； -(C 2-C 20雜環基)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 2-C 9雜環基)-C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-C(=NR 5a)NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)； -(C 1-C 20雜芳基二基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 20雜芳基)-NR 5-C(=NR 5a)N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-N(R 5)C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(=O)-*； -C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(=O)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -C(=O)N(R 5) 2； -C(=O)N(R 5)-*； -C(=O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(=O)R 5； -C(=O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(=O)N(R 5) 2； -C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5； -C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(=NR 5a)N(R 5) 2； -C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5C(=NR 5a)R 5； -C(=O)NR 5-(C 1-C 8烷基二基)-NR 5(C 2-C 5雜芳基)； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-N(R 5)-*； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-*； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -N(R 5) 2； -N(R 5)-*； -N(R 5)C(=O)R 5； -N(R 5)C(=O)-*； -N(R 5)C(=O)N(R 5) 2； -N(R 5)C(=O)N(R 5)-*； -N(R 5)CO 2R 5； -NR 5C(=NR 5a)N(R 5) 2； -NR 5C(=NR 5a)N(R 5)-*； -NR 5C(=NR 5a)R 5； -N(R 5)C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -N(R 5)-(C 2-C 5雜芳基)； -N(R 5)-S(=O) 2-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -O-C(=O)N(R 5) 2； -O-C(=O)N(R 5)-*； -O-(R 5)-*； -O(R 5)； -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*；及 -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-OH； 或R 2及R 3一起形成5-員或6-員雜環基環； X 1、X 2、X 3及X 4獨立地選自由以下組成之群：鍵、C(=O)、C(=O)N(R 5)、O、N(R 5)、S、S(O) 2及S(O) 2N(R 5)； R 5獨立地選自由以下組成之群：H、C 6-C 20芳基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基二基、C 1-C 12烷基及C 1-C 12烷基二基，或兩個R 5基團一起形成5員或6員雜環基環； R 5a選自由C 6-C 20芳基及C 1-C 20雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之連接位點，且其中R 1、R 2、R 3及R 4中之一者連接至L；
L為選自由以下組成之群的連接子： Q-C(=O)-PEG-； Q-C(=O)-PEG-C(=O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(=O)-Gluc-； Q-C(=O)-PEG-O-； Q-C(=O)-PEG-O-C(=O)-； Q-C(=O)-PEG-C(=O)-； Q-C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-； Q-C(=O)-PEG-N(R 6)-； Q-C(=O)-PEG-N(R 6)-C(=O)-； Q-C(=O)-PEG-N(R 6)-PEG-C(=O)-PEP-； Q-C(=O)-PEG-N +(R 6) 2-PEG-C(=O)-PEP-； Q-C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； Q-C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(=O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； Q-C(=O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(=O)-； Q-C(=O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-C(=O)-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(=O)-Gluc-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-O-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-O-C(=O)-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(PEG-CO 2H)-PEG-N(R 5)-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)N(PEG-CO 2H)-PEG-N(R 5)-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-C(=O)-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(PEG-CO 2H)-PEG-C(=O)-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)N(PEG-CO 2H)-PEG-C(=O)-； Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)-PEP-；及 Q-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(=O)-； R 6獨立地為H或C 1-C 6烷基； PEG具有式-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-；m為1至5之整數，且n為2至50之整數；
Gluc具有下式： ；
PEP具有下式： 其中AA獨立地選自天然或非天然胺基酸側鏈，或者一或多個AA及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波浪線指示連接點；
Cyc選自C 6-C 20芳基二基及C 1-C 20雜芳基二基，其視情況經一或多個選自以下各項之基團取代：F、Cl、NO 2、-OH、-OCH 3、及具有以下結構之葡醣醛酸： ； R 7選自由-CH(R 8)O-、-CH 2-、-CH 2N(R 8)-及-CH(R 8)O-C(=O)-組成之群，其中R 8選自H、C 1-C 6烷基、C(=O)-C 1-C 6烷基及-C(=O)N(R 9) 2，其中R 9獨立地選自由H、C 1-C 12烷基及-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-OH組成之群，其中m為1至5之整數，且n為2至50之整數，或兩個R 9基團一起形成5員或6員雜環基環； y為2至12之整數； z為0或1； Q選自由以下組成之群：N-羥基丁二醯亞胺基、N-羥基磺基丁二醯亞胺基、順丁烯二醯亞胺及獨立地經一或多個選自F、Cl、NO 2及SO 3 -之基團取代之苯氧基；且 烷基、烷基二基、烯基、烯基二基、炔基、炔基二基、芳基、芳基二基、碳環基、碳環基二基、雜環基、雜環基二基、雜芳基及雜芳基二基獨立地且視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH 2CH 3、-CH=CH 2、-C≡CH、-C≡CCH 3、-CH 2CH 2CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2CH(CH 3) 2、-CH 2OH、-CH 2OCH 3、-CH 2CH 2OH、-C(CH 3) 2OH、-CH(OH)CH(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CH 2OH、-CH 2CH 2SO 2CH 3、-CH 2OP(O)(OH) 2、-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CH 2CHF 2、-CH(CH 3)CN、-C(CH 3) 2CN、-CH 2CN、-CH 2NH 2、-CH 2NHSO 2CH 3、-CH 2NHCH 3、-CH 2N(CH 3) 2、-CO 2H、-COCH 3、-CO 2CH 3、-CO 2C(CH 3) 3、-COCH(OH)CH 3、-CONH 2、-CONHCH 3、-CON(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CONH 2、-NH 2、-NHCH 3、-N(CH 3) 2、-NHCOCH 3、-N(CH 3)COCH 3、-NHS(O) 2CH 3、-N(CH 3)C(CH 3) 2CONH 2、-N(CH 3)CH 2CH 2S(O) 2CH 3、- NHC(=NH)H、-NHC(=NH)CH 3、-NHC(=NH)NH 2、-NHC(=O)NH 2、-NO 2、=O、-OH、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CH 2OCH 3、-OCH 2CH 2OH、-OCH 2CH 2N(CH 3) 2、-O(CH 2CH 2O) n-(CH 2) mCO 2H、-O(CH 2CH 2O) nH、-OCH 2F、-OCHF 2、-OCF 3、-OP(O)(OH) 2、-S(O) 2N(CH 3) 2、-SCH 3、-S(O) 2CH 3及-S(O) 3H。
式II之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物之示範性實施例包括如下情況，其中Q選自： 。
式II之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物之示範性實施例包括如下情況，其中Q為經一或多個F取代之苯氧基。
式II之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物之示範性實施例包括如下情況，其中Q為2,3,5,6-四氟苯氧基。
8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子(8SO2BzL)化合物之示範性實施例選自表2a。對各化合物進行合成、純化且藉由質譜法表徵且顯示具有所指示之質量。其他實驗程序可在實例中找到。表2a之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物展示令人驚訝且出乎意料之TLR8促效劑選擇性特性，其可預測適用於治療癌症及其他病症之治療劑活性。表2a之式II化合物8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子中間物用於藉由實例201之方法與抗體結合以形成表3a之免疫結合物。 表 2a 8-磺醯基-苯并氮呯-連接子(8SO2BzL)化合物
8SO2BzL編號 結構 MW
8SO2BzL-1 1211.3
8SO2BzL-2 1047.1
8SO2BzL-3 1001.2
8SO2BzL-4 987.1
8SO2BzL-5 1046.2
8SO2BzL-6 1074.2
8SO2BzL-7 1044.2
8SO2BzL-8 1045.2
8SO2BzL-9 985.2
8SO2BzL-10 999.2
8SO2BzL-11 1001.2
8SO2BzL-12 1101.3
8SO2BzL-13 1060.2
8SO2BzL-14 1015.2
8SO2BzL-15 1129.3
8SO2BzL-16 1023.2
8SO2BzL-17 1047.1
8SO2BzL-18 971.1
8SO2BzL-19 998.1
8SO2BzL-20 1058.2
8SO2BzL-21 1041.1
8SO2BzL-22 1027.1
8SO2BzL-23 1087.1
根據實例201，來自表2b之比較化合物具有活化酯、四氟苯基或磺基四氟苯基，其與抗體之離胺酸殘基反應以形成在抗體與TLR促效劑-連接子部分之間具有醯胺鍵之免疫結合物。 表 2b TLR促效劑-連接子比較化合物
化合物 結構 MW
C-1 1163.2
C-2 1274.3
8-磺醯基-苯并氮呯免疫結合物
免疫刺激性抗體結合物(亦即免疫結合物)將TLR7/8促效劑引導到腫瘤中以活化腫瘤浸潤性骨髓細胞且啟動廣泛的先天性及適應性抗腫瘤免疫反應(Ackerman等人 (2021) Nature Cancer2:18-33。
免疫結合物之示範性實施例包含藉由連接子共價連接至一或多個8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯部分之抗體，且具有式I： Ab-[L-D] pI 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： Ab為該抗體； p為1至8之整數； L為連接子；
D為具有下式之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯部分：
R 1、R 2、R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：H、C 1-C 12烷基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基、C 2-C 9雜環基及C 1-C 20雜芳基，其中烷基、烯基、炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基獨立地且視情況經選自以下之一或多個基團取代： -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 12烷基二基)-OR 5； -(C 3-C 12碳環基)； -(C 3-C 12碳環基)-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 3-C 12碳環基)-NR 5-C(=NR 5)NR 5-*； -(C 6-C 20芳基)； -(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-C(=NR 5a)N(R 5)-*； -(C 2-C 20雜環基)； -(C 2-C 20雜環基)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 2-C 9雜環基)-C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-C(=NR 5a)NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)； -(C 1-C 20雜芳基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 20雜芳基)-NR 5-C(=NR 5a)N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-N(R 5)C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(=O)-*； -C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(=O)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -C(=O)N(R 5) 2； -C(=O)N(R 5)-*； -C(=O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(=O)R 5； -C(=O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(=O)N(R 5) 2； -C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5； -C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(=NR 5a)N(R 5) 2； -C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5C(=NR 5a)R 5； -C(=O)NR 5-(C 1-C 8烷基二基)-NR 5(C 2-C 5雜芳基)； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-N(R 5)-*； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-*； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -N(R 5) 2； -N(R 5)-*； -N(R 5)C(=O)R 5； -N(R 5)C(=O)-*； -N(R 5)C(=O)N(R 5) 2； -N(R 5)C(=O)N(R 5)-*； -N(R 5)CO 2R 5； -NR 5C(=NR 5a)N(R 5) 2； -NR 5C(=NR 5a)N(R 5)-*； -NR 5C(=NR 5a)R 5； -N(R 5)C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -N(R 5)-(C 2-C 5雜芳基)； -N(R 5)-S(=O) 2-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -O-C(=O)N(R 5) 2； -O-C(=O)N(R 5)-*； -O-(R 5)-*； -O(R 5)； -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*；及 -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-OH； 或R 2及R 3一起形成5-員或6-員雜環基環； X 1、X 2、X 3及X 4獨立地選自由以下組成之群：鍵、C(=O)、C(=O)N(R 5)、O、N(R 5)、S、S(O) 2及S(O) 2N(R 5)； R 5獨立地選自由以下組成之群：H、C 6-C 20芳基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基二基、C 1-C 12烷基及C 1-C 12烷基二基，或兩個R 5基團一起形成5員或6員雜環基環； R 5a選自由C 6-C 20芳基及C 1-C 20雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之連接位點，且其中R 1、R 2、R 3及R 4中之一者連接至L；
L為選自由以下組成之群的連接子： -C(=O)-PEG-； -C(=O)-PEG-C(=O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(=O)-Gluc-； -C(=O)-PEG-O-； -C(=O)-PEG-O-C(=O)-； -C(=O)-PEG-C(=O)-； -C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-； -C(=O)-PEG-N(R 6)-； -C(=O)-PEG-N(R 6)-C(=O)-； -C(=O)-PEG-N(R 6)-PEG-C(=O)-PEP-； -C(=O)-PEG-N +(R 6) 2-PEG-C(=O)-PEP-； -C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； -C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(=O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； -C(=O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(=O)-； -C(=O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(=O)-Gluc-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-O-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-O-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(PEG-CO 2H)-PEG-N(R 5)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)N(PEG-CO 2H)-PEG-N(R 5)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(PEG-CO 2H)-PEG-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)N(PEG-CO 2H)-PEG-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)-PEP-；及 -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(=O)-； R 6獨立地為H或C 1-C 6烷基； PEG具有式-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-；m為1至5之整數，且n為2至50之整數； Gluc具有下式： ； PEP具有下式： 其中AA獨立地選自天然或非天然胺基酸側鏈，或者一或多個AA及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波浪線指示連接點；
Cyc選自C 6-C 20芳基二基及C 1-C 20雜芳基二基，其視情況經一或多個選自以下各項之基團取代：F、Cl、NO 2、-OH、-OCH 3、及具有以下結構之葡醣醛酸： ； R 7選自由-CH(R 8)O-、-CH 2-、-CH 2N(R 8)-及-CH(R 8)O-C(=O)-組成之群，其中R 8選自H、C 1-C 6烷基、C(=O)-C 1-C 6烷基及-C(=O)N(R 9) 2，其中R 9獨立地選自由H、C 1-C 12烷基及-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-OH組成之群，其中m為1至5之整數，且n為2至50之整數，或兩個R 9基團一起形成5員或6員雜環基環； y為2至12之整數； z為0或1；且 烷基、烷基二基、烯基、烯基二基、炔基、炔基二基、芳基、芳基二基、碳環基、碳環基二基、雜環基、雜環基二基、雜芳基及雜芳基二基獨立地且視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH 2CH 3、-CH=CH 2、-C≡CH、-C≡CCH 3、-CH 2CH 2CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2CH(CH 3) 2、-CH 2OH、-CH 2OCH 3、-CH 2CH 2OH、-C(CH 3) 2OH、-CH(OH)CH(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CH 2OH、-CH 2CH 2SO 2CH 3、-CH 2OP(O)(OH) 2、-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CH 2CHF 2、-CH(CH 3)CN、-C(CH 3) 2CN、-CH 2CN、-CH 2NH 2、-CH 2NHSO 2CH 3、-CH 2NHCH 3、-CH 2N(CH 3) 2、-CO 2H、-COCH 3、-CO 2CH 3、-CO 2C(CH 3) 3、-COCH(OH)CH 3、-CONH 2、-CONHCH 3、-CON(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CONH 2、-NH 2、-NHCH 3、-N(CH 3) 2、-NHCOCH 3、-N(CH 3)COCH 3、-NHS(O) 2CH 3、-N(CH 3)C(CH 3) 2CONH 2、-N(CH 3)CH 2CH 2S(O) 2CH 3、- NHC(=NH)H、-NHC(=NH)CH 3、-NHC(=NH)NH 2、-NHC(=O)NH 2、-NO 2、=O、-OH、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CH 2OCH 3、-OCH 2CH 2OH、-OCH 2CH 2N(CH 3) 2、-O(CH 2CH 2O) n-(CH 2) mCO 2H、-O(CH 2CH 2O) nH、-OCH 2F、-OCHF 2、-OCF 3、-OP(O)(OH) 2、-S(O) 2N(CH 3) 2、-SCH 3、-S(O) 2CH 3及-S(O) 3H。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 1為鍵，且R 1為H。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 2為鍵，且R 2為C 1-C 8烷基。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 2及X 3各自為鍵，且R 2及R 3獨立地選自C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 12烷基)、-(C 1-C 12烷基二基)-OR 5、-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5、-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2、-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5及-O-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括其中R 2為C 1-C 8烷基，且R 3為-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 4。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2為-CH 2CH 2CH 3且R 3選自-CH 2CH 2CH 2NHCO 2(t-Bu)、-OCH 2CH 2NHCO 2(環丁基)及-CH 2CH 2CH 2NHCO 2(環丁基)。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2及R 3各自獨立地選自-CH 2CH 2CH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CF 3、-CH 2CH 2CF 3、-OCH 2CH 2OH及-CH 2CH 2CH 2OH。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2及R 3各自為-CH 2CH 2CH 3。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2為-CH 2CH 2CH 3且R 3為-OCH 2CH 3。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 3-R 3選自由以下組成之群：
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 4為鍵，且R 4為H。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 1連接至L。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2及R 3連接至L。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 3-R 3-L選自由以下組成之群： 其中波浪線指示與N之連接點。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 4為C 1-C 12烷基。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 4為-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*；其中星號*指示L之連接點。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L為-C(=O)-PEG-或-C(=O)-PEG-C(=O)-。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L連接至抗體之半胱氨酸硫醇。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中對於PEG，m為1或2，且n為2至10之整數；或其中n為10。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP為二肽且具有下式： 。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中AA 1及AA 2獨立地選自H、-CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2(C 6H 5)、-CH 2CH 2CH 2CH 2NH 2、-CH 2CH 2CH 2NHC(NH)NH 2、-CHCH(CH 3)CH 3、-CH 2SO 3H及-CH 2CH 2CH 2NHC(O)NH 2；或者AA 1及AA 2形成5員環脯氨酸胺基酸。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中AA 1為-CH(CH 3) 2，且AA 2為-CH 2CH 2CH 2NHC(O)NH 2。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中AA 1及AA 2獨立地選自GlcNAc天冬胺酸、-CH 2SO 3H及-CH 2OPO 3H。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中PEP具有下式： 其中AA 1及AA 2獨立地選自天然存在之胺基酸之側鏈。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP為三肽且具有下式： 。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP為四肽且具有下式： 。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中： AA 1選自由Abu、Ala及Val組成之群； AA 2選自由Nle(O-Bzl)、Oic及Pro組成之群； AA 3選自由Ala及Met(O) 2組成之群；且 AA 4選自由Oic、Arg(NO 2)、Bpa及Nle(O-Bzl)組成之群。 式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP選自由以下組成之群：Ala-Pro-Val、Asn-Pro-Val、Ala-Ala-Val、Ala-Ala-Pro-Ala 、Ala-Ala-Pro-Val 及Ala-Ala-Pro-Nva。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP選自以下結構： ； ； ；及 。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L選自以下結構： 其中波浪線指示與R 5之連接。
本發明包括式I實施例之特徵之所有合理組合及排列。
在某些實施例中，本發明之免疫結合物化合物包括具有免疫刺激活性之彼等者。本發明之免疫結合物將有效劑量之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯(8SO2Bz)藥物選擇性遞送至腫瘤組織，藉此相對於非經結合之8SO2Bz可在增加治療指數(「治療窗」)之同時達成更大選擇性(亦即，更低有效劑量)。
根據實例201之方法製備表3a及3b之各免疫結合物，藉由HPLC純化，並藉由質譜法表徵。 表3a 8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯免疫結合物(IC)
免疫結合物編號 8SO2BzL表2a 抗體 抗原 DAR cDC活化(IL12p70分泌) – EC 50(nM)
IC-1 8SO2BzL-1 曲妥珠單抗 HER2 2.5   
IC-2 8SO2BzL-2 TROP2 3.9 0.8
IC-3 8SO2BzL-3 TROP2 3.9 0.4
IC-4 8SO2BzL-4 TROP2 3.8   
IC-5 8SO2BzL-5 TROP2 3.7 0.4
IC-6 8SO2BzL-6 TROP2 2.6 0.6
IC-7 8SO2BzL-7 TROP2 3.9 27.3
IC-8 8SO2BzL-8 TROP2 3.6 4.2
IC-9 8SO2BzL-9 TROP2 4.0 2.4
IC-10 8SO2BzL-10 TROP2 4.3 1.5
IC-11 8SO2BzL-8 TROP2 3.8 小鼠
IC-12 8SO2BzL-8 TROP2 3.8 小鼠
IC-13 8SO2BzL-8 利妥昔單抗 CD20 3.2   
IC-14 8SO2BzL-8 TROP2 3.3 小鼠
IC-15 8SO2BzL-7 阿維單抗 PD-L1 4.0   
IC-16 8SO2BzL-8 阿維單抗 PD-L1 3.8   
IC-17 8SO2BzL-5 110-G1f PD-L1 3.1、4.0 0.3
IC-18 8SO2BzL-4 110-G1f PD-L1 3.2、3.4、3.5、3.9 0.4
IC-19 8SO2BzL-3 110-G1f PD-L1 3.1 0.4
IC-20 8SO2BzL-2 110-G1f PD-L1 3.5 0.2
IC-21 8SO2BzL-7 抗-M PD-L1 3.3   
IC-21 8SO2BzL-7 大鼠IgG2b 同型對照 3.3   
IC-23 8SO2BzL-11 曲妥珠單抗 HER2 3.3   
IC-24 8SO2BzL-12 曲妥珠單抗 HER2 3.8   
IC-25 8SO2BzL-14 曲妥珠單抗 HER2 3.4   
IC-26 8SO2BzL-15 曲妥珠單抗 HER2 3.5 1.5
IC-27 8SO2BzL-16 曲妥珠單抗 HER2 3.5、3.6 1.6
IC-28 8SO2BzL-18 110-G1f PD-L1 3.5 0.4
IC-29 8SO2BzL-19 110-G1f PD-L1 3.6 0.6
IC-30 8SO2BzL-20 110-G1f PD-L1 3.5 1.3
IC-31 8SO2BzL-17 曲妥珠單抗 HER2 3.2   
IC-32 8SO2BzL-2 曲妥珠單抗 HER2 3.3 1.7
IC-33 8SO2BzL-3 曲妥珠單抗 HER2 3.5 0.5
IC-34 8SO2BzL-4 曲妥珠單抗 HER2 3.7 0.9
IC-35 8SO2BzL-5 曲妥珠單抗 HER2 3.5 0.9
IC-36 8SO2BzL-10 曲妥珠單抗 HER2 3.7   
IC-37 8SO2BzL-23 曲妥珠單抗 HER2 2.1 1.3
IC-38 8SO2BzL-22 曲妥珠單抗 HER2 1.9 1.8
IC-39 8SO2BzL-21 曲妥珠單抗 HER2 2.8 1.6
IC-40 8SO2BzL -9 曲妥珠單抗 HER2 4.0   
IC-41 8SO2BzL-7 曲妥珠單抗 HER2 4.0   
IC-42 8SO2BzL-8 曲妥珠單抗 HER2 3.4、4.0   
IC-43 8SO2BzL-6 曲妥珠單抗 HER2 3.8   
IC-44 8SO2BzL-7 h1gG1 同型對照 3.8   
表3b 比較免疫結合物(CIC)
比較免疫結合物編號 比較化合物 表2b 抗體 DAR cDC活化(IL12p70分泌) – EC 50(nM)
CIC-1 C-1 TROP2 2.4 0.8
CIC-2 C-2 TROP2 2.5 0.7
圖1展示了在將不同濃度之免 疫結合物IC-3、比較物CIC-1及裸抗體TROP2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的 TNFa(腫瘤壞死因子α)細胞介素水準之圖。圖2展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-3、比較物CIC-2及裸抗體TROP2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的TNFa (腫瘤壞死因子α)細胞介素水準之圖。
使用LegendPlex細胞介素珠粒陣列套組確定上清液中分泌之細胞介素水準。靶向TROP2之免疫結合物IC-2、CIC-1及CIC-2誘導細胞介素TNFa (alpha)之分泌，這與增強對癌症之免疫反應有關，並證明當暴露於表現TROP2之腫瘤細胞時髓系細胞之活化。與比較免疫結合物CIC-1及CIC-2相比，8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯免疫結合物IC-3刺激了更高水準之 TNFα。值得注意地，8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯有效負荷代表了一種更有效的有效負荷，從而提供增加的活性，同時降低分子量及疏水性。 裸抗體TROP2不誘導髓系活化，證明了對TLR7/8活化性有效負荷之依賴性。
藥物加載量由p表示，其為式I免疫結合物中每抗體之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯(8SO2Bz)部分數量，且如表3a之示範性免疫結合物所量測(DAR)。  藥物(8SO2Bz)加載量範圍可為每抗體1至約8個藥物部分(D)。 式I之免疫結合物包括與1至約8範圍之藥物部分結合的抗體之混合物或集合。  在一些實施例中，可結合至抗體之藥物部分之數目受限於反應性或可用胺基酸側鏈殘基(諸如離胺酸及半胱胺酸)之數目。 在一些實施例中，藉由本文所描述之方法將遊離半胱胺酸殘基引入到抗體胺基酸序列中。在此等態樣中，p可為1、2、3、4、5、6、7或8及其範圍，諸如1至8或2至5。在任何此等態樣中，p與n相等(亦即，p = n = 1、2、3、4、5、6、7或8，或其間之某個範圍)。   式I之示範性免疫結合物包括但不限於具有1、2、3或4個經工程改造半胱胺酸胺基酸之抗體(Lyon, R.等人(2012) Methods in Enzym. 502:123-138)。在一些實施例中，在未使用工程化之情況下，一或多個遊離半胱胺酸殘基已存在於抗體中，形成鏈內二硫鍵及鏈間二硫鍵(天然二硫鍵基團)，在此情況下現有遊離、還原的半胱胺酸殘基可用於使抗體結合至藥物。在一些實施例中，在抗體結合之前使抗體暴露於還原條件，以產生一或多個遊離半胱胺酸殘基。
對於一些免疫結合物，p可受抗體上連接位點之數目限制。舉例而言，如在本文所描述之某些示範性實施例中，在連接為半胱胺酸硫醇時，抗體可具有僅一個或有限數目之半胱胺酸硫醇基，或可具有僅一個或有限數目之充足反應性硫醇基，藥物可與該等基團連接。在其他實施例中，對於與式II之8SO2Bz -連接子化合物結合而言，抗體中之一或多個離胺酸胺基可為可用的及反應性的。在某些實施例中，較高藥物加載量( 例如p ＞5)可引起某些抗體-藥物結合物之聚集、不可溶性、毒性或細胞滲透性損失。在某些實施例中，免疫結合物之平均藥物加載量在1至約8；約2至約6；或約3至約5範圍內。在某些實施例中，抗體經受變性條件以揭示反應性親核基團，諸如離胺酸或半胱胺酸。
免疫結合物之加載量(藥物/抗體比)可以不同方式加以控制，且例如藉由以下控制：(i)限制8SO2Bz -連接子中間物化合物相對於抗體之莫耳過量，(ii)限制結合反應時間或溫度，及(iii)部分或有限之還原變性條件以獲得經最佳化之抗體反應性。
應瞭解，若抗體之超過一個親核基團與藥物反應，則所得產物為具有一或多個連接至抗體之藥物部分之分佈的免疫結合物化合物之混合物。可藉由對抗體具特異性且對藥物具特異性之雙ELISA抗體分析由混合物計算每個抗體之平均藥物數目。可藉由質譜分析鑑定混合物中之個別免疫結合物分子且藉由HPLC (例如疏水相互作用層析)分離(參見例如McDonagh等人(2006) Prot. Engr. Design 及 Selection19(7):299-307；Hamblett等人(2004) Clin. Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett, K.J.等人 「Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」, 摘要編號624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日, Proceedings of the AACR, 第45卷, 2004年3月；Alley, S.C.,等人「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,」 摘要編號627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日, Proceedings of the AACR, 第45卷, 2004年3月)。在某些實施例中，可藉由電泳或層析自結合混合物分離具有單一加載值之均質免疫結合物。
活體外免疫結合物活性之評估可根據實例203之方法進行。 免疫結合物之組合物
本發明提供一種組合物，例如醫藥學上或藥理學上可接受之組合物或調配物，其包含複數種如本文所描述之免疫結合物及視情況存在之用於其之載劑，例如醫藥學上或藥理學上可接受之載劑。組合物中之免疫結合物可為相同或不同的，亦即，組合物可包含具有鍵聯至抗體構築體上相同位置之相同數目之佐劑的免疫結合物及/或具有鍵聯至抗體構築體上不同位置之相同數目之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯(8SO2Bz)佐劑、具有鍵聯至抗體構築體上相同位置之不同數目之8SO2Bz佐劑或具有鍵聯至抗體構築體上不同位置之不同數目之8SO2Bz佐劑的免疫結合物。
在一示範性實施例中，包含免疫結合物化合物之組合物包含免疫結合物化合物之混合物，其中免疫結合物化合物之混合物中每個抗體之平均藥物8SO2Bz)加載量(DAR)為約2至約5。
本發明之免疫結合物之組合物可具有約0.4至約10之平均佐劑與抗體構築體比(DAR)。熟習此項技術者將認識到，在包含多種本發明之免疫結合物的組合物中結合至抗體構築體之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯佐劑之數目在免疫結合物之間可不同，且因此佐劑與抗體構築體(例如抗體)比可經量測為可稱為藥物與抗體比(DAR)之平均值。佐劑與抗體構築體(例如抗體)比可藉由任何合適的方法評估，該等方法中許多為此項技術中已知的，包括質譜法、ELISA檢定及HPLC等習知手段。亦可測定就p而言組合物中免疫結合物之定量分佈。在一些情況下，其中p為來自具有其他藥物加載量之免疫結合物的某一值之均質免疫結合物的分離、純化及表徵可藉由諸如逆相HPLC或電泳之手段來達成。
在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種醫藥學上或藥理學上可接受之賦形劑。舉例而言，本發明之免疫結合物可經調配用於非經腸投與，諸如靜脈內投與或投與至體腔或器官管腔中。或者，可腫瘤內注射免疫結合物。用於注射之組合物將通常包含免疫結合物溶解於醫藥學上可接受之載劑中之溶液。在可接受之媒劑及溶劑中，可採用水及一或多種鹽(諸如氯化鈉)之等張溶液，例如林格氏溶液(Ringer's solution)。此外，可習知採用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和固定油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸之脂肪酸同樣可用於製備可注射劑。此等組合物理想地為無菌的且通常不含不希望之物質。此等組合物可藉由習知之熟知滅菌技術進行滅菌。組合物可按需要含有醫藥學上可接受之助劑物質以接近生理條件，諸如pH調節及緩衝劑、毒性調節劑，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉及類似物。
組合物可含有任何適合之濃度之免疫結合物。組合物中免疫結合物之濃度可廣泛地改變，且將根據所選之特定投與方式及患者之需要主要基於流體體積、黏度、體重及類似因素加以選擇。在某些實施例中，用於注射之溶液調配物中免疫結合物之濃度將在約0.1% (w/w)至約10% (w/w)範圍內。 用免疫結合物治療癌症之方法
本發明提供一種用於治療癌症之方法。該方法包括向有需要之個體(例如患有癌症且需要治療癌症之個體)投與治療有效量之如本文所描述之免疫結合物(例如如本文所描述呈組合物形式)。該方法包括投與治療有效量之選自表3a之免疫結合物(IC)。
預期本發明之免疫結合物可用於治療例如以腫瘤抗原之過表現為特徵的各種過度增殖性疾病或病症。示範性過度增殖性病症包括良性或惡性實體瘤及血液學病症，諸如白血病及淋巴系惡性腫瘤。
在另一態樣中，提供一種用作藥劑之免疫結合物。在某些實施例中，本發明提供一種用於治療個體之方法中的免疫結合物，該方法包括向該個體投與有效量之免疫結合物。在一個此種實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種例如如本文所描述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供免疫結合物在藥劑之製造或製備中之用途。在一個實施例中，該藥劑用於治療癌症，該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之該藥劑。在一個此種實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種例如如本文所描述之其他治療劑。
癌瘤為起源於上皮組織之惡性腫瘤。上皮細胞覆蓋身體之外表面、襯於內部空腔且形成腺組織之內襯。癌瘤之實例包括但不限於腺癌(在腺(分泌)細胞中開始之癌症，諸如乳癌、胰腺癌、肺癌、***癌、胃癌、胃食管連接部癌及結腸癌)；腎上腺皮質癌；肝細胞癌；腎細胞癌；卵巢癌；原位癌；導管癌；乳癌；基底細胞癌；鱗狀細胞癌；移行細胞癌；結腸癌；鼻咽癌；多室性囊性腎細胞癌；燕麥狀細胞癌；大細胞肺癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；及諸如此類。癌瘤可見於***、胰臟、結腸、腦(通常呈繼發性轉移形式)、肺、***及皮膚中。在一些實施例中，用於治療非小細胞肺癌之方法包括投與含有能夠結合腫瘤相關抗原之抗體構築體之免疫結合物。
軟組織腫瘤為衍生自結締組織之高度多樣化之罕見腫瘤群。軟組織腫瘤之實例包括但不限於肺泡軟組織肉瘤；血管瘤樣纖維組織細胞瘤；軟骨黏液樣纖維瘤；骨骼軟骨肉瘤；骨外黏液樣軟骨肉瘤；透明細胞肉瘤；促結締組織增生性小圓細胞腫瘤；隆凸性皮膚纖維肉瘤；子宮內膜基質瘤；尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)；纖維瘤病(硬纖維瘤)；嬰兒型纖維肉瘤；胃腸道間質瘤；骨骼巨細胞腫瘤；腱鞘巨細胞腫瘤；炎性肌纖維母細胞腫瘤；子宮肌瘤；平滑肌肉瘤；脂胚細胞瘤；典型脂肪瘤；紡錘細胞或多形性脂肪瘤；非典型性脂肪瘤；軟骨樣脂肪瘤；分化良好型脂肪肉瘤；黏液樣/圓細胞脂肪肉瘤；多形性脂肪肉瘤；黏液樣惡性纖維組織細胞瘤；高級惡性纖維組織細胞瘤；黏液纖維肉瘤；惡性周圍神經鞘腫瘤；間皮瘤；神經胚細胞瘤；骨軟骨瘤；骨肉瘤；原始神經外胚層腫瘤；齒槽橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；良性或惡性神經鞘瘤；滑膜肉瘤；伊凡氏腫瘤(Evan’s tumor)；結節性筋膜炎；硬纖維瘤型纖維瘤病；孤立性纖維腫瘤；隆凸性皮膚纖維肉瘤(DFSP)；血管肉瘤；上皮樣血管內皮瘤；腱鞘巨細胞腫瘤(TGCT)；色素沈著絨毛結節性滑膜炎(PVNS)；纖維組織發育異常；黏液纖維肉瘤；纖維肉瘤；滑膜肉瘤；惡性周圍神經鞘腫瘤；神經纖維瘤；軟組織多形性腺瘤；及源自纖維母細胞、肌纖維母細胞、組織細胞、維管細胞/內皮細胞及神經鞘細胞之瘤形成。
肉瘤為一種罕見類型之癌症，其產生於間充質來源之細胞中，例如骨骼中或身體之軟組織中，包括軟骨、脂肪、肌肉、血管、纖維組織或其他結締組織或支持組織。不同類型之肉瘤係基於癌症形成於何處。舉例而言，骨肉瘤形成於骨骼中，脂肪肉瘤形成於脂肪中，且橫紋肌肉瘤形成於肌肉中。肉瘤之實例包括但不限於皮膚腫瘤；胸肺區之原始神經外胚層腫瘤(PNET) (阿金氏腫瘤(Askin's tumor))；葡萄樣肉瘤；軟骨肉瘤；惡性血管內皮細胞瘤；惡性神經鞘瘤；骨肉瘤；及軟組織肉瘤(例如肺泡軟部分肉瘤；血管肉瘤；囊性肉瘤葉狀柄隆凸性皮膚纖維肉瘤(DFSP)；硬纖維瘤腫瘤；促結締組織增生小圓細胞腫瘤；上皮樣肉瘤；骨外軟骨肉瘤；骨外骨肉瘤；纖維肉瘤；胃腸道基質瘤(GIST)；血管外皮瘤；血管肉瘤(hemangiosarcoma) (更通常稱為「血管肉瘤(angiosarcoma)」)；卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；平滑肌肉瘤；脂肪肉瘤；***肉瘤；惡性周圍神經鞘腫瘤(MPNST)；神經纖維肉瘤；滑膜肉瘤；及未分化多形性肉瘤)。
畸胎瘤為一類生殖細胞腫瘤，其可含有若干不同類型之組織(例如可包括衍生自任何及/或所有三個胚層( 內胚層、中胚層及外胚層)之組織)，包括例如毛髮、肌肉及骨骼。畸胎瘤最常發生於女性之卵巢、男性之睾丸及兒童之尾骨中。
黑色素瘤為一種開始於黑色素細胞(產生黑色素之細胞)中之癌症形式。黑色素瘤可開始於痣(皮膚黑色素瘤)中，但亦可開始於其他色素沈著組織中，諸如眼睛中或腸道中。
默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)為一種罕見類型之皮膚癌，其通常表現為面部、頭部或頸部之肉色或藍紅色結節。默克細胞癌亦稱為皮膚之神經內分泌癌。在一些實施例中，用於治療默克細胞癌之方法包括投與含有能夠結合例如CEA之抗體構築體(例如拉貝珠單抗、其生物仿製藥或其生物改良藥)的免疫結合物。在一些實施例中，當進行投與時默克細胞癌已轉移。
白血病為開始於血液形成組織(諸如骨髓)中之癌症且引起大量異常血細胞產生且進入血流。舉例而言，白血病可起源於通常在血流中成熟之骨髓源性細胞。白血病係針對疾病多麼快速發展及進展(例如急性相較於慢性)且針對受影響之白血細胞類型(例如骨髓相較於淋巴)而命名。髓系白血病亦稱為骨髓性或髓母細胞性白血病。淋巴系白血病亦稱為淋巴母細胞性或淋巴球性白血病。淋巴樣白血病細胞可在可變得腫脹之淋巴結中收集。白血病之實例包括但不限於急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性髓系白血病(CML)及慢性淋巴球性白血病(CLL)。
淋巴瘤為開始於免疫系統之細胞中之癌症。舉例而言，淋巴瘤可起源於通常在淋巴系統中成熟之骨髓源性細胞。存在兩種基本類別之淋巴瘤。一種類別之淋巴瘤為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)，其以一類稱為里德-斯特恩伯格細胞(Reed-Sternberg cell)之細胞之存在為標記。當前存在6種已識別之HL類型。霍奇金淋巴瘤之實例包括結節性硬化經典霍奇金淋巴瘤(CHL)、混合細胞性CHL、淋巴細胞消耗CHL、富淋巴細胞CHL及結節性淋巴細胞優勢型HL。
其他類別之淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其包括免疫系統細胞之一大群各種癌症。非霍奇金淋巴瘤可進一步分成具有惰性(生長遲緩)過程之癌症及具有侵襲性(快速生長)過程之彼等癌症。當前存在61種已識別之NHL類型。非霍奇金淋巴瘤之實例包括但不限於AIDS相關淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴瘤、母細胞性NK-細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、伯基特氏樣淋巴瘤(小非核裂細胞淋巴瘤)、慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、腸病型T細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、肝脾性γ-δ T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、淋巴母細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、鼻T細胞淋巴瘤、兒科淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、轉型淋巴瘤、治療相關T細胞淋巴瘤及沃爾德斯特羅姆氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)。
腦癌包括腦組織之任何癌症。腦癌之實例包括但不限於神經膠質瘤(例如膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、室管膜瘤及諸如此類)、腦膜瘤、垂體腺瘤及前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層腫瘤(神經管母細胞瘤)。
本發明之免疫結合物可單獨或與療法中之其他劑組合使用。舉例而言，免疫結合物可與至少一種其他治療劑(諸如化學治療劑)共投與。此等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於同一或單獨調配物中)及分開投與，在此情況下，投與免疫結合物可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行。免疫結合物亦可與放射療法組合使用。
本發明之免疫結合物(及任何其他治療劑)可藉由任何合適之方式投與，包括經口、非經腸、肺內及鼻內方式，且若需要局部治療，則為病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥可藉由任何適合之途徑例如藉由注射(諸如靜脈內或皮下注射)進行，這部分取決於投與為短暫的抑或長期的。本文中涵蓋多種給藥方案，包括但不限於經過多個時間點單次或多次投與、快速投與及脈衝輸注。
免疫結合物係使用任何適合之給藥方案(諸如用於拉貝珠單抗、其生物仿製藥或其生物改良藥之給藥方案)以任何治療有效量向有需要之個體投與。舉例而言，該等方法可包括投與免疫結合物以向個體提供約100 ng/kg至約50 mg/kg之劑量。免疫結合物劑量可在約5 mg/kg至約50 mg/kg、約10 μg/kg至約5 mg/kg或約100 μg/kg至約1 mg/kg範圍內。免疫結合物劑量可為約100、200、300、400或500 μg/kg。免疫結合物劑量可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg。視特定結合物以及所治療癌症之類型及嚴重程度而定，免疫結合物劑量亦可在此等範圍之外。投與頻率可在每週單個劑量至多個劑量範圍內，或更頻繁。在一些實施例中，約每月一次至約每週五次投與免疫結合物。在一些實施例中，每週一次投與免疫結合物。
在另一態樣中，本發明提供一種用於預防癌症之方法。該方法包括向個體投與治療有效量之免疫結合物(例如如上文所描述呈組合物形式)。在某些實施例中，個體易患某一所要預防之癌症。
本發明之一些實施例提供如上文所描述之用於治療癌症之方法，其中癌症為乳癌。乳癌可來源於***中之不同區域，且已表徵許多不同類型之乳癌。舉例而言，本發明之免疫結合物可用於治療導管原位癌；侵入性導管癌瘤(例如小管癌；髓樣癌；黏液癌；乳頭狀癌；或***篩狀癌)；小葉原位癌；侵入性小葉癌；炎性乳癌；及其他形式之乳癌，諸如三陰性(針對***受體、孕激素受體及過量HER2蛋白測試為陰性)乳癌。在一些實施例中，用於治療乳癌之方法包括投與含有能夠結合腫瘤相關抗原(TAA)或過表現TAA之腫瘤之抗體構築體的免疫結合物。
在一些實施例中，癌症易受由TLR7及/或TLR8誘導之促炎性反應影響。
在一些實施例中，向需要治療宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、***癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、泌尿道癌、尿路上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、默克細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌或乳腺之患者施用治療有效量之免疫結合物。該默克細胞癌可為轉移性默克細胞癌。乳癌可為三陰性乳癌。食管癌可為胃食管結合部腺癌。  實例 實例L-1              4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]磺醯基]苯甲醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸8SO2BzL-1之合成 8-溴-N-乙氧基-N-丙基-2-(三苯甲基胺基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-1b之製備
在25℃下向8-溴-2-(三苯甲基胺基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸 8SO2BzL-1a (1 g, 1.91 mmol, 1 eq)及N-乙氧基丙-1-胺 (320 mg, 2.29 mmol, 1.2 eq, HCl)於DCM (15 mL)及DMA (5 mL)中之混合物中整份添加EDCI (1.10 g, 5.73 mmol, 3.0 eq)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。  將混合物濃縮以移除DCM。 然後將殘餘物用NaHCO 3水溶液稀釋直到pH達到8與9之間。  將混合物用EtOAc (30 mL x 3)萃取。 將有機層用鹽水洗滌，經由Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。 藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/0, 3/1)純化殘餘物 ，得到呈白色固體狀之8SO2BzL-1b (0.7 g, 1.15 mmol, 60.21%產率)。 1H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ 7.38-7.15 (m, 15H), 7.06-6.94 (m, 2H), 6.72 (s, 1H), 6.16 (s, 1H), 4.03-3.83 (m, 2H), 3.73 (t, J=7.2 Hz, 2H), 2.78 (s, 2H), 1.89-1.64 (m, 2H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.99 (t, J=7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 608.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 608.2 (觀測值)。 4-[[4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-2-(三苯甲基胺基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]硫基]苯甲酸甲酯8SO2BzL-1c 之製備
在25℃下在N2下，向 8SO2BzL-1b (0.35 g，575 umol，1.0 eq)及4-硫基苯甲酸甲酯(116 mg，690 umol，1.2 eq)於DMF (4 mL)中之混合物中整份添加二環己基[2’,4’,6’-參)丙-2-基)[1,1'-聯苯基]磷烷(XPhos，CAS Reg. No. 564483-18-7, Huang, X.等人 (2003) J. Am. Chem. Soc.125(22):6653–6655; Bruno, N.C.等人, (2013) Chemical Science, 4(3):916–920,) (82.3 mg, 173 umol, 0.3 eq)、Cs 2CO 3(375 mg, 1.15 mmol, 2.0 eq)及[2-(2-胺基苯基)苯基]-氯-鈀; 二環己基-[3-(2,4,6-三異丙基苯基)苯基]磷烷(Pd-Xphos-G2, CAS Reg. No. 1310584-14-5) (226 mg, 288 umol, 0.5 eq) ，且然後 在120℃下攪拌12 h。  將該混合物用水(20 mL)稀釋且用EtOAc (10 mL x 3)萃取。 將有機層用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/0, 3/1)純化殘餘物，得到8SO2BzL-1c (0.25 g, 359.26 umol, 62.47%產率)。  LC/MS [M+H] 696.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 696.2 (觀測值)。 4-[[4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-2-(三苯甲基胺基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]磺醯基]苯甲酸甲酯8SO2BzL-1d之製備
在25℃下向 8SO2BzL-1c (0.25 g，359 umol，1.0 eq)於DCM (2 mL)、THF (2 mL)及H 2O (2 mL)中之混合物中整份添加過一硫酸氫鉀 、KHSO 5、Oxone (663 mg， 1.08 mmol, 3.0 eq)，且然後在25℃下攪拌12 h。  將該混合物用水稀釋且用EtOAc (20 mL x 3)萃取。 將有機層用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。 藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/0, 1/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之8SO2BzL-1d (0.2 g, 274.78 umol, 76.48%產率)。LC/MS [M+H] 728.27 (計算值)；LC/MS [M+H] 728.2 (觀測值)。 4-[[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]磺醯基]苯甲酸甲酯8SO2BzL-1e之製備
在25℃下向8SO2BzL-1d (0.1 g, 137 umol, 1.0 eq)於DCM (4 mL)中之混合物中整份添加TFA (313 mg, 2.75 mmol, 203 uL, 20.0 eq)，且然後在50℃下攪拌12 h。 在真空中濃縮混合物得到殘餘物，藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-乙腈，ACN]；B%：15 %-35%,8min)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之8SO2BzL-1e (0.046 g, 94.74 umol, 68.96%產率)。 1H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ8.21 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.04 (s, 1H), 7.95-7.87 (m, 1H), 7.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 6.97 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.93-3.82 (m, 2H), 3.70 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.23 (s, 2H), 1.82-1.66 (m, 2H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.96 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 485.16 (計算值)；LC/MS [M+H] 486.1 (觀測值)。 4-[[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]磺醯基]苯甲酸8SO2BzL-1f之製備
在25°C下向8SO2BzL-e (0.24 g, 494 umol, 1.0 eq)於MeOH (2 mL)、H2O (2 mL)及THF (2 mL)中之混合物中整份添加LiOH.H2O (62.2 mg, 1.48 mmol, 3.0 eq)，且然後在25°C下攪拌2 h。  將混合物用HCl (1M)淬滅以將pH調節至6與7之間並且將水相用EtOAc (10 mL × 3)萃取。 將經合併之有機層用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮，得到呈黃色油狀之8SO2BzL-1f (0.23 g，粗製物)。 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 8.16-8.06 (m, 4H), 7.61-7.54 (m, 2H), 7.49 (dd, J = 1.6, 8.0 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 3.82 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.89 (s, 2H), 1.70-1.55 (m, 2H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 472.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 472.1 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]磺醯基]苯甲醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯8SO2BzL-1g之製備
在25℃下向 8SO2BzL-1f (0.2 g, 424 umol, 1.0 eq)於DMF (4 mL)中之混合物中整份添加3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯(248 mg, 424 umol, 1.0eq)、DIEA (164 mg, 1.27 mmol, 222 uL, 3.0 eq)及 氮雜苯并***四甲基脲六氟磷酸鹽 (HATU，CAS Reg. No. 148893-10-1) (177 mg, 467 umol, 1.1 eq)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。   將混合物用水稀釋且用EtOAc (30 mL x 3)萃取。 將有機層用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮，得到呈黃色油狀之8SO2BzL-1g(0.5 g，粗製物)。LC/MS [M+H] 1039.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1039.5 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]磺醯基]苯甲醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸8SO2BzL-1h之製備
在25℃下向8SO2BzL-1g (0.5 g, 481 umol, 1.0 eq)於CH 3CN (1 mL)及H 2O (3 mL)中之混合物中整份添加TFA (439 mg, 3.85 mmol, 285 uL, 8.0 eq)，且然後在80℃下攪拌1小時。  將混合物濃縮，得到殘餘物。 藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-35%，8min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之8SO2BzL- 1h (0.15 g, 152.57 umol, 31.71%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.14-8.08 (m, 2H), 8.06-7.95 (m, 4H), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 3.94 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.75-3.70 (m, 4H), 3.65-3.50 (m, 40H), 3.40 (s, 2H), 2.53 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.82-1.69 (m, 2H), 1.16 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 982.45 (計算值)；LC/MS [M+H] 983.4 (觀測值)。 8SO2BzL-1之製備
在25℃下向8SO2BzL-1h(0.15 g, 152.57 umol, 1.0 eq)於DCM (3 mL)及DMA (0.5 mL)中之混合物中整份添加2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(164 mg, 610 umol, 4.0 eq)及EDCI (146 mg, 763 umol, 5.0 eq) ，且然後在25℃下攪拌0.5 h。  將混合物濃縮，得到殘餘物。 藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-40%，8 min)純化殘餘物，得到呈淺黃色固體狀之8SO2BzL-1 (58.9 mg, 48.63 umol, 31.87%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.11-8.06 (m, 2H), 8.05-7.99 (m, 3H), 7.95 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 3.93 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.67-3.53 (m, 34H), 3.53-3.48 (m, 6H), 3.42 (s, 2H), 2.97 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.83-1.65 (m, 2H), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1211.4 (計算值)；LC/MS [M+H] 1211.3 (觀測值)。 實例L-2      2-胺基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基羰基胺基]乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-磺酸8SO2BzL-2之合成 2-胺基-4-[2-(三級丁氧基羰基胺基)乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-磺酸8SO2BzL-2b之製備
在25℃下向N-[2-[(2-胺基-8-芐基硫基-3H-1-苯并氮呯-4-羰基)-丙基-胺基]氧乙基]胺基甲酸三級丁酯8SO2BzL-2a (0.15 g, 286 umol , 1.0 eq)於H 2O (0.15 mL)及AcOH (0.5 mL)中之混合物中整份添加N-氯代琥珀醯亞胺NCS (153 mg，1.14 mmol，4.0 eq)，且然後在25℃下攪拌1 h。  將混合物用NaHCO3稀釋以調節pH至7與8之間。  然後用EtOAc (10 mL x 3)萃取混合物。 將有機層用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。 藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(TFA)-ACN]；B%：5%-35%，8min)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之8SO2BzL-2b (11.5 mg, 23.83 umol, 8.34%產率)。 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 11.87 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.55 (s, 2H), 7.34-7.27 (m, 1H), 3.92-3.78 (m, 2H), 3.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 3.16-3.01 (m, 2H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 0.89(t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 483.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 483.1 (觀測值)。 2-胺基-4-[2-胺基乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1- 苯并氮呯-8-磺酸8SO2BzL-2c之製備
向8SO2BzL-2b (150 mg, 310.85 umol, 1 eq)於EtOAc (10.0 mL)中之溶液中添加HCl/EtOAc (4 M, 20.0 mL, 257 eq)，且然後在25℃下攪拌1 h。 濃縮混合物，得到呈白色固體狀之8SO2BzL-2c (200 mg，粗製物)。LC/MS [M+H] 383.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 383.2 (觀測值)。 8SO2BzL-2之製備
向8SO2BzL-2c (70.0 mg, 167.11 umol, 1 eq, HCl)於DMF (1.00 mL)中之溶液中添加DIEA (90.0 mg, 668 umol, 120 uL, 4 eq)及2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基 (4-硝基苯基)碳酸酯 (70.0 mg, 83.5 umol, 0.5 eq)，且然後在0℃下攪拌1 h。將混合物過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(TFA)-ACN]；B%：1%-30%，8 min)純化，得到呈淡黃色油狀之 8SO2BzL-2 (15 mg, 12.92 umol, 7.73%產率，TFA)。1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ7.89-7.77 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 6.89 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 3.97 (br t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.86-3.79 (m, 2H), 3.75 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.66-3.58 (m, 38H), 3.56-3.49 (m, 4H), 3.42-3.35 (m, 4H), 1.81-1.73 (m, 2H), 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1047.4 (計算值)；LC/MS [M+H] 1047.7 (觀測值)。 實例L-3      2-胺基-8-(N-(1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基)-N-甲基胺磺醯基)-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-3之合成 2-胺基-N-乙氧基-8-((4-甲氧基苄基)硫基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-3b之製備
向2-胺基-8-溴-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-3a (0.96 g, 1.99 mmol)及4-甲氧基-α-甲苯硫醇(0.37 g, 2.39 mmol)於二噁烷 (10 mL)中之混合物中添加 4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫噸(Xantphos，CAS Reg. No. 161265-03-8 (0.06 g, 0.10 mmol)、Pd 2(dba) 3(0.05 g，0.05 mmol)，然後是三乙胺(0.56 mL，3.99 mmol)。將混合物加熱至回流1 h，然後冷卻。 藉由蒸發去除溶劑，且經12個管柱體積使用1-10% MeOH/DCM梯度藉由矽膠層析純化粗產物，得到8SO2BzL-3b (0.72 g, 82%)。 2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-磺醯氯8SO2BzL-3c之製備
在10攝氏度下，向8SO2BzL-3b (0.72 g，1.64 mmol)於10 mL乙腈/水(9:1)中之溶液中分批添加N-氯代琥珀醯亞胺(0.66 g，4.91 mmol)。 添加完成後，再攪拌20 min，得到8SO2BzL-3c粗產物溶液，原樣用於下一步驟中。 (2-((2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)磺醯基)-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十四烷-34-基)胺基甲酸三級丁酯8SO2BzL-3d之製備
將一份8SO2BzL-3c (1.00 mL, 0.16 mmol)滴加至攪拌中的 (5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十四烷-34-基)胺基甲酸三級丁酯 (0.12 g, 0.19 mmol)及  三乙胺 (0.09 mL, 0.64 mmol)於乙腈(3 mL)中之混合物中。 15 min後將反應濃縮且經10 min使用10-90% ACN/水(+0.1% TFA)梯度藉由逆相層析純化，得到8SO2BzL-3d (0.08 g, 51%)。 2-胺基-8-(N-(32-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷基)-N-甲基胺磺醯基)-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺鹽酸鹽8SO2BzL-3e之製備
向8SO2BzL-3d (0.08 g, 0.08 mmol)於ACN (3 mL)中之溶液中添加HCl水溶液(6M，3mL)且將混合物在室溫下攪拌45 min。  去除溶劑且將分離之糖漿與ACN (3 mL)共沸，得到呈朦朧白色膜之8SO2BzL-3e之HCl鹽(0.06 g, 85%)。 8SO2BzL-3之製備
向8SO2BzL-3e HCl (0.06 g，0.07 mmol)於DMF(3 mL)中之溶液中添加 三乙胺(0.04 mL，0.28 mmol)。分批添加2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯 (0.02 g, 0.08 mmol)。添加完成後，加入乙酸(9 uL)且真空去除溶劑。藉由逆相HPLC純化後，蒸發溶劑後得到呈透明油狀之8SO2BzL-3 (0.03 g, 48%)。LC/MS [M+H] 1001.48 (計算值)；LC/MS [M+H] 1074.88 (觀測值)。 實例L-4      2-胺基-8-(N-(1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基)胺磺醯基)-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-4之合成 (32-((2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯)-8-磺醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷基)胺基甲酸三級丁酯8SO2BzL-4b之製備
向(32-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷基)胺基甲酸三級丁酯、Boc-胺基-PEG10-胺(0.10 g，0.16 mmol)及DIPEA (0.14 mL, 0.80 mmol)於DMF (4 mL)中之溶液中添加2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-磺醯氯8SO2BzL-4a (0.16 M, 1.00 mL, 0.16 mmol)於DMF中之溶液。 20 min後將反應濃縮，且然後經10 min使用10-90% ACN/水梯度在逆相HPLC上純化，去除溶劑後得到8SO2BzL-4b (0.07 g, 47%)。 2-胺基-8-(N-(32-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷基)胺磺醯基)-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺SO2BzL-4c之製備
向8SO2BzL-4b (0.07 g, 0.07 mmol)於乙腈(3 mL)中之溶液中添加HCl水溶液(6M，3 mL)且將混合物在室溫下攪拌45 min。  去除溶劑且將分離之糖漿與ACN (3 mL)共沸，得到呈朦朧白色膜之8SO2BzL-4c HCl鹽(0.06 g, 82%) 。 8SO2BzL-4之製備
向8SO2BzL-4c HCl (0.06 g, 0.06 mmol)於DMF (3 mL)中之溶液中添加  三乙胺(0.03 mL, 0.25 mmol)。  分批添加2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(0.02 g, 0.07 mmol)。 添加完成後，加入乙酸(9 uL)且真空去除溶劑。 藉由逆相HPLC純化後，去除溶劑後得到8SO2BzL-4 (0.04 g，69％)。 LC/MS [M+H] 987.45(計算值)； LC/MS [M+H] 987.86(觀測值)。 實例L-5      (2-((2-胺基-N-丙基-8-胺磺醯基-3H--苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基 酯8SO2BzL-5之合成 (2-((2-胺基-8-((4-甲氧基苄基)硫基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-b之製備
向(2-((2-胺基-8-溴-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-5a (0.96 g, 1.99 mmol)及 4-甲氧基-α-甲苯硫醇(0.37 g，2.39 mmol)於二噁烷(10 mL)中之混合物中添加Xantphos (0.06 g，0.10 mmol)、Pd 2(dba) 3(0.05 g，0.05 mmol)，然後是 三乙胺(0.56 mL，3.99 mmol)。 將混合物加熱至回流1 h，然後冷卻。 藉由蒸發去除溶劑，且經12個管柱體積使用1-10% MeOH/DCM梯度，藉由矽膠層析純化粗產物，得到呈黃色固體狀之8SO2BzL-5b (0.78 g, 71%)。 (2-((2-胺基-8-(氯磺醯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-5c之製備
在0攝氏度下，向8SO2BzL-5b (0.78 g, 1.41 mmol)於乙腈/水(9:1，10 mL)中之溶液中分三等份添加N-氯代琥珀醯亞胺(0.56 g, 4.22 mmol)。 添加完成後，產物8SO2BzL-5c不經進一步純化原樣使用。 (2-((2-胺基-N-丙基-8-胺磺醯基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-5d之製備
在0度下向8SO2BzL-5c (2.00 mL, 0.28 mmol)於乙腈/水(9:1)中之溶液中添加氫氧化銨溶液(0.20 mL, 1.66 mmol)。 10 min後去除溶劑，且使用10-90%乙腈/水梯度藉由逆相HPLC純化粗產物，蒸發溶劑後得到呈黃色膜之8SO2BzL-5d (0.06 g, 41%)。 8SO2BzL-5e之製備
在室溫下將8SO2BzL-5e (0.06 g, 0.11 mmol)於乙腈 (2 mL)及6 N HCl (2.00 mL, 12.00 mmol)中之溶液攪拌45 min。 真空去除溶劑，得到8SO2BzL-5e HCl鹽(0.05 g, 101%)。 8SO2BzL-5之製備
在室溫下向8SO2BzL-5e (0.04 g，0.10 mmol)於DMF (4 mL)中之溶液中添加三乙胺(0.06 mL，0.40 mmol)。向此混合物中添加1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基(4-硝基苯基)碳酸酯PNPC-PEG10-Mal (0.08 g, 0.10 mmol)於DMF (2 mL)中之溶液  。 20 min後添加乙酸 (6 uL)，將反應在真空下濃縮，且經10 min使用10-90% ACN/水 (+0.1% TFA)梯度藉由逆相HPLC純化，濃縮純級分後得到8SO2BzL-5 (0.04 g, 37%)。LC/MS [M+H] 1046.45 (計算值)；LC/MS [M+H] 1046.88 (觀測值)。 實例L-6      1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基 (2-((2-胺基-8-(N,N-二甲基胺磺醯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸酯8SO2BzL-6之合成 N-[2-[(2-胺基-8-苄基硫基-3H-1-苯并氮呯-4-羰基)-丙基-胺基]氧基乙基]胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-6b之製備
在25℃下在N2下向N-[2-[(2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羰基)-丙基-胺基]氧基乙基]胺基甲酸三級丁酯8SO2BzL-6a (0.5 g, 1.04 mmol , 1.0 eq)及芐硫醇(benzylthiol/benzylmercaptan/phenylmethanethiol, BnSH, CAS Reg. No. 100-53-8) (155 mg，1.25 mmol，146.05 uL，1.2 eq)於二噁烷(15 mL)中之混合物中整份添加 4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫噸(Xantphos，CAS Reg. No. 161265-03-8) (120 mg, 208 umol, 0.2 eq)、(參)二亞苄基丙酮)二鈀Pd 2(dba) 3(CAS Reg. No. 51364-51-3) (190 mg, 208 umol, 0.2 eq)及二異丙基乙胺DIEA (268 mg, 2.08 mmol, 362 uL, 2.0 eq)，且然後在110℃下攪拌2 h。  將該混合物用水(20 mL)稀釋且用EtOAc (10 mL x 3)萃取。 將有機層用鹽水洗滌，經由Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。 將混合物進一步藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(TFA)-ACN]；B%：25%-55%，8min)純化，得到呈黃色固體狀之8SO2BzL-6b (0.5 g, 952.97 umol, 91.75% 產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.43-7.38 (m, 3H), 7.36-7.22 (m, 5H), 4.30 (s, 2H), 3.91 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.32 (s, 2H), 3.24 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 1.81-1.70 (m, 2H), 1.34 (s, 9H), 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 525.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 525.2 (觀測值)。 N-[2-[[2-胺基-8-(二甲基胺磺醯基)-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]氧基乙基]胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-6c之製備
在25℃下向8SO2BzL-6b (50.0 mg, 95.30 umol, 1 eq)於CH 3CN (1.00 mL)及H 2O (0.10 mL)中之溶液中添加AcOH (60.0 mg, 953 umol, 50.0 uL, 10 eq)、N-氯代琥珀醯亞胺NCS (50.0 mg, 381 umol, 4 eq) ，且然後在此溫度下攪拌10 min，然後添加N-甲基甲胺鹽酸鹽/二甲胺 HCl (80.0 mg, 953 umol, 10 eq)及DIEA (250 mg, 1.91 mmol, 330 uL, 20 eq)。 將混合物在0℃下再攪拌1 h。 將混合物過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相: [水(TFA)-ACN]；B%: 10%-40%，8min)純化，得到呈白色固體狀之8SO2BzL-6c (12 mg, 23.55 umol, 24.71%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ7.92-7.72 (m, 3H), 7.50 (s, 1H), 3.94 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.75 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.44 (s, 2H), 3.26 (br t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.77 (s, 6H), 1.77 (sxt, J = 7.2 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H), 0.99 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 510.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 510.3 (觀測值)。 2-胺基-N-(2-胺基乙氧基)-8-(N,N-二甲基胺磺醯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺鹽酸鹽8SO2BzL-6d之製備
在室溫下將8SO2BzL-6c (0.04 g, 0.08 mmol)於乙腈 (2 mL)及6 N HCl (1.41 mL, 8.46 mmol)中之溶液攪拌45分鐘。 真空去除溶劑，得到8SO2BzL-6d (0.04 g, 100%)。 8SO2BzL-6之製備
在室溫下向8SO2BzL-6d (0.04 g, 0.10 mmol)於DMF (4 mL)中之溶液中添加三乙胺 (0.04 mL, 0.28 mmol)。向此混合物中添加1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基(4-硝基苯基)碳酸酯(0.06 g, 0.07 mmol)於DMF (2 mL)中之溶液。 20 min後添加乙酸 (6 uL)，將反應在真空下濃縮，且經10 min使用10-90% ACB/水 (+0.1% TFA)梯度藉由逆相HPLC純化，濃縮純級分後得到8SO2BzL-6 (0.04 g, 51%)。LC/MS [M+H] 1074.48 (計算值)；LC/MS [M+H] 1074.90 (觀測值)。 實例L-9      2-胺基-8-(N-(1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基)胺磺醯基)-N,N-二丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-9之合成 2-胺基-8-((4-甲氧基苄基)硫基)-N,N-二丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-9b之製備
向2-胺基-8-溴-N,N-二丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-9a (0.96 g, 1.99 mmol)及4-甲氧基-α-甲苯硫醇(0.37 g，2.39 mmol)於二噁烷(10 mL)中之混合物中添加Xantphos (0.06 g，0.10 mmol)、Pd 2(dba) 3(0.05 g，0.05 mmol)，然後是三乙胺(0.56 mL，3.99 mmol)。 將混合物加熱至回流1 h，然後冷卻。 藉由蒸發去除溶劑，且經12個管柱體積使用1-10% MeOH/DCM梯度藉由矽膠層析純化粗產物，得到8SO2BzL-9b (0.69 g, 79%)。 2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-磺醯氯8SO2BzL-9c之製備
在  10攝氏度下，向8SO2BzL-9b (0.68 g, 1.55 mmol)於10 mL乙腈/水(9:1)中之溶液中分三等份添加N-氯代琥珀醯亞胺NCS (0.62 g, 4.66 mmol)。 添加完成後，再攪拌20 min，得到8SO2BzL-9c。 (32-((2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯)-8-磺醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷基)胺基甲酸三級丁酯8SO2BzL-9d之製備
將一份先前獲得的8SO2BzL-9c (1.00 mL, 0.15 mmol)滴加至攪拌中的(32-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷基)胺基甲酸三級丁酯(0.11 g, 0.18 mmol)及三乙胺 (0.08 mL, 0.60 mmol)於乙腈(3 mL)中之混合物中。  15 min後將反應濃縮且經10 min使用10-90% ACN/水(+0.1% TFA)梯度藉由逆相層析純化，得到8SO2BzL-9d (0.07 g, 51%)。 2-胺基-8-(N-(32-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷基)胺磺醯基)-N,N-二丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-9e之製備
向8SO2BzL-9d (0.07 g, 0.08 mmol)於乙腈(3 mL)中之溶液中添加HCl水溶液(6M，3 mL)且將混合物在室溫下攪拌45 min。  去除溶劑且將分離之糖漿與乙腈(3 mL)共沸，得到呈朦朧白色膜之8SO2BzL-9e HCl鹽(0.06 g, 86%)。 8SO2BzL-9之製備
向8SO2BzL-9e HCl (0.06 g, 0.06 mmol)於DMF (3 mL)中之溶液中添加  三乙胺(0.03 mL, 0.25 mmol)。 分批添加2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(0.02 g, 0.07 mmol)。 添加完成後，加入乙酸(9 uL)且真空去除溶劑。 藉由逆相HPLC純化後，蒸發後得到8SO2BzL-9 (0.03 g, 43%)。LC/MS [M+H] 985.47 (計算值)；LC/MS [M+H] 985.88 (觀測值)。 實例L-10    2-胺基-8-(N-(1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基)-N-甲基胺磺醯基)-N,N-二丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-10之合成 (2-((2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)磺醯基)-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十四烷-34-基)胺基甲酸三級丁酯8SO2BzL-10b之製備
將2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基磺醯氯8SO2BzL-10a (1.00 mL, 0.15 mmol)於乙腈中之溶液滴加至攪拌中的 (5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十四烷-34-基)胺基甲酸三級丁酯(0.11 g, 0.18 mmol)及三乙胺(0.08 mL, 0.60 mmol)於乙腈(3 mL)中之混合物中。  15 min後將反應濃縮且經10 min使用10-90% ACN/水(+0.1% TFA)梯度藉由逆相層析純化，得到8SO2BzL-10b (0.05 g, 37%)。 2-胺基-8-(N-(32-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷基)-N-甲基胺磺醯基)-N,N-二丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-10c之製備
向8SO2BzL-10b (0.05 g, 0.05 mmol)於乙腈(3 mL)中之溶液中添加HCl水溶液(6M，3 mL)且將混合物在室溫RT下攪拌45 min。  去除溶劑且將分離之糖漿與ACN (3 mL)共沸，得到呈朦朧白色膜之8SO2BzL-10c HCl鹽(0.04 g, 91%)。 8SO2BzL-10之製備
向8SO2BzL-10c HCl (0.04 g, 0.05 mmol)於DMF (3 mL)中之溶液中添加  三乙胺 (0.03 mL, 0.20 mmol)。 分批添加2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(0.02 g, 0.06 mmol)。  添加完成後，加入乙酸(9 uL)且真空去除溶劑。藉由逆相HPLC純化後，蒸發後得到8SO2BzL-10 (0.02 g, 42%)。 LC/MS [M+H] 999.49 (計算值)；LC/MS [M+H] 999.92 (觀測值)。 實例L-12           2-胺基-6-[5-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基胺基]戊基]-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-磺酸8SO2BzL-12之合成 2-胺基-8-溴-N-乙氧基-6-碘-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-12b之製備
向2-胺基-8-溴-6-碘-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸8SO2BzL-12a (2.0 g, 4.91 mmol, 1.0 eq)於DCM (20 mL)及DMA (10 mL)中之溶液中添加甲磺酸CH 3SO 3H (472 mg, 4.91 mmol, 350 uL, 1.0 eq)、N-乙氧基丙-1-胺 (823 mg, 5.90 mmol, 1.2 eq, HCl)及EDCI (3.77 g, 19.7 mmol, 4 eq)。 將混合物在25℃下攪拌2 h。 用飽和Na 2CO 3將反應混合物之pH調節至約9。 將水相用乙酸乙酯(50 mL x 3)萃取。將經合併之有機相用鹽水(20 mL x 2)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。  將粗產物與EtOAc在25℃下研磨10min，得到呈黃色固體狀之 8SO2BzL-12b (1.24 g, 2.52 mmol, 51.3%產率)。  LC/MS [M+H] 491.97 (計算值)；LC/MS [M+H] 491.9 (觀測值)。 N-[5-[2-胺基-8-溴-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-6-基]戊-4-炔基]胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-12c之製備
將8SO2BzL-12b (800 mg，1.63 mmol，1.0 eq)、N-戊-4-炔基胺基甲酸三級丁酯(328 mg，1.79 mmol，1.1 eq)、Pd(PPh 3) 2Cl 2(114 mg， 163 umol, 0.1 eq)、碘化亞銅CuI (61.9 mg, 325 umol, 0.2 eq)於DMF (16 mL)及Et 3N (6 mL)中之混合物脫氣且用N 2吹掃3次，然後在N 2氣氛下於80℃攪拌2 h。將混合物倒入冰水(w/w = 1/1) (20 mL)中且攪拌10 min。將水相用乙酸乙酯(30 mL x 3)萃取。  將經合併之有機相用鹽水(20 mL x 2)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。 藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/0, 2/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之8SO2BzL-12c (690 mg, 1.26 mmol, 77.5%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 7.53 (s, 1H), 7.27 (s, 2H), 3.93 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.19 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.90-2.83 (m, 2H), 2.51 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.82-1.70 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。 LC/MS [M+H] 547.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 547.2 (觀測值)。 N-[5-[2-胺基-8-苄基硫基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-6-基]戊-4-炔基]胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-12d之製備
將8SO2BzL-12c (350 mg，639 umol，1.0 eq)、苄硫醇BnSH(0.25 g，2.01 mmol，236 uL，3.15 eq)、DIEA(165 mg，1.28 mmol，223 uL，2.0 eq)、Xantphos (74.0 mg, 128 umol, 0.2 eq)及Pd 2(dba) 3(117 mg, 128 umol, 0.2 eq)於二噁烷(10 mL)中之混合物脫氣且用N 2吹掃3次，然後在N 2氣氛下於110℃攪拌 1 h。 將殘餘物倒入到冰水(w/w = 1/1) (10 mL)中且攪拌5 min。將水相用乙酸乙酯(10 mL x 3)萃取。 將經合併之有機相用鹽水(10 mL x 1)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。 藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/0, 0/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之8SO2BzL-12d (300 mg, 508 umol, 79.4%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 7.56 (s, 1H), 7.37-7.34 (m, 2H), 7.30-7.19 (m, 3H), 7.09 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.20 (s, 2H), 3.93 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.30 (s, 2H), 3.19 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.49 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.81-1.72 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.16 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。 LC/MS [M+H] 591.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 591.3 (觀測值)。 N-[5-[2-胺基-8-氯磺酰基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-6-基]戊-4-炔基]胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-12e之製備
向8SO2BzL-12d (300 mg，508 umol，1.0 eq)於MeCN (6 mL)及H 2O (0.6 mL)中之溶液中添加AcOH (305 mg，5.08 mmol，290 uL，10 eq)及NCS (271 mg, 2.03 mmol, 4.0 eq)，且然後在25℃下攪拌1 h。將反應混合物倒入到冰水 (w/w = 1/1) (10 mL)中且攪拌 5 min。將水相用乙酸乙酯(10 mL × 3)萃取，將經合併之有機相用無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮，得到呈黃色油狀之粗產物8SO2BzL-12e (250 mg, 441 umol, 86.8%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟中。  LC/MS [M+H] 567.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 567.3 (觀測值)。 2-胺基-6-(5-胺基戊-1-炔基)-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-磺酸8SO2BzL-12f之製備
在100℃下將8SO2BzL-12e (250 mg，441 umol，1.0 eq)於MeCN (2.5 mL)及H 2O (13 mL)中之溶液攪拌1 h。 在真空中濃縮混合物。 呈黃色固體狀之粗產物8SO2BzL-12f (200 mg, 412 umol, 93.5%產率, HCl)不經進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS [M+H]   449.18 (計算值)；LC/MS [M+H] 449.1 (觀測值)。 2-胺基-6-[5-(三級丁氧基羰基胺基)戊-1-炔基]- 4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-磺酸8SO2BzL-12g之製備
向8SO2BzL-12f (200 mg, 446 umol, 1.0 eq)於THF (5 mL)及H 2O (5 mL)中之溶液中添加NaHCO 3(112 mg，1.34 mmol，52 uL，3.0 eq)及Boc 2O (146 mg, 669 umol, 154 uL, 1.5 eq)，且然後在25℃下攪拌 1 h。 在30℃下在減壓下濃縮混合物。 藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(TFA)-ACN]；B%: 10%-40%，8min)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之8SO2BzL-12g (100 mg, 182 umol, 40.9%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 7.84 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 3.98 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.38 (s, 2H), 3.18 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.54 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.81-1.76 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。  LC/MS [M+H] 549.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 549.3 (觀測值)。 2-胺基-6-[5-(三級丁氧基羰基胺基)戊基]-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-磺酸8SO2BzL-12h之製備
將8SO2BzL-12g (100 mg，182 umol，1.0 eq)、Pd(OH) 2/C (64.0 mg，91.1 umol，20% 純度，0.5 eq)於MeOH (10 mL)中之混合物脫氣且用 H 2(367 ug, 182 umol, 1 eq)吹掃3 次，然後在H 2(30 psi)氣氛下於25℃攪拌1 h。 將混合物過濾。 藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(TFA)-ACN]；B%: 5%-55%，8min)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之8SO2BzL-12h (72 mg, 130 umol, 71.5%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 7.70 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 3.98 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.36 (s, 2H), 3.02 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.84 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.83-1.74 (m, 2H), 1.71-1.59 (m, 2H), 1.52-1.34 (m, 13H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 553.26 (計算值)；LC/MS [M+H] 553.2 (觀測值)。 2-胺基-6-(5-胺基戊基)-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-磺酸8SO2BzL-12i之製備
向8SO2BzL-12h (60 mg, 108 umol, 1 eq)於EtOAc (2 mL)中之溶液中添加HCl/EtOAc (4 M, 1 mL, 37 eq)，且然後在20℃下攪拌1 h。 將混合物在真空中濃縮，得到呈白色固體狀之8SO2BzL-12i (50 mg, 102 umol, 94.2%產率, HCl)。LC/MS [M+H] 453.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 453.2 (觀測值)。 8SO2BzL-12之製備
向3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(68.2 mg, 102 umol, 1.0 eq)於DMF (1 mL)中之溶液中添加DIEA (66.1 mg, 511 umol, 89 uL, 5.0 eq)、8SO2BzL-12i (50 mg, 102 umol, 1 eq, HCl)及HATU (38.9 mg, 102 umol, 1.0 eq)。 將其在25℃下攪拌0.5 h。 將混合物過濾且藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(TFA)-ACN]；B%：5%-35%，8min)純化，得到呈黃色油狀之8SO2BzL-12 (14 mg, 12.7 umol, 12.43%產率)  。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 7.72 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 6.91 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 4.01 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.80-3.55 (m, 42H), 3.43-3.35 (m, 4H), 3.19 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.88 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.80 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.74-1.64 (m, 2H), 1.60-1.51 (m, 2H), 1.45-1.43 (m, 2H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.02 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1101.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1101.9 (觀測值)。 實例L-13    1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基 (2-((2-胺基-8-(N-甲基胺磺醯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸酯8SO2BzL-13之合成 (2-((2-胺基-8-(N-甲基胺磺醯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-13b之製備
在0度下向(2-((2-胺基-8-(氯磺醯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺基甲酸三級丁酯8SO2BzL-13a (0.14 M , 2.00 mL, 0.28 mmol)於乙腈/水(9:1)中之溶液中添加甲胺溶液(2 M於THF中，0.70 mL，1.40 mmol)。 10 min後去除溶劑，且使用10-90%乙腈/水梯度藉由逆相HPLC純化粗產物，蒸發溶劑後得到呈黃色膜之8SO2BzL-13b (0.09 g, 68%)。 2-胺基-N-(2-胺基乙氧基)-8-(N-甲基胺磺醯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-13c之製備
在室溫下將8SO2BzL-13b (0.09 g, 0.19 mmol)於乙腈 (2 mL)及   6 N HCl (2.00 mL, 12.00 mmol)中之溶液攪拌45分鐘。 真空去除溶劑，得到8SO2BzL-13c HCl鹽(0.08 g, 99%)。 8SO2BzL-13之製備
在室溫下向8SO2BzL-13c HCl (0.03 g, 0.06 mmol)於DMF (4 mL)中之溶液中添加三乙胺 (0.04 mL, 0.26 mmol)。向此混合物中添加1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十五烷-35-基(4-硝基苯基)碳酸酯PNPC-PEG10-mal (0.05 g, 0.06 mmol)於DMF (2 mL)中之溶液 。 20 min後添加乙酸 (6 uL)，將反應在真空下濃縮，且經10 min使用10-90% ACN/水 (+0.1% TFA)梯度藉由逆相HPLC純化，濃縮純級分後得到8SO2BzL-13 (0.04 g, 52%)。 LC/MS [M+H] 1060.47 (計算值)；LC/MS [M+H] 1060.89 (觀測值)。 實例L-15           2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基 N-[2-[[2-胺基-8-(噻唑-2-基胺磺醯基)-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]氧基乙基]胺甲酸酯8SO2BzL-15之合成 8-溴-2-(三苯甲基胺基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯8SO2BzL-15b之製備
將2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯 8SO2BzL-15a (5 g, 16.1 mmol, 1 eq)、TrtCl (6.76 g, 24.2 mmol, 1.5 eq)、 TEA (4.91 g，48.5 mmol，6.75 mL，3 eq)及DMAP (395 mg，3.23 mmol，0.2 eq) 於DCM (50 mL)中之混合物脫氣且用N 2吹掃3次，且然後在N 2氣氛下於40℃攪拌16 h。  藉由添加H2 O (50 mL)淬滅反應混合物且用 EtOAc (100 mL)萃取。  將經合併之有機層用鹽水(50 mL)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。 藉由管柱層析(SiO 2，石油醚:乙酸乙酯 = 100:1至0:1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之8SO2BzL-15b (7.8 g, 14.1 mmol, 87.4%產率)。LC/MS [M+H] 551.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 551.1 (觀測值)。 8-苄基硫基-2-(三苯甲基胺基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯8SO2BzL-15c之製備
將8SO2BzL-15b (3 g, 5.44 mmol, 1 eq )、DIEA (1.41 g, 10.8 mmol, 1.90 mL, 2 eq、(1E,4E)-1,5-二苯基戊-1,4-二烯-3-酮-;鈀Pd 2(dba) 3(CAS Reg. No. 51364-51-3) (996 mg, 1.09 mmol, 0.2 eq)  及(5-二苯基膦基-9,9-二甲基-xanthen-4-基)-二苯基-膦烷Xphos (629 mg, 1.09 mmol, 0.2 eq)於二噁烷(30 mL)之混合物 )脫氣且用N 2吹掃3次，然後添加苄硫醇BnSH(1.35 g，10.8 mmol，1.27 mL， 2 eq)，將混合物在N 2氣氛下於110℃攪拌1 h。藉由添加H 2O (50 mL)淬滅反應混合物且用EtOAc (100 mL x 2)萃取。 將經合併之有機層用鹽水(100 mL)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由  管柱層析(SiO 2，石油醚 :乙酸乙酯= 100:1至 0:18)純化殘餘物，得到呈黃 色油狀之8SO2BzL-15c (2.3 g, 3.87 mmol, 71.1%產率)。 8-氯磺醯基-2-(三苯甲基胺基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯8SO2BzL-15d之製備
在25℃下將 8SO2BzL-15c (3 g，5.04 mmol，1 eq)、NCS (2.69 g，20.2 mmol，4 eq)、AcOH (3.03 g，50.4 mmol，2.88 mL，10 eq)於MeCN(30 mL)及H2O (3 mL)中之混合物攪拌1 h。 藉由添加H2O (50 mL)淬滅反應混合物且用EtOAc (50 mL)萃取。 將經合併之有機層用鹽水(50 mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO2， 石油醚:乙酸乙酯= 99:1至 0:1)純化殘餘物，得到呈黃 色固體狀之8SO2BzL-15d (2 g, 3.50 mmol, 69.4%產率)。 LC/MS [M+H] 571.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 571.2 (觀測值)。 8-(噻唑-2-基胺磺醯基)-2-(三苯甲基胺基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯8SO2BzL-15e之製備
將 8SO2BzL-15d (1.5 g，2.63 mmol，1 eq)及1-甲基咪唑(258 mg，3.15 mmol，251 uL，1.2 eq)於MeCN (30 mL)中之混合物脫氣且用 N 2吹掃3次，然後在N 2氣氛下於25℃攪拌2 h。 然後添加4,5-二氫噻唑-2-胺(1.07g，10.5mmol，4 eq)且將所得混合物在N 2氣氛下於25℃再攪拌16 h。 藉由添加H 2O (50 mL)淬滅反 應混合物且用EtOAc (50mL)萃取。將經合併之有機層用鹽水(100 mL)洗滌，經 Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。   藉由管柱層析(SiO 2， 石油醚:乙酸乙酯=100:1 至0:1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之8SO2BzL-15e (0.5 g, 787 umol, 29.9%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ7.71 (s, 1H), 7.23 (m, 20H), 6.75 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.36 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.98 (s, 2H), 1.38 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 635.17 (計算值)；LC/MS [M+H] 635.1 (觀測值)。 8-(N-(噻唑-2-基)胺磺醯基)-2-(三苯甲基胺基)-3H-苯并[b]氮呯-4-甲酸8SO2BzL-15f之製備
在25℃下將 8SO2BzL-15e (0.5 g，787.69 umol，1 eq)、LiOH.H2O (264 mg，6.30 mmol，8 eq)於H2O (4 mL)及THF (4 mL)中之混合物攪拌3 h。 藉由添加2M HCl調節pH＝約6來淬滅反應溶液，然後過濾得到呈白色固體狀之 8SO2BzL-15f (0.45 g，699.66 umol，88.82％產率，HCl)。LC/MS [M+H]   607.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 607.2 (觀測值)。 N-[2-[丙基-[8-(噻唑-2-基胺磺醯基)-2-(三苯甲基胺基)-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]胺基]氧基乙基]胺甲酸三級丁酯8SO2BzL-15g之製備
將8SO2BzL-15f (0.42 g, 692 umol, 1eq )、N-[2-(丙基胺基氧基)乙基]胺甲酸三級丁酯(181 mg, 830 umol, 1.2 eq)、甲磺酸 (133 mg, 1.38 mmol, 98.5 uL, 2 eq )、EDCI (663 mg, 3.46 mmol, 5 eq)於DMA (5 mL)及DCM (5 mL)中之混合物除氣且用N 2吹掃3次，然後在N 2氣氛下於25℃攪拌1 h。藉由添加Na 2HCO 3(3 mL)直至pH為約7來淬滅反應混合物，且用 EtOAc (5 mL*3)萃取。將經合併之有機層用鹽水(5 mL)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。  藉由管柱層析(SiO 2， 石油醚:乙酸乙酯＝99:1至20:80) 純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之8SO2BzL-15g (0.5 g，619 umol，89.5％產率)。 LC/MS [M+H] 807.3(計算值)； LC/MS [M+H] 807.3(觀測值)。 2-胺基-N-(2-胺基乙氧基)-N-丙基-8-(噻唑-2-基胺磺醯基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺8SO2BzL-15h之製備
在25 ℃下將 8SO2BzL-15g (0.5 g，619 umol，1 eq)、TFA (5.65 g，49.5 mmol，3.67 mL，80 eq)於DCM (10 mL)中之混合物攪拌16 h。  藉由添加H 2O (5 mL)來淬滅反應混合物，且用 MTBE (10 mL) (5 mL x 2)萃取以去除過量TFA。 將經合併之水層在減壓下濃縮，得到呈白色固體之8SO2BzL-15h (0.25 g，432 umol，69.7％產率，TFA)。LC/MS [M+H]   465.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 465.1 (觀測值)。 8SO2BzL-15之製備
將8SO2BzL-15h (0.2 g, 288 umol, 1eq, 2TFA)、2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基 (4-硝基苯基)碳酸酯(232 mg, 288 umol, 1eq)、 DIEA (111 mg, 866 umol, 150 uL, 3 eq)於DMF (0.5 mL)中之混合物除氣且用N 2淨化3次，然後在N 2氣氛下於0℃攪拌1 h。  用TFA淬滅反應溶液，直到pH = 約6。  藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80 x 30mm x 3um；流動相：[水(TFA)-ACN]；B%：15%-40%，8 min)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之8SO2BzL-15  (15.0 mg, 13.2 umol, 4.6%產率)。 1H NMR (MeOD-d 4, 400 MHz) δ7.97 (s, 1H), 7.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.18 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.90 (s, 2H), 6.81 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.17 (s, 2H), 3.74 (m, 2H), 3.67 (m, 2H), 3.59 (m, 42H), 3.38 (m, 6H), 1.80-1.72 (m, 2H) 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1129.4 (計算值)；LC/MS [M+H] 1129.5 (觀測值)。 實例201 免疫結合物(IC)之製備
為了製備離胺酸結合之免疫結合物，使用G-25 SEPHADEX TM脫鹽管柱(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)或Zeba™ Spin脫鹽管柱(Thermo Fisher Scientific)將抗體緩衝液交換至含有100 mM硼酸、50 mM氯化鈉、1 mM乙二胺四乙酸之結合緩衝液(pH 8.3)中。然後使用緩衝液將析出液各自調節至約1-10 mg/ml之濃度且然後無菌過濾。將抗體預升溫至20-30℃並與在二甲亞碸(DMSO)或二甲基乙醯胺(DMA)中溶解至濃度為5至20 mM的2-20 (例如7-10)莫耳當量之式II之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子(8SO2Bz-L)化合物之四氟苯基(TFP)或磺酸四氟苯基(sulfoTFP)酯快速混合。使反應在30℃下進行約16小時，且然後藉由在以pH 7.2磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)平衡之兩個連續G-25脫鹽管柱或Zeba™ Spin 脫鹽管柱上運行，將免疫結合物(IC)自反應物分離，提供表3a及3b之免疫結合物(IC)。在連接至XEVO TMG2-XS TOF質譜儀(Waters Corporation)之ACQUITY TMUPLC H級(Waters Corporation, Milford, MA)上使用C4逆相管柱藉由液相層析質譜分析確定佐劑-抗體比(DAR)。
為了製備經半胱胺酸結合之免疫結合物，使用Zeba™ Spin脫鹽管柱(Thermo Fisher Scientific)將抗體緩衝液交換到含有PBS pH 7.2及2 mM EDTA之結合緩衝液中。使用2至4莫耳過量之三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)在37℃下還原鏈間二硫鍵達30 min – 2小時。使用以結合緩衝液預平衡之Zeba™ Spin脫鹽管柱移除過量TCEP或DTT。使用結合緩衝液將經緩衝液交換之抗體之濃度調節至大約5至20 mg/ml且進行無菌過濾。將順丁烯二醯亞胺-8SO2Bz-L化合物溶解於二甲基亞碸(DMSO)或二甲基乙醯胺(DMA)中，至5至20 mM濃度。對於結合，將抗體與10至20莫耳當量之順丁烯二醯亞胺-8SO2Bz-L混合。在某些情況下，添加多至20% (v/v)之額外DMA或DMSO以提高順丁烯二醯亞胺-8SO2Bz-L於結合緩衝液中之溶解度。使反應在20℃下進行大約30 min至4小時。使用兩個連續Zeba™ Spin脫鹽管柱將所得結合物自未經反應之順丁烯二醯亞胺-8SO2Bz-L中純化。將該等管柱用pH 7.2磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)預平衡。在連接至XEVO TMG2-XS TOF質譜儀(Waters Corporation)之ACQUITY TMUPLC H級(Waters Corporation, Milford, MA)上使用C4逆相管柱藉由液相層析質譜分析評估佐劑與抗體比(DAR)。
對於結合，可將抗體溶解於此項技術中已知不會不利地影響抗體之穩定性或抗原結合特異性之水性緩衝系統中。可使用磷酸鹽緩衝鹽水。將8SO2Bz-L化合物溶解於包含如本文別處所描述之至少一種極性非質子溶劑的溶劑系統中。在一些此等態樣中，將8SO2Bz-L在pH 8 Tris緩衝液(例如50 mM Tris)中溶解至濃度為約5 mM、約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM或約50 mM，及其範圍，諸如約5 mM至約50 mM或約10 mM至約30 mM。在一些態樣中，將8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子中間物溶解於DMSO (二甲亞碸)、DMA (二甲基乙醯胺)、乙腈或另一種適合的偶極非質子溶劑中。
或者，在結合反應中，可將當量過量之8SO2Bz-L溶液稀釋且與抗體溶液組合。可將8SO2Bz-L溶液適當地用至少一種極性非質子溶劑及至少一種極性質子溶劑稀釋，該等溶劑之實例包括水、甲醇、乙醇、正丙醇及乙酸。8SO2Bz-L中間物與抗體之莫耳當量可為約1.5:1、約3:1、約5:1、約10:1、約15:1或約20:1，及其範圍，諸如約1.5:1至約20:1、約1.5:1至約15:1、約1.5:1至約10:1、約3:1至約15:1、約3:1至約10:1、約5:1至約15:1或約5:1至約10:1。 可適當地藉由此項技術中已知之方法(諸如LC-MS)監測反應是否完成。結合反應通常在約1小時至約16小時範圍內完成。 反應完成後，可將試劑添加至反應混合物中以淬滅反應。若抗體硫醇基與8SO2Bz-L連接子中間物之硫醇-反應性基團(諸如順丁烯二醯亞胺)反應，則未反應之抗體硫醇基可與封端試劑反應。適合封端試劑之實例為乙基順丁烯二醯亞胺。
結合後，免疫結合物可藉由此項技術中已知之純化方法自未結合反應物及/或結合物聚集物純化及分離，該等純化方法諸如例如且不限於尺寸排阻層析、疏水性相互作用層析、離子交換層析、聚焦層析、超濾、離心超濾、切向流過濾及其組合。例如，純化之前可在20 mM丁二酸鈉pH 5中稀釋免疫結合物。將稀釋溶液施加到陽離子交換管柱，隨後用例如至少10個管柱體積之20 mM丁二酸鈉pH 5洗滌。結合物可適合地用緩衝液諸如PBS溶析。 實例202 HEK報導子檢定
表現人類TLR7或人類TLR8之HEK293報導細胞係購自Invivogen且在細胞繁殖及實驗中遵循廠商協議。簡單來說，使細胞在5% CO 2下在補充有10% FBS、吉歐黴素(Zeocin)及殺稻瘟菌素(Blasticidin)之DMEM中生長至80-85%匯合。然後將細胞以4x10 4個細胞/孔接種於具有含有HEK偵測培養基及免疫刺激分子之基質的96孔平板中。使用讀板儀在620-655 nm波長下量測活性。 實例203 活體外免疫結合物活性之評估
此實例顯示本發明之免疫結合物有效引發免疫活化，且因此可用於治療癌症。 a) 人類抗原呈遞細胞之分離：人類骨髓抗原呈遞細胞(APC)係藉由密度梯度離心使用含有針對CD14、CD16、CD40、CD86、CD123及HLA-DR之單株抗體的ROSETTESEP TM人類單核球富集混合物(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)自獲自健康供血者之人類外周血(Stanford Blood Center, Palo Alto, California)負向選擇。隨後經由負向選擇使用無CD16耗盡且含有針對CD14、CD16、CD40、CD86、CD123及HLA-DR之單株抗體的EASYSEP TM人類單核球富集套組(Stem Cell Technologies)將不成熟APC純化至＞90%純度。 b) 骨髓APC活化檢定：將2 x 10 5個APC在含有伊斯科夫改良杜爾貝科氏培養基(iscove’s modified dulbecco’s medium，IMDM) (Lonza)之96孔板(Corning, Corning, NY)中溫育，該培養基補充有10% FBS、100 U/mL青黴素、100 μg/mL (每毫升微克數)鏈黴素、2 mM L-麩醯胺、丙酮酸鈉、非必需胺基酸及(在指出的情況下)各種濃度之未經結合之抗體及本發明之免疫結合物(IC)(如根據以上實例所製備)。18小時後經由ELISA對無細胞上清液進行分析，以量測TNFα分泌作為促炎性反應之讀出。 c) PBMC活化檢定：藉由密度梯度離心自獲自健康獻血者之人類外周血(Stanford Blood Center, Palo Alto, California)中分離人類外周血單核細胞。將PBMC在96孔板(Corning, Corning, NY)中在與表現CEA之腫瘤細胞(例如MKN-45、HPAF-II)以10:1效應細胞與靶細胞比率之共培養物中溫育。用不同濃度之未經結合之(裸)抗體及本發明之免疫結合物(如根據以上實例所製備)刺激細胞。根據製造商指南，使用LegendPlex™套組(BioLegend®, San Diego, CA)藉由細胞介素珠陣列分析無細胞上清液。 d) 人類常規樹突細胞之分離：人類常規樹突細胞(cDC)係藉由密度梯度離心自獲自健康獻血者之人類外周血(Stanford Blood Center, Palo Alto, California)負向選擇。簡言之，首先藉由使用ROSETTESEP TM人類CD3耗盡混合物(Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)自細胞製備物中移除T細胞來富集細胞。然後藉由負向選擇使用EASYSEP TM人類髓系DC富集套組(Stem Cell Technologies)進一步富集cDC。 e) cDC活化檢定：將 8 x 10 4個APC與表現ISAC靶抗原之腫瘤細胞以10:1效應物(cDC)與靶(腫瘤細胞)之比率共培養。將細胞在含有RPMI-1640培養基之96孔板(Corning, Corning, NY)中溫育，該培養基補充有10% FBS及(在所指示之情況下)不同濃度之本發明之指定免疫結合物(如根據以上實例製備)。在隔夜溫育約18小時後，收集無細胞上清液並使用BioLegend LEGENDPLEX細胞介素珠粒陣列分析細胞介素分泌(包括TNFα)。
除了所描述之利用不同髓系細胞群之檢定以外，亦可使用各種篩選檢定來量測髓系細胞類型之活化。此等細胞可包括以下：自健康供體血液中分離之單核球、經M-CSF分化之巨噬球、經GM-CSF分化之巨噬球、GM-CSF+IL-4單核球衍生性樹突細胞、自健康供體血液中分離之常規樹突細胞(cDC)，及極化至免疫抑制狀態之髓系細胞(亦稱為髓系來源之抑制細胞或MDSC)。MDSC極化細胞之實例包括向免疫抑制狀態分化之單核球，例如M2a MΦ (IL4/IL13)、M2c MΦ (IL10/TGFb)、GM-CSF/IL6 MDSC及腫瘤馴化(tumor-educated)單核球(TEM)。可使用腫瘤條件培養基(例如 786.O、MDA-MB-231、HCC1954)進行TEM分化。原代腫瘤相關髓系細胞亦可包括存在於離散(dissociated)腫瘤細胞懸液中的原代細胞(Discovery Life Sciences)。
所描述髓系細胞群之活化評估可作為單一培養物或作為與表現相關抗原之細胞之共培養物進行，免疫結合物(IC)可藉由抗體之CDR區結合該相關抗原。在溫育18-48小時後，可藉由使用流動式細胞測量術上調細胞表面共刺激分子或藉由量測經分泌之促炎細胞介素來評估活化。對於細胞介素量測，收穫無細胞上清液且藉由細胞介素珠粒陣列(例如來自Biolegend之LegendPlex)使用流動式細胞測量術進行分析。
本文中引用之所有參考文獻(包括公開案、專利申請及專利)皆以引用方式併入本文，達到如同逐一個別地及特別地指出之將各參考文獻以引用方式將各參考文獻併入本文以及並且在本文中全部闡述之相同程度。
圖1展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-3、比較物CIC-1及裸抗體TROP2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的TNFα(腫瘤壞死因子α)細胞介素水準之圖。 圖2展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-3、比較物CIC-2及裸抗體TROP2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的TNFa (腫瘤壞死因子α)細胞介素水準之圖。
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Claims (49)

  1. 一種免疫結合物，其包含藉由連接子共價連接至一或多個8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯部分之抗體，且具有式I： Ab-[L-D] PI 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： Ab係該抗體，其中該抗體結合至選自PD-L1、HER2、CEA及TROP2之靶標， p為1至8之整數； L為該連接子； D為具有下式之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯部分： R 1、R 2、R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：H、C 1-C 12烷基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基、C 2-C 9雜環基及C 1-C 20雜芳基，其各自獨立地且視情況經選自以下之一或多個基團取代： -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 12烷基二基)-OR 5； -(C 3-C 12碳環基)； -(C 3-C 12碳環基)-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 3-C 12碳環基)-NR 5-C(=NR 5)NR 5-*； -(C 6-C 20芳基)； -(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-C(=NR 5a)N(R 5)-*； -(C 2-C 20雜環基)； -(C 2-C 20雜環基)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 2-C 9雜環基)-C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-C(=NR 5a)NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)； -(C 1-C 20雜芳基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 20雜芳基)-NR 5-C(=NR 5a)N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-N(R 5)C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(=O)-*； -C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(=O)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -C(=O)N(R 5) 2； -C(=O)N(R 5)-*； -C(=O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(=O)R 5； -C(=O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(=O)N(R 5) 2； -C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5； -C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(=NR 5a)N(R 5) 2； -C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5C(=NR 5a)R 5； -C(=O)NR 5-(C 1-C 8烷基二基)-NR 5(C 2-C 5雜芳基)； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-N(R 5)-*； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-*； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -C(=O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-C(=O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -N(R 5) 2； -N(R 5)-*； -N(R 5)C(=O)R 5； -N(R 5)C(=O)-*； -N(R 5)C(=O)N(R 5) 2； -N(R 5)C(=O)N(R 5)-*； -N(R 5)CO 2R 5； -NR 5C(=NR 5a)N(R 5) 2； -NR 5C(=NR 5a)N(R 5)-*； -NR 5C(=NR 5a)R 5； -N(R 5)C(=O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -N(R 5)-(C 2-C 5雜芳基)； -N(R 5)-S(=O) 2-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -O-C(=O)N(R 5) 2； -O-C(=O)N(R 5)-*； -O-(R 5)-*； -O(R 5)； -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*；及 -S(=O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-OH； 或R 2及R 3一起形成5-員或6-員雜環基環； X 1、X 2、X 3及X 4獨立地選自由以下組成之群：鍵、C(=O)、C(=O)N(R 5)、O、N(R 5)、S、S(O) 2及S(O) 2N(R 5)； R 5獨立地選自由以下組成之群：H、C 6-C 20芳基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基二基、C 1-C 12烷基及C 1-C 12烷基二基，或兩個R 5基團一起形成5員或6員雜環基環； R 5a選自由C 6-C 20芳基及C 1-C 20雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之連接位點，且其中R 1、R 2、R 3及R 4中之一者連接至L； L為選自由以下組成之群的連接子： -C(=O)-PEG-； -C(=O)-PEG-C(=O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(=O)-Gluc-； -C(=O)-PEG-O-； -C(=O)-PEG-O-C(=O)-； -C(=O)-PEG-C(=O)-； -C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-； -C(=O)-PEG-N(R 6)-； -C(=O)-PEG-N(R 6)-C(=O)-； -C(=O)-PEG-N(R 6)-PEG-C(=O)-PEP-； -C(=O)-PEG-N +(R 6) 2-PEG-C(=O)-PEP-； -C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； -C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(=O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； -C(=O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(=O)-； -C(=O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(=O)-Gluc-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-O-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-O-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(PEG-CO 2H)-PEG-N(R 5)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)N(PEG-CO 2H)-PEG-N(R 5)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-N(PEG-CO 2H)-PEG-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)N(PEG-CO 2H)-PEG-C(=O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-C(=O)-PEP-；及 -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(=O)N(R 6)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(=O)-； R 6獨立地為H或C 1-C 6烷基； PEG具有式-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-；m為1至5之整數，且n為2至50之整數； Gluc具有下式： ； PEP具有下式： 其中AA獨立地選自天然或非天然胺基酸側鏈，或者一或多個AA及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波浪線指示連接點； Cyc選自C 6-C 20芳基二基及C 1-C 20雜芳基二基，其視情況經一或多個選自以下各項之基團取代：F、Cl、NO 2、-OH、-OCH 3、及具有以下結構之葡醣醛酸： ； R 7選自由-CH(R 8)O-、-CH 2-、-CH 2N(R 8)-及-CH(R 8)O-C(=O)-組成之群，其中R 8選自H、C 1-C 6烷基、C(=O)-C 1-C 6烷基及-C(=O)N(R 9) 2，其中R 9獨立地選自由H、C 1-C 12烷基及-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-OH組成之群，其中m為1至5之整數，且n為2至50之整數，或兩個R 9基團一起形成5員或6員雜環基環； y為2至12之整數； z為0或1；且 烷基、烷基二基、烯基、烯基二基、炔基、炔基二基、芳基、芳基二基、碳環基、碳環基二基、雜環基、雜環基二基、雜芳基及雜芳基二基獨立地且視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH 2CH 3、-CH=CH 2、-C≡CH、-C≡CCH 3、-CH 2CH 2CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2CH(CH 3) 2、-CH 2OH、-CH 2OCH 3、-CH 2CH 2OH、-C(CH 3) 2OH、-CH(OH)CH(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CH 2OH、-CH 2CH 2SO 2CH 3、-CH 2OP(O)(OH) 2、-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CH 2CHF 2、-CH(CH 3)CN、-C(CH 3) 2CN、-CH 2CN、-CH 2NH 2、-CH 2NHSO 2CH 3、-CH 2NHCH 3、-CH 2N(CH 3) 2、-CO 2H、-COCH 3、-CO 2CH 3、-CO 2C(CH 3) 3、-COCH(OH)CH 3、-CONH 2、-CONHCH 3、-CON(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CONH 2、-NH 2、-NHCH 3、-N(CH 3) 2、-NHCOCH 3、-N(CH 3)COCH 3、-NHS(O) 2CH 3、-N(CH 3)C(CH 3) 2CONH 2、-N(CH 3)CH 2CH 2S(O) 2CH 3、- NHC(=NH)H、-NHC(=NH)CH 3、-NHC(=NH)NH 2、-NHC(=O)NH 2、-NO 2、=O、-OH、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CH 2OCH 3、-OCH 2CH 2OH、-OCH 2CH 2N(CH 3) 2、-O(CH 2CH 2O) n-(CH 2) mCO 2H、-O(CH 2CH 2O) nH、-OCH 2F、-OCHF 2、-OCF 3、-OP(O)(OH) 2、-S(O) 2N(CH 3) 2、-SCH 3、-S(O) 2CH 3及-S(O) 3H。
  2. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗體為具有結合PD-L1之抗原結合域之抗體構築體。
  3. 如請求項2之免疫結合物，其中該抗體選自由以下組成之群：阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及阿維單抗(avelumab)或其生物類似物或生物改良物。
  4. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗體為具有結合HER2之抗原結合域之抗體構築體。
  5. 如請求項4之免疫結合物，其中該抗體選自由以下組成之群：曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、馬吉妥昔單抗(margetuximab)及HT-19或其生物類似物或生物改良物。
  6. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗體為具有結合CEA之抗原結合域之抗體構築體。
  7. 如請求項6之免疫結合物，其中該抗體為拉貝珠單抗(labetuzumab)或其生物類似物或生物改良物。
  8. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗體為具有結合TROP2之抗原結合域之抗體構築體。
  9. 如請求項8之免疫結合物，其中該抗體為戈沙妥組單抗(labetuzumab)或其生物類似物或生物改良物。
  10. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中X 1為鍵，且R 1為H。
  11. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中X 2為鍵，且R 2為C 1-C 8烷基。
  12. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物-，其中X 2及X 3各自為鍵，且R 2及R 3獨立地選自C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 12烷基)、-(C 1-C 12烷基二基)-OR 5、-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5、-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2、-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5及-O-(C 1-C 12烷基)OC(O)N(R 5) 2。
  13. 如請求項12之免疫結合物，其中R 2為C 1-C 8烷基，且R 3為-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 4。
  14. 如請求項12之免疫結合物，其中R 2為-CH 2CH 2CH 3且R 3-選自-CH 2CH 2CH 2NHCO 2(t-Bu)、-OCH 2CH 2NHCO 2(環丁基)及CH 2CH 2CH 2NHCO 2(環丁基)。
  15. 如請求項12之免疫結合物，其中R 2及R 3各自獨立地選自-CH2CH 2CH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CF 3、-CH 2CH 2CF 3、-OCH 2CH 2OH及-CH 2CH 2CH 2OH。
  16. 如請求項12之免疫結合物，其中R 2及R 3各自為-CH 2CH 2CH 3。
  17. 如請求項12之免疫結合物，其中R 2為-CH 2CH 2CH 3且R 3為-OCH 2CH 3。
  18. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中X 3R 3選自由以下組成之群：
  19. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中X 4為鍵，且R 4為H。
  20. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中R 1連接至L。
  21. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中R 2或R 3連接至L。
  22. 如請求項21之免疫結合物，其中X 3-R 3-L選自由以下組成之群： 其中波浪線指示與N之連接點。
  23. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中R 4為C 1-C 12烷基。
  24. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中R 4為 (C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*；其中星號*指示L之連接點。-
  25. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中L為-C(=O)-PEG-或-C(=O)-PEG-C(=O)-。
  26. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中L連接至該抗體之半胱氨酸硫醇。
  27. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中對於該PEG，m為1或2，且n為2至10之整數。
  28. 如請求項27之免疫結合物，其中n為10。
  29. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP為二肽且具有下式： 。
  30. 如請求項29之免疫結合物，其中AA 1及AA 2獨立地選自H、-CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2(C 6H 5)、-CH 2CH 2CH 2CH 2NH 2、-CH 2CH 2CH 2NHC(NH)NH 2、-CHCH(CH 3)CH 3、-CH 2SO 3H及-CH 2CH 2CH 2NHC(O)NH 2；或者AA 1及AA 2形成5員環脯氨酸胺基酸。
  31. 如請求項29之免疫結合物，其中AA 1為-CH(CH 3) 2，且AA 2為-CH 2CH 2CH 2NHC(O)NH 2。
  32. 如請求項29之免疫結合物，其中AA 1及AA 2獨立地選自GlcNAc天冬胺酸、-CH 2SO 3H及-CH 2OPO 3H。
  33. 如請求項29之免疫結合物，其中PEP具有下式： 其中AA 1及AA 2獨立地選自天然存在之胺基酸之側鏈。
  34. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP為三肽且具有下式： 。
  35. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP為四肽且具有下式： 。
  36. 如請求項35之免疫結合物，其中 AA 1選自由Abu、Ala及Val組成之群； AA 2選自由Nle(O-Bzl)、Oic及Pro組成之群； AA 3選自由Ala及Met(O) 2組成之群；且 AA 4選自由Oic、Arg(NO 2)、Bpa及Nle(O-Bzl)組成之群。
  37. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP選自由以下組成之群：Ala-Pro-Val、Asn-Pro-Val、Ala-Ala-Val、Ala-Ala-Pro-Ala、Ala-Ala-Pro-Val 及Ala-Ala-Pro-Nva 。
  38. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP選自以下結構： ； ； ；及 。
  39. 如請求項1至9中任一項之免疫結合物，其中L選自以下結構： 其中波浪線指示與R 5之連接。
  40. 一種選自表2a之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物。
  41. 一種免疫結合物，其藉由將抗體與選自表2a之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物結合而製備。
  42. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至39中任一項之免疫結合物及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、媒劑、載劑或賦形劑。
  43. 一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量之如請求項1至39中任一項之免疫結合物，其中該癌症選自宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、***癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、泌尿道癌、尿路上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌及乳腺。
  44. 如請求項43之方法，其中該癌症易受由TLR7及/或TLR8促效作用誘導之促炎性反應影響。
  45. 如請求項43之方法，其中該癌症選自三陰性乳癌、轉移性默克細胞癌及胃食管結合部腺癌。
  46. 如請求項43之方法，其中該免疫結合物向該患者靜脈內、瘤內或皮下投與。
  47. 如請求項43之方法，其中該免疫結合物以約0.01至20 mg/kg體重之劑量向該患者投與。
  48. 如請求項1至39中任一項之免疫結合物用於治療癌症之用途，其中該癌症選宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、***癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、泌尿道癌、尿路上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、默克細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌及乳腺。
  49. 一種製備如請求項1之式I之免疫結合物的方法，其中如請求項40之8-磺醯基-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物與該抗體結合。
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