TW202405170A - 用於抑制補體成分c3蛋白表達的組合物和方法 - Google Patents

用於抑制補體成分c3蛋白表達的組合物和方法 Download PDF

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Abstract

本申請關於補體成分C3蛋白表達的組合物和方法。具體的，本申請提供了可用於補體成分C3基因表達和用於治療C3相關疾病和病症的組合物和方法。提供了可用於降低細胞和對象中C3表達的C3 dsRNA試劑、C3反義多核苷酸試劑、包含C3 dsRNA 試劑的組合物和包含C3反義多核苷酸試劑的組合物。

Description

用於抑制補體成分C3蛋白表達的組合物和方法
本發明的部分實施方案關於可用於抑制補體成分C3蛋白表達的組合物和方法。
在1890年補體被首次發現，是提供了保護宿主免受病原體入侵的先天免疫系統的一部分，是對抗外來病原體的第一道免疫防線。活化補體將導致一系列連續的酶促反應，稱爲補體活化，導致形成强效過敏毒素 C3a和C5a，從而引發過多的從化學吸引到細胞雕亡的生理反應。最初認爲補體在入侵的病原體先天免疫中發揮重要作用，然而，最近越來越多證據揭示，補體也在關於T細胞和B細胞的適應性免疫中起重要作用，有助於消除病原體 (Dunkelberger JR and Song WC. (2010) Cell Res. 20:34; Molina H, et al. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A. 93:3357)；維持免疫原性避免病毒再次入侵以及多種人類的病理狀態(Qu, H, et al. (2009) Mol Immunol. 47:185; Wagner, E. and Frank MM. (2010) No/ Rev Drug Discov. 9:43)。形成補體系統的大多數是蛋白質，包括補體成分蛋白C3(在本文中也稱爲C3)，大量合成並分泌到肝臟中的肝細胞中的血液中，活化系統的炎症反應導致吞噬細胞吸引和調理作用，從而清除病原體、免疫複合物和細胞碎片。
補體成分C3 是補體系統活化途徑的關鍵組成部分，已知補體活化通過三種不同的途徑發生：旁路途經、經典途徑以及凝集蛋白途徑，它們全部會合在所謂的補體成分C3轉化酶複合物的形成中，這些酶複合物將補體成分 C3 蛋白裂解爲 C3a 和 C3b；一旦被裂解，C3b 形成複合物的一部分，複合物反過來將 C5 切割成 C5a 和 C5b；裂解後，C5b 是主要補體途徑效應物，即膜攻擊複合物的關鍵成分之一。 因此，補體成分C3（也稱爲C3）的作用是必不可少的，因爲它在補體活化的所有三種途徑中起作用。
補體系統的異常獲得或遺傳活化以及C3異常或過表達引發許多不同疾病，包括例如：與腎臟相關的C3 腎小球病 (C3G)、免疫複合物介導的腎小球腎炎（IC 介導的 GN），感染後腎小球腎炎 (PIGN)、系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、缺血/再灌注損傷和 IgA 腎病、陣發性夜間血紅蛋白尿 (PNH)、非典型溶血性***候群 (aHUS)、以及其他器官與C3相關的疾病，如視神經脊髓炎 (NMO)、多灶性運動神經病 (MMN)、重症肌無力症力 (MG)、原發性膜性腎病，還已知與補體功能障礙有關其他器官的疾病，例如年齡相關性黃斑變性(AMD)、類風濕性關節炎(RA)、抗中性粒細胞胞漿自身抗體相關血管炎(ANCA-AV)、牙周疾病和牙周病、瘧疾貧血、敗血症以及神經退行性疾病。
目前，可用於治療補體成分C3相關疾病的治療，這些疾病需要耗時和侵入性管理，費用高昂，具有巨大臨床未滿足的需求；因此，本領域需要給予患有補體成分 C3 相關疾病的患者替代療法或者聯合療法。
根據本發明的一個方面，提供了一種用於抑制補體成分C3表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑，該dsRNA試劑包含正義鏈和反義鏈，在反義鏈中的核苷酸位置2至18處包含與 C3 RNA轉錄物互補的區域，其中互補區域包含與表1-3中所列出的反義序列之一相差0、1、2或3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且任選地包含靶向配體。
在一些實施方案中，與C3 RNA轉錄物互補的區域包含與表1-3中所列出的反義序列之一相差不超過3個核苷酸的至少15、16、17、18或19個連續核苷酸。
在一些實施方案中，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 1的任意靶區域至少基本互補，並且在表1-3之一中提供。
在一些實施方案中，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 1的任意靶區域完全互補並且在表1-3之一中提供。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包含表1-3中所列出的任一個正義鏈序列，其中正義鏈序列與dsRNA試劑中的反義鏈序列至少基本上互補。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包含表1-3中列出的任一個正義鏈序列，其中正義鏈序列與dsRNA試劑中的反義鏈序列完全互補。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包含表1-3中列出的任一個反義鏈序列。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包含表1-3中作爲雙鏈體序列列出的任一個序列。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包含至少一個修飾的核苷酸。
在一些實施方案中，反義鏈的所有核苷酸或基本上所有核苷酸都是修飾的核苷酸。在一些實施方案中，至少一種修飾的核苷酸包括：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-脫氧核苷酸、2',3'-seco核苷酸模擬物、鎖核苷酸、開環核酸核苷酸（unlocked nucleic acid nucleotide, UNA）、乙二醇核酸核苷酸（glycol nucleic acid nucleotide，GNA）、2'-F-***糖核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2'-OMe 核苷酸、反向2'-脫氧核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸和3'-OMe核苷酸、包括5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸、或與膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、氨基磷酸酯或包含核苷酸的非天然鹼基。在一些實施方案中，反義鏈包含15個或更多個獨立選自2'-O-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的修飾核苷酸，其中少於6個2'-氟核苷酸修飾的核苷酸。在某些實施方案中，反義鏈包含3個或5個2'-氟核苷酸，優選地，反義鏈包含5個2'-氟核苷酸。 在一些實施方案中，正義鏈包含15個或更多個獨立選自2'-O-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的修飾核苷酸，其中少於4個2'-氟核苷酸修飾的核苷酸。 在某些實施方案中，正義鏈包含 3 個 2'-氟核苷酸。 在一些實施方案中，反義鏈包含15個或更多個獨立選自2'-O-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的修飾核苷酸，其中至少16個修飾核苷酸是2'-O-甲基核苷酸並且位於反義鏈5'端的第2、7、12、14和/或16位是2'-氟核苷酸修飾的核苷酸（從反義鏈5'第一個配對的核苷酸開始計算）。在一些實施例中，正義鏈包含獨立地選自2' -O-甲基核苷酸和2' - 氟核苷酸的 15 個或更多修飾核苷酸，其中至少 18 個修飾核苷酸是2' -O-甲基核苷酸並且位於正義鏈3'端的第9、11和/或13位是2'-氟核苷酸修飾的核苷酸(從正義鏈3'第一個配對的核苷酸開始計算)。在一些實施例中，反義鏈包含在從5'末端到3'末端的方向上，反義鏈的第2、7、12、14和16位的核苷酸是2'-氟修飾的核苷酸，從反義鏈5'端第一個配對的核苷酸開始計算，並且每個反義鏈中其他位置的核苷酸獨立地是非氟修飾的核苷酸。在一些實施方案中，反義鏈在從5'末端到3'末端的方向上包含位置反義鏈的第2、5、12、14和16位是2'-氟修飾的核苷酸，從反義鏈5'第一個配對的核苷酸開始計算，並且反義鏈中其他位置的每個核苷酸獨立地是非氟修飾的核苷酸。 在一些實施例中，正義鏈包含在從3'末端到5'末端的方向上，在正義鏈的位置9、11和13的核苷酸是2'-氟修飾的核苷酸，從正義鏈3'端第一個配對的核苷酸開始計算，並且每個核苷酸在有義鏈中的其他位置獨立地是非氟修飾的核苷酸。在一些實施方案中，反義鏈在從5'末端到3'末端的方向上包含位置反義鏈的第7位是UNA修飾的核苷酸，從反義鏈5'第一個配對的核苷酸開始計算。
在一些實施方案中，一種用於抑制補體成分C3表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑，該dsRNA試劑包含正義鏈和反義鏈，在反義鏈中的核苷酸位置2至18處包含與C3RNA轉錄物互補的區域，反義鏈與正義鏈完全或者部分互補，並且任選地包含靶向配體，其中每條鏈的長度爲17至40個核苷酸，其中有義鏈序列包含由式(I)表示: 5′-(N′ L) n′N′ LN′ LN′ LN′ LN′ LN′ FN′ LN′ FN′ LN′ FN′ LN′ LN′ LN′ LN′ LN′ LN′ L(N′ L) m′-3′   (I) 其中:每個N′ F表示一個2'-氟修飾的核苷酸；每個N′ L獨立代表修飾或未修飾的核苷酸但不代表2'-氟修飾的核苷酸，n'爲0-7的整數, m'爲0-3的整數。在某些實施方案中，m′爲1。在某些實施方案中，n′爲3 ，m′爲1；或者 n′爲0 ，m′爲0；或 n′爲3，m′爲3。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包括在引導鏈的5'末端處的E-乙烯基膦酸酯核苷酸。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，正義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，反義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，正義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，反義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在一些實施方案中，正義鏈和反義鏈的所有或基本上所有核苷酸都是修飾的核苷酸。
在一些實施方案中，修飾的正義鏈是表2和/或表3中列出的修飾的正義鏈序列。在一些實施方案中，修飾的反義鏈是表2和/或表3中列出的修飾的反義鏈序列。
在一些實施方案中，正義鏈與反義鏈互補或基本互補，並且互補區域的長度在16至23個核苷酸之間。在一些實施方案中，互補區域的長度爲19-21個核苷酸。在一些實施方案中，互補區域的長度爲14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施方案中，dsRNA試劑中每條鏈的長度不超過40個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過30個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過25個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過23個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過21個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度爲15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22或 23個核苷酸。
在一些實施方案中，所述C3 RNA轉錄物是SEQ ID NO：1。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包含至少一種修飾的核苷酸並且還包含一個或更多個靶向基團或連接基團。
在一些實施方案中，一個或更多個靶向基團或連接基團與正義鏈綴合。在一些實施方案中，靶向基團或連接基團包括N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）。
在一些實施方案中，靶向基團或連接基團如式(X)所示的結構，包括靶向部分、鏈接鍵以及接頭W，其中靶向部分選自N-乙醯基-半乳糖胺衍生物（GalNAc），其通過鏈接鍵與接頭W鏈接，接頭W具有如式(XI)所示的結構，X選自O、NH 2或者S，Y ﹣選自：O ﹣、S ﹣、甲基或者NRaRb，Ra和Rb分別獨立的選自氫、取代或者未取代的C 1-C 6的烷基、取代或者未取代的C 3-C 6的環烷基，或者Ra和Rb與附著的原子一起鏈接形成含有1-3個N、O、S雜原子組成的3-12元雜環烷基， 式（X） (式XI)。
在一些優選的實施例中，取代或者未取代的C 1-C 6的烷基、取代或者未取代的C 3-C 6的環烷基中，所述的取代基選自羥基、氨基。在一些實施方案中，X選自O或者S，Y ﹣選自：O ﹣、S ﹣。在一些實施方案中，靶向基團中的鏈接鍵選自聚乙二醇、任選取代的C 2-C 12烷基, 取代或者未取代的C 3-C 12環烷基、取代或者未取代的C 3-C 12雜環烷基、取代或者未取代的C 3-C 12醯胺。在一些實施方案中，取代或者未取代的C 2-C 12烷基, 取代或者未取代的C 3-C 12環烷基、取代或者未取代的C 3-C 12雜環烷基、取代或者未取代的C 3-C 12醯胺中，所述的取代基選自羥基、羰基。
在一些實施方案中，靶向基團中的鏈接鍵優選自以下片段： 、 、 、 、 、 和 , 其中每個m獨立的爲1-6的整數，每個n、o、p獨立的爲0或者1，每個q 1與q 2分別獨立的爲0、1或者2。
在一些實施方案中，靶向基團中的鏈接鍵更優選自以下片段： 、 、 、 、 、 。
在一些實施方案中，靶向基團中的靶向部分具有爲以下結構片段， n''分別獨立爲1或者2。
在一些實施方案中，靶向基團具有以下結構：
GLO-1 GLS-1
GLO-2 GLS-2
GLO-3 GLS-3
GLO-4 GLS-4
GLO-5 GLS-5
GLO-6 GLS-6
GLO-7 GLS-7
GLO-8 GLS-8
GLO-9 GLS-9
GLO-10 GLS-10
GLO-11 GLS-11
GLO-12 GLS-12
GLO-13 GLS-13
GLO-14 GLS-14
GLO-15 GLS-15
GLO-16 GLS-16   。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包含與正義鏈的5'-末端綴合的靶向基團。在一些實施方案中，dsRNA試劑包含與正義鏈的3'-末端綴合的靶向基團。
在一些實施方案中，反義鏈在3'-末端包含一個反向無鹼基殘基。在一些實施方案中，正義鏈在3'或/和5'末端包含一個或兩個反向無鹼基殘基。
在一些實施方案中，dsRNA試劑具有兩個平末端。
在一些實施方案中，至少一條鏈包含至少1個核苷酸長的3'突出端。在一些實施方案中，至少一條鏈包含至少2個核苷酸長的3'突出端。在一個實施例中，正義鏈在3’‑末端和/或5’‑末端具有1‑10個核苷酸突出端，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸的突出端。
本發明的另一個方面，提供了補體成分C3表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑，該dsRNA試劑包含正義鏈和反義鏈，其中每條鏈的長度是14個至30個核苷酸，在反義鏈中的核苷酸位置2至18處包含與 C3 RNA轉錄物互補的區域，其中互補區域包含與式I中所列出的反義序列之一相差0、1、2或3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且任選地包含靶向配體: 雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑反義鏈: 5’ -N a-(A 1A 2A 3A 4)i-N b–(B 1B 2B 3B 4) -N b-(C 1C 2C 3C 4C 5)j -N a- 3’ 其中: i和 j，獨立選自0或者1; 每個 N a和 N b分別獨立的代表 0-17寡核苷酸； A 1A 2A 3A 4表示四個連續的核苷酸依次被代表小寫2'-OMe、大寫2'-氟、小寫2'-OMe、小寫2'-OMe修飾的一個基序，優選的A 1與A 2之間、A 2與A 3之間進一步均包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯； B 1B 2B 3B 4表示四個連續的核苷酸均被小寫2'-OMe修飾的一個基序； C 1C 2C 3C 4C 5表示五個連續的核苷酸均被小寫2'-OMe修飾的的一個基序，優選的C 3與C 4之間、 C 4與C 5之間進一步包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在一些實施例中， N a分別獨立的代表0個寡核苷酸， N b分別獨立的代表2-5個經本文所用化學修飾的寡核苷酸，i和 j分別代表1。
在一些實施方案中，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 1的任意靶區域至少基本互補。在一些實施方案中，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 1的任意靶區域完全互補。在一些實施方案中， dsRNA任一項所述的正義鏈序列與所述dsRNA試劑中的反義鏈序列至少基本上互補。在一些實施方案中， dsRNA任一項所述的正義鏈序列與所述dsRNA試劑中的反義鏈序列完全互補。
在一些實施方案中，正義鏈所有或基本上所有核苷酸都是修飾的核苷酸。
在一些實施方案中，正義鏈在3'或/和5'末端包含一個或兩個反向無鹼基殘基。
在一些實施方案中，dsRNA試劑具有兩個平末端。在一些實施方案中，至少一條鏈包含至少1個核苷酸長的3'突出端。在一些實施方案中，至少一條鏈包含至少2個核苷酸長的3'突出端。在一個實施例中，正義鏈在3’‑末端和/或5’‑末端具有1‑10核苷酸突出端，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸的突出端。
在一些實施方案中，dsRNA試劑包含至少一種修飾的核苷酸並且還包含一個或更多個靶向基團或連接基團。在一些實施方案中，一個或更多個靶向基團或連接基團與正義鏈綴合。在一些實施方案中，靶向基團或連接基團包括N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）。在一些實施方案中，靶向基團如本文所用，GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-5、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、GLS-10、GLS-11、GLS-12、GLS-13、GLS-14、GLS-15、GLS-16、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16中的任一種。
根據本發明的另一個方面，提供了一種組合物，其包含本發明上述dsRNA試劑方面的任意實施方案。
在某些實施方案中，組合物還包含藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，組合物還包含一種或更多種另外的治療劑。
在某些實施方案中，組合物被包裝在藥盒、容器、包裝物、分配器、預填充注射器或小瓶中。
在一些實施方案中，組合物被配製用於皮下給藥或被配製用於靜脈內（IV）給藥。
根據本發明的另一方面，提供了一種細胞，其包含本發明上述dsRNA試劑方面的任意實施方案。
在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞，任選地是人細胞。
根據本發明的另一方面，提供了一種抑制細胞中C3基因表達的方法，該方法包括：(i)製備包含有效量的上述dsRNA試劑或上述組合物方面的任意實施方案的細胞。
在某些實施方案中，該方法還包括：(ii)將製備的細胞維持足夠的時間以獲得C3基因的mRNA轉錄物的降解，從而抑制細胞中C3基因的表達。
在一些實施方案中，細胞在對象體內並且dsRNA試劑經皮下施用於對象。
在一些實施方案中，細胞在對象體內並且dsRNA試劑通過IV給藥施用於對象。
在某些實施方案中，該方法還包括在向對象施用dsRNA 試劑後評估對C3基因的抑制，其中評估的手段包括：(i) 確定對象中C3相關疾病或病症的一個或更多個生理特徵，以及(ii)將所確定的生理特徵與C3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或C3相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較，其中的比較結果指示對象中C3基因表達的抑制存在或不存在。
在一些實施方案中，所確定的生理特徵是在血液中的C3水平；
在一些實施方案中，以陣發性睡眠性血紅蛋白尿 (PNH)一種相對罕見的疾病爲例，包括一種以補體介導的血管內溶血爲特徵的獲得性溶血性貧血、血紅蛋白尿、骨髓衰竭和血栓形成傾向（形成血栓的傾向）所確定的生理特徵。血液中C3水平和/或C3的降低表明對象中C3基因表達的降低。
根據本發明的另一方面，提供了一種抑制對象中C3基因表達的方法，其包括向對象施用有效量的前述dsRNA試劑方面的實施方案或前述組合物的實施方案。
在一些實施方案中，將dsRNA試劑皮下施用於對象。在某些實施方案中，dsRNA試劑通過IV給藥施用於對象。在一些實施方案中，該方法還包括：在施用dsRNA試劑後評估C3基因的抑制，其中評估手段包括：(i) 確定對象的C3相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵；(ii)將確定的生理特徵與C3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或C3相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較；其中比較結果指示對象中C3基因表達的抑制存在或不存在。在一些實施方案中，所確定的生理特徵是在血液中的C3水平；在一些實施方案中，陣發性睡眠性血紅蛋白尿 (PNH) 是一種相對罕見的疾病，包括一種以補體介導的血管內溶血爲特徵的獲得性溶血性貧血、血紅蛋白尿、骨髓衰竭和血栓形成傾向（形成血栓的傾向）所確定的生理特徵。血液中C3水平和/或C3的降低表明對象中C3基因表達的降低。
根據本發明的另一方面，提供了一種治療與C3蛋白相關之疾病或病症的方法，其包括：向對象施用有效量的本發明的前述dsRNA試劑方面的任意實施方案或本發明的前述組合物的任意實施方案，以抑制C3基因表達。
在某些實施方式中，C3相關障礙選自：與腎臟相關的C3 腎小球病 (C3G)、免疫複合物介導的腎小球腎炎（IC 介導的 GN）、感染後腎小球腎炎 (PIGN)、系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、缺血/再灌注損傷和 IgA 腎病、陣發性夜間血紅蛋白尿 (PNH)、非典型溶血性***候群 (aHUS)，以及其他器官與C3相關的疾病，如視神經脊髓炎 (NMO)、多灶性運動神經病 (MMN)、重症肌無力症 (MG)、原發性膜性腎病，還已知與補體功能障礙有關其他器官的疾病，例如年齡相關性黃斑變性(AMD)、類風濕性關節炎(RA)、抗中性粒細胞胞漿自身抗體相關血管炎(ANCA-AV)、牙周疾病和牙周病、瘧疾貧血、敗血症以及神經退行性疾病，優選爲C3 腎小球病 (C3G)、陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性***候群(aHUS)、狼瘡腎炎、IgA腎病(IgA N)和原發性膜性腎病、年齡相關性黃斑變性(AMD)。
在一些實施方案中，該方法還包括：向對象施用另外的治療方案。
在一些實施方案中，另外的治療方案包括C3相關疾病或病症的治療。在某些實施方案中，另外的治療方案包括：向對象施用一種或更多種本發明的C3反義多核苷酸；向對象施用非C3 dsRNA治療劑；以及在對象中進行行爲改變。在一些實施方案中，非C3 dsRNA治療劑是以下中的一種：另外的治療劑，例如抗補體組分C5 抗體或其抗原結合片段（例如依庫珠單抗）、iRNA 靶向補體成分 C5 和/或 C3 肽抑制劑（例如康普辛伐他汀）的藥劑， 從而治療患有將從C3減少中受益的疾病的受試者表達。
在一些實施方案中，將dsRNA試劑皮下施用於對象。在某些實施方案中，dsRNA試劑通過IV給藥施用於對象。在一些實施方案中，該方法還包括確定所施用的雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑在對象中的功效。在一些實施方案中，確定治療在對象中的功效的手段包括：(i) 確定對象中C3相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵；(ii)將確定的生理特徵與C3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵進行比較，其中該比較結果指示對對象施用雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑的功效存在、不存在和水平中的一種或更多種。在一些實施方案中，所確定的生理特徵是在血液中的C3水平；在一些實施方案中，陣發性睡眠性血紅蛋白尿 (PNH) 是一種相對罕見的疾病，包括一種以補體介導的血管內溶血爲特徵的獲得性溶血性貧血、 血紅蛋白尿、骨髓衰竭和血栓形成傾向（形成血栓的傾向）所確定的生理特徵。血液中C3水平和/或溶血的降低表明對對象施用雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑的有效性的存在。
根據本發明的另一方面，提供了與對象中C3蛋白的基線治療前水平相比降低對象中C3蛋白水平的方法，其包括向對象施用有效量的本發明的前述dsRNA試劑方面的任意實施方案或本發明的前述組合物的任意實施方案，以降低C3基因表達的水平。 在一些實施方案中，將dsRNA試劑皮下施用於對象或通過IV施用於對象。
根據本發明的另一方面，提供了與對象中C3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比改變對象中C3相關疾病或病症的生理特徵的方法，該方法包括向對象施用有效量的本發明前述dsRNA試劑方面的任意實施方案或本發明的前述組合物的任意實施方案，以改變對象中C3相關疾病或病症的生理特徵。在一些實施方案中，將dsRNA試劑皮下施用於對象或通過IV施用於對象。在某些實施方案中，生理特徵是在血液中的C3水平；在一些實施方案中，所確定的生理特徵是溶血的降低。 序列說明
雙鏈體AV00375至AV00447顯示在表1中並且顯示了其正義鏈序列。
雙鏈體AV00375至AV00447顯示在表1中並且顯示了其反義鏈序列。
SEQ ID NO: 1是人C3 mRNA [NCBI 參考序列：NM_000064.4]。
在顯示於表2的序列中，化學修飾表示爲：大寫：2'-氟；小寫：2'-OMe；硫代磷酸酯：*；UNA：開環核酸。
在顯示於表3的序列中，體內研究中使用的遞送分子在每條正義鏈的3'或5'末端表示爲“GLX-n”。化學修飾表示爲：大寫：2'-氟；小寫：2'-OMe；硫代磷酸酯：*；UNA：開環核酸；Invab = 反向無鹼基。
本發明的部分實施方案包括能夠抑制補體成分C3基因表達的RNAi試劑，例如但不限於雙鏈(ds)RNAi試劑。本發明的C3 dsRNA試劑可以靶向C3轉錄物，導致C3蛋白表達的抑制。本發明的部分實施方案還包括包含C3 RNAi試劑的組合物和使用該組合物的方法。本文公開的C3 RNAi試劑可接附於遞送化合物以遞送至細胞，包括遞送至肝細胞。本發明的藥物組合物可包含至少一種C3 dsRNA試劑和遞送化合物。在本發明的一些實施方案中，遞送化合物是含GalNAc的遞送化合物。遞送至細胞的C3 RNAi試劑能夠抑制C3基因表達，從而降低基因的C3蛋白産物在細胞中的活性。本發明的dsRNAi試劑可用於治療C3相關疾病和病症。這樣的dsRNAi試劑包括例如表1中所顯示的雙鏈體AV00375至AV00447。在一些實施方案中，優選的dsRNAi試劑包括例如雙鏈體AV00378、AV00383、AV00385、AV00386、AV00388、AV00375、AV00413、AV00416或AV00429。在另一些實施方案中，優選的表2中dsRNAi試劑包括例如雙鏈體AV00378、AV00383、AV00385、AV00386、AV00388、AV00375、AV00413、AV00416或AV00429。
在本發明的一些實施方案中，降低細胞或對象中C3表達分別治療與細胞或對象中C3表達相關的疾病或病症。可通過降低 C3 活性治療的疾病和病症的非限制性實例是：與腎臟相關的C3 腎小球病 (C3G)、免疫複合物介導的腎小球腎炎（IC 介導的 GN）、感染後腎小球腎炎 (PIGN)、系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、缺血/再灌注損傷和 IgA 腎病、陣發性夜間血紅蛋白尿 (PNH)、非典型溶血性***候群 (aHUS)、以及其他器官與C3相關的疾病，如視神經脊髓炎 (NMO)、多灶性運動神經病 (MMN)、重症肌無力症力 (MG)、原發性膜性腎病，還已知與補體功能障礙有關其他器官的疾病，例如年齡相關性黃斑變性(AMD)、類風濕性關節炎(RA)、抗中性粒細胞胞漿自身抗體相關血管炎(ANCA-AV)、牙周疾病和牙周病、瘧疾貧血、敗血症以及神經退行性疾病，優選爲C3 腎小球病 (C3G)、陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性***候群(aHUS)、狼瘡腎炎、IgA腎病(IgA N)和原發性膜性腎病、年齡相關性黃斑變性(AMD)。
下面描述了如何製備和使用包含 C3 單鏈（ssRNA）和雙鏈（dsRNA）試劑的組合物來抑制 C3 基因表達，以及用於治療由C3基因表達引起或調節的疾病和病症的組合物和方法。如本文所用，由C3基因表達的存在和/或水平引起或調節的疾病和/或病症稱爲“C3相關疾病和/或病症”。術語“RNAi”也是本領域已知的，並且可以被稱爲“siRNA”。
如本文所用，術語“RNAi”是指包含RNA並通過RNA誘導的沉默複合物（RISC）途徑介導RNA轉錄物的靶向切割的試劑。如本領域已知的，RNAi靶區域是指在基因轉錄過程中形成的RNA分子的核苷酸序列的連續部分，其包括信使RNA（mRNA），它是初級轉錄産物RNA的加工産物。該序列的靶標部分將至少足夠長以用作在該部分處或附近進行 RNAi定向切割的底物。靶序列可以是8-30個核苷酸長（包括端值）、10-30個核苷酸長（包括端值）、12-25個核苷酸長（包括端值）、15-23個核苷酸長（包括端值）、16 -23 個核苷酸長（包括端值），或18-23個核苷酸長（包括端值），並包括每個規定範圍內的所有較短長度。在本發明的一些實施方案中，靶序列爲9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個核苷酸長。在某些實施方案中，靶序列的長度在9到26個核苷酸之間（包括端值），包括其間的所有子範圍和整數。例如，雖然不意在限制，但在本發明的某些實施方案中，靶序列爲8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長，該序列與C3基因的RNA轉錄物的至少一部分完全或至少基本上互補。
本發明的一些方面包括包含一種或更多種C3 dsRNA試劑和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在本發明的某些實施方案中，如本文所述的C3 RNAi抑制C3蛋白的表達。
本發明的一些實施方案中，藥物組合物包括一種、兩種、三種或更多種獨立的抗C3 dsRNA試劑，並且還可以包括一種或多種獨立選擇的遞送化合物。 在一些實施方案中，將能夠分別靶向C3 mRNA的一個、兩個、三個、四個或更多個不同位置/區域的兩個、三個、四個或更多個抗C3 dsRNA施用於細胞或對象中。
如本文所用，“dsRNA試劑”是指包含RNA或RNA樣（例如，化學修飾的RNA）寡核苷酸分子的組合物，其能夠降解或抑制靶mRNA轉錄物的翻譯。儘管不希望限於特定理論，但本發明的dsRNA試劑可通過RNA干擾機制起作用（即，通過與哺乳動物細胞的RNA干擾途徑機制（RNA誘導的沉默複合物或RISC）相互作用來誘導産生RNA干擾），或通過任何替代機制或途徑起作用。在植物、無脊椎動物和脊椎動物細胞中實現基因沉默的方法是本領域所公知的（參見例如，Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485; Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363; Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309; 以及Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)），其各自的公開內容通過引用整體並入本文。本領域已知的基因沉默手段可與本文提供的公開內容結合使用以實現抑制C3的表達。
本文公開的dsRNA試劑由正義鏈和反義鏈組成，其包括但不限於：短干擾RNA（siRNA）、RNAi試劑、微RNA（miRNA）、短髮夾 RNA（shRNA）和切丁酶（Dicer）底物。本文描述的dsRNA試劑的反義鏈至少部分地與所靶向的mRNA互補，本領域能夠理解，多種長度的dsRNA雙鏈體結構可用於抑制靶基因表達。例如，已知具有19、20、21、22和23個鹼基對的雙鏈體結構的dsRNA可有效誘導RNA干擾（Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）。本領域還已知較短或較長的RNA雙鏈體結構也可有效誘導RNA干擾。本發明的某些實施方案中的C3 dsRNA可以包含至少一條長度至少爲21 nt的鏈，或者雙鏈體可以具有基於表1-4中任何列出的序列之一的長度減1、2、3 nt或更短的長度。與分別在表1-3中列出的dsRNA相比，在其一端或兩端減少4個核苷酸也可以是有效的。在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑可具有來自表1-3的一個或更多個序列的至少15、16、17、18、19、20或更多個連續核苷酸的部分序列，並且它們抑制C3基因表達的能力與由包含全序列（此處也稱爲“親本”序列）的dsRNA産生的抑制水平相差不超過5%、10%、15%、20%、25%或30%。表1-3中公開的正義序列、反義序列和雙鏈體在本文中可以稱爲“親本”序列，意味著表1-3中公開的序列可以被修飾、縮短、延長、包括替換等，如本文所述，所得序列保留其親本序列在本發明的方法和組合物中的全部或至少部分功效。
本發明的組合物和方法的某些實施方案在組合物中包含單鏈RNA和/或將單鏈RNA施用於對象。例如，表1-3任一項中所列的反義鏈可以作爲一種組合物或在一種組合物內，該組合物施用給對象會降低對象中C3多肽活性和/或C3基因的表達。表1-3顯示了某些C3 dsRNA試劑的反義鏈和正義鏈核心延伸鹼基序列。可以包含在本發明的某些組合物中和/或在本發明的某些方法中施用的單鏈反義分子在本文中稱爲“單鏈反義試劑”或“反義多核苷酸試劑”。可以包含在某些組合物中和/或在本發明的某些方法中施用的單鏈正義分子在本文中稱爲“單鏈正義試劑”或“正義多核苷酸試劑”。術語“鹼基序列”在本文中是指沒有化學修飾或遞送化合物的多核苷酸序列。例如，表1所示的正義鏈對應於是表3中的相應鹼基序列；但表3中的相應序列中顯示了各自的化學修飾和遞送化合物。在此公開的序列可以被分配標識符。例如，單鏈正義序列可以用“正義鏈SS#”來標識；單鏈反義序列可以用“反義鏈AS#”來標識；並且包含正義鏈和反義鏈的雙鏈體可以用“雙鏈體AD#”來標識。
表1包括正義鏈和反義鏈，並提供了由表1中同一行上的正義鏈和反義鏈形成的雙鏈體的標識號。在本發明的某些實施方案中，反義序列在其第1位中包含核鹼基u或核鹼基a。在本發明的某些實施方案中，反義序列在反義序列的第1位包含核鹼基u。如本文所用，術語“匹配位置”在某種意義上是指當兩條鏈作爲雙鏈體時每條鏈中互相“配對”的位置。例如，在21核鹼基正義鏈和21核鹼基反義鏈中，正義鏈第1位與反義鏈第21位的核鹼基處於“匹配位置”。在另一個非限制性實例中，對於23核鹼基正義鏈和23核鹼基反義鏈，正義鏈的第2位核鹼基與反義鏈的22位處於匹配位置。在另一個非限制性實例中，在18核鹼基正義鏈和18核鹼基反義鏈中，正義鏈第1位核鹼基與反義鏈第18位核鹼基處於匹配位置；並且正義鏈中的第4位核鹼基與反義鏈中的第15位核鹼基處於匹配位置。技術人員會理解如何識別雙鏈和成對鏈的正義和反義鏈之間的匹配位置。
表1中的第一列表示雙鏈體的雙鏈體AV#，該雙鏈體在表格同一行中包含正義和反義序列。例如，表1公開了指定爲“雙鏈體AV00375”的雙鏈體，其包含相應的正義鏈序列和反義鏈序列。因此，表1中的每一行都標識了本發明的雙鏈體，每一個都包含顯示在同一行中的正義和反義序列，每個雙鏈體的指定標識符均顯示在該行的第一列中。
在本發明方法的一些實施方案中，向對象施用包含表1中所示多核苷酸序列的RNAi試劑。在本發明的一些實施方案中，向對象施用的RNAi試劑包括雙鏈體，所述雙鏈體包含表1中列出的鹼基序列中的至少一個，並包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或24個序列修改。在本發明方法的一些實施方案中，還包括將表1中所示多核苷酸序列的RNAi試劑連接至遞送分子上，其非限制性實例是包含GalNAc的遞送化合物。
表1：無修飾的C3 RNAi試劑反義鏈和正義鏈序列。所有序列均顯示爲5'到3'方向。雙鏈體AV#是分配給表中同一行中兩條鏈的雙鏈體的編號。表1第三列中的“SEQ ID NO：2-74”是第二列中顯示的正義序列的序列編號，表1第五列中的“SEQ ID NO:75-147”是第四列中顯示的反義序列的序列編號。
雙鏈體AV# 正義鏈鹼基序列5'→ 3' SEQ ID NO 反義鏈鹼基序列5'→ 3' SEQ ID NO
AV00375 CUAUCGGAUCUUCACCGUCAA 2 UUGACGGUGAAGAUCCGAUAG 75
AV00376 GAUCCGAGCCUACUAUGAAAA 3 UUUUCAUAGUAGGCUCGGAUC 76
AV00377 GAGAAAUUCUACUACAUCUAA 4 UUAGAUGUAGUAGAAUUUCUC 77
AV00378 GAAUUCUACUACAUCUAUAAA 5 UUUAUAGAUGUAGUAGAAUUC 78
AV00379 GGCCUUUGUCAUCUUCGGGAA 6 UUCCCGAAGAUGACAAAGGCC 79
AV00380 GAUCCCCAUCGUGACCUCUCA 7 UGAGAGGUCACGAUGGGGAUC 80
AV00381 CAAACCAGGAAUGCCCUUUGA 8 UCAAAGGGCAUUCCUGGUUUG 81
AV00382 GGAAUGCCCUUUGACCUCAUA 9 UAUGAGGUCAAAGGGCAUUCC 82
AV00383 ACUCCAACAAUUACCUGCAUA 10 UAUGCAGGUAAUUGUUGGAGU 83
AV00384 CGUCAACUUCCUCCUGCGAAA 11 UUUCGCAGGAGGAAGUUGACG 84
AV00385 CGCUACUACACCUACCUGAUA 12 UAUCAGGUAGGUGUAGUAGCG 85
AV00386 GUUCGUGCUGAAUAAGAAGAA 13 UUCUUCUUAUUCAGCACGAAC 86
AV00387 GGAGAACCCCAUGAGGUUCUA 14 UAGAACCUCAUGGGGUUCUCC 87
AV00388 GUUGCAGAAGAGAACAUCGUA 15 UACGAUGUUCUCUUCUGCAAC 88
AV00389 GGAGAACAUCGUUUCCCGAAA 16 UUUCGGGAAACGAUGUUCUCC 89
AV00390 AGAACAUCGUUUCCCGAAGUA 17 UACUUCGGGAAACGAUGUUCU 90
AV00391 GUCACAGUAAUGCAGGACUUA 18 UAAGUCCUGCAUUACUGUGAC 91
AV00392 ACAGUAAUGCAGGACUUCUUA 19 UAAGAAGUCCUGCAUUACUGU 92
AV00393 ACCCUACUCUGUUGUUCGAAA 20 UUUCGAACAACAGAGUAGGGU 93
AV00394 CCCUACUCUGUUGUUCGAAAA 21 UUUUCGAACAACAGAGUAGGG 94
AV00395 CUACUCUGUUGUUCGAAACGA 22 UCGUUUCGAACAACAGAGUAG 95
AV00396 CUACUCCACAAUCCAGCCUUA 23 UAAGGCUGGAUUGUGGAGUAG 96
AV00397 CAUUUCAUCAGUGACGGUGUA 24 UACACCGUCACUGAUGAAAUG 97
AV00398 GGUCAUCGCUGUGCAUUACCA 25 UGGUAAUGCACAGCGAUGACC 98
AV00399 CUGUGCAUUACCUGGAUGAAA 26 UUUCAUCCAGGUAAUGCACAG 99
AV00400 GUGCAUUACCUGGAUGAAACA 27 UGUUUCAUCCAGGUAAUGCAC 100
AV00401 GUCUCUCUGGCUGUCAACCUA 28 UAGGUUGACAGCCAGAGAGAC 101
AV00402 GGAGACUUCCUUGAAGCCAAA 29 UUUGGCUUCAAGGAAGUCUCC 102
AV00403 GACUUCCUUGAAGCCAACUAA 30 UUAGUUGGCUUCAAGGAAGUC 103
AV00404 CUUGAAGCCAACUACAUGAAA 31 UUUCAUGUAGUUGGCUUCAAG 104
AV00405 AGCCAACUACAUGAACCUACA 32 UGUAGGUUCAUGUAGUUGGCU 105
AV00406 CUUAACAAAUUUCUGACCACA 33 UGUGGUCAGAAAUUUGUUAAG 106
AV00407 GACCACAGCCAAAGAUAAGAA 34 UUCUUAUCUUUGGCUGUGGUC 107
AV00408 CCUACUGCAGCUAAAAGACUA 35 UAGUCUUUUAGCUGCAGUAGG 108
AV00409 CUGCAGCUAAAAGACUUUGAA 36 UUCAAAGUCUUUUAGCUGCAG 109
AV00410 UGCAGCUAAAAGACUUUGACA 37 UGUCAAAGUCUUUUAGCUGCA 110
AV00411 GCAGCUAAAAGACUUUGACUA 38 UAGUCAAAGUCUUUUAGCUGC 111
AV00412 GCUCAAUGAACAGAGAUACUA 39 UAGUAUCUCUGUUCAUUGAGC 112
AV00413 CUCAAUGAACAGAGAUACUAA 40 UUAGUAUCUCUGUUCAUUGAG 113
AV00414 CAAUGAACAGAGAUACUACGA 41 UCGUAGUAUCUCUGUUCAUUG 114
AV00415 UGUUCCAAGCCUUGGCUCAAA 42 UUUGAGCCAAGGCUUGGAACA 115
AV00416 GUUCCAAGCCUUGGCUCAAUA 43 UAUUGAGCCAAGGCUUGGAAC 116
AV00417 CCUUGGCUCAAUACCAAAAGA 44 UCUUUUGGUAUUGAGCCAAGG 117
AV00418 GAGGAAAAUGAGGGUUUCACA 45 UGUGAAACCCUCAUUUUCCUC 118
AV00419 GGUGGUGACAAUGUACCAUGA 46 UCAUGGUACAUUGUCACCACC 119
AV00420 UGGUGACAAUGUACCAUGCUA 47 UAGCAUGGUACAUUGUCACCA 120
AV00421 AUCAACUCACCUGUAAUAAAA 48 UUUUAUUACAGGUGAGUUGAU 121
AV00422 CUCACCUGUAAUAAAUUCGAA 49 UUCGAAUUUAUUACAGGUGAG 122
AV00423 UCACCUGUAAUAAAUUCGACA 50 UGUCGAAUUUAUUACAGGUGA 123
AV00424 CCUCAAGGUCACCAUAAAACA 51 UGUUUUAUGGUGACCUUGAGG 124
AV00425 UGCCAAGAACACUAUGAUCCA 52 UGGAUCAUAGUGUUCUUGGCA 125
AV00426 GGAACACUAUGAUCCUUGAGA 53 UCUCAAGGAUCAUAGUGUUCC 126
AV00427 UAUGAUCCUUGAGAUCUGUAA 54 UUACAGAUCUCAAGGAUCAUA 127
AV00428 CUUGAGAUCUGUACCAGGUAA 55 UUACCUGGUACAGAUCUCAAG 128
AV00429 GGAGACCAGGAUGCCACUAUA 56 UAUAGUGGCAUCCUGGUCUCC 129
AV00430 AUUGGACAUAUCCAUGAUGAA 57 UUCAUCAUGGAUAUGUCCAAU 130
AV00431 GUGGACAUAUCCAUGAUGACA 58 UGUCAUCAUGGAUAUGUCCAC 131
AV00432 ACAGAUACAUCUCCAAGUAUA 59 UAUACUUGGAGAUGUAUCUGU 132
AV00433 CAAGUAUGAGCUGGACAAAGA 60 UCUUUGUCCAGCUCAUACUUG 133
AV00434 AGGUCUCACACUCUGAGGAUA 61 UAUCCUCAGAGUGUGAGACCU 134
AV00435 GUCUAGCUUUCAAAGUUCACA 62 UGUGAACUUUGAAAGCUAGAC 135
AV00436 GCUUUAAUGUAGAGCUUAUCA 63 UGAUAAGCUCUACAUUAAAGC 136
AV00437 GUCUACGCCUAUUACAACCUA 64 UAGGUUGUAAUAGGCGUAGAC 137
AV00438 GGAAUUGCUUCAUACAAAAGA 65 UCUUUUGUAUGAAGCAAUUCC 138
AV00439 CAGGAGUGGACUAUGUGUACA 66 UGUACACAUAGUCCACUCCUG 139
AV00440 CAGCUGUCCAAUGACUUUGAA 67 UUCAAAGUCAUUGGACAGCUG 140
AV00441 CUGUCCAAUGACUUUGACGAA 68 UUCGUCAAAGUCAUUGGACAG 141
AV00442 GGUCCAAUGACUUUGACGAGA 69 UCUCGUCAAAGUCAUUGGACC 142
AV00443 UCCAAUGACUUUGACGAGUAA 70 UUACUCGUCAAAGUCAUUGGA 143
AV00444 GCUUUGACGAGUACAUCAUGA 71 UCAUGAUGUACUCGUCAAAGC 144
AV00445 GAGUACAUCAUGGCCAUUGAA 72 UUCAAUGGCCAUGAUGUACUC 145
AV00446 AGAAGAAACACUACCUCAUGA 73 UCAUGAGGUAGUGUUUCUUCU 146
AV00447 GAAGAAACACUACCUCAUGUA 74 UACAUGAGGUAGUGUUUCUUC 147
表2顯示了本發明的某些化學修飾的C3 RNAi劑反義鏈和正義鏈序列。在本發明方法的一些實施方案中，將具有表2中所示多核苷酸序列的RNAi試劑施用於細胞和/或對象。在本發明方法的一些實施方案中，將具有表2中所示多核苷酸序列的RNAi試劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，向對象施用的RNAi試劑包含在表2第一列中標注的雙鏈體，並且分別包含顯示在表2中同一行第三列和第六列的正義和反義鏈序列中的序列修飾。在本發明方法的一些實施方案中，表2中所示的序列可以連接到（在本文中也稱爲“綴合到”）能夠將RNAi試劑遞送至對象的細胞和/或組織的化合物上。可用於本發明的某些實施方案中的遞送化合物的非限制性實例是含GalNAc的化合物。在表2中，第一列表示鹼基序列的雙鏈體AV#，與表1對應。對於雙鏈體AV#標識的鹼基序列，不僅顯示正義和反義鏈所包含的鹼基序列，而且具有表2同一行中所示的指定化學修飾。例如，表1第一行顯示了正義和反義鹼基單鏈序列，它們一起構成雙鏈體，標識爲：雙鏈體AV# AV00375；而表2列出的雙鏈體AV# AV00375中，作爲雙鏈體，其包含AV00375-SS和AV00375- AS的鹼基序列，而且分別包含在第三列和第六列中顯示的正義和反義序列中的化學修飾。表2第二列中的“正義鏈SS#”是同一行中第三列所示正義序列（包括修飾）的指定標識符。表2第五列中的“反義鏈AS#”是第六列中顯示的反義序列（包括修飾）的指定標識符。表2第四列中的“SEQ ID NO”是同一行中第三列所示正義序列（包括修飾）的序列編號。表2第七列中的“SEQ ID NO”是第六列中顯示的反義序列（包括修飾）的序列編號。
表2：提供化學修飾的C3 RNAi試劑反義鏈和正義鏈序列。所有序列都顯示爲5'到3'。這些序列用於本文所述的某些體外測試研究。化學修飾表示爲：大寫：2'-氟；小寫：2'-OMe；硫代磷酸酯：* ; UNA：開環核酸。
雙鏈體AV# 正義鏈SS# 正義序列 SEQ ID NO 反義鏈AS# 反義序列 SEQ ID NO
AV00375 AV00375-SS c*u*aucggaUcUuCaccguca*a 148 AV00375-AS u*U*gaCg(gUNA)ugaaGaUcCgau*a*g 221
AV00376 AV00376-SS g*a*uccgagCcUaCuaugaaa*a 149 AV00376-AS u*U*uucaUaguaGgCuCgga*u*c 222
AV00377 AV00377-SS g*a*gaaauuCuAcUacaucua*a 150 AV00377-AS u*U*agauGuaguAgAaUuuc*u*c 223
AV00378 AV00378-SS g*a*auucuaCuAcAucuauaa*a 151 AV00378-AS u*U*uauaGauguAgUaGaau*u*c 224
AV00379 AV00379-SS g*g*ccuuugUcAuCuucggga*a 152 AV00379-AS u*U*ccCg(aUNA)agauGaCaAagg*c*c 225
AV00380 AV00380-SS g*a*uccccaUcGuGaccucuc*a 153 AV00380-AS u*G*agAg(gUNA)ucacGaUgGgga*u*c 226
AV00381 AV00381-SS c*a*aaccagGaAuGcccuuug*a 154 AV00381-AS u*C*aaAg(gUNA)gcauUcCuGguu*u*g 227
AV00382 AV00382-SS g*g*aaugccCuUuGaccucau*a 155 AV00382-AS u*A*ugagGucaaAgGgCauu*c*c 228
AV00383 AV00383-SS a*c*uccaacAaUuAccugcau*a 156 AV00383-AS u*A*ugCa(gUNA)guaaUuGuUgga*g*u 229
AV00384 AV00384-SS c*g*ucaacuUcCuCcugcgaa*a 157 AV00384-AS u*U*ucGc(aUNA)ggagGaAgUuga*c*g 230
AV00385 AV00385-SS c*g*cuacuaCaCcUaccugau*a 158 AV00385-AS u*A*ucagGuaggUgUaGuag*c*g 231
AV00386 AV00386-SS g*u*ucgugcUgAaUaagaaga*a 159 AV00386-AS u*U*cuucUuauuCaGcAcga*a*c 232
AV00387 AV00387-SS g*g*agaaccCcAuGagguucu*a 160 AV00387-AS u*A*gaacCucauGgGgUucu*c*c 233
AV00388 AV00388-SS g*u*ugcagaAgAgAacaucgu*a 161 AV00388-AS u*A*cgauGuucuCuUcUgca*a*c 234
AV00389 AV00389-SS g*g*agaacaUcGuUucccgaa*a 162 AV00389-AS u*U*ucGg(gUNA)aaacGaUgUucu*c*c 235
AV00390 AV00390-SS a*g*aacaucGuUuCccgaagu*a 163 AV00390-AS u*A*cuUc(gUNA)ggaaAcGaUguu*c*u 236
AV00391 AV00391-SS g*u*cacaguAaUgCaggacuu*a 164 AV00391-AS u*A*agucCugcaUuAcUgug*a*c 237
AV00392 AV00392-SS a*c*aguaauGcAgGacuucuu*a 165 AV00392-AS u*A*agaaGuccuGcAuUacu*g*u 238
AV00393 AV00393-SS a*c*ccuacuCuGuUguucgaa*a 166 AV00393-AS u*U*ucgaAcaacAgAgUagg*g*u 239
AV00394 AV00394-SS c*c*cuacucUgUuGuucgaaa*a 167 AV00394-AS u*U*uucgAacaaCaGaGuag*g*g 240
AV00395 AV00395-SS c*u*acucugUuGuUcgaaacg*a 168 AV00395-AS u*C*guUu(cUNA)gaacAaCaGagu*a*g 241
AV00396 AV00396-SS c*u*acuccaCaAuCcagccuu*a 169 AV00396-AS u*A*agGc(uUNA)ggauUgUgGagu*a*g 242
AV00397 AV00397-SS c*a*uuucauCaGuGacggugu*a 170 AV00397-AS u*A*caCc(gUNA)ucacUgAuGaaa*u*g 243
AV00398 AV00398-SS g*g*ucaucgCuGuGcauuacc*a 171 AV00398-AS u*G*guaaUgcacAgCgAuga*c*c 244
AV00399 AV00399-SS c*u*gugcauUaCcUggaugaa*a 172 AV00399-AS u*U*ucauCcaggUaAuGcac*a*g 245
AV00400 AV00400-SS g*u*gcauuaCcUgGaugaaac*a 173 AV00400-AS u*G*uuucAuccaGgUaAugc*a*c 246
AV00401 AV00401-SS g*u*cucucuGgCuGucaaccu*a 174 AV00401-AS u*A*gguuGacagCcAgAgag*a*c 247
AV00402 AV00402-SS g*g*agacuuCcUuGaagccaa*a 175 AV00402-AS u*U*uggcUucaaGgAaGucu*c*c 248
AV00403 AV00403-SS g*a*cuuccuUgAaGccaacua*a 176 AV00403-AS u*U*aguuGgcuuCaAgGaag*u*c 249
AV00404 AV00404-SS c*u*ugaagcCaAcUacaugaa*a 177 AV00404-AS u*U*ucauGuaguUgGcUuca*a*g 250
AV00405 AV00405-SS a*g*ccaacuAcAuGaaccuac*a 178 AV00405-AS u*G*uaggUucauGuAgUugg*c*u 251
AV00406 AV00406-SS c*u*uaacaaAuUuCugaccac*a 179 AV00406-AS u*G*ugGu(cUNA)agaaAuUuGuua*a*g 252
AV00407 AV00407-SS g*a*ccacagCcAaAgauaaga*a 180 AV00407-AS u*U*cuuaUcuuuGgCuGugg*u*c 253
AV00408 AV00408-SS c*c*uacugcAgCuAaaagacu*a 181 AV00408-AS u*A*gucuUuuagCuGcAgua*g*g 254
AV00409 AV00409-SS c*u*gcagcuAaAaGacuuuga*a 182 AV00409-AS u*U*caaaGucuuUuAgCugc*a*g 255
AV00410 AV00410-SS u*g*cagcuaAaAgAcuuugac*a 183 AV00410-AS u*G*ucaaAgucuUuUaGcug*c*a 256
AV00411 AV00411-SS g*c*agcuaaAaGaCuuugacu*a 184 AV00411-AS u*A*gucaAagucUuUuAgcu*g*c 257
AV00412 AV00412-SS g*c*ucaaugAaCaGagauacu*a 185 AV00412-AS u*A*guauCucugUuCaUuga*g*c 258
AV00413 AV00413-SS c*u*caaugaAcAgAgauacua*a 186 AV00413-AS u*U*aguaUcucuGuUcAuug*a*g 259
AV00414 AV00414-SS c*a*augaacAgAgAuacuacg*a 187 AV00414-AS u*C*guagUaucuCuGuUcau*u*g 260
AV00415 AV00415-SS u*g*uuccaaGcCuUggcucaa*a 188 AV00415-AS u*U*ugAg(cUNA)caagGcUuGgaa*c*a 261
AV00416 AV00416-SS g*u*uccaagCcUuGgcucaau*a 189 AV00416-AS u*A*uugaGccaaGgCuUgga*a*c 262
AV00417 AV00417-SS c*c*uuggcuCaAuAccaaaag*a 190 AV00417-AS u*C*uuuuGguauUgAgCcaa*g*g 263
AV00418 AV00418-SS g*a*ggaaaaUgAgGguuucac*a 191 AV00418-AS u*G*ugaaAcccuCaUuUucc*u*c 264
AV00419 AV00419-SS g*g*uggugaCaAuGuaccaug*a 192 AV00419-AS u*C*auggUacauUgUcAcca*c*c 265
AV00420 AV00420-SS u*g*gugacaAuGuAccaugcu*a 193 AV00420-AS u*A*gcAu(gUNA)guacAuUgUcac*c*a 266
AV00421 AV00421-SS a*u*caacucAcCuGuaauaaa*a 194 AV00421-AS u*U*uuauUacagGuGaGuug*a*u 267
AV00422 AV00422-SS c*u*caccugUaAuAaauucga*a 195 AV00422-AS u*U*cgaaUuuauUaCaGgug*a*g 268
AV00423 AV00423-SS u*c*accuguAaUaAauucgac*a 196 AV00423-AS u*G*ucgaAuuuaUuAcAggu*g*a 269
AV00424 AV00424-SS c*c*ucaaggUcAcCauaaaac*a 197 AV00424-AS u*G*uuuuAugguGaCcUuga*g*g 270
AV00425 AV00425-SS u*g*ccaagaAcAcUaugaucc*a 198 AV00425-AS u*G*gaucAuaguGuUcUugg*c*a 271
AV00426 AV00426-SS g*g*aacacuAuGaUccuugag*a 199 AV00426-AS u*C*ucAa(gUNA)gaucAuAgUguu*c*c 272
AV00427 AV00427-SS u*a*ugauccUuGaGaucugua*a 200 AV00427-AS u*U*acagAucucAaGgAuca*u*a 273
AV00428 AV00428-SS c*u*ugagauCuGuAccaggua*a 201 AV00428-AS u*U*acCu(gUNA)guacAgAuCuca*a*g 274
AV00429 AV00429-SS g*g*agaccaGgAuGccacuau*a 202 AV00429-AS u*A*uaguGgcauCcUgGucu*c*c 275
AV00430 AV00430-SS a*u*uggacaUaUcCaugauga*a 203 AV00430-AS u*U*caucAuggaUaUgUcca*a*u 276
AV00431 AV00431-SS g*u*ggacauAuCcAugaugac*a 204 AV00431-AS u*G*ucauCauggAuAuGucc*a*c 277
AV00432 AV00432-SS a*c*agauacAuCuCcaaguau*a 205 AV00432-AS u*A*uacuUggagAuGuAucu*g*u 278
AV00433 AV00433-SS c*a*aguaugAgCuGgacaaag*a 206 AV00433-AS u*C*uuugUccagCuCaUacu*u*g 279
AV00434 AV00434-SS a*g*gucucaCaCuCugaggau*a 207 AV00434-AS u*A*uccuCagagUgUgAgac*c*u 280
AV00435 AV00435-SS g*u*cuagcuUuCaAaguucac*a 208 AV00435-AS u*G*ugaaCuuugAaAgCuag*a*c 281
AV00436 AV00436-SS g*c*uuuaauGuAgAgcuuauc*a 209 AV00436-AS u*G*auaaGcucuAcAuUaaa*g*c 282
AV00437 AV00437-SS g*u*cuacgcCuAuUacaaccu*a 210 AV00437-AS u*A*gguuGuaauAgGcGuag*a*c 283
AV00438 AV00438-SS g*g*aauugcUuCaUacaaaag*a 211 AV00438-AS u*C*uuuuGuaugAaGcAauu*c*c 284
AV00439 AV00439-SS c*a*ggagugGaCuAuguguac*a 212 AV00439-AS u*G*uacaCauagUcCaCucc*u*g 285
AV00440 AV00440-SS c*a*gcugucCaAuGacuuuga*a 213 AV00440-AS u*U*caaaGucauUgGaCagc*u*g 286
AV00441 AV00441-SS c*u*guccaaUgAcUuugacga*a 214 AV00441-AS u*U*cgucAaaguCaUuGgac*a*g 287
AV00442 AV00442-SS g*g*uccaauGaCuUugacgag*a 215 AV00442-AS u*C*ucGu(cUNA)aaagUcAuUgga*c*c 288
AV00443 AV00443-SS u*c*caaugaCuUuGacgagua*a 216 AV00443-AS u*U*acucGucaaAgUcAuug*g*a 289
AV00444 AV00444-SS g*c*uuugacGaGuAcaucaug*a 217 AV00444-AS u*C*augaUguacUcGuCaaa*g*c 290
AV00445 AV00445-SS g*a*guacauCaUgGccauuga*a 218 AV00445-AS u*U*caauGgccaUgAuGuac*u*c 291
AV00446 AV00446-SS a*g*aagaaaCaCuAccucaug*a 219 AV00446-AS u*C*auGa(gUNA)guagUgUuUcuu*c*u 292
AV00447 AV00447-SS g*a*agaaacAcUaCcucaugu*a 220 AV00447-AS u*A*caugAgguaGuGuUucu*u*c 293
表3顯示了本發明的某些化學修飾的C3 RNAi試劑反義鏈和正義鏈序列。在本發明方法的一些實施方案中，將表3中所示的RNAi試劑施用於細胞和/或對象。在本發明方法的一些實施方案中，將具有表3中所示多核苷酸序列的RNAi試劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，向對象施用的RNAi試劑包含在表3的第一列中標識的雙鏈體，並且分別包含在表3中同一行第三列和第六列的正義和反義鏈序列中顯示的序列修飾和/或遞送化合物。該序列用於本文別處描述的某些體內測試研究。在本發明方法的一些實施方案中，表3中所示的序列可以連接到（在本文中也稱爲“綴合到”）用於遞送的化合物上，其非限制性實例是含GalNAc的化合物，即在表3中第三列的正義鏈上具有標識爲“GLX-n”的遞送化合物。遞送化合物的某些實施方案被標識爲表3中第三列有義鏈上的“GLS-5”、“GLS-15”或“GLX-n”。如本文所用和表3中所示，“GLS-5”、“GLS-15”和“GLX-n”表示含有GalNAc的化合物。如本文所用， “GLX”用於表示“GLS”或“GLO”遞送化合物（“X”可以是“S”或“O”），並且GLX-n可以是任何GLS和GLO可以在合成過程中連接到寡核苷酸 3'-或者5'-末端的遞送化合物。舉例但不局限於此：GLX-13和GLX-14可以在合成過程中連接到本發明的寡核苷酸的3'-末端；GLX-5和GLX-15可以在合成過程中連接到本發明的寡核苷酸的5'-末端。在一些實施例中，如本文所用和表3所示，“GLX-n”用於表示所連接的含GalNAc的化合物，其被代替爲化合物GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-5、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、GLS-10、GLS-11、GLS-12、GLS-13、GLS-14、GLS-15、GLS-16、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16中的任一種。在一些實施中， GLX-n表示爲舉例但是不限於此現有技術中（Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958−16961）公開的可用於所連接的含GalNAc的化合物，該化合物用於本文別處描述的某些體內測試研究。本領域技術人員將能夠製備和使用本發明的dsRNA化合物，其中附著的遞送化合物包括但是不局限於：GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-5、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、 GLS-10、GLS-11、 GLS-12、 GLS-13、GLS-14、 GLS-15、 GLS-16、 GLO-1、 GLO-2、 GLO -3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15 和 GLO-16。其中每一個的結構在本文別處提供。表3的第一列提供了分配給表中該行中的正義和反義序列的雙鏈體的雙鏈體AD#。例如，雙鏈體AD# AD00343是正義鏈AD00343-SS和反義鏈AD00343-AS構成的雙鏈體。表3中的每一行提供了一條正義鏈和一條反義鏈，並公開了所示正義鏈和反義鏈構成的雙鏈體。表3第二列中的“正義鏈SS#”是同一行第三列所示正義序列（包括修改）的指定標識符。表3第五列中的“反義鏈AS#”是第六列中顯示的反義序列（包括修飾）的指定標識符。某些所連接的含GalNAc的GLO化合物的標識符顯示爲GLX-n，並且應當理解，GLO-n或GLS-n化合物中的另一種可以替代顯示爲GLX-n的化合物，所得化合物也包括所得化合物包括在本發明的方法和/或組合物的實施方案中。表3中SEQ ID NO:294至SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:392至SEQ ID NO:406是正義鏈的序列並且SEQ ID NO:343至SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:407至SEQ ID NO:421是反義鏈序列。在表3中，遞送分子表示爲在正義鏈NO:294至SEQ ID NO:342、NO:392至SEQ ID NO:406的3'或者5'端的“GLS-5”、“GLS-15”或“GLX-n”。化學修飾表示爲：大寫：2'-氟；小寫：2'-甲氧基；硫代磷酸鹽：*；Invab：反向無鹼基。
表3提供了用於體內測試的化學修飾的C3 RNAi試劑反義鏈和正義鏈序列。所有序列都顯示爲5'到3'。這些序列用於本文別處描述的某些體內測試研究。體內研究中使用的遞送分子在每條正義鏈5'或者3'末端表示爲“GLn-x”。化學修飾表示爲：大寫：2'-氟；小寫：2'-OMe；硫代磷酸酯：*；Invab爲“反向無鹼基”,UNA：開環核酸。
雙鏈體AD# 正義鏈SS# 正義序列 SEQ ID NO 反義鏈AS# 反義序列 SEQ ID NO
AD00343 AD00343-SS g*c*uccaacAaUuAccugcau*a(GLX-n) 294 AD00343-AS u*A*ugCa(gUNA)guaaUuGuUgga*g*c 343
AD00344 AD00344-SS c*g*agaacaUcGuUucccgaa*a(GLX-n) 295 AD00344-AS u*U*ucGg(gUNA)aaacGaUgUucu*c*g 344
AD00345 AD00345-SS g*c*uuggcuCaAuAccaaaag*a(GLX-n) 296 AD00345-AS u*C*uuuuGguauUgAgCcaa*g*c 345
AD00346 AD00346-SS c*g*uggugaCaAuGuaccaug*a(GLX-n) 297 AD00346-AS u*C*auggUacauUgUcAcca*c*g 346
AD00347 AD00347-SS g*g*gugacaAuGuAccaugcu*a(GLX-n) 298 AD00347-AS u*A*gcAu(gUNA)guacAuUgUcac*c*c 347
AD00348 AD00348-SS g*u*caacucAcCuGuaauaaa*a(GLX-n) 299 AD00348-AS u*U*uuauUacagGuGaGuug*a*c 348
AD00349 AD00349-SS g*c*accuguAaUaAauucgac*a(GLX-n) 300 AD00349-AS u*G*ucgaAuuuaUuAcAggu*g*c 349
AD00350 AD00350-SS g*c*agauacAuCuCcaaguau*a(GLX-n) 301 AD00350-AS u*A*uacuUggagAuGuAucu*g*c 350
AD00351 AD00351-SS g*c*caaugaCuUuGacgagua*a(GLX-n) 302 AD00351-AS u*U*acucGucaaAgUcAuug*g*c 351
AD00385 AD00385-SS (GLS-5)*(Invab)*guaucggaUcUuCaccgucaa*(Invab) 303 AD00385-AS u*U*gaCg(gUNA)ugaaGaUcCgau*a*c 352
AD00386 AD00386-SS (GLS-5)*(Invab)*cgaaugccCuUuGaccucaua*(Invab) 304 AD00386-AS u*A*ugagGucaaAgGgCauu*c*g 353
AD00387 AD00387-SS (GLS-5)*(Invab)*ggucaacuUcCuCcugcgaaa*(Invab) 305 AD00387-AS u*U*ucGc(aUNA)ggagGaAgUuga*c*c 354
AD00388 AD00388-SS (GLS-5)*(Invab)*ggcuacuaCaCcUaccugaua*(Invab) 306 AD00388-AS u*A*ucagGuaggUgUaGuag*c*c 355
AD00389 AD00389-SS (GLS-5)*(Invab)*cuugcagaAgAgAacaucgua*(Invab) 307 AD00389-AS u*A*cgauGuucuCuUcUgca*a*g 356
AD00390 AD00390-SS (GLS-5)*(Invab)*guacuccaCaAuCcagccuua*(Invab) 308 AD00390-AS u*A*agGc(uUNA)ggauUgUgGagu*a*c 357
AD00391 AD00391-SS (GLS-5)*(Invab)*caccacagCcAaAgauaagaa*(Invab) 309 AD00391-AS u*U*cuuaUcuuuGgCuGugg*u*g 358
AD00392 AD00392-SS (GLS-5)*(Invab)*gguuccaaGcCuUggcucaaa*(Invab) 310 AD00392-AS u*U*ugAg(cUNA)caagGcUuGgaa*c*c 359
AD00393 AD00393-SS (GLS-5)*(Invab)*cuuccaagCcUuGgcucaaua*(Invab) 311 AD00393-AS u*A*uugaGccaaGgCuUgga*a*g 360
AD00394 AD00394-SS (GLS-5)*(Invab)*cgagaccaGgAuGccacuaua*(Invab) 312 AD00394-AS u*A*uaguGgcauCcUgGucu*c*g 361
AD00395 AD00395-SS (GLS-5)*(Invab)*gaaguaugAgCuGgacaaaga*(Invab) 313 AD00395-AS u*C*uuugUccagCuCaUacu*u*c 362
AD00396 AD00396-SS (GLS-5)*(Invab)*cucuagcuUuCaAaguucaca*(Invab) 314 AD00396-AS u*G*ugaaCuuugAaAgCuag*a*g 363
AD00397 AD00397-SS (GLS-5)*(Invab)*gagcugucCaAuGacuuugaa*(Invab) 315 AD00397-AS u*U*caaaGucauUgGaCagc*u*c 364
AD00410 AD00410-SS (GLS-5)*(Invab)*cgccuuugUcAuCuucgggaa*(Invab) 316 AD00410-AS u*U*cccgAagauGaCaAagg*c*g 365
AD00411 AD00411-SS (GLS-5)*(Invab)*cauccccaUcGuGaccucuca*(Invab) 317 AD00411-AS u*G*agagGucacGaUgGgga*u*g 366
AD00412 AD00412-SS (GLS-5)*(Invab)*cucacaguAaUgCaggacuua*(Invab) 318 AD00412-AS u*A*agucCugcaUuAcUgug*a*g 367
AD00413 AD00413-SS (GLS-5)*(Invab)*cucucucuGgCuGucaaccua*(Invab) 319 AD00413-AS u*A*gguuGacagCcAgAgag*a*g 368
AD00414 AD00414-SS (GLS-5)*(Invab)*guuaacaaAuUuCugaccaca*(Invab) 320 AD00414-AS u*G*ugguCagaaAuUuGuua*a*c 369
AD00415 AD00415-SS (GLS-5)*(Invab)*gcuacugcAgCuAaaagacua*(Invab) 321 AD00415-AS u*A*gucuUuuagCuGcAgua*g*c 370
AD00416 AD00416-SS (GLS-5)*(Invab)*gucaaugaAcAgAgauacuaa*(Invab) 322 AD00416-AS u*U*aguaUcucuGuUcAuug*a*c 371
AD00417 AD00417-SS (GLS-5)*(Invab)*gaugauccUuGaGaucuguaa*(Invab) 323 AD00417-AS u*U*acagAucucAaGgAuca*u*c 372
AD00418 AD00418-SS (GLS-5)*(Invab)*guuggacaUaUcCaugaugaa*(Invab) 324 AD00418-AS u*U*caucAuggaUaUgUcca*a*c 373
AD00419 AD00419-SS (GLS-5)*(Invab)*guguccaaUgAcUuugacgaa*(Invab) 325 AD00419-AS u*U*cgucAaaguCaUuGgac*a*c 374
AD00420 AD00420-SS (GLS-5)*(Invab)*ccuuugacGaGuAcaucauga*(Invab) 326 AD00420-AS u*C*augaUguacUcGuCaaa*g*g 375
AD00526 AD00526-SS (GLS-15)*(Invab)*gugugcauUaCcUggaugaaa*(Invab) 327 AD00526-AS u*U*ucauCcaggUaAuGcac*a*c 376
AD00527 AD00527-SS (GLS-15)*(Invab)*gugcagcuAaAaGacuuugaa*(Invab) 328 AD00527-AS u*U*caaaGucuuUuAgCugc*a*c 377
AD00528 AD00528-SS (GLS-15)*(Invab)*ccucaaugAaCaGagauacua*(Invab) 329 AD00528-AS u*A*guauCucugUuCaUuga*g*g 378
AD00529 AD00529-SS (GLS-15)*(Invab)*gaaugaacAgAgAuacuacga*(Invab) 330 AD00529-AS u*C*guagUaucuCuGuUcau*u*c 379
AD00530 AD00530-SS (GLS-15)*(Invab)*ggacaaugUaCcAugcuaaga*(Invab) 331 AD00530-AS u*C*uuagCauggUaCaUugu*c*c 380
AD00531 AD00531-SS (GLS-15)*(Invab)*ggccaagaAcAcUaugaucca*(Invab) 332 AD00531-AS u*G*gaucAuaguGuUcUugg*c*c 381
AD00532 AD00532-SS (GLS-15)*(Invab)*cuggacauAuCcAugaugaca*(Invab) 333 AD00532-AS u*G*ucauCauggAuAuGucc*a*g 382
AD00533 AD00533-SS (GLS-15)*(Invab)*gggucucaCaCuCugaggaua*(Invab) 334 AD00533-AS u*A*uccuCagagUgUgAgac*c*c 383
AD00534 AD00534-SS (GLS-15)*(Invab)*ccuuuaauGuAgAgcuuauca*(Invab) 335 AD00534-AS u*G*auaaGcucuAcAuUaaa*g*g 384
AD00535 AD00535-SS (GLS-15)*(Invab)*gaggagugGaCuAuguguaca*(Invab) 336 AD00535-AS u*G*uacaCauagUcCaCucc*u*c 385
AD00579 AD00579-SS (GLS-15)*(Invab)*cauccgagCcUaCuaugaaaa*(Invab) 337 AD00579-AS u*U*uucaUaguaGgCuCgga*u*g 386
AD00580 AD00580-SS (GLS-15)*(Invab)*caauucuaCuAcAucuauaaa*(Invab) 338 AD00580-AS u*U*uauaGauguAgUaGaau*u*g 387
AD00581 AD00581-SS (GLS-15)*(Invab)*cuucgugcUgAaUaagaagaa*(Invab) 339 AD00581-AS u*U*cuucUuauuCaGcAcga*a*g 388
AD00582 AD00582-SS (GLS-15)*(Invab)*gccuacucUgUuGuucgaaaa*(Invab) 340 AD00582-AS u*U*uucgAacaaCaGaGuag*g*c 389
AD00583 AD00583-SS (GLS-15)*(Invab)*ggcagcuaAaAgAcuuugaca*(Invab) 341 AD00583-AS u*G*ucaaAgucuUuUaGcug*c*c 390
AD00584 AD00584-SS (GLS-15)*(Invab)*gcucaaggUcAcCauaaaaca*(Invab) 342 AD00584-AS u*G*uuuuAugguGaCcUuga*g*c 391
AD00740 AD00740-SS (GLS-15)*(Invab)*cuaaugcaGgAcuUcuucau*a*(Invab) 392 AD00740-AS u*A*ugAagaaguCcUgcaUu*a*g 407
AD00741 AD00741-SS (GLS-15)*(Invab)*gaugcaggAcUucUucaucg*a*(Invab) 393 AD00741-AS u*C*gaUgaagaaGuCcugCa*u*c 408
AD00742 AD00742-SS (GLS-15)*(Invab)*guacccuaCuCugUuguucg*a*(Invab) 394 AD00742-AS u*C*gaAcaacagAgUaggGu*a*c 409
AD00743 AD00743-SS (GLS-15)*(Invab)*cacucuguUgUucGaaacga*a*(Invab) 395 AD00743-AS u*U*cgUuucgaaCaAcagAg*u*g 410
AD00744 AD00744-SS (GLS-15)*(Invab)*ggaaacgaGcAggUggaaau*a*(Invab) 396 AD00744-AS u*A*uuUccaccuGcUcguUu*c*c 411
AD00344-1 AD00344-1-SS (GLS-15)*(Invab)*cgagaacaUcGuUucccgaa*a*(Invab) 397 AD00344-1-AS u*U*ucGg(gUNA)aaacGaUgUucu*c*g 412
AD00388-1 AD00388-1-SS (GLS-15)*(Invab)*ggcuacuaCaCcUaccugau*a*(Invab) 398 AD00388-1-AS u*A*ucagGuaggUgUaGuag*c*c 413
AD00389-1 AD00389-1-SS (GLS-15)*(Invab)*cuugcagaAgAgAacaucgu*a*(Invab) 399 AD00389-1-AS u*A*cgauGuucuCuUcUgca*a*g 414
AD00385-1 AD00385-1-SS (GLS-15)*(Invab)*guaucggaUcUuCaccgucaa*(Invab) 400 AD00385-1-AS u*U*gaCg(gUNA)ugaaGaUcCgau*a*c 415
AD00416-1 AD00416-1-SS (GLS-15)*(Invab)*gucaaugaAcAgAgauacuaa*(Invab) 401 AD00416-1-AS u*U*aguaUcucuGuUcAuug*a*c 416
AD00580-1 AD00580-1-SS (GLS-15)*(Invab)*caauccuaCuAcAucuauaa*a*(Invab) 402 AD00580-1-AS u*U*uauaGauguAgUaGaau*u*g 417
AD00343-1 AD00343-1-SS (GLS-15)*(Invab)*gcucuaacAaUuAccugcau*a*(Invab) 403 AD00343-1-AS u*A*ugCa(gUNA)guaaUuGuUgga*g*c 418
AD00388-1 AD00388-1-SS (GLS-15)*(Invab)*ggcuacuaCaCcUaccugau*a*(Invab) 404 AD00388-1-AS u*A*ucagGuaggUgUaGuag*c*c 419
AD00581-1 AD00581-1-SS (GLS-15)*(Invab)*cuucgugcUgAaUaagaaga*a*(Invab) 405 AD00581-1-AS u*U*cuucUuauuCaGcAcga*a*g 420
AD00389-1 AD00389-1-SS (GLS-15)*(Invab)*cuugcagaAgAgAacaucgu*a*(Invab) 406 AD00389-1-AS u*A*cgauGuucuCuUcUgca*a*g 421
錯配
本領域技術人員已知，對於dsRNA的功效而言，錯配是可以容忍的，尤其是錯配在dsRNA的末端區域內的情况。某些錯配具有更好的耐受性，例如具有擺動鹼基對G:U和A:C的錯配對功效的耐受性更好（Du et el., A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites. Nucleic Acids Res. 2005 Mar 21;33(5):1671-7. Doi: 10.1093/nar/gki312. Nucleic Acids Res. 2005;33(11):3698）。本發明的方法和化合物的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑可以含有一個或更多個與C3靶序列的錯配。在一些實施方案中，本發明的C3 dsRNA試劑不包含錯配。在某些實施方案中，本發明的C3 dsRNA試劑包含不超過1個錯配。在一些實施方案中，本發明的C3 dsRNA試劑包含不超過2個錯配。在某些實施方案中，本發明的C3 dsRNA試劑包含不超過3個錯配。在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑的反義鏈包含與不位於互補區域中心的C3靶序列的錯配。在一些實施方案中，C3 dsRNA試劑的反義鏈包含1、2、3、4或更多個錯配，其位於互補區域的5'或3'末端之一或兩者的最末5、4、3、2或1個核苷酸內。本文所述的方法和/或本領域已知的方法可用於確定包含與C3靶序列錯配的C3 dsRNA試劑是否有效抑制C3基因的表達。 互補性
如本文所用，除非另有說明，否則術語“互補性/互補”當用於描述第一核苷酸序列（例如，C3 dsRNA試劑正義鏈或靶標C3 mRNA）與第二核苷酸序列（例如，C3 dsRNA試劑反義鏈或單鏈反義多核苷酸）的相關性時，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交[在哺乳動物生理條件（或體外類似條件）下形成鹼基對間氫鍵]、並且在某些條件下形成雙螺旋或雙螺旋結構的能力。其中也可以應用其他條件，例如在生物體內可能遇到的生理相關條件。技術人員將能夠根據雜交核苷酸的最終應用確定最適合測試兩個序列互補性的條件集。互補序列包括沃森-克裏克鹼基對或非沃森-克裏克鹼基對，並且包括天然或修飾的核苷酸或核苷酸模擬物，只要至少達到上述雜交要求的程度即可。序列同一性或互補性與修飾無關。
例如，在如本文所述的C3 dsRNA內的互補序列包含含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列的全長上的鹼基配對。此類序列在本文中可被稱爲彼此“完全互補”。應當理解，在設計兩個寡核苷酸以在雜交時形成一個或更多個單鏈突出端的實施方案中，這種突出端在本文中不被視爲基於互補性確定的錯配。例如，C3 dsRNA試劑包含一個長度爲19個核苷酸的寡核苷酸和另一個長度爲20個核苷酸的寡核苷酸，其中較長的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補的19個核苷酸的序列，出於本文所述的目的，此種情况可以稱爲“完全互補”。因此，如本文所用，“完全互補”是指第一多核苷酸的連續序列中的所有（100%）鹼基會與第二多核苷酸的連續序列中的相同數目的鹼基雜交。連續序列可以包含第一或第二核苷酸序列的全部或部分。
如本文所用，術語“基本互補”是指在核鹼基序列的雜交對中，第一多核苷酸的連續序列中的鹼基的至少約85％（但不是全部）會與第二多核苷酸的連續序列中相同數目的鹼基雜交。如果兩個序列在雜交時包含一個或更多個錯配鹼基對，例如至少1、2、3、4或5個錯配鹼基對，則可以使用術語“基本上互補”來指第一序列相對於第二序列形成多達15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個鹼基對(bp)的雙鏈體，同時保留在與其最終應用最相關的條件下雜交的能力，例如，通過RISC途徑抑制C3基因表達。術語“部分互補”在本文中可用於指核鹼基序列的雜交對中，第一多核苷酸的連續序列中鹼基的至少75%（但不是全部）會與第二多核苷酸的連續序列中相同數目的鹼基雜交。在一些實施方案中，“部分互補”是指第一多核苷酸的連續序列中至少76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的鹼基會與第二多核苷酸的連續序列中相同數量的鹼基雜交。
術語“互補”、“完全互補”、“基本互補”和“部分互補”在本文中使用時可用於指C3 dsRNA試劑的正義鏈與反義鏈之間的鹼基匹配、C3 dsRNA試劑的反義鏈與靶C3 mRNA的序列之間的鹼基匹配，或單鏈反義寡核苷酸與靶C3 mRNA序列之間的鹼基匹配。應當理解，術語“C3 dsRNA試劑的反義鏈”可以指與“C3反義多核苷酸試劑”相同的序列。
如本文所用，在提及核酸序列時使用的術語“基本相同”或“基本同一性”是指核酸序列與參考序列相比，包含具有至少約85%或更高序列同一性的序列，優選至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98% 或至少99 %同一性。序列同一性的百分比通過在比對窗口上比較兩個序列的最佳比對來確定。百分比是通過以下方式來計算的：確定在兩個序列中出現相同核酸鹼基的位置數以産生匹配位置的數量；將匹配位置的數量除以比對窗口中的位置總數，然後將結果乘以 100，從而得出序列同一性的百分比。本文公開的發明包括與本文公開（例如，在表 1-3 中）的那些基本相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述核苷酸序列與本文公開（例如，在表1-3中）的序列完全相同，或具有至少約 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
如本文所用，術語“包含序列的鏈”是指包含核苷酸鏈的寡核苷酸，所述核苷酸鏈由使用標準核苷酸命名法指代的序列描述。如本文所用，術語“雙鏈RNA”或“dsRNA”指包含RNA分子或RNAi分子複合物的序列，所述分子或複合物具有包含兩條反向平行且基本或完全互補的核酸鏈的雜交雙鏈區，其分別被稱爲相對於靶C3 RNA 具有“正義”和“反義”方向。雙鏈區可以具有允許通過RISC途徑特異性降解靶標C3 RNA的任何所需長度，但通常長度爲9至30個鹼基對，例如長度爲15-30個鹼基對。考慮到9到30個鹼基對之間的雙鏈體，雙鏈體可以是此範圍內的任何長度，例如，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 、23、24、25、26、27、28、29或30個鹼基對，以及其中的任何子範圍，包括但不限於15-30個鹼基對、15-26個鹼基對；15-23鹼基對、15-22鹼基對、15-21鹼基對、15-20鹼基對、15-19鹼基對、15-18鹼基對、15-17鹼基對、18-30個鹼基對、18-26個鹼基對、18-23個鹼基對、18-22個鹼基對、18-21個鹼基對、18-20個鹼基對、19-30個鹼基對、19-26個鹼基對、19-23個鹼基對、19-22個鹼基對、19-21個鹼基對、19-20個鹼基對、20-30個鹼基對、20-26個鹼基對、20-25個鹼基對、20-24個鹼基對、20-23個鹼基對、20-22個鹼基對、20-21個鹼基對、21-30個鹼基對、21-26個鹼基對、21-25個鹼基對、21-24個鹼基對、21-23個鹼基對或21-22個鹼基對。通過用切丁酶和類似酶加工在細胞中産生的C3 dsRNA試劑的長度通常在19-22個鹼基對的範圍內。C3 dsDNA劑的雙鏈區的一條鏈包含與靶C3 RNA的區域基本互補的序列。形成雙鏈體結構的兩條鏈可以來自具有至少一個自身互補區的單個RNA分子，或者可以由兩個或更多個單獨的RNA分子形成。在雙鏈區由單個分子形成的情况下，該分子可以具有由單鏈核苷酸鏈在3'-末端的一條鏈和相應的5'-末端的另一條鏈形成的雙鏈體結構（本文稱爲“髮夾環”）。在本發明的一些實施方案中，髮夾構型包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個或更多個未配對的核苷酸。當C3 dsRNA試劑的基本互補的兩條鏈由單獨的 RNA 分子組成時，這些分子不需要共價連接，但也可以共價連接。當兩條鏈通過髮夾環以外的方式共價連接時，連接結構被稱爲“接頭”。術語“siRNA”在本文中也用於指如本文所述的dsRNA試劑。
在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑可以包含在dsRNA試劑的一個或兩個末端具有未配對核苷酸或核苷酸類似物的正義和反義序列。沒有未配對核苷酸的末端被稱爲“平末端”並且沒有核苷酸突出端。如果dsRNA試劑的兩端都是平末端，則dsRNA被稱爲“平末端的”。在本發明的一些實施方案中，dsRNA試劑的第一末端是平末端的，在一些實施方案中，dsRNA試劑的第二末端是平末端的，並且在本發明的某些實施方案中，C3 dsRNA試劑的兩個末端都是平末端的。
在本發明的dsRNA試劑的一些實施方案中，dsRNA不具有一個或兩個平末端。在這種情况下，在dsRNA試劑的一條鏈的末端有至少一個未配對的核苷酸。例如，當dsRNA一條鏈的3'-末端延伸超出另一條鏈的5'-末端時，則存在核苷酸突出端，反之亦然。dsRNA 可包含至少1、2、3、4、5、6 或更多個核苷酸的突出端。核苷酸突出端可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，包括脫氧核苷酸/核苷。應當理解，在一些實施方案中，核苷酸突出端在dsRNA試劑的正義鏈上、在dsRNA試劑的反義鏈上，或在 dsRNA 試劑的兩端，突出端的核苷酸可存在於dsRNA的反義鏈或正義鏈的 5' 端、3' 端或兩端。在本發明的某些實施方案中，突出端中的一個或更多個核苷酸被核苷硫代磷酸酯替換。
如本文所用，術語“反義鏈”或“引導鏈”是指包含與C3靶序列基本互補的區域的C3 dsRNA試劑的鏈。如本文所用，術語“正義鏈”或“過客鏈”是指包含與C3 dsRNA試劑的反義鏈的區域基本互補的區域的C3 dsRNA試劑的鏈。 修飾
在本發明的一些實施方案中，C3 RNAi劑的RNA被化學修飾以獲得增强的穩定性和/或一種或更多種其他有益特性。本發明的某些實施方案中的核酸可以通過本領域公知的方法合成和/或修飾，例如，見 “Current protocols in Nucleic Acid Chemistry," Beaucage, S. L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA，其作爲參考在此並入本文。可以存在於本發明的C3 dsRNA試劑的某些實施方案中的修飾包括例如：(a)末端修飾，例如5'端修飾（磷酸化、綴合、反向連接等）、3'端修飾（綴合、DNA核苷酸、反向連接等）；(b) 鹼基修飾，例如用穩定鹼基、去穩定鹼基或與擴展的配偶體庫進行鹼基配對的鹼基替換、缺失鹼基（無鹼基核苷酸）或綴合鹼基；(c) 糖修飾（例如，在2'位置或4'位置）或糖的替換；以及 (d) 骨架修飾，包括磷酸二酯鍵的修飾或替換。在本發明的C3 dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和C3正義多核苷酸的某些實施方案中可用的RNA化合物的具體實例包括但不限於包含修飾骨架或沒有天然核苷間鍵聯的RNA。作爲非限制性實例，具有骨架修飾的RNA在骨架中可以不具有磷原子。在其核苷間骨架中沒有磷原子的RNA可稱爲寡核苷。在本發明的某些實施方案中，修飾的RNA在其核苷間骨架中具有磷原子。
應當理解，術語“RNA分子”或“RNA”或“核糖核酸分子”不僅包括在自然界中表達或發現的RNA分子，還包括RNA的類似物和衍生物，其包含一種或更多種如本文所述或本領域已知的核糖核苷酸/核糖核苷類似物或衍生物。術語“核糖核苷”和“核糖核苷酸”在本文中可互換使用。RNA分子可以在核鹼基結構或核糖-磷酸骨架結構中進行修飾（例如，如下文所述），並且包含核糖核苷類似物或衍生物的分子必須保留形成雙鏈體的能力。作爲非限制性實例，RNA分子還可包含至少一種修飾的核糖核苷，其包括但不限於2'-O-甲基修飾的核苷、包含5'硫代磷酸酯基團的核苷、與膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團相連的末端核苷、鎖核苷、無鹼基核苷、2'-脫氧-2'-氟修飾的核苷、2'-氨基修飾的核苷、2'-烷基修飾的核苷、嗎啉代核苷、氨基磷酸酯或包含核苷的非天然鹼基，或其任何組合。在本發明的一些實施方案中，RNA分子包含以下數量的修飾的核糖核苷：至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或長達C3 dsRNA 試劑分子的核糖核苷的全長。對於這種RNA分子中的多個修飾的核糖核苷中的每一個，修飾不必相同。
在一些實施方案中，本發明的dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸可以包含一個或更多個獨立選擇的修飾核苷酸和/或一個或更多個獨立選擇的非磷酸二酯鍵。本文所用的術語“獨立選擇”用於指選定的要素，例如修飾的核苷酸、非磷酸二酯鍵等，是指兩個或更多個選定的要素可以彼此相同但不必彼此相同。如本文所用，“核苷酸鹼基”、“核苷酸”或“核鹼基”是雜環嘧啶或嘌呤化合物，其是所有核酸的標準成分，並且包括形成核苷酸的鹼基：腺嘌呤 (a)、鳥嘌呤 (g)、胞嘧啶 (c)、胸腺嘧啶 (t) 和尿嘧啶 (u)。核鹼基可進一步修飾以包括（但不旨在限制）：通用鹼基、疏水性鹼基、混雜鹼基、尺寸擴大的鹼基和氟化鹼基。術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”在本文中可用於指未修飾的核苷酸、修飾的核苷酸或替代部分。本領域技術人員將認識到，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分替換，而不會顯著改變包含帶有這種替換部分的核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對特性。
在一個實施方案中，預期用於本文所述的方法和組合物中的修飾的RNA是肽核酸（PNA），其具有形成所需雙鏈體結構並且允許或介導靶RNA經由RISC途徑的特異性降解的能力。在本發明的某些實施方案中，C3 RNA干擾劑包括與靶C3 RNA序列相互作用以指導靶C3 RNA切割的單鏈RNA。
修飾的RNA骨架可以包含例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯（包括 3'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯）、次膦酸酯、氨基磷酸酯（包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯）、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯，和硼酸磷酸酯（其具有正常3'-5' 連接的，以及這些的2'-5'連接類似物，以及具有倒置極性的那些，其中相鄰的核苷單元對以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'形式連接）。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。製備含磷鍵的方法是本領域的常規實施手段，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的C3 dsRNA試劑、某些修飾的C3反義多核苷酸和/或某些修飾的C3正義多核苷酸。
其中不包含磷原子的修飾的RNA骨架具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵聯、或一個或更多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵聯形成的骨架。其包括具有嗎啉鍵的那些（部分由核苷的糖部分形成）；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲乙醯和硫甲乙醯骨架；亞甲基甲乙醯和硫甲乙醯骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸鹽骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸鹽和磺醯胺骨架；醯胺骨架；以及其他混合有N、O、S和CH 2成分的部分。製備不含磷原子的修飾的RNA骨架的方法在本領域中是常規實踐，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的C3 dsRNA試劑、某些修飾的C3反義多核苷酸和/或某些修飾的C3正義多核苷酸。
在本發明的某些實施方案中，RNA模擬物被包括在C3 dsRNA、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸中，例如但不限於用新基團替換核苷酸單元的糖和核苷間鍵聯（即骨架）。在此類實施方案中，保持鹼基單位以與合適的C3核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物（已被證明具有優異雜交特性的RNA模擬物），被稱爲肽核酸（PNA）。在PNA化合物中，RNA 的糖骨架被含有醯胺的骨架，特別是氨乙基甘氨酸骨架取代。核鹼基被保留並直接或間接地與骨架醯胺部分的氮雜氮原子結合。製備RNA模擬物的方法是本領域常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的C3 dsRNA試劑。
本發明的一些實施方案包括具有硫代磷酸酯骨架的RNA和具有雜原子骨架的寡核苷，特別是-CH 2-NH-CH 2-、-CH 2-N(CH 3)-O-CH 2-[稱爲亞甲基（甲基亞氨基）或 MMI 骨架]、-CH 2-O-N(CH 3)-CH 2-、-CH 2-N(CH 3)-N(CH 3)-CH 2-以及-N(CH 3)-CH 2-[其中天然磷酸二酯骨架表示爲-O-P-O-CH 2-]。製備具有硫代磷酸酯骨架的RNA和具有雜原子骨架的寡核苷的方法是本領域常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的C3 dsRNA試劑、某些C3反義多核苷酸和/或某些C3正義多核苷酸。
修飾的RNA還可以包含一個或更多個取代的糖部分。本發明的C3 dsRNA、C3 反義多核苷酸和/或C3 正義多核苷酸可在2'位置包含以下之一：OH；F；O-、-S-、或N-烷基；O-、-S-或N-烯基；O-、-S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C 1至C 10烷基或C 2至C 10烯基和炔基。示例性的合適的修飾包括：O[(CH 2) nO] mCH 3、O(CH 2) nOCH 3、O(CH 2) nNH 2、O(CH 2) nCH 3、O(CH 2) nONH 2、以及O(CH 2) nON[(CH 2) nCH 3)] 2，其中n和m爲1至約10。在其他實施方案中，dsRNA在2'位置包括以下之一：C 1至C 10低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH 3、OCN、Cl、Br、CN、CF 3、OCF 3、SOCH 3、SO 2CH 3、ONO 2、NO 2、N 3、NH 2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基；取代的甲矽烷基、RNA 裂解基團、報告基團、嵌入劑；用於改善C3 dsRNA試劑的藥代動力學特性的基團；或用於改善C3 dsRNA 試劑、C3 反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸的藥效學特性的基團，和其他具有類似性質的取代基。在一些實施方案中，修飾包括2'-甲氧基乙氧基（2'-O-CH 2CH 2OCH 3，也稱爲2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE）(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)，即烷氧基-烷氧基。另一種示例性修飾是2'-二甲氨基乙氧基乙氧基，即O(CH 2) 2ON(CH 3) 2基團，也稱爲 2'-DMAOE，如下文實施例中所述；以及2'-二甲氨基乙氧基乙氧基（在本領域中也稱爲 2'-O-二甲氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)。製備所描述的那些的修飾RNA的方法是本領域常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的C3 dsRNA試劑。
其他修飾包括 2'-甲氧基（2'-OCH 3）、2'-氨基丙氧基 （2'-OCH 2CH 2CH 2NH 2）和2'-氟（2'-F）。類似的修飾也可以在本發明的C3 dsRNA 試劑、C3 反義多核苷酸的RNA上的其他位置、C3正義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸的其他位置，特別是3'末端核苷酸上或2'-5'連接的C3 dsRNA、C3反義多核苷酸或C3正義多核苷酸中的糖的3'位置、和5'末端核苷酸的5'位置進行。C3 dsRNA 試劑、C3 反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸也可以具有糖模擬物，例如代替呋喃戊糖的環丁基部分。製備例如所描述的那些的修飾RNA的方法是本領域常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的C3 dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸。
在一些實施方案中，C3 dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸可以包括核鹼基（在本領域中通常簡稱爲“鹼基”）修飾或取代。如本文所用，“未修飾的”或“天然”核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核鹼基包括其他合成和天然核鹼基，例如 5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基和其他腺嘌呤和鳥嘌呤的烷基衍生物、2-丙基和其他腺嘌呤和鳥嘌呤的烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶；8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基以及其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-鹵代，特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-氮雜鳥嘌呤和7-氮雜腺嘌呤以及3-氮雜鳥嘌呤和3-氮雜腺嘌呤。可以包含在本發明的C3 dsRNA試劑的某些實施方案中的另外的核鹼基是本領域已知的，參見例如：Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. Ed. Wiley-VCH, 2008; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, Ed. John Wiley & Sons, 1990, English et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993。製備包含核鹼基修飾和/或取代的dsRNA、C3反義鏈多核苷酸和/或C3正義鏈多核苷酸(例如本文所述的那些)的方法是本領域常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的C3 dsRNA試劑、C3正義多核苷酸和/或C3反義多核苷酸。
本發明的C3 dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸的某些實施方案包括經修飾以包括一種或更多種鎖核酸（LNA）的RNA。鎖核酸是具有這樣的修飾核糖部分的核苷酸，其包含額外的連接2'和4'碳的橋。這種結構有效地將核糖“鎖定”在 3'-內結構構象中。在本發明的C3 dsRNA 試劑、C3 反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸中添加鎖核酸可以增加血清中的穩定性，並減少脫靶效應（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, O R. et al., (2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。製備包含鎖核酸的dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸的方法是本領域常規實施的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的C3 dsRNA試劑。本發明的C3 dsRNA化合物、正義多核苷酸和/或反義多核苷酸的某些實施方案包括至少一種修飾的核苷酸，其中所述至少一種修飾的核苷酸包含：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-脫氧核苷酸、2',3'-seco 核苷酸模擬物、鎖核苷酸、2'-F-***糖核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸和3'-Ome核苷酸、包含 5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸，或與膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、氨基磷酸酯或包含核苷酸的非天然鹼基。在一些實施方案中，C3 dsRNA化合物在反義鏈（在本文中也稱爲引導鏈）的5’末端處包含E-乙烯基膦酸酯核苷酸。
本發明的某些實施方案中，在C3 dsRNA化合物、正義多核苷酸的3'和5'末端和/或反義多核苷酸的3'末端包含至少一種修飾的核苷酸，其中至少一種修飾的核苷酸包括：無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2'-OMe核苷酸、反向2'-脫氧核苷酸。本領域技術人員已知，在寡核苷酸末端包含無鹼基或反向無鹼基核苷酸可增强穩定性 （Czauderna et al. Structural variations and stabilizing modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2003;31(11):2705-2716. doi:10.1093/nar/gkg393）。
本發明的某些實施方案中，C3 dsRNA化合物、反義多核苷酸包含至少一種修飾的核苷酸，其中所述至少一種修飾的核苷酸包含開環核酸核苷酸（UNA）或/和二醇核酸核苷酸（GNA）。本領域技術人員已知，UNA和GNA是熱不穩定化學修飾，可以顯著改善siRNA化合物的脫靶譜 （Janas, et al., Selection of GalNAc-conjugated siRNAs with limited off-target-driven rat hepatotoxicity. Nat Commun. 2018;9(1):723. doi:10.1038/s41467-018-02989-4; Laursen et al., Utilization of unlocked nucleic acid (UNA) to enhance siRNA performance in vitro and in vivo. Mol BioSyst. 2010;6:862–70）。
在某些實施方案中，本發明關於用於治療的開環核酸（UNA）寡聚體。開環核酸（unlocked nucleic acid，UNA）是RNA的無環類似物，其中核糖環的C2'和C3'原子之間的鍵已被切斷。已經證明，摻入UNA對 siRNA基因沉默活性具有良好的耐受性，在某些情况下甚至可以增强其活性（Meghan A. et al. “Locked vs. unlocked nucleic acids (LNA vs. UNA): contrasting structures work towards common therapeutic goals”. Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 5680–5689 ）。
UNA是一種熱不穩定修飾，用UNA替換核糖核苷酸會降低鹼基配對强度和雙鏈體穩定性。將UNA策略性地放置在siRNA反義鏈的種子區域可以降低通過microRNA (miRNA)介導的基因沉默機制中的脫靶活性。miRNA主要通過反義種子區（從5'端開始的第2-8位）與靶mRNA之間的鹼基配對來識別靶基因，以進行基因抑制。每個miRNA都可能調節大量基因。RNA誘導沉默複合物（RISC）所加載的siRNA反義鏈也可以通過miRNA介導的機制潜在地調節大量非預期基因。因此，在siRNA的種子區域中加入熱不穩定的核苷酸，如UNA，可以降低脫靶活性（Lam JK, Chow MY, Zhang Y, Leung SW. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Sep 15;4(9):e252. doi: 10.1038/mtna.2015.23. PMID: 26372022; PMCID: PMC4877448.）。具體而言，這樣的RNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸的複合物在種子區域含有至少一個UNA核苷酸單體（Narendra Vaish et al. “Improved specificity of gene silencing by siRNAs containing unlocked nucleobase analog”. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 5 1823–1832）。
根據本技術方案，在RNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸的複合物中並入UNA的潜在優勢包括但不限於：
1. 減少脫靶活性。在siRNA種子區添加UNA會降低種子區的鹼基配對强度，從而降低由micro-RNA機制引起的潜在脫靶活性。
2. UNA在siRNA活性方面具有良好的耐受性。在某些情况下，UNA 可以導致活性增强。
可用於本技術方案的示例性UNA單體包括但不限於： 。
Invab是反向無鹼基(脫氧核糖)殘基。例如，在一些實施方案中，Invab：在一些實施方案中，有義鏈或反義鏈可包括“末端帽”，其如本文所用是可以在本文公開的RNAi試劑的鏈的一個或多個末端處並入的非核苷酸化合物或其他部分，並且在一些情况下可以爲RNAi試劑提供某些有利特性，諸如例如針對核酸外切酶降解的保護。在一些實施方案中，反向無鹼基殘基(Invab)作爲末端帽添加 (參見，例如F. Czauderna,   Nucleic Acids Res., 2003,31(11),2705-16)。末端帽通常是本領域中已知的，在一些實施方案中，末端帽存在於有義鏈的5'末端處、3'末端處或5'和3'末端兩者處。
可以在本發明的某些實施方案的C3 dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸的RNA中包含另一種修飾，其包括分別增强C3 dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸的一種或更多種特徵的一種或更多種配體、部分或與RNA化學連接的綴合物。可以增强的特徵的非限制性實例是：C3 dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸活性、細胞分布、C3 dsRNA 試劑的遞送、C3 dsRNA 試劑的藥代動力學特性以及 C3 dsRNA 試劑的細胞攝取。在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑包含一個或更多個靶向基團或連接基團，在本發明的C3 dsRNA試劑的某些實施方案中，其與正義鏈綴合。靶向基團的非限制性實例是包含N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）的化合物。術語“靶向基團”、“靶向劑”、“連接劑”、“靶向化合物”和“靶向配體”在本文中可互換使用。在本發明的某些實施方案中，C3 dsRNA試劑包含與正義鏈的5'-末端綴合的靶向化合物。在本發明的某些實施方案中，C3 dsRNA試劑包含與正義鏈的3'-末端綴合的靶向化合物。在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑包含含有GalNAc的靶向基團。 在本發明的某些實施方案中，C3 dsRNA試劑不包含與正義鏈的3'-末端和5'-末端之一或兩者綴合的靶向化合物。在本發明的某些實施方案中，C3 dsRNA試劑不包含與正義鏈的5'-末端和3'-末端之一或兩者綴合的含有GalNAc的靶向化合物。
另外的靶向和連接劑是本領域衆所周知的，例如，可用於本發明的某些實施方案中的靶向和連接劑包括但不限於脂質部分，例如膽固醇部分 （Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）、膽酸 （Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）、硫醚，例如beryl-S-三苯甲基硫醇（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、硫膽固醇（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）、脂肪鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基-銨1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、聚胺或聚乙二醇鏈（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）或金剛烷乙酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）、棕櫚醯部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）或十八胺或己氨基-羰氧基膽固醇部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）。
包含C3 dsRNA試劑、C3反義多核苷酸和/或C3正義多核苷酸的組合物的某些實施方案可包含改變C3 dsRNA試劑的分布、靶向等性質的配體。在包含本發明的C3 dsRNA試劑的組合物的一些實施方案中，例如與不存在此類配體的物種相比，配體增加對選定靶標（例如分子、細胞或細胞類型、區室，例如細胞或器官區室、組織、器官或身體區域）的親和力。在本發明的組合物和/或方法中有用的配體可以是天然存在的物質，例如蛋白質（例如人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）或球蛋白）、碳水化合物（例如，葡聚糖、支鏈澱粉、幾丁質、殼聚糖、菊粉、環糊精或透明質酸）或脂質。配體也可以是重組或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸或聚胺。 聚氨基酸的實例是聚賴氨酸（PLL）、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙醇酸)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物（HMPA）、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物，或聚磷嗪。多胺的示例包括：聚乙烯亞胺、聚賴氨酸（PLL）、精胺、亞精胺、多胺、假肽-多胺、擬肽多胺、樹枝狀多胺、精氨酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、多胺的季鹽或α螺旋肽。
本發明的組合物和/或方法中包含的配體可包含靶向基團，其非限制性實例爲細胞或組織靶向劑，例如，凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如結合特定細胞類型如腎細胞或肝細胞的抗體。靶向基團可以是促甲狀腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯-半乳糖胺、N-乙醯-葡糖胺多價甘露糖、多價岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、雙膦酸鹽、聚谷氨酸鹽、聚天冬氨酸、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、維生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模擬物。
配體的其他實例包括染料、嵌入劑（例如吖啶）、交聯劑（例如補骨脂素、絲裂黴素 C）、卟啉（TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin）、多環芳烴（例如吩嗪、二氫吩嗪）；人工核酸內切酶（例如 EDTA）、親脂性分子，例如膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪和肽綴合物（例如，觸角肽、Tat肽）、烷化劑、磷酸鹽、氨基、巰基、PEG（例如，PEG-40K）、MPEG、[MPEG] 2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性標記物、酶、半抗原（例如生物素）、轉運/吸收促進劑（例如阿司匹林、維生素 E、葉酸）、合成核糖核酸酶（例如咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑偶聯物、四氮雜大環的Eu 3+複合物）、二硝基苯基、HRP或AP。
本發明的組合物和/或方法中包括的配體可以是蛋白質，例如糖蛋白或肽，例如對共配體具有特定親和力的分子，或抗體，例如與特定細胞類型如癌細胞、內皮細胞、心肌細胞 或骨細胞結合的抗體。在本發明的組合物和/或方法的實施方案中有用的配體可以是激素或激素受體。在本發明的組合物和/或方法的實施方案中有用的配體可以是脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔酶、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯-半乳糖胺、N-乙醯-葡糖胺多價甘露糖或多價岩藻糖。在本發明的組合物和/或方法的實施方案中有用的配體可以是例如通過破壞細胞的細胞骨架（例如，通過破壞細胞的微管、微絲和/或中間絲）而增加C3 dsRNA試劑向細胞中的攝取的物質。此類試劑的非限制性實例是：紫杉醇、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、促進微絲聚合劑、紅海海綿素A、鬼筆環肽、猪苓內酯A、茚滿新鹼和肌鈣蛋白。
在一些實施方案中，與本發明的C3 dsRNA試劑連接的配體用作藥代動力學(PK)調節劑。 可用於本發明的組合物和方法的PK調節劑的實例包括但不限於：親脂劑、膽汁酸、類固醇、磷脂類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素、膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、維生素E、生物素、結合血清蛋白的適體等。還已知包含許多硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸與血清蛋白結合，因此，在骨架中包含多個硫代磷酸酯鍵的短寡核苷酸，例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基的寡核苷酸也可用作本發明的組合物和/或方法中的配體。 C3 dsRNA 試劑組合物
在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑在組合物中。本發明的組合物可包含一種或更多種C3 dsRNA試劑和任選的一種或更多種藥學上可接受的載體、遞送劑、靶向劑、可檢測標簽等，根據本發明方法的一些實施方案可用的靶向劑的非限制性實例是將本發明的C3 dsRNA試劑引導至和/或進入待治療細胞的試劑。靶向劑的選擇將取決於以下要素：C3 相關疾病或病症的性質，以及靶細胞類型。在一個非限制性實例中，在本發明的一些實施方案中，可能需要將C3 dsRNA試劑靶向至和/或進入肝細胞。應當理解，在本發明方法的一些實施方案中，治療劑包含僅具有遞送劑的C3 dsRNA試劑，例如包含N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）的遞送劑，而沒有任何附加的連接元件。例如，在本發明的一些方面，C3 dsRNA試劑可以連接到包含GalNAc的遞送化合物上，並且包含在含有藥學上可接受載體的組合物中，並且在沒有任何連接至C3 dsRNA試劑的可檢測標記或靶向劑等的情况下施用至細胞或對象。
在本發明的C3 dsRNA試劑與一種或更多種遞送劑、靶向劑、標記劑等一起施用和/或連接到其上的情况下，本領域技術人員能夠瞭解並能夠選擇和使用適合的試劑用於本發明的方法中。在本發明的某些方法中可以使用標記試劑來確定C3 dsRNA試劑在細胞和組織中的位置，並且可用於確定已在本發明的方法中施用的包含C3 dsRNA試劑的治療組合物的細胞、組織或器官位置。接附和使用標記試劑如酶標記、染料、放射性標記等的手段是本領域公知的。應當理解，在本發明的組合物和方法的一些實施方案中，標記試劑連接至C3 dsRNA試劑中所包含的正義多核苷酸和反義多核苷酸之一或兩者。 C3 dsRNA 試劑和 C3 反義多核苷酸試劑的遞送
本發明方法的某些實施方案包括將C3 dsRNA試劑遞送到細胞中。 如本文所用，術語“遞送”是指促進或影響細胞攝取或吸收。C3 dsRNA試劑的吸收或攝取可通過獨立的擴散或活性細胞過程來發生，或通過使用可與本發明的C3 dsRNA試劑相關的遞送劑、靶向劑等來進行。適用於本發明方法的遞送方式包括但不限於體內遞送，其中將C3 dsRNA試劑注射到組織部位或全身給藥。在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑連接至遞送劑。
可用於將C3 dsRNA試劑遞送至細胞、組織和/或對象的方法的非限制性實例包括：C3 dsRNA-GalNAc綴合物、SAMiRNA技術、基於LNP的遞送方法和裸RNA遞送。 這些和其他遞送方法已在本領域成功地用於遞送治療性RNAi試劑以治療各種疾病和病症，例如但不限於：肝病、急性間歇性卟啉症（AIP）、血友病、肺纖維化等。多種遞送方式的詳細信息可在出版物中找到，例如：Nikam, R.R. & K. R. Gore (2018) Nucleic Acid Ther, 28 (4), 209-224 Aug 2018; Springer A.D. & S.F. Dowdy (2018) Nucleic Acid Ther. Jun 1; 28(3): 109–118; Lee, K. et al., (2018) Arch Pharm Res, 41(9), 867-874; 和Nair, J.K. et al., (2014) J. Am. Chem. Soc. 136:16958-16961，其內容均以引用方式並入本文。
本發明的一些實施方案包括使用脂質奈米顆粒（LNP）將本發明的C3 dsRNA試劑遞送至細胞、組織和/或對象。LNP 通常用於體內遞送 C3  dsRNA 試劑，包括治療性 C3 dsRNA 試劑。使用LNP或其他遞送劑的一個好處是，當使用LNP或其他遞送劑遞送至對象時，C3 RNA劑的穩定性增加。在本發明的一些實施方案中，LNP包含負載有一種或更多種本發明的C3 RNAi分子的陽離子LNP。將包含C3 RNAi分子的 LNP施用於對象，LNP及其接附的C3 RNAi分子通過胞吞作用被細胞攝取，它們的存在導致RNAi觸發分子的釋放，從而介導RNAi。
可用於本發明的實施方案以將本發明的C3 dsRNA試劑遞送至細胞、組織和/或對象的遞送劑的另一個非限制性實例是：包含GalNAc的試劑，其與本發明的C3 dsRNA試劑連接並將C3 dsRNA試劑遞送至細胞、組織和/或對象。PCT申請WO2020191183 A1 中公開了可用於本發明的方法和組合物的某些實施方案中的某些包含GalNAc的其他遞送劑的實例。可用於本發明的組合物和方法中以將C3 dsRNA試劑遞送至細胞的GalNAc 靶向配體的非限制性實例是靶向配體簇。在此提出的靶向配體簇的實例如：具有磷酸二酯鍵的GalNAc配體（GLO）和具有硫代磷酸酯鍵的GalNAc配體（GLS）。術語“GLX-n”在本文中可用於表示所連接的含GalNAC的化合物舉例並不局限於是以下化合物：GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-5、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、GLS-10、GLS-11、GLS-12、GLS-13、GLS-14、GLS-15、GLS-16、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16中的任一種，每個的結構如下所示，下圖中GalNAc靶向配體與本發明的RNAi劑的連接位置在每個靶向配體的最右側。應當理解，本發明的任何RNAi和dsRNA分子都可以連接到GLS-1、GLS-2、GLS-3、GLS-4、GLS-5、GLS-6、GLS-7、GLS-8、GLS-9、GLS-10、GLS-11、GLS-12、GLS-13、GLS-14、GLS-15、GLS-16、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16上，以下是GLO-1到GLO-16和GLS-1到GLS-16 的結構。
GLO-1 GLS-1
GLO-2 GLS-2
GLO-3 GLS-3
GLO-4 GLS-4
GLO-5 GLS-5
GLO-6 GLS-6
GLO-7 GLS-7
GLO-8 GLS-8
GLO-9 GLS-9
GLO-10 GLS-10
GLO-11 GLS-11
GLO-12 GLS-12
GLO-13 GLS-13
GLO-14 GLS-14
GLO-15 GLS-15
GLO-16 GLS-16   。
“雜環烷基”表示具有指定數目的環原子的非芳族的部分飽和的或完全飽和的環(例如，3-10 或 3-7 元雜環烷基)，所述環原子由一個或多個選自 N、O 和 S 的雜原子(例如， 1、2、3 或 4 個雜原子)組成，且其餘的環原子爲碳。5 元雜環烷基是具有 5 個 環原子的雜環烷基。6 元雜環烷基是具有 6 個環原子的雜環烷基。雜環烷基可以是單環或多環(例如，二環、三環)的。雜環烷基的例子包括氧雜環丙基、氮雜環丙基、氮雜環丁基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、呱啶基、呱嗪基、 嗎啉基和硫代嗎啉基。此外，多環雜環烷基的一個環可以爲芳族的(例如，芳基或雜芳基)，只要所述多環雜環烷基經由非芳族碳或氮原子結合至母體結構。例如，1,2,3,4-四氫喹啉-1-基(其中所述部分經 由非芳族氮原子結合至母體結構)被認爲是雜環烷基，而 1,2,3,4-四氫喹啉-8-基 (其中所述部分經由芳族碳原子結合至母體結構)不被認爲是雜環烷基。低級雜環烷烴一般是指 C 3-6個單環，在無特殊說明情况下，低級雜環烷基一般可優先 爲完全飽和的碳環。在本發明的一些實施方案中，體內遞送也可以通過β-葡聚糖遞送系統，例如美國專利No. 5,032,401和5,607,677, 以及美國公布No. 2005/0281781中描述的那些，它們的全部內容通過引用並入本文。也可以使用本領域已知的方法例如電穿孔和脂質轉染將C3 RNAi試劑體外引入細胞。在本發明方法的某些實施方案中，C3 dsRNA在沒有靶向劑的情况下被遞送。這些RNA可以作爲“裸”RNA分子遞送。作爲非限制性實例，本發明的C3 dsRNA可以在包含RNAi試劑但不包含靶向劑（例如 GalNAc 靶向化合物）的藥物組合物中施用於對象，以治療對象的C3相關疾病或病症，例如腎病。
應當理解，除了本文描述的某些遞送方式之外，其他RNAi遞送方式可以與本文描述的C3 RNAi試劑和治療方法的實施方案結合使用，例如但不限於本文描述的那些和本領域中使用的那些。
本發明的C3 dsRNA試劑可以以有效降低細胞和/或對象中C3多肽的水平和活性的量和方式施用於對象。在本發明方法的一些實施方案中，將一種或更多種C3 dsRNA試劑施用於細胞和/或對象以治療與C3表達和活性相關的疾病或病症。在一些實施方案中，本發明的方法包括向需要此類治療的對象施用一種或更多種C3 dsRNA試劑以減輕對象中與C3表達相關的疾病或病症。可以施用本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑以降低體外、離體和體內細胞中的一種或更多種中的C3表達和/或活性。
在本發明的一些實施方案中，通過將C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑遞送（例如引入）細胞中來降低細胞中C3多肽的水平並因此降低其活性。靶向劑和方法可用於幫助將C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑遞送至對象內的特定細胞類型、細胞亞型、器官、空間區域，和/或細胞內的亞細胞區域。C3 dsRNA試劑可以在本發明的某些方法中單獨地或與一種或更多種另外的C3 dsRNA試劑組合施用。在一些實施方案中，向對象施用2、3、4或更多種獨立選擇的C3 dsRNA試劑。 在本發明的某些實施方案中，將C3 dsRNA試劑與一種或更多種用於治療C3相關疾病或病症的另外的治療方案聯合施用於對象以治療C3相關疾病或病症。另外的治療方案的非限制性實例是：施用一種或更多種本發明的C3反義多核苷酸、施用非C3 dsRNA治療劑和行爲改變。可以在以下一個或更多個時間施用另外的治療方案：在施用本發明的C3 dsRNA試劑之前、同時和之後。應當理解，本文所用的“同時”是指在零時間的5分鐘內、零時間的10分鐘內、零時間的30分鐘內、零時間的45分鐘內和零時間的60分鐘內，其中“零時間”是向對象施用本發明的C3 dsRNA試劑的時間。非C3 dsRNA 治療劑的非限制性實例是：另外的治療劑，如例如抗補體 組分 C5 抗體或其抗原結合片段（例如依庫珠單抗）、iRNA 靶向補體成分 C5 和/或 C3 肽抑制劑（例如康普辛伐他汀）的藥劑， 從而治療患有將從C3減少中受益的疾病的受試者表達，或上述任何的組合，及配製成藥劑組合的治療成人和兒童陣發性睡眠性血紅蛋白尿症和非典型溶血性***候群治療劑。行爲改變的非限制性實例是：飲食方案、諮詢和鍛煉方案。這些和其他治療劑以及行爲改變是本領域已知的，並且可用於治療對象的C3疾病或病症，並且還可以與一種或更多種本發明的C3 dsRNA試劑組合，向對象給藥以治療C3疾病或病症。向細胞或對象施用以治療C3相關疾病或病症的本發明的C3 dsRNA試劑可以與一種或更多種其他治療劑或活性成分以協同方式起作用，從而增加一種或更多種治療劑或活性成分的有效性和/或增加C3 dsRNA試劑治療C3相關疾病或病症的有效性。
本發明的治療方法包括施用C3 dsRNA試劑，可在 C3 相關疾病或病症發作之前和/或當存在C3相關疾病或病症時使用，包括在疾病或病症的早期、中期、晚期階段以及任何這些階段之前和之後的所有時間使用。本發明的方法還可以治療先前已經接受過一種或更多種其他治療劑和/或治療活性成分的C3相關疾病或病症治療的對象，其中一種或更多種其他治療劑和/或治療活性成分在治療對象的C3相關疾病或病症方面不成功、成功性最小和/或不再成功。 載體編碼的 dsRNA
在本發明的某些實施方案中，可以使用載體將C3 dsRNA試劑遞送到細胞中。C3 dsRNA 試劑轉錄單位可包含在DNA或RNA載體中。用於將序列遞送到細胞和/或對象中的此類編碼轉基因的載體的製備和使用是本領域公知的。可在本發明的方法中使用導致C3 dsRNA瞬時表達的載體，瞬時表達例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小時或更多小時、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 周或更多周。瞬時表達的長度可以使用基於以下要素的常規方法確定：例如但不限於所選的特定載體構建體和靶細胞和/或組織。此類轉基因可作爲線性構建體、環狀質粒或病毒載體引入，其可爲整合或非整合載體。也可以構建轉基因以使其作爲染色體外質粒遺傳（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
C3 dsRNA試劑的一條或更多條單鏈可以從表達載體上的啓動子轉錄。在要表達兩條單獨的鏈以産生例如dsRNA的情况下，可以使用例如轉染或感染的方式將兩個單獨的表達載體共同引入細胞。在某些實施方案中，本發明的C3 dsRNA試劑的每條單獨鏈都可以被包含在同一表達載體上的啓動子轉錄。在本發明的某些實施方案中，C3 dsRNA試劑被表達爲通過接頭多核苷酸序列連接的反向重複多核苷酸，使得C3 dsRNA試劑具有莖環結構。
RNA表達載體的非限制性實例是DNA質粒或病毒載體。在本發明的實施方案中有用的表達載體可以與真核細胞相容。真核細胞表達載體在本領域是常規使用的，並且可從許多商業來源獲得。C3 dsRNA 表達載體的遞送可以是全身性的，例如通過靜脈內或肌肉內給藥、通過給藥至從對象移出的靶細胞然後將靶細胞重新引入對象，或通過允許引入所需靶細胞的任何其他方式來進行。
可包括在該方法的實施方案中的病毒載體系統包括但不限於：(a)腺病毒載體；(b) 逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c) 腺相關病毒載體；(d) 單純疱疹病毒載體；(e) SV 40 載體；(f) 多瘤病毒載體；(g) 乳頭狀瘤病毒載體；(h) 小核糖核酸病毒載體；(i) 痘病毒載體，例如正痘病毒載體，例如痘苗病毒載體或禽痘病毒載體，例如金絲雀痘或家禽痘病毒載體；(j) 輔助依賴型或無腸腺病毒載體。用於重組表達C3 dsRNA試劑的構建體可以包含調節元件，例如啓動子、增强子等，它們可以被選擇以提供組成型或調節型/誘導型表達。病毒載體系統以及啓動子和增强子的使用等在本領域是常規的並且可以與本文所述的方法和組合物結合使用。
本發明的某些實施方案包括使用病毒載體將C3 dsRNA試劑遞送到細胞中。許多基於腺病毒的遞送系統在本領域中常規用於遞送至例如肺、肝、中樞神經系統、內皮細胞和肌肉。可用於本發明方法的病毒載體的非限制性實例是：AAV載體、痘病毒如痘苗病毒、改良安卡拉病毒（MVA）、NYVAC、禽痘如禽痘或金絲雀痘病毒。
本發明的某些實施方案包括使用載體將C3 dsRNA試劑遞送到細胞中的方法，並且此類載體可以在藥學上可接受的載體中，所述載體可以但不必包括其中嵌入基因遞送載體的緩釋基質。在一些實施方案中，用於遞送C3 dsRNA的載體可以由重組細胞産生，並且本發明的藥物組合物可以包括一種或更多種産生C3 dsRNA遞送系統的細胞。 含有 C3 dsRNA 或 ssRNA 試劑的藥物組合物
本發明的某些實施方案包括含有C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑和藥學上可接受的載體的藥物組合物的用途。包含C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的藥物組合物可用於本發明的方法中以降低細胞中的C3基因表達和C3活性，並可用於治療C3相關疾病或病症。此類藥物組合物可以基於遞送方式來配製。用於遞送方式的製劑的非限制性實例是：配製用於皮下遞送的組合物、配製用於通過腸胃外遞送全身給藥的組合物、配製用於靜脈內（IV）遞送的組合物、配製用於鞘內遞送的組合物、配製用於直接遞送至腦中的組合物等。可以使用一種或更多種方式施用本發明的藥物組合物以將C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑遞送到細胞中，例如：表面（例如，通過透皮貼劑）；肺部，例如通過吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括通過霧化器；氣道內、鼻內、表皮和透皮、口服或腸胃外。腸胃外給藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；表皮下，例如通過植入裝置；或顱內，例如通過實質內；鞘內或心室內施用。C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑也可以直接遞送至靶組織，例如直接遞送至肝臟、直接遞送至腎臟等。可以理解的是，“遞送C3 dsRNA試劑”或“遞送C3反義多核苷酸試劑”到細胞中分別包括遞送C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑、直接在細胞中表達C3 dsRNA試劑以及從遞送到細胞中的編碼載體表達C3 dsRNA試劑，或使得C3 dsRNA或C3反義多核苷酸試劑出現在細胞中的任何合適的方式。製劑的製備和使用以及用於遞送抑制性RNA的手段是本領域公知的和常規使用的。
如本文所用，“藥物組合物”包含藥理學有效量的本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑和藥學上可接受的載體。術語“藥學上可接受的載體”是指用於施用治療劑的載體。此類載體包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術語明確排除細胞培養基。對於口服給藥的藥物，藥學上可接受的載體包括但不限於藥學上可接受的賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣以及乳糖，而玉米澱粉和藻酸是合適的崩解劑。黏合劑可包括澱粉和明膠，而潤滑劑（如果存在）通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如果需要，片劑可以用例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之類的材料包衣，以延遲在胃腸道中的吸收。包含在藥物製劑中的試劑在下文進一步描述。如本文所用的術語，例如“藥理學有效量”、“治療有效量”和“有效量”，是指本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑産生預期的藥理學、治療或預防結果的量。例如，如果與疾病或障礙相關的可測量參數至少降低 10% 時，則認爲給定的臨床治療有效，那麽用於治療該疾病或病症的藥物的治療有效量是使該參數降低至少10%所需的量。例如，治療有效量的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑可以將C3多肽水平降低至少10%。藥物組合物可以包含這樣的dsRNAi試劑，其包括例如表1中所顯示的雙鏈體AV00375至AV00447。在一些實施方案中，優選的dsRNAi試劑包括例如雙鏈體AV00375、AV00413、AV00416或AV00429。在另一些實施方案中，優選的表2中dsRNAi試劑包括例如AV00375、AV00413、AV00416或AV00429。 有效量
在一些方面，本發明的方法包括將細胞與有效量的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑接觸以減少所接觸細胞中的C3基因表達。本發明方法的某些實施方案包括以有效降低C3基因表達和治療對象的C3相關疾病或病症的量向對象施用C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑。就減少C3的表達和/或用於治療C3相關疾病或病症而言，所使用的“有效量”是實現所需生物學效果所必需或足夠的量。例如，治療C3相關疾病或病症的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的有效量可以是：(i) 減緩或停止疾病或病症的進展所需的量；(ii) 逆轉、減少或消除疾病或病症的一種或更多種症狀。在本發明的一些方面，有效量是當施用於需要治療C3相關疾病或病症的對象時，導致疾病或病症的預防和/或治療的治療響應的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的量。根據本發明的一些方面，有效量是本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑當與針對C3相關疾病或病症的另一種治療性治療組合或共同施用時，導致預防和/或治療該疾病或病症的治療響應的量。在本發明的一些實施方案中，用本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑治療對象的生物學效應可以是由C3相關疾病或病症引起的症狀的改善和/或完全消除。在本發明的一些實施方案中，生物學效應是C3相關疾病或病症的完全消除，例如通過指示對象沒有C3相關疾病或病症的診斷測試來證明。可檢測的生理症狀的非限制性實例包括在施用本發明的試劑後對象肝臟中脂質積累的減少。其他評估C3相關疾病或病症狀態的本領域已知方式可用於確定本發明的試劑和/或方法對C3相關疾病或病症的影響。
通常在臨床試驗中確定將C3多肽活性降低至治療C3相關疾病或病症的水平的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的有效量，這樣的臨床試驗在盲法研究中爲測試人群與對照人群建立有效劑量。在一些實施方案中，有效量是導致所需響應的量，例如減少細胞、組織和/或患有疾病或病症的對象中的C3相關疾病或病症的量。因此，用於治療可通過降低C3多肽活性治療的 C3相關疾病或病症的C3dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的有效量可以是這樣的量：當施用時，將對象中C3多肽活性的量降低至低於在未施用C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的情况下將存在於細胞、組織和/或對象中的量。在本發明的某些方面，存在於未接觸或施用過本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的細胞、組織和/或對象中的C3多肽活性和/或C3基因表達的水平被稱爲“對照”量。在本發明方法的一些實施方案中，對象的對照量是對象的治療前量；換言之，對象在施用C3試劑之前的水平可以是該對象的對照水平，並且用於與其在向對象施用siRNA後的C3多肽活性和/或C3基因表達水平相比較。在治療C3相關疾病或病症的情况下，期望的響應可以是減少或消除細胞、組織和/或對象中疾病或病症的一種或更多種症狀。減少或消除可以是暫時的，也可以是永久性的。應當理解，可以使用確定C3多肽活性、C3基因表達、症狀評估、臨床測試等的方法來監測C3相關疾病或病症的狀態。在本發明的一些方面，對治療C3相關疾病或病症的期望響應是延遲疾病或病症的發作或甚至預防疾病或病症的發作。
降低C3多肽活性的化合物的有效量也可以通過以下方式確定：評估施用C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑對細胞或對象的生理作用，例如施用後C3相關疾病或病症的減少。對象的測定和/或症狀監測可用於確定本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的功效（其可以在本發明的藥物化合物中給藥），並確定對治療是否有響應。一個非限制性實例是一種或更多種本領域已知的血清脂質譜測試。另一個非限制性示例是：在用本發明的C3 dsRNA試劑治療對象之前和之後，可以使用一種或更多種本領域已知的腎功能測試來確定對象的C3相關腎病或病症的狀態。在另一個非限制性實例中，使用一種或更多種本領域已知的獲得性溶血性貧血、血紅蛋白尿、骨髓衰竭和血栓形成傾向（形成血栓的傾向）測試來確定對象中C3相關疾病的狀態。在該實施例中，疾病包括陣發性睡眠性血紅蛋白尿 (PNH)，並且該測試用於確定在用本發明的C3 dsRNA試劑治療對象之前和之後對象中的溶血水平。
本發明的一些實施方案包括確定向對象施用的本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑來治療C3相關疾病或病症之功效的方法，其通過評估和/或監測對象中C3相關疾病或病症的一種或更多種“生理特徵”來進行。C3相關疾病或病症的生理特徵的非限制性實例是許多患者還會出現腎功能衰竭和血栓栓塞的風險增加事件。確定這種生理特徵的標準方法是本領域已知的，包括但不限於血液測試、成像研究、身體檢查等，該症候群的定義是存在溶血、肝酶升高和血小板計數低。
可以理解的是，可以至少部分地基於這種對對象確定的疾病和/或病症狀態和/或生理特徵的測定結果來修改向對象施用的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的量。治療量可以通過例如以下方式改變：通過改變施用C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的組合物、通過改變給藥途徑、通過改變給藥時間等，來增加或減少C3-dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的量。C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的有效量將隨著所治療的特定病症、所治療對象的年齡和身體狀况、病情的嚴重程度、治療的持續時間、共同治療的性質（如果有的話）、具體的給藥途徑以及健康從業者知識和專業知識範圍內的其他因素而變化。例如，有效量可取決於對治療C3相關疾病或病症有效的C3多肽活性和/或C3基因表達的所需水平。技術人員可以憑經驗確定用於本發明方法的特定C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的有效量，而無需過度實驗。結合本文提供的教導，通過從本發明的多種C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑中進行選擇，並權衡例如效力、相對生物利用度、患者體重、不良副作用的嚴重程度和優選的給藥方式等因素，可以規劃有效的預防性或治療性治療方案以有效治療特定對象。如在本發明的實施方案中使用的，本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的有效量可以是當與細胞接觸時在細胞中産生所需生物學效應的量。
應當認識到，C3基因沉默可以在表達C3的任何細胞中通過組成型或通過基因組工程進行，並通過任何合適的測定來確定。在本發明的一些實施方案中，通過施用本發明的C3 dsRNA試劑，C3基因表達降低至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在本發明的一些實施方案中，通過施用本發明的C3 dsRNA試劑，C3基因表達減少5%至10%、5%至25%、10%至50%、10%至75%、25%至75%、25%至100%或50%至100%。 給藥
C3 dsRNA試劑和C3反義多核苷酸試劑以足以抑制C3基因表達的劑量在藥物組合物中遞送。在本發明的某些實施方案中，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的劑量爲每千克接受者體重每天0.01至200.0毫克，一般爲每天1至50mg/kg體重、5至40mg/kg體重、10至30mg/kg體重、1至20mg/kg體重、1至10mg/kg體重、4至15mg/kg體重，包括端值。例如，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的每單次給藥可以以從約0.01 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、1.1 mg/kg、1.2 mg/kg、1.3 mg/kg、1.4 mg/kg、1.5 mg/kg、1.6 mg/kg、1.7 mg/kg、1.8 mg/kg、1.9 mg/kg、2 mg/kg、2.1 mg/kg、2.2 mg/kg、2.3 mg/kg、2.4 mg/kg、2.5 mg/kg、2.6 mg/kg、2.7 mg/kg、2.8 mg/kg、2.9 mg/kg、3.0 mg/kg、3.1 mg/kg、3.2 mg/kg、3.3 mg/kg、3.4 mg/kg、3.5 mg/kg、3.6 mg/kg、3.7 mg/kg、3.8 mg/kg、3.9 mg/kg、4 mg/kg、4.1 mg/kg、4.2 mg/kg、4.3 mg/kg、4.4 mg/kg、4.5 mg/kg、4.6 mg/kg、4.7 mg/kg、4.8 mg/kg、4.9 mg/kg、5 mg/kg、5.1 mg/kg、5.2 mg/kg、5.3 mg/kg、5.4 mg/kg、5.5 mg/kg、5.6 mg/kg、5.7 mg/kg、5.8 mg/kg、5.9 mg/kg、6 mg/kg、6.1 mg/kg、6.2 mg/kg、6.3 mg/kg、6.4 mg/kg、6.5 mg/kg、6.6 mg/kg、6.7 mg/kg、6.8 mg/kg、6.9 mg/kg、7 mg/kg、7.1 mg/kg、7.2 mg/kg、7.3 mg/kg、7.4 mg/kg、7.5 mg/kg、7.6 mg/kg、7.7 mg/kg、7.8 mg/kg、7.9 mg/kg、8 mg/kg、8.1 mg/kg、8.2 mg/kg、8.3 mg/kg、8.4 mg/kg、8.5 mg/kg、8.6 mg/kg、8.7 mg/kg、8.8 mg/kg、8.9 mg/kg、9 mg/kg、9.1 mg/kg、9.2 mg/kg、9.3 mg/kg、9.4 mg/kg、9.5 mg/kg、9.6 mg/kg、9.7 mg/kg、9.8 mg/kg、9.9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg、20 mg/kg、21 mg/kg、22 mg/kg、23mg/kg、24 mg/kg、25 mg/kg、26 mg/kg、27 mg/kg、28 mg/kg、29 mg/kg、30 mg/kg、31 mg/kg、32 mg/kg、33mg/kg、34 mg/kg、35 mg/kg、36 mg/kg、37 mg/kg、38 mg/kg、39 mg/kg、40 mg/kg、41 mg/kg、42 mg/kg、43mg/kg、44 mg/kg、45 mg/kg、46 mg/kg、47 mg/kg、48 mg/kg、49 mg/kg至50 mg/kg體重的量來施用。
在確定本發明的C3 dsRNA試劑的遞送劑量和時間時可以考慮多種因素。遞送的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的絕對量將取決於多種因素，包括共同治療、劑量數和個體對象參數，包括年齡、身體狀况、體格大小和體重。這些是本領域普通技術人員衆所公知的因素，並且可以通過常規實驗解決。在一些實施方案中，可以使用最大劑量，即根據合理的醫學判斷的最高安全劑量。
在一些實施方案中，本發明的方法可包括向對象施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個劑量的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑。在一些情况下，可以至少每天、每隔一天、每周、每隔一周、每月等向對象施用藥物化合物（例如，包含C3 dsRNA試劑或包含C3反義多核苷酸劑）的劑量，可以每天給藥一次或每天給藥多於一次，例如在一個24小時周期內給藥2、3、4、5或更多次。本發明的藥物組合物可以每天給藥一次；或者C3 dsRNA試劑或 C3 反義多核苷酸試劑可以在一天中以適當的間隔以兩個、三個或更多個亞劑量給藥，或者甚至使用連續輸注或通過控釋製劑遞送。在本發明方法的一些實施方案中，將本發明的藥物組合物每天一次或更多次、每周一次或更多次、每月一次或更多次或每年一次或更多次施用給對象。
在某些方面，本發明的方法包括單獨施用藥物化合物；與一種或更多種其他C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑組合；和/或與對患有 C3相關疾病或病症的對象施用的其他藥物療法或治療活動或方案組合。藥物化合物可以以藥物組合物的形式給藥。本發明方法中使用的藥物組合物可以是無菌的，並且含有一定量的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑，其會將C3多肽的活性降低到足以在適合施用於對象的重量或體積單位中産生所需響應的水平。可以根據不同參數選擇向對象施用的包含C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑藥物組合物的劑量以降低C3蛋白活性，特別是根據所使用的給藥方式和對象的狀態來進行選擇。其他因素包括所需的治療時間。如果對象在初始劑量下的響應不足，則可以在患者耐受性允許的範圍內採用更高的劑量（或通過不同的、更局部的遞送途徑有效地提高劑量）。 治療
如本文所用的，術語“預防”或“進行預防”，當用於指將受益於C3基因表達降低的疾病、病症或其病况時，是指對象發生與此類疾病、病症或病况相關的症狀的可能性降低，所述與此類疾病、病症或病况相關的症狀是例如與由C3活化引起或與之相關的疾病或病症相關的症狀，例如C3 腎小球病 (C3G)。在這樣的情况下發生C3 腎小球病 (C3G)的可能性被降低：例如，當個體具有一種或更多種C3 腎小球病 (C3G)風險因素，其相對於具有相同風險因素且未接受本文所述治療的人群而言，未能發展出相關疾病、病症或病症，或與此類疾病、病症或病症相關的症狀的發展程度降低（例如，在臨床上患有該疾病或病症的量表上降低至少約 10%），或延遲症狀的表現（例如，延遲數天、數周、數月或數年），則被認爲是有效的預防。
對於C3相關疾病和病症，其中C3多肽的水平和/或活性的降低可有效治療該疾病或病症，可以使用本發明的方法和C3 dsRNA試劑來治療以抑制C3表達。可以用本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑和本發明的治療方法治療的疾病和病症的實例包括但不限於：C3 腎小球病 (C3G)、免疫複合物介導的腎小球腎炎（IC 介導的 GN）、感染後腎小球腎炎 (PIGN)、系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、缺血/再灌注損傷和 IgA 腎病、陣發性夜間血紅蛋白尿 (PNH)、非典型溶血性***候群 (aHUS)、視神經脊髓炎 (NMO)、多灶性運動神經病 (MMN)、重症肌無力症 (MG)，還已知與補體功能障礙有關其他器官的疾病，例如年齡相關性黃斑變性(AMD)、類風濕性關節炎(RA)、抗中性粒細胞胞漿自身抗體相關血管炎(ANCA-AV)、牙周疾病和牙周病、瘧疾貧血、敗血症以及神經退行性疾病。此類疾病和病症在本文中可稱爲“C3相關疾病和病症”和“由C3引起和/或調節的疾病和病症”。
在本發明的某些方面，可以在診斷C3相關疾病或病症之前或之後的一個或更多個時間向對象施用本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑。在本發明的一些方面，對象處於患有或發展C3相關疾病或病症的風險中。與發展C3相關疾病或病症的對照風險相比，有發展C3相關疾病或病症風險的對象是發展C3相關疾病或病症的可能性提高的對象。在本發明的一些實施方案中，與風險的對照水平相比，風險水平在統計上是顯著的。有風險的對象可包括，例如：是或將是具有預先存在的疾病和/或遺傳異常的對象，其使得該對象比沒有預先存在的疾病或遺傳異常的對照對象更易患C3相關疾病或病症；具有C3相關疾病或病症的家族和/或個人病史的對象；以及先前已接受C3相關疾病或病症治療的對象。應當理解，使對象對C3相關疾病或病症更易感的預先存在的疾病和/或遺傳異常可以是這樣的疾病或遺傳異常：當存在時，其先前已被確定爲與發展C3相關疾病或病症的更高可能性具有相關關係。
應當理解，可以基於個體對象的醫學狀况向對象施用C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑。例如，爲對象提供的醫療保健可以評估從對象獲得的樣品中測量的C3水平，並確定通過施用本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑來降低對象的C3水平是可期望的。在一個非限制性實例中，可以從對象獲得生物樣品，例如血液或血清樣品，並且在樣品中確定對象的C3水平。向對象施用C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑，並且在給藥後從對象獲得血液或血清樣品，並且使用該樣品測定C3水平，並將該結果與對象給藥前（先前）樣品中確定的結果進行比較。與給藥前水平相比，隨後樣品中對象的C3水平降低則表明所施用的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑在降低對象的C3水平方面的功效。在一個非限制性實例中，溶血可以被認爲是C3相關病症的生理特徵，即使對象沒有被診斷爲患有C3相關疾病，例如本文公開的疾病。醫療保健提供者可以監測對象的溶血的變化，作爲施用的本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的功效的量度。 在一個非限制性實例中，補體成分C3相關疾病是陣發性的夜間血紅蛋白尿（PNH）。 PNH 可能是經典 PNH 或 PNH 在另一種骨髓衰竭綜合症候群和/或骨髓增生異常綜合症候群 (MDS) 的情况下，例如， 血細胞減少。
本發明方法的某些實施方案包括調整治療，所述治療包括至少部分地基於對對象中由治療引起的C3 相關疾病或病症一種或更多種生理特徵的變化的評估，來向對象施用本發明的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑。例如，在本發明的一些實施方案中，可以確定對對象施用的本發明的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的作用，並用於幫助調節隨後向對象施用的本發明的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的量。在一個非限制性實例中，對對象施用本發明的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑，並在施用後測定對象血栓；並且至少部分基於所確定的水平，確定是否需要更高量的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑以提高所施用試劑的生理作用，例如降低或進一步降低對象的溶血。在另一個非限制性實例中，向對象施用本發明的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑，並在給藥後確定對象的溶血，並且至少部分地基於所確定的水平，預期向對象施用更低量的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑。
因此，本發明的一些實施方案包括評估由對象先前治療引起的一種或更多種生理特徵的變化，以調整隨後施用於對象的本發明的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的量。本發明方法的一些實施方案包括對C3相關疾病或病症的生理特徵的1、2、3、4、5、6或更多次測定；評估和/或監測施用的本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的功效；並任選地使用所測定的結果來調整以下一項或更多項：本發明的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑治療對象中C3相關疾病或病症的劑量、給藥方案和/或給藥頻率。在本發明方法的一些實施方案中，向對象施用有效量的本發明的dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的期望結果是：與爲對象確定的先前相比，對象C3轉錄物水平、血漿C3水平、C3基因表達的降低。
如本文所用，術語“治療”、“治療性”或“治療的”當用於C3相關疾病或病症時可指預防性治療、降低對象發展C3相關疾病或病症的可能性，並且也可以指在對象已經發展出C3相關疾病或病症之後爲了消除或降低C3相關疾病或病症的水平而進行的治療、防止C3相關疾病或病症變得更嚴重，和/或與在不存在降低對象中C3多肽活性的療法的情况下的對象相比，減緩對象中C3相關疾病或病症的進展。
本發明的試劑、組合物和方法的某些實施方案可用於抑制C3基因表達。如本文所用，關於C3基因的表達，術語“抑制”、“沉默”、“減少”、“下調”和“敲低”是指例如通過以下一種或更多種情况改變C3基因的表達：分別與由C3基因轉錄的RNA的對照水平、所表達的C3的活性對照水平或由mRNA 翻譯的C3的對照水平相比，當細胞、細胞群、組織、器官或對象與本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑接觸（例如，用其處理）時，其中由基因轉錄的RNA的水平、表達的C3的活性水平，以及由細胞、細胞群、組織、器官或對象中的mRNA翻譯的C3多肽、蛋白質或蛋白質亞基的水平降低。在一些實施方案中，對照水平是未接觸C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑（例如用其處理）的細胞、組織、器官或對象中的水平。 施用方法
C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的多種給藥途徑可用於本發明的方法。特定遞送模式的選擇將至少部分取決於所治療的特定病症和治療功效所需的劑量。一般而言，本發明的方法可以使用醫學上可接受的任何給藥模式來實施，這意味著産生C3相關疾病或病症的有效治療水平而不引起臨床上不可接受的副作用的任何模式。在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑可以通過口服、腸內、黏膜、皮下和/或腸胃外途徑施用。術語“腸胃外”包括皮下、靜脈內、鞘內、肌內、腹膜內和胸骨內注射或輸注技術。其他途徑包括但不限於鼻（例如，通過胃鼻管）、經皮、***、直腸、舌下和吸入。本發明的遞送途徑可包括鞘內、心室內或顱內。在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑可以放置在緩釋基質中並通過將基質放置在對象中來施用。在本發明的一些方面，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑可以使用塗覆有靶向特定細胞或細胞器的遞送劑的奈米顆粒遞送至對象細胞。多種遞送方式、方法、試劑是本領域已知的。遞送方法和遞送劑的非限制性實例在本文別處另外提供。在本發明的一些方面，關於C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的術語“遞送”可以是指：向細胞或對象施用一種或更多種“裸”C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑序列。在本發明的某些方面，“遞送”是指通過轉染方式給予細胞或對象、將包含 C3 dsRNA 試劑或 C3 反義多核苷酸試劑的細胞遞送給對象、將編碼C3 dsRNA試劑或 C3 反義多核苷酸試劑的載體遞送到細胞和/或對象等中。使用轉染方式遞送C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑可包括向細胞和/或對象施用載體。
在本發明的一些方法中，一種或更多種C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑可以以製劑形式給藥，也可以在藥學上可接受的溶液中給藥，其通常可以含有藥學上可接受濃度的鹽、緩衝劑、防腐劑、相容的載體、佐劑和任選的其他治療成分。在本發明的一些實施方案中，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑可以與另一種治療劑一起配製成用於同時給藥。根據本發明的方法，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑可以以藥物組合物的形式給藥。通常，藥物組合物包含C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑和任選的藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體是本領域普通技術人員公知的。如本文所用，藥學上可接受的載體是指不干擾活性成分生物活性（例如，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑抑制細胞或對象中C3基因表達的能力）有效性的無毒材料。施用和遞送用於治療用途的C3dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的多種方法是本領域已知的並且可用於本發明的方法中。
藥學上可接受的載體包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑和本領域公知的其他材料。示例性的藥學上可接受的載體描述於美國專利No. 5,211,657中，而其他載體是本領域技術人員已知的。這種製劑通常可以含有鹽、緩衝劑、防腐劑、相容的載體和任選的其他治療劑。用於醫藥時，該鹽應當是藥學上可接受的，但非藥學上可接受的鹽可以方便地用於製備其藥學上可接受的鹽，不排除在本發明的範圍之外。此類藥理學和藥學上可接受的鹽包括但不限於由以下酸製備的鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。此外，藥學上可接受的鹽可以製備爲鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
本發明方法的一些實施方案包括將一種或更多種C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑直接施用於組織。在一些實施方案中，施用化合物的組織是其中存在或可能出現C3相關疾病或病症的組織，其非限制性實例是肝臟或腎臟。直接組織給藥可以通過直接注射或其他方式實現。許多口服遞送的化合物自然進入並通過肝臟和腎臟，本發明的治療方法的一些實施方案包括向對象口服施用一種或更多種C3 dsRNA試劑。C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑，單獨或與其他治療劑聯合，可以施用一次，或者它們可以多次施用。如果多次給藥，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑可以通過不同途徑給藥。例如，雖然不打算限制，第一次（或前幾次）給藥可以通過皮下方式進行，並且一次或更多次額外給藥可以是口服和/或全身給藥。
對於其中希望全身性施用C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑的本發明實施方案，可以配製C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑用於通過注射例如通過推注或連續輸注腸胃外施用。注射製劑可以以單位劑型存在，例如安瓿或多劑量容器，其添加或不添加防腐劑。C3 dsRNA試劑製劑（也稱爲藥物組合物）可採用油性或水性載體中的混懸液、溶液或乳液等形式，並且可含有配製劑，例如混懸劑、穩定劑和/或分散劑。
腸胃外給藥的製劑包括無菌水溶液或非水溶液、混懸液和乳液。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射的有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水、酒精/水溶液、乳液或混懸液，包括鹽水和緩衝介質。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化鈉溶液、乳酸林格氏液或固定油。靜脈內賦形劑包括流體和營養補充劑、電解質補充劑（例如基於林格氏葡萄糖溶液的那些）等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。其他形式的給藥，例如靜脈給藥，將導致較低的劑量。如果對象在初始劑量下的反應不足，則可以在患者耐受性允許的範圍內採用更高的劑量（或通過不同的、更局部的遞送途徑有效地提高劑量）。可以根據需要每天使用多次劑量以實現一種或更多種 C3 dsRNA 試劑或 C3 反義多核苷酸試劑的適當全身或局部水平，並實現C3蛋白活性的適當降低。
在其他實施方案中，本發明的方法包括使用遞送載體，例如生物相容性微粒、奈米顆粒或適合植入受體例如對象的植入物。PCT公開WO 95/24929（通過引用並入本文）中描述了可根據該方法使用的示例性可生物降解植入物，其描述了用於包含生物大分子的生物相容的、可生物降解的聚合物基質。
不可生物降解的和可生物降解的聚合物基質都可用於本發明的方法中，以將一種或更多種C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑遞送給對象。在一些實施方案中，基質可以是可生物降解的。基質聚合物可以是天然或合成聚合物。可以基於期望釋放的時間段來選擇聚合物，通常在幾小時到一年或更長時間的數量級。通常，可以使用在幾小時到三到十二個月之間的一段時間內的釋放。聚合物任選地呈水凝膠形式，其可以吸收高達其重量約90％的水，並且還任選地與多價離子或其他聚合物交聯。
通常，C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑在本發明的一些實施方案中可以使用可生物降解的植入物通過擴散或通過聚合物基質的降解來遞送。用於這種用途的示例性合成聚合物是本領域公知的。使用本領域已知的方法，可生物降解的聚合物和不可生物降解的聚合物可用於遞送C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑。生物黏附聚合物如可生物侵蝕的水凝膠（H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587）也可用於遞送 C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑，以治療C3相關疾病或病症。其他合適的遞送系統可以包括定時釋放、延遲釋放或持續釋放遞送系統。此類系統可避免重複施用C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸劑，從而提高對象和醫療保健專業人員的便利性。許多類型的釋放遞送系統是可用的並且是本領域普通技術人員已知的。見例如美國專利No. 5,075,109、4,452,775、4,675,189、5,736,152、3,854,480、5,133,974和5,407,686。此外，可以使用基於泵的硬件輸送系統，其中一些也適用於植入。
長期持續釋放植入物的使用可以適用於對象的預防性治療和具有發生復發性C3相關疾病或病症的風險的對象。如本文所用，長期釋放是指將植入物構建和布置成以至少長達10天、20天、30天、60天、90天、六個月、一年或更長時間遞送治療水平的C3 dsRNA 試劑或C3反義多核苷酸試劑。長期持續釋放植入物是本領域普通技術人員衆所公知的並且包括上述的一些釋放系統。
C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑的治療製劑可以通過將具有所需純度的分子或化合物與任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑[Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, (2006)]以凍乾製劑或水溶液的形式混合來製備用於儲存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度下對接受者是無毒的，並且包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑（例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲銨氯化物；苯扎氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸酯類，例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚）；低分子量（少於約 10 個殘基）多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇等糖類；形成鹽的反離子，如鈉；金屬配合物（例如，鋅-蛋白質配合物）；和/或非離子表面活性劑，例如TWEEN®、PLURONICS®或聚乙二醇 （PEG）。 細胞、對象和對照
本發明的方法可以與細胞、組織、器官和/或對象結合使用。在本發明的一些方面，對象是人或脊椎動物哺乳動物，包括但不限於狗、猫、馬、牛、山羊、小鼠、大鼠和靈長類動物，例如猴。因此，本發明可用於治療人和非人對象的C3相關疾病或病症。在本發明的一些方面，對象可以是農場動物、動物園動物、馴養動物或非馴養動物，並且本發明的方法可用於獸醫預防和治療方案。在本發明的一些實施方案中，對象是人並且本發明的方法可用於人預防和治療方案。
可應用本發明的對象的非限制性實例是被診斷患有、懷疑患有或有風險患有與以下疾病或病症相關的疾病或病症的對象：高於期望的 C3 表達和/或活性，也稱爲“升高的 C3 表達水平”。與高於期望水平的C3表達和/或活性相關的疾病和病症的非限制性實例在本文別處描述。本發明的方法可應用於在治療時已被診斷爲患有該疾病或病症的對象、與高於期望的 C3 表達和/或活性相關的對象，或被認爲處於患有或發展與高於期望的C3 表達和/或活性相關的疾病或病症的風險中的對象。在本發明的一些方面，與高於期望的C3表達和/或活性水平相關的疾病或病症是急性疾病或病症；在本發明的某些方面，與高於期望的C3表達和/或活性水平相關的疾病或病症是慢性疾病或病症。
在一個非限制性實例中，將本發明的C3 dsRNA試劑施用於被診斷患有腎病，包括但是不局限於：C3 腎小球病 (C3G)、免疫複合物介導的腎小球腎炎（IC 介導的 GN）、感染後腎小球腎炎 (PIGN)、缺血/再灌注損傷和 IgA 腎病、陣發性夜間血紅蛋白尿 (PNH)。本發明的方法可應用於在治療時已被診斷爲患有該疾病或病症的對象，或被認爲有患或發展該疾病或病症的風險的對象。
在另一個非限制性實例中，將本發明的C3 dsRNA試劑施用以治療指因C3被活化導致或與其相關的疾病或障礙，或其症狀或進展響應於C3失活的疾病或障礙。術語“C3相關疾病”包括因C3表達降低而受益的疾病、障礙或病症。這類疾病通常與溶血、肝酶升高和血小板計數低疾病生理特徵相關。腎病包括但是不局限於：C3 腎小球病 (C3G),免疫複合物介導的腎小球腎炎（IC 介導的 GN），感染後腎小球腎炎 (PIGN)、缺血/再灌注損傷和 IgA 腎病、陣發性夜間血紅蛋白尿 (PNH)。在某些實施方式中，C3相關疾病包括陣發性夜間血紅蛋白尿 (PNH)。
在另一個非限制性實例中，將本發明的C3 dsRNA試劑施用以治療用於抑制神經細胞中C3基因表達的分子，例如神經細胞內的神經細胞受試者，例如哺乳動物，例如患有C3相關神經退行性疾病的人，例如，阿爾茨海默病 (AD)、肌萎縮側索硬化症 (ALS)、精神***症、帕金森病 (PD) 和朊病毒疾病，例如克雅氏病 (CJD)。
可應用本發明方法的細胞包括體外、體內、離體細胞。細胞可以在對象中、在培養物中和/或混懸液中，或處於任何其他合適的狀態或條件中。可以應用本發明的方法的細胞可以是：肝臟細胞（liver cell）、肝細胞（hepatocyte）、心臟細胞、胰腺細胞、心血管細胞、腎細胞或其他類型的脊椎動物細胞，包括人和非人哺乳動物細胞。在本發明的某些方面，可應用本發明方法的細胞是健康的正常細胞，其未知爲疾病細胞。在本發明的某些實施方案中，將本發明的方法和組合物應用於肝臟細胞、肝細胞、心臟細胞、胰腺細胞、心血管細胞和/或腎細胞的細胞。在本發明的某些方面，對照細胞是正常細胞，但應當理解，具有疾病或病症的細胞也可以在特定情况下用作對照細胞，例如在比較具有疾病或病症的經處理細胞與具有疾病或病症的未處理細胞的結果等的情况下。
根據本發明的方法，可以確定C3多肽活性的水平並將其與C3多肽活性的對照水平進行比較。對照可以是預定值，其可以採取多種形式。它可以是單個截止值，例如中位數或平均值。它可以基於比較組來建立，例如在具有正常水平的C3多肽和/或C3多肽活性的組和具有增加的C3多肽和/或C3多肽活性水平的組中。比較組的另一個非限制性實例可以是具有C3相關疾病或病症的一種或更多種症狀或診斷的群體與沒有疾病或病症的一種或更多種症狀或診斷的群體；已對其施用本發明的siRNA治療的對象組與未對其施用本發明的siRNA治療的對象組。通常，對照可以基於適當年齡組中的明顯健康的正常個體或明顯健康的細胞。應當理解，除了預定值之外，根據本發明的對照可以是與實驗材料平行測試的材料樣品。示例包括來自對照群體的樣品或通過製造産生的對照樣品，以用於與實驗樣品進行平行測試。在本發明的一些實施方案中，對照可包括未用本發明的C3 dsRNA試劑接觸或處理的細胞或對象，在這種情况下，可以比較C3多肽和/或C3多肽活性的對照水平以及與本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑接觸的細胞或對象中C3多肽和/或C3多肽活性的水平。
在本發明的一些實施方案中，對照水平可以是爲對象確定的C3多肽水平，其中將在不同時間爲同一對象確定的C3多肽水平與該對照水平進行比較。在一個非限制性實例中，在從未接受過本發明的C3治療的對象獲得的生物樣品中確定C3的水平。在一些實施方案中，生物樣品是血清樣品。從對象獲得的樣品中測定的C3多肽水平可作爲對象的基線或對照值。在本發明的治療方法中向對象施用一次或更多次C3 dsRNA試劑之後，可以從對象獲得一個或更多個另外的血清樣品，並且可以將隨後的一個或更多個樣品中的C3多肽水平與對象的對照/基線水平進行比較。此類比較可用於評估對象中C3相關疾病或病症的發作、進展或消退。例如，從對象獲得的基線樣品中C3多肽的水平高於在給予對象本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑後從同一對象獲得的水平，則表示C3相關疾病或病症的消退並且表示施用的本發明的C3 dsRNA試劑治療C3相關疾病或病症産生的功效。
在本發明的某些方面，爲對象確定的C3多肽和/或C3多肽活性水平中的一個或更多個值可以作爲對照值，並用於稍後在同一對象中比較C3多肽和/或C3活性水平，從而允許評估對象中“基線”C3多肽活性的變化。因此，將初始水平用作該對象的對照水平的情况下，初始C3多肽水平和/或初始C3多肽活性水平可以用於顯示和/或確定本發明的方法和化合物在對象中所能夠降低對象中C3多肽和/或C3多肽活性的水平。
使用本發明的方法，可以將本發明的C3 dsRNA試劑和/或C3反義多核苷酸試劑施用於對象。這樣的dsRNAi試劑包括例如表1中所顯示的雙鏈體AV00375至AV00447。在一些實施方案中，優選的dsRNAi試劑包括例如雙鏈體AV00375、AV00413、AV00416或AV00429，在另一些實施方案中，優選的dsRNAi試劑包括例如AV00375、AV00413、AV00416或AV00429。可以如下評估本發明的施用和治療的功效：與先前時間點從對象獲得的血清樣品中C3多肽的給藥前水平相比，或與非接觸對照水平（例如對照血清樣品中的C3多肽水平）相比，當施用和治療後，從對象獲得的血清樣品中C3多肽的水平降低至少0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80 %、90%、95%或更多。應當理解，C3多肽的水平和C3多肽活性的水平都與C3基因表達的水平相關。本發明方法的某些實施方案包括以有效抑制C3基因表達的量向對象施用本發明的C3 dsRNA和/或C3反義試劑，從而降低對象中C3多肽的水平並降低C3多肽活性的水平。 在本發明的方法的一些實施方案中，細胞與本發明的siRNA試劑的接觸（在本文中也稱爲處理）導致細胞中C3基因表達抑制至少約1%、2%、 3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19% , 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36 %、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、 53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69% , 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86 %、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或約 100%，例如，至低於化驗檢測水平。
本發明的一些實施方案包括從一個或更多個對象獲得的一個或更多個生物樣品中確定C3多肽的存在、不存在和/或量（本文也稱爲水平）。該測定可用於評估本發明的治療方法的功效。例如，本發明的方法和組合物可用於確定生物樣品中C3多肽的水平，該生物樣品獲自先前用施用本發明的C3 dsRNA試劑和/或C3反義劑治療的對象。與先前時間點從對象獲得的血清樣品中C3多肽的給藥前水平相比，或與非接觸對照水平（例如對照血清樣品中的C3多肽水平）相比，當施用和治療後，從對象獲得的血清樣品中C3多肽的水平降低至少0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80 %、90%、95%或更多，則表明給予對象的治療的功效水平。
在本發明的一些實施方案中，針對對象確定的C3相關疾病或病症的生理特徵可以作爲對照結果，並將同一對象在不同時間的生理特徵的確定結果與對照結果進行比較。在一個非限制性實例中，病理特徵溶血測量自從未給予本發明的C3治療的對象，其可用作對象的基線或對照值。在本發明的治療方法中向對象施用一次或更多次C3 dsRNA試劑之後，血細胞並分別與對象的對照/基線水平進行比較。此類比較可用於評估對象中C3相關疾病或病症的發作、進展或消退。例如，從對象獲得的基線血細胞高於在對對象施用本發明的C3 dsRNA試劑或C3反義多核苷酸試劑後從同一對象測定的血栓，則表示C3相關疾病或病症的消退並且表示施用的本發明的C3 dsRNA試劑治療C3相關疾病或病症的功效。
本發明的一些實施方案包括使用例如但不限於以下方法確定C3相關疾病或病症的生理特徵的存在、不存在和/或變化：(1) 測量對象的血細胞；(2)評估從一名或更多名對象獲得的一份或更多份生物樣品的生理特徵；(3) 或對對象進行身體檢查。該測定可用於評估本發明的治療方法的功效。 藥盒
包含一種或更多種C3 dsRNA試劑和/或C3反義多核苷酸試劑及其在本發明方法中的使用說明的藥盒也在本發明的範圍內。本發明的藥盒可包含可用於治療C3相關疾病或病症的C3 dsRNA試劑、C3正義多核苷酸和C3反義多核苷酸試劑中的一種或更多種。可以製備包含一種或更多種C3 dsRNA試劑、C3正義多核苷酸和C3反義多核苷酸試劑的藥盒以用於本發明的治療方法。本發明藥盒的組分可以以水性介質或凍乾形式包裝。本發明的藥盒可以包含被分隔開以在其中封閉地收納一個或更多個容器裝置或一系列容器裝置（例如試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器等）的載體。第一容器裝置或一系列容器裝置可包含一種或更多種化合物，例如C3 dsRNA試劑和/或C3正義或反義多核苷酸試劑。第二容器裝置或一系列容器裝置可包含靶向劑、標記劑、遞送劑等，其可作爲在本發明的治療方法的實施方案中施用的C3 dsRNA試劑和/或C3反義多核苷酸的一部分包括在內。
本發明的藥盒還可包含說明書。說明通常採用書面形式，並且將爲執行由藥盒體現的治療和基於該治療做出決定提供指導。
提供以下實施例以說明本發明實踐的具體實例，其並不旨在限制本發明的範圍。對本領域普通技術人員來說明顯的是，本發明可應用於多種組合物和方法。 實施例
實施例1.RNAi試劑的合成
上表 2-3 中所示的 C3 RNAi 試劑雙鏈體是根據以下通用程序合成的：
使用基於亞磷醯胺化學的成熟固相合成方法，在寡核苷酸合成儀上合成siRNA的正義和反義鏈序列。寡核苷酸鏈的增長是通過4步循環實現的：去保護、縮合、加帽和用於添加每個核苷酸的氧化或硫化步驟。合成是在由可控多孔玻璃（CPG, 1000 Å）製成的固體支持物上進行的。單體亞磷醯胺購自商業來源。根據本文實施例2-3的程序合成具有GalNAc配體簇的亞磷醯胺（GLPA1、GLPA2和GLPA15作爲非限制性實例）。對於用於體外篩選的 siRNA（表2），合成是在2 μmol 規模下進行的；對於用於體內測試的 siRNA（表3），合成規模爲5 μmol 或更大。在GalNAc配體（作爲非限制性實例的 GLO-0）連接在正義鏈的3'-末端的情况下，使用連接有GalNAc配體的CPG固體支持物。在GalNAc配體（GLS-1、GLS2或GLS-15作爲非限制性實例）連接在正義鏈的5'-末端的情况下，將GalNAc亞磷醯胺（GLPA1、GLPA2或GLPA15作爲非限制性實例）用於最後的偶聯反應。將3%二氯甲烷中的三氯乙酸（TCA）用於4,4'-二甲氧基三苯甲基保護基 （DMT）的脫保護。5-乙硫基-1H-四唑用作活化劑。THF/Py/H 2O中的I 2和吡啶/MeCN中的苯乙醯二硫化物（PADS）分別用於氧化和硫化反應。在最後的固相合成步驟之後，通過用1:1體積的20wt%甲胺水溶液和28%氫氧化銨溶液處理來切割固體載體結合的低聚物並去除保護基團。爲了合成用於體外篩選的siRNA，將粗混合物濃縮。將剩餘的固體溶解在1.0 M NaOAc中，加入冰冷的EtOH以沉澱出作爲鈉鹽的單鏈産物，其無需進一步純化即可用於退火。爲了合成用於體內測試的siRNA，粗單鏈産物通過離子對反相HPLC（IP-RP-HPLC）進一步純化。通過將來自IP-RP-HPLC的純化單鏈寡核苷酸産物溶解在1.0 M NaOAc中並通過添加冰冷的 EtOH 進行沉澱，將其轉化爲鈉鹽。在水中通過等摩爾互補進行正義鏈和反義鏈寡核苷酸的退火，以形成雙鏈siRNA産物，將其凍乾以提供蓬鬆的白色固體。
實施例2.中間體-A和中間體-B的製備
如以下方案1所示，通過在二氯甲烷（DCM）中用三甲基甲矽烷基三氟甲磺酸酯（TMSOTf）處理市售的半乳糖胺五乙酸酯來合成中間體-A。然後用Cbz保護的2-(2-氨基乙氧基)乙-1-醇進行糖基化，得到化合物II。通過氫化除去Cbz保護基團以提供作爲三氟乙酸鹽（TFA）鹽的中間體-A。除了使用Cbz保護的2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇作爲原料之外，中間體B基於相同的方案合成。 中間體-A 中間體-B 方案1
向化合物I（20.0 g, 51.4 mmol）在 100 mL 1,2-二氯乙烷（DCE）中的溶液中加入TMSOTf（17.1 g, 77.2 mmol）。將所得反應溶液在60℃下攪拌2小時，然後在25℃下攪拌1小時；Cbz保護的2-(2-氨基乙氧基)乙-1-醇（13.5 g, 56.5 mmol）在DCE（100 mL）中用4 Å粉末分子篩（10 g）乾燥，在N 2氣氛下在0℃滴加到上述反應溶液中。在N 2氣氛下，將所得反應混合物在25℃下攪拌16小時。過濾反應混合物並用飽和NaHCO 3（200mL）、水（200mL）和飽和鹽水（200mL）洗滌。有機層經無水Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮，得到粗産物，將其與2-甲基四氫呋喃/庚烷（5/3，v/v，1.80L）一起研磨2小時。將所得混合物過濾並乾燥以得到呈白色固體狀的化合物II（15.0g，産率50.3％）。
將 10% Pd/C（1.50 g）小心地加入到乾燥和氬氣吹掃的氫化瓶中，然後加入10毫升四氫呋喃（THF），然後是化合物II（15.0克，26.4毫摩爾）在THF（300毫升）和TFA（三氟乙酸，3.00克，26.4毫摩爾）中的溶液。將所得混合物脫氣並用H2吹掃3次並在H 2（45 psi）氣氛下在25℃下攪拌3小時。薄層色譜法（TLC，溶劑：DCM:MeOH = 10:1）表明化合物II已完全消耗。過濾反應混合物並減壓濃縮。將殘餘物溶解在無水DCM（500mL）中並濃縮。該過程重複3次以得到呈泡沫狀白色固體的中間體-A（14.0g，産率96.5%）。1H NMR (400 MHz DMSO-d6): δ ppm 7.90 (d, J = 9.29 Hz, 1 H), 7.78 (br s, 3 H), 5.23 (d, J = 3.26 Hz, 1 H), 4.98 (dd, J = 11.29, 3.26 Hz, 1 H), 4.56 (d, J = 8.53 Hz, 1 H), 3.98 - 4.07 (m, 3 H), 3.79 - 3.93 (m, 2 H), 3.55 - 3.66 (m, 5 H), 2.98 (br d, J = 4.77 Hz, 2 H), 2.11 (s, 3 H), 2.00 (s, 3 H), 1.90 (s, 3 H), 1.76 (s, 3 H)。
使用與合成中間體-A類似的程序合成中間體-B。1H NMR (400 MHz DMSO-d6): δ ppm 7.90 (br d, J = 9.03 Hz, 4 H), 5.21 (d, J = 3.51 Hz, 1 H), 4.97 (dd, J = 11.1 Hz, 1 H), 4.54 (d, J = 8.53 Hz, 1 H), 3.98 - 4.06 (m, 3 H), 3.88 (dt, J = 10.9 Hz, 1 H), 3.76 - 3.83 (m, 1 H), 3.49 - 3.61 (m, 9 H), 2.97 (br s, 2 H), 2.10 (s, 3 H), 1.99 (s, 3 H), 1.88 (s, 3 H), 1.78 (s, 3 H).計算質譜C20H34N2O11: 478.22; 實測: 479.3 (M+H+)。
實施例3.GalNAc配體簇亞磷醯胺GLPA1、GLPA2和GLPA15的合成。
按照以下方案2製備GLPA1和GLPA2。從苄基保護的丙烷-1,3-二胺開始，用2-溴乙酸叔丁酯對其進行烷基化，得到三酯化合物I。通過氫化除去苄基保護基，得到仲胺化合物II。將醯胺與6-羥基己酸偶聯得到化合物III。然後在用二氧六環中的HCl處理時除去叔丁基保護基以生成三酸化合物IV。進行三酸化合物IV和中間體-A或中間體-B之間的醯胺偶聯以提供化合物Va或Vb。亞磷醯胺GLPA1或GLPA2是通過化合物Va或Vb與2-氰乙基N,N-二異丙基氯亞磷醯胺和催化量的1H-四唑的亞磷酸化合成的。 方案2
向N-苄基-1,3-丙二胺（5.00 g, 30.4 mmol）在二甲基甲醯胺（DMF, 100 mL）中的溶液中加入2-溴乙酸叔丁酯（23.7 g, 121 mmol）；然後滴加二異丙基乙胺（DIEA，23.61g，182mmol）。將所得反應混合物在25-30℃攪拌16小時。 LCMS顯示 N-苄基-1,3-丙二胺被完全消耗。反應混合物用H 2O（500mL）稀釋並用EtOAc（500mL×2）萃取。合並的有機物用飽和鹽水（1L）洗滌，用無水Na 2SO 4乾燥，過濾，減壓濃縮，得到粗産物；經矽膠柱層析純化（梯度：石油醚:乙酸乙酯20:1至5:1）。獲得無色油狀化合物I（12.1g，産率78.4%）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 7.26 - 7.40 (m, 5 H), 3.79 (s, 2 H), 3.43 (s, 4 H), 3.21 (s, 2 H), 2.72 (dt, J= 16.9, 7.34 Hz, 4 H), 1.70 (quin, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.44 - 1.50 (m, 27 H)。
乾燥的氫化瓶用氬氣吹掃3次。加入Pd/C（200mg，10％），然後加入MeOH（5mL），然後加入化合物I（1.00g，1.97mmol）在MeOH（5mL）中的溶液。反應混合物在真空下脫氣並重新填充H 2。這個過程重複3次。將混合物在H 2（15 psi）氣氛下在25℃攪拌12小時。LCMS顯示化合物I被完全消耗。在N 2氣氛下減壓過濾反應混合物。減壓濃縮濾液，得到黃色油狀化合物II（655mg，産率79.7%），其無需進一步純化即可用於下一步。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 3.44 (s, 4 H), 3.31 (s, 2 H), 2.78 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 2.68 (t, J = 6.9 Hz, 2 H), 1.88 (br s, 1 H), 1.69 (quin, J = 7.03 Hz, 2 H), 1.44 - 1.50 (s, 27 H)。
化合物II（655mg，1.57mmol）、6-羥基己酸（249mg，1.89mmol）、DIEA（1.02g，7.86mmol）、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI，904mg，4.72mmol）和1-羥基苯並***（HOBt，637mg，4.72mmol）的DMF（6mL）溶液的混合物脫氣並用N2吹掃3次；然後在N 2氣氛下在 25℃攪拌3小時。LCMS指示所需産物。反應混合物用H 2O（10mL）稀釋並用EtOAc 20mL（10mL×2）萃取。合並有機物並用飽和鹽水（20mL）洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾並濃縮以得到粗産物；將其通過矽膠柱色譜法（梯度：石油醚:乙酸乙酯從5:1至1:1）純化，得到呈黃色油狀的化合物III（650mg，産率77.8%）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 3.90 - 3.95 (s, 2 H), 3.63 (t, J = 6.40 Hz, 2 H), 3.38 - 3.45 (m, 6 H), 2.72 (t, J = 6.65 Hz, 2 H), 2.40 (t, J = 7.28 Hz, 2 H), 1.55 - 1.75 (m, 8 H), 1.44 (s, 27 H). 計算質譜C27H50N2O8: 530.36; 實測: 531.3 (M+H +)。
將化合物III（5.5g，10.3mmol）在HCl/二氧六環（2M，55mL）中的混合物在25℃下攪拌3小時。LCMS顯示完全消耗化合物III。過濾反應混合物，用EtOAc（50mL）洗滌，減壓乾燥，得到粗産物。將其溶解在CH3CN（50mL）中，真空除去揮發物。重複該過程3次以得到呈白色固體狀的化合物IV（2.05g，産率54.5％）。 1H NMR (400 MHz, D2O): δ ppm 4.21 (s, 1 H), 4.07 (d, J = 4.5 Hz, 4 H), 3.99 (s, 1 H), 3.45 - 3.52 (m, 3 H), 3.42 (t, J = 6.5 Hz, 1 H), 3.32 - 3.38 (m, 1 H), 3.24 - 3.31 (m, 1 H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 2.24 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 1.99 (dt, J = 15.5, 7.53 Hz, 1 H), 1.85 - 1.94 (m, 1 H), 1.85 - 1.94 (m, 1 H), 1.39 - 1.56 (m, 4 H), 1.19 - 1.31 (m, 2 H)。
將化合物IV（500 mg, 1.05 mmol）、中間體-A（2.02 g, 3.67 mmol）、DIEA （813 mg, 6.30 mmol）、EDCI（704 mg, 3.67 mmol）和在DMF（10 毫升）中的HOBt（496 mg, 3.67 mmol）的混合物脫氣並用N 2吹掃3次，然後將混合物在N 2氣氛下在25℃攪拌3小時。LCMS 指示所需産物。通過加入H 2O（10mL）淬滅反應混合物，用DCM（10mL×2）萃取。合並的有機物用10%檸檬酸（20mL）萃取。水相用飽和NaHCO 3溶液中和並用DCM（10 mL x 2）再萃取。有機物經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮以産生呈白色固體狀的化合物Va（570mg，0.281mmol，産率26.8％）。 1H NMR: (400 MHz, CDCl3) ppm δ 7.84 - 8.12 (m, 3 H), 6.85 - 7.15 (m, 2 H), 6.66 - 6.81 (m, 1 H), 5.36 (br d, J = 2.7 Hz, 3 H), 5.11 - 5.27 (m, 3 H), 4.63 - 4.85 (m, 3 H), 3.90 - 4.25 (m, 18 H), 3.37 - 3.75 (m, 28 H), 3.15 - 3.28 (m, 4 H), 2.64 (br d, J = 6.53 Hz, 2 H), 2.30 - 2.46 (m, 2 H), 2.13 - 2.18 (m, 9 H), 2.05 (s, 9 H), 1.94 - 2.03 (m, 18 H), 1.68 (br s, 2 H), 1.45 (br s, 2 H), 1.12 (br t, J = 7.0 Hz, 2 H)。
向化合物Va（260 mg, 0.161 mmol）的無水DCM（5 mL）溶液中加入四唑二異丙基銨（30.3 mg, 0.177 mmol）；然後在環境溫度和N 2下滴加3-雙(二異丙基氨基)膦醯氧基丙腈（194 mg, 0.645 mmol）。將反應混合物在20至25℃攪拌2小時。LCMS表明化合物Va被完全消耗。冷却至-20℃後，將反應混合物在0℃加入攪拌的鹽水/飽和NaHCO 3（1:1，5mL）溶液。攪拌1分鐘後，加入DCM（5mL）。出現分層。有機層用鹽水/飽和 NaHCO 3水溶液（1:1, 5 mL）洗滌，用Na 2SO 4乾燥，過濾並濃縮至體積約1 mL。在攪拌下將殘餘溶液滴加到20mL甲基叔丁基醚（MTBE）中。這導致白色固體沉澱。將混合物離心，收集固體。將固體重新溶解在1mL DCM中並通過加入MTBE（20mL）沉澱。再次通過離心分離固體。將收集的固體溶解在無水CH3CN中。除去揮發物。該過程再重複兩次，得到呈白色固體狀的GalNAc配體亞磷醯胺化合物GLPA1（153 mg, 84.4 μmol）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): ppm δ 7.71 - 8.06 (m, 2 H), 6.60 - 7.06 (m, 3 H), 5.37 (br d, J = 3.0 Hz, 3 H), 5.18 - 5.32 (m, 3 H), 4.70 - 4.86 (m, 3 H), 3.92 - 4.25 (m, 18 H), 3.42 - 3.85 (m, 30 H), 3.25 (m, 4 H), 2.59 - 2.75 (m, 4 H), 2.27 - 2.44 (m, 2 H), 2.15 - 2.20 (s, 9 H) 2.07 (s, 9 H), 1.96 - 2.03 (m, 18 H), 1.65 (br s, 4 H), 1.44 (br d, J = 7.28 Hz, 2 H), 1.14 - 1.24 (m, 12 H). 31P NMR (CDCl3): ppm δ 147.15.
除了使用中間體-B之外，使用相同的程序合成GalNAc配體亞磷醯胺化合物GLPA2。1H NMR (400 MHz, CDCl3): ppm δ 7.94 - 8.18 (m, 1 H), 7.69 (br s, 1 H), 6.66 - 7.10 (m, 3 H), 5.35 (d, J = 3.5 Hz, 3 H), 5.07 - 5.25 (m, 3 H), 4.76 - 4.86 (m, 3 H), 4.01 - 4.31 (m, 10 H), 3.91 - 4.01 (m, 8 H), 3.74 - 3.86 (m, 4 H), 3.52 - 3.71 (m, 30 H), 3.42 - 3.50 (m, 6 H), 3.15 - 3.25 (m, 4 H), 2.52 - 2.70 (m, 4 H), 2.22 - 2.45 (m, 2 H), 2.15 - 2.22 (s, 9 H), 2.06 (s, 9 H), 1.95 - 2.03 (m, 18 H), 1.77 (br s, 2 H), 1.58 - 1.66 (m, 4 H), 1.40 (m, 2 H), 1.08 - 1.24 (m, 12 H). 31P NMR (CDCl3): ppm δ 147.12。
按照以下方案3製備GLPA15。
向中間體化合物II（275 g, 660 mmol, 1.00 當量（eq））的二氯甲烷(2.75 L)溶液中加入三乙胺(133 g, 1.32 mol, 2.00 eq.), 隨後滴加入Cbz-Cl (169 g, 990 mmol, 1.50 eq.)。反應液在25 ℃ 攪拌2小時，LCMS顯示化合物II完全轉化。反應液依次用 NaHCO3 (800 mL)飽和溶液、飽和食鹽水（500 mL）洗滌，有機相用無水Na 2SO 4乾燥。過濾除去乾燥劑後，濾液濃縮至乾。該粗品經柱層析後(SiO 2, PE/EA=100/1 to 5/1)得到無色油狀化合物III-1 (290 g, 527 mmol, 産率75.7%)。 1H NMR (400 MHz in DMSO-d6): δ ppm 7.23 - 7.40 (m, 5 H), 5.00 - 5.12 (m, 2 H), 3.86 - 3.95 (m, 2 H), 3.23 - 3.39 (m, 6 H), 2.55 - 2.67 (m, 2 H), 1.56 - 1.64 (m, 2 H), 1.31 - 1.46 (m, 27 H). MS (ESI) [M+H] +m/z: 551.6。
向化合物III-1 (145 g, 263 mmol, 1.00 eq) 中加入 HCOOH (2.9 L)，該溶液在 60 ℃下攪拌12小時，LCMS顯示化合物III-1轉化完全。向反應液中加入1.5 L甲苯 和1.5L乙腈，減壓濃縮至約500 mL, 隨後加入甲苯/乙腈（1:1，~750 mL) 並濃縮至約500 mL, 然後加入乙腈(~1000 mL)並濃縮至乾，粗品用700 mL乙腈在60 ℃ 粉碎2小時, 過濾。收集固體，乾燥得白色固體化合物IV-1 (105 g, 定量)。1H NMR (400 MHz in DMSO-d6): δ ppm 7.26 - 7.40 (m, 5 H), 5.02 - 5.10 (m, 2 H), 3.89 - 4.00 (m, 2 H), 3.36 - 3.45 (m, 4 H), 3.24 - 3.34 (m, 2 H), 2.59 - 2.72 (m, 2 H), 1.40 (s, 2 H). MS (ESI) [M+H] +m/z: 383.0。
向化合物IV-1 (100 g, 261 mmol .)和中間體-A (502 g, 915. mmol, 3.50 eq.) 的DMF (1.0 L)溶液中加入TBTU(327 g, 1.02 mol, 3.90 eq.), 三乙胺 (212 g, 2.09 mol, 8.00 eq.)，反應在25 ℃進行1小時，LCMS顯示化合物IV-1轉化完成。將反應液加入到 4000 mL水中, 並用甲基叔丁基醚 (2000 mL 分兩次) 萃取除去雜質，剩餘水相用二氯甲烷(3000 mL 分兩次)萃取。二氯甲烷相依次用10%檸檬酸水溶液 (2000 mL 分兩次)、飽和 NaHCO3 (2.0 L 分兩次), 飽和鹽水（2.0 L）洗滌, 無水Na2SO4乾燥。過濾得濾液，減壓濃縮得到白色固體化合物V-1 (260 g, 159 mmol, 産率60.9%) 。 1H NMR (400 MHz in DMSO-d6): δ ppm 7.99 - 8.08 (m, 2 H), 7.93 (br d, J=5.50 Hz, 1 H), 7.79 - 7.86 (m, 3 H), 7.26 - 7.39 (m, 5 H), 5.22 (d, J=3.13 Hz, 3 H), 4.95 - 5.08 (m, 5 H), 4.54 (br d, J=8.38 Hz, 3 H), 4.03 (s, 9 H), 3.81 - 3.93 (m, 5 H), 3.76 (br d, J=4.88 Hz, 3 H), 3.44 - 3.62 (m, 10 H), 3.34 - 3.43 (m, 6 H), 3.24 (br d, J=6.13 Hz, 7 H), 3.02 - 3.09 (m, 4 H), 2.40 - 2.47 (m, 2 H), 2.10 (s, 9 H), 1.99 (s, 9 H), 1.89 (s, 9 H), 1.77 (s, 9 H), 1.57 - 1.68 (m, 2 H)。 MS (ESI) [M+H] +m/z: 816.4。
用氬氣惰性化2 L氫化釜並小心加入乾Pd/C (9 g)，加入 MeOH (50 mL) 潤濕Pd/C , 然後在氬氣氣氛下緩慢加入化合物V-1 (90 g, 55.1 mmol, 1.00 eq.) 和三氟乙酸 (6.29 g, 55.1 mmol, 1.00 eq.) 的MeOH (850 mL)溶液。混合物經脫氣/加H 2三次置換爲氫氣氣氛，在25 ℃攪拌10小時。LCMS顯示化合物V-1轉化完全，過濾除去Pd/C，濾液經減壓濃縮得到化合物VI-1 (80 g, 産率90.2%). 1H NMR (400 MHz in DMSO-d6): δ ppm 9.12 (br s, 2 H), 8.50 (br t, J=5.19 Hz, 1 H), 8.10 (br t, J=5.50 Hz, 2 H), 7.85 - 7.91 (m, 3 H), 5.22 (d, J=3.25 Hz, 3 H), 4.95 - 5.01 (m, 3 H), 4.52 - 4.58 (m, 3 H), 4.03 (s, 9 H), 3.84 - 3.93 (m, 3 H), 3.75 - 3.83 (m, 3 H), 3.39 - 3.61 (m, 16 H), 3.23 - 3.32 (m, 6 H), 3.15 - 3.18 (m, 3 H), 2.97 - 3.05 (m, 2 H), 2.54 - 2.61 (m, 2 H), 2.10 (s, 9 H), 2.00 (s, 9 H), 1.89 (s, 9 H), 1.77 - 1.80 (m, 9 H), 1.70 - 1.76 (m, 2 H). MS (ESI) [M+H] +m/z: 749.3。
向化合物VI-1 (270 g, 168 mmol, 1.00 eq.)和戊二酸酐 (28.6 g, 252 mmol, 1.50 eq) 的二氯甲烷(2.7 L) 溶液中加入三乙胺(67.8 g, 672 mmol, 4.00 eq)，該溶液在25 ℃ 攪拌1小時，LCMS顯示化合物VI-1完全轉化爲化合物VII。向反應液中加入4-羥基呱啶(42.4 g, 420 mmol, 2.50 eq.)和 TBTU(107 g, 335 mmol, 2.00 eq.)， 並在25 ℃繼續攪拌1小時。LCMS顯示化合物VII轉化完全。 緩慢加入飽和NH4Cl (3.0 L)淬滅反應，分層，水相用二氯甲烷(2 x 1000 mL) 萃取並與先前的有機相合並。合並的有機相用飽和NaHCO3 (aq)和飽和鹽水的1:1混合液(3.0 L)洗滌，用無水Na2SO4乾燥，過濾減壓濃縮。粗品溶於1.5 L二氯甲烷, 滴加到甲基叔丁基醚 (7.5 L)中，半透明的白色沉澱在滴加過程中逐漸形成。真空過濾沉澱，收集固體真空乾燥得到白色固體化合物VIII (207 g, 産率72.8%) 。 1H NMR (400 MHz in DMSO-d6): δ ppm 8.05 (br d, J=2.00 Hz, 2 H), 7.82 (br d, J=7.38 Hz, 3 H), 5.21 (br s, 3 H), 4.98 (br d, J=10.26 Hz, 3 H), 4.72 (br s, 1 H), 4.54 (br d, J=7.88 Hz, 3 H), 4.03 (br s, 9 H), 3.74 - 3.94 (m, 9 H), 3.45 - 3.71 (m, 12 H), 3.40 (br s, 6 H), 3.24 (br s, 7 H), 3.07 (br d, J=14.13 Hz, 5 H), 2.91 - 3.01 (m, 1 H), 2.24 - 2.44 (m, 5 H), 2.20 (br s, 1 H), 2.10 (s, 9 H), 1.96 - 2.04 (m, 9 H), 1.89 (br s, 9 H), 1.74 - 1.81 (m, 9 H), 1.51 - 1.73 (m, 6 H), 1.07 - 1.36 (m, 3 H). MS (ESI) [M+H] +m/z: 848.0。
向化合物 VIII (200 g, 118 mmol, 1.00 eq.)、四唑二異丙基銨 (8.08 g, 47.2 mmol, 0.40 eq) 的二氯甲烷 (2.0 L) 溶液中加入3-雙(二異丙基氨基)膦醯氧基丙腈，（53.3 g, 177 mmol, 1.50 eq.)，反應液在40 ℃ 攪拌2小時，LCMS顯示化合物13轉化完成。反應液用飽和 NaHCO3 和飽和食鹽水的1:1混合液(2.0 L)洗滌， 經無水Na 2SO 4乾燥，濾液濃縮後所得粗品溶於二氯甲烷(1.2 L), 滴加到攪拌的甲基叔丁基醚 (6.0 L)中，過濾懸濁液，濾餅用基叔丁基醚淋洗，收集固體進行真空乾燥，將産品溶於二氯甲烷(1.0 L)並濃縮至乾，重複操作4次以除去殘留叔丁基醚得到GLPA15 (164 g, 産率73.3%)。 1H NMR (400 MHz in DMSO-d6): δ ppm 8.05 (br d, J = 6.50 Hz, 2 H), 7.81 (br d, J=9.01 Hz, 3 H), 5.22 (d, J=3.25 Hz, 3 H), 4.98 (dd, J=11.26, 3.25 Hz, 3 H), 4.55 (br d, J=8.50 Hz, 3 H), 4.03 (s, 9 H), 3.64 - 3.97 (m, 12 H), 3.55 - 3.63 (m, 6 H), 3.50 (br s, 5 H), 3.40 (br d, J=6.13 Hz, 6 H), 3.17 - 3.30 (m, 9 H), 3.07 (br d, J=14.26 Hz, 4 H), 2.76 (t, J=5.82 Hz, 2 H), 2.18 - 2.47 (m, 6 H), 2.10 (s, 9 H), 1.99 (s, 9 H), 1.89 (s, 9 H), 1.78 (s, 9 H), 1.52 - 1.74 (m, 6 H), 1.12 - 1.19 (m, 12 H). 31P NMR (DMSO-d6): ppm δ 145.25. MS (ESI) [M+H] +m/z: 1895.7。
在某些研究中，提供了用於將包含GalNAc（本文也稱爲GalNAc遞送化合物）的靶向基團連接到正義鏈的5'-末端的方法，其包括在固相合成的最後一個偶聯步驟中使用GalNAc亞磷醯胺（GLPA1），使用這樣的合成工藝，例如在寡核苷酸鏈延長時使用的（即在正義鏈的5'末端添加核苷酸）工藝，以將其連接到正義鏈的5'-末端。
在一些研究中，將包含GalNAc的靶向基團連接到正義鏈的3'-末端的方法包括使用包含GLO-n的固體支持物（CPG）。在一些研究中，將包含GalNAc的靶向基團連接到正義鏈的 3'-末端的方法包括：將 GalNAc 靶向基團通過酯鍵連接到CPG固體支持物上，並在合成正義鏈時使用帶有連接的GalNAc靶向基團的所得CPG，這導致GalNAc靶向基團連接在正義鏈的3'-末端。 其他GalNAc亞磷醯胺化合物（GLPAn）也同樣可以在使用合理對應的中間體後，採用本文類似或者本領域中熟知的方法獲得，並作爲靶向基團連接到siRNA雙鏈體合適的位置。 實施例 4. C3 siRNA雙鏈體的體外篩選
Huh7細胞用胰蛋白酶消化並調整到合適的密度，然後接種到 96 孔板中。根據製造商的建議，在接種的同時，使用Lipofectamine RNAiMax （Invitrogen -13778-150）用測試siRNA或PBS對照轉染細胞。siRNA以兩個濃度（0.08 nM和0.6 nM）一式三份進行測試。
轉染後24小時，去除培養基並收穫細胞用於RNA提取。根據手册使用TRIzol™ Reagent (Invitrogen - 15596018)提取總RNA。
根據手册，使用PrimeScript™ RT試劑盒和gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa-RR047A)合成cDNA。通過qPCR檢測C3 cDNA。平行檢測GAPDH cDNA作爲內部對照。PCR如下進行：在95 ℃下進行30秒，然後以在95 ℃下10秒、在60 ℃下30秒的循環進行40個循環。 數據分析
使用比較性Ct（ΔΔCt）方法，通過相對定量（RQ）確定每個樣品中C3基因的表達；該方法測量靶基因和看家基因（GAPDH）之間的 Ct 差異（ΔCt）。
方程式列出如下：
ΔCT = 靶基因平均 Ct– GAPDH平均Ct
ΔΔCT=ΔCT (樣品) –ΔCT (隨機對照或Lipofectamine RNAiMax對照);
靶基因mRNA的相對定量 = 2^(-ΔΔCT)
抑制%= (對照的相對定量–樣品的相對定量)/對照的相對定量×100%。
表4提供了使用多種C3 RNAi試劑抑制C3表達的體外研究的實驗結果；使用的雙鏈序列對應於表 2 中所示的化合物。
雙鏈體AV# 平均抑制% SD
0.6nM 0.08nM 0.6nM 0.08nM
AV00375 89.66 80.97 0.88 1.51
AV00376 80.04 54.22 2.07 2.23
AV00377 86.27 71.81 1.75 2.28
AV00378 80.15 63.16 2.56 0.47
AV00379 48.04 28.03 3.85 3.00
AV00380 70.72 34.00 0.50 2.21
AV00381 32.56 9.04 4.96 7.84
AV00382 78.79 47.83 1.57 8.15
AV00383 50.68 11.08 0.60 4.03
AV00384 89.05 69.34 0.71 0.47
AV00385 75.08 29.64 1.35 3.48
AV00386 80.74 42.84 0.91 6.38
AV00387 33.36 13.81 0.96 11.29
AV00388 82.28 43.11 1.73 2.82
AV00389 85.69 68.12 1.21 1.46
AV00390 37.86 19.06 6.76 2.12
AV00391 11.49 7.59 12.73 3.46
AV00392 2.02 3.70 10.32 7.62
AV00393 83.04 56.71 0.79 3.29
AV00394 85.63 64.42 0.79 1.83
AV00395 20.75 6.46 3.40 6.63
AV00396 69.63 34.06 2.17 10.10
AV00398 56.44 -3.43 1.99 16.16
AV00399 23.19 -8.57 3.15 5.70
AV00400 60.97 6.35 0.89 9.96
AV00401 77.72 34.42 0.57 6.28
AV00402 77.35 39.88 2.42 2.48
AV00403 82.03 52.63 1.97 4.79
AV00404 57.67 28.05 6.24 3.47
AV00405 83.20 63.73 1.10 2.22
AV00406 68.52 41.76 5.85 2.35
AV00407 63.63 34.38 4.98 6.25
AV00408 84.43 65.55 1.20 3.07
AV00409 80.66 51.10 0.99 2.82
AV00410 78.96 49.11 1.33 1.38
AV00411 80.37 48.33 1.77 3.79
AV00412 -1.19 -6.73 5.97 9.11
AV00413 89.53 78.21 1.28 2.87
AV00415 87.26 63.52 1.03 3.37
AV00416 88.71 70.41 0.80 1.91
AV00417 68.29 27.12 2.06 7.42
AV00418 80.00 38.08 2.05 5.82
AV00419 72.57 25.79 1.42 4.35
AV00420 70.86 34.66 0.77 4.97
AV00421 87.21 72.95 1.24 1.36
AV00422 79.68 54.44 0.76 1.92
AV00423 62.35 39.20 3.87 0.96
AV00424 75.91 44.48 1.07 3.04
AV00425 76.20 39.92 1.91 6.36
AV00426 -10.91 -2.67 16.19 11.34
AV00427 64.92 24.72 2.33 5.76
AV00428 70.43 30.55 0.91 7.23
AV00429 90.36 77.31 0.72 1.21
AV00430 64.39 17.35 1.50 7.16
AV00431 31.89 19.58 5.11 10.32
AV00432 48.55 12.39 1.42 5.02
AV00433 86.15 50.08 0.86 4.57
AV00434 21.52 3.27 12.34 11.77
AV00435 76.63 51.50 4.78 4.80
AV00436 37.03 21.81 15.57 4.56
AV00437 51.27 17.90 0.47 8.64
AV00438 -14.06 -3.49 21.52 4.61
AV00439 62.79 23.11 1.35 5.13
AV00440 57.88 14.89 4.42 4.49
AV00441 67.25 31.15 6.02 7.40
AV00442 1.29 -7.59 4.94 10.62
AV00443 80.05 44.67 0.52 1.70
AV00444 31.00 -1.99 5.77 8.53
AV00445 22.94 -6.56 4.02 4.12
AV00446 31.22 -5.35 3.83 10.14
AV00447 18.12 -5.32 4.16 11.05
實施例5. C3 siRNA雙鏈體的體內測試
爲了評估C3 siRNA的體內活性，使用了感染了編碼人C3和螢光素酶基因的AAV的小鼠（每組4隻小鼠）。在siRNA給藥前14天，對雌性C57BL/6J小鼠通過靜脈注射1x10^11 viral particle of 編碼人C3和螢光素酶基因的腺相關病毒8（AAV8）載體的原液來進行感染。在第0天，小鼠皮下注射單劑量3 mg/kg或者6 mg/kg的C3 siRNA試劑或PBS。在第0天siRNA給藥前和第7和14天終止時收集血樣。測量螢光素酶活性。通過比較siRNA處理組給藥前血樣的螢光素酶活性和第7，14天收集血樣的螢光素酶活性並且基於來自 PBS 處理組的血清樣品中的螢光素酶活性變化進行歸一化，以計算剩餘百分比，結果如表5所示。
表5.使用對應於表 3 中所示的序列、化學修飾和遞送的化合物， GLX-n爲Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958−16961中的GalNAc3所示的遞送化合物。
雙鏈體（Duplex）ID 第7天螢光素酶剩餘百分比 第14天螢光素酶剩餘百分比 劑量 mg/kg
平均±SD 平均±SD
AD00343 0.39±0.15 0.32±0.05 6.0
AD00344 0.82±0.36 0.46±0.04 6.0
AD00388 0.67±0.27 0.43±0.11 6.0
AD00389 0.49±0.45 0.32±0.13 6.0
AD00416 0.82±0.43 0.59±0.18 6.0
實施例6. C3 siRNA雙鏈體的體內測試
爲了評估C3 siRNA的體內活性，使用了感染了編碼人C3和螢光素酶基因的AAV的小鼠（每組4隻小鼠）。在siRNA給藥前7天，對雌性C57BL/6J小鼠通過靜脈注射1x10^11 viral particle of 編碼人C3和螢光素酶基因的腺相關病毒8（AAV8）載體的原液來進行感染。在第0天，小鼠皮下注射單劑量3 mg/kg的C3 siRNA試劑或PBS。在第0天siRNA給藥前和第7天終止時收集血樣，通過siRNA處理組和PBS處理組 第7天收集血樣，用ELISA 測定法測量相對於處理前變化進行歸一化血漿樣品中的編碼人C3蛋白濃度來計算保留百分比；結果如表6-8。
表6.使用對應於表 3 中所示的序列、化學修飾和遞送的化合物， GLX-n爲Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958−16961中的GalNAc3所示的遞送化合物。
雙鏈體（Duplex）ID 通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比 (平均± SD) 雙鏈體（Duplex） ID 通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比 (平均± SD)
AD00345 0.48±0.14 AD00349 0.98±0.27
AD00346 0.40±0.14 AD00350 0.87±0.15
AD00347 0.26±0.04 AD00351 0.51±0.20
AD00348 0.39±0.06
表7.使用對應於表 3 中所示的序列、化學修飾和遞送的化合物，各3 mg/kg， GLX-n爲Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958−16961中的GalNAc3所示的遞送化合物。
雙鏈體（Duplex）ID 通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比 (平均± SD) 雙鏈體（Duplex） ID 通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比 (平均± SD)
AD00385 0.9 ±0.41 AD00392 1.25 ±0.5
AD00386 1.09 ±0.59 AD00393 0.92 ±0.39
AD00387 2.16 ±0.98 AD00394 1.01 ±0.35
AD00388 0.65 ±0.29 AD00395 0.39±0.68
AD00389 0.38 ±0.13 AD00396 0.37 ±0.71
AD00390 0.9 ±0.41 AD00397 0.95 ±0.42
AD00391 0.98 ±0.46
表8.使用對應於表 3 中所示的序列、化學修飾和遞送的化合物，各3 mg/kg， GLX-n爲Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958−16961中的GalNAc3所示的遞送化合物。
雙鏈體（Duplex）ID 通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比 (平均± SD) 雙鏈體（Duplex） ID 通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比 (平均± SD)
AD00410 0.93 ±0.33 AD00416 0.13 ±0.03
AD00411 0.98 ±0.52 AD00417 0.22 ±0.12
AD00412 0.34 ±0.09 AD00418 0.35 ±0.05
AD00413 0.43 ±0.15 AD00419 0.31 ±0.12
AD00414 0.53 ±0.21 AD00420 0.76 ±0.21
AD00415 0.57 ±0.13
實施例7. C3 siRNA雙鏈體的體內測試
爲了評估C3 siRNA的體內活性，使用了感染了編碼人C3和螢光素酶基因的AAV的小鼠（每組4隻小鼠）。在siRNA給藥前7天，對雌性C57BL/6J小鼠通過靜脈注射1x10^11 viral particle of 編碼人C3和螢光素酶基因的腺相關病毒8（AAV8）載體的原液來進行感染。在第0天，小鼠皮下注射單劑量3 mg/kg或者6 mg/kg的C3 siRNA試劑或PBS。在第0天siRNA給藥前和第7天、14天、21天終止時收集血樣，通過siRNA處理組和PBS處理組 第7天、14天、21天收集血樣，用ELISA 測定法測量相對與處理前變化進行歸一化血漿樣品中的編碼人C3蛋白濃度來計算保留百分比；結果如表9-11。
表9. 單次使用3mpk 對應於表 3 中所示的序列、化學修飾和遞送的化合物，通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比。
雙鏈體（Duplex）ID 通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比 (平均± SD)
第7天 第14天 第21天
AD00385 0.59±0.23 0.48±0.08 1.01±0.38
AD00579 1.19±0.63 0.7±0.31 1.53±0.68
AD00580 0.51±0.26 0.59±0.43 0.92±0.37
AD00581 0.33±0.05 0.5±0.12 0.89±0.53
AD00582 1.15±0.34 0.78±0.37 0.74±0.39
AD00583 1.66±1.15 1.17±0.19 0.62±0.38
AD00393 1.23±0.56 1.15±0.71 0.82±0.36
AD00584 1.74±0.96 0.84±0.27 0.89±0.29
AD00394 1.9±0.77 1.79±1.36 0.85±0.4
AD00527 1.99±1 1.61±0.53 0.92±0.14
AD00530 2.34±1.21 1.36±0.96 1.44±0.69
AD00531 1.74±0.98 1.71±0.82 1.19±0.35
AD00534 1.53±0.41 1.58±0.93 1.33±0.53
表10. 單次使用6mpk 對應於表 3 中所示的序列、化學修飾和遞送的化合物，通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比。
雙鏈體（Duplex）ID 通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比 (平均± SD
第7天 第14天
AD00343 0.68 ± 0.34 0.86 ± 0.74
AD00344-1 0.37 ± 0.11 0.68 ± 0.14
AD00388-1 0.45 ± 0.27 0.74 ± 0.61
AD00389-1 0.29 ± 0.09 0.53 ± 0.2
AD00580 0.2 ± 0.09 0.54 ± 0.45
AD00581 0.38 ± 0.18 0.52 ± 0.2
AD00416 0.45 ± 0.3 0.15 ± 0.05
AD00348 0.46 ± 0.32 0.23 ± 0.07
AD00351 0.68 ± 0.48 0.32 ± 0.16
AD00350 0.54 ± 0.19 0.7 ± 0.25
AD00345 0.69 ± 0.44 0.48 ± 0.22
AD00740 1.53 ± 0.57 1.02 ± 0.74
AD00741 0.43 ± 0.06 0.24 ± 0.13
AD00742 0.57 ± 0.18 0.3 ± 0.14
AD00743 0.5 ± 0.32 0.27 ± 0.04
AD00744 0.48 ± 0.3 0.17 ± 0.06
表11. 單次使用6mpk 對應於表 3 中所示的序列、化學修飾和遞送的化合物，通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比。
雙鏈體（Duplex）ID 通過ELISA測量的小鼠血漿中人C3的保留百分比 (平均± SD
第7天 第14天
AD00385-1 1.03 ± 0.18 0.69 ± 0.30
AD00416-1 0.60 ± 0.22 0.64 ± 0.27
等同物
儘管本文已經描述和說明了本發明的幾個實施例，但本領域普通技術人員很容易理解，用於執行此處描述的功能和/或獲得結果和/或一個或更多個優點的多種其他手段和/或結構，以及這些變化和/或修改中的每一個都被認爲在本發明的範圍內。更一般地，本領域技術人員將容易理解，此處描述的所有參數、尺寸、材料和配置都是示例性的，並且實際參數、尺寸、材料和/或配置將取決於使用本發明教導的具體應用。本領域技術人員將認識到或能夠僅使用常規實驗來確定本文描述的本發明的特定實施例的許多等價物。因此，應當理解，前述實施例僅通過示例的方式呈現並且屬所附申請專利範圍及其等效物的範圍內，本發明可以以不同於具體描述和要求保護的方式實施。本發明針對在此描述的每個單獨的特徵、系統、物品、材料和/或方法。此外，兩個或更多個此類特徵、系統、物品、材料和/或方法的任何組合，如果此類特徵、系統、物品、材料和/或方法相互不矛盾，則也包括在本發明的範圍內。
如本文所定義和使用的所有定義應理解爲對照字典定義、通過引用並入的文件中的定義和/或所定義術語的普通含義。
在說明書和申請專利範圍中並未使用數量限定的情况，除非明確指出相反，否則應理解爲“至少一個”。
說明書和申請專利範圍中使用的短語“和/或”應理解爲表示如此結合的要素中的“一個或兩個”，即這樣的要素在某些情况下組合出現而在其他情况下分離出現。除了由“和/或”具體標識的要素之外，除非明確指出相反，否則可以可選地存在其他要素，無論與那些具體標識的要素相關或不相關。
本申請中引用或參考的所有參考文獻、專利和專利申請和出版物均通過引用整體並入本文。
無
無
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無。

Claims (69)

  1. 一種用於抑制補體成分C3表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑，其中所述dsRNA試劑包含正義鏈和反義鏈，所述反義鏈中的核苷酸第2至18位包含與C3 RNA轉錄物互補的區域，其中互補區域包含與表1-3之一中所列出的反義序列之一相差0、1、2或3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且任選地包含靶向配體。
  2. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述與C3 RNA轉錄物互補的區域包含至少15、16、17、18或19個連續核苷酸，其與表1-3之一中所列出的反義序列之一相差不超過3個核苷酸。
  3. 如請求項1或2所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO：1中的任一個靶區域至少基本上互補，並且在表1-3的任一個中提供。
  4. 如請求項3所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO：1中的任一靶區完全互補，並在表1-3的任一個中提供。
  5. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑包含表1-3中任一項所述的正義鏈序列，其中所述正義鏈序列與所述dsRNA試劑中的反義鏈序列至少基本上互補。
  6. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑包含表1-3中任一項所述的正義鏈序列，其中所述正義鏈序列與所述dsRNA試劑中的反義鏈序列完全互補。
  7. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑包含表1-3中任一項所列出的反義鏈序列。
  8. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑包含表1-3中任一項中作爲雙鏈體序列所列出的序列。
  9. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑包含至少一個修飾的核苷酸。
  10. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述反義鏈中的所有或基本上所有核苷酸是修飾的核苷酸。
  11. 如請求項9或10所述的dsRNA試劑，其中所述至少一種修飾的核苷酸包括：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-脫氧核苷酸、2'3'-seco 核苷酸模擬物、鎖定核苷酸、開環核酸核苷酸（UNA）、乙二醇核酸核苷酸 （GNA）、2'-F-***糖核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2'-OMe核苷酸、反向2'-脫氧核苷酸、2'-氨基修飾核苷酸、2'-烷基修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸和3'-OMe核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸，或與膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、氨基磷酸酯，或包含核苷酸的非天然鹼基。
  12. 如請求項9或10所述的dsRNA試劑，其中在引導鏈的5'末端包含E-乙烯基膦酸酯核苷酸。
  13. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  14. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述正義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  15. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述反義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  16. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述正義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  17. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述反義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  18. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述正義鏈和反義鏈的全部或基本上全部核苷酸是修飾的核苷酸。
  19. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中修飾的正義鏈是表2-3之一中所列出的修飾的正義鏈序列。
  20. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中修飾的反義鏈是表2-3之一中所列出的修飾的反義鏈序列。
  21. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述正義鏈與反義鏈互補或基本上互補，並且互補區域的長度爲16至23個核苷酸。
  22. 如請求項21所述的dsRNA試劑，其中所述互補區域的長度爲19至21個核苷酸。
  23. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中每條鏈的長度爲不超過30個核苷酸。
  24. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中每條鏈的長度爲不超過25個核苷酸。
  25. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中每條鏈的長度爲不超過23個核苷酸。
  26. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑包含至少一種修飾的核苷酸，並且還包含一種或更多種靶向基團或連接基團。
  27. 如請求項26所述的dsRNA試劑，其中所述一種或更多種靶向基團或連接基團與所述正義鏈綴合。
  28. 如請求項26或27所述的dsRNA試劑，其中所述靶向基團或連接基團包括N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）。
  29. 如請求項28所述的dsRNA試劑，其中所述靶向基團或連接基團如式(X)所示的結構，包括靶向部分、鏈接鍵以及接頭W，其中靶向部分選自N-乙醯基-半乳糖胺衍生物（GalNAc），其通過鏈接鍵與接頭W鏈接，接頭W具有如式(XI)所示的結構，X選自O、NH 2或者S，Y ﹣選自：O ﹣、S ﹣、甲基或者NRaRb，Ra和Rb分別獨立的選自氫、取代或者未取代的C 1-C 6的烷基、取代或者未取代的C 3-C 6的環烷基，或者Ra和Rb與附著的原子一起鏈接形成含有1-3個N、O、S雜原子組成的3-12元雜環烷基；優選的取代或者未取代的C 1-C 6的烷基、取代或者未取代的C 3-C 6的環烷基中，所述的取代基選自羥基、氨基； 式（X） (式XI)。
  30. 如請求項29所述的dsRNA試劑，其中靶向基團中的鏈接鍵選自聚乙二醇、任選取代的C 2-C 12烷基, 取代或者未取代的C 3-C 12環烷基、取代或者未取代的C 3-C 12雜環烷基、取代或者未取代的C 3-C 12醯胺。
  31. 如請求項30所述的dsRNA試劑，其中取代或者未取代的C 2-C 12烷基, 取代或者未取代的C 3-C 12環烷基、取代或者未取代的C 3-C 12雜環烷基、取代或者未取代的C 3-C 12醯胺中，所述的取代基選自羥基、羰基。
  32. 如請求項30所述的dsRNA試劑，其中靶向基團中的鏈接鍵優選自以下片段： 、 、 、 、 、 和 , 其中每個m獨立的爲1-6的整數，每個n、o、p獨立的爲0或者1，每個q 1與q 2分別獨立的爲0、1或者2。
  33. 如請求項32所述的dsRNA試劑，其中靶向基團中的鏈接鍵更優選自以下片段： 、 、 、 、 、 。
  34. 如請求項29所述的dsRNA試劑，其中靶向基團中的靶向部分具有爲以下結構片段， n’爲1或者2。
  35. 如請求項29所述的dsRNA試劑，其中X選自O或者S，Y ﹣選自：O ﹣或者S ﹣。
  36. 如請求項26或27所述的dsRNA試劑，其中所述靶向基團具有以下結構： GLO-1 GLS-1 GLO-2 GLS-2 GLO-3 GLS-3 GLO-4 GLS-4 GLO-5 GLS-5 GLO-6 GLS-6 GLO-7 GLS-7 GLO-8 GLS-8 GLO-9 GLS-9 GLO-10 GLS-10 GLO-11 GLS-11 GLO-12 GLS-12 GLO-13 GLS-13 GLO-14 GLS-14 GLO-15 GLS-15 GLO-16 GLS-16   。
  37. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑包含與所述正義鏈的5'-末端綴合的靶向基團。
  38. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑包含與所述正義鏈的3'-末端綴合的靶向基團。
  39. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述反義鏈在3'-末端包含一個反向無鹼基殘基。
  40. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述正義鏈在3'或/和5'末端包含一個或兩個反向無鹼基殘基。
  41. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA試劑具有兩個平末端。
  42. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中至少一條鏈包含至少1個核苷酸的3'突出端。
  43. 如請求項1所述的dsRNA試劑，其中至少一條鏈包含至少2個核苷酸的3'突出端。
  44. 如請求項1所述的dsRNA試劑，正義鏈在3’‑末端和/或5’‑末端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸的突出端。
  45. 一種用於抑制補體成分C3表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑，其中所述dsRNA試劑包含包含正義鏈和反義鏈，其中每條鏈的長度是14個至30個核苷酸，在反義鏈中的核苷酸位置2至18處包含與 C3 RNA轉錄物互補的區域，其中互補區域包含與式I中所列出的反義序列之一相差0、1、2或3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且任選地包含靶向配體，雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑反義鏈: 5’ -N a-(A 1A 2A 3A 4)i-N b–(B 1B 2B 3B 4) -N b-(C 1C 2C 3C 4C 5)j -N a- 3’ 其中: i和 j，獨立選自0或者1; 每個 N a和 N b分別獨立的代表 0-17寡核苷酸； A 1A 2A 3A 4表示四個連續的核苷酸依次被代表小寫2'-OMe、大寫2'-氟、小寫2'-OMe、小寫2'-OMe修飾的一個基序， A 1與A 2之間、A 2與A 3之間進一步均包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯； B 1B 2B 3B 4表示四個連續的核苷酸均被小寫2'-OMe修飾的一個基序； C 1C 2C 3C 4C 5表示五個連續的核苷酸均被小寫2'-OMe修飾的一個基序，C 3與C 4之間、 C 4與C 5之間進一步包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  46. 如請求項45所述的dsRNA試劑， N a分別獨立的代表0個寡核苷酸， N b分別獨立的代表2-5個經化學修飾的寡核苷酸，i和 j分別代表1。
  47. 如請求項45所述的dsRNA試劑，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 1的任意靶區域至少基本互補。
  48. 如請求項45所述的dsRNA試劑，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 1的任意靶區域完全互補。.
  49. 如請求項45所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA任一項所述的正義鏈序列與所述dsRNA試劑中的反義鏈序列至少基本上互補。
  50. 如請求項45所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA任一項所述的正義鏈序列，與所述dsRNA試劑中的反義鏈序列完全互補。
  51. 如請求項45所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA正義鏈在3'或/和5'末端包含一個或兩個反向無鹼基殘基。
  52. 如請求項45所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA具有兩個平末端。
  53. 如請求項45所述的dsRNA試劑，其中所述dsRNA正義鏈在3’‑末端和/或5’‑末端具有一個 1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸的突出端。
  54. 一種包含如請求項1至53中任一項所述的dsRNA試劑的組合物。
  55. 如請求項54所述的組合物，其還包含藥學上可接受的載體。
  56. 如請求項55所述的組合物，其還包含一種或更多種另外的治療劑。
  57. 如請求項56所述的組合物，其中所述組合物被包裝在藥盒、容器、包裝物、分配器、預填充注射器或小瓶中。
  58. 如請求項54所述的組合物，其中所述組合物被配製成用於皮下給藥或被配製成用於靜脈內（IV）給藥。
  59. 一種包含如請求項1至53中任一項所述的dsRNA試劑的細胞。
  60. 如請求項59所述的細胞，其特徵在於，所述細胞是哺乳動物細胞，任選地是人細胞。
  61. 一種抑制細胞中補體成分C3基因表達的方法，其包括： (i) 製備包含有效量的如請求項1至53中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑或如請求項54至58中任一項所述的組合物的細胞； (ii) 將的(i)中製備的細胞維持足夠的時間，以獲得C3基因的mRNA轉錄物的降解，從而抑制細胞中C3基因的表達。
  62. 如請求項61所述的方法，其特徵在於，所述細胞在對象體內並且將所述dsRNA試劑皮下施用至所述對象。
  63. 一種抑制對象中C3基因表達的方法，其中所述方法包括向對象施用有效量的如請求項1至53中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑或如請求項54至58中任一項所述的組合物。
  64. 一種治療與C3蛋白相關的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向對象施用有效量的如請求項1至53中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）試劑或如請求項54至58中任一項所述的組合物，以抑制C3基因表達。
  65. 如請求項64所述的方法，其中所述疾病或病症是由以下導致或與其相關：C3活化或其響應於C3活化的症狀或進展，所述疾病或病症通常與C3 表達相關，所述疾病包括以下的一種或多種： C3 腎小球病 (C3G)、免疫複合物介導的腎小球腎炎（IC 介導的 GN），感染後腎小球腎炎 (PIGN)、系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、缺血/再灌注損傷和 IgA 腎病、陣發性夜間血紅蛋白尿 (PNH)、非典型溶血性***候群 (aHUS)、視神經脊髓炎 (NMO)、多灶性運動神經病 (MMN)、重症肌無力症 (MG)、原發性膜性腎病、黃斑變性(AMD)、類風濕性關節炎(RA)、抗中性粒細胞胞漿自身抗體相關血管炎(ANCA-AV)、牙周疾病和牙周病、瘧疾貧血、敗血症以及神經退行性疾病。
  66. 如請求項65所述的方法，其還包括對所述對象施用另外的治療方案。
  67. 如請求項66所述的方法，其中所述另外的治療方案包括：向所述對象施用一種或更多種的C3反義多核苷酸，向所述對象施用非C3 dsRNA治療劑。
  68. 如請求項67所述的方法，其中所述非C3 dsRNA治療劑是以下中的一種或更多種：另外的治療劑，如抗補體組分 C5 抗體或其抗原結合片段、iRNA 靶向補體成分 C5 和/或 C3 肽抑制劑。
  69. 如請求項68所述的方法，其中所述非C3 dsRNA治療劑選自以下中的一種或更多種：依庫珠單抗或康普辛伐他汀類藥物。
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