TW202329987A - 用於抑制乙型肝炎病毒（hbv）蛋白表達的組合物和方法 - Google Patents

用於抑制乙型肝炎病毒（hbv）蛋白表達的組合物和方法 Download PDF

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Abstract

提供了可用於降低一種或更多種乙型肝炎病毒（HBV）基因的表達和用於治療HBV相關疾病和病症的組合物和方法。提供了可用於降低細胞和對象中的HBV表達的HBV dsRNA劑以及包含HBV dsRNA劑的組合物。

Description

用於抑制乙型肝炎病毒（HBV）蛋白表達的組合物和方法
本發明部分地涉及可用於抑制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）蛋白表達的組合物和方法。
估計慢性乙型肝炎感染（CHB）影響全球超過3.5億人並且是由肝相關病症和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）導致死亡的主要原因之一（www.cdc.gov/hepatitis/hbv/pdfs/hepbatrisk.pdf）。儘管乙型肝炎病毒（HBV）疫苗提供了預防新的HBV感染情况的有效方法，但對用於治療現有HBV感染和HBV相關疾病和病症的治療和方法仍存在巨大未滿足的醫學需求。
HBV病毒粒子包含緊凑的3.2千鹼基（kb）基因組，其作爲部分雙鏈、鬆弛環狀DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）存在，具有7-9鹼基末端冗餘，其在肝細胞的細胞核內轉化爲共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），從而作爲用於HBV轉錄的微染色體發揮功能（Bock CT, et al., J Mol Biol. 2001; 307:183–196）。宿主RNA聚合酶II轉錄cccDNA上的HBV基因以產生五種病毒RNA：（1）編碼前核心（HBeAg）的轉錄物，（2）前基因組RNA（pregenomic RNA，pgRNA），其編碼結構衣殼蛋白（核心）和聚合酶並且經逆轉錄產生rcDNA，（3）前S1轉錄物，其編碼大S表面蛋白，（4）另一種轉錄物，其編碼前S2和S表面蛋白（中S和小S），以及（5）X基因mRNA。三種表面蛋白共同構成HBsAg。所有HBV轉錄物均在重叠閱讀框中編碼，具有共同的3’末端並利用同一多腺苷酸化信號（polyadenylation signal，PAS）。HBsAg在脂質雙層中形成圍繞每個核心衣殼化的部分雙鏈HBV基因組的包膜。
慢性HBV感染的自然演變包括四個連續的階段：（1）早期“免疫耐受”階段，其包括高水平的病毒複製和最少的肝炎症；（2）免疫反應階段，其包括明顯的肝炎症和血清轉氨酶升高；（3）一些患者進入“非複製”階段，其包括血清轉化爲抗HBeAg、檢測不到病毒血症或低水平的病毒血症（通過基於PCR的測定低於2000 IU/ml）和肝炎症的消退；以及（4）HBeAg陰性慢性乙型肝炎，其由於出現特定的病毒突變，阻止了HBeAg的產生但不妨礙病毒複製。第四階段是慢性乙型肝炎（CHB）的一種形式，其可表現爲HBeAg陽性CHB或HBeAg陰性CHB，並且特徵爲血清HBV DNA和血清轉氨酶（ALT和AST）水平發生波動並且爲進行性肝病。
儘管cccDNA被認爲是HBV轉錄和複製的驅動因子，但HBV DNA可整合到宿主基因組中。HBeAg陽性患者的cccDNA水平高於HBeAg陰性患者，但HBeAg陰性患者的整合的HBV的水平較高。研究表明，除cccDNA之外，整合的HBV DNA也可以是HBsAg的來源（Wooddell et al., Sci Transl. Med. 2017 Sep 27;9(409):eaan0241. doi: 10.1126/scitranslmed.aan0241）。HBeAg和HBsAg在慢性感染中發揮重要作用並被認爲導致T細胞耐受和耗竭（Kakimi et el., J Virol. 2002; 76:8609–8620）。HBsAg損失被認爲是HBV有效免疫控制的標志。對於CHB患者，HBsAg的血清清除是期望的治療終點（“功能性治愈”）且具有改善的長期預後。
目前可用治療可實現的功能性治愈率相對較低。核苷（核苷酸）類似物（NUC）和聚乙二醇化干擾素（PEG-IFN）是目前用於CHB的兩種可用的治療選擇。施用NUC可有效控制病毒複製並與不良結局降低相關，但它們不干擾病毒抗原產生或分泌。用NUC治療難以實現CHB的“功能性治愈”。PEG-IFN治療可誘導長期免疫控制，但在實現“功能性治愈”方面的效力非常低。Lau et al.已經表明，在PEG-IFN單藥治療48周之後，僅3%的接受治療的個體實現了HBsAg血清清除（Lau et al., N Engl J Med. 2005;352(26):2682–95.）。慢性乙型肝炎和另一些HBV相關疾病和病症仍然是世界範圍內的重大健康問題並且需要有效的治療方法。
根據本發明的一個方面，提供了用於抑制細胞中乙型肝炎病毒（HBV）表達的雙鏈核糖核酸（double-stranded ribonucleic acid，dsRNA）劑，其中所述dsRNA劑包含有義鏈和反義鏈，並且任選地包含靶向配體，所述反義鏈中的第2至18位核苷酸包含HBV RNA轉錄物的互補區，其中所述互補區包含與表1至表4之一中列出的反義序列之一存在0、1、2或3個核苷酸差異的至少15個連續核苷酸。在一些實施方案中，HBV RNA轉錄物的互補區包含與表1至表4之一中列出的反義序列之一存在不超過3個核苷酸差異的至少15、16、17、18或19個連續核苷酸。在某些實施方案中，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 673的任一個靶區域至少基本上互補，並且在表1至表4的任一個中提供。在一些實施方案中，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 673的任一個靶區域完全互補，並且在表1至表4的任一個中提供。在一些實施方案中，dsRNA劑包含表1至表4任一個中所示的有義鏈序列，其中有義鏈序列與dsRNA劑中的反義鏈序列至少基本上互補。在某些實施方案中，dsRNA劑包含表1至表4任一個中所示的有義鏈序列，其中有義鏈序列與dsRNA劑中的反義鏈序列完全互補。在一些實施方案中，dsRNA劑包含表1至表4任一個中所示的反義鏈序列。在一些實施方案中，dsRNA劑包含在表1至表4的任一個中的雙鏈體序列所示的序列。在一些實施方案中，dsRNA的反義鏈由核苷酸序列II：5’-z 1uugucaacaagaaaaaz 2-3’組成，其中z 1選自c、g、a或u，z 2是核苷酸序列IV。在某些實施方案中，z 1是u。在某些實施方案中，核苷酸序列IV的長度爲0至15個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列IV選自c、cu、ca、cc、cg、ccu、cca、ccc、ccg、cccc、cccu、ccca、cccg、ccccg、ccccgc、ccccgcc、ccccgccu、ccccgccug、ccccgccuguaacac、cccguu或cccgga。在某些實施方案中，核苷酸序列IV的長度爲1、2、3或4個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列IV選自c、cu、ca、cc、cg、ccu、cca、ccc、ccg、cccc、cccu、ccca或cccg。在一些實施方案中，dsRNA的有義鏈由核苷酸序列III：5’-z 3uuuuucuuguugacaaz 4-3’組成，其中z 3是核苷酸序列V，z 4選自c、g、a或u。在某些實施方案中，z 4是a。在某些實施方案中，核苷酸序列V的長度爲0至15個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列V選自g、ag、ug、gg、cg、agg、ugg、ggg、cgg、gggg、aggg、uggg、cggg、cgggg、gcgggg、ggcgggg、aggcgggg、caggcgggg或guguuacaggcgggg。在某些實施方案中，核苷酸序列V的長度爲1、2、3或4個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列V選自g、ag、ug、gg、cg、agg、ugg、ggg、cgg、gggg、aggg、uggg或cggg。在一些實施方案中，dsRNA的反義鏈由核苷酸序列VI：5’-z 5ugucaacaagaaaaacz 6-3’組成，其中z 5選自c、g、a或u，z 6是核苷酸序列VIII。在某些實施方案中，z 5是a。在某些實施方案中，核苷酸序列VIII的長度爲0至15個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列VIII選自c、cc、ccu、cca、ccc、ccg、cccu、ccca、cccc、cccg、ccug、cccuc、cccuu、cccua、cccgc、cccgcc、ccuguu、ccugga、cccgccu、cccgccug、cccgccugu、cccgccuguaacacg。在某些實施方案中，核苷酸序列VIII的長度爲1、2、3或4個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列VIII選自c、cc、ccu、cca、ccc、ccg、cccu、ccca、cccc、cccg或ccug。在一些實施方案中，dsRNA的有義鏈由核苷酸序列VII：5’-z 7guuuuucuuguugacaz 8-3’組成，其中z 7是核苷酸序列IX，z 8選自c、g、a或u。在某些實施方案中，z 8是u。在某些實施方案中，核苷酸序列IX的長度爲0至15個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列IX選自g、ag、ug、gg、cg、agg、ugg、ggg、cgg、ggag、aagg、uagg、cagg、gcggg、ggcggg、aggcggg、caggcggg、acaggcggg或cguguuacaggcggg。在某些實施方案中，核苷酸序列IX的長度爲1、2、3或4個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列IX選自g、ag、ug、gg、cg、agg、ugg、ggg、cgg、ggag、aagg、uagg或cagg。在一些實施方案中，z 1是與z 4互補的核苷酸。在一些實施方案中，z 2是與z 3互補的核苷酸序列。在一些實施方案中，z 5是與z 8互補的核苷酸序列。在一些實施方案中，z 6是與z 7互補的核苷酸序列。在一些實施方案中，dsRNA劑包含有義鏈和反義鏈，其中dsRNA的反義鏈由如上所述的核苷酸序列II或VI組成，其中有義鏈的長度不超過30個核苷酸，其包含含有至少15、16、17、18或19個核苷酸的反義鏈的互補區。在一些實施方案中，dsRNA劑包含有義鏈和反義鏈，其中dsRNA的有義鏈由核苷酸序列III組成，並且dsRNA的反義鏈由核苷酸序列II組成，其中核苷酸序列II和III如上所述。在一些實施方案中，dsRNA劑包含有義鏈和反義鏈，其中dsRNA的有義鏈由核苷酸序列VII組成並且dsRNA的反義鏈由核苷酸序列VI組成，其中核苷酸序列VI和VII如上所述。在一些實施方案中，核苷酸序列II包含具有至少1個核苷酸的3’突出端。在一些實施方案中，核苷酸序列II包含具有至少2個核苷酸的3’突出端。在某些實施方案中，核苷酸序列II中的所述3’突出端選自uu或ga。在一些實施方案中，核苷酸序列VI包含具有至少1個核苷酸的3’突出端。在一些實施方案中，核苷酸序列VI包含具有至少2個核苷酸的3’突出端。在某些實施方案中，核苷酸序列VI中的所述3’突出端選自uu或ga。
在一些實施方案中，dsRNA包含有義鏈和反義鏈，所述反義鏈包含含有至少15個連續核苷酸的互補區，所述連續核苷酸與選自以下的任一核苷酸序列存在0、1、2或3個核苷酸差異： 。
在某些實施方案中，有義鏈和反義鏈包含含有至少15個連續核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸與選自以下的任一核苷酸序列存在0、1、2或3個核苷酸差異： 。
在某些實施方案中，dsRNA劑包含至少一個經修飾核苷酸。在一些實施方案中，反義鏈的所有或基本上所有核苷酸均是經修飾核苷酸。在某些實施方案中，所述至少一個經修飾核苷酸包含：2’-O-甲基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脫氧核苷酸、2’3’-seco核苷酸模擬物、鎖核苷酸、解鎖核酸核苷酸（unlocked nucleic acid nucleotide，UNA）、二醇核酸核苷酸（glycol nucleic acid nucleotide，GNA）、2’-F-***糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2’-OMe核苷酸、反向2’-脫氧核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸，及3’-OMe核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團的核苷酸，或者與膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、氨基磷酸酯（phosphoramidate），或包含非天然鹼基的核苷酸。在一些實施方案中，dsRNA劑在反義鏈的5’末端包含E-乙烯基膦酸酯核苷酸。在一些實施方案中，dsRNA劑包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，有義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方案中，反義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，有義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，反義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方案中，有義鏈和反義鏈的所有或基本上所有核苷酸均是經修飾核苷酸。在一些實施方案中，反義鏈包含15個或更多個獨立地選自2’-O-甲基核苷酸和2’-氟核苷酸的經修飾核苷酸，其中少於6個經修飾核苷酸是2’-氟核苷酸。在某些實施方案中，反義鏈包含3個或5個2’-氟核苷酸。在一些實施方案中，反義鏈包含15個或更多個獨立地選自2’-O-甲基核苷酸和2’-氟核苷酸的經修飾核苷酸，其中至少14、15或16個經修飾核苷酸是2’-O-甲基核苷酸並且從反義鏈的5’末端起第2、7、12、14和/或16位的核苷酸是2’-氟核苷酸。在一些實施方案中，dsRNA包含有義鏈和反義鏈，反義鏈與對應於靶基因的mRNA的至少一部分互補，其中dsRNA的反義鏈包含如式（C）所示的核苷酸序列並且dsRNA的有義鏈包含如式（D）所示的核苷酸序列： 式（C） 式（D） 其中，每個N F或N’ F表示2’-氟修飾的核苷酸；N M1、N M2、N M3、N M4、N M5、N M6、N M7、N M8、N’ N1、N’ N2、N’ N3、N’ N4、N’ N5和N’ N6各自獨立地表示經修飾或未經修飾的核苷酸，並且N M4、N M5、N M7和N M8不是2’-氟修飾的核苷酸；每個N L或N’ L獨立地表示經修飾或未經修飾的核苷酸但不表示2’-氟修飾的核苷酸，並且n和n’可以是0至7的整數。
在一些實施方案中，dsRNA包含有義鏈和反義鏈，所述反義鏈包含含有至少15個連續核苷酸的互補區，所述連續核苷酸與選自以下的任一核苷酸序列存在0、1、2或3個核苷酸差異： 。
在一些實施方案中，經修飾有義鏈是表2至表4之一中所示的經修飾有義鏈序列。在某些實施方案中，經修飾反義鏈是表2至表4之一中所示的經修飾反義鏈序列。在某些實施方案中，有義鏈與反義鏈互補或基本上互補，並且互補區的長度爲16至23個核苷酸。在一些實施方案中，互補區的長度爲19至21個核苷酸。在某些實施方案中，互補區的長度爲14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過40個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過30個核苷酸。在某些實施方案中，每條鏈的長度不超過27個核苷酸。在某些實施方案中，每條鏈的長度不超過25個核苷酸。在某些實施方案中，每條鏈的長度不超過23個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過21個核苷酸。在某些實施方案中，每條鏈的長度爲19至32個核苷酸。在某些實施方案中，每條鏈的長度爲19、20、21、22、23、24、25、26、32個核苷酸。在一些實施方案中，dsRNA劑包含至少一個經修飾核苷酸並且還包含一個或更多個靶向基團或連接基團。在一些實施方案中，一個或更多個靶向基團或連接基團與有義鏈綴合。在一些實施方案中，靶向基團或連接基團包含N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）。在某些實施方案中，靶向基團具有以下結構： 或 。
在一些實施方案中，dsRNA劑包含與有義鏈的5’末端綴合的靶向基團。在一些實施方案中，dsRNA劑包含與有義鏈的3’末端綴合的靶向基團。在某些實施方案中，反義鏈在3’末端包含一個反向無鹼基殘基。在某些實施方案中，有義鏈在3’和/或5’末端包含一個或兩個反向無鹼基殘基。在一些實施方案中，dsRNA劑具有兩個平末端。在某些實施方案中，至少一條鏈包含具有至少1個核苷酸的3’突出端。在一些實施方案中，至少一條鏈包含具有至少2個核苷酸的3’突出端。在一些實施方案中，有義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 281、290、295、300、304、306、307、331、557、567、569、571、572、573、560、563、607、628至637或918至921。在一些實施方案中，反義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 419、428、433、438、442、444、445、469、582、592、594、596、597、598、585、588、642、663至672或922至925。在某些實施方案中，dsRNA劑包含：SEQ ID NO: 281和SEQ ID NO: 419；SEQ ID NO: 290和SEQ ID NO: 428；SEQ ID NO: 295和SEQ ID NO: 433；SEQ ID NO: 300和SEQ ID NO: 438；SEQ ID NO: 304和SEQ ID NO: 442；SEQ ID NO: 306和SEQ ID NO: 444；SEQ ID NO: 307和SEQ ID NO: 445；SEQ ID NO: 331和SEQ ID NO: 469；SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582；SEQ ID NO: 567和SEQ ID NO: 592；SEQ ID NO: 569和SEQ ID NO: 594；SEQ ID NO: 571和SEQ ID NO: 596；SEQ ID NO: 572和SEQ ID NO: 597；SEQ ID NO: 573和SEQ ID NO: 598；SEQ ID NO: 560和SEQ ID NO: 585；SEQ ID NO: 563和SEQ ID NO: 588；SEQ ID NO: 607和SEQ ID NO: 642；SEQ ID NO: 628和SEQ ID NO: 663；SEQ ID NO: 629和SEQ ID NO: 664；SEQ ID NO: 630和SEQ ID NO: 665；SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666；SEQ ID NO: 632和SEQ ID NO: 667；SEQ ID NO: 633和SEQ ID NO: 668；SEQ ID NO: 634和SEQ ID NO: 669；SEQ ID NO: 635和SEQ ID NO: 670；SEQ ID NO: 636和SEQ ID NO: 671；SEQ ID NO: 637和SEQ ID NO: 672；SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922；SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923；SEQ ID NO: 920和SEQ ID NO: 924；或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925。在某些實施方案中，dsRNA包含選自以下的雙鏈體：AD00170、AD00378、AD00170-1、AD00263、AD00265、AD00267、AD00268、AD00269、AD00173、AD00176、AD00383、AD00384、AD00378-1、AD00170-2、AD00268-2和AD00263-2。
根據本發明的另一個方面，提供了組合物，其包含前述dsRNA劑中任一種的任何實施方案的一種、兩種、三種或更多種dsRNA劑。在一些實施方案中，組合物還包含可藥用載體。在某些實施方案中，組合物還包含一種或更多種另外的治療劑。在某些實施方案中，組合物被包裝在藥盒、容器、包裝物、分配器、預填充注射器或小瓶中。在一些實施方案中，組合物被配製成用於皮下施用或被配製成用於靜脈內（intravenous，IV）施用。在一些實施方案中，至少一種dsRNA劑的有義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 281、290、295、300、304、306、307、331、557、567、569、571、572、573、560、563、607、628至637或918至921。在一些實施方案中，至少一種dsRNA劑的反義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 419、428、433、438、442、444、445、469、582、592、594、596、597、598、585、588、642、663至672或922至925。在某些實施方案中，dsRNA劑包含：SEQ ID NO: 281和SEQ ID NO: 419；SEQ ID NO: 290和SEQ ID NO: 428；SEQ ID NO: 295和SEQ ID NO: 433；SEQ ID NO: 300和SEQ ID NO: 438；SEQ ID NO: 304和SEQ ID NO: 442；SEQ ID NO: 306和SEQ ID NO: 444；SEQ ID NO: 307和SEQ ID NO: 445；SEQ ID NO: 331和SEQ ID NO: 469；SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582；SEQ ID NO: 567和SEQ ID NO: 592；SEQ ID NO: 569和SEQ ID NO: 594；SEQ ID NO: 571和SEQ ID NO: 596；SEQ ID NO: 572和SEQ ID NO: 597；SEQ ID NO: 573和SEQ ID NO: 598；SEQ ID NO: 560和SEQ ID NO: 585；SEQ ID NO: 563和SEQ ID NO: 588；SEQ ID NO: 607和SEQ ID NO: 642；SEQ ID NO: 628和SEQ ID NO: 663；SEQ ID NO: 629和SEQ ID NO: 664；SEQ ID NO: 630和SEQ ID NO: 665；SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666；SEQ ID NO: 632和SEQ ID NO: 667；SEQ ID NO: 633和SEQ ID NO: 668；SEQ ID NO: 634和SEQ ID NO: 669；SEQ ID NO: 635和SEQ ID NO: 670；SEQ ID NO: 636和SEQ ID NO: 671；SEQ ID NO: 637和SEQ ID NO: 672；SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922；SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923；SEQ ID NO: 920和SEQ ID NO: 924；或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925。在某些實施方案中，dsRNA包含選自以下的雙鏈體：AD00170、AD00378、AD00170-1、AD00263、AD00265、AD00267、AD00268、AD00269、AD00173、AD00383、AD00384、AD00378-1、AD00170-2、AD00268-2、AD00263-2和AD00176。
根據本發明的另一個方面，提供了細胞，其包含本發明前述方面的任何實施方案的dsRNA劑。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞，任選地是人細胞。
根據本發明的另一個方面，提供了抑制細胞中乙型肝炎病毒（HBV）基因表達的方法，所述方法包括（i）製備包含有效量的本發明前述dsRNA劑方面的任何實施方案或本發明任何前述方面的組合物的任何實施方案的一種或更多種雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑的細胞。在一些實施方案中，所述方法還包括（ii）將所製備的細胞維持足以獲得HBV基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制所述細胞中HBV基因的表達；抑制所述細胞中HBV的複製；以及降低所述細胞中HBV抗原的水平。在一些實施方案中，一種或更多種HBV抗原是HBcAg、HBsAg和HBeAg。在某些實施方案中，細胞在對象中並且將dsRNA劑皮下施用於對象。在一些實施方案中，細胞在對象中並且通過IV施用將dsRNA劑施用於對象。在一些實施方案中，細胞在對象中。在一些實施方案中，將2、3、4或更多種dsRNA劑施用於對象。在某些實施方案中，所述方法還包括在向對象施用dsRNA劑之後評估對HBV基因的抑制，其中用於評估的手段包括：（i）確定對象中HBV相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵；以及（ii）將所確定的生理特徵與HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或者與HBV相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較，其中所述比較指示所述對象中HBV基因表達抑制的存在或不存在。在一些實施方案中，對照生理特徵是感染HBV且未施用dsRNA劑的對象的生理特徵。在一些實施方案中，在對象中確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：對象中丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平、對象中天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平；對象中的HBV病毒載量；對象中的HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）水平；對象中一種或更多種HBV抗原的水平；對象中HBcAg、HBsAg和HBeAg中一種或更多種的水平；對象中一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體的存在、不存在和/或水平。在一些實施方案中，生理特徵是在從對象獲得的生物樣品中確定的。在某些實施方案中，生物樣品包含以下中的一種或更多種：血清樣品、組織樣品、細胞樣品和肝樣品。在一些實施方案中，與生理特徵的對照水平相比，在對象中確定的生理特徵是異常的。在一些實施方案中，與HBV相關疾病或病症的對照生理特徵和/或者HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比，所述對象中以下一種或更多種的水平被確定爲統計學上顯著更高指示對象中HBV基因表達的狀態：ALT；AST；HBV病毒載量、HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg、HBsAg和HBeAg中的一種或更多種；以及一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體。在某些實施方案中，對照生理特徵是感染HBV且未施用dsRNA劑的對象的生理特徵。在某些實施方案中，對象中以下一種或更多種的降低指示對象中HBV基因表達的降低：ALT；AST；HBV病毒載量；HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg；HBsAg；和HBeAg。在一些實施方案中，與HBV相關疾病或病症的對照生理特徵和/或HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比對象中抗乙型肝炎病毒抗體的提高指示對象中HBV基因表達的降低。在一些實施方案中，HBV相關疾病或病症是以下中的一種或更多種：其中疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）、肝損傷、肝硬化、急性乙型肝炎、急性暴發性肝炎、以及肝纖維化、肝炎症和肝細胞癌。在某些實施方案中，HBV相關疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）和急性乙型肝炎。
根據本發明的另一個方面，提供了抑制對象中HBV基因表達的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明前述dsRNA劑方面的任何實施方案或者本發明前述組合物的任何實施方案的一種或更多種雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑。在一些實施方案中，將兩種、三種、四種或更多種dsRNA劑施用於對象。在一些實施方案中，將dsRNA劑皮下施用於對象。在某些實施方案中，將dsRNA劑通過IV施用而施用於對象。在一些實施方案中，所述方法還包括在施用一種或更多種dsRNA劑之後評估對HBV基因的抑制，其中用於評估的手段包括：（i）確定對象中HBV相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵以及（ii）將所確定的生理特徵與HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與HBV相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較，其中所述比較指示對對象中HBV基因表達的抑制的存在或不存在。在一些實施方案中，在對象中確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：對象中丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平、對象中天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平；對象中的HBV病毒載量；對象中的HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）水平；對象中一種或更多種HBV抗原的水平；對象中HBcAg、HBsAg和HBeAg中一種或更多種的水平；對象中一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體的存在、不存在和/或水平。在一些實施方案中，生理特徵是在從對象獲得的生物樣品中確定的。在某些實施方案中，生物樣品包含以下中的一種或更多種：血清樣品、細胞樣品、組織樣品和肝樣品。在一些實施方案中，與HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與HBV相關疾病或病症的對照生理特徵相比，在對象中確定的生理特徵更加異常。在一些實施方案中，與HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與HBV相關疾病或病症的對照生理特徵相比，所述對象中以下一種或更多種的水平被確定爲在統計學上顯著更高、更低或未變化指示對象中HBV基因表達的狀態：ALT；AST；HBV病毒載量；HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg、HBsAg和HBeAg中的一種或更多種；以及一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體。在某些實施方案中，對象中以下一種或更多種的降低指示對象中HBV基因表達的降低：ALT；AST；HBV病毒載量；HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg；HBsAg；和HBeAg。在一些實施方案中，與HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與HBV相關疾病或病症的對照生理特徵相比對象中抗乙型肝炎病毒抗體的提高指示對象中HBV基因表達的降低。在某些實施方案中，HBV相關疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、急性乙型肝炎、肝細胞癌、終末期肝病、肝纖維化、肝炎症、肝損傷、肝硬化和丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）。在某些實施方案中，HBV相關疾病或病症是以下中的一種或更多種：其中疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）和急性乙型肝炎。
根據本發明的另一個方面，提供了治療與乙型肝炎病毒（HBV）蛋白的存在相關的疾病或病症的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明前述dsRNA劑方面的任何實施方案或者本發明前述組合物的任何實施方案的一種或更多種雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，以抑制編碼HBV蛋白的HBV基因的表達。在一些實施方案中，所述方法包括向對象施用兩種、三種、四種或更多種dsRNA劑。在一些實施方案中，所述疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）、肝損傷、肝硬化、急性乙型肝炎、急性暴發性肝炎、肝炎症、肝纖維化和肝細胞癌。在某些實施方案中，所述方法還包括向對象施用另外的治療方案。在某些實施方案中，另外的治療方案包括：向對象施用一種或更多種：HBV反義多核苷酸、另外的HBV dsRNA治療劑、非HBV dsRNA治療劑、HBV非dsRNA治療劑、以及行爲改變。在一些實施方案中，非HBV dsRNA治療劑是以下中的一種或更多種：抗病毒劑、抗病毒核苷或核苷酸類似物（NUC）、病毒聚合酶抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、免疫刺激劑、治療性疫苗、病毒進入抑制劑、抑制HBsAg分泌或釋放的寡核苷酸、衣殼抑制劑、共價閉合環狀（ccc）HBV DNA抑制劑。在一些實施方案中，NUC是：富馬酸替諾福韋酯（Tenofovir disoproxil fumarate，TDF）、替諾福韋艾拉酚胺（Tenofovir alafenamide）、拉米夫定（Lamivudine）、阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil）、恩替卡韋（Entecavir，ETV）或替比夫定（Telbivudine）。在一些實施方案中，免疫刺激劑是聚乙二醇化干擾素α2a（PEG-IFN-a2a）、干擾素α-2b、重組人白介素-7、Toll-樣受體7（TLR7）激動劑，或檢查點抑制劑（例如，PD1抑制劑）。在某些實施方案中，將一種或更多種dsRNA劑皮下施用於對象。在某些實施方案中，通過IV施用將一種或更多種dsRNA劑施用於對象。在一些實施方案中，所述方法還包括確定所施用的一種或更多種雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑在對象中的效力。在某些實施方案中，確定對象中治療效力的手段包括：（i）確定對象中HBV相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵以及（ii）將所確定的生理特徵與HBV相關疾病或病狀的基線治療前生理特徵進行比較，其中所述比較指示向對象施用雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑的效力的存在、不存在和水平中的一種或更多種。在一些實施方案中，在對象中確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：對象中丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平、對象中天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平；對象中的HBV病毒載量；對象中的HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）水平；對象中一種或更多種HBV抗原的水平；對象中HBcAg、HBsAg和HBeAg中一種或更多種的水平；對象中一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體的存在、不存在和/或水平。在某些實施方案中，生理特徵是在從對象獲得的生物樣品中確定的。在一些實施方案中，生物樣品包含以下中的一種或更多種：血清樣品、細胞樣品、組織樣品和肝樣品。在一些實施方案中，與HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵或所述生理特徵的對照水平相比，在對象中確定的生理特徵是不同的。在某些實施方案中，與HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比，所述對象中以下一種或更多種的水平被確定爲在統計學上顯著更低指示對象中HBV基因表達降低的狀態：ALT；AST；HBV病毒載量；HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg、HBsAg和HBeAg中的一種或更多種。在一些實施方案中，與基線治療前抗乙型肝炎病毒抗體或抗乙型肝炎病毒抗體的對照水平相比對象中抗乙型肝炎病毒抗體的提高指示對象中HBV基因表達的降低。在一些實施方案中，HBV相關疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、急性乙型肝炎、肝細胞癌、終末期肝病、急性暴發性肝炎、肝炎症、肝損傷、肝硬化、肝纖維化和丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）。
根據本發明的另一個方面，提供了與對象中HBV蛋白的基線治療前水平相比降低對象中HBV蛋白水平的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明前述dsRNA劑方面的任何實施方案或者本發明前述組合物的任何實施方案的一種或更多種雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，以降低HBV基因表達的水平。在某些實施方案中，將dsRNA劑皮下施用於對象或通過IV施用而施用於對象。
根據本發明的另一個方面，提供了與對象中乙型肝炎病毒（HBV）相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比改變對象中乙型肝炎病毒（HBV）相關疾病或病症的生理特徵的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明前述dsRNA劑方面的任何實施方案或者本發明前述組合物的任何實施方案的一種或更多種雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，以改變對象中HBV相關疾病或病症的生理特徵。在一些實施方案中，將一種或更多種dsRNA劑皮下施用於對象或通過IV施用而施用於對象。在某些實施方案中，生理特徵是在對象中確定的生理特徵中的一種或更多種，其是以下中的一種或更多種：對象中丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平、對象中天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平；對象中的HBV病毒載量；對象中的HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）水平；對象中一種或更多種HBV抗原的水平；對象中HBcAg、HBsAg和HBeAg中一種或更多種的水平；對象中一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體的存在、不存在和/或水平。
根據本發明的另一個方面，提供了用於治療與HBV基因表達相關的疾病或病症的方法中的前述dsRNA劑。在一些實施方案中，所述疾病或病狀是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）、肝損傷、肝硬化、急性乙型肝炎、急性暴發性肝炎以及肝纖維化、肝炎症和肝細胞癌。
在本發明任何前述方法的某些實施方案中，dsRNA劑的有義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 281、290、295、300、304、306、307、331、557、567、569、571、572、573、560、563、607、628至637或918至921。在本發明任何前述方法的一些實施方案中，dsRNA劑的反義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 419、428、433、438、442、444、445、469、582、592、594、596、597、598、585、588、642、663至672或922至925。在本發明任何前述方法的某些實施方案中，dsRNA劑包含：SEQ ID NO: 281和SEQ ID NO: 419；SEQ ID NO: 290和SEQ ID NO: 428；SEQ ID NO: 295和SEQ ID NO: 433；SEQ ID NO: 300和SEQ ID NO: 438；SEQ ID NO: 304和SEQ ID NO: 442；SEQ ID NO: 306和SEQ ID NO: 444；SEQ ID NO: 307和SEQ ID NO: 445；SEQ ID NO: 331和SEQ ID NO: 469；SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582；SEQ ID NO: 567和SEQ ID NO: 592；SEQ ID NO: 569和SEQ ID NO: 594；SEQ ID NO: 571和SEQ ID NO: 596；SEQ ID NO: 572和SEQ ID NO: 597；SEQ ID NO: 573和SEQ ID NO: 598；SEQ ID NO: 560和SEQ ID NO: 585；SEQ ID NO: 563和SEQ ID NO: 588；SEQ ID NO: 607和SEQ ID NO: 642；SEQ ID NO: 628和SEQ ID NO: 663；SEQ ID NO: 629和SEQ ID NO: 664；SEQ ID NO: 630和SEQ ID NO: 665；SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666；SEQ ID NO: 632和SEQ ID NO: 667；SEQ ID NO: 633和SEQ ID NO: 668；SEQ ID NO: 634和SEQ ID NO: 669；SEQ ID NO: 635和SEQ ID NO: 670；SEQ ID NO: 636和SEQ ID NO: 671； SEQ ID NO: 637和SEQ ID NO: 672；SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922；SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923；SEQ ID NO: 920和SEQ ID NO: 924；或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925。在某些實施方案中，dsRNA包含選自以下的雙鏈體：AD00170、AD00378、AD00170-1、AD00263、AD00265、AD00267、AD00268、AD00269、AD00173、AD00383、AD00384、AD00378-1、AD00170-2、AD00268-2、AD00263-2和AD00176。 序列簡述
SEQ ID NO: 1至138、674至734在表1中示出並且是有義鏈序列。
SEQ ID NO: 139至276、735至795在表1中示出並且是反義鏈序列。
SEQ ID NO: 277至414、796至856是有義鏈序列且SEQ ID NO: 415至552、857至917是反義鏈序列並且在表2中示出，其中化學修飾由以下表示：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；以及硫代磷酸酯：*。
SEQ ID NO: 553至577是有義鏈序列且SEQ ID NO: 578至602是反義鏈序列並且在表3中示出。遞送分子在每條有義鏈的3’末端表示爲“GLO-0”。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；以及硫代磷酸酯：*。
SEQ ID NO: 603至637、918至921是有義鏈序列且638至672、922至925是反義鏈序列並且在表4中示出。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*；以及Invab=反向無鹼基。
SEQ ID NO: 673是智人（Homo sapiens）乙型肝炎病毒（HBV）mRNA序列[NCBI參考序列: AM282986]：
本發明部分地包括RNAi劑，例如但不限於雙鏈（ds）RNAi劑，其能够抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因表達。本發明的抗HBV dsRNA劑可靶向所有五種HBV轉錄物，導致所有HBV病毒蛋白的抑制。本發明的化合物、組合物和方法爲慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和/或其他HBV相關疾病和病症提供了抗HBV RNAi治療劑和治療。使用本發明的方法遞送至細胞的抗HBV RNAi劑和化合物能够抑制HBV基因表達，從而降低該基因的HBV蛋白產物在細胞中的活性。可將本發明的抗HBV dsRNAi劑施用於對象來治療對象的HBV相關疾病和/或病症。
在本發明的某些實施方案中，本發明的藥劑、化合物、組合物和方法用於實現HBV相關疾病和/或病症的“功能性治愈”。HBV感染和/或HBV相關疾病或病症的功能性治愈可通過乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的血清清除來表明。本文中使用的術語“血清清除”意指對象中可檢測的血清HBsAg的對象水平降低和/或對象血清中可檢測的HBsAg完全消除。應理解，血清清除可發生在具有或不具有血清轉化（seroconversion）爲乙型肝炎表面抗體（抗HBs）的對象中。
本文中所述的HBV RNAi能够抑制HBV蛋白的表達。在本發明的一些實施方案中，降低細胞或對象中HBV表達分別在細胞或對象中治療與HBV表達相關的疾病或病症。可通過降低HBV活性來治療的疾病和病症的一些非限制性實例是：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、急性乙型肝炎、肝細胞癌、終末期肝病、肝炎症、肝纖維化、肝損傷、肝硬化、急性暴發性肝炎、丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）或降低HBV蛋白的水平和活性在醫學上對對象有益的其他疾病。
本發明部分地包括包含抗HBV RNAi劑的組合物和使用這樣的組合物的方法。本發明的一些方面包括藥物組合物，其包含一種或更多種HBV dsRNA劑和可藥用載體。在某些實施方案中，本發明的抗HBV RNAi劑與能够將RNAi劑遞送至細胞（包括但不限於肝細胞）的遞送化合物連接。在一些實施方案中，遞送化合物是包含GalNAc的遞送化合物。本發明的某些藥物組合物包含一種、兩種、三種或更多種獨立選擇的抗HBV dsRNA劑，並且還可包含一種或更多種獨立選擇的遞送化合物。在一些實施方案中，將能够分別靶向HBV mRNA的一個、兩個、三個、四個或更多個不同位置/區域的兩種、三種、四種或更多種抗HBV dsRNA施用於細胞和/或對象。
以下描述了製備和使用包含能够抑制HBV基因表達的抗HBV dsRNA劑（雙鏈體）的組合物的方法，以及用於治療由HBV基因表達引起和/或調節的疾病和病症的組合物和方法。本文中使用的由HBV基因表達的存在和/或水平引起或調節的疾病和/或病症被稱爲“HBV相關疾病和/或病症”。
本文中使用的術語“RNAi”是指包含能够通過RNA誘導的沉默複合物（RNA-induced silencing complex，RISC）途徑介導RNA轉錄物的靶向切割的RNA的藥劑。術語“RNAi”和“RNAi劑”可在本文中分別與以下互換使用：術語“抗HBV RNAi”和“抗HBV RNAi劑”；“HBV RNAi”和“HBV RNAi劑”；“dsRNA”和“dsRNA劑”；“HBV dsRNA”和“HBV dsRNA劑”；以及“抗HBV dsRNA”和“抗HBV dsRNA劑”。如本領域已知的，RNAi靶區域是指在基因轉錄期間形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續部分，包括作爲初級轉錄產物的RNA加工產物的信使RNA（messenger RNA，mRNA）。mRNA分子的靶部分（在本文中也稱爲“靶序列”）將至少足够長以在該部分處或該部分附近用作RNAi定向切割的底物。靶序列可以是8至30個核苷酸長（包括端點）、10至30個核苷酸長（包括端點）、12至25個核苷酸長（包括端點）、15至23個核苷酸長（包括端點）、16至23個核苷酸長（包括端點），或18至23個核苷酸長（包括端點），包括每個規定範圍內的所有較短長度。在某些實施方案中，靶序列爲9至26個核苷酸長（包括端點），包括其之間的所有子範圍和整數。例如，儘管不旨在限制，在本發明的某些實施方案中，靶序列是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長，其中該序列與HBV基因的RNA轉錄物的至少一部分完全或至少基本上互補。
本文中使用的“dsRNA劑”意指包含能够以序列特異性方式降解或抑制靶mRNA的信使RNA（mRNA）轉錄物之翻譯的RNA或RNA樣（例如，經化學修飾的RNA）寡核苷酸分子的組合物。雖然不希望受特定理論的限制，但本發明的dsRNA劑可通過RNA干擾機制[即，通過與哺乳動物細胞的RNA干擾途徑機制（RNA誘導的沉默複合物或RISC）相互作用來誘導RNA干擾]，或通過任何替代機制或途徑發揮作用。用於使植物、無脊椎動物和脊椎動物細胞中基因沉默的方法是本領域公知的[參見，例如，Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485；Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363；Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309；和Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)]，其各自的公開內容通過引用整體併入本文]。本領域已知的基因沉默操作可與本文中提供的公開內容聯合使用以抑制HBV的表達。
本文中公開的dsRNA劑包含有義鏈和反義鏈，並且包括但不限於：短干擾RNA（short interfering RNA，siRNA）、RNAi劑、微RNA（micro RNA，miRNA）、短髮夾RNA（short hairpin RNA，shRNA），及切丁酶（dicer）底物。本文中所述的dsRNA劑的反義鏈與被靶向的mRNA至少部分互補。本領域理解不同長度的dsRNA雙鏈體結構可用於抑制靶基因表達。例如，已知具有19、20、21、22和23個鹼基對的雙鏈體結構的dsRNA有效誘導RNA干擾（Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）並且本領域還已知更短或更長的RNA雙鏈體結構也能够有效誘導RNA干擾。在本發明的某些實施方案中，HBV dsRNA可包含長度爲最小21 nt的至少一條鏈或者可具有更短的雙鏈體。在某些實施方案中，本發明的dsRNA劑是表1至表4任一個中公開的雙鏈體。在一些實施方案中，本發明的dsRNA劑是表1至表4中公開的雙鏈體，但在該雙鏈體的一端或兩端减去1、2、3或4個核苷酸，並且還能够降低HBV表達。在本發明的一些實施方案中，HBV dsRNA劑可具有來自表1至表4中一個或更多個序列的至少15、16、17、18、19、20或更多個連續核苷酸的部分序列，並且它們抑制HBV基因表達的能力與包含完整序列的dsRNA產生的抑制水平相差不超過5%、10%、15%、20%、25%或30%。表1至表4中公開的有義序列、反義序列和雙鏈體在本文中可稱爲“親本”序列，意指表1至表4中公開的序列可如本文中所述被修飾、縮短、延長、包括替換等，其中所得序列保留其親本序列在本發明的方法和組合物中的全部或至少部分效力。本發明的dsRNA中包含的有義鏈和反義鏈是獨立選擇的。本文中使用的術語“獨立選擇的”意指兩個或更多個類似要素各自可獨立於其他要素的選擇來選擇。例如，雖然不旨在限制，但在製備本發明的dsRNA時，可選擇兩條鏈的“要素”以包括在雙鏈體中。一個選擇的要素，有義序列，可以是SEQ ID NO: 553（在表3中示出）並且另一個選擇的要素，反義序列，可以是SEQ ID NO: 578或者可以是與其親本序列SEQ ID NO: 578相比被修飾、縮短、延長和/或包含1、2或3個替換的SEQ ID NO: 578。應理解，本發明的雙鏈體不需要包含在表1至表4中示出爲雙鏈體配對的有義和反義序列二者。
表1至表4示出了某些HBV dsRNA劑反義鏈和有義鏈核心延伸鹼基序列。本文中使用術語“鹼基序列”以提及沒有化學修飾或遞送化合物的多核苷酸序列。例如，表1中示出的有義鏈acuucucucaauuuucuagga（SEQ ID NO: 2）是表2中SEQ ID NO: 278的鹼基序列，其中SEQ ID NO: 278與其化學修飾一起示出。本文中公開的序列可被分配標識符。例如，單鏈有義序列可用“有義鏈SS#”來標識；單鏈反義序列可用“反義鏈AS#”來標識，並且包含有義鏈和反義鏈的雙鏈體可用“雙鏈體AV#”或“雙鏈體AD#”來標識。
表1公開了有義鏈和反義鏈序列並且提供了由表1中同一行上的有義鏈和反義鏈形成的雙鏈體的標識號。本文中使用的術語有義鏈和反義鏈中的“匹配位置”是當兩條鏈是雙鏈體化鏈時每條鏈中“配對”的位置。例如，在21-核鹼基有義鏈和21-核鹼基反義鏈中，該有義鏈第1位的核鹼基和該反義鏈中第21位的核鹼基處於“匹配位置”。在另一個非限制性實例中，在23-核鹼基有義鏈和23-核鹼基反義鏈中，該有義鏈的核鹼基2和該反義鏈第22位的核鹼基處於匹配位置。在另一個非限制性實例中，在18-核鹼基有義鏈和18-核鹼基反義鏈中，該有義鏈第1位的核鹼基和反義鏈中第18位的核鹼基處於匹配位置，並且該有義鏈中第4位的核鹼基和該反義鏈中第15位的核鹼基處於匹配位置。本領域技術人員將理解如何識別是或將是雙鏈體化鏈和配對鏈的有義鏈和反義鏈中的匹配位置。
表1中的第一列表示包含同一表行中有義序列和反義序列的雙鏈體的雙鏈體AV#。例如，表1公開了被分配雙鏈體AV#AV00053的雙鏈體，其包含有義鏈SEQ ID NO: 1和反義鏈SEQ ID NO: 139。因此，表1中的每一行公開了本發明的雙鏈體，其各自包含同一行中示出的有義序列和反義序列。
在本發明的方法的一些實施方案中，將包含表1中公開的雙鏈序列的RNAi劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，施用於對象的RNAi劑包含含有表1中所示的鏈序列中的至少一個的雙鏈體，其包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個序列修飾。在本發明的方法的一些實施方案中，將包含表1中示出的dsRNA多核苷酸序列的RNAi劑與遞送分子（在本文也稱爲遞送化合物）連接。遞送化合物的一個非限制性實例是包含GalNAc化合物的遞送化合物。 表1：未經修飾的HBV RNAi劑有義鏈和反義鏈序列。所有序列均以5’至3’方向顯示。雙鏈體AV#是分配至表中同一行中兩條鏈的雙鏈體的編號。
雙鏈體ID 有義鏈 SEQ ID NO 反義鏈 SEQ ID NO
AV00053 ugguggacuucucucaauuua 1 uaaauugagagaaguccacca 139
AV00054 acuucucucaauuuucuagga 2 uccuagaaaauugagagaagu 140
AV00055 guuaccaauuuucuuuuguca 3 ugacaaaagaaaauugguaac 141
AV00056 cauaagaggacucuuggacua 4 uaguccaagaguccucuuaug 142
AV00057 gggguuuuucuuguugacaaa 5 uuugucaacaagaaaaacccc 143
AV00058 uggacuucucucaauuuucua 6 uagaaaauugagagaagucca 144
AV00059 cugcuaugccucaucuucuua 7 uaagaagaugaggcauagcag 145
AV00060 cauuuguucagugguucguaa 8 uuacgaaccacugaacaaaug 146
AV00061 gggcgcaccucucuuuacgca 9 ugcguaaagagaggugcgccc 147
AV00062 uagacucgugguggacuucua 10 uagaaguccaccacgagucua 148
AV00063 ggacuucucucaauuuucuaa 11 uuagaaaauugagagaagucc 149
AV00064 uuggcucaguuuacuagugca 12 ugcacuaguaaacugagccaa 150
AV00065 cuagugccauuuguucaguga 13 ucacugaacaaauggcacuag 151
AV00066 uguuaccaauuuucuuuugua 14 uacaaaagaaaauugguaaca 152
AV00067 uucgcuucaccucugcacgua 15 uacgugcagaggugaagcgaa 153
AV00068 uaggaggcuguaggcauaaaa 16 uuuuaugccuacagccuccua 154
AV00069 aggcuguaggcauaaauugga 17 uccaauuuaugccuacagccu 155
AV00070 cuucucucaauuuucuaggga 18 ucccuagaaaauugagagaag 156
AV00071 cuguuaccaauuuucuuuuga 19 ucaaaagaaaauugguaacag 157
AV00072 ccgucugugccuucucaucua 20 uagaugagaaggcacagacgg 158
AV00073 uacauaagaggacucuuggaa 21 uuccaagaguccucuuaugua 159
AV00074 uacaggcgggguuuuucuuga 22 ucaagaaaaaccccgccugua 160
AV00075 caggcgggguuuuucuuguua 23 uaacaagaaaaaccccgccug 161
AV00076 cgggguuuuucuuguugacaa 24 uugucaacaagaaaaaccccg 162
AV00077 cucgugguggacuucucucaa 25 uugagagaaguccaccacgag 163
AV00078 cgugguggacuucucucaaua 26 uauugagagaaguccaccacg 164
AV00079 gugguggacuucucucaauua 27 uaauugagagaaguccaccac 165
AV00080 uuuacuagugccauuuguuca 28 ugaacaaauggcacuaguaaa 166
AV00081 agugccauuuguucaguggua 29 uaccacugaacaaauggcacu 167
AV00082 uuaccaauuuucuuuugucua 30 uagacaaaagaaaauugguaa 168
AV00083 aggccuauugauuggaaagua 31 uacuuuccaaucaauaggccu 169
AV00084 ccgauccauacugcggaacua 32 uaguuccgcaguauggaucgg 170
AV00085 gugugcacuucgcuucaccua 33 uaggugaagcgaagugcacac 171
AV00086 uuacauaagaggacucuugga 34 uccaagaguccucuuauguaa 172
AV00087 uccugcugcuaugccucauca 35 ugaugaggcauagcagcagga 173
AV00088 cugugccaaguguuugcugaa 36 uucagcaaacacuuggcacag 174
AV00089 ugugccaaguguuugcugaca 37 ugucagcaaacacuuggcaca 175
AV00090 cgugugcacuucgcuucacca 38 uggugaagcgaagugcacacg 176
AV00091 guauaagaggacucuuggaca 39 uguccaagaguccucuuauac 177
AV00092 gucuagacucgugguggacua 40 uaguccaccacgagucuagac 178
AV00093 ucuagacucgugguggacuua 41 uaaguccaccacgagucuaga 179
AV00094 auccugcugcuaugccucaua 42 uaugaggcauagcagcaggau 180
AV00095 aagguauguugcccguuugua 43 uacaaacgggcaacauaccuu 181
AV00096 aguuuacuagugccauuugua 44 uacaaauggcacuaguaaacu 182
AV00097 ccauuuguucagugguucgua 45 uacgaaccacugaacaaaugg 183
AV00098 cagcgcaugcguggaaccuua 46 uaagguuccacgcaugcgcug 184
AV00099 augucaacgaccgaccuugaa 47 uucaaggucggucguugacau 185
AV00100 guuacaggcgggguuuuucua 48 uagaaaaaccccgccuguaac 186
AV00101 gcagagucuagacucguggua 49 uaccacgagucuagacucugc 187
AV00102 gagucuagacucgugguggaa 50 uuccaccacgagucuagacuc 188
AV00103 cuucauccugcugcuaugcca 51 uggcauagcagcaggaugaag 189
AV00104 ccugcugcuaugccucaucua 52 uagaugaggcauagcagcagg 190
AV00105 agguauguugcccguuuguca 53 ugacaaacgggcaacauaccu 191
AV00106 gugccauuuguucagugguua 54 uaaccacugaacaaauggcac 192
AV00107 cggggcgcaccucucuuuaca 55 uguaaagagaggugcgccccg 193
AV00108 uuacaggcgggguuuuucuua 56 uaagaaaaaccccgccuguaa 194
AV00109 acaggcgggguuuuucuugua 57 uacaagaaaaaccccgccugu 195
AV00110 ucaagguauguugcccguuua 58 uaaacgggcaacauaccuuga 196
AV00111 cauacugcggaacuccuagca 59 ugcuaggaguuccgcaguaug 197
AV00112 gaccacggggcgcaccucuca 60 ugagaggugcgccccgugguc 198
AV00113 ugucaacgaccgaccuugaga 61 ucucaaggucggucguugaca 199
AV00114 uucauccugcugcuaugccua 62 uaggcauagcagcaggaugaa 200
AV00115 gcuccucugccgauccauaca 63 uguauggaucggcagaggagc 201
AV00116 cuccucugccgauccauacua 64 uaguauggaucggcagaggag 202
AV00117 ccucugccgauccauacugca 65 ugcaguauggaucggcagagg 203
AV00118 cgauccauacugcggaacuca 66 ugaguuccgcaguauggaucg 204
AV00119 ggcgcaccucucuuuacgcga 67 ucgcguaaagagaggugcgcc 205
AV00120 cccgucugugccuucucauca 68 ugaugagaaggcacagacggg 206
AV00121 ucaacgaccgaccuugaggca 69 ugccucaaggucggucguuga 207
AV00053-1 guggacuucucucaauuua 70 uaaauugagagaaguccac 208
AV00054-1 uucucucaauuuucuagga 71 uccuagaaaauugagagaa 209
AV00055-1 uaccaauuuucuuuuguca 72 ugacaaaagaaaauuggua 210
AV00056-1 uaagaggacucuuggacua 73 uaguccaagaguccucuua 211
AV00057-1 gguuuuucuuguugacaaa 74 uuugucaacaagaaaaacc 212
AV00058-1 gacuucucucaauuuucua 75 uagaaaauugagagaaguc 213
AV00059-1 gcuaugccucaucuucuua 76 uaagaagaugaggcauagc 214
AV00060-1 uuuguucagugguucguaa 77 uuacgaaccacugaacaaa 215
AV00061-1 gcgcaccucucuuuacgca 78 ugcguaaagagaggugcgc 216
AV00062-1 gacucgugguggacuucua 79 uagaaguccaccacgaguc 217
AV00063-1 acuucucucaauuuucuaa 80 uuagaaaauugagagaagu 218
AV00064-1 ggcucaguuuacuagugca 81 ugcacuaguaaacugagcc 219
AV00065-1 agugccauuuguucaguga 82 ucacugaacaaauggcacu 220
AV00066-1 uuaccaauuuucuuuugua 83 uacaaaagaaaauugguaa 221
AV00067-1 cgcuucaccucugcacgua 84 uacgugcagaggugaagcg 222
AV00068-1 ggaggcuguaggcauaaaa 85 uuuuaugccuacagccucc 223
AV00069-1 gcuguaggcauaaauugga 86 uccaauuuaugccuacagc 224
AV00070-1 ucucucaauuuucuaggga 87 ucccuagaaaauugagaga 225
AV00071-1 guuaccaauuuucuuuuga 88 ucaaaagaaaauugguaac 226
AV00072-1 gucugugccuucucaucua 89 uagaugagaaggcacagac 227
AV00073-1 cauaagaggacucuuggaa 90 uuccaagaguccucuuaug 228
AV00074-1 caggcgggguuuuucuuga 91 ucaagaaaaaccccgccug 229
AV00075-1 ggcgggguuuuucuuguua 92 uaacaagaaaaaccccgcc 230
AV00076-1 ggguuuuucuuguugacaa 93 uugucaacaagaaaaaccc 231
AV00077-1 cgugguggacuucucucaa 94 uugagagaaguccaccacg 232
AV00078-1 ugguggacuucucucaaua 95 uauugagagaaguccacca 233
AV00079-1 gguggacuucucucaauua 96 uaauugagagaaguccacc 234
AV00080-1 uacuagugccauuuguuca 97 ugaacaaauggcacuagua 235
AV00081-1 ugccauuuguucaguggua 98 uaccacugaacaaauggca 236
AV00082-1 accaauuuucuuuugucua 99 uagacaaaagaaaauuggu 237
AV00083-1 gccuauugauuggaaagua 100 uacuuuccaaucaauaggc 238
AV00084-1 gauccauacugcggaacua 101 uaguuccgcaguauggauc 239
AV00085-1 gugcacuucgcuucaccua 102 uaggugaagcgaagugcac 240
AV00086-1 acauaagaggacucuugga 103 uccaagaguccucuuaugu 241
AV00087-1 cugcugcuaugccucauca 104 ugaugaggcauagcagcag 242
AV00088-1 gugccaaguguuugcugaa 105 uucagcaaacacuuggcac 243
AV00089-1 ugccaaguguuugcugaca 106 ugucagcaaacacuuggca 244
AV00090-1 ugugcacuucgcuucacca 107 uggugaagcgaagugcaca 245
AV00091-1 auaagaggacucuuggaca 108 uguccaagaguccucuuau 246
AV00092-1 cuagacucgugguggacua 109 uaguccaccacgagucuag 247
AV00093-1 uagacucgugguggacuua 110 uaaguccaccacgagucua 248
AV00094-1 ccugcugcuaugccucaua 111 uaugaggcauagcagcagg 249
AV00095-1 gguauguugcccguuugua 112 uacaaacgggcaacauacc 250
AV00096-1 uuuacuagugccauuugua 113 uacaaauggcacuaguaaa 251
AV00097-1 auuuguucagugguucgua 114 uacgaaccacugaacaaau 252
AV00098-1 gcgcaugcguggaaccuua 115 uaagguuccacgcaugcgc 253
AV00099-1 gucaacgaccgaccuugaa 116 uucaaggucggucguugac 254
AV00100-1 uacaggcgggguuuuucua 117 uagaaaaaccccgccugua 255
AV00101-1 agagucuagacucguggua 118 uaccacgagucuagacucu 256
AV00102-1 gucuagacucgugguggaa 119 uuccaccacgagucuagac 257
AV00103-1 ucauccugcugcuaugcca 120 uggcauagcagcaggauga 258
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AV00105-1 guauguugcccguuuguca 122 ugacaaacgggcaacauac 260
AV00106-1 gccauuuguucagugguua 123 uaaccacugaacaaauggc 261
AV00107-1 gggcgcaccucucuuuaca 124 uguaaagagaggugcgccc 262
AV00108-1 acaggcgggguuuuucuua 125 uaagaaaaaccccgccugu 263
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AV00110-1 aagguauguugcccguuua 127 uaaacgggcaacauaccuu 265
AV00111-1 uacugcggaacuccuagca 128 ugcuaggaguuccgcagua 266
AV00112-1 ccacggggcgcaccucuca 129 ugagaggugcgccccgugg 267
AV00113-1 ucaacgaccgaccuugaga 130 ucucaaggucggucguuga 268
AV00114-1 cauccugcugcuaugccua 131 uaggcauagcagcaggaug 269
AV00115-1 uccucugccgauccauaca 132 uguauggaucggcagagga 270
AV00116-1 ccucugccgauccauacua 133 uaguauggaucggcagagg 271
AV00117-1 ucugccgauccauacugca 134 ugcaguauggaucggcaga 272
AV00118-1 auccauacugcggaacuca 135 ugaguuccgcaguauggau 273
AV00119-1 cgcaccucucuuuacgcga 136 ucgcguaaagagaggugcg 274
AV00120-1 cgucugugccuucucauca 137 ugaugagaaggcacagacg 275
AV00121-1 aacgaccgaccuugaggca 138 ugccucaaggucggucguu 276
AV01258 cggguuuuucuuguugacaaa 674 uuugucaacaagaaaaacccg 735
AV01259 cggguuuuucuuguugacaau 675 auugucaacaagaaaaacccg 736
AV01260 cggguuuuucuuguugacaac 676 guugucaacaagaaaaacccg 737
AV01261 cggguuuuucuuguugacaag 677 cuugucaacaagaaaaacccg 738
AV01262 uuuuucuuguugacaaa 678 uuugucaacaagaaaaa 739
AV01263 guuuuucuuguugacaaa 679 uuugucaacaagaaaaac 740
AV01264 aguuuuucuuguugacaaa 680 uuugucaacaagaaaaacu 741
AV01265 uguuuuucuuguugacaaa 681 uuugucaacaagaaaaaca 742
AV01266 gguuuuucuuguugacaaa 682 uuugucaacaagaaaaacc 743
AV01267 cguuuuucuuguugacaaa 683 uuugucaacaagaaaaacg 744
AV01268 agguuuuucuuguugacaaa 684 uuugucaacaagaaaaaccu 745
AV01269 ugguuuuucuuguugacaaa 685 uuugucaacaagaaaaacca 746
AV01270 ggguuuuucuuguugacaaa 686 uuugucaacaagaaaaaccc 747
AV01271 cgguuuuucuuguugacaaa 687 uuugucaacaagaaaaaccg 748
AV01273 aggguuuuucuuguugacaaa 688 uuugucaacaagaaaaacccu 749
AV01274 uggguuuuucuuguugacaaa 689 uuugucaacaagaaaaaccca 750
AV01275 cgggguuuuucuuguugacaaa 690 uuugucaacaagaaaaaccccg 751
AV01276 gcgggguuuuucuuguugacaaa 691 uuugucaacaagaaaaaccccgc 752
AV01277 ggcgggguuuuucuuguugacaaa 692 uuugucaacaagaaaaaccccgcc 753
AV01278 aggcgggguuuuucuuguugacaaa 693 uuugucaacaagaaaaaccccgccu 754
AV01279 caggcgggguuuuucuuguugacaaa 694 uuugucaacaagaaaaaccccgccug 755
AV01280 guguuacaggcgggguuuuucuuguugacaaa 695 uuugucaacaagaaaaaccccgccuguaacac 756
AV01281 cggguuuuucuuguugacaaa 696 uuugucaacaagaaaaacccguu 757
AV01282 cggguuuuucuuguugacaaa 697 uuugucaacaagaaaaacccgga 758
AV01283 cggguuuuucuuguugacaaa 698 uuugucaacaagaaaaacccg 759
AV01284 cggguuuuucuuguugacaaa 699 uuugucaacaagaaaaacccg 760
AV01285 cggguuuuucuuguugacaaa 700 uuugucaacaagaaaaacccg 761
AV01286 cggguuuuucuuguuaacaaa 701 uuugucaacaagaaaaacccg 762
AV01287 cggguuuuucuuguugacaga 702 ucugucaacaagaaaaacccg 763
AV01288 cggguuuuucuuguugacaaa 703 uuugucaacaagaaaaacccg 764
AV01289 caggguuuuucuuguugacau 704 augucaacaagaaaaacccug 765
AV01290 caggguuuuucuuguugacaa 705 uugucaacaagaaaaacccug 766
AV01291 caggguuuuucuuguugacac 706 gugucaacaagaaaaacccug 767
AV01292 caggguuuuucuuguugacag 707 cugucaacaagaaaaacccug 768
AV01293 guuuuucuuguugacau 708 augucaacaagaaaaac 769
AV01294 gguuuuucuuguugacau 709 augucaacaagaaaaacc 770
AV01295 agguuuuucuuguugacau 710 augucaacaagaaaaaccu 771
AV01296 ugguuuuucuuguugacau 711 augucaacaagaaaaacca 772
AV01297 ggguuuuucuuguugacau 712 augucaacaagaaaaaccc 773
AV01298 cgguuuuucuuguugacau 713 augucaacaagaaaaaccg 774
AV01299 aggguuuuucuuguugacau 714 augucaacaagaaaaacccu 775
AV01300 uggguuuuucuuguugacau 715 augucaacaagaaaaaccca 776
AV01301 gggguuuuucuuguugacau 716 augucaacaagaaaaacccc 777
AV01302 cggguuuuucuuguugacau 717 augucaacaagaaaaacccg 778
AV01303 gaggguuuuucuuguugacau 718 augucaacaagaaaaacccuc 779
AV01304 aaggguuuuucuuguugacau 719 augucaacaagaaaaacccuu 780
AV01305 uaggguuuuucuuguugacau 720 augucaacaagaaaaacccua 781
AV01306 gcgggguuuuucuuguugacau 721 augucaacaagaaaaaccccgc 782
AV01307 ggcgggguuuuucuuguugacau 722 augucaacaagaaaaaccccgcc 783
AV01308 aggcgggguuuuucuuguugacau 723 augucaacaagaaaaaccccgccu 784
AV01309 caggcgggguuuuucuuguugacau 724 augucaacaagaaaaaccccgccug 785
AV01310 acaggcgggguuuuucuuguugacau 725 augucaacaagaaaaaccccgccugu 786
AV01311 cguguuacaggcgggguuuuucuuguugacau 726 augucaacaagaaaaaccccgccuguaacacg 787
AV01312 caggguuuuucuuguugacau 727 augucaacaagaaaaacccuguu 788
AV01313 caggguuuuucuuguugacau 728 augucaacaagaaaaacccugga 789
AV01314 caggguuuuucuuguugacau 729 augucaacaagaaaaacccug 790
AV01315 caggguuuuucuuguugacau 730 augucaacaagaaaaacccug 791
AV01316 caggguuuuucuuguugacau 731 augucaacaagaaaaacccug 792
AV01317 caggguuuuucuugucgacau 732 augucaacaagaaaaacccug 793
AV01318 caggguuuuucuuguugacgu 733 acgucaacaagaaaaacccug 794
AV01319 caggguuuuucuuguugacau 734 augucaacaagaaaaacccug 795
表2示出了本發明的某些經化學修飾的HBV RNAi劑有義鏈和反義鏈序列。在本發明的方法的一些實施方案中，將具有表2中示出的多核苷酸序列的RNAi劑施用於細胞和/或對象。在本發明的一些實施方案中，施用於對象的RNAi劑包含是在表2的一行中第一列標識的雙鏈體，並且包含分別在表2的同一行中第四列和第七列中的有義鏈序列和反義鏈序列中示出的序列修飾。在本發明的方法的一些實施方案中，表2中示出的序列可與能够將RNAi劑遞送至對象中的細胞和/或組織的化合物連接（在本文中也稱爲“綴合”）。可用於本發明的某些實施方案中的遞送化合物的一個非限制性實例是包含GalNAc的化合物。在表2中，第一列表示如表1中示出的鹼基序列的雙鏈體AV#。表2公開了雙鏈體AV#並且還示出了包含在該雙鏈體的有義序列和反義序列中的化學修飾。例如，表1示出了鹼基單鏈序列SEQ ID NO: 1（有義）和SEQ ID NO: 139（反義），其一起是標識爲雙鏈體AV# AV00053的雙鏈雙鏈體。表2列出了雙鏈體AV# AV00053，並示出了SEQ ID NO: 277和SEQ ID NO: 415的雙鏈體，其分別包含鹼基序列SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 139，但具有分別在第四列和第七列中所示的有義鏈序列和反義鏈序列中示出的化學修飾。表2第二列中的“有義鏈SS#”是針對同一行中第四列示出的有義序列（包含修飾）分配的標識符。表2第五列中的“反義鏈AS#”是針對第七列中示出的反義序列（包含修飾）分配的標識符。 表2：提供了經化學修飾的HBV RNAi劑有義鏈和反義鏈序列。所有序列均以5’至3’顯示。這些序列用於本文中所述的某些體外測試研究。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*
表3公開了本發明的某些經化學修飾的HBV RNAi劑反義鏈和有義鏈序列以及dsRNA。在本發明的方法的一些實施方案中，將表3中示出的RNAi劑施用於細胞和/或對象。在本發明的方法的一些實施方案中，將包含表3示出的多核苷酸序列的RNAi劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，施用於對象的RNAi劑包含在表3中第一列中標識的雙鏈體，其中該雙鏈體包含分別在表3的同一行中第四列和第七列中的有義鏈序列和反義鏈序列中示出的序列修飾和/或遞送化合物。這些序列用於本文中別處所述的某些體內測試研究。在一些實施方案中，表3中示出的序列可與用於遞送的化合物連接（在本文中也稱爲“綴合”），所述用於遞送的化合物的一個非限制性實例是包含GalNAc的化合物。遞送化合物的某些實施方案在表3中在第四列的有義鏈上標識爲“GLX-0”。如本文中所用和表3中所示，“GLX-0”表示包含GalNAc的化合物。應理解，另外的GLO-n或GLS-n化合物可替換顯示爲GLO-0的化合物，其中所得化合物包括在本發明的方法和/或組合物的一個實施方案中。在本發明的一些實施方案中，表3中顯示爲GLX-0的遞送化合物被以下化合物中的任一種替代：GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-5、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、GLS-10、GLS-11、GLS-12、GLS-13、GLS-14、GLS-15、GLS-16、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16，其各自的結構在本文別處提供。本領域技術人員將能够製備和使用本發明的dsRNA化合物，其中所連接的遞送化合物是以下之一：GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-5、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、GLS-10、GLS-11、GLS-12、GLS-13、GLS-14、GLS-15、GLS-16、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16。表3的每一行提供了分配至該表的該行中的有義序列和反義序列的雙鏈體的雙鏈體AD#。例如，雙鏈體AD#AD00166是包含有義鏈SEQ ID NO: 553和反義鏈SEQ ID NO: 578的雙鏈體。表3中的每一行提供了有義鏈和反義鏈，並且公開了示出的有義鏈和反義鏈的雙鏈體。表3第二列中的“有義鏈SS#”是針對同一行中第四列示出的有義序列（包含修飾）分配的標識符。表3第五列中的“反義鏈AS#”是針對第七列中示出的反義序列（包含修飾）分配的標識符。某些所連接的包含GalNAc的GLO或GLS化合物的標識符顯示爲GLX-0，並且應理解，另外的GLO或GLS化合物可替換顯示爲GLX-0的化合物，其中所得化合物包括在本發明的方法和/或組合物的一個實施方案中。 表3提供了經化學修飾的HBV RNAi劑有義鏈和反義鏈序列。所有序列均以5’至3’顯示。這些序列用於本文中所述的某些體內測試研究。體內研究中使用的遞送分子在每條有義鏈的3’末端表示爲“GLX-0”。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*
表4示出了本發明的某些經化學修飾的HBV RNAi劑有義鏈序列和反義鏈序列，並標識了包含有義和反義的雙鏈體。在本發明的方法的一些實施方案中，將具有表4中示出的多核苷酸序列的RNAi劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，施用於對象的RNAi劑包含在表4的一行中第一列標識的雙鏈體，並且包含分別在表4的同一行中第四列和第七列中的有義鏈序列和反義鏈序列中示出的序列修飾和/或遞送化合物。在一些實施方案中，表4中示出的序列可與能够將dsRNA劑遞送至對象中的細胞和/或組織的化合物連接。可在本發明的某些實施方案中使用的遞送化合物的一個非限制性實例是包含GalNAc的化合物。在表4中，術語“GLS-5”表示如示出的有義鏈中的包含GalNAc的化合物。應理解，在本發明的化合物、組合物和方法的某些實施方案中，GLS-5被以下化合物中的任一種替代：GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、GLS-10、GLS-11、GLS-12、GLS-13、GLS-14、GLS-15、GLS-16、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16，其各自的結構在本文別處提供。表4的第一列表示針對該行中公開的雙鏈體的雙鏈體標識號。 表4：經化學修飾的HBV RNAi劑有義鏈和反義鏈序列。序列用於本文別處所述的某些體內研究。所有序列均以5’至3’顯示。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*；Invab=反向無鹼基。
在本發明的方法和組合物的一些實施方案中，本發明的dsRNA劑的有義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 281、290、295、300、304、306、307、331、557、567、569、571、572、573、560、563、607、628至637或918至921。在本發明的方法和組合物的某些實施方案中，dsRNA劑的反義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 419、428、433、438、442、444、445、469、582、592、594、596、597、598、585、588、642、663至672或922至925。在本發明的方法和組合物的一些實施方案中，dsRNA劑包含：SEQ ID NO: 281和SEQ ID NO: 419；SEQ ID NO: 290和SEQ ID NO: 428；SEQ ID NO: 295和SEQ ID NO: 433；SEQ ID NO: 300和SEQ ID NO: 438；SEQ ID NO: 304和SEQ ID NO: 442；SEQ ID NO: 306和SEQ ID NO: 444；SEQ ID NO: 307和SEQ ID NO: 445；SEQ ID NO: 331和SEQ ID NO: 469；SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582；SEQ ID NO: 567和SEQ ID NO: 592；SEQ ID NO: 569和SEQ ID NO: 594；SEQ ID NO: 571和SEQ ID NO: 596；SEQ ID NO: 572和SEQ ID NO: 597；SEQ ID NO: 573和SEQ ID NO: 598；SEQ ID NO: 560和SEQ ID NO: 585；SEQ ID NO: 563和SEQ ID NO: 588；SEQ ID NO: 607和SEQ ID NO: 642；SEQ ID NO: 628和SEQ ID NO: 663；SEQ ID NO: 629和SEQ ID NO: 664；SEQ ID NO: 630和SEQ ID NO: 665；SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666；SEQ ID NO: 632和SEQ ID NO: 667；SEQ ID NO: 633和SEQ ID NO: 668；SEQ ID NO: 634和SEQ ID NO: 669；SEQ ID NO: 635和SEQ ID NO: 670；SEQ ID NO: 636和SEQ ID NO: 671；SEQ ID NO: 637和SEQ ID NO: 672；SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922；SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923；SEQ ID NO: 920和SEQ ID NO: 924；或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925。
在本發明的某些實施方案中，dsRNA（在本文中也稱爲“雙鏈體”）是表1至表4之一中公開的一種。表1至表4中的每一行公開了包含在該表行中的有義鏈序列和反義鏈序列的雙鏈體。除表1至表4中公開的雙鏈體之外，還應理解，在一些實施方案中，本發明的雙鏈體可包含表1至表4中所示的有義序列和反義序列，其與表1至表4中所示序列中顯示的存在0、1、2或3個核苷酸差異。因此，在一些實施方案中，本發明的雙鏈體中的反義鏈可以是與SEQ ID NO: 139中核苷酸相比具有0、1、2或3個不同核苷酸的SEQ ID NO: 139。
應理解，本發明的雙鏈體中的有義鏈序列和反義鏈序列可獨立選擇。因此，本發明的dsRNA可包含表1至表4中的一行中公開的雙鏈體的有義鏈和反義鏈。或者，在本發明的dsRNA中，dsRNA中所選擇的有義鏈和反義鏈之一或二者可包含表1至表4中所示的序列，但其中該有義序列和反義序列之一或二者相對於親本序列包含1、2、3個或更多個核鹼基替換。在一些實施方案中，選擇的序列可比其親本序列更長或更短。因此，本發明中包括的dsRNA劑可以但不必須包含表1至表4中公開爲雙鏈體的有義和反義對的確切序列。
在一些實施方案中，dsRNA劑包含有義鏈和反義鏈，反義鏈中的第2至18位核苷酸包含HBV RNA轉錄物的互補區，其中所述互補區包含與表1至表4之一中列出的反義序列之一存在0、1、2或3個核苷酸差異的至少15個連續核苷酸，並且任選地包含靶向配體。在一些情况下，HBV RNA轉錄物的互補區包含與表1至表4之一中列出的反義序列之一存在不超過3個核苷酸差異的至少15、16、17、18或19個連續核苷酸。在本發明的dsRNA劑的一些實施方案中，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 673的任一個靶區域至少基本上互補，並且在表1至表4的任一個中提供。在一些實施方案中，本發明的dsRNA劑的反義鏈與SEQ ID NO: 673的任一個靶區域完全互補，並且在表1至表4的任一個中提供。在一些實施方案中，dsRNA劑包含表1至表4的任一個中所示的有義鏈序列，並且所述有義鏈序列與dsRNA劑中的反義鏈序列至少基本上互補。在另一些實施方案中，本發明的dsRNA劑包含表1至表4的任一個中所示的有義鏈序列，並且所述有義鏈序列與dsRNA劑中的反義鏈序列完全互補。在一些情况下，本發明的dsRNA劑包含表1至表4的任一個中所示的反義鏈序列。本發明的dsRNA劑的一些實施方案包含表1至表4的任一個中公開爲雙鏈體的有義序列和反義序列。如本文中所述，應理解本發明的雙鏈體中的有義鏈和反義鏈可獨立選擇。 錯配
本領域技術人員已知，錯配針對在dsRNA中的效力是耐受的，尤其是如果錯配在dsRNA的末端區域中的情况下。在dsRNA中，某些錯配的耐受較好，例如針對效力，具有擺動鹼基對G:U和A:C的錯配的耐受較好（Du et el., Nucleic Acids Res. 2005 Mar 21;33(5):1671-7）。在本發明的方法和化合物的一些實施方案中，HBV dsRNA劑可包含與HBV靶序列的一個或更多個錯配。在一些實施方案中，本發明的HBV dsRNA劑不包含錯配。在某些實施方案中，本發明的HBV dsRNA劑包含不超過1個、不超過2個或不超過3個與HBV靶序列的錯配。在本發明的一些實施方案中，HBV dsRNA劑的反義鏈包含不位於互補區中心的與HBV靶序列的錯配。在一些實施方案中，HBV dsRNA劑的反義鏈包含1、2、3、4個或更多個錯配，其在來自互補區的5’末端和3’末端之一或二者的最後5、4、3、2或1個核苷酸中。本文中所述的方法和/或本領域已知的方法可用於確定包含與HBV靶序列的錯配的HBV dsRNA劑是否有效抑制HBV基因的表達。 互補性
除非另有說明，否則本文中使用的術語“互補”在用於描述與第二核苷酸序列（例如，HBV dsRNA劑反義鏈）相關的第一核苷酸序列（例如，HBV dsRNA劑有義鏈）時，意指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下雜交[在哺乳動物生理條件（或類似的體外條件）下形成鹼基對氫鍵]並形成雙鏈體或雙螺旋結構的能力。其他條件也可適用，例如如可在生物體內遇到的生理相關條件。本領域技術人員將能够根據雜交核苷酸的最終應用來確定最適合於測試兩個序列的互補性的一組條件。至少在滿足上述雜交要求的程度上，互補序列包含沃森-克裏克（Watson-Crick）鹼基對或非沃森-克裏克鹼基對，並且包含天然或經修飾核苷酸或核苷酸模擬物。序列同一性或互補性與修飾無關。
互補序列，例如在如本文中所述的HBV dsRNA中的互補序列，包含含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在該核苷酸序列之一或二者的全長上的鹼基配對。這樣的序列在本文中可被稱爲相對於彼此“完全互補”。應理解，在一些實施方案中，當兩個寡核苷酸被設計成在雜交之後形成一個或更多個單鏈突出端時，這樣的突出端在本文中不被認爲是關於確定互補性的錯配。例如，HBV dsRNA劑包含一個長度爲19個核苷酸的寡核苷酸和另一個長度爲20個核苷酸的寡核苷酸，其中較長的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補的19個核苷酸的序列，出於本文中所述的目的，其也可被稱爲“完全互補”。因此，本文中使用的“完全互補”意指第一多核苷酸的連續序列中的所有（100%）鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中相同數目的鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
本文中使用的術語“基本上互補”意指在雜交的核鹼基序列對中，第一多核苷酸的連續序列中至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%但不是全部的鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中相同數目的鹼基雜交。術語“基本上互補”可用於提及第一序列相對於第二序列，如果這兩個序列針對多至15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個鹼基對（bp）的雙鏈體在雜交之後包含一個或更多個（例如至少1、2、3、4或5個）錯配鹼基對同時保留在與它們的最終應用（例如，通過RISC途徑抑制HBV基因表達）最相關的條件下雜交的能力。
術語“部分互補”在本文中可用於提及這樣的核鹼基序列的雜交對，其中第一多核苷酸的連續序列中的至少75%但不是全部的鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中的相同數目的鹼基雜交。在一些實施方案中，“部分互補”意指第一多核苷酸的連續序列中的至少76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中的相同數目的鹼基雜交。
術語“互補”、“完全互補”、“基本上互補”和“部分互補”在本文中用於提及在HBV dsRNA劑的有義鏈與反義鏈之間，或在HBV dsRNA劑的反義鏈與靶HBV mRNA的序列之間的鹼基匹配。應理解，術語“HBV dsRNA劑的反義鏈”可以指“HBV反義多核苷酸劑”的相同序列。
如本文中使用的，在提及核酸序列時使用的術語“基本上相同”或“顯著同一性”意指包含與參考序列相比具有至少約85%序列同一性或更多，優選至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的序列的核酸序列。序列同一性的百分比是通過在比較窗口中比較兩個最佳比對的序列來確定的。百分比通過以下來計算：確定兩個序列中出現相同核酸鹼基的位置的數目以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗口中位置的總數目，並將結果乘以100，以得到序列同一性的百分比。本文中公開的發明涵蓋與本文中（例如，表1至表4中）公開的那些基本上相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，本文中公開的序列與本文中（例如，表1至表4中）公開的那些完全相同，或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
本文中使用的術語“包含序列的鏈”意指包含核苷酸鏈的寡核苷酸，其由使用標準核苷酸命名法提及的序列描述。本文中使用的術語“雙鏈RNA”或“dsRNA”是指包含RNA分子或分子複合物的RNAi，所述RNA分子或分子複合物具有包含兩條反平行且基本上或完全互補的核酸鏈的雜交雙鏈體區，其被稱爲相對於靶HBV RNA具有“有義”和“反義”取向。雙鏈體區可以是允許通過RISC途徑特異性降解所期望的靶HBV RNA的任何長度，但長度通常爲9至30個鹼基對，例如長度爲15至30個鹼基對。如果考慮9至30個鹼基對之間的雙鏈體，該雙鏈體可以是該範圍內的任何長度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，以及其之間的任何子範圍，包括但不限於：15至30個鹼基對、15至26個鹼基對、15至23個鹼基對、15至22個鹼基對、15至21個鹼基對、15至20個鹼基對、15至19個鹼基對、15至18個鹼基對、15至17個鹼基對、18至30個鹼基對、18至26個鹼基對、18至23個鹼基對、18至22個鹼基對、18至21個鹼基對、18至20個鹼基對、19至30個鹼基對、19至26個鹼基對、19至23個鹼基對、19至22個鹼基對、19至21個鹼基對、19至20個鹼基對、20至30個鹼基對、20至26個鹼基對、20至25個鹼基對、20至24個鹼基對、20至23個鹼基對、20至22個鹼基對、20至21個鹼基對、21至30個鹼基對、21至26個鹼基對、21至25個鹼基對、21至24個鹼基對、21至23個鹼基對，或21至22個鹼基對。
通過用切丁酶和類似酶處理而在細胞中產生的HBV dsRNA劑的長度通常爲19至22個鹼基對。HBV dsRNA劑的雙鏈體區的一條鏈包含與靶HBV RNA的區域基本上互補的序列。形成雙鏈體結構的兩條鏈可來自具有至少一個自身互補區的單個RNA分子，或者可由兩個或更多個單獨的RNA分子形成。當雙鏈體區由單個分子的兩條鏈形成時，該分子可具有由形成雙鏈體結構的一條鏈的3’末端與相應另一條鏈的5’末端之間的單鏈核苷酸鏈（本文中稱爲“髮夾環”）分離的雙鏈體區。在本發明的一些實施方案中，髮夾環包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個未配對的核苷酸。當HBV dsRNA劑的兩條基本上互補的鏈由單獨的RNA分子構成時，那些分子不需要但可以共價連接。當兩條鏈通過除髮夾環之外的方式共價連接時，連接結構被稱爲“接頭”。術語“siRNA”在本文中還用於指如本文中所述的dsRNA劑。
在本發明的一些實施方案中，HBV dsRNA劑可包含在dsRNA劑的一個或兩個末端不具有未配對的核苷酸或核苷酸類似物的有義序列和反義序列。沒有未配對核苷酸的末端被稱爲“平末端”並且沒有核苷酸突出端。如果dsRNA劑的兩端均是平的，則dsRNA被稱爲“平末端的”。在本發明的一些實施方案中，dsRNA劑的僅第一末端是平的，在一些實施方案中，dsRNA劑的僅第二末端是平的，並且在本發明的某些實施方案中，HBV dsRNA劑的兩端均是平的。
在本發明的dsRNA劑的一些實施方案中，dsRNA不具有一個或兩個平末端。在這樣的情况下，在dsRNA劑的鏈的末端有至少一個未配對核苷酸。例如，當dsRNA的一條鏈的3’末端延伸超出另一條鏈的5’末端時，則存在核苷酸突出端，或反之亦然。dsRNA可包含具有至少1、2、3、4、5、6個或更多個核苷酸的突出端。核苷酸突出端可包含以下或由以下組成：核苷酸/核苷類似物，包括脫氧核苷酸/核苷。應理解，在一些實施方案中，核苷酸突出端在dsRNA劑的有義鏈上、在dsRNA劑的反義鏈上，或在dsRNA劑的兩端，並且突出端的核苷酸可存在於dsRNA的反義鏈或有義鏈的5’末端、3’末端或兩端。在本發明的某些實施方案中，突出端中的一個或更多個核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
本文中使用的術語“反義鏈”或“引導鏈”是指包含與HBV靶序列至少基本上互補的區域的HBV dsRNA劑的鏈。本文中使用的術語“有義鏈”或“過客鏈”是指包含與HBV dsRNA劑的反義鏈的區域至少基本上互補之區域的HBV dsRNA劑的鏈。 修飾
在本發明的一些實施方案中，HBV RNAi劑的RNA被化學修飾以增强穩定性和/或一種或更多種其他有益特徵。在本發明的某些實施方案中，核酸可通過本領域已充分建立的方法來合成和/或修飾，例如，在“Current protocols in Nucleic Acid Chemistry," Beaucage, S. L. et al. (編輯), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA中描述的那些，其通過引用併入本文。可存在於本發明的HBV dsRNA劑的某些實施方案中的修飾包括，例如：（a）末端修飾，例如，5’末端修飾（磷酸化、綴合、反向連接等）、3’末端修飾（綴合、DNA核苷酸、反向連接等）；（b）鹼基修飾，例如，用穩定鹼基、去穩定鹼基或與擴展的配偶體庫鹼基配對的鹼基替代，移除鹼基（無鹼基核苷酸）或者綴合鹼基；（c）糖修飾（例如，在第2’位或第4’位）或糖替代；以及（d）骨架修飾，包括修飾或替代磷酸二酯鍵聯。在本發明的HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和HBV有義多核苷酸的某些實施方案中可用的RNA化合物的一些具體實例包括但不限於包含經修飾骨架或非天然核苷間鍵聯的RNA。作爲一個非限制性實例，具有經修飾骨架的RNA可不在骨架中具有磷原子。在核苷間骨架中不具有磷原子的RNA可被稱爲寡核苷。在本發明的某些實施方案中，經修飾RNA在其核苷間骨架中具有磷原子。
應理解，術語“RNA分子”或“RNA”或“核糖核酸分子”不僅涵蓋如在自然界中表達或發現的RNA分子，還涵蓋包含如本文中所述或本領域已知的一種或更多種核糖核苷酸/核糖核苷類似物或衍生物的RNA類似物和衍生物。術語“核糖核苷”和“核糖核苷酸”在本文中可互換使用。RNA分子可在核鹼基結構或在核糖-磷酸骨架結構（例如，如下文中所述的）中進行修飾，並且包含核糖核苷類似物或衍生物的分子必須保留形成雙鏈體的能力。作爲一些非限制性實例，RNA分子還可包含至少一個經修飾核糖核苷，其包括但不限於2’-O-甲基修飾的核苷、包含5’硫代磷酸酯基團的核苷、與膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷、鎖核苷、無鹼基核苷、2’-脫氧-2’-氟修飾的核苷、2’-氨基修飾的核苷、2’-烷基修飾的核苷、嗎啉代核苷、氨基磷酸酯，或包含非天然鹼基的核苷，或者其任何組合。在本發明的一些實施方案中，RNA分子包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或高至HBV dsRNA劑分子全長的爲經修飾核糖核苷的核糖核苷。對於RNA分子中這樣的多個經修飾核糖核苷中的每個，修飾不必相同。
本發明的dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸在一些實施方案中可包含一個或更多個獨立選擇的經修飾核苷酸和/或一個或更多個獨立選擇的非磷酸二酯鍵聯。如本文中使用的，提及所選擇的要素（例如本發明的經修飾核苷酸、非磷酸二酯鍵聯、靶向劑、dsRNA劑、雙鏈體等）時使用的術語“獨立選擇”意指兩個或更多個所選擇的要素可以但不必須彼此相同。
本文中使用的“核苷酸鹼基”、“核苷酸”或“核鹼基”是雜環嘧啶或嘌呤化合物，其是所有核酸的標準成分，並且包括形成核苷酸腺嘌呤（a）、鳥嘌呤（g）、胞嘧啶（c）、胸腺嘧啶（t）和尿嘧啶（u）的鹼基。可進一步修飾核鹼基以包括但不旨在限制：通用鹼基、疏水鹼基、混雜鹼基（promiscuous base）、尺寸擴大的鹼基（size-expanded base）和氟化鹼基。術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”在本文中可用於指未經修飾核苷酸、經修飾核苷酸或替代物替代部分。本領域技術人員將認識到，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可被其他部分替代，而基本上不改變包含帶有這樣的替代部分的核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對特性。
在一個實施方案中，考慮用於本文中所述的方法和組合物的經修飾RNA是肽核酸（peptide nucleic acid，PNA），其具有形成所需雙鏈體結構的能力並且允許或介導靶RNA通過RISC途徑的特異性降解。在本發明的某些實施方案中，HBV RNA干擾劑包括與靶HBV RNA序列相互作用以指導靶HBV RNA的切割的單鏈RNA。
經修飾RNA骨架可包括例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包括3’-亞烷基膦酸酯的其他烷基膦酸酯、以及手性膦酸酯、次膦酸酯、包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯，及具有正常3’-5’鍵聯的硼酸磷酸酯、其2’-5’連接的類似物、以及其中核苷單元的相鄰對以3’-5’到5’-3’或2’-5’到5’-2’連接的具有相反極性的那些。還包括多種鹽、混合鹽和游離酸形式。製備含磷鍵聯的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾HBV dsRNA劑、某些經修飾HBV反義多核苷酸和/或某些經修飾HBV有義多核苷酸。
其中不包含磷原子的經修飾RNA骨架具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵聯，或者一個或更多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵聯形成的骨架。這些包括具有以下的那些：嗎啉鍵聯（部分由核苷的糖部分形成）；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲乙醯（formacetyl）和硫甲乙醯骨架；亞甲基甲乙醯和硫甲乙醯骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺醯胺骨架；醯胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH 2組分部分的另一些。製備不包含磷原子的經修飾RNA骨架的手段是本領域常規實踐的，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾HBV dsRNA劑、某些經修飾HBV反義多核苷酸和/或某些經修飾HBV有義多核苷酸。
在本發明的某些實施方案中，RNA模擬物包括在HBV dsRNA、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸中，例如但不限於：用新的基團替代核苷酸單元的糖和核苷間鍵聯，即骨架。在這樣的一些實施方案中，維持鹼基單元用於與適當的HBV核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物，已顯示具有優異的雜交特性的RNA模擬物，被稱爲肽核酸（PNA）。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被包含醯胺的骨架、特別是氨基乙基甘氨酸骨架替代。核鹼基被保留並且與骨架醯胺部分的氮雜氮原子直接或間接結合。製備RNA模擬物的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾HBV dsRNA劑。
本發明的一些實施方案包括這樣的RNA，其具有硫代磷酸酯骨架和具有雜原子骨架的寡核苷，並且雜原子骨架特別地是--CH 2--NH--CH 2-、--CH 2--N(CH 3)--O--CH 2--[被稱爲亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架]、--CH 2--O--N(CH 3)--CH 2--、-CH 2--N(CH 3)--N(CH 3)--CH 2--和--N(CH 3)--CH 2----[其中天然磷酸二酯骨架表示爲--O--P--O--CH 2--]。製備具有硫代磷酸酯骨架和具有雜原子骨架的寡核苷的RNA的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾HBV dsRNA劑、某些HBV反義多核苷酸和/或某些HBV有義多核苷酸。
經修飾RNA也可包含一個或更多個經取代的糖部分。本發明的HBV dsRNA、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸可在第2’位包含以下中的一種：OH；F；O--、S--或N-烷基；O--、S--或N-烯基；O--、S-或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是經取代或未經取代的C 1至C 10烷基或C 2至C 10烯基和炔基。一些示例性的合適的修飾包括O[(CH 2) nO] mCH 3、O(CH 2) nOCH 3、O(CH 2) nNH 2、O(CH 2) nCH 3、O(CH 2) nONH 2和O(CH 2) nON[(CH 2) nCH 3)] 2，其中n和m爲1至約10。在另一些實施方案中，dsRNA在第2’位包含以下中的一種：C 1至C 10低級烷基、經取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH 3、OCN、Cl、Br、CN、CF 3、OCF 3、SOCH 3、SO 2CH 3、ONO 2、NO 2、N 3、NH 2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、經取代的甲矽烷基、RNA切割基團、報道基團、嵌入劑、用於改善HBV dsRNA劑的藥代動力學特性的基團，或用於改善HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸的藥效學特性的基團，以及具有類似特性的另一些取代基。在一些實施方案中，修飾包括2’-甲氧基乙氧基（2’-O--CH 2CH 2OCH 3，也稱爲2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504），即烷氧基-烷氧基。另一個示例性修飾是如下文實例中所述的2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH 2) 2ON(CH 3) 2基團，也稱爲2’-DMAOE；以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基（在本領域中也稱爲2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE），即2’-O--CH 2-O--CH 2--N(CH 2) 2。製備經修飾RNA（例如所述的那些）的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾HBV dsRNA劑。
另一些修飾包括2’-甲氧基（2’-OCH 3）、2’-氨基丙氧基（2’-OCH 2CH 2CH 2NH 2）和2’-氟（2’-F）。也可在本發明的HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸的RNA上的其他位置進行類似的修飾，特別是在3’末端核苷酸上或者2’-5’連接的HBV dsRNA、HBV反義多核苷酸或HBV有義多核苷酸中糖的第3’位，以及5’末端核苷酸的第5’位。HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸也可具有糖模擬物，例如替代呋喃戊糖的環丁基部分。製備經修飾RNA（例如所述的那些）的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸。
在一些實施方案中，HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸可包含核鹼基（在本領域中通常簡稱爲“鹼基”）修飾或替換。本文中使用的“未經修飾的”或“天然的”核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。經修飾核鹼基包括另一些合成和天然核鹼基，例如5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物和另一些烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基衍生物和另一些烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和另一些8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代、特別是5-溴、5-三氟甲基和另一些5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。可包括在本發明的HBV dsRNA劑的某些實施方案中的另外的核鹼基是本領域已知的，參見例如：Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. Ed. Wiley-VCH, 2008；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 第858至859頁, Kroschwitz, J. L, Ed. John Wiley & Sons, 1990, English et al., Angewandte Chemie, 國際版, 1991, 30, 613, Sanghvi, Y S., 第15章, dsRNA Research and Applications, 第289至302頁, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC出版, 1993。製備包含核鹼基修飾和/或替換（例如本文中所述的那些）的dsRNA、HBV反義鏈多核苷酸和/或HBV有義鏈多核苷酸的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾HBV dsRNA劑、HBV有義多核苷酸和/或HBV反義多核苷酸。
本發明的HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸的某些實施方案包括經修飾以包含一個或更多個鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）的RNA。鎖核酸是具有經修飾核糖部分的核苷酸，其包含連接2’和4’碳的額外的橋聯。這種結構有效地將核糖“鎖”在3’-endo結構構象中。在本發明的HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸中添加鎖核酸可提高血清中的穩定性，並降低脫靶效應（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook, O R. et al., (2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。製備包含鎖核酸的dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾HBV dsRNA劑。
本發明的HBV dsRNA化合物、有義多核苷酸和/或反義多核苷酸的某些實施方案包括至少一個經修飾核苷酸，其中所述至少一個經修飾核苷酸包含：2’-O-甲基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脫氧核苷酸、2’3’-seco核苷酸模擬物、鎖核苷酸、2’-F-***糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸，及3’-OMe核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團的核苷酸，或者與膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、氨基磷酸酯，或包含非天然鹼基的核苷酸。在一些實施方案中，HBV dsRNA化合物在反義鏈（本文中也稱爲引導鏈）的5’末端包含E-乙烯基膦酸酯核苷酸。
本發明的HBV dsRNA化合物、有義多核苷酸的3’和5’末端以及/或反義多核苷酸的3’末端的某些實施方案包括至少一個經修飾核苷酸，其中所述至少一個經修飾核苷酸包含：無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2’-OMe核苷酸、反向2’-脫氧核苷酸。本領域技術人員已知，在寡核苷酸的末端包含無鹼基或反向無鹼基核苷酸增强了穩定性（Czauderna et al. Nucleic Acids Res. 2003;31(11):2705-2716. doi:10.1093/nar/gkg393）。
本發明的HBV dsRNA化合物、反義多核苷酸的某些實施方案包括至少一個經修飾核苷酸，其中所述至少一個經修飾核苷酸包含解鎖核酸核苷酸（UNA）或/和二醇核酸核苷酸（GNA）。本領域技術人員已知，UNA和GNA是熱去穩定化學修飾，可顯著改善siRNA化合物的脫靶特性（Janas, et al., Nat Commun. 2018;9(1):723. doi:10.1038/s41467-018-02989-4; Laursen et al., Mol BioSyst. 2010;6:862–70）。
可包含在本發明的HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸的某些實施方案的RNA中的另一種修飾包括分別將增强HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸的一種或更多種特徵的一個或更多個配體、部分或綴合物與RNA化學連接。可增强的特徵的一些非限制性實例是：HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸活性；細胞分布；HBV dsRNA劑的遞送；HBV dsRNA劑的藥代動力學特性；和HBV dsRNA劑的細胞攝取。在本發明的一些實施方案中，HBV dsRNA劑包含一個或更多個靶向基團或連接基團，其在本發明的HBV dsRNA劑的某些實施方案中與有義鏈綴合。靶向基團的一個非限制性實例是包含N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）的化合物。術語“靶向基團”、“靶向劑”、“連接劑”、“靶向化合物”和“靶向配體”在本文中可互換使用。在本發明的某些實施方案中，HBV dsRNA劑包含與有義鏈的5’末端綴合的靶向化合物。在本發明的某些實施方案中，HBV dsRNA劑包含與有義鏈的3’末端綴合的靶向化合物。在本發明的一些實施方案中，HBV dsRNA劑包含含有GalNAc的靶向基團。在本發明的某些實施方案中，HBV dsRNA劑不包含與有義鏈的3’末端和5’末端之一或二者綴合的靶向化合物。在本發明的某些實施方案中，HBV dsRNA劑不包含與有義鏈的5’末端和3’末端之一或二者綴合的包含GalNAc的靶向化合物。
另外的靶向劑和連接劑是本領域公知的，例如，可用於本發明的某些實施方案的靶向劑和連接劑包括但不限於脂質部分，例如：膽固醇部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）；膽酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）；硫醚，例如beryl-S-三苯甲基硫醇（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309；Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）；硫膽固醇（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）；脂肪族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）；磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）；多胺或聚乙二醇鏈（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）；或金剛烷乙酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）；棕櫚基部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）；或者十八胺或己基氨基-羰基氧基膽固醇部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）。
包含HBV dsRNA劑、HBV反義多核苷酸和/或HBV有義多核苷酸的組合物的某些實施方案可包括改變HBV dsRNA劑的分布、靶向等的配體。在包含本發明的HBV dsRNA劑的組合物的一些實施方案中，配體提高對所選靶標（例如，分子、細胞或細胞類型、區室例如細胞或器官區室、組織、器官或身體的區域）的親和力，例如與不存在這樣的配體的種類相比。可用於本發明的組合物和/或方法的配體可以是天然存在的物質，例如：蛋白質（例如，人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、低密度脂蛋白（LDL）或球蛋白）；碳水化合物（例如，右旋糖酐、短梗黴聚糖（pullulan）、甲殼素、殼聚糖、菊粉、環糊精或透明質酸）；或脂質。配體也可以是重組分子或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸或聚胺。聚氨基酸的一些實例是聚賴氨酸（polylysine，PLL）、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙醇酸)共聚物、二乙烯醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物（HMPA）、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的實例包括：聚乙烯亞胺、聚賴氨酸（PLL）、精胺、亞精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模擬物聚胺、樹狀體聚胺、精氨酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺的季鹽或α螺旋肽。
本發明的組合物和/或方法中包含的配體可包含靶向基團，其的一些非限制性實例是細胞或組織靶向劑，例如凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如，與特定細胞類型（例如腎細胞或肝細胞）結合的抗體。靶向基團可以是促甲狀腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺多價甘露糖、多價岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、雙膦酸酯、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂質、膽固醇、甾體、膽汁酸、葉酸、維生素B12、維生素A、生物素，或者RGD肽或RGD肽模擬物。
配體的另一些實例包括染料、嵌入劑（例如，吖啶）、交聯劑（例如，補骨脂素、絲裂黴素C）、卟啉（TPPC4、德卟啉（texaphyrin）、Sapphyrin）、多環芳烴（例如，吩嗪、二氫吩嗪）、人工核酸內切酶（例如，EDTA）、親脂性分子，例如膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪）和肽綴合物（例如，觸足肽（antennapedia peptide）、Tat肽）、烷化劑、磷酸鹽/酯、氨基、巰基、PEG（例如，PEG-40K）、MPEG、[MPEG] 2、聚氨基、烷基、經取代的烷基、放射性標記的標志物、酶、半抗原（例如，生物素）、轉運/吸收促進劑（例如，阿司匹林、維生素E、葉酸）、合成核糖核酸酶（例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑綴合物、四氮雜大環的Eu3+複合物）、二硝基苯基、HRP或AP。
本發明的組合物和/或方法中包含的配體可以是蛋白質（例如糖蛋白），或肽（例如對共配體具有特定親和力的分子），或抗體（例如與特定細胞類型（例如但不限於肝細胞）結合的抗體）。可用於本發明的組合物和/或方法的一個實施方案的配體可以是激素或激素受體。可用於本發明的組合物和/或方法的一個實施方案的配體可以是脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺多價甘露糖，或多價岩藻糖。可用於本發明的組合物和/或方法的一個實施方案的配體可以是這樣的物質，其可例如通過破壞細胞的細胞骨架，例如通過破壞細胞的微管、微絲和/或中間絲來提高細胞對HBV dsRNA劑的攝取。這種類型的物質的一些非限制性實例是：紫杉醇、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑（nocodazole）、japlakinolide、拉春庫林A（latrunculin A）、鬼筆環肽（phalloidin）、swinholide A、茚滿新鹼（indanocine）和myoservin。
在一些實施方案中，與本發明的HBV dsRNA劑連接的配體作爲藥代動力學（PK）調節劑發揮作用。可用於本發明的組合物和方法的PK調節劑的實例包括但不限於：親脂類（lipophile）、膽汁酸、類固醇、磷脂類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素、膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生（naproxen）、布洛芬（ibuprofen）、維生素E、生物素、結合血清蛋白的適配體，等等。還已知包含多個硫代磷酸酯鍵聯的寡核苷酸與血清蛋白結合，因此在本發明的組合物和/或方法中也可使用在骨架中包含多個硫代磷酸酯鍵聯的短寡核苷酸，例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基的寡核苷酸作爲配體。 HBV dsRNA 劑組合物
在本發明的一些實施方案中，HBV dsRNA劑在組合物中。本發明的組合物可包含一種或更多種HBV dsRNA劑和任選的可藥用載體、遞送劑、靶向劑、可檢測標記等中的一種或更多種。根據本發明的方法的一些實施方案，可用的靶向劑的一個非限制性實例是將本發明的HBV dsRNA劑定向至和/或定向入待處理細胞中的藥劑。靶向劑的選擇將取决於如下這樣的要素：HBV相關疾病或病症的性質，以及所靶向的細胞類型。在一個非限制性實例中，在本發明的一些實施方案中，可期望將HBV dsRNA劑靶向至和/或靶向進入肝細胞中。應理解，在本發明的方法的一些實施方案中，治療劑包含僅具有遞送劑（例如包含N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）的遞送劑）的HBV dsRNA劑，而沒有任何另外的連接元件。例如，在本發明的一些方面中，HBV dsRNA劑可與包含GalNAc的遞送化合物連接，並且被包含在包含可藥用載體的組合物中，並且在沒有與HBV dsRNA劑連接的任何可檢測標記或靶向劑等的情况下被施用於細胞或對象。
在本發明的HBV dsRNA劑與以下一種或更多種一起施用和/或與以下一種或更多種連接的情况下：遞送劑、靶向劑、標記劑等，本領域技術人員將意識到並且能够選擇和使用用於本發明方法的合適試劑。標記劑可用於本發明的某些方法中以確定細胞和組織中HBV dsRNA劑的位置，並且可用於確定已在本發明的方法中施用的包含HBV dsRNA劑的治療組合物的細胞、組織或器官位置。用於連接和使用標記劑例如酶標記、染料、放射性標記等的方法是本領域中公知的。應理解，在本發明的組合物和方法的一些實施方案中，標記劑與HBV dsRNA劑中包含的有義多核苷酸和反義多核苷酸之一或二者連接。 HBV dsRNA 劑的遞送
本發明的方法的某些實施方案包括將HBV dsRNA劑遞送至細胞中。本文中使用的術語“遞送”意指促進或影響細胞攝取或吸收。對HBV dsRNA劑的吸收或攝取可通過獨立的擴散或活性細胞過程，或者通過使用可與本發明的HBV dsRNA劑締合的遞送劑、靶向劑等而發生。適用於本發明方法的遞送手段包括但不限於：體內遞送，其中將HBV dsRNA劑注射到組織部位或全身施用。在本發明的一些實施方案中，HBV dsRNA劑與遞送劑連接。
可用於將HBV dsRNA劑遞送至細胞、組織和/或對象的方法的一些非限制性實例包括：HBV dsRNA-GalNAc綴合物、SAMiRNA技術、基於LNP的遞送方法和裸RNA遞送。這些和另一些遞送方法已在本領域中成功用於遞送治療性RNAi劑以用於治療多種疾病和病症，例如但不限於：肝病、急性間歇性卟啉病（acute intermittent porphyria，AIP）、血友病、肺纖維化等。多種遞送手段的細節在以下出版物中找到，例如：Nikam, R.R. & K. R. Gore (2018) Nucleic Acid Ther, 28 (4), 209-224 Aug 2018；Springer A.D. & S.F. Dowdy (2018) Nucleic Acid Ther. Jun 1; 28(3): 109–118；Lee, K. et al., (2018) Arch Pharm Res, 41(9), 867-874；和Nair, J.K. et al., (2014) J. Am. Chem. Soc. 136:16958-16961，其各自的內容通過引用併入本文。
本發明的一些實施方案包括使用脂質納米粒（lipid nanoparticle，LNP）將本發明的HBV dsRNA劑遞送至細胞、組織和/或對象。LNP通常用於體內遞送HBV dsRNA劑，包括治療性HBV dsRNA劑。使用LNP或另一些遞送劑的一個益處是當使用LNP或另一些遞送劑將其遞送至對象時，HBV RNA劑的穩定性提高。在本發明的一些實施方案中，LNP包括負載有本發明的一種或更多種HBV RNAi分子的陽離子LNP。將包含HBV RNAi分子的LNP施用於對象，LNP及其所連接的HBV RNAi分子通過胞吞作用被細胞攝取，它們的存在導致介導RNAi的RNAi觸發分子的釋放。
可用於本發明的實施方案中以將本發明的HBV dsRNA劑遞送至細胞、組織和/或對象的遞送劑的另一個非限制性實例是，包含與本發明的HBV dsRNA劑連接的GalNAc並將HBV dsRNA劑遞送至細胞、組織和/或對象的藥劑。在PCT申請WO2020191183A1中公開了可用於本發明的方法和組合物的某些實施方案中的某些另外的包含GalNAc的遞送劑的一些實例。可用於本發明的組合物和方法以將HBV dsRNA劑遞送至細胞的GalNAc靶向配體的一個非限制性實例是靶向配體簇。本文中呈現的靶向配體簇的一些實例被稱爲：具有磷酸二酯鍵聯的GalNAc配體（GLO）和具有硫代磷酸酯鍵聯的GalNAc配體（GLS）。術語“GLX-0”可在本文中用於表示所連接的包含GalNAc的化合物，其是以下化合物中的任一種：GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-5、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、GLS-10、GLS-11、GLS-12、GLS-13、GLS-14、GLS-15、GLS-16、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16，其各自的結構在下文示出，其中下文中GalNAc靶向配體與本發明的RNAi劑的連接位置在各自的最右側（用“ ⸾”示出）。應理解，本發明的任何RNAi和dsRNA分子可與以下連接：GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-5、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、GLS-10、GLS-11、GLS-12、GLS-13、GLS-14、GLS-15、GLS-16、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16。GLO-1至GLO-16以及GLS-1至GLS-16結構如下所示。 GLO-10 GLS-10 GLO-11
在本發明的一些實施方案中，體內遞送也可通過β-葡聚糖遞送系統，例如在美國專利No. 5,032,401和5,607,677以及美國公開No. 2005/0281781中描述的那些，其在此通過引用整體併入。也可使用本領域已知的方法例如電穿孔和脂質轉染將HBV RNAi劑體外引入到細胞中。在本發明的方法的某些實施方案中，HBV dsRNA在沒有靶向劑的情况下被遞送。這些RNA可作爲“裸”RNA分子遞送。作爲一個非限制性實例，本發明的HBV dsRNA可在包含RNAi劑但不包含靶向劑（例如GalNAc靶向化合物）的藥物組合物中施用於對象以治療對象中的HBV相關疾病或病症，例如肝病。
除本文中所述的某些遞送手段之外，應理解，RNAi遞送手段（例如但不限於本文中所述的那些和本領域中使用的那些）可與本文中所述的HBV RNAi劑和治療方法的實施方案聯合使用。
本發明的HBV dsRNA劑可以以有效降低細胞和/或對象中HBV多肽的水平和活性的量和方式施用於對象。在本發明的方法的一些實施方案中，將一種或更多種HBV dsRNA劑施用於細胞和/或對象以治療與HBV表達和活性相關的疾病或病症。在一些實施方案中，本發明的方法包括向需要這樣的治療的對象施用一種或更多種獨立選擇的HBV dsRNA劑以降低對象中與HBV表達相關的疾病或病症。可施用本發明的HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑以降低在體外、離體和體內細胞中的一種更多種中HBV表達和/或活性。
在本發明的一些實施方案中，通過將HBV dsRNA劑遞送（例如引入）到細胞中來降低細胞中HBV多肽的水平並由此降低其活性，並且因此降低病毒的功能。靶向劑和方法可用於幫助將HBV dsRNA劑遞送至特定細胞類型、細胞亞型、器官、對象中的空間區域，和/或細胞中的亞細胞區域。HBV dsRNA劑可在本發明的某些方法中單獨施用或與一種或更多種另外的HBV dsRNA劑組合施用。在一些實施方案中，將2、3、4種或更多種獨立選擇的HBV dsRNA劑施用於對象。在本發明的組合物和方法的一些實施方案中，包含兩種、三種或更多種獨立選擇的治療分子。在本發明的方法的一些實施方案中，將靶向HBV mRNA的一個、兩個或更多個不同位置/區域的兩種、三種、四種或更多種HBV siRNA施用於細胞和/或對象。在這樣的情况下，本發明的組合物可包含兩種、三種、四種或更多種獨立選擇的HBV siRNA，其各自均與獨立選擇的遞送化合物綴合。本發明的藥劑和/或組合物的某些實施方案包括二價siRNA化合物（在本文中也稱爲連接的siRNA化合物），其包含均與同一遞送化合物綴合的兩個獨立選擇的HBV siRNA。
在本發明的某些實施方案中，將HBV dsRNA劑與用於治療HBV相關疾病或病症的一種或更多種另外的治療方案聯合施用於對象以治療HBV相關疾病或病症。這樣的組合可產生協同作用。另外的治療方案的一些非限制性實例是：施用一種或更多種本發明的HBV反義多核苷酸、施用非HBV dsRNA治療劑、以及行爲改變。可在以下中的一個或更多個時間施用另外的治療方案：在施用本發明的HBV dsRNA劑之前、與其同時和在其之後。應理解，本文中使用的與其同時爲在零時刻的五分鐘內、在零時刻的10分鐘內、在零時刻的30分鐘內、在零時刻的45分鐘內和在零時刻的60分鐘內，其中“零時刻”是將本發明的HBV dsRNA劑施用於對象的時間。
在一個非限制性實例中，在本發明的一些實施方案中，施用於對象的另外的治療方案包括以下中的一種或更多種：一種或更多種HBV反義多核苷酸、一種或更多種另外的HBV dsRNA治療劑、一種或更多種非HBV dsRNA和/或siRNA治療劑，以及行爲改變。非HBV dsRNA治療方案的一個非限制性實例包括向對象施用以下中的一種或更多種：抗病毒劑；抗病毒核苷或核苷酸類似物（NUC），其非限制性實例是：富馬酸替諾福韋酯（TDF）、替諾福韋艾拉酚胺、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋（ETV）和替比夫定；病毒聚合酶抑制劑；逆轉錄酶抑制劑；免疫刺激劑；治療性疫苗；病毒進入抑制劑；抑制HBsAg分泌或釋放的寡核苷酸；衣殼抑制劑；共價閉合環狀（ccc）HBV DNA抑制劑，以及其他治療劑和/或方法例如但不限於：肝移植和化學治療。可用於本發明的方法的免疫刺激劑的一些非限制性實例是：聚乙二醇化干擾素α2a（PEG-IFN-α2a）、干擾素α-2b、重組人白介素-7和Toll-樣受體7（TLR7）激動劑以及檢查點抑制劑（例如，PD1抑制劑）。
行爲改變的一些非限制性實例是：飲食方案、作息方案、隔離方案和諮詢。這些和其他治療劑和行爲改變在本領域中是已知的並且用於治療對象中的HBV相關疾病或病症，並且可與一種或更多種本發明的HBV dsRNA劑的施用組合來施用於對象以治療HBV相關疾病或病症。施用於細胞或對象以治療HBV相關疾病或病症的本發明的HBV dsRNA劑可與一種或更多種其他治療劑或活性以協同方式起作用，並提高一種或更多種治療劑或活性的有效性以及/或者提高HBV dsRNA劑在治療HBV相關疾病或病症中的有效性。
包括施用HBV dsRNA劑的本發明治療方法可在感染HBV的無症狀對象中和/或當存在HBV相關疾病或病症的一種或更多種症狀時使用，包括在疾病或病症的早期階段、中期階段和晚期階段以及任意這些階段之前和之後的所有時間。本發明的方法還可用於治療以下對象：其之前已經用一種或更多種其他治療劑和/或治療活性來治療HBV相關疾病或病症，其中所述其他治療劑和/或治療活性在治療對象中的HBV相關疾病或病症中不成功、具有最小的成功和/或不再成功。 載體編碼的 dsRNA
在本發明的某些實施方案中，可使用載體將HBV dsRNA劑遞送至細胞中。HBV dsRNA劑轉錄單元可包含在DNA或RNA載體中。用於將序列遞送至細胞和/或對象中的這樣的編碼轉基因的載體的製備和使用是本領域公知的。載體可用於本發明的方法中，其導致HBV dsRNA瞬時表達例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個小時、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周。瞬時表達的長度可使用基於要素的常規方法來確定，所述要素例如但不限於所選的特定載體構建體以及靶細胞和/或組織。這樣的轉基因可作爲線性構建體、環狀質粒或病毒載體引入，其可以是整合或非整合載體。還可構建轉基因以允許其作爲染色體外質粒遺傳（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
可從表達載體上的啓動子轉錄HBV dsRNA劑的單獨的一條鏈或多條鏈。在待表達兩條單獨的鏈以產生例如dsRNA的情况下，可使用手段例如轉染或感染將兩種單獨的表達載體共引入至細胞。在某些實施方案中，本發明的HBV dsRNA劑的每條單獨的鏈均可由二者包含在同一表達載體上的啓動子轉錄。在本發明的某些實施方案中，HBV dsRNA劑表達爲通過接頭多核苷酸序列連接的反向重複多核苷酸，使得HBV dsRNA劑具有莖和環結構。
RNA表達載體的一些非限制性實例是DNA質粒或病毒載體。可用於本發明的一些實施方案的表達載體可與真核細胞相容。真核細胞表達載體在本領域中常規使用並且可從許多商業來源獲得。HBV dsRNA表達載體的遞送可以是全身性的，例如通過靜脈內或肌內施用，通過施用至從對象外植的靶細胞隨後再引入到對象中，或者通過允許引入到期望的靶細胞的任何其他手段。
可包括在方法實施方案中的病毒載體系統包括但不限於：（a）腺病毒載體；（b）逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；（c）腺相關病毒載體；（d）單純疱疹病毒載體；（e）SV 40載體；（f）多瘤病毒載體；（g）乳頭瘤病毒載體；（h）小核糖核酸病毒載體；（i）痘病毒載體，例如天花，例如痘苗病毒載體或禽痘（avipox），例如金絲雀痘（canary pox）或鶏痘（fowl pox）；以及（j）輔助依賴性或無腸（gutless）腺病毒。用於重組表達HBV dsRNA劑的構建體可包含調節元件，例如啓動子、增强子等，其可被選擇以提供組成型或調節/誘導型表達。啓動子和增强子等的使用以及病毒載體系統在本領域中是常規的並且可與本文中所述的方法和組合物聯合使用。
本發明的某些實施方案包括用於將HBV dsRNA劑遞送至細胞中的病毒載體的用途。許多基於腺病毒的遞送系統在本領域中常規用於遞送至例如肺、肝、中樞神經系統、內皮細胞和肌肉。可用於本發明的方法的病毒載體的一些非限制性實例是：AAV載體、痘病毒例如痘苗病毒、改良型病毒安卡拉株（Modified Virus Ankara，MVA）、NYVAC、禽痘例如鶏痘或金絲雀痘。
本發明的某些實施方案包括使用載體將HBV dsRNA劑遞送至細胞的方法，並且這樣的載體可在可藥用載體中，其可以但不必須包含其中嵌入了基因遞送載劑的緩慢釋放基質。在一些實施方案中，用於遞送HBV dsRNA的載體可由重組細胞產生，並且本發明的藥物組合物可包含一種或更多種產生HBV dsRNA遞送系統的細胞。 包含 HBV dsRNA 的藥物組合物
本發明的某些實施方案包括包含HBV dsRNA劑和可藥用載體的藥物組合物的用途。包含HBV dsRNA劑的藥物組合物可用於本發明的方法中以降低細胞中的HBV基因表達和HBV活性，並且可用於治療HBV相關疾病或病症。這樣的藥物組合物可基於遞送方式進行配製。針對遞送方式的製劑的一些非限制性實例是：配製成用於皮下遞送的組合物、配製成用於通過腸胃外遞送來全身施用的組合物、配製成用於靜脈內（IV）遞送的組合物、配製成用於鞘內遞送的組合物、配製成用於直接遞送至腦的組合物等。可使用一種或更多種手段進行施用本發明的藥物組合物以將HBV dsRNA劑遞送至細胞中，所述手段例如：表面（例如，通過經皮貼劑）；肺部，例如，通過吸入或吹入散劑或氣溶膠劑，包括通過霧化器；氣管內、鼻內、表皮和經皮；經口或腸胃外。腸胃外施用包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌內注射或輸注；皮下，例如，通過植入裝置；或顱內，例如，通過實質內（intraparenchymal）、鞘內或心室內（intraventricular）施用。也可將HBV dsRNA劑直接遞送至靶組織，例如直接遞送至肝、直接遞送至腎等。應理解“遞送HBV dsRNA劑”到細胞中涵蓋分別直接遞送HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑，以及由被遞送到細胞中的編碼載體在細胞中表達HBV dsRNA劑，或者通過使HBV dsRNA出現在細胞中的任何合適的手段。用於遞送抑制性RNA的手段以及製劑的製備和使用是本領域公知且常規使用的。
本文中使用的“藥物組合物”包含藥理學有效量的本發明的HBV dsRNA劑和可藥用載體。術語“可藥用載體”是指用於施用治療劑的載體。這樣的載體包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術語特別地不包括細胞培養基。對於經口施用的藥物，可藥用載體包括但不限於可藥用賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、結合劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣以及乳糖，而玉米澱粉和藻酸是合適的崩解劑。結合劑可包括澱粉和明膠，而潤滑劑如果存在的話通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。如果期望，片劑可用材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯來包被，以延遲在胃腸道中的吸收。藥物製劑中包含的試劑在下文中進一步描述。
本文中使用的術語例如：“藥理學有效量”、“治療有效量”和“有效量”是指本發明的HBV dsRNA劑產生預期的藥理學、治療性或預防性結果的量。例如，如果認爲在與疾病或病症相關的可測量參數降低至少10%時給定的臨床治療是有效的，則用於治療該疾病或病症的藥物的治療有效量是必須使該參數降低至少10%的量。例如，治療有效量的HBV dsRNA劑可將HBV多肽水平降低至少10%。 有效量
在一些方面中，本發明的方法包括使細胞與有效量的HBV dsRNA劑接觸以降低所接觸細胞中的HBV基因表達。本發明的方法的某些實施方案包括以在對象中有效降低HBV基因表達並治療HBV相關疾病或病症的量向對象施用HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑。在降低HBV的表達和/或用於治療HBV相關疾病或病症方面使用的“有效量”是實現期望的生物學效應所必需或足够的量。例如，治療HBV相關疾病或病症的HBV dsRNA劑的有效量可以是實現以下效果所必需的量：（i）减緩或停止疾病或病症進展；或者（ii）逆轉、减輕或消除疾病或病症的一種或更多種症狀。在本發明的一些方面中，有效量是當施用於需要治療HBV相關疾病或病症的對象時導致預防和/或治療該疾病或病症的治療性響應的HBV dsRNA劑的量。根據本發明的一些方面，有效量是當與用於HBV相關疾病或病症的另一種治療性治療組合或共施用時導致預防和/或治療該疾病或病症的治療性響應的本發明的HBV dsRNA劑的量。在本發明的一些實施方案中，用本發明的HBV dsRNA劑治療對象的生物學效應可以是改善和/或完全消除由HBV相關疾病或病症引起的症狀。在本發明的一些實施方案中，生物學效應是完全消除HBV相關疾病或病症，如例如通過指示對象沒有HBV相關疾病或病症的診斷測試所證明的。評估HBV相關疾病或病症的狀態的另外的本領域已知手段可用於確定本發明的藥劑和/或方法對HBV相關疾病或病症的作用。
通常，將在臨床試驗中確定用於將HBV多肽活性降低至治療HBV相關疾病或病症的水平的HBV dsRNA劑的有效量，以在盲研究中建立測試群體相對於對照群體的有效劑量。在一些實施方案中，有效量將是導致期望響應的量，例如，在具有疾病或病症的細胞、組織和/或對象中减輕HBV相關疾病或病症的量。因此，治療可通過降低HBV多肽活性來治療的HBV相關疾病或病症的HBV dsRNA劑的有效量可以是這樣的量：當施用時使對象中HBV多肽活性的量降低至小於在沒有施用HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑的情况下細胞、組織和/或對象中存在的量的量。在本發明的某些方面中，在未接觸或施用本發明的HBV dsRNA劑的細胞、組織和/或對象中存在的HBV多肽活性和/或HBV基因表達的水平被稱爲“對照”量。在本發明的方法的一些實施方案中，對象的對照量是對象的治療前的量，換言之，在施用HBV藥劑之前對象中的水平可以是該對象的對照水平，並且與將siRNA施用於對象之後對象中HBV多肽活性和/或HBV基因表達的水平進行比較。在治療HBV相關疾病或病症的情况下，期望響應可以是降低或消除細胞、組織和/或對象中疾病或病症的一種或更多種症狀。降低或消除可以是暫時的或者可以是永久性的。應理解，可使用確定HBV多肽活性、HBV基因表達、症狀評價、臨床測試等的方法來監測HBV相關疾病或病症的狀態。在本發明的一些方面中，對治療HBV相關疾病或病症的期望響應延遲疾病或病症的發作或者甚至阻止疾病或病症的發作。
降低HBV多肽活性的化合物的有效量也可通過評估HBV dsRNA劑的施用對細胞或對象的生理作用（例如施用之後HBV相關疾病或病症的减輕）來確定。對象的測定和/或症狀監測可用於確定可在本發明的藥物化合物中施用的本發明的HBV dsRNA劑的效力，並用於確定對治療的響應的存在或不存在。一個非限制性實例是一種或更多種本領域已知的血清譜測試。另一個非限制性實例是，一種或更多種本領域已知的肝功能測試可用於確定在使用本發明的HBV dsRNA劑治療對象之前和之後對象中HBV相關肝疾病或病症的狀態。在另一個非限制性實例中，一種或更多種本領域已知的HBV病毒載量水平測試用於確定對象中HBV相關疾病的狀態。在該實例中，該疾病包括HBV病毒載量水平，並且該測試用於確定在使用本發明的HBV dsRNA劑治療對象之前和之後對象中的HBV病毒載量水平。
本發明的一些實施方案包括通過評估和/或監測對象中HBV相關疾病或病症的一種或更多種“生理特徵”來確定施用於對象以治療HBV相關疾病或病症的本發明的dsRNA劑的效力的方法。HBV相關疾病或病症的生理特徵的一些非限制性實例是對象中丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平、對象中天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平；對象中的HBV病毒載量；對象中的HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）水平；對象中一種或更多種HBV抗原的水平；對象中HBcAg、HBsAg和HBeAg中一種或更多種的水平；對象中一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體的存在、不存在和/或水平，以及一種或更多種身體症狀，例如但不限於：疼痛、發熱等。確定這樣的生理特徵的常規手段是本領域已知的，並且包括但不限於血液測試、血清分析、組織活檢、成像研究、身體檢查等。
應理解，施用於對象的HBV dsRNA劑的量可至少部分地基於針對對象確定的疾病和/或病症狀態和/或生理特徵的這樣的確定來修改。治療量可通過以下而變化：例如，通過提高或降低HBV-dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑的量、通過改變分別施用HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑的組合物、通過改變施用途徑、通過改變給藥時間等。HBV dsRNA劑的有效量將隨以下而變化：所治療的特定病症、所治療的對象的年齡和身體狀况；病症的嚴重程度、治療的持續時間、併行治療（如果有的話）的性質、特定施用途徑以及在保健醫生的知識和專長之內的其他因素。例如，有效量可取决於有效治療HBV相關疾病或病症的HBV多肽活性和/或HBV基因表達的期望水平。本領域技術人員可憑經驗確定用於本發明方法的本發明的特定HBV dsRNA劑的有效量，而無需過度實驗。結合本文中提供的教導，通過從本發明的多種HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑中進行選擇以及對因素（例如效力、相對生物利用度、患者體重、不良副作用的嚴重程度和優選的施用方式）進行權衡，可計劃有效治療特定對象的有效預防性或治療性治療方案。如在本發明的一些實施方案中使用的，本發明的HBV dsRNA劑的有效量可以是當與細胞接觸時在細胞中產生期望生物學作用的量。
應認識到，HBV基因沉默可在組成型或通過基因組改造表達HBV的任何細胞中並且通過任何適當的測定來確定。在本發明的一些實施方案中，通過施用本發明的HBV dsRNA劑，HBV基因表達降低至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在本發明的一些實施方案中，通過施用本發明的HBV dsRNA劑，HBV基因表達降低5%至10%、5%至25%、10%至50%、10%至75%、25%至75%、25%至100%，或50%至100%。 給藥
HBV dsRNA劑和HBV反義多核苷酸劑以足以抑制HBV基因表達的劑量在藥物組合物中遞送。在本發明的某些實施方案中，HBV dsRNA劑的劑量爲每天0.01至200.0毫克/千克接受者的體重，通常爲每天1至50 mg/千克體重、5至40 mg/kg體重、10至30 mg/kg體重、1至20 mg/kg體重、1至10 mg/kg體重、4至15 mg/kg體重，包括端點。例如，HBV dsRNA劑可以以以下量施用：每單劑量從約0.01 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、1.1 mg/kg、1.2 mg/kg、1.3 mg/kg、1.4 mg/kg、1.5 mg/kg、1.6 mg/kg、1.7 mg/kg、1.8 mg/kg、1.9 mg/kg、2 mg/kg、2.1 mg/kg、2.2 mg/kg、2.3 mg/kg、2.4 mg/kg、2.5 mg/kg、2.6 mg/kg、2.7 mg/kg、2.8 mg/kg、2.9 mg/kg、3.0 mg/kg、3.1 mg/kg、3.2 mg/kg、3.3 mg/kg、3.4 mg/kg、3.5 mg/kg、3.6 mg/kg、3.7 mg/kg、3.8 mg/kg、3.9 mg/kg、4 mg/kg、4.1 mg/kg、4.2 mg/kg、4.3 mg/kg、4.4 mg/kg、4.5 mg/kg、4.6 mg/kg、4.7 mg/kg、4.8 mg/kg、4.9 mg/kg、5 mg/kg、5.1 mg/kg、5.2 mg/kg、5.3 mg/kg、5.4 mg/kg、5.5 mg/kg、5.6 mg/kg、5.7 mg/kg、5.8 mg/kg、5.9 mg/kg、6 mg/kg、6.1 mg/kg、6.2 mg/kg、6.3 mg/kg、6.4 mg/kg、6.5 mg/kg、6.6 mg/kg、6.7 mg/kg、6.8 mg/kg、6.9 mg/kg、7 mg/kg、7.1 mg/kg、7.2 mg/kg、7.3 mg/kg、7.4 mg/kg、7.5 mg/kg、7.6 mg/kg、7.7 mg/kg、7.8 mg/kg、7.9 mg/kg、8 mg/kg、8.1 mg/kg、8.2 mg/kg、8.3 mg/kg、8.4 mg/kg、8.5 mg/kg、8.6 mg/kg、8.7 mg/kg、8.8 mg/kg、8.9 mg/kg、9 mg/kg、9.1 mg/kg、9.2 mg/kg、9.3 mg/kg、9.4 mg/kg、9.5 mg/kg、9.6 mg/kg、9.7 mg/kg、9.8 mg/kg、9.9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg、20 mg/kg、21 mg/kg、22 mg/kg、23 mg/kg、24 mg/kg、25 mg/kg、26 mg/kg、27 mg/kg、28 mg/kg、29 mg/kg、30 mg/kg、31 mg/kg、32 mg/kg、33 mg/kg、34 mg/kg、35 mg/kg、36 mg/kg、37 mg/kg、38 mg/kg、39 mg/kg、40 mg/kg、41 mg/kg、42 mg/kg、43 mg/kg、44 mg/kg、45 mg/kg、46 mg/kg、47 mg/kg、48 mg/kg、49 mg/kg、至50 mg/kg 體重。
在確定本發明的HBV dsRNA劑的遞送劑量和時機時可考慮多種因素。遞送的HBV dsRNA劑的絕對量將取决於多種因素，包括併行治療、劑量數和個體對象參數，包括年齡、身體狀况、體型和體重。這些是本領域普通技術人員公知的因素並且可僅使用常規實驗來解决。在一些實施方案中，可使用最大劑量，即根據合理的醫學判斷的最高安全劑量。
在一些實施方案中，本發明的方法可包括向對象施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個劑量的HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑。在一些情况下，可至少每天、每隔一天、每周、每隔一周、每月等向對象施用藥物化合物（例如，包含HBV dsRNA劑或包含HBV反義多核苷酸劑的藥物化合物）。劑量可每天一次或每天多於一次地施用，例如在一個24小時期間內2、3、4、5次或更多次地施用。本發明的藥物組合物可每天一次地施用，或者HBV dsRNA劑可在全天以適當的間隔以兩個、三個或更多個亞劑量來施用，或者甚至使用通過控釋製劑的連續輸注或遞送。在本發明的方法的一些實施方案中，將本發明的藥物組合物每天一次或更多次、每周一次或更多次、每月一次或更多次，或者每年一次或更多次地施用於對象。
在一些方面中，本發明的方法包括單獨、與一種或更多種其他HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑組合，和/或與施用於患有HBV相關疾病或病症的對象的其他藥物治療或治療活動或方案組合來施用藥物化合物。藥物化合物可在藥物組合物中施用。在本發明的方法中使用的藥物組合物可以是無菌的並且含有適合施用於對象的以重量或體積爲單位的一定量的HBV dsRNA劑，其將HBV多肽的活性降低至足以產生期望響應的水平。可根據不同參數，特別是根據所使用的施用方式和對象的狀態來選擇向對象施用的包含HBV dsRNA劑的藥物組合物的降低HBV蛋白活性的劑量。其他因素包括期望的治療時間。在對象中的響應在施加的初始劑量下不足的情况下，可在患者耐受允許的程度上採用更高劑量（或通過不同的更加局部的遞送途徑的有效更高的劑量）。 治療
可使用本發明的方法和HBV dsRNA劑抑制HBV表達來治療HBV相關疾病和病症，其中HBV多肽的水平和/或活性降低對治療該疾病或病症有效。可用本發明的HBV dsRNA劑和本發明的治療方法來治療的疾病和病症的一些實例包括但不限於：乙型肝炎、HBV感染、慢性乙型肝炎、丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）、肝損傷、肝硬化、急性乙型肝炎、急性暴發性肝炎、肝炎症、肝纖維化和肝細胞癌。這樣的疾病和病症在本文中可稱爲“HBV相關疾病和病症”以及“由HBV引起和/或調節的疾病和病症”。應理解，對象中的丁型肝炎病毒（HDV）感染是HBV相關疾病，因爲雖然它本身不感染患者，但HDV可共同感染感染有HBV的對象。
在本發明的某些方面中，可在診斷HBV相關疾病或病症之前或之後的一個或更多個時間向對象施用本發明的HBV dsRNA劑。在本發明的一些方面中，對象處於患有或發生HBV相關疾病或病症的風險中。與發生HBV相關疾病或病症的對照風險相比，處於發生HBV相關疾病或病症的風險中的對象是具有提高的發生HBV相關疾病或病症的可能性的對象。在本發明的一些實施方案中，與對照風險水平相比，風險水平可以是統計學上顯著的。處於風險中的對象可包括，例如，（1）已經與携帶HBV的對象密切接觸和/或正處於其風險中的對象，（2）已經與感染有HBV的對象的血液、***和/或***液接觸和/或正處於其風險中的對象，（3）具有先前存在的疾病和/或異常（例如但不限於使對象比沒有先前存在的疾病或異常的對照對象更易患HBV感染以及導致的HBV相關疾病或病症的免疫缺陷）的對象；（4）具有HBV相關疾病或病症的個人病史的對象；（5）以及先前已經治療過HBV相關疾病或病症的對象。應理解，使對象更易患HBV相關疾病或病症的先前存在的疾病和/或異常可以是先前已鑒定爲當存在時與發生HBV相關疾病或病症的更高可能性具有相關關係的疾病和/或異常。
應理解，可基於個體對象的醫學狀况向對象施用HBV dsRNA劑。例如，爲對象提供的醫療保健可評估從對象獲得的樣品中測量的ALT水平，並確定是否期望通過施用本發明的HBV dsRNA劑來降低對象的ALT水平。在該實例中，可認爲ALT水平是HBV相關病症的一個生理特徵，即使對象未被診斷爲患有HBV相關疾病（例如本文公開的一種）。醫療保健提供者可監測對象ALT水平的變化，作爲所施用的本發明的HBV dsRNA劑的效力的量度。在一個非限制性實例中，從對象獲得生物樣品，例如血液或血清樣品，並在樣品中確定對象的HBV病毒載量。在對象中發現存在HBV病毒載量之後，將HBV dsRNA劑施用於對象，並且在施用之後從對象獲得後續血液或血清樣品，並使用後續樣品測定HBV病毒載量，並將結果與在對象的施用前（之前的）樣品中確定的結果進行比較。與施用前水平相比，後期樣品中對象的HBV病毒載量水平的降低指示所施用的HBV dsRNA劑在降低對象中HBV病毒載量水平方面的效力。
本發明的方法的某些實施方案包括調節治療，其包括至少部分地基於對由治療引起的對象的HBV相關疾病或病症的生理特徵中的一種或更多種的變化的評估，向對象施用本發明的HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑。例如，在本發明的一些實施方案中，可確定施用的本發明的dsRNA劑對對象的作用，並用於幫助調節隨後施用於對象的本發明的dsRNA劑的量。在一個非限制性實例中，向對象施用本發明的dsRNA劑，在施用之後在從對象獲得的生物樣品中確定一種或更多種HBV病毒抗原的存在和/或水平，並且至少部分地基於所確定的水平，確定是否更大量的dsRNA劑是期望的，以提高所施用的藥劑的生理作用，例如降低或進一步降低對象的一種或更多種HBV病毒抗原的存在和/或水平。在另一個非限制性實例中，向對象施用本發明的dsRNA劑，在施用之後確定對象的HBV病毒載量，並且至少部分地基於所確定的HBV病毒載量，可期望將更低量、更高量或相同量的dsRNA劑施用於對象。
因此，本發明的一些實施方案包括評估由對象的先前治療引起的一種或更多種生理特徵的變化，以調節隨後施用於對象的本發明的dsRNA劑的量。本發明的方法的一些實施方案包括1、2、3、4、5、6或更多次確定HBV相關疾病或病症的生理特徵，以評估和/或監測所施用的本發明的HBV dsRNA劑的效力，並且任選地使用所述確定來調節以下中的一項或更多項：本發明的dsRNA劑的劑量、施用方案和/或施用頻率，以治療對象中的HBV相關疾病或病症。在本發明的方法的一些實施方案中，向對象施用有效量的本發明的dsRNA劑的期望結果是以下中一種或更多種的降低：對象中ALT；AST；HBV病毒載量、HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg；HBsAg；和HBeAg，其指示對象中HBV基因表達的降低。在本發明方法的某些實施方案中，向對象施用有效量的本發明的HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑的期望結果是：與HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或者與HBV相關疾病或病症的對照生理特徵相比，對象中抗乙型肝炎病毒抗體提高，其指示對象中HBV基因表達降低。
本文中使用的術語“治療”及其變化形式關於HBV相關疾病或病症使用時，可指降低對象發生HBV相關疾病或病症的可能性的預防性治療，並且還可指在對象已發生HBV相關疾病或病症之後的治療，以與不存在降低HBV多肽在對象中活性的治療的對象相比消除或降低HBV相關疾病或病症的水平、防止HBV相關疾病或病症變得更晚期（例如，更嚴重），和/或减緩對象中HBV相關疾病或病症的進展。
本發明的藥劑、組合物和方法的某些實施方案可用於抑制HBV基因表達。本文中提及HBV基因表達時使用的術語“抑制”、“沉默”、“降低”、“下調”和“敲低”意指，分別與從HBV基因轉錄的RNA、表達的HBV的活性水平或從mRNA翻譯的HBV的水平的對照水平相比，當細胞、細胞群、組織、器官或對象與本發明的HBV dsRNA劑接觸（例如，用其處理）時，如在轉錄HBV基因的細胞、細胞群、組織、器官或對象中通過以下中的一種或更多種測量的HBV基因的表達降低：從基因轉錄的RNA的水平，表達的HBV的活性水平，以及從mRNA翻譯的HBV多肽、蛋白質或蛋白質亞基的水平。在一些實施方案中，對照水平是未與HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑接觸（例如，用其處理）的細胞、組織、器官或對象中的水平。 施用方法
HBV dsRNA劑的多種施用途徑可用於本發明的方法中。選擇的特定遞送模式將至少部分取决於所治療的特定病症和治療效果所需的劑量。一般而言，本發明的方法可使用醫學上可接受的任何施用模式來實施，意指任何產生治療HBV相關疾病或病症的有效水平而不引起臨床上不可接受的不良作用的方式。在本發明的一些實施方案中，HBV dsRNA劑可通過經口、經腸、經粘膜、皮下和/或腸胃外途徑施用。術語“腸胃外”包括皮下、靜脈內、鞘內、肌內、腹膜內和胸骨內注射，或輸注技術。其他途徑包括但不限於經鼻（例如，通過胃-鼻管）、經皮、經***、經直腸、舌下和吸入。本發明的遞送途徑可包括鞘內、心室內或顱內。在本發明的一些實施方案中，可將HBV dsRNA劑置於緩慢釋放基質中並通過將該基質置於對象中來施用。在本發明的一些方面中，可使用經靶向特定細胞或細胞器的遞送劑包被的納米粒將HBV dsRNA劑遞送至對象細胞。多種遞送手段、遞送方法、遞送劑是本領域已知的。遞送方法和遞送劑的一些非限制性實例在本文中別處另外提供。在本發明的一些方面中，術語“遞送”在提及HBV dsRNA劑時可意指向細胞或對象施用一種或更多種“裸”HBV dsRNA劑序列，並且在本發明的某些方面中，“遞送”意指通過轉染方式向細胞或對象施用、將包含HBV dsRNA劑的細胞遞送至對象、將編碼HBV dsRNA劑的載體遞送至細胞和/或對象中，等等。使用轉染方式遞送HBV dsRNA劑可包括向細胞和/或對象施用載體。
在本發明的一些方法中，一種或更多種HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑可在製劑中施用，所述製劑可以以可藥用溶液施用，其可常規地包含可藥用濃度的鹽、緩衝劑、防腐劑、相容性載體、輔料和任選地，其他治療成分。在本發明的一些實施方案中，HBV dsRNA劑可與其他治療劑一起配製以用於同時施用。根據本發明的一些方法，HBV dsRNA劑可在藥物組合物中施用。一般而言，藥物組合物包含HBV dsRNA劑以及任選地，可藥用載體。可藥用載體是本領域普通技術人員公知的。本文中使用的可藥用載體意指不干擾活性成分的生物活性的有效性（例如HBV dsRNA劑抑制細胞或對象中HBV基因表達的能力）的無毒材料。針對治療用途施用和遞送dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑的許多方法是本領域已知的，並且可用於本發明的方法中。
可藥用載體包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑和本領域公知的其他材料。示例性的可藥用載體在美國專利No. 5,211,657中描述，並且其他是本領域技術人員已知的。這樣的製劑可常規地包含鹽、緩衝劑、防腐劑、相容性載體和任選地，其他治療劑。當在醫學中使用時，鹽應該是可藥用的，但不可藥用鹽可適當地用於製備其可藥用鹽，並且不排除在本發明的範圍外。這樣的藥理學上和藥學上可接受的鹽包括但不限於由以下酸製備的那些：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。而且，可藥用鹽可作爲鹼金屬或鹼土金屬鹽、例如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽製備。
本發明方法的一些實施方案包括直接向組織施用一種或更多種HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑。在一些實施方案中，施用化合物的組織是其中HBV相關疾病或病症存在或可能出現的組織，其一些非限制性實例是肝或腎。直接組織施用可通過直接注射或其他方式來實現。許多經口遞送的化合物自然地到達並穿過肝和腎，並且本發明的治療方法的一些實施方案包括向對象經口施用一種或更多種HBV dsRNA劑。單獨或與其他治療劑聯合的HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑可一次施用，或者替代地它們可以以多次施用來施用。如果施用多次，則HBV dsRNA劑可通過不同途徑施用。例如但不旨在是限制性的，第一次（或前幾次）施用可通過皮下方式進行，並且一次或更多次另外的施用可以是經口和/或全身施用。
對於期望全身施用HBV dsRNA劑的本發明的一些實施方案，HBV dsRNA劑可被配製成用於通過注射（例如，通過推注或連續輸注）腸胃外施用。用於注射的製劑可以在有或無添加的防腐劑的情况下以單位劑量形式存在，例如在安瓿中或在多劑量容器中。HBV dsRNA劑製劑（也被稱爲藥物組合物）可採用例如在油性或水性載劑中的混懸劑、溶液劑或乳劑的形式，並且可包含配製劑，例如助懸劑、穩定劑和/或分散劑。
用於腸胃外施用的製劑包括無菌水性溶液或非水性溶液劑、混懸劑和乳劑。非水性溶劑的一些實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油（例如橄欖油）和可注射有機酯（例如油酸乙酯）。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或混懸液，包括鹽水和緩衝介質。腸胃外載劑包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖（Ringer’s dextrose）、葡萄糖和氯化鈉、乳酸鹽林格液（lactated Ringer’s），或不揮發性油（fixed oil）。靜脈內載劑包括流體和營養補充劑、電解質補充劑（例如基於林格葡萄糖的那些）等。還可存在防腐劑和其他添加劑，例如如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。較低劑量將產生於其他施用形式，例如靜脈內施用。在對象中的響應在施加的初始劑量下不足的情况下，可在患者耐受允許的程度上採用更高劑量（或通過不同的、更加局部的遞送途徑的有效更高的劑量）。根據需要，可使用每天多劑量以實現一種或更多種HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑的適當全身或局部水平並且實現HBV蛋白活性的適當降低。
在另一些實施方案中，本發明的一些方法包括使用適用於植入接受者（例如對象）中的遞送載劑，例如生物相容性微粒、納米粒或植入物。根據該方法可用的示例性的生物蝕解性（bioerodible）植入物在PCT公開No. WO 95/24929（通過引用併入本文中）中描述，其描述了用於包含生物大分子的生物相容的生物可降解的聚合物基質。
在本發明的方法中，非生物可降解和生物可降解的聚合物基質二者均可用於將一種或更多種HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑遞送至對象。在一些實施方案中，基質可以是生物可降解的。基質聚合物可以是天然或合成的聚合物。聚合物可基於期望釋放的時間來選擇，通常約數小時至一年或更長。通常來說，可使用在數小時至三到十二個月的時間內的釋放。聚合物任選爲在水中可吸收其重量的多至約90%的水凝膠形式，並且還任選與多價離子或其他聚合物交聯。
一般而言，在本發明的一些實施方案中，可使用生物蝕解性植入物以擴散的方式或通過聚合物基質的降解來遞送HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑。用於這樣的用途的示例性合成聚合物是本領域公知的。可使用本領域已知的方法將生物可降解的聚合物和非生物可降解的聚合物用於遞送HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑。生物粘附性聚合物（例如，生物蝕解性水凝膠）（參見H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587，其教導通過引用併入本文）也可用於遞送用於治療HBV相關疾病或病症的HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑。另一些合適的遞送系統可包括定時釋放、延遲釋放或持續釋放遞送系統。這樣的系統可避免HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑的重複施用，提高對象和醫療保健專業人員的方便。許多類型的釋放遞送系統是可用的並且是本領域普通技術人員已知的。（參見例如：美國專利No. 5,075,109；4,452,775；4,675,189；5,736,152；3,854,480；5,133,974；和5,407,686（其各自的教導通過引用併入本文）。另外，可使用基於泵的硬件遞送系統，其中一些適於植入。
長期持續釋放植入物的使用可適用於預防性治療對象和處於發生復發性HBV相關疾病或病症非風險中的對象。本文中使用的長期釋放意指植入物被構建和布置爲在至少多至10天、20天、30天、60天、90天、六個月、一年或更長的時間內遞送治療水平的HBV dsRNA劑。長期持續釋放植入物是本領域普通技術人員公知的，並且包括上述一些釋放系統。
可通過將具有期望純度的分子或化合物與任選的可藥用載體、賦形劑或穩定劑混合[Remington's Pharmaceutical Sciences第21版, (2006)]以凍乾製劑或水溶液的形式製備HBV dsRNA劑或HBV反義多核苷酸劑的治療性製劑以用於儲存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在使用的劑量和濃度下對接受者是無毒的，並且包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑（例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲銨；苯扎氯銨、苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬複合物（例如，Zn-蛋白質複合物）；和/或非離子表面活性劑，例如TWEEN ®、PLURONICS ®或聚乙二醇（PEG）。 細胞、對象和對照
本發明的方法可與細胞、組織、器官和/或對象結合使用。在本發明的一些方面中，對象是人或脊椎動物哺乳動物，包括但不限於狗、猫、馬、牛、羊、小鼠、大鼠和靈長類，例如猴。因此，本發明可用於治療人和非人對象中的HBV相關疾病或病症。在本發明的一些方面中，對象可以是農場動物、動物園動物、家養動物或非家養動物，並且本發明的方法可用於獸醫預防和治療方案。在本發明的一些實施方案中，對象是人並且本發明的方法可用於人預防和治療方案。
本發明可應用於的對象的一些非限制性實例是被診斷爲患有、疑似患有或有風險患有與高於期望的HBV表達和/或活性（也稱爲“HBV表達水平升高”）相關的疾病或病症的對象。與高於期望的HBV表達和/或活性水平相關的疾病和病症的一些非限制性實例在本文別處描述。本發明的方法可應用於在治療時已被診斷爲患有與高於期望的HBV表達和/或活性相關的疾病或病症的對象，或者被認爲處於患有或發生與高於期望的HBV表達和/或活性相關的疾病或病症的風險中的對象。在本發明的一些方面中，與高於期望的HBV表達和/或活性水平相關的疾病或病症是急性疾病或病症，並且在本發明的某些方面中，與高於期望的HBV表達和/或活性水平相關的疾病或病症是慢性疾病或病症。
在一個非限制性實例中，將本發明的HBV dsRNA劑施用於被診斷爲患有、疑似患有或有風險患有急性乙型肝炎的對象，所述急性乙型肝炎是期望降低HBV表達的疾病。本發明的方法可應用於在治療時已被診斷爲患有該疾病或病症的對象，或者被認爲處於患有或發生該疾病或病症的風險中的對象。
在另一個非限制性實例中，將本發明的HBV dsRNA劑施用於被診斷爲患有、疑似患有或有風險患有丁型肝炎（HDV）的對象，所述丁型肝炎是期望降低HBV表達的疾病。本發明的方法可應用於在治療時已被診斷爲患有該疾病或病症的對象，或者被認爲處於患有或發生該疾病或病症的風險中的對象。
本發明方法可應用於的細胞包括爲體外、體內、離體細胞的細胞。細胞可在對象中、培養物中和/或混懸液中，或處於任何其他合適的狀態或條件。本發明方法可應用於的細胞可以是肝細胞（liver cell）、肝細胞（hepatocyte）、心臟細胞、胰細胞、心血管細胞、腎細胞或其他類型的脊椎動物細胞，包括人和非人哺乳動物細胞。在本發明的某些方面中，本發明方法可應用於的細胞是已知不是患病細胞的健康正常細胞。在本發明的某些實施方案中，本發明的方法和組合物應用於的細胞是肝細胞（liver cell）、肝細胞（hepatocyte）、心臟細胞、胰細胞、心血管細胞和/或腎細胞。在本發明的某些方面中，對照細胞是正常細胞，但應理解，具有疾病或病症的細胞在特定情况下也可用作對照細胞，例如以比較具有疾病或病症的經處理的細胞相對於具有疾病或病症的未經處理的細胞的結果，等等。適於使用本發明實施方案治療的細胞可以是表達HBV基因的細胞，包括感染有HBV的細胞，或者包含含有HBV基因組或HBV基因的一部分的表達載體的細胞。
根據本發明的方法，可確定HBV多肽活性的水平並將其與HBV多肽活性的對照水平進行比較。對照可以是預定值，其可採取多種形式。它可以是單個截止值，例如，中值或平均值。其可基於比較組，例如具有較低的HBV多肽水平和/或HBV多肽活性的組以及具有提高的HBV多肽水平和/或HBV多肽活性的組來建立。比較組的另一個非限制性實例可以是具有HBV相關疾病或病症的一種或更多種症狀或者被診斷爲HBV相關疾病或病症的組；沒有該疾病或病症的一種或更多種症狀或者未被診斷爲該疾病或病症的組；已施用本發明的siRNA治療的對象的組；未施用本發明的siRNA治療的對象的組。通常而言，對照可基於適當年齡段中明顯健康的正常個體或明顯健康的細胞。應理解，根據本發明的對照除了預定值之外還可以是與實驗材料平行測試的材料的樣品。實例包括來自對照群體的樣品或待與實驗樣品平行測試的通過製造產生的對照樣品。在本發明的一些實施方案中，對照可包括未用本發明的HBV dsRNA劑接觸或處理的細胞或對象，並且在這樣的情况下，可將對照HBV多肽水平和/或HBV多肽活性與在與本發明的HBV dsRNA劑接觸的細胞或對象中的HBV多肽水平和/或HBV多肽活性進行比較。
在本發明的一些實施方案中，針對對象確定的HBV多肽水平可以是針對被比較的針對同一對象在不同時間確定的HBV多肽水平的對照水平。在一個非限制性實例中，在從未施用本發明的HBV治療的對象中獲得的生物樣品中確定HBV的水平。在一些實施方案中，生物樣品是血清樣品或組織樣品。從對象中獲得的樣品中確定的HBV多肽水平可用作對象的基線或對照值。在本發明的治療方法中在向對象施用一次或更多次HBV dsRNA劑之後，可從對象中獲得一個或更多個另外的血清樣品，並且可將隨後的一個或更多個樣品中的HBV多肽水平與對象的對照/基線水平進行比較。這樣的比較可用於評估對象中HBV相關疾病或病症的發作、進展或消退。例如，從對象中獲得的基線樣品中的HBV多肽水平或HBV病毒載量水平高於在向該對象施用本發明的HBV dsRNA劑之後從同一對象中獲得的水平指示HBV相關疾病或病症的消退，並且指示所施用的本發明的HBV dsRNA劑用於治療HBV相關疾病或病症的效力。在一些實施方案中，與在先前從對象獲得的樣品中確定的水平相比來自該對象的樣品中HBV多肽水平在統計學上顯著降低表明HBV相關疾病或病症消退。
在本發明的一些方面中，針對對象確定的HBV多肽水平和/或HBV多肽活性中一種或更多種的值可用作用於在同一對象中稍後比較HBV多肽水平和/或HBV活性的對照值，因此允許評估對象中與“基線”HBV多肽活性的變化。因此，初始HBV多肽水平和/或初始HBV多肽活性水平可存在於對象中和/或在對象中確定，並且本發明的方法和化合物可用於降低對象中HBV多肽水平和/或HBV多肽活性，其中初始水平用作該對象的對照水平。
使用本發明的方法，可將本發明的HBV dsRNA劑施用於對象。當與在先前時間點從對象中獲得的血清樣品和/或組織樣品中的施用前HBV多肽水平或HBV病毒載量相比，或與非接觸對照水平（例如對照血清樣品中的HBV多肽水平或HBV病毒載量）相比，從對象中獲得的血清樣品和/或組織樣品中的HBV多肽水平或HBV病毒載量降低至少0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%時，可評估本發明的施用和治療的效力。應理解，本文中所述的HBV多肽水平、HBV病毒載量、一種或更多種HBV抗原的存在、HBV多肽活性水平和另一些生理特徵均與HBV基因表達水平相關。本發明的方法的某些實施方案包括向對象施用有效抑制HBV基因表達並由此在對象中降低HBV多肽水平並降低HBV多肽活性水平的量的本發明的HBV dsRNA。
本發明的一些實施方案包括確定從一個或更多個對象中獲得的一個或更多個生物樣品中HBV多肽的存在、不存在和/或量（在本文中也稱爲水平）。該測定可用於評估本發明的治療方法的效力。例如，本發明的方法和組合物可用於確定生物樣品中HBV多肽和/或HBV病毒載量的水平，所述生物樣品從先前用施用本發明的HBV dsRNA劑進行治療的對象中獲得。在從經治療對象中獲得的生物樣品中確定的HBV多肽水平和/或HBV病毒載量與分別針對對象確定的治療前HBV多肽水平或HBV病毒載量相比或與未接觸的對照生物樣品水平相比將低至少0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%、99.99%或更多指示向對象施用的治療的效力水平。在本發明的方法的一些實施方案中，細胞與本發明的siRNA劑的接觸（在本文中也稱爲治療）導致細胞中HBV基因表達抑制至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或約100%，例如至低於測定的檢測水平。
在本發明的一些實施方案中，針對對象確定的HBV相關疾病或病症的生理特徵可以是與在同一對象中在不同時間對生理特徵的確定進行比較的對照確定。在一個非限制性實例中，在從未施用本發明的HBV治療的對象中獲得的生物樣品中確定生理特徵例如ALT水平、AST水平和/或病毒載量水平。在從對象中獲得的樣品中確定的ALT水平、AST水平和/或病毒載量水平（和/或HBV疾病或病症的其他生理特徵）可用作對象的基線或對照值。在本發明的治療方法中在向對象施用一次或更多次HBV dsRNA劑之後，可從對象中獲得一個或更多個另外的生物樣品，並且可將隨後的一個或更多個樣品中的ALT水平、AST水平和/或病毒載量水平分別與對象的對照/基線水平和/或比例進行比較。這樣的比較可用於評估對象中HBV相關疾病或病症的發作、進展或消退。例如，從對象中獲得的基線樣品中的ALT水平、AST水平和/或病毒載量水平高於在向該對象施用本發明的HBV dsRNA劑之後從同一對象中獲得的樣品中確定的ALT水平、AST水平和/或病毒載量水平指示HBV相關疾病或病症的消退，並且指示所施用的本發明的HBV dsRNA劑用於治療HBV相關疾病或病症的效力。
在本發明的一些方面中，針對對象確定的HBV相關疾病或病症的生理特徵中一種或更多種的值可用作用於在同一對象中稍後比較生理特徵的對照值，因此允許評估對象中與“基線”生理特徵的變化。因此，初始生理特徵可存在於對象中和/或在對象中確定，並且本發明的方法和化合物可用於降低對象中HBV多肽水平和/或HBV多肽活性，其中初始生理特徵確定用作該對象的對照。
使用本發明的方法，可將有效量的本發明的HBV dsRNA劑施用於對象以治療HBV疾病或病症。本發明的施用和治療的效力可通過確定HBV疾病或病症的一種或更多種生理特徵的變化來評估。在一些非限制性實例中，與在治療前時間點從對象中獲得的生物樣品中生理特徵的施用前水平相比或與針對非接觸對照確定的生理特徵相比在用本發明的方法治療之後從對象獲得的生物樣品中確定的ALT水平、AST水平、HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）、一種或更多種HBV抗原、HBcAg、HBsAg和HBeAg中一種或更多種、以及病毒載量水平降低至少0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%、99.99%或100%表明了施用於對象的治療的效力。應理解，本文中所述的HBV生理特徵的確定與HBV基因表達水平相關。本發明的方法的某些實施方案包括以有效抑制HBV基因表達並由此降低以下或以其他方式積極影響對象中HBV相關疾病或病症的生理特徵的量向對象施用本發明的HBV dsRNA劑：ALT水平、AST水平、HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg、HBsAg和HBeAg中的一種或更多種；以及病毒載量水平。
本發明的一些實施方案包括使用例如但不限於以下的方法來確定HBV相關疾病或病症的生理特徵的存在、不存在和/或變化：（1）評估從一個或更多個對象中獲得的一個或更多個生物樣品的生理特徵；（2）對對象進行細胞和/或組織活檢（例如但不限於肝活檢）；以及（3）或者對象的身體檢查。該確定可用於評估本發明的治療方法的效力。 藥盒
藥盒也在本發明的範圍內，其包含一種或更多種本發明的HBV dsRNA劑以及其在本發明方法中使用的說明書。本發明的藥盒可包含可用於治療HBV相關疾病或病症的HBV dsRNA劑、HBV有義多核苷酸和HBV反義多核苷酸劑中的一種或更多種。包含一種或更多種HBV dsRNA劑、HBV有義多核苷酸和HBV反義多核苷酸劑的藥盒可被製備用於本發明的治療方法。本發明藥盒的組分可包裝在水性介質中或以凍乾形式包裝。本發明的藥盒可包含載體，所述載體被分隔成其中嚴密封閉地容納一個或更多個容器裝置或一系列容器裝置，例如測試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器等。第一容器裝置或第一系列容器裝置可包含一種或更多種化合物，例如HBV dsRNA劑和/或一種或更多種HBV有義或反義多核苷酸分子。第二容器裝置或第二系列容器裝置可包含靶向劑、標記劑、遞送劑等，其在本發明治療方法的一個實施方案中可作爲待施用的HBV dsRNA劑的一部分被包括在內。
本發明的藥盒還可包含說明書。說明書通常以書面形式，並爲實施通過藥盒實現的治療和基於該治療作出决定提供指導。
提供以下實施例以舉例說明本發明實踐的一些具體實例，並不旨在限制本發明的範圍。對本領域普通技術人員來說明顯的是，本發明將以多種組合物和方法應用。 實施例 實施例1. HBV RNAi劑的合成
上表2至表4中示出的HBV RNAi劑雙鏈體是根據以下一般程序合成的： 使用基於亞磷醯胺化學的充分確立的固相合成方法在寡核苷酸合成儀上合成siRNA的有義鏈序列和反義鏈序列。寡核苷酸鏈增長通過4步循環實現：脫保護、偶聯、加帽和氧化或硫化步驟以用於添加每個核苷酸。合成是在由可控孔度玻璃（controlled pore glass）（CPG，500或1000 Å）製成的固體支持物上進行的。單體亞磷醯胺購自商業來源。根據本文中實施例2至3的程序合成具有GalNAc配體簇的亞磷醯胺（作爲非限制性實例的GLPA1和GLPA2）。對於用於體外篩選的siRNA（表2），以20 nmol規模進行合成，並且對於用於體內測試的siRNA（表3、4和5），以1 µmol或更大的規模進行合成。在GalNAc配體（作爲非限制性實例的GLO-0）連接在有義鏈的3’末端的情况下，使用GalNAc配體連接的CPG固體支持物。在GalNAc配體（作爲非限制性實例的GLS-1或GLS-2）連接在有義鏈的5’末端的情况下，使用GalNAc亞磷醯胺（作爲非限制性實例的GLPA1或GLPA2）用於最後的偶聯反應。二氯甲烷中的三氯乙酸（TCA）3%用於4,4’-二甲氧基三苯甲基保護基（DMT）的脫保護。5-乙硫基-1H-四唑用作活化劑。THF/Py/H 2O中的I 2和吡啶/MeCN中的苯乙醯二硫化物（PADS）分別用於氧化和硫化反應。在最終的固相合成步驟之後，用乙腈中的20%二乙胺除去氰乙基保護基。去除核鹼基的保護基並通過用28%氫氧化銨溶液在65℃下處理2小時來切割固體支持物結合的寡聚體。將含有粗制單鏈產物的水溶液濃縮並通過離子配對反相HPLC（ion pairing reversed phase HPLC，IP-RP-HPLC）純化。來自IP-RP-HPLC的經純化單鏈寡核苷酸產物通過溶解在1.0 M NaOAc中而轉化爲鈉鹽並且通過添加冰冷的EtOH沉澱。等摩爾互補有義鏈和反義鏈寡核苷酸的退火在水中進行，以形成雙鏈siRNA產物，將其凍乾以得到蓬鬆的白色固體。 實施例2. 中間體A和中間體B的製備。
如以下方案1所示，中間體A是通過用二氯甲烷（DCM）中的三氟甲磺酸三甲基甲矽烷基酯（TMSOTf）處理可商購的半乳糖胺五乙酸酯來合成的。隨後用Cbz保護的2-(2-氨基乙氧基)乙烷-1-醇進行糖基化，以得到化合物II。通過氫化除去Cbz保護基，以得到作爲三氟乙酸（TFA）鹽的中間體A。除了使用Cbz保護的2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙烷-1-醇作爲起始物質之外，基於相同的方案合成中間體B。 方案1
向化合物I（20.0 g，51.4 mmol）在100 mL 1,2-二氯乙烷（DCE）中的溶液添加TMSOTf（17.1 g，77.2 mmol）。將所得反應溶液在60℃下攪拌2小時，並且然後在25℃下攪拌1小時。將經4 Å粉末分子篩（10 g）乾燥的在DCE（100 mL）中的Cbz保護的2-(2-氨基乙氧基)乙烷-1-醇（13.5 g，56.5 mmol）在N 2氣氛下在0℃下逐滴添加至上述反應溶液中。將所得反應混合物在N 2氣氛下在25℃下攪拌16小時。將反應混合物過濾並用飽和NaHCO 3（200 mL）、水（200 mL）和飽和鹽水（200 mL）洗滌。將有機層經無水Na 2SO 4乾燥，過濾並在在减壓下下濃縮，以得到粗制產物，將其與2-甲基四氫呋喃/庚烷（5/3，v/v，1.80 L）一起研磨2小時。將所得混合物過濾並乾燥，以得到作爲白色固體的化合物II（15.0 g，50.3%產率）。
向經乾燥和氬氣吹掃的氫化瓶中小心地添加10% Pd/C（1.50 g），隨後添加10 mL四氫呋喃（THF），並且然後添加化合物II（15.0 g，26.4 mmol）在THF（300 mL）和TFA（三氟乙酸，3.00 g，26.4 mmol）中的溶液。將所得混合物脫氣並用H 2吹掃三次並在H 2（45 psi）氣氛下在25℃下攪拌3小時。薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC，溶劑：DCM:MeOH=10:1）指示化合物II已完全耗盡。將反應混合物過濾並在减壓下濃縮。將殘餘物溶解在無水DCM（500 mL）中並濃縮。將該過程重複3次以得到作爲泡沫狀白色固體的中間體A（14.0 g，96.5%產率）。
中間體B是使用與用於中間體A的合成類似的程序來合成的。 C 20H 34N 2O 11的質量計算值: 478.22；實測值: 479.3 (M+H +)。 實施例3. GalNAc配體簇亞磷醯胺GLPA1、GLPA2和GLPA15的合成
根據以下方案2來製備GLPA1和GLPA2。從苄基保護的丙烷-1,3-二胺開始，將其用2-溴乙酸叔丁酯進行烷基化以得到三酯化合物I。通過氫化除去苄基保護基以得到仲胺化合物II。醯胺與6-羥基己酸偶聯得到化合物III。然後在二氧六環中的HCl處理後除去叔丁基保護基，以產生三酸化合物IV。在三酸化合物IV與中間體A或中間體B之間進行醯胺偶聯，以得到化合物Va或Vb。亞磷醯胺GLPA1或GLPA2是通過用2-氰乙基N,N-二異丙基氯亞磷醯胺和催化量的1H-四唑使化合物Va或Vb磷酸化來合成的。 方案2
向N-苄基-1,3-丙二胺（5.00 g，30.4 mmol）在二甲基甲醯胺（DMF，100 mL）中的溶液添加2-溴乙酸叔丁酯（23.7 g，121 mmol），隨後逐滴添加二異丙基乙胺（DIEA，23.61 g，182 mmol）。將所得反應混合物在25℃至30℃下攪拌16小時。LCMS顯示N-苄基-1,3-丙二胺已完全耗盡。將反應混合物用H 2O（500 mL）稀釋並用EtOAc（500 mL×2）萃取。將合併的有機物用飽和鹽水（1 L）洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾，並在减壓下濃縮以得到粗制產物，將其通過矽膠柱色譜（梯度：石油醚:乙酸乙酯爲20:1至5:1）純化。得到作爲無色油狀物的化合物I（12.1 g，78.4%產率）。
用氬氣吹掃經乾燥的氫化瓶三次。添加Pd/C（200 mg，10%），隨後添加MeOH（5 mL），並且然後添加化合物I（1.00 g，1.97 mmol）在MeOH（5 mL）中的溶液。將反應混合物在真空下脫氣並用H 2重新填充。將該過程重複三遍。將混合物在H 2（15 psi）氣氛下在25℃下攪拌12小時。LCMS顯示化合物I已完全耗盡。在N 2氣氛下在减壓下過濾反應混合物。在减壓下濃縮濾液，以得到作爲黃色油狀物的化合物II（655 mg，79.7%產率），其無需進一步純化即可用於下一步。
將化合物II（655 mg，1.57 mmol）、6-羥基己酸（249 mg，1.89 mmol）、DIEA（1.02 g，7.86 mmol）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI，904 mg，4.72 mmol）和1-羥基苯并***（HOBt，637 mg，4.72 mmol）在DMF（6 mL）中的混合物脫氣並用N 2吹掃3次，並且然後在N 2氣氛下在25℃下攪拌3小時。LCMS指示期望的產物。將反應混合物用H 2O（10 mL）稀釋並用EtOAc 20 mL（10 mL×2）萃取。合併有機物並用飽和鹽水（20 mL）洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾，並濃縮以得到粗制產物，將其通過矽膠柱色譜（梯度：石油醚:乙酸乙酯爲5:1至1:1）純化以得到作爲黃色油狀物的化合物III（650 mg，77.8%產率）。 C 27H 50N 2O 8的質量計算值: 530.36；實測值: 531.3 (M+H +)。
將化合物III（5.5 g，10.3 mmol）在HCl/二氧六環（2 M，55 mL）中的混合物在25℃下攪拌3小時。LCMS顯示化合物III完全耗盡。將反應混合物過濾，用EtOAc（50 mL）洗滌，並在减壓下乾燥，以得到粗制產物。將其溶解在CH 3CN（50 mL）中，在真空下除去揮發物。將該過程重複3次，以得到作爲白色固體的化合物IV（2.05 g，54.5%產率）。
將化合物IV（500 mg，1.05 mmol）、中間體A（2.02 g，3.67 mmol）、DIEA（813 mg，6.30 mmol）、EDCI（704 mg，3.67 mmol）和HOBt（496 mg，3.67 mmol）在DMF（10 mL）中的混合物脫氣並用N 2吹掃3次，並且然後將混合物在N2氣氛下在25℃下攪拌3小時。LCMS指示期望的產物。將反應混合物通過添加H 2O（10 mL）來淬滅，用DCM（10 mL×2）萃取。將合幷的有機物用10%檸檬酸（20 mL）萃取。將水相用飽和NaHCO 3溶液中和並用DCM（10 mL×2）再萃取。將有機物經硫酸鈉乾燥，過濾並在减壓下濃縮，以得到作爲白色固體的化合物Va（570 mg，0.281 mmol，26.8%產率）。
在環境溫度下在N 2下向化合物Va（260 mg，0.161 mmol）在無水DCM（5 mL）中的溶液添加二異丙基銨四唑化物（30.3 mg，0.177 mmol），隨後逐滴添加3-雙(二異丙基氨基)膦醯氧基丙腈（194 mg，0.645 mmol）。將反應混合物在20℃至25℃下攪拌2小時。LCMS指示化合物Va已完全耗盡。在冷却至-20℃之後，在0℃下將反應混合物添加至攪拌的鹽水/飽和NaHCO 3水溶液（1:1，5 mL）中。在攪拌1分鐘之後，添加DCM（5 mL）。分離層。將有機物用鹽水/飽和NaHCO 3水溶液（1:1，5 mL）洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾並濃縮至約1 mL體積。在攪拌的情况下將殘餘物溶液逐滴添加至20 mL甲基叔丁基醚（MTBE）。這導致白色固體沉澱。將混合物離心，並收集固體。將固體重新溶解在1 mL DCM中並通過添加MTBE（20 mL）沉澱。通過離心再次分離固體。將收集的固體溶解在無水CH 3CN中。除去揮發物。將該過程再重複兩次，以得到作爲白色固體的GalNAc配體亞磷醯胺化合物GLPA1（153 mg，84.4 μmol）。
除了使用中間體B之外，使用相同的程序合成GalNAc配體亞磷醯胺化合物GLPA2。
根據以下方案3來製備GLPA15。 方案3
從仲胺化合物I（方案2中的化合物II）開始，引入Cbz保護以得到化合物II。通過用酸處理來除去化合物II的叔丁基，以得到三酸化合物III。化合物III與中間體A進行醯胺偶聯得到化合物IV。通過氫化除去化合物IV的Cbz保護基，以得到仲胺化合物V，其與戊二酸酐反應以得到羧基化合物VI。化合物VI與呱啶-4-醇在醯胺偶聯反應條件下反應以得到化合物VII。通過用2-氰乙基N,N-二異丙基氯亞磷醯胺和催化量的1H-四唑處理化合物VII合成亞磷醯胺化合物GLPA15。
在某些研究中，用於將包含GalNAc的靶向基團（本文中也稱爲GalNAc遞送化合物）與有義鏈的5’末端連接的方法包括使用合成過程在固相合成的最後的偶聯步驟中使用GalNAc亞磷醯胺（GLPA1），所述合成過程例如如果進行了向有義鏈的5’末端添加核苷酸的寡核苷酸鏈增長，則使用的過程。
在一些研究中，將包含GalNAc的靶向基團與有義鏈的3’末端連接的方法包括使用包含GLO-n的固體支持物（CPG）。在一些研究中，將包含GalNAc的靶向基團與有義鏈的3’末端連接的方法包括通過酯鍵將GalNAc靶向基團與CPG固體支持物連接，並在合成有義鏈時使用所得的具有所連接的GalNAc靶向基團的CPG，這導致GalNAc靶向基團連接在有義鏈的3’末端。 實施例4. HBV siRNA雙鏈體的體外篩選
HBV轉染的HepG2.2.15細胞系用於HBV siRNA劑的體外評價。將HepG2.2.15細胞接種到96孔板中並使用Lipofectamine® RNAiMax作爲轉染劑，用HBV siRNA劑以終濃度爲0.04 nM、0.2 nM和1 nM轉染。在接種之後在72小時的天數時收集上清液。通過ELISA測定確定HBsAg水平。通過將來自用HBV siRNA劑轉染的樣品的HBsAg水平與未經轉染的對照樣品（僅Lipofectamine® RNAiMax）的HBsAg水平進行比較來計算敲低活性。一式三份進行實驗。結果總結在表5和表7中。即使在0.04 nM下，多種siRNA也表現出抑制HBsAg表達的良好活性。選擇了表現出良好至優異活性的一組siRNA用於體內測試。 表5 提供了使用多種HBV RNAi劑來抑制HBsAg表達的體外研究的實驗結果。研究在本文別處描述。
雙鏈體 ID 平均抑制%
1 nM 0.2 nM 0.04 nM
平均抑制% STD 平均抑制% STD 平均抑制% STD
AV00053 90.63 1.42 75.93 3.06 12.27 14.97
AV00054 94.67 2.68 89.97 0.76 33.87 10.02
AV00055 95.73 0.45 93.83 1.59 73.23 8.74
AV00056 96.67 0.50 85.30 4.16 31.87 14.20
AV00057 96.43 1.26 97.07 1.18 82.40 5.53
AV00058 95.00 1.31 90.57 2.92 36.03 13.59
AV00059 91.20 2.00 76.17 4.09 10.47 18.77
AV00060 97.80 1.51 87.50 3.80 53.10 12.17
AV00061 84.50 2.36 60.90 2.21 6.27 16.95
AV00062 98.07 0.21 95.33 1.00 46.67 15.18
AV00063 95.93 2.06 83.13 4.39 13.00 9.62
AV00064 95.77 0.72 83.53 4.57 30.53 8.46
AV00065 96.27 2.23 77.33 7.61 33.60 2.25
AV00066 92.13 4.90 92.70 2.27 84.50 0.10
AV00067 100.00 0.00 88.33 5.35 36.33 1.50
AV00068 100.00 0.00 100.00 0.00 65.80 0.56
AV00069 98.80 0.85 99.43 0.42 54.20 2.97
AV00070 98.17 1.93 46.30 24.08 23.23 4.67
AV00071 98.67 2.31 100.00 0.00 73.80 3.10
AV00072 100.00 0.00 90.63 14.86 59.87 4.67
AV00073 69.40 20.35 9.10 47.84 15.57 5.60
AV00074 96.33 5.03 87.77 21.19 47.83 2.30
AV00075 98.70 1.30 93.40 5.67 23.60 7.57
AV00076 99.87 0.23 99.23 1.33 67.47 3.49
AV00077 85.17 1.46 70.33 4.53 16.77 11.78
AV00078 99.10 0.56 97.57 0.35 45.03 6.45
AV00079 95.10 4.20 86.73 4.76 31.93 8.95
AV00080 97.47 1.82 86.80 9.95 66.50 5.65
AV00081 93.23 1.10 86.40 2.65 27.10 9.13
AV00082 99.50 0.30 94.13 6.13 66.97 4.65
AV00083 97.47 1.86 97.93 0.50 68.70 3.44
AV00084 89.00 0.98 43.77 15.95 -0.50 6.14
AV00085 95.97 3.27 91.37 2.48 29.77 3.66
AV00086 86.07 5.26 59.50 6.22 8.57 14.39
AV00087 89.30 6.01 72.20 12.25 8.97 15.45
AV00088 94.27 1.76 73.57 13.73 17.63 6.99
AV00089 90.40 2.42 63.83 1.03 13.13 6.35
AV00090 96.60 1.61 89.40 3.03 53.97 2.35
AV00091 98.57 1.10 91.00 2.76 27.00 6.85
AV00092 97.50 1.04 76.47 6.39 26.00 4.83
AV00093 90.03 2.39 69.10 12.06 17.60 2.89
AV00094 99.27 0.67 93.07 4.28 50.97 2.95
AV00095 74.97 11.41 45.83 4.92 12.93 6.32
AV00096 91.47 5.18 57.00 8.34 16.63 5.01
AV00097 95.07 4.41 88.97 4.10 37.70 5.44
AV00098 94.43 4.24 90.77 5.54 47.20 3.93
AV00099 71.93 7.96 50.13 3.15 2.30 6.85
AV00100 87.47 7.27 63.53 9.72 -6.77 8.80
AV00101 85.37 4.18 42.27 3.23 -26.43 7.90
AV00102 94.37 5.36 67.73 3.02 -8.20 11.91
AV00103 94.00 4.22 89.53 3.81 -3.00 28.80
AV00104 87.47 6.82 49.17 8.36 -12.00 22.88
AV00105 99.90 0.10 96.67 3.31 14.30 11.61
AV00106 99.87 0.23 97.80 0.17 29.37 6.09
AV00107 99.47 0.35 90.70 3.33 19.50 17.00
AV00108 35.03 21.35 12.67 11.81 -19.73 14.65
AV00109 96.70 3.29 83.33 8.02 7.23 25.36
AV00110 100.00 0.00 98.57 1.69 42.07 13.88
AV00111 75.00 4.19 27.70 12.06 -13.33 15.88
AV00112 87.77 7.50 45.77 15.87 -4.43 14.34
AV00113 27.57 11.66 -24.07 8.65 -29.53 15.30
AV00114 93.57 3.10 78.80 2.17 13.97 14.85
AV00115 97.80 1.08 87.17 4.20 41.20 11.26
AV00116 83.93 4.89 67.27 6.91 9.20 10.00
AV00117 77.70 7.43 38.80 7.43 3.97 13.49
AV00118 94.00 1.56 73.37 1.80 11.07 6.13
AV00119 89.57 0.80 58.37 3.71 19.47 7.41
AV00120 99.37 0.31 93.83 3.79 69.20 5.57
AV00121 74.83 5.31 30.57 4.15 7.47 8.98
表7 提供了使用多種HBV RNAi劑來抑制HBsAg表達的體外研究的實驗結果。研究在本文別處描述。
雙鏈體ID 平均抑制%
1 nM 0.04 nM
平均抑制% STD 平均抑制% STD
AV01258 66.03 1.07 38.84 2.63
AV01259 72.73 4.06 65.13 9.34
AV01260 58.50 3.97 34.51 4.09
AV01261 59.10 1.43 21.00 1.75
AV01262 -15.58 20.65 -17.77 8.32
AV01263 15.93 4.77 -17.45 1.53
AV01264 59.66 2.33 13.49 6.44
AV01265 41.12 1.62 -0.45 7.85
AV01266 62.29 1.64 17.87 0.70
AV01267 71.24 0.85 39.46 1.50
AV01268 60.34 0.74 55.60 0.92
AV01269 65.40 4.10 39.61 4.23
AV01270 64.13 0.55 38.87 4.02
AV01271 63.81 1.41 43.45 0.03
AV00057 67.84 1.86 56.32 0.52
AV01273 63.25 2.93 57.11 2.13
AV01274 79.59 3.34 64.74 0.86
AV01275 74.55 0.72 61.25 3.99
AV01276 66.64 4.38 48.82 4.31
AV01277 74.44 6.63 58.12 4.08
AV01278 68.11 6.86 47.17 2.04
AV01279 60.16 7.07 37.95 5.21
AV01280 67.92 1.28 14.83 1.57
AV01281 79.62 2.15 65.34 0.75
AV01282 80.38 0.46 61.42 3.25
AV01283 72.42 1.26 42.27 0.13
AV01284 74.42 5.62 48.43 6.25
AV01285 76.18 1.72 47.59 8.98
AV01286 85.49 0.35 66.22 0.19
AV01287 64.66 8.63 27.79 1.00
AV01288 73.01 3.07 67.60 2.03
AV01289 83.68 1.19 73.41 2.26
AV01290 70.77 2.12 48.65 1.49
AV01291 70.65 1.84 45.80 4.70
AV01293 67.51 7.01 32.56 0.71
AV01294 25.93 2.24 9.62 3.68
AV01295 61.92 3.37 22.19 9.25
AV01296 78.13 3.35 59.18 3.85
AV01297 87.50 0.34 63.20 1.81
AV01298 79.02 1.49 61.64 1.84
AV01299 81.97 2.66 70.71 1.67
AV01300 82.36 1.15 70.33 3.88
AV01301 79.96 4.2 62.60 1.72
AV01302 90.58 2.54 60.88 1.49
AV01303 92.07 2.04 65.97 1.79
AV01304 92.79 6.13 71.91 1.29
AV01305 88.40 4.12 55.36 4.69
AV01306 78.13 1.3 14.30 6.85
AV01307 88.38 1.46 57.92 8.49
AV01308 85.08 0.4 58.98 0.73
AV01309 86.50 2.65 51.86 0.57
AV01310 72.74 12.22 41.82 10.07
AV01311 57.74 1.11 21.57 13.04
AV01312 82.52 2.71 69.91 12.08
AV01313 89.11 2.47 75.06 2.05
AV01314 95.40 2.23 88.25 3.28
AV01315 94.62 0.72 62.81 9.21
AV01316 93.43 0.52 69.42 5.12
AV01317 92.85 2.39 78.99 1.25
AV01318 88.86 1.02 60.18 13.13
AV01319 90.65 0.40 77.74 4.85
實施例5. siRNA劑的體內篩選
使用AAV-HBV小鼠模型評價HBV siRNA劑的體內效力。用1x10^11 rAAV8-1.3 HBV病毒基因組通過尾靜脈注射感染雄性C57BL/6小鼠（5周齡）。在感染之後14天，採取血液樣品並通過ELISA測定測量小鼠血清中的HBsAg。選擇具有高HBsAg表達水平（log HBsAg IU/ml ＞ 4.9）的小鼠進行研究。在感染之後第18天，向每隻小鼠皮下施用單次3 mg/kg劑量的HBV siRNA或PBS對照。在給藥之後第7天和第14天抽取血液樣品。通過ELISA測定測量血清HBsAg。將每隻動物在某個時間點的HBsAg水平除以該動物的處理前表達水平（感染之後第14天），以確定“相對於處理前歸一化”的表達的比率。通過將單個動物的“相對於處理前歸一化”比率除以PBS對照組中所有小鼠的平均“相對於處理前歸一化”比率來計算敲低活性。結果總結在表6中。確定高效的HBV siRNA。特別地，用siRNA劑AD00170、AD00263、AD00265、AD00267、AD00268、AD00269、AD00173和AD00176處理的小鼠顯示HBsAg降低超過96%（相對於處理前歸一化）。在本實施例中，表3中所述化合物中的GLO-0是指Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958-16961中的化合物GalNAc3。 表6. 經AAV-HBV轉導小鼠中的HBV siRNA單次3 mpk皮下劑量篩選。將小鼠血清中HBsAg降低的百分比相對於siRNA給藥前HBsAg水平和PBS對照組歸一化。
雙鏈體ID 在siRNA處理後7天和14天小鼠血清中HBsAg的降低百分比
第7天 第14天
AD00166 75.98% 39.95%
AD00167 70.82% 81.65%
AD00168 95.79% 89.35%
AD00169 94.07% 87.96%
AD00170 99.68% 99.34%
AD00171 48.41% 35.98%
AD00172 83.22% 87.40%
AD00173 96.00% 95.92%
AD00174 44.78% 3.08%
AD00175 57.40% 48.30%
AD00176 91.10% 96.39%
AD00177 64.43% 72.23%
AD00261 68.52% 88.31%
AD00262 87.71% 93.28%
AD00263 98.90% 98.97%
AD00264 55.87% 69.62%
AD00265 86.59% 96.14%
AD00266 90.70% 95.80%
AD00267 99.93% 99.91%
AD00268 98.95% 98.55%
AD00269 96.95% 98.01%
AD00270 85.03% 77.79%
AD00271 79.51% 90.03%
AD00272 76.43% 79.85%
AD00273 55.91% 56.05%
實施例6. siRNA劑在AAV-HBV小鼠模型中的體內測試
使用AAV-HBV小鼠模型評價HBV siRNA劑的體內效力。用1x10^11 rAAV8-1.3 HBV病毒基因組通過尾靜脈注射感染雄性C57BL/6小鼠（5周齡）。在感染之後14天，採取血液樣品並通過ELISA測定測量小鼠血清中的HBsAg。選擇具有高HBsAg表達水平（log HBsAg IU/ml ＞ 4.9）的小鼠進行研究。在感染之後第18天，每隻小鼠皮下施用單次3 mg/kg劑量的HBV siRNA或PBS對照。在給藥之後第7天、第14天和第21天抽取血液樣品。通過ELISA測定測量血清HBsAg和HBeAg。將每隻動物在某個時間點的HBsAg和HBeAg水平除以該動物的處理前表達水平（感染之後第14天），以確定“相對於處理前歸一化”的表達比率。通過將單個動物的“相對於處理前歸一化”比率除以PBS對照組中所有小鼠的平均“相對於處理前歸一化”比率來計算敲低活性。結果總結在表8和表9中。確定高效的HBV siRNA。特別地，用siRNA劑AD00170、AD00263、AD00267、AD00378、AD00383和AD00384處理的小鼠顯示HBsAg降低超過96%（相對於處理前歸一化）。在本實施例中，表3中所述化合物中的GLO-0是指Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958-16961中的化合物GalNAc3。 表8. 經AAV-HBV轉導小鼠中的HBV siRNA單次3 mpk皮下劑量篩選。將小鼠血清中HBsAg降低的百分比相對於siRNA給藥前HBsAg水平和PBS對照組歸一化。
雙鏈體ID 在siRNA處理後7天、14天和21天小鼠血清中HBsAg的降低百分比
第7天 第14天 第21天
AD00170 98.55±0.47 99.69±0.30 99.73±0.22
AD00263 99.04±0.33 99.54±0.37 99.29±0.24
AD00266 70.27±14.02 80.71±4.17 77.49±11.30
AD00267 98.65±0.75 99.81±0.09 99.82±0.07
AD00268 93.44±4.32 96.94±3.01 93.68±2.65
AD00269 94.45±3.19 97.49±1.56 93.99±3.79
AD00173 88.60±3.02 93.87±1.67 83.08±5.71
AD00176 77.00±5.59 87.82±3.79 67.18±12.36
AD00378 98.97±0.69 99.72±0.23 99.68±0.11
AD00383 98.86±0.61 99.84±0.05 99.76±0.08
AD00384 96.06±1.61 99.74±0.11 99.51±0.21
表9. 經AAV-HBV轉導小鼠中的HBV siRNA單次3 mpk皮下劑量篩選。將小鼠血清中HBeAg降低的百分比相對於siRNA給藥前HBeAg水平和PBS對照組歸一化。
雙鏈體ID 在siRNA處理後7天、14天和21天小鼠血清中HBsAg的降低百分比
第7天 第14天 第21天
AD00170 74.23±4.07 86.47±4.25 91.93±2.16
AD00263 91.31±1.44 90.83±1.37 88.46±2.17
AD00266 25.13±16.91 42.77±13.33 35.92±17.54
AD00267 79.30±4.46 90.58±1.67 93.04±2.38
AD00268 89.25±6.66 91.13±1.46 88.05±0.93
AD00269 86.86±4.17 83.80±4.01 80.65±3.31
AD00173 77.93±3.51 80.73±4.02 70.20±4.24
AD00176 72.77±6.78 73.11±6.83 69.58±8.28
AD00378 84.63±2.26 93.37±1.47 95.82±1.28
AD00383 85.49±1.62 93.78±1.22 96.29±1.11
AD00384 77.80±5.93 89.81±3.52 95.47±1.61
實施例7. siRNA劑在AAV-HBV小鼠模型中的體內測試
使用AAV-HBV小鼠模型評價HBV siRNA劑的體內效力。用1x10^11 rAAV8-1.3 HBV病毒基因組通過尾靜脈注射感染雄性C57BL/6小鼠（5周齡）。在感染之後14天，採取血液樣品並通過ELISA測定測量小鼠血清中的HBsAg。選擇具有高HBsAg表達水平（log HBsAg IU/ml ＞ 4.9）的小鼠進行研究。在感染之後第18天，每隻小鼠皮下施用單次3 mg/kg劑量的HBV siRNA或PBS對照。在給藥之後第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天、第49天、第56天、第63天、第70天、第77天、第84天和第91天抽取血液樣品。通過ELISA測定測量HBsAg水平，並通過qPCR確定HBV DNA水平。結果總結在圖1和圖2中。在本實施例中，陽性對照是WO2020036862中的AD-81890。 等同方案
雖然本文中已經描述並舉例說明了本發明的數個實施方案，但是本領域普通技術人員將容易想到用於執行本文所述功能和/或獲得本文所述結果和/或一個或更多個優點的多種其他方式和/或結構，並且每個這樣的變化和/或修改均被認爲在本發明的範圍內。更一般地，本領域技術人員將容易理解，本文中所述的所有參數、尺寸、材料和配置旨在是示例性的，並且實際的參數、尺寸、材料和/或配置將取决於使用本發明的教導的一個或更多個具體應用。本領域技術人員將認識到或僅使用常規實驗就能够確定本文中所述的本發明具體實施方案的許多等同方案。因此，應理解，前述實施方案僅以實例的方式呈現，並且在所附權利要求書及其等同方案的範圍內，本發明可以以不同於具體描述且要求保護的方式來實施。本發明涉及本文中所述的每種單獨特徵、系統、物品、材料和/或方法。另外，如果這樣的特徵、系統、物品、材料和/或方法不相互不一致，則兩種或更多種這樣的特徵、系統、物品、材料和/或方法的任意組合均包括在本發明的範圍內。
本文中定義和使用的所有定義應理解爲優先於字典定義、通過引用併入的文件中的定義和/或所定義術語的一般含義。
除非明確地指出相反，否則如本文在說明書和權利要求書中使用的沒有數量詞修飾的名詞應理解成意指“至少一個/種”。
如本文在說明書和權利要求書中使用的短語“和/或”應理解爲意指如此連接的要素中的“任一者或二者”，即所述要素在一些情况下聯合存在，而在另一些情况下分離存在。除非明確指出相反，否則除由“和/或”短語明確確定的要素之外可以任選地存在其他要素，不管與這些明確確定的要素相關還是不相關。
本申請中引用或參考的所有參考文獻、專利和專利申請以及出版物在此通過引用整體併入本文。
圖1是示出在單次皮下給藥3 mg/kg siRNA化合物之後AAV-HBV小鼠血清中的HBsAg水平的圖。
圖2是示出在單次皮下給藥3 mg/kg siRNA化合物之後AAV-HBV小鼠血清中的HBV DNA水平的圖。
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Claims (106)

  1. 用於抑制細胞中乙型肝炎病毒（HBV）表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，其中所述dsRNA劑包含有義鏈和反義鏈，並且任選地包含靶向配體，所述反義鏈中的第2至18位核苷酸包含HBV RNA轉錄物的互補區，其中所述互補區包含與表1至表4之一中列出的反義序列之一存在0、1、2或3個核苷酸差異的至少15個連續核苷酸。
  2. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述HBV RNA轉錄物的互補區包含與表1至表4之一中列出的反義序列之一存在不超過3個核苷酸差異的至少15、16、17、18或19個連續核苷酸。
  3. 權利要求1或2所述的dsRNA劑，其中dsRNA的所述反義鏈與SEQ ID NO: 673的任一個靶區域至少基本上互補，並且在表1至表4的任一個中提供。
  4. 權利要求3所述的dsRNA劑，其中dsRNA的所述反義鏈與SEQ ID NO: 673的任一個靶區域完全互補，並且在表1至表4的任一個中提供。
  5. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含表1至表4的任一個中所示的有義鏈序列，其中所述有義鏈序列與所述dsRNA劑中的反義鏈序列至少基本上互補。
  6. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含表1至表4的任一個中所示的有義鏈序列，其中所述有義鏈序列與所述dsRNA劑中的反義鏈序列完全互補。
  7. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含表1至表4的任一個中所示的反義鏈序列。
  8. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含表1至表4的任一個中的雙鏈體序列所示的序列。
  9. 權利要求1所述的dsRNA，其中所述dsRNA劑包含至少一個經修飾核苷酸。
  10. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述反義鏈的所有或基本上所有核苷酸均是經修飾核苷酸。
  11. 權利要求9或10所述的dsRNA劑，其中所述至少一個經修飾核苷酸包含：2’-O-甲基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脫氧核苷酸、2’3’-seco核苷酸模擬物、鎖核苷酸、解鎖核酸核苷酸（UNA）、二醇核酸核苷酸（GNA）、2’-F-***糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2’-OMe核苷酸、反向2’-脫氧核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸，及3’-OMe核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團的核苷酸，或者與膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、氨基磷酸酯，或包含非天然鹼基的核苷酸。
  12. 權利要求9或10所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑在所述反義鏈的5’末端包含E-乙烯基膦酸酯核苷酸。
  13. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  14. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  15. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述反義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  16. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  17. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述反義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  18. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈和所述反義鏈的所有或基本上所有核苷酸均是經修飾核苷酸。
  19. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中經修飾有義鏈是表2至表4之一中所示的經修飾有義鏈序列。
  20. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中經修飾反義鏈是表2至表4之一中所示的經修飾反義鏈序列。
  21. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈與所述反義鏈互補或基本上互補，並且所述互補區的長度爲16至23個核苷酸。
  22. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述互補區的長度爲19至21個核苷酸。
  23. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中每條鏈的長度不超過30個核苷酸。
  24. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中每條鏈的長度不超過25個核苷酸。
  25. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中每條鏈的長度不超過23個核苷酸。
  26. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含至少一個經修飾核苷酸並且還包含一個或更多個靶向基團或連接基團。
  27. 權利要求26所述的dsRNA劑，其中所述一個或更多個靶向基團或連接基團與所述有義鏈綴合。
  28. 權利要求26或27所述的dsRNA劑，其中所述靶向基團或連接基團包含N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）。
  29. 權利要求26或27所述的dsRNA劑，其中所述靶向基團具有以下結構： 。
  30. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含與所述有義鏈的5’末端綴合的靶向基團。
  31. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含與所述有義鏈的3’末端綴合的靶向基團。
  32. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述反義鏈在3’末端包含一個反向無鹼基殘基。
  33. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈在3’或/和5’末端包含一個或兩個反向無鹼基殘基。
  34. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑具有兩個平末端。
  35. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中至少一條鏈包含具有至少1個核苷酸的3’突出端。
  36. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中至少一條鏈包含具有至少2個核苷酸的3’突出端。
  37. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 281、290、295、300、304、306、307、331、557、567、569、571、572、573、560、563、607、628至637或918至921，優選SEQ ID NO: 557、607、631、918、919或921。
  38. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述反義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 419、428、433、438、442、444、445、469、582、592、594、596、597、598、585、588、642、663至672或922至925，優選SEQ ID NO: 582、642、666、922、923或925。
  39. 權利要求1所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含SEQ ID NO: 281和SEQ ID NO: 419；SEQ ID NO: 290和SEQ ID NO: 428；SEQ ID NO: 295和SEQ ID NO: 433；SEQ ID NO: 300和SEQ ID NO: 438；SEQ ID NO: 304和SEQ ID NO: 442；SEQ ID NO: 306和SEQ ID NO: 444；SEQ ID NO: 307和SEQ ID NO: 445；SEQ ID NO: 331和SEQ ID NO: 469；SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582；SEQ ID NO: 567和SEQ ID NO: 592；SEQ ID NO: 569和SEQ ID NO: 594；SEQ ID NO: 571和SEQ ID NO: 596；SEQ ID NO: 572和SEQ ID NO: 597；SEQ ID NO: 573和SEQ ID NO: 598；SEQ ID NO: 560和SEQ ID NO: 585；SEQ ID NO: 563和SEQ ID NO: 588；SEQ ID NO: 607和SEQ ID NO: 642；SEQ ID NO: 628和SEQ ID NO: 663；SEQ ID NO: 629和SEQ ID NO: 664；SEQ ID NO: 630和SEQ ID NO: 665；SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666；SEQ ID NO: 632和SEQ ID NO: 667；SEQ ID NO: 633和SEQ ID NO: 668；SEQ ID NO: 634和SEQ ID NO: 669；SEQ ID NO: 635和SEQ ID NO: 670；SEQ ID NO: 636和SEQ ID NO: 671；或SEQ ID NO: 637和SEQ ID NO: 672；SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922、SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923、SEQ ID NO: 920和SEQ ID NO: 924，或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925；優選SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582；SEQ ID NO: 607和SEQ ID NO: 642、SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666、SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922、SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923，或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925。
  40. 組合物，其包含權利要求1至39中任一項所述的dsRNA劑中的一種、兩種、三種或更多種dsRNA劑。
  41. 權利要求40所述的組合物，其還包含可藥用載體。
  42. 權利要求41所述的組合物，其還包含一種或更多種另外的治療劑。
  43. 權利要求42所述的組合物，其中所述組合物被包裝在藥盒、容器、包裝物、分配器、預填充注射器或小瓶中。
  44. 權利要求40所述的組合物，其中所述組合物被配製成用於皮下施用或被配製成用於靜脈內（IV）施用。
  45. 權利要求40所述的組合物，其中至少一種所述dsRNA劑的有義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 281、290、295、300、304、306、307、331、557、567、569、571、572、573、560、563、607、628至637或918至921，優選SEQ ID NO: 557、607、631、918、919或921。
  46. 權利要求40所述的組合物，其中至少一種所述dsRNA劑的反義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 419、428、433、438、442、444、445、469、582、592、594、596、597、598、585、588、642、663至672，或922至925，優選SEQ ID NO: 582、642、666、922、923或925。
  47. 權利要求40所述的組合物，其中至少一種所述dsRNA劑包含：SEQ ID NO: 281和SEQ ID NO: 419；SEQ ID NO: 290和SEQ ID NO: 428；SEQ ID NO: 295和SEQ ID NO: 433；SEQ ID NO: 300和SEQ ID NO: 438；SEQ ID NO: 304和SEQ ID NO: 442；SEQ ID NO: 306和SEQ ID NO: 444；SEQ ID NO: 307和SEQ ID NO: 445；SEQ ID NO: 331和SEQ ID NO: 469；SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582；SEQ ID NO: 567和SEQ ID NO: 592；SEQ ID NO: 569和SEQ ID NO: 594；SEQ ID NO: 571和SEQ ID NO: 596；SEQ ID NO: 572和SEQ ID NO: 597；SEQ ID NO: 573和SEQ ID NO: 598；SEQ ID NO: 560和SEQ ID NO: 585；SEQ ID NO: 563和SEQ ID NO: 588；SEQ ID NO: 628和SEQ ID NO: 663；SEQ ID NO: 629和SEQ ID NO: 664；SEQ ID NO: 630和SEQ ID NO: 665；SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666；SEQ ID NO: 632和SEQ ID NO: 667；SEQ ID NO: 633和SEQ ID NO: 668；SEQ ID NO: 634和SEQ ID NO: 669；SEQ ID NO: 635和SEQ ID NO: 670；SEQ ID NO: 636和SEQ ID NO: 671；SEQ ID NO: 637和SEQ ID NO: 672、SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922；SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923；SEQ ID NO: 920和SEQ ID NO: 924；或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925；優選SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582、SEQ ID NO: 607和SEQ ID NO: 642、SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666、SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922、SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923，或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925。
  48. 細胞，其包含權利要求1至39中任一項所述的dsRNA劑。
  49. 權利要求48所述的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞，任選地是人細胞。
  50. 抑制細胞中乙型肝炎病毒（HBV）基因表達的方法，所述方法包括： （i）製備包含有效量的一種或更多種權利要求1至39中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑的細胞或權利要求40至47中任一項所述的組合物。
  51. 權利要求50所述的方法，其還包括： （ii）將權利要求50（i）中製備的所述細胞維持足以獲得HBV基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制所述細胞中HBV基因的表達；抑制所述細胞中HBV的複製；以及降低所述細胞中HBV抗原的水平。
  52. 權利要求51所述的方法，其中一種或更多種HBV抗原是HBcAg、HBsAg和HBeAg。
  53. 權利要求50或51所述的方法，其中所述細胞在對象中並且將所述dsRNA劑皮下施用於所述對象。
  54. 權利要求50或51所述的方法，其中所述細胞在對象中並且通過IV施用將所述dsRNA劑施用於所述對象。
  55. 權利要求50至54中任一項所述的方法，其中將2、3、4或更多種dsRNA劑施用於所述對象。
  56. 權利要求50至55中任一項所述的方法，其還包括在將所述dsRNA劑施用於所述對象之後評估對HBV基因的抑制，其中用於所述評估的手段包括： （i）確定所述對象中HBV相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵，以及 （ii）將所確定的生理特徵與所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與所述HBV相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較，其中所述比較指示對所述對象中HBV基因表達的抑制的存在或不存在。
  57. 權利要求56所述的方法，其中所述對照生理特徵是感染HBV且未施用所述dsRNA劑的對象的生理特徵。
  58. 權利要求57所述的方法，其中所述對象中所確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：所述對象中丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平、所述對象中天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平；所述對象中的HBV病毒載量；所述對象中的HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）水平；所述對象中一種或更多種HBV抗原的水平；所述對象中HBcAg、HBsAg和HBeAg中一種或更多種的水平；所述對象中一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體的存在、不存在和/或水平。
  59. 權利要求56所述的方法，其中所述生理特徵是在從所述對象獲得的生物樣品中確定的。
  60. 權利要求59所述的方法，其中所述生物樣品包含以下中的一種或更多種：血清樣品、組織樣品、細胞樣品和肝樣品。
  61. 權利要求56所述的方法，其中與所述生理特徵的對照水平相比，所述對象中所確定的生理特徵是異常的。
  62. 權利要求61所述的方法，其中與所述HBV相關疾病或病症的對照生理特徵和/或者所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比，所述對象中以下一種或更多種的水平被確定在統計學上顯著更高指示所述對象中HBV基因表達的狀態：ALT；AST；HBV病毒載量；HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg、HBsAg和HBeAg中的一種或更多種；以及一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體。
  63. 權利要求62所述的方法，其中所述對照生理特徵是感染HBV且未施用所述dsRNA劑的對象的生理特徵。
  64. 權利要求56所述的方法，其中所述對象中以下一種或更多種的降低指示所述對象中HBV基因表達的降低：ALT；AST；HBV病毒載量；HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg；HBsAg；和HBeAg。
  65. 權利要求56所述的方法，其中與所述HBV相關疾病或病症的對照生理特徵和/或所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比，所述對象中抗乙型肝炎病毒抗體的增加指示所述對象中HBV基因表達的降低。
  66. 權利要求56所述的方法，其中所述HBV相關疾病或病症是以下中的一種或更多種：其中所述疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）、肝損傷、肝硬化、急性乙型肝炎、急性暴發性肝炎以及肝纖維化、肝炎症和肝細胞癌。
  67. 抑制對象中HBV基因表達的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的一種或更多種權利要求1至39中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑或權利要求40至47中任一項所述的組合物。
  68. 權利要求67所述的方法，其中將兩種、三種、四種或更多種所述dsRNA劑施用於所述對象。
  69. 權利要求67或68所述的方法，其中所述dsRNA劑皮下施用於所述對象。
  70. 權利要求67或68所述的方法，其中所述dsRNA劑通過IV施用而施用於所述對象。
  71. 權利要求67至70中任一項所述的方法，其還包括在施用所述一種或更多種dsRNA劑之後評估對HBV基因的抑制，其中用於所述評估的手段包括： （i）確定所述對象中HBV相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵，以及 （ii）將所確定的生理特徵與所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與所述HBV相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較， 其中所述比較指示對所述對象中HBV基因表達的抑制的存在或不存在。
  72. 權利要求71所述的方法，其中所述對象中所確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：所述對象中丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平、所述對象中天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平；所述對象中的HBV病毒載量；所述對象中的HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）水平；所述對象中一種或更多種HBV抗原的水平；所述對象中HBcAg、HBsAg和HBeAg中一種或更多種的水平；所述對象中一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體的存在、不存在和/或水平。
  73. 權利要求71所述的方法，其中所述生理特徵是在從所述對象獲得的生物樣品中確定的。
  74. 權利要求73所述的方法，其中所述生物樣品包含以下中的一種或更多種：血清樣品、細胞樣品、組織樣品和肝樣品。
  75. 權利要求71所述的方法，其中與所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與所述HBV相關疾病或病症的對照生理特徵相比，所述對象中所確定的生理特徵更加異常。
  76. 權利要求73所述的方法，其中與所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與所述HBV相關疾病或病症的對照生理特徵相比，所述對象中以下一種或更多種的水平被確定在統計學上顯著更高、更低或未變化指示所述對象中HBV基因表達的狀態：ALT；AST；HBV病毒載量；HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg、HBsAg和HBeAg中的一種或更多種；以及一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體。
  77. 權利要求71所述的方法，其中所述對象中以下一種或更多種的降低指示所述對象中HBV基因表達的降低：ALT；AST；HBV病毒載量；HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg；HBsAg；和HBeAg。
  78. 權利要求76所述的方法，其中與所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與所述HBV相關疾病或病症的對照生理特徵相比，所述對象中抗乙型肝炎病毒抗體的增加指示所述對象中HBV基因表達的降低。
  79. 權利要求71所述的方法，其中所述HBV相關疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、急性乙型肝炎、肝細胞癌、肝損傷、肝硬化、急性暴發性肝炎、終末期肝病、肝纖維化、肝炎症和丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）。
  80. 治療與乙型肝炎病毒（HBV）蛋白的存在相關的疾病或病症的方法，所述方法包括向對象施用有效量的一種或更多種權利要求1至39中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，或權利要求40至47中任一項所述的組合物，以抑制編碼所述HBV蛋白的HBV基因的表達。
  81. 權利要求80所述的方法，其中所述方法包括向所述對象施用兩種、三種、四種或更多種dsRNA劑。
  82. 權利要求80或81所述的方法，其中所述疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）、肝損傷、肝硬化、急性乙型肝炎、急性暴發性肝炎、肝炎症、肝纖維化和肝細胞癌。
  83. 權利要求80或81所述的方法，其還包括向所述對象施用另外的治療方案。
  84. 權利要求81所述的方法，其中所述另外的治療方案包括：向所述對象施用一種或更多種：HBV反義多核苷酸、另外的HBV dsRNA治療劑、非HBV dsRNA治療劑、HBV非dsRNA治療劑以及行爲改變。
  85. 權利要求84所述的方法，其中所述非HBV dsRNA治療劑是以下中的一種或更多種：抗病毒劑、抗病毒核苷或核苷酸類似物（NUC）、病毒聚合酶抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、免疫刺激劑、治療性疫苗、病毒進入抑制劑、抑制HBsAg分泌或釋放的寡核苷酸、衣殼抑制劑、共價閉合環狀（ccc）HBV DNA抑制劑。
  86. 權利要求85所述的方法，其中所述NUC是：富馬酸替諾福韋酯（TDF）、替諾福韋艾拉酚胺、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋（ETV），或替比夫定。
  87. 權利要求85所述的方法，其中所述免疫刺激劑是聚乙二醇化干擾素α2a（PEG-IFN-a2a）、干擾素α-2b、重組人白介素-7、Toll-樣受體7（TLR7）激動劑，或檢查點抑制劑（例如，PD1抑制劑）。
  88. 權利要求80所述的方法，其中所述一種或更多種dsRNA劑皮下施用於所述對象。
  89. 權利要求80所述的方法，其中所述一種或更多種dsRNA劑通過IV施用而施用於所述對象。
  90. 權利要求80至89中任一項所述的方法，其還包括確定所施用的一種或更多種雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑在所述對象中的效力。
  91. 權利要求90所述的方法，其中確定在所述對象中的治療效力的手段包括： （i）確定所述對象中HBV相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵，以及 （ii）將所確定的生理特徵與所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵進行比較， 其中所述比較指示向所述對象施用所述雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑的效力的存在、不存在和水平中的一種或更多種。
  92. 權利要求91所述的方法，其中所述對象中所確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：所述對象中丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平、所述對象中天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平；所述對象中的HBV病毒載量；所述對象中的HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）水平；所述對象中一種或更多種HBV抗原的水平；所述對象中HBcAg、HBsAg和HBeAg中一種或更多種的水平；所述對象中一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體的存在、不存在和/或水平。
  93. 權利要求91所述的方法，其中所述生理特徵是在從所述對象獲得的生物樣品中確定的。
  94. 權利要求93所述的方法，其中所述生物樣品包含以下中的一種或更多種：血清樣品、細胞樣品、組織樣品和肝樣品。
  95. 權利要求91所述的方法，其中所述對象中所確定的生理特徵與所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵或所述生理特徵的對照水平相比是不同的。
  96. 權利要求95所述的方法，其中與所述HBV相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比，所述對象中以下一種或更多種的水平被確定在統計學上顯著更低指示所述對象中HBV基因表達降低的狀態：ALT；AST；HBV病毒載量；HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）；一種或更多種HBV抗原；HBcAg、HBsAg和HBeAg中的一種或更多種。
  97. 權利要求95所述的方法，其中與基線治療前抗乙型肝炎病毒抗體或抗乙型肝炎病毒抗體的對照水平相比，所述對象中抗乙型肝炎病毒抗體的增加指示所述對象中HBV基因表達的降低。
  98. 權利要求91至97中任一項所述的方法，其中所述HBV相關疾病或病症是以下中的一種或更多種：乙型肝炎、慢性乙型肝炎、急性乙型肝炎、肝細胞癌、肝損傷、肝硬化、終末期肝病、急性暴發性肝炎、肝炎症、肝纖維化和丁型肝炎病毒感染（δ肝炎或HDV）。
  99. 與對象中HBV蛋白的基線治療前水平相比降低所述對象中HBV蛋白水平的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的一種或更多種權利要求1至39中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，或權利要求40至47中任一項所述的組合物，以降低HBV基因表達的水平。
  100. 權利要求99所述的方法，其中所述dsRNA劑皮下施用於所述對象或通過IV施用而施用於所述對象。
  101. 與對象中乙型肝炎病毒（HBV）相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比改變所述對象中所述HBV相關疾病或病症的生理特徵的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的一種或更多種權利要求1至39中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，或權利要求40至47中任一項所述的組合物，以改變所述對象中所述HBV相關疾病或病症的生理特徵。
  102. 權利要求101所述的方法，其中所述一種或更多種dsRNA劑皮下施用於所述對象或通過IV施用而施用於所述對象。
  103. 權利要求101所述的方法，其中所述生理特徵是在所述對象中確定的生理特徵中的一種或更多種，其是以下中的一種或更多種：所述對象中丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平；所述對象中天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平；所述對象中的HBV病毒載量；所述對象中的HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）水平；所述對象中一種或更多種HBV抗原的水平；所述對象中HBcAg、HBsAg和HBeAg中的一種或更多種的水平；所述對象中一種或更多種抗乙型肝炎病毒抗體的存在、不存在和/或水平。
  104. 權利要求50、67、80、99和101中任一項所述的方法，其中所述dsRNA劑的有義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 281、290、295、300、304、306、307、331、557、567、569、571、572、573、560、563、607、628至637或918至921，優選SEQ ID NO: 557、607、631、918、919或921。
  105. 權利要求50、67、80、99和101中任一項所述的方法，其中所述dsRNA劑的反義鏈包含以下之一：SEQ ID NO: 419、428、433、438、442、444、445、469、582、592、594、596、597、598、585、588、642、663至672或922至925，優選SEQ ID NO: 582、642、666、922、923或925。
  106. 權利要求50、67、80、99和101中任一項所述的方法，其中所述dsRNA劑包含SEQ ID NO: 281和SEQ ID NO: 419；SEQ ID NO: 290和SEQ ID NO: 428；SEQ ID NO: 295和SEQ ID NO: 433；SEQ ID NO: 300和SEQ ID NO: 438；SEQ ID NO: 304和SEQ ID NO: 442；SEQ ID NO: 306和SEQ ID NO: 444；SEQ ID NO: 307和SEQ ID NO: 445；SEQ ID NO: 331和SEQ ID NO: 469；SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582；SEQ ID NO: 567和SEQ ID NO: 592；SEQ ID NO: 569和SEQ ID NO: 594；SEQ ID NO: 571和SEQ ID NO: 596；SEQ ID NO: 572和SEQ ID NO: 597；SEQ ID NO: 573和SEQ ID NO: 598；SEQ ID NO: 560和SEQ ID NO: 585；SEQ ID NO: 563和SEQ ID NO: 588；SEQ ID NO: 607和SEQ ID NO: 642；SEQ ID NO: 628和SEQ ID NO: 663；SEQ ID NO: 629和SEQ ID NO: 664；SEQ ID NO: 630和SEQ ID NO: 665；SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666；SEQ ID NO: 632和SEQ ID NO: 667；SEQ ID NO: 633和SEQ ID NO: 668；SEQ ID NO: 634和SEQ ID NO: 669；SEQ ID NO: 635和SEQ ID NO: 670；SEQ ID NO: 636和SEQ ID NO: 671；或SEQ ID NO: 637和SEQ ID NO: 672；SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922；SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923；SEQ ID NO: 920和SEQ ID NO: 924；或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925；優選SEQ ID NO: 557和SEQ ID NO: 582；SEQ ID NO: 607和SEQ ID NO: 642；SEQ ID NO: 631和SEQ ID NO: 666；SEQ ID NO: 918和SEQ ID NO: 922；SEQ ID NO: 919和SEQ ID NO: 923；或SEQ ID NO: 921和SEQ ID NO: 925。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2699583A4 (en) * 2011-04-21 2015-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF EXPRESSION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV)
CN103333890B (zh) * 2012-12-21 2015-04-15 厦门成坤生物技术有限公司 治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰制剂
JOP20200092A1 (ar) * 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
EP3228326A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
AU2018331383A1 (en) * 2017-09-14 2020-04-23 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents and compositions for inhibiting expression of angiopoietin-like 3 (ANGPTL3), and methods of use
PE20220561A1 (es) * 2017-10-20 2022-04-13 Dicerna Pharmaceuticals Inc Metodos para el tratamiento de infeccion de hepatitis b
CA3129261A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents for hepatitis b virus infection

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