TW202321287A

TW202321287A - 特異性靶向間皮素之經工程改造之免疫細胞及其用途

Info

Publication number: TW202321287A
Application number: TW111128411A
Authority: TW
Inventors: 武千央; 山口晶子; 蓋瑞沙畢羅
Original assignee: 日商武田藥品工業股份有限公司
Priority date: 2021-07-29
Filing date: 2022-07-28
Publication date: 2023-06-01
Also published as: AU2022318416A1; WO2023007431A1; CN117642421A; CA3227581A1; KR20240040068A

Abstract

本文揭示經分離之核酸分子，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸，該嵌合抗原受體包含特異性識別人類間皮素之抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、4-1BB細胞內區域及CD3ζ細胞內區域；編碼IL-7之聚核苷酸；及編碼CCL19之聚核苷酸。本文亦揭示包含該等核酸分子之載體、經修飾之免疫細胞及醫藥組合物以及使用方法。

Description

特異性靶向間皮素之經工程改造之免疫細胞及其用途

本發明係關於一種表現特異性識別人類間皮素之細胞表面分子、白介素7 (IL-7)及趨化因子(C-C基元)配位體19 (CCL19)的免疫細胞；一種包含該免疫細胞之醫藥組合物；一種包含編碼特異性識別間皮素之細胞表面分子之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸的表現載體；一種使用方法；及一種用於產生表現特異性識別人類間皮素之細胞表面分子、IL-7及CCL19之免疫細胞的方法，該方法包括將編碼特異性識別人類間皮素之細胞表面分子之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸引入免疫細胞。

惡性腫瘤為影響世界上許多人之疾病，且一般而言，普遍藉由化學療法、放射療法或手術療法進行治療。然而，已存在各種問題，諸如有害反應之發生、一些功能之損失及不能治療之復發或轉移。因而，近年來一直在推進免疫細胞療法之開發以維持患者之較高品質的生活(QOL)。免疫細胞療法涉及自患者收穫免疫細胞，進行用於增強所收穫之免疫細胞之免疫功能的程序，擴增細胞，及將細胞再投與回患者體內。舉例而言，免疫細胞療法可包括自患者收集T細胞，將編碼嵌合抗原受體(組成性雄固烷受體：下文亦稱為「CAR」)之核酸引入T細胞，及將T細胞再投與回患者體內。雖然早期使用CAR-T療法已在血液癌癥中觀測到成功，但亦在實體瘤之治療中觀測到危及生命之毒性及實質性功效缺乏。因而，需要改良之CAR-T療法。 先前技術文件 專利文件

專利文件1：WO2016/056228

專利文件2：WO2019/124468

專利文件3：WO2013/063419 非專利文件

非專利文件1：Adachi等人, 「IL-7 and CCL19 expression in CAR-T cells improves immune cell infiltration and CAR-T cell survival in the tumor」, Nature Biotech, 36(4): 346-353, 2018。

本發明要解決之目標技術問題

使用T細胞之免疫療法存在許多挑戰，諸如運送至實體瘤不充分、對正常組織之高毒性、不能克服免疫抑制腫瘤微環境及內源性免疫反應之活化不充分。另外，已顯示經修飾以表現特異性識別間皮素之CAR的免疫細胞展現最低之治療功效。因此，要解決之目標技術問題為提供優化之經修飾免疫細胞來靶向表現間皮素之癌癥。 用於解決目標技術問題之手段

本發明人已發現，經修飾以表現特異性識別間皮素之CAR、IL-7及CCL19的免疫細胞可改良免疫療法之治療功效且改良存活率。

在某些實施例中，本發明包含一種經分離之核酸分子，其包含：編碼嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸，該碼嵌合抗原受體包含特異性識別人類間皮素之抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、4-1BB細胞內區域及CD3ζ細胞內區域；編碼IL-7之聚核苷酸；及編碼CCL19之聚核苷酸。在一些實施例中，IL-7為人類IL-7。在一些實施例中，CCL19為人類CCL19。在一些實施例中，抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含含有SEQ ID NO: 1-3之三個互補決定區(CDR)，且其中VL包含含有SEQ ID NO: 4-6之三個CDR。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 7且VL包含SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，抗體包含單鏈可變片段(scFv)形式。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域在經分離之核酸分子中之CD3ζ細胞內區域的上游。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，CD8跨膜區包含SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，核酸進一步包含連接抗體與CD8鉸鏈區之長度為3至10個胺基酸殘基之肽連接子。在一些實施例中，肽連接子包含AAA。在一些實施例中，經分離之核酸分子進一步包含信號傳導肽。在一些實施例中，信號傳導肽位於經分離之核酸分子中特異性識別人類間皮素之抗體的上游。在一些實施例中，信號傳導肽包含SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸各自獨立地在包含編碼自裂解2A肽(2A肽)之聚核苷酸的啓動子下轉錄。在一些實施例中，2A肽為P2A，視情況包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP。在一些實施例中，將肽連接子進一步添加至2A肽之N端，其中肽連接子包含GSG。在一些實施例中，IL-7包含SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，CCL19包含SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸在核酸分子中自5'端至3'端排列為編碼CAR之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO: 16之多肽。在一些實施例中，經分離之核酸分子包含SEQ ID NO: 17。在一些實施例中，經分離之核酸分子包含SEQ ID NO: 25。

在某些實施例中，本發明包含含有本文所描述之核酸分子的載體。在一些實施例中，載體為病毒載體，視情況為表現載體。在一些實施例中，病毒載體選自逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，病毒載體為γ逆轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為pSFG載體、pMSGV載體或pMSCV載體。在一些實施例中，載體為質體。

在某些實施例中，本發明包含一種免疫細胞，其來源於哺乳動物或自哺乳動物分離且包含本文所描述之核酸分子或本文所描述之載體。在一些實施例中，本發明包含一種免疫細胞，其來源於哺乳動物或自哺乳動物分離且表現a)嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含特異性識別人類間皮素之抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、4-1BB細胞內區域及CD3ζ細胞內區域，b) IL-7，及c) CCL19。在一些實施例中，免疫細胞為T細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、抗原呈遞細胞或粒細胞，視情況為T細胞或NK細胞。

在某些實施例中，本發明包含一種醫藥組合物，其包含本文所描述之免疫細胞及醫藥學上可接受之添加劑。

在某些實施例中，本發明包含一種治療表現間皮素之癌癥的方法，該方法包括向有需要之個體投與本文所描述之免疫細胞或本文所描述之醫藥組合物。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為實體瘤，視情況選自間皮瘤、結腸直腸癌、胰臟癌、胸腺癌、膽管癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、***癌、膀胱癌、***癌、頸癌、子宮癌、肝癌、腎癌、脾臟癌、氣管癌、支氣管癌、胃癌、食管癌、膽囊癌、睪丸癌、卵巢癌及骨癌。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為造血系統癌癥。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為肉瘤，視情況選自軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤及軟組織肉瘤。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為轉移性癌癥。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為復發性癌癥或難治性癌癥。在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與另一治療劑或另一治療方案。在一些實施例中，另一治療劑包括化學治療劑、免疫治療劑、靶向療法、放射療法或其組合。在一些實施例中，另一治療方案包括一綫療法。在一些實施例中，另一治療方案包括手術。在一些實施例中，上文所描述之免疫細胞或上文所描述之醫藥組合物與另一治療劑同時投與。在一些實施例中，上文所描述之免疫細胞或上文所描述之醫藥組合物與另一治療劑依序投與。在一些實施例中，上文所描述之免疫細胞或上文所描述之醫藥組合物在投與另一治療劑之前向個體投與。在一些實施例中，上文所描述之免疫細胞或上文所描述之醫藥組合物在投與另一治療劑之後向個體投與。在一些實施例中，個體為人類。

在某些實施例中，本發明包含一種減少腫瘤細胞增殖之方法，該方法包括使腫瘤細胞與本文所描述之免疫細胞接觸，從而減少腫瘤細胞增殖。在一些實施例中，該方法為活體外方法。在一些實施例中，該方法為活體內方法。

在某些實施例中，本發明包含一種用於產生表現特異性識別人類間皮素之細胞表面分子、IL-7及CCL19之免疫細胞的方法，該方法包括：將本文所描述之核酸分子或本文所描述之載體引入免疫細胞，以誘導免疫細胞表現特異性識別人類間皮素之細胞表面分子、IL-7及CCL19。在一些實施例中，免疫細胞為T細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、抗原呈遞細胞或粒細胞，視情況為T細胞或NK細胞。

在某些實施例中，本發明包含一種套組，其包括本文所描述之核酸分子；本文所描述之載體、本文所描述之免疫細胞或本文所描述之醫藥組合物，及使用說明書。 本發明之作用

本發明之免疫細胞針對表現間皮素(例如人類間皮素)之癌細胞具有細胞毒性活性且能夠抑制表現間皮素(例如人類間皮素)之腫瘤的形成。另外，本發明之免疫細胞對癌細胞之再次出現具有抑制作用。另外，本發明之免疫細胞具有優良安全型態。

相關申請案之交叉引用

本申請案根據35 U.S.C§119 (e)主張於2021年7月29日申請之美國臨時申請案第63/227,116號之優先權，該臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。 經工程改造之免疫細胞

在某些實施例中，本文揭示經工程改造之免疫細胞，其表現特異性結合於間皮素之經工程改造之細胞表面分子、白介素7 (IL-7)及趨化因子(C-C基元)配位體19 (CCL19)。在一些實施例中，經工程改造之細胞表面分子包含特異性識別間皮素之嵌合抗原受體(CAR)或特異性結合於間皮素之T細胞受體(TCR)。

在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞含有編碼經工程改造之細胞表面分子之外源性核酸、編碼IL-7之外源性核酸及編碼CCL19之外源性核酸。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞表現特異性識別間皮素之表面分子、IL-7及CCL19。

間皮素(MSLN)為細胞表面結合糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定蛋白，其中正常表現限於諸如來自胸膜、心包、腹膜、鞘膜、卵巢或輸卵管之間皮細胞。然而，MSLN亦已顯示在大量癌癥中過表現，諸如惡性間皮瘤、卵巢癌、乳癌(例如三陰性乳癌，TNBC)、胰臟癌、肺癌、胃癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膽管癌、子宮漿液性癌、膽管細胞癌及小兒急性骨髓性白血病。另外，增加之MSLN表現與患有TNBC、卵巢癌、肺腺癌、膽管細胞癌及胰腺腺癌之患者中的不良預後相關。

MSLN之生理及生物功能尚未完全闡明。然而，MSLN已顯示將參與癌癥發病機理之若干機制。舉例而言，在上皮卵巢癌中，當與表現更低MSLN水準之化學療法敏感患者進行比較時，在手術切除之卵巢癌組織中展現更高 MSLNmRNA表現水準之患者顯示對使用鉑及環磷醯胺之化學療法之抗性(Tang等人, 「The role of mesothelin in tumor progression and targeted therapy」, Anticancer Agents Med Chem. 13(2): 276-280 (2013))。亦發現MSLN以高親和力結合於表面黏蛋白MUC16 (或CA125)且已表明該結合介導卵巢癌細胞黏附於間皮細胞且促進轉移(Rump等人, 「Binding of ovarian cancer antigen CA125/MUC16 to mesothelin mediates cell adhesion」, J Biol Chem 279(10): 9190-9198, 2004；Gubbels等人, 「Mesothelin-MUC16 binding is a high affinity, N-glycan dependent interaction that facilitates peritoneal metastasis of ovarian tumors」, Mol Cancer 5(1): 50, 2006)。另外，MSLN已顯示將在活體外與活體內參與胰臟癌中之腫瘤進展、細胞存活及增殖(Li等人, 「Mesothelin is a malignant factor and therapeutic vaccine target for pancreatic cancer」, Mol Cancer Ther. 7(2): 286-296, 2008)。 嵌合抗原受體 (CAR) A. 抗間皮素抗體

在一些實施例中，經工程改造之細胞表面分子包含含有特異性識別間皮素之抗體的嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，抗體特異性識別哺乳動物間皮素，例如嚙齒動物間皮素、非人類靈長類動物間皮素或人類間皮素。

40 kDa蛋白質人類間皮素由MSLN基因編碼。關於人類間皮素之序列資訊可藉由檢索公衆已知之文件或數據庫(諸如NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)適當地獲得。關於人類間皮素之胺基酸序列資訊之實例可包括基因庫登錄號NP_037536.2、AAV87530.1及其同種型。

在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 1中所闡述之CDRH1、如SEQ ID NO: 2中所闡述之CDRH2及如SEQ ID NO: 3中所闡述之CDRH3或由其組成；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所闡述之CDRL1、如SEQ ID NO: 5中所闡述之CDRL2及如SEQ ID NO: 6中所闡述之CDRL3或由其組成。參見表1。表1

P4*	序列	SEQ ID NO:
HCDR1	GDSVSSNSAT	1
HCDR2	TYYRSKWYN	2
HCDR3	ARGMMTYYYGMDV	3
LCDR1	SGINVGPYR	4
LCDR2	YKSDSDK	5
LCDR3	MIWHSSAAV	6
VH	QVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGS	7
VL	QPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLS	8

*抗間皮素抗體在本文中亦稱為P4。

在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有約80%序列一致性之序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有約80%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有約85%序列一致性之序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有約90%序列一致性之序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有約95%序列一致性之序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有約96%序列一致性之序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有約97%序列一致性之序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有約98%序列一致性之序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有約99%序列一致性之序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有約99%序列一致性之序列。抗間皮素抗體可包含含有SEQ ID NO: 7之重鏈可變區(VH)及含有SEQ ID NO: 8之輕鏈可變區(VL)。抗間皮素抗體可包含由SEQ ID NO: 7組成之重鏈可變區(VH)及由SEQ ID NO: 8組成之輕鏈可變區(VL)。

在一些實施例中，在抗間皮素抗體中構架區內之一或多個殘基經修飾，從而在VH或VL區中產生80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。術語『構架區」係指抗體中排除互補決定區(CDR)之區域。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 7之80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 7之85%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 7之90%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 7之95%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 7之96%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 7之97%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 7之98%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 7之99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 8之80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 8之85%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 8之90%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 8之95%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 8之96%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 8之97%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 8之98%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素抗體包含構架區內之一或多個修飾且具有包含與SEQ ID NO: 8之99%序列一致性之序列。

在一些實施例中，抗間皮素抗體包含單鏈可變片段(scFv)形式。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含VH，該VH包含如SEQ ID NO: 1中所闡述之CDRH1、如SEQ ID NO: 2中所闡述之CDRH2及如SEQ ID NO: 3中所闡述之CDRH3或由其組成；及VL，該VL包含如SEQ ID NO: 4中所闡述之CDRL1、如SEQ ID NO: 5中所闡述之CDRL2及如SEQ ID NO: 6中所闡述之CDRL3或由其組成。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含VH，該VH包含與SEQ ID NO: 7具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO: 8具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。

在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體之VH與VL通過肽連接子連接。肽連接子可包括3個或更多個胺基酸殘基，例如約3至約30、約3至約20、3至約10、約5至約30、約5至約20或約5至約10個。肽連接子可包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個胺基酸殘基。

肽連接子可包括複數個聚丙胺酸、聚甘胺酸或丙胺酸與甘胺酸殘基之混合物。肽連接子可包括(Gly ₄Ser)n連接子，其中n為1至10之整數，較佳為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，進一步較佳為2、3、4或5。在一些實施例中，肽連接子包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10)。在一些情況下，肽連接子包含SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 20)。在一些情況下，肽連接子包含SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ (SEQ ID NO: 21)。在一些情況下，肽連接子包含GSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 22)。

在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含含有與QVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLS (SEQ ID NO: 9)之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含含有與SEQ ID NO: 9之約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含含有與SEQ ID NO: 9之約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含含有與SEQ ID NO: 9之約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含含有與SEQ ID NO: 9之約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含含有與SEQ ID NO: 9之約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含含有與SEQ ID NO: 9之約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含含有與SEQ ID NO: 9之約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體包含SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體由SEQ ID NO: 9組成。 B. 信號傳導肽

在一些實施例中，本文所揭示之嵌合抗原受體(CAR)包含信號傳導肽(例如作為前導序列)。信號傳導肽可使CAR定位至細胞之表面。信號傳導肽可包括免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈、CD8、T細胞受體α及β鏈、CD3ζ、CD28、CD3E、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR源性信號肽(前導序列)之多肽。

在一些實施例中，信號傳導肽包含含有與MDWTWRILFLVAAATGAHS (SEQ ID NO: 15)之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，信號傳導肽包含含有與SEQ ID NO: 15之約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，信號傳導肽包含含有與SEQ ID NO: 15之約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，信號傳導肽包含含有與SEQ ID NO: 15之約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，信號傳導肽包含含有與SEQ ID NO: 15之約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，信號傳導肽包含含有與SEQ ID NO: 15之約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，信號傳導肽包含含有與SEQ ID NO: 15之約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，信號傳導肽包含含有與SEQ ID NO: 15之約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，信號傳導肽包含SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，信號傳導肽由SEQ ID NO: 15組成。 C. 跨膜區

在一些實施例中，抗間皮素抗體連接至一或多個跨膜及細胞內信號傳導結構域。跨膜區可來源於天然或合成來源。示例性跨膜區可包括來源於CD8、T細胞受體α及β鏈、CD3ζ、CD28、CD3E (CD3ε)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154及GITR之跨膜區的多肽。在一些實施例中，跨膜區包含CD8跨膜區(例如人類CD8跨膜區)。

在一些實施例中，跨膜區包含含有與IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 12)之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 12之約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 12之約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 12之約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 12之約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 12之約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 12之約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 12之約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，跨膜區由SEQ ID NO: 12組成。

在一些實施例中，跨膜區包含含有與IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN (SEQ ID NO: 28)之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 28之約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 28之約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 28之約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 28之約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 28之約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 28之約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含含有與SEQ ID NO: 28之約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，跨膜區包含SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，跨膜區由SEQ ID NO: 28組成。 D. 細胞外鉸鏈區

包含任意寡肽或多肽或由其組成之細胞外鉸鏈區可位於識別間皮素之細胞表面分子與跨膜區之間。細胞外鉸鏈區之長度之實例可包括1至100個胺基酸殘基，較佳10至70、10至50或10至30個胺基酸殘基。示例性細胞外鉸鏈區可包括來源於CD8、CD28及CD4之鉸鏈區及免疫球蛋白鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區包含人類CD8之鉸鏈區。

在一些實施例中，細胞外鉸鏈區為CD8鉸鏈區，其包含與TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 11)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 11具有約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 11具有約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 11具有約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 11具有約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 11具有約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 11具有約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 11具有約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，CD8鉸鏈區由SEQ ID NO: 11組成。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含具有PTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 29)之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 29具有約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 29具有約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 29具有約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 29具有約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 29具有約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 29具有約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 29具有約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD8鉸鏈區包含SEQ ID NO: 29。在一些實施例中，CD8鉸鏈區由SEQ ID NO: 29組成。

在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體通過肽連接子連接至鉸鏈區。肽連接子可包括3個或更多個胺基酸殘基，例如約3至約30、約3至約20、3至約10、約5至約30、約5至約20或約5至約10個。肽連接子可包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個胺基酸殘基。

肽連接子可包括複數個聚丙胺酸、聚甘胺酸或丙胺酸與甘胺酸殘基之混合物或丙胺酸或甘胺酸與一或多個其他胺基酸之混合物。在一些實施例中，肽連接子包含AlaAlaAla (「AAA」)。在一些實施例中，肽連接子為三丙胺酸連接子或AlaAlaAla (「AAA」)。在一些實施例中，肽連接子包含ArgAlaAlaAla (「RAAA」) (SEQ ID NO: 30)。在一些實施例中，肽連接子為ArgAlaAlaAla (「RAAA」) (SEQ ID NO: 30)。

在一些實施例中，抗間皮素scFv抗體在不存在連接子之情況下連接至鉸鏈區。 E. 免疫細胞活化信號傳導區域

在一些實施例中，CAR包含一或多個細胞內信號傳導區域。細胞內信號傳導區域可包含當細胞表面分子識別間皮素時能夠將信號轉導至細胞中之區域。細胞內信號傳導區域可包含選自CD28、4-1BB (CD137)、GITR、CD27、OX40、HVEM、CD3ζ或Fc受體相關γ鏈之多肽之細胞內區域的至少一或多個成員。在一些實施例中，細胞內信號傳導區域包含CD28細胞內區域之多肽、4-1BB細胞內區域之多肽、CD3細胞內區域之多肽或其組合。

在一些實施例中，CAR包含4-1BB細胞內區域。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含含有與KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 13)之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 13之約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 13之約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 13之約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 13之約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 13之約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 13之約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 13之約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域包含SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域由SEQ ID NO: 13組成。

在一些實施例中，CAR進一步包含CD3ζ細胞內區域。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含含有與RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 14)之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 14之約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 14之約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 14之約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 14之約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 14之約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 14之約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含含有與SEQ ID NO: 14之約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域包含SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，CD3ζ細胞內區域由SEQ ID NO: 14組成。 IL-7 及 CCL19

白介素7 (IL-7)參與多能(multipotent/pluripotent)造血幹細胞向淋巴祖細胞之分化及淋巴譜系中之細胞(例如B細胞、T細胞及NK細胞)的增殖。IL-7由非造血細胞(諸如骨髓、胸腺或淋巴器官或組織之基質細胞)產生。在癌癥環境中，投與IL-7已顯示瞬時破壞CD8 ⁺與CD4 ⁺T細胞之穩態及CD4 ⁺CD25 ⁺Foxp3 ⁺T調控細胞百分比之降低。

在一些實施例中，本文所描述之免疫細胞表現IL-7。在一些實施例中，IL-7包含含有與MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH (SEQ ID NO: 18)之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，IL-7包含含有與SEQ ID NO: 18之約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，IL-7包含含有與SEQ ID NO: 18之約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，IL-7包含含有與SEQ ID NO: 18之約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，IL-7包含含有與SEQ ID NO: 18之約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，IL-7包含含有與SEQ ID NO: 18之約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，IL-7包含含有與SEQ ID NO: 18之約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，IL-7包含含有與SEQ ID NO: 18之約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，IL-7包含SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，IL-7由SEQ ID NO: 18組成。

趨化因子(C-C基元)配位體19 (CCL19)亦稱為EBl1配位體趨化因子(ELC)及巨噬細胞炎性蛋白-3-β (MIP-3-β)，其在淋巴細胞再循環及歸巢中起作用。CCL19由淋巴結之樹突細胞或巨噬細胞表現且具有經由其受體CCR7起始T細胞、B細胞或成熟樹突細胞遷移之功能。

在一些實施例中，本文所描述之免疫細胞進一步表現CCL19。在一些實施例中，CCL19包含含有與MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS (SEQ ID NO: 19)之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，CCL19包含含有與SEQ ID NO: 19之約85%序列一致性之序列。在一些實施例中，CCL19包含含有與SEQ ID NO: 19之約90%序列一致性之序列。在一些實施例中，CCL19包含含有與SEQ ID NO: 19之約95%序列一致性之序列。在一些實施例中，CCL19包含含有與SEQ ID NO: 19之約96%序列一致性之序列。在一些實施例中，CCL19包含含有與SEQ ID NO: 19之約97%序列一致性之序列。在一些實施例中，CCL19包含含有與SEQ ID NO: 19之約98%序列一致性之序列。在一些實施例中，CCL19包含含有與SEQ ID NO: 19之約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，CCL19包含SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，CCL19由SEQ ID NO: 19組成。 另一免疫功能控制因子

本發明之免疫細胞可進一步表現另一免疫功能控制因子，諸如IL-15、CCL21、IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IP-10、幹擾素-γ、MIP-1α、GM-CSF、M-CSF、TGF-β或TNF-α。在一些實施例中，另一免疫功能控制因子包括IL-15。在一些實施例中，另一免疫功能控制因子包括IL-2。在一些實施例中，另一免疫功能控制因子包括幹擾素-γ。在一些實施例中，另一免疫功能控制因子包括GM-CSF。在一些實施例中，另一免疫功能控制因子包括TGF-β。在一些實施例中，另一免疫功能控制因子包括TNF-α。在一些實施例中，另一免疫功能控制因子較佳為除IL-12外之免疫功能控制因子。 各區域之排列

在某些實施例中，本文揭示一種經分離之核酸分子，其包含編碼特異性結合於間皮素之經工程改造之細胞表面分子(例如特異性結合於間皮素之CAR)、IL-7及CCL19的一或多個聚核苷酸。在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼包含特異性識別人類間皮素之抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、4-1BB細胞內區域及CD3ζ細胞內區域之CAR的聚核苷酸；編碼IL-7之聚核苷酸；及編碼CCL19之聚核苷酸。在一些實施例中，編碼CAR、IL-7及CCL19之聚核苷酸位於核酸分子中之兩個或更多個不同聚核苷酸上。在其他實施例中，經分離之核酸分子包含編碼CAR及IL-7之聚核苷酸、編碼CAR及CCL19之聚核苷酸或編碼CAR、IL-7或CCL19之聚核苷酸。

在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸包含特異性識別人類間皮素之抗體上游之信號傳導肽。在一些實施例中，抗體藉由肽連接子(例如AlaAlaAla)連接至CD8鉸鏈區。在一些實施例中，4-1BB細胞內區域位於聚核苷酸中CD3ζ細胞內區域之上游。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 16)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 16具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 16具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 16具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 16具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 16具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 16具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 16具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 16。CAR可由SEQ ID NO: 16組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 31)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 31具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 31具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 31具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 31具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 31具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 31具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 31具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 31。CAR可由SEQ ID NO: 31組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 32)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 32具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 32具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 32具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 32具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 32具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 32具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 32具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 32。CAR可由SEQ ID NO: 32組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 33)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 33具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 33具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 33具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 33具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 33具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 33具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 33具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 33。CAR可由SEQ ID NO: 33組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 34)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 34具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 34具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 34具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 34具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 34具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 34具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 34具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 34。CAR可由SEQ ID NO: 34組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 35)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 35具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 35具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 35具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 35具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 35具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 35具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 35具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 35。CAR可由SEQ ID NO: 35組成。

該聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 36)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 36具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 36具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 36具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 36具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 36具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 36具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 36具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 36。CAR可由SEQ ID NO: 36組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 37)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 37具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 37具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 37具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 37具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 37具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 37具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 37具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 37。CAR可由SEQ ID NO: 37組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 38)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 38具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 38具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 38具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 38具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 38具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 38具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 38具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 38。CAR可由SEQ ID NO: 38組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 39)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 39具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 39具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 39具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 39具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 39具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 39具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 39具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 39。CAR可由SEQ ID NO: 39組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 40)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 40具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 40具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 40具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 40具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 40具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 40具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 40具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 40。CAR可由SEQ ID NO: 40組成。

聚核苷酸可編碼包含與MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 41)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的CAR。CAR可包含與SEQ ID NO: 41具有約85%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 41具有約90%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 41具有約95%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 41具有約96%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 41具有約97%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 41具有約98%序列一致性之序列。CAR可包含與SEQ ID NO: 41具有約99%序列一致性之序列。CAR可包含SEQ ID NO: 41。CAR可由SEQ ID NO: 41組成。

編碼本文所描述之CAR的聚核苷酸可包含與ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCCGCCACAGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGACACCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGTGCCATCTCCGGCGATAGCGTGAGCAGCAACAGCGCCACCTGGAACTGGATCAGGCAGAGCCCCAGCAGAGGACTGGAGTGGCTGGGCAGGACCTACTACAGGAGCAAGTGGTACAACGACTACGCCGTGAGCGTGAAGAGCAGGATGAGCATCAACCCCGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCCGTGACCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCATGATGACCTACTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCATCCTGGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGAGGAGGCGGAAGCCAGCCTGTGCTGACCCAGAGCAGCAGCCTGAGCGCTAGCCCTGGAGCTAGCGCCAGCCTGACCTGCACCCTGAGAAGCGGCATCAACGTGGGCCCCTACAGGATCTACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCAGCCCCCCCCAGTACCTGCTGAACTACAAGAGCGACAGCGACAAGCAGCAGGGCAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCAAGGATGCCAGCGCCAACGCCGGAGTGCTGCTGATCAGCGGCCTGAGGAGCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCATGATCTGGCACAGCAGCGCCGCCGTGTTTGGAGGCGGAACCCAGCTGACCGTGCTGAGCGCGGCCGCAACCACCACCCCCGCCCCTAGACCTCCTACACCCGCTCCCACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTTTAAGACCCGAGGCTTGTAGACCCGCTGCTGGCGGCGCCGTGCATACCAGAGGACTGGACTTCGCTTGTGACATCTACATCTGGGCTCCTTTAGCCGGCACATGTGGAGTGCTGCTGCTGTCTTTAGTGATCACTTTATACTGCAAGAGGGGTCGTAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAAGAAGAGGACGGCTGCAGCTGTCGTTTTCCCGAAGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGATGCCCCCGCTTACCAGCAAGGTCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATTTAGGTCGTAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAGCCTCGTAGGAAGAACCCCCAAGAAGGTTTATACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGAGGCAAGGGCCACGACGGTTTATACCAAGGTCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGATGCTTTACACATGCAAGCTTTACCTCCTCGT (SEQ ID NO: 17)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。聚核苷酸可包含與SEQ ID NO: 17具有約85%序列一致性之核酸序列。聚核苷酸可包含與SEQ ID NO: 17具有約90%序列一致性之核酸序列。聚核苷酸可包含與SEQ ID NO: 17具有約95%序列一致性之核酸序列。聚核苷酸可包含與SEQ ID NO: 17具有約96%序列一致性之核酸序列。聚核苷酸可包含與SEQ ID NO: 17具有約97%序列一致性之核酸序列。聚核苷酸可包含與SEQ ID NO: 17具有約98%序列一致性之核酸序列。聚核苷酸可包含與SEQ ID NO: 17具有約99%序列一致性之核酸序列。聚核苷酸可包含SEQ ID NO: 17。聚核苷酸可由SEQ ID NO: 17組成。

在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸各自獨立地在包含編碼自裂解2A肽(2A肽)或內部核糖體進入位點(IRES)之聚核苷酸的啓動子下轉錄。在一些實施例中，編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸各自獨立地在包含編碼2A肽或IRES之聚核苷酸的啓動子下轉錄。

在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸各自獨立地在包含編碼2A肽之聚核苷酸的啓動子下轉錄。2A肽家族中存在四個成員：P2A、E2A、F2A及T2A。P2A來源於豬鐵士古病毒(teschovirus)-1 2A。E2A來源於馬鼻炎A病毒。F2A來源於***病毒18。T2A來源於扁刺蛾病毒2A。2A肽成員之示例性序列包括： P2A - ATNFSLLKQAGDVEENPGP； E2A - QCTNYALLKLAGDVESNPGP； F2A - VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP；及 T2A – EGRGSLLTCGDVEENPGP。

在一些實施例中，將肽連接子進一步添加至2A肽之末端，例如在N端。在一些實施例中，肽連接子包含GSG。

在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸各自獨立地在包含編碼P2A肽之聚核苷酸的啓動子下轉錄。P2A肽可包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP。在一些實施例中，將肽連接子(例如GSG)進一步添加至P2A肽之N端。在一些情況下，P2A包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 23)。

在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸在核酸分子中自5'端至3'端排列為：編碼CAR之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸；編碼CAR之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸；編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CAR之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸；編碼CCL19之聚核苷酸-編碼CAR之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸；編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸-編碼CAR之聚核苷酸；或編碼CCL19之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CAR之聚核苷酸。

在一些實施例中，編碼第一2A肽之聚核苷酸(位於第1與第2聚核苷酸之間)及編碼第二2A肽之聚核苷酸(位於第2與第3聚核苷酸之間)為非一致(密碼子優化)之聚核苷酸以防止意外重組。在一些實施例中，編碼第一P2A肽之聚核苷酸包含GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCC (SEQ ID NO: 26)且編碼第二P2A肽之多肽包含GGCAGCGGCGCCACCAACTTCTCTCTGCTGAAGCAAGCCGGCGATGTGGAGGAGAATCCCGGCCCC (SEQ ID NO: 27)。

在一些實施例中，本文所描述之編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸可包含與ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCCGCCACAGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGACACCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGTGCCATCTCCGGCGATAGCGTGAGCAGCAACAGCGCCACCTGGAACTGGATCAGGCAGAGCCCCAGCAGAGGACTGGAGTGGCTGGGCAGGACCTACTACAGGAGCAAGTGGTACAACGACTACGCCGTGAGCGTGAAGAGCAGGATGAGCATCAACCCCGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCCGTGACCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCATGATGACCTACTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCATCCTGGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGAGGAGGCGGAAGCCAGCCTGTGCTGACCCAGAGCAGCAGCCTGAGCGCTAGCCCTGGAGCTAGCGCCAGCCTGACCTGCACCCTGAGAAGCGGCATCAACGTGGGCCCCTACAGGATCTACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCAGCCCCCCCCAGTACCTGCTGAACTACAAGAGCGACAGCGACAAGCAGCAGGGCAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCAAGGATGCCAGCGCCAACGCCGGAGTGCTGCTGATCAGCGGCCTGAGGAGCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCATGATCTGGCACAGCAGCGCCGCCGTGTTTGGAGGCGGAACCCAGCTGACCGTGCTGAGCGCGGCCGCAACCACCACCCCCGCCCCTAGACCTCCTACACCCGCTCCCACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTTTAAGACCCGAGGCTTGTAGACCCGCTGCTGGCGGCGCCGTGCATACCAGAGGACTGGACTTCGCTTGTGACATCTACATCTGGGCTCCTTTAGCCGGCACATGTGGAGTGCTGCTGCTGTCTTTAGTGATCACTTTATACTGCAAGAGGGGTCGTAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAAGAAGAGGACGGCTGCAGCTGTCGTTTTCCCGAAGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGATGCCCCCGCTTACCAGCAAGGTCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATTTAGGTCGTAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAGCCTCGTAGGAAGAACCCCCAAGAAGGTTTATACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGAGGCAAGGGCCACGACGGTTTATACCAAGGTCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGATGCTTTACACATGCAAGCTTTACCTCCTCGTGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCCTGCATGTTCCATGTGAGCTTCAGGTACATCTTCGGACTGCCTCCTCTCATCCTGGTCCTCCTCCCCGTGGCCAGCTCCGACTGTGACATCGAAGGAAAGGATGGCAAGCAGTACGAAAGCGTGCTGATGGTGAGCATCGATCAGCTCCTGGATTCCATGAAGGAAATCGGCTCCAACTGCCTCAACAATGAGTTCAACTTTTTTAAGAGGCATATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTTCTGTTCAGGGCCGCCAGGAAGCTGAGACAGTTCCTCAAGATGAATAGCACCGGCGACTTCGACCTCCATCTGCTGAAGGTGTCCGAGGGAACCACCATCCTGCTGAACTGCACCGGCCAAGTGAAGGGAAGAAAACCTGCTGCCCTGGGCGAGGCTCAGCCTACCAAGAGCCTGGAGGAGAACAAAAGCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTGTGCTTCCTCAAGAGGCTCCTGCAGGAGATTAAGACCTGTTGGAACAAGATCCTGATGGGCACAAAGGAGCACGGCAGCGGCGCCACCAACTTCTCTCTGCTGAAGCAAGCCGGCGATGTGGAGGAGAATCCCGGCCCCATGGCTCTGCTGCTCGCCCTGAGCCTGCTCGTCCTCTGGACCTCCCCTGCTCCTACCCTGAGCGGCACCAATGACGCTGAAGACTGCTGCCTGTCCGTGACCCAGAAGCCTATCCCCGGATATATCGTGAGGAATTTTCATTACCTCCTGATCAAGGACGGCTGTAGAGTGCCCGCCGTCGTGTTCACAACACTCAGAGGCAGGCAGCTGTGTGCTCCCCCCGACCAGCCTTGGGTGGAGAGAATCATTCAGAGACTGCAAAGGACCTCCGCTAAGATGAAGAGGAGGTCCAGC (SEQ ID NO: 25)具有約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。載體

在一些實施例中，一或多個載體涵蓋編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸。在一些實施例中，載體(例如表現載體)包含核酸分子，該核酸分子包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸，該嵌合抗原受體包含特異性識別人類間皮素之抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、4-1BB細胞內區域及CD3ζ細胞內區域；編碼IL-7之聚核苷酸；及編碼CCL19之聚核苷酸。參見圖1A。在一些實施例中，編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸在載體(例如表現載體)中自5'端至3'端排列為：編碼CAR之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸；編碼CAR之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸；編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CAR之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸；編碼CCL19之聚核苷酸-編碼CAR之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸；編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸-編碼CAR之聚核苷酸；或編碼CCL19之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CAR之聚核苷酸。

在一些實施例中，第一載體(例如第一表現載體)包含編碼CAR之聚核苷酸且第二載體(例如第二表現載體)包含編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸，其中編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸視情況在第二載體(例如第二表現載體)中自5'端至3'端排列為編碼IL-7之聚核苷酸-編碼CCL19之聚核苷酸或編碼CCL19之聚核苷酸-編碼IL-7之聚核苷酸。

在其他實施例中，第一載體(例如第一表現載體)包含編碼CAR之聚核苷酸及編碼IL-7之聚核苷酸或編碼CCL19之聚核苷酸，且第二載體(例如第二表現載體)包含未包括在第一載體中的編碼IL-7之聚核苷酸或編碼CCL19之聚核苷酸。在一些實施例中，第一載體(例如第一表現載體)包含編碼CAR之聚核苷酸及編碼IL-7之聚核苷酸，且第二載體(例如第二表現載體)包含編碼CCL19之聚核苷酸。在其他實施例中，第一載體(例如第一表現載體)包含編碼CAR之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸，且第二載體(例如第二表現載體)包含編碼IL-7之聚核苷酸。

在其他實施例中，第一載體(例如第一表現載體)包含編碼CAR之聚核苷酸，第二載體(例如第二表現載體)包含編碼IL-7之聚核苷酸，且第三載體(例如第三表現載體)包含編碼CCL19之聚核苷酸。

本發明之載體(例如表現載體)可包含一或多個天然來源之核酸或人工合成之核酸，且可根據要引入本發明之載體(例如表現載體)之細胞類型適當地選擇。其序列資訊可藉由檢索公衆已知之文件或數據庫(諸如NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/))適當地獲得。

本發明之載體可為表現載體，藉由使載體與細胞接觸將該表現載體引入免疫細胞或其前驅體細胞，使得其中編碼之預定蛋白質(多肽)可在免疫細胞中表現，從而產生本發明之經修飾免疫細胞。本發明之表現載體未由任何實施例特別限制。熟習此項技術者能夠設計且製備容許所需蛋白質(多肽)在免疫細胞中表現之表現載體。本發明之包含編碼特異性識別人類間皮素之細胞表面分子之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸的表現載體之實例可包括用於產生本發明之免疫細胞之表現載體中的任一者。

本發明之表現載體之類型可為綫性形式或環狀形式，且可為非病毒載體(諸如質體)，可為病毒載體，或可為基於轉位子之載體。此類載體可含有控制序列，諸如啓動子或終止子；或選擇性標記序列，諸如耐藥基因或報告基因。編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸可可操作地排列在啓動子序列下游，使得各個聚核苷酸可高效轉錄。

啓動子之實例可包括：病毒源性啓動子，諸如逆轉錄病毒LTR啓動子、SV40早期啓動子、巨細胞病毒啓動子及單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶啓動子；及哺乳動物源性啓動子，諸如磷酸甘油酸激酶(PGK)啓動子、Xist啓動子、β-肌動蛋白啓動子及RNA聚合酶II啓動子。在一些實施例中，啓動子可較佳包括逆轉錄病毒LTR啓動子。逆轉錄病毒LTR啓動子可包含CTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCA (SEQ ID NO: 24)。或者，可使用由四環素誘導之四環素反應性啓動子、由幹擾素誘導之Mx1啓動子或類似啓動子。本發明之表現載體中使用由特定物質誘導之啓動子允許根據癌癥治療過程控制對IL-7及CCL19表現之誘導，舉例而言，當含有本發明之載體的免疫細胞以用於治療癌癥之醫藥組合物形式使用時。

病毒載體之實例可包括逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒載體，且可較佳包括逆轉錄病毒載體，例如γ逆轉錄病毒載體，更佳為pMSGV載體(Tamada k等人, Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002))、pMSCV載體(由Takara Bio Inc.製造)或pSFG載體。使用逆轉錄病毒載體允許轉殖基因之長期及穩定表現，因為轉殖基因整合於宿主細胞之基因組中。

一或多種分析可用於證實本發明之表現載體含於免疫細胞中。示例性分析可包括用於篩查經工程改造之免疫細胞之CAR表現的流式細胞術、北方墨點法(Northern blotting)、南方墨點法(Southern blotting)、PCR (諸如RT-PCR)、ELISA或西方墨點法(Western blotting)。在一些實施例中，表現載體進一步包含標記基因(例如編碼螢光蛋白，諸如綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)或黃色螢光蛋白(YFP))以偵測免疫細胞對CAR、IL-7及/或CCL19之表現。 免疫細胞及製備方法

在某些實施例中，本文所描述之免疫細胞經修飾以表現特異性識別間皮素(例如人類間皮素)之細胞表面分子、IL-7及CCL19 (圖1B)。示例性免疫細胞可包括淋巴樣細胞，諸如T細胞、自然殺手細胞(NK細胞)及B細胞；抗原呈遞細胞，諸如單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞；或粒細胞，諸如嗜中性白血球、嗜伊紅白血球、嗜鹼性白血球或肥大細胞。免疫細胞可包括來源於哺乳動物(諸如人類、狗、貓、豬或小鼠)之T細胞，較佳為來源於或分離自人類之T細胞。免疫細胞(例如T細胞)可通過培養(例如離體培養)獲得，或直接自哺乳動物收穫。免疫細胞不受限制，只要細胞參與免疫反應且可表現特異性識別間皮素(例如人類間皮素)之細胞表面分子、表現IL-7且表現CCL19即可。免疫細胞可為自有需要之個體收穫以用於後續治療之自體細胞。免疫細胞亦可為對有需要之個體而言的異基因細胞或同基因細胞。免疫細胞亦可藉由在用於誘導幹細胞(例如誘導多能幹細胞(iPS細胞)、胚胎幹細胞(ES細胞))或祖細胞且將其分化為免疫細胞之適當條件下培養此類細胞來獲得。

在某些實施例中，本文揭示經修飾以表現特異性識別間皮素之CAR、IL-7及CCL19的免疫細胞群體。在一些實施例中，免疫細胞群體包含表現特異性識別間皮素之CAR、IL-7及CCL19之經修飾T細胞(例如離體擴增或自哺乳動物收穫)。免疫細胞群體可包含約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高百分比之經修飾T細胞。免疫細胞群體可包含約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%之經修飾T細胞。免疫細胞群體可包含實質上純之經修飾T細胞群體。示例性T細胞可包括α-βT細胞、γ-δT細胞、CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、腫瘤浸潤T細胞、記憶T細胞、原初T細胞及自然殺手T (NKT)細胞。

在一些實施例中，經修飾以表現特異性識別間皮素之CAR、IL-7及CCL19之免疫細胞群體包含小於約30%、25%、20%、15%、10%、5%或更少之污染細胞。如本文所用，術語「污染細胞」係指不表現特異性識別間皮素之CAR、IL-7及CCL19之細胞。污染細胞可包括不表現特異性識別間皮素之CAR、IL-7及CCL19之T細胞，及不表現特異性識別間皮素之CAR、IL-7及CCL19之其他類型之免疫細胞。污染細胞亦可指來自體液(諸如血液或骨髓流體)、來源於組織(諸如脾臟組織、胸腺或淋巴結)或來源於癌癥組織(諸如原發性腫瘤組織、轉移性腫瘤組織或癌性腹水)之非免疫細胞。

用於產生本發明之免疫細胞之方法的實例可包括將編碼細胞表面分子之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸引入免疫細胞的製備方法。製備方法可包括如例如WO2016/056228、WO2017/159736、WO2013/176915、WO2015/120096、WO2016/019300或Vormittag P等人, Curr Opin Biotechnol 2018; 53: 164-81中所描述之製備方法。替代實例可包括自藉由將用於表現特異性識別間皮素(例如人類間皮素)之細胞表面分子、IL-7及/或CCL19之載體植入受精卵中所產生之基因轉殖哺乳動物純化及獲得免疫細胞之方法，及必要時將用於表現特異性識別間皮素(例如人類間皮素)之細胞表面分子、IL-7及/或CCL19之載體進一步引入自基因轉殖哺乳動物純化及獲得之免疫細胞的製備方法。

在引入編碼細胞表面分子之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸或上文描述之載體的情況下，該方法可為用於將聚核苷酸或載體引入免疫細胞之任何方法。實例可包括電穿孔方法(Cytotechnology, 3, 133 (1990))、磷酸鈣方法(日本未審查專利申請公開案第2-227075號)、脂質體轉染方法(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7413 (1987))及病毒感染方法。示例性病毒感染方法可包括用要引入之載體及包裝質體轉染包裝細胞，諸如GP2-293細胞(由Takara Bio Inc.製造)、Plat-GP細胞(由Cosmo Bio Co., Ltd.製造)、PG13細胞(ATCC CRL-10686)或PA317細胞(ATCC CRL-9078)以製備重組病毒，及用重組病毒感染免疫細胞(參見例如WO2017/159736)之方法。

在一些實施例中，該方法包括將包含編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸的一或多個載體引入免疫細胞。在一些實施例中，該方法包括將包含核酸分子之載體(例如表現載體)引入免疫細胞，該核酸分子包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸，該嵌合抗原受體包含特異性識別人類間皮素之抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、4-1BB細胞內區域及CD3ζ細胞內區域；編碼IL-7之聚核苷酸；及編碼CCL19之聚核苷酸。在一些實施例中，該方法包括將包含編碼CAR之聚核苷酸的第一載體(例如第一表現載體)及包含編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸的第二載體(例如第二表現載體)一起或分階段引入免疫細胞。在一些實施例中，該方法包括將包含編碼CAR之聚核苷酸及編碼IL-7之聚核苷酸或編碼CCL19之聚核苷酸的第一載體(例如第一表現載體)及包含未包括在第一載體中之編碼IL-7之聚核苷酸或編碼CCL19之聚核苷酸的第二載體(例如第二表現載體)一起或分階段引入免疫細胞。在一些實施例中，該方法包括將包含編碼CAR之聚核苷酸及編碼IL-7之聚核苷酸的第一載體(例如第一表現載體)及包含編碼CCL19之聚核苷酸的第二載體(例如第二表現載體)一起或分階段引入免疫細胞。在一些實施例中，該方法包括將包含編碼CAR之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸的第一載體(例如第一表現載體)及包含編碼IL-7之聚核苷酸的第二載體(例如第二表現載體)一起或分階段引入免疫細胞。在一些實施例中，該方法包括將引入包含編碼CAR之聚核苷酸的第一載體(例如第一表現載體)、包含編碼IL-7之聚核苷酸的第二載體(例如第二表現載體)及包含編碼CCL19之聚核苷酸的第三載體(例如第三表現載體)一起或分階段引入免疫細胞。

可將編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸中之一或多者整合至免疫細胞之基因組中。在一些實施例中，未將編碼CAR之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸整合至基因組中(例如附加地)。 使用方法

在某些實施例中，本文揭示一種治療表現間皮素之癌癥之方法。在一些實施例中，該方法包括向有需要之個體投與經修飾以表現特異性結合於間皮素之經工程改造之細胞表面分子、白介素7 (IL-7)及趨化因子(C-C基元)配位體19 (CCL19)的本文所描述之免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞經修飾以表現經工程改造之細胞表面分子，該經工程改造之細胞表面分子包括特異性識別間皮素之嵌合抗原受體(CAR)或特異性結合於間皮素之T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，免疫細胞經修飾以表現包含特異性識別人類間皮素之抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、4-1BB細胞內區域及CD3ζ細胞內區域的CAR；IL-7；及CCL19。

在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為實體瘤。在一些實施例中，實體瘤包括間皮瘤、結腸直腸癌、胰臟癌、胸腺癌、膽管癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、***癌、膀胱癌、***癌、頸癌、子宮癌、肝癌、腎癌、胃癌、脾臟癌、氣管癌、支氣管癌、胃癌、食管癌、膽囊癌、睪丸癌、卵巢癌或骨癌。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為卵巢癌。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為間皮瘤。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為胃癌。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、肺類癌腫瘤、肺腺鱗癌、大細胞神經內分泌癌或唾液腺型肺癌)。在一些實施例中，表現間皮素之癌癥為NSCLC (例如肺腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞未分化性癌、肉瘤樣癌或腺鱗癌)。

表現間皮素之癌癥可為造血系統癌癥。造血系統癌癥可為B細胞造血系統癌癥、T細胞造血系統癌癥、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤。造血系統癌癥可為急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)或瓦登斯特隆巨球蛋白血癥(Waldenstrom macroglobulinemia)。

造血系統癌癥可為肉瘤。肉瘤可包括軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤或軟組織肉瘤。

表現間皮素之癌癥可為轉移性癌癥，例如轉移性實體瘤或轉移性造血系統癌癥。轉移性表現間皮素之癌癥可為轉移性卵巢癌、轉移性間皮瘤、轉移性胃癌或轉移性肺癌(例如轉移性NSCLC)。

表現間皮素之癌癥可為復發性或難治性癌癥，例如復發性或難治性實體瘤或復發性或難治性造血系統癌癥。復發性或難治性表現間皮素之癌癥可為復發性或難治性卵巢癌、復發性或難治性間皮瘤、復發性或難治性胃癌或復發性或難治性肺癌(例如復發性或難治性NSCLC)。

在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與另一治療劑或另一治療方案。另一治療劑可包括化學治療劑、免疫治療劑、靶向療法、放射療法或其組合。說明性另一治療劑包括但不限於烷基化劑，諸如六甲蜜胺、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、氮芥苯丁酸、順鉑、環磷醯胺、達卡巴嗪(dacarbazine)、洛莫司汀(lomustine)、美法侖(melphalan)、奧沙利鉑(oxalaplatin)、替莫唑胺(temozolomide)或噻替派(thiotepa)；抗代謝物，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰基嘌呤(6-MP)、卡培他濱(capecitabine)、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達拉濱(fludarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、胺甲喋呤或培美曲塞(pemetrexed)；蒽環類，諸如柔紅比星(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)或伊達比星(idarubicin)；拓撲異構酶I抑制劑，諸如拓撲替康(topotecan)或伊立替康(irinotecan) (CPT-11)；拓撲異構酶II抑制劑，諸如依託泊苷(etoposide) (VP-16)、替尼泊苷(teniposide)或米托蒽醌(mitoxantrone)；有絲***抑制劑，諸如多西他賽(docetaxel)、雌莫司汀(estramustine)、伊沙匹隆(ixabepilone)、帕西他賽(paclitaxel)、長春花鹼、長春新鹼或長春瑞濱(vinorelbine)；或皮質類固醇，諸如潑尼松(prednisone)、甲基潑尼松或***(dexamethasone)。

在一些實施例中，另一治療劑包括一綫療法。如本文所用，「一綫療法」包括對患有癌癥之個體的一級治療。在一些實施例中，癌癥為原發性癌。在其他實施例中，癌癥為轉移性或復發性癌癥。在一些實施例中，一綫療法包括化學療法。在其他實施例中，一綫治療包括放射療法。熟練技工將容易理解不同一綫治療可適用於不同癌癥類型。

在一些實施例中，另一治療劑包括聚ADP核糖聚合酶(PARP)之抑制劑。示例性PARP抑制劑包括但不限於奧拉帕利(olaparib) (AZD-2281，Lynparza®，來自Astra Zeneca)、蘆卡帕利(rucaparib) (PF-01367338，Rubraca®，來自Clovis Oncology)、尼拉帕利(niraparib) (MK-4827，Zejula®，來自Tesaro)、他拉唑帕利(talazoparib) (BMN-673，來自BioMarin Pharmaceutical Inc.)、維利帕利(veliparib) (ABT-888，來自Abb Vie)、CK-102 (以前為CEP 9722，來自Teva Pharmaceutical Industries Ltd.)、E7016 (來自Eisai)、伊尼帕利(iniparib) (BSI 201，來自Sanofi)及帕米帕利(pamiparib) (BGB-290，來自BeiGene)。

在一些實施例中，另一治療劑包括免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，檢查點抑制劑包括派姆單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、曲美木單抗(tremelimumab)或伊匹單抗(ipilimumab)。在一些實施例中，檢查點抑制劑包括PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、LAG3、B7-H3、KIR、CD137、PS、TFM3、CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、OX40、GITR、ICOS、BTLA (CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGHT、DR3、CD226、CD2或SLAM之抑制劑。抑制劑可為抗體或其片段(例如單株抗體、人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、RNAi分子或小分子。

在一些實施例中，另一治療劑包括抗體，諸如阿侖單抗(alemtuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、維布妥昔單抗(brentuximab vedotin)、恩美曲妥珠單抗(ado-trastuzumab emtansine)或博納吐單抗(blinatumomab)。

在一些實施例中，另一治療劑包括細胞因子。示例性細胞因子包括但不限於IL-Iβ、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21或TNFα。

在一些實施例中，另一治療劑包括受體促效劑。在一些實施例中，受體促效劑包括鐘樣受體(TLR)配位體。在一些實施例中，TLR配位體包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9。在一些實施例中，TLR配位體包括合成配位體，諸如Pam3Cys、CFA、MALP2、Pam2Cys、FSL-1、Hib-OMPC、聚I:C、聚A:U、AGP、MPL A、RC-529、MDF2p、CFA或鞭毛蛋白。

在一些實施例中，另一治療劑包括氟達拉濱及環磷醯胺。

在一些實施例中，另一治療劑包括替沙侖賽(tisagenlecleucel) (KYMRIAH®)、阿基侖賽(axicabtagene ciloleucel) (YESCARTA®)或布瑞基奧侖賽(brexucabtagene autoleucel) (TECARTUS®)。

在一些實施例中，另一治療方案包括手術。

在一些實施例中，本文所描述之免疫細胞或本文所描述之醫藥組合物與另一治療劑同時投與。

在一些實施例中，本文所描述之免疫細胞或本文所描述之醫藥組合物與另一治療劑依序投與。在一些實施例中，本文所描述之免疫細胞或本文所描述之醫藥組合物在投與另一治療劑之前向個體投與。在其他實施例中，本文所描述之免疫細胞或本文所描述之醫藥組合物在投與另一治療劑之後向個體投與。

在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，本文亦描述一種用於產生表現特異性識別間皮素(例如人類間皮素)之細胞表面分子、IL-7及CCL19之免疫細胞的方法。該方法包括將本文所描述之核酸分子或包含該核酸分子之載體引入免疫細胞以誘導免疫細胞表現特異性識別人類間皮素之細胞表面分子、IL-7及CCL19。在一些實施例中，免疫細胞為T細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、抗原呈遞細胞或粒細胞，視情況為T細胞或NK細胞。 醫藥組合物

在某些實施例中，上文所描述之免疫細胞經調配呈醫藥組合物形式。在一些實施例中，醫藥組合物藉由多種投藥途徑向個體投與，包括但不限於非經腸、經口、舌下或經真皮投藥途徑。在一些實施例中，非經腸投與包括靜脈內、皮下、肌肉內、鼻內、動脈內、關節內、真皮內、骨內輸注、腹膜內、蛛網膜下、顱內、滑膜內、瘤內、皮內、髓內、心內或鞘內投與。在一些實施例中，醫藥組合物經調配用於局部投與。在其他實施例中，醫藥組合物經調配用於全身投與。

在一些實施例中，醫藥組合物包含醫藥學上可接受之添加劑。添加劑之實例可包括鹽水、緩衝鹽水、細胞培養基、右旋糖、可注射水、甘油、乙醇、穩定劑、增溶劑、表面活性劑、緩衝液、防腐劑、張力劑、填料、潤滑劑或其組合。

在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含pH值調節劑或緩衝劑，其包括酸，諸如乙酸、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸及鹽酸；鹼，諸如氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉及三羥基甲基胺基甲烷；及緩衝劑，諸如檸檬酸鹽/右旋糖、碳酸氫鈉及氯化銨。此類酸、鹼及緩衝劑以將組合物之pH值維持在可接受範圍內所需之量被包括在內。

在一些實施例中，醫藥組合物以使組合物之滲透壓在可接受範圍內所需之量包括一或多種鹽。此類鹽包括具有鈉、鉀或銨陽離子及氯離子、檸檬酸根、抗壞血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根或亞硫酸氫根陰離子之彼等鹽，合適之鹽包括氯化鈉、氯化鉀、硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及硫酸銨。

在示例性方法中，本發明之醫藥組合物可獨立地一次性或分若干份每天4次、3次、兩次或一次；以1天、2天、3天、4天或5天間隔；每週一次；以7天、8天或9天間隔；每週兩次；每月一次；每月兩次；每月三次或更頻繁地投與。

在其中患者之狀態改良之情況下，根據醫生之判斷持續給予組合物投與，或者，暫時降低正在投與之組合物劑量或暫時中止某一長度之時間(亦即，「藥物假期」)。在一些實施例中，藥物假期之長度在2天與1年之間變化，僅舉例而言包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。在藥物假期期間劑量降低為10%-100%，僅舉例而言包括10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。

在一些實施例中，對應於此類量之給定經修飾T細胞之量視諸如疾病之嚴重程度、需要治療之個體或宿主之身份(例如重量)的因素而改變，然而常規地根據圍繞案例之特定情況(包括例如所投與之特定劑、投藥途徑及所治療之個體或宿主)以此項技術中已知之方式來確定。在一些實施例中，所需劑量適宜地以單次劑量或以同時(或歷時短時間段)或以適當間隔(例如以每天兩個、三個、四個或更多個亞劑量之形式)投與的分開之劑量存在。

前述範圍僅為提示性的，因為關於個別治療方案之變數的數值較大，且偏離此等建議值相當大並不罕見。此類劑量視許多變數而改變，該等變數不限於所使用化合物之活性、要治療之疾病或疾患、投與模式、個別個體之要求、正在治療之疾病或疾患之嚴重程度及開業醫師之判斷。

在一些實施例中，此類治療方案之毒性及治療功效在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序來確定，包括但不限於測定LD50 (使群體之50%致死之劑量)及ED50 (在群體之50%中治療有效之劑量)。毒性與治療效應之間的劑量比率為治療指數且其表示為LD50與ED50之間的比率。展現高治療指數之化合物為較佳的。在調配用於人類之一系列劑量時使用獲自細胞培養分析及動物研究之資料。此類化合物之劑量較佳在包括具有最小毒性之ED50的循環濃度之範圍內。劑量視所採用之劑型及所使用之投藥途徑而定在此範圍內變化。套組 / 製品

在某些實施例中，本文揭示一種套組，其包括上文所描述之核酸分子、包含上文所描述之核酸分子之載體、表現特異性識別間皮素(例如人類間皮素)之CAR、IL-7及CCL19之免疫細胞或醫藥組合物。在一些實施例中，套組可含有一或多種包裝材料，諸如包裝插頁、標籤、包裝物或陳述用於治療癌癥之使用方法等之類似物。由於本發明之醫藥組合物中之免疫細胞對腫瘤復發具有抑制作用，故本發明之醫藥組合物可充當用於抑制腫瘤復發之醫藥組合物。用於抑制腫瘤復發之此類醫藥組合物可含有一或多種包裝材料，諸如包裝插頁、標籤、包裝物或陳述用於抑制腫瘤復發之使用方法等的類似物。

術語「包裝材料」係指容納套組之組分的物理結構。材料可以無菌方式維持組分，且可由常用於此類目的之材料(例如紙、起皺纖維、玻璃、塑膠、金屬箔片、安瓿、小瓶、管等)製成。

本發明之套組可包括標籤或插頁。標籤或插頁包括「印刷品」，例如紙或卡紙，或與組件、套組或包裝材料(例如盒)分開或固定至組件、套組或包裝材料(例如盒)，或黏附至容納套組組分之安瓿、管或小瓶。標籤或插頁可另外包括電腦可讀媒體，諸如磁盤(例如軟盤、ZIP盤)、光盤(諸如CD-ROM/RAM或DVD-ROM/RAM)、DVD、MP3、磁帶或電存儲媒體，諸如RAM及ROM或其混合物，諸如磁性/光學存儲媒體、快閃媒體或記憶型卡片。

標籤或插頁可包括其中一或多種組分(例如結合劑或醫藥組合物)之標識資訊、劑量之量、活性劑之臨床藥理學(包括作用機制)、藥物動力學及藥效動力學。標籤或插頁可包括標識製造商資訊、批號及製造地點及日期之資訊。

標籤或插頁可包括關於套組組分可用於之疾病的資訊。標籤或插頁可包括供臨床醫師或個體在方法或治療協議或治療方案中使用套組組分中之一或多者的說明書。說明書可包括劑量量、頻率或持續時間及用於實踐本文所描述之方法、治療協議或治療劑方案中之任一者的說明。

標籤或插頁可包括關於組分可提供之任何益處(諸如治療任何益處)的資訊。標籤或插頁可包括關於潛在有害副作用之資訊，諸如警告個體或臨床醫師關於使用特定組合物(例如本文所描述之經修飾免疫細胞)將不適當之情況。舉例而言，有害副作用通常更可能在活性劑之較高劑量量、頻率或持續時間下發生，且因此，說明書可包括針對較高劑量量、頻率或持續時間之建議。在個體已經、將要或當前正在攝入可能與組合物不相容之一或多種其他藥物或個體已經、將要或當前正在經歷將與組合物不相容之另一治療協議或治療方案時亦可發生有害副作用，且因此，說明書可包括關於此類不相容性之資訊。定義

除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及申請專利範圍中所用，單數形式「一種」、「一個」及「該」包括複數參考物。舉例而言，術語「一個細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。

如本文所用，術語「包含」意在指組合物及方法包括所列舉之元素，但不排除其他元素。「基本上由……組成」當用於限定組合物及方法時應意謂排除對用於預期用途之組合具有任何重要意義的其他元素。舉例而言，如本文所定義之基本上由元素組成的組合物將不排除來自分離及純化方法之痕量污染物及醫藥學上可接受之載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、防腐劑等。「由……組成」應意謂排除超過痕量之其他成分之元素及用於投與本文所揭示之組合物的實質性方法步驟。由此等過渡術語中之每一者限定之態樣在本發明之範疇內。

如本文所用，術語「約」用於表明一值包括用於確定該值之裝置或方法之誤差的標凖偏差。術語「約」在包括範圍之數字標識(例如溫度、時間、量及濃度)之前使用時指示近似值，該等近似值可改變(+)或(-) 15%、10%、5%、3%、2%或1%。

亦如本文所用，「及/或」係指且涵蓋相關所列項中之一或多者之任何及所有可能的組合，並且當以替代方案(「或」)解釋時缺少組合。

如本文所用，「視情況存在」或「視情況」意謂隨後描述之事件或情況可能發生或可能不發生，且該描述包括事件或情況發生之實施例及其不發生之實施例。

如本文所用，術語「抗體」係指經由重鏈及輕鏈可變結構域(分別為VH及VL)結合至其他分子(抗原，例如間皮素)之蛋白質。術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體中參與抗體與抗原之結合的結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中各結構域包含四個保守構架區(FR)及三個CDR。(參見例如Kindt等人Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁(2007)。單個VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體的VH或VL結構域分別篩選互補VL或VH結構域之文庫而加以分離。參見例如Portolano等人, J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人, Nature 352:624-628 (1991)。

本發明之抗體包括單株抗體。術語「單株」當用於提及抗體時係指基於、獲自或來源於單個純系(包括任何真核、原核或噬菌體純系)之抗體。因此，「單株」抗體在本文中根據結構而非其製備方法來定義。

單株抗體藉由此項技術中已知之方法來製備(Kohler等人, Nature, 256:495(1975)；以及Harlow及Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1999)。簡單來說，可藉由用抗原注射小鼠來獲得單株抗體。用於對動物進行免疫之多肽或肽可來源於經轉譯之DNA或經化學合成且綴合至載體蛋白。化學偶合至免疫肽之常用載體包括例如鑰孔戚血藍素(KLH)、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)及破傷風類毒素。如下驗證抗體製備：分析血清樣品，移除脾臟以獲得B淋巴細胞，使B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤，對雜交瘤進行選殖，選擇產生針對抗原之抗體的陽性純系，且自雜交瘤培養物分離抗體。單株抗體可藉由多種確定之技術自雜交瘤培養物分離及純化，該等技術包括例如使用蛋白質-A瓊脂糖之親和層析、尺寸排阻層析及離子交換層析(參見例如Coligan等人, Current Protocols in Immunology第2.7.1-2.7.12部分及第2.9.1-2.9.3部分；及Barnes等人, 「Methods in Molecular Biology」, 10:79-104, Humana Press (1992))。

本發明之抗體可屬於任何抗體類別：IgM、IgG、IgE、IgA、IgD或亞類。IgG之示例性亞類為IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃及IgG ₄。

本發明之抗體可為人類化抗體。術語「人類化」係指具有受體人類免疫球蛋白分子中特異性結合於抗原之一或多個互補決定區(CDR)的非人類胺基酸殘基及構架區(FR)中側接CDR之一或多個人類胺基酸殘基的抗體序列。任何小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、非人類靈長類動物(例如猿、黑猩猩、獼猴、猩猩等)或其他動物抗體均可用作用於產生人類化抗體之CDR供給者。人類構架區殘基可經對應非人類殘基(例如來自供給者可變區)置換。因此，人類構架區中之殘基可經來自非人類CDR供給者抗體之對應殘基取代。人類化抗體可包括既不存在於人類抗體中亦不存在於供給者CDR或構架序列中的殘基。使用來源於人類化單株抗體之抗體組分使與非人類區域之免疫原性相關的問題減少。製備人類化抗體之方法為此項技術中已知的(參見例如美國專利第5,225,539號；第5,530,101號、第5,565,332號及第5,585,089號；Riechmann等人, (1988) Nature 332:323；EP 239,400；W091/09967；EP 592,106；EP 519,596；Padlan Molecular Immunol. (1991) 28:489；Studnicka等人, Protein Engineering (1994) 7:805；Singer等人, J. Immunol. (1993) 150:2844；及Roguska等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1994) 91:969)。

本發明之抗體可為嵌合抗體。術語「嵌合抗體」係指其中不同部分來源於不同動物物種之抗體，諸如具有來源於鼠單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的彼等抗體，例如人類化抗體。在一些實施例中，使用經開發用於藉由將具有適當抗原特異性之來自小鼠抗體分子之基因與具有適當生物活性之來自人抗體分子之基因剪接在一起來製備「嵌合抗體」之技術(Morrison等人, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855；Neuberger等人, 1984, Nature 312:604-608；Takeda等人, 1985, Nature 314:452-454)。

本發明之抗體包括其結合片段。示例性抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fv、Fd、單鏈Fv (scFv)、二硫鍵連接之Fv (sdfv)、輕鏈可變區VL、重鏈可變區VH、三特異性片段(Fab ₃)、雙特異性片段(Fab ₂)、雙抗體((V _L-V _H) ₂或(V _H-V _L) ₂)、三抗體(三價)、四抗體(四價)、微型抗體((scFV-C _H) ₂)、雙特異性單鏈Fv (Bis-scFv)、IgGΔCH2、scFv-Fc、(scFv) ₂-Fc及IgG4PE。此類片段可具有如全長抗體之結合親和力、如全長抗體之結合特異性或如全長抗體之一或多種活性或功能，例如間皮素結合抗體之功能或活性。

可將抗體片段組合。舉例而言，V _L或V _H子序列可由連接子序列連接從而形成V _L-V _H嵌合體。單鏈Fv (scFv)序列之組合可由連接子序列連接從而形成scFv-scFv嵌合體。抗體片段包括單獨或與其他序列之全部或一部分組合的單鏈抗體或可變區。

抗體片段可藉由包括但不限於完整抗體之蛋白水解消化之各種技術產生以及由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，抗體為重組產生之片段，諸如包含不天然存在之排列的片段，諸如具有由合成連接子(例如肽連接子)連接之兩個或更多個抗體區域或鏈的彼等片段，及/或可不藉由天然存在之完整抗體之酶消化產生的片段。在一些態樣中，抗體片段為scFv。

抗體片段亦可藉由抗體之蛋白水解(例如藉由整個抗體之胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化)產生。藉由使用胃蛋白酶之酶促裂解產生之抗體片段提供表示F(ab') ₂之5S片段。此片段可使用硫醇還原劑進一步裂解以產生3.5S Fab'單價片段。或者，使用胃蛋白酶之酶促裂解直接產生兩個單價Fab'片段及Fc片段(參見例如美國專利第4,036,945號及第4,331,647號；及Edelman等人, Methods Enymol. 1:422 (1967))。亦可使用其他裂解抗體之方法，諸如分離重鏈以形成單價輕鏈-重鏈片段、片段之進一步裂解或其他酶促或化學方法。

在一些實施例中，經描述用於產生單鏈抗體之技術(美國專利第4,694,778號；Bird, 1988, Science 242:423-42；Huston等人, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；及Ward等人, 1989, Nature 334:544-54)適合於製備單鏈抗體。藉由經由胺基酸橋連接Fv區之重鏈及輕鏈片段從而產生單鏈多肽來形成單鏈抗體。亦視情況使用用於組裝大腸桿菌中之功能性Fv片段的技術(Skerra等人, 1988, Science 242:1038-1041)。

如本文所用，「一致」、「序列一致性」或「一致性」百分比當用於兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中時，係指兩個或更多個序列為相同的或在指定區域具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基，例如至少60%一致性，較佳至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之一致性。比對及序列一致性可使用此項技術中已知之軟體程式，例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編1987)補編30, 第7.7.18部分, 表7.7.1中所描述之彼等軟體程式來確定。較佳地，比對時使用預設參數。較佳比對程式為BLAST，使用預設參數。特定而言，較佳程式為BLASTN及BLASTP，使用以下預設參數：遺傳密碼=標準；過濾=無；股=兩者；截止值= 60；預期值= 10；矩陣= BLOSUM62；描述= 50個序列；排序依據=高得分；資料庫=非冗余，基因庫+ EMBL + DDBJ + PDB +基因庫CDS轉譯+ SwissProtein + SPupdate + PIR。此等程式之細節可在以下網路位址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。術語「一致」、「序列一致性」或「一致性」百分比亦指或可應用於測試序列之互補序列。該等術語亦包括具有缺失及/或添加之序列，以及具有取代之彼等序列。如本文所描述，較佳算法可解釋間隙及類似物。較佳地，在長度為至少約25個胺基酸或核苷酸之區域，或更佳地在長度為至少50-100個胺基酸或核苷酸之區域存在一致性。「不相關」或「非同源」序列與本文所揭示之序列中之一者擁有小於40%之一致性或者小於25%之一致性。

術語「蛋白質」、「肽」及「多肽」可互換使用且在其廣義上係指具有兩個或更多個亞單位胺基酸、胺基酸類似物或擬肽物之化合物。亞單位可由肽鍵連接。在另一態樣中，亞單位可由其他鍵(例如酯、醚等)連接。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸且對可構成蛋白質或肽之序列的最大胺基酸數目沒有限制。多肽包括全長天然多肽及「經修飾」形式，諸如子序列、變異體序列、融合/嵌合序列及顯性負序列。如本文所用，術語「胺基酸」係指天然及/或非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸及D與L光學異構體兩者、胺基酸類似物及擬肽物。

肽包括L-異構體及D-異構體及其組合。肽可包括典型地與蛋白質之轉譯後加工相關的修飾，例如環化(例如二硫鍵或醯胺鍵)、磷酸化、糖基化、羧基化、泛素化、肉豆蔻基化或脂化。經修飾之肽可具有經另一殘基取代、添加至序列中或自序列中缺失之一或多個胺基酸殘基。特定實例包括一或多個胺基酸取代、添加或缺失(例如1-3、3-5、5-10、10-20或更多個)。

如本文所用，術語「修飾」及「經修飾」係指與作為沒有修飾之抗體、蛋白質或多肽之等效物的參考抗體、蛋白質或多肽相比，抗體、蛋白質或多肽之一或多個胺基酸殘基之突變、取代、添加或缺失。在一些實施例中，修飾包括保守取代。

「保守取代」為一個胺基酸由生物學、化學或結構類似之殘基置換。生物學類似意謂取代與未經取代之序列之活性或功能相容。結構類似意謂胺基酸具有類似長度之側鏈，諸如丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸，或具有類似尺寸。化學類似意謂殘基具有相同電荷或均為親水性或疏水性。特定實例包括一個疏水性殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一疏水性殘基，或一個極性殘基取代另一極性殘基，諸如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸或麩醯胺取代天冬醯胺、絲胺酸取代蘇胺酸及類似取代。

如本文所用，術語「核酸」係指DNA或RNA，其包括天然、合成或人工核苷酸類似物或鹼基。在一些實施例中，核苷酸類似物或人工核苷酸鹼基包含在核糖部分之2′羥基處具有修飾之核酸。在一些實施例中，修飾包括H、OR、R、鹵基、SH、SR、NH ₂、NHR、NR ₂或CN，其中R為烷基部分。示例性烷基部分包括但不限於鹵素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(一級、二級或三級)、醯胺、醚、酯、醇及氧。在一些實施例中，烷基部分進一步包含修飾。在一些實施例中，修飾包括偶氮基、酮基、醛基、羧基、硝基、亞硝基、腈基、雜環(例如咪唑、肼基或羥基胺基)基團、異氰酸酯或氰酸酯基或含硫基團(例如亞碸、碸、硫化物或二硫化物)。在一些實施例中，烷基部分進一步包含雜取代。在一些實施例中，雜環基團之碳經氮、氧或硫取代。在一些實施例中，雜環取代包括但不限於嗎啉基、咪唑及吡咯啶基。

在一些實施例中，核苷酸類似物包括經修飾之鹼基，諸如但不限於5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2丙基鳥嘌呤、2-胺基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷及在5位置具有修飾之其他核苷酸、5-(2-胺基)丙基尿苷、5-鹵基胞苷、5-鹵基尿苷、4-乙醯胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2,2-二甲基鳥苷、5-甲基胺基乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、去氮核苷酸(諸如7-去氮-腺苷、6-偶氮基尿苷、6-偶氮基胞苷或6-偶氮基胸苷)、5-甲基-2-硫尿苷、其他硫代鹼基(諸如2-硫尿苷、4-硫尿苷及2-巰胞苷)、二氫尿苷、假尿苷、辮苷、古嘌苷、萘基及經取代之萘基、任何O-烷基化及N-烷基化嘌呤及嘧啶(諸如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮或吡啶-2-酮)、苯基及經修飾之苯基(諸如胺基酚或2,4,6-三甲氧基苯)、充當G形夾核苷酸之經修飾之胞嘧啶、8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-取代之尿嘧啶及胸腺嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基胺基烷基核苷酸及烷基羰基烷基化核苷酸。經修飾之核苷酸亦包括就糖部分而言經修飾之核苷酸以及具有不為核糖基之糖或其類似物之核苷酸。舉例而言，在一些實施例中，糖部分為或係基於甘露糖、***糖、葡萄呱喃糖、半乳呱喃糖、4′-硫代核糖及其他糖、雜環或碳環。術語核苷酸亦包括此項技術中已知為通用鹼基之內容。舉例而言，通用鹼基包括但不限於3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素。

本發明之核酸分子可基於關於各個核酸之核苷酸序列的資訊藉由公衆已知之技術(諸如化學合成方法或PCR擴增方法)來製備。經選擇用於編碼胺基酸之密碼子可經工程改造以優化相關宿主細胞中之核酸表現。

如本文所用，術語「實質上」當描述T細胞群體時係指包含小於約30%、25%、20%、15%、10%、5%或更少之污染細胞的群體。在一些實施例中，在T細胞群體中污染細胞不到約20%。在一些實施例中，在T細胞群體中污染細胞不到約15%。在一些實施例中，在T細胞群體中污染細胞不到約10%。

如本文所用，術語「治療(treating/treatment)」及類似術語意指獲得所需藥理學及/或生理效應。就改善疾病之癥狀或部分或完全治癒疾病及/或可歸因於疾病之有害作用而言，作用可為治療性的。在一個態樣中，術語「治療」排除預防。

如本文所用，「治療」進一步包括全身性改善與病變相關之癥狀及/或延遲癥狀發作。「治療」之臨床及亞臨床證據將隨病變、個體及治療改變。在一個態樣中，治療排除預防。

術語「改善」意謂個體之疾患的可偵測改良。可偵測改良包括由疾病引起或與疾病相關之癥狀(諸如由疾病引起或與疾病相關之一或多種有害癥狀、病癥、病痛、病變、疾病或併發癥)的發生、頻率、嚴重程度、進展或持續的主觀或客觀降低、減小、抑制、阻抑、限制或控制，或疾病之潛在原因或結果的改良，或疾病之逆轉。

因此，治療可使得降低、減輕、抑制、阻抑、限制、控制或預防疾病或相關癥狀或結果或潛在原因；降低、降輕、抑制、阻抑、限制、控制或預防疾病、疾患、癥狀或結果或潛在原因之進展或惡化；或疾病狀況或癥狀之一或多種其他癥狀之進一步惡化或發生。因此，成功治療結果產生降低、減輕、抑制、阻抑、限制、控制或預防個體中之疾患、疾病或癥狀(諸如由疾病或疾患引起或與疾病或疾患相關之一或多種有害癥狀、病癥、病痛、病變、疾病或併發癥)之一或多種癥狀或潛在原因或結果的發生、頻率、嚴重程度、進展或持續之「治療作用」或「益處」。因此，將影響疾患、疾病或癥狀之一或多種潛在原因之治療方法視為有益的。穩定病癥或疾患亦為成功治療結果。

因此，治療益處或改良不需要完全消除與疾患或疾病相關之任一種、大多數或所有癥狀、併發癥、結果或潛在原因。因此，當在短或長的持續時間(數小時、數天、數週、數個月等)內，存在增加之個體疾患之改良，或發生、頻率、嚴重程度、進展或持續時間之部分降低、減輕、抑制、阻抑、限制、控制或預防，或一或多種相關有害癥狀或併發癥或結果或潛在原因、病癥或疾病之生理、生物化學或細胞表現或特徵中之一或多者(諸如由疾病或疾患引起或與疾病或疾患相關之一或多種有害癥狀、病癥、病痛、病變、疾病或併發癥)的惡化或進展之抑制或逆轉(例如穩定疾患、病癥或疾病之一或多種癥狀或併發癥)時，實現令人滿意之終點。

術語「可接受」、「有效」或「充足」當用於描述本文所揭示之任何組分、範圍、劑型等之選擇時意味著該組分、範圍、劑型等適合於所揭示之目的。

術語「個體(subject)」、「宿主」、「個體(individual)」及「患者」在本文中可互換地用於指動物，典型地為哺乳動物。任何合適之哺乳動物均可藉由本文所描述之方法、細胞或組合物來治療。哺乳動物之非限制性實例包括人類、非人類靈長類動物(例如猿、長臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、獼猴及類似動物)、家養動物(例如狗及貓)、農場動物(例如馬、牛、山羊、綿羊、豬)及實驗動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在一些實施例中，哺乳動物為人類。哺乳動物可為任何年齡或處於任何發育階段(例如成人、青少年、兒童、嬰兒或子宮內之哺乳動物)。哺乳動物可為雄性或雌性。哺乳動物可為懷孕之雌性。在一些實施例中，個體為人類。實例

此等實例僅出於說明目的而提供且不限制本文所提供之申請專利範圍之範疇。實例 1 CAR-T 細胞之製備

在MSGV γ-逆轉錄病毒載體之轉導中，將質粒使用使Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)與pAmpho載體一起轉染至GP2-293包裝細胞株中，以產生病毒上清液。轉染之後48小時收集上清液，且藉由在Retronectin (Takarabio, Shiga, Japan)塗佈之板上離心來製備病毒結合板。將外周血單核細胞(PBMC)藉由經固化之抗人類CD3 Ab (OKT3，5 μg/mL)活化，且在含有重組人類IL-2 (400 IU/mL)之培養基中培養3天。將PBMC添加至病毒結合板上且培養24小時以進行第1次感染。接著，將培養PBMC轉移至另一病毒結合板以進行第2次感染，且在4小時孵育之後，將感染之細胞用含有400 IU/mL重組人類IL-2之新鮮培養基擴增3天。在SFGγ-逆轉錄病毒載體之轉導中，將質粒使用FuGENE® HD轉染試劑(Promega Corp., WI, USA)與 gag/pol基因(Cell Biolabs Inc., CA, US)及VSV-G載體(Takarabio, Shiga, Japan)一起轉染至PhoenixAmpho包裝細胞株中。使用EasySep ^TM人類T細胞分離套組(Stem Cell Technologies, BC, Canada)自PBMC分離T細胞，且與T細胞TransAct (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)及10 ng/mL重組人類IL-2 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)一起培養2天。將T細胞保持在含有10 ng/mL重組人類IL-2之培養基中培養，且在距離分離3天之後，將T細胞用病毒上清液在塗有20 ug/mL Retronectin之板上轉導5小時。將經轉導之T細胞使用G-Rex (WilsonWolf, MN, USA)擴增4天。轉導效率藉由流式細胞術來確定。使用X-VIVO™ 15培養基(Lonza, Basel, Switzerland)或CTS ^TMOpTmizer ^TMT細胞擴增SFM (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)作為培養基。 CAR-T 細胞之活體外腫瘤細胞毒性活性之評估

針對表現人類MSLN之細胞對CAR-T細胞之活體外目標腫瘤細胞殺傷活性進行評估。平行地評估未轉導(UTD) T細胞作為對照物品。此研究中所用之目標細胞為內源性表現人類MSLN之Capan-2細胞及MSTO-211H-Luc細胞。接種目標細胞，隨後添加CAR-T細胞或UTD T細胞，其經稀釋以獲得效應細胞(CAR陽性):目標細胞(E:T)比率之6點系列：3:1、1:1、0.3:1、0.1:1、0.03:1及0.01:1。在共培養48小時之後，在洗去T細胞之後使用CellTiter-Glo ^®發光細胞活力分析(Promega Corp., WI, USA)量測目標細胞株之活力。藉由將T細胞共培養條件下目標細胞之細胞活力與非T細胞共培養條件下進行比較來計算相對殺傷活性。

CAR-T細胞及UTD T細胞針對Capan-2及MSTO-211H-Luc細胞之活體外目標細胞殺傷活性呈現於圖2中。所有所測試之CAR-T細胞均針對Capan-2及MSTO-211H-Luc細胞展現劑量依賴性目標細胞殺傷活性增加。相比之下，UTD T細胞即使在最高E:T比率下亦顯示有限之殺死Capan-2及MSTO-211H-Luc細胞之能力。與第3 8-28BBz_7x19 CAR-T細胞(CAR#301)相比，第2 8-28z_7x19 CAR-T (CAR#305)、第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#309)及第2 28-28z_7x19 CAR-T (CAR#311)細胞展現類似至更高之目標細胞殺傷活性。

下文描述對實驗中所用之抗MSLN CAR-IL-7-CCL19構築體之描述： CAR#301 ( 含 F2A 之第 3 8-28BBz_7x19 ， pMSGV)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類CD8、CD28、4-1BB及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#305 ( 含 F2A 之第 2 8-28z_7x19 ， pMSGV)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類CD28及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#309 ( 含 F2A 之第 2 8-BBz_7x19 ， pMSGV)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類4-1BB及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#311 ( 含 F2A 之第 2 28-28z_7x19 ， pMSGV)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD28之鉸鏈及跨膜區，人類CD28及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#334 ( 含 F2A 之第 3 8-28BBz_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類CD8、CD28、4-1BB及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#314 ( 含 F2A 之第 2 8-28z_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類CD28及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#318 ( 含 F2A 之第 2 8-BBz_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類4-1BB及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#323 ( 含 F2A 之第 2 28-28z_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD28之鉸鏈及跨膜區，人類CD28及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#345 ( 含 P2A 之第 2 28-28z_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD28之鉸鏈及跨膜區，人類CD28及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#347 ( 含 P2A 之第 2 8-28z_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類CD28及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#348 ( 含 P2A 之第 3 8-28BBz_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類CD8、CD28、4-1BB及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#349 ( 含 P2A 之第 2 8-BBz_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類4-1BB及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#357 ( 含 F2A 之第 2 8-BBz_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類4-1BB及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#358 ( 含 T2A 之第 2 8-BBz_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類4-1BB及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#364 ( 含非一致核苷酸 P2A 序列之第 2 28-28z_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD28之鉸鏈及跨膜區，人類CD28及CD3z之細胞內信號結構域 CAR#365 ( 含非一致核苷酸 P2A 序列之第 2 8-BBz_7x19 ， pSFG)編碼抗MSLN scFv之抗MSLN CAR DNA片段，人類CD8之鉸鏈及跨膜區，人類4-1BB及CD3z之細胞內信號結構域

在上文所描述之實驗中所用之構築體中，將GSG (肽連接子)添加至各P2A、F2A、T2A序列之N端。 CAR-T 細胞之活體內抗腫瘤活性之評估

為雌性NSG小鼠皮下接種MSLN陽性Capan-2腫瘤細胞之2百萬(M)個細胞。在接種之後第7天，以若干劑量靜脈內單次投與CAR-T細胞(第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#334) 0.8 M、2 M及5 M，第2 8-28z_7x19 (CAR#314)及第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#318) 3.2 M，第2 28-28z_7x19 CAR-T細胞(CAR#323) 5M作為CAR陽性細胞數目)。作為對照組，投與媒劑對照磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或對照UTD T細胞。每週兩次量測各小鼠之腫瘤體積(TV)。

各處理組(每組5個小鼠)中小鼠之腫瘤體積(TV)呈現於圖3中。在5 M 第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#334)組及3.2 M 第2 8-28z_7x19 CAR-T組(CAR#314)中，在投與之後頭3週內TV傾向於緩慢增加，且觀測到TV適度降低之傾向。另一方面，在5 M第2 28-28z_7x19 CAR-T組(CAR#323)及3.2 M 第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#318)組中，在CAR-T治療之後2週內觀測到腫瘤收縮，且各組中之5個小鼠中有3個展現腫瘤組織消退，表明為完全反應(CR)。此等結果表明，與第3 8-28BBz_7x19 CAR-T構築體相比，具有IL-7及CCL19裝甲之第2代CAR-T具有更高之抗腫瘤功效。 使用異種移植腫瘤組織之組織病理學評估來評估 CAR-T 細胞之抗腫瘤活性

為雌性NSG小鼠皮下接種間皮素陽性Capan-2腫瘤細胞之2百萬(M)個細胞。在接種之後第7天，靜脈內單次投與CAR-T細胞之5 M個CAR陽性細胞。所測試之構築體為第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#349)及第2 28-28z_7x19 CAR-T細胞(CAR#345)。作為對照組，投與媒劑對照磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或等效總T細胞數目之對照UTD T細胞。每週兩次量測各小鼠之腫瘤體積(TV)。在各組之終點(第2 28-28z_7x19 CAR-T (CAR#345)組之第18天及UTD或第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#349)組之第32天)時，收集腫瘤異種移植物且進行組織載玻片之顯微鏡檢驗。參見圖4A。

各組之平均腫瘤體積(TV)繪於圖4B中。第2 28-28z_7x19 CAR-T (CAR#345)處理組展現自CAR-T投與之後8天起平均TV之急速增加，且在第18天因評估為仁慈終點之GvHD樣癥狀將所有小鼠處死。另一方面，在第2 8-BBz_7x19 CAR-T ( CAR#349)處理組中自第15天至第22天觀測到平均TV增加，且此等腫大之腫瘤異種移植物到第32天時快速減小。在第32天，5個小鼠中有3個展現腫瘤消退，表明第2 8-BBz_7x19 CAR-T細胞(CAR#349)之完全反應。用UTD T細胞處理之腫瘤異種移植物保留腫瘤細胞之腺體模式且觀測到人類CD3陽性T細胞之輕度浸潤。在第2 28-28z_7x19 CAR-T (CAR#345)處理組之腫瘤異種移植物中觀測到人類CD3陽性T細胞之明顯浸潤。自第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#349)處理之小鼠收集之腫瘤異種移植物顯示在終點時腫瘤已收縮，然而，在剩餘異種移植物中確認人類CD3陽性T細胞之中度浸潤。在CAR-T處理之小鼠的此等異種移植組織中，腫瘤細胞之腺體生長模式丟失且組織充滿浸潤之人類T細胞，此完全不同於UTD T細胞處理之小鼠。此等結果表明，在CAR-T處理之小鼠中觀測到之腫瘤質量增加為所投與之人類T細胞在異種移植腫瘤微環境中累積之結果，此可被視為腫瘤之假性進展，表明由IL-7依賴性T細胞增殖及CCL19依賴性T細胞累積引起之功效的MOA驅動跡象。 使用腫瘤細胞之生物發光成像 (BLI) 評估 CAR-T 細胞之抗腫瘤活性

平均腫瘤體積為評估腫瘤負荷之常用手段，然而如藉助於CAR-T或其他類似測試物品將預測到的，當測試物品刺激腫瘤組織中之免疫細胞累積時，藉由腫瘤體積(TV)量測之效應可為複雜的。使用表現螢光素酶之腫瘤細胞株對腫瘤體積進行活體內評估可為此等模型中對抗腫瘤功效之更特定量測，因為儘管未觀測到歸因於炎癥之腫瘤體積改變或增加，但可特定地量測腫瘤細胞減少。為雌性NSG小鼠腹膜內接種MSLN陽性SKOV3-luc腫瘤細胞之5百萬(M)個細胞。在接種之後第4天，以若干劑量靜脈內單次投與CAR-T細胞(第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)及第2 28-28z_7x19 CAR-T細胞(CAR#364) 0.1 M、0.3 M及1 M作為CAR陽性細胞數目)。作為對照組，針對0.3 M及1 M UTD組投與媒劑對照磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或等效總T細胞數目之對照UTD T細胞。對小鼠進行28天監測。每週量測一次總通量(TF)，該總通量為SKOV3-luc細胞之發光之度量，與存在於動物中之SKOV3-luc腫瘤細胞之數目成比例且可用於評估抗腫瘤功效。參見圖5A。

此研究之持續時間為28天，然而，使用0.1 M、0.3 M及1 M劑量之所有第2 28-28z_7x19 CAR-T (CAR#364)處理組在CAR-T注射後第14天均因仁慈終點被處死。劑量為1M個CAR-T細胞之兩個CAR-T處理組(CAR#364及CAR#365)在第14天均展現平均總通量降低，此最初在CAR-T注射後第7天進行第一次量測時被觀測到。在0.3 M及1 M劑量下在第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)處理組中，平均TF降低在研究階段之持續時間內持續存在。在第2 8-BBz_7x19 (CAR#365) CAR-T之0.1 M劑量組中，在整個研究持續時間內腫瘤細胞保持存在。媒劑對照組及UTD T細胞之兩個劑量組之TF自第7天至終點持續增加。此等結果指示如藉由平均TF (發光之度量)之顯著降低所量測第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)與第2 28-28z_7x19 CAR-T (CAR#364)細胞兩者在帶有SKOV3-luc異種移植物之NSG小鼠中之劑量依賴性抗腫瘤活性的證據。參見圖5B。

為評估CAR-T細胞之非抗原依賴性活體內細胞擴增能力，在CAR-T投與之後研究在存在或不存在表現抗原之腫瘤的情況下小鼠之體重(BW)變化。在將人類T細胞注射至小鼠中之後典型地觀測到作為移植物抗宿主疾病(GvHD)癥狀的BW降低。

為雌性NSG小鼠皮下接種MSLN陽性Capan-2腫瘤細胞之2百萬(M)個細胞。在接種之後第7天，靜脈內單次投與CAR-T細胞之3 M個CAR陽性細胞。所測試之CAR-T構築體為第2 8-28z_7x19 (CAR#347)、第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#349)及第2 28-28z_7x19 CAR-T細胞(CAR#345)。作為對照組，投與等效總細胞數目之UTD T細胞(4.4 M個細胞)。在同一天將此等T細胞投與至不帶有腫瘤之小鼠中。每週量測兩次各小鼠之體重(BW)。

將具有5個動物之各小鼠組之平均BW變化(%)繪於圖6A及圖6B中。

在Capan-2腫瘤異種移植模型中，在投與第2 8-28z_7x19 CAR-T細胞(CAR#347)之後11天觀測到急速BW降低。在第2 28-28z_7x19 CAR-T細胞(CAR#345)投與之後14天亦觀測到BW降低，而在UTD T細胞中與第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#349)處理組中均未觀測到顯著BW降低。在不帶腫瘤條件下，僅在第2 8-28z_7x19 CAR-T (CAR#347)處理組情況下在第11天觀測到平均BW之顯著降低，而在其他CAR-T處理組及UTD組情況下未觀測到平均BW之顯著降低，表明第2 8-28z_7x19 CAR-T (CAR#347)在沒有抗原刺激情況下之高活體內擴增能力，此可被視為脫靶毒性風險。 CAR-T 細胞之活體內安全性評估

在不帶腫瘤之雌性NSG小鼠中進行總計7.5 x 106個細胞(等效於3M個CAR+細胞)之單次劑量投與之後，評估構築體CAR#365 (第2 8-BBz_7x19 )、CAR#364 (第2 28-28z_7x19)及未轉導(UTD)細胞之安全性。在此研究中，在CAR-T投與後17天對動物人道地施以安樂死且評估血清化學、器官重量及宏觀及微觀病理學之變化。

在三組之間血清化學或器官重量沒有顯著變化，且所有動物存活至最終屍檢。在投與CAR#364之動物中存在宏觀發現且由肺變色及脾臟增大組成，此兩者均與器官重量增加極少相關聯且微觀上與此等組織中CAR-T細胞之存在(亦即混合細胞炎癥(肺)及增加之白髓細胞性(脾臟))相關聯。

在肺及脾臟中UTD細胞具有極低程度之推定CAR-T浸潤/炎癥。此發現被認為可能與移植物抗宿主疾病(GvHD)有關，因為該模式在肺中為典型的。投與CAR#365之動物類似於投與UTD細胞之動物，其中肺單核浸潤或混合細胞炎癥之發生率較低，且在脾臟中且另外在骨髓中推定CAR-T細胞移植之發生率較高。在一個動物中存在其他發現，該等發現各自在肝臟中(可能符合GvHD之極低程度之推定CAR-T浸潤)。

投與CAR#364之動物如投與UTD細胞之動物一般具有較高嚴重程度之發現，其他發現均在肝臟中。此等發現暗示補充之信號傳導引起加重之GvHD效應及/或與細胞因子裝甲相關之其他CAR-T活化機制。

總的說來，構築體CAR#365在不帶腫瘤之雌性NSG小鼠中良好耐受，並且具有類似於UTD細胞之極低程度之發現，此指示該等發現可能與GvHD有關。與在正常組織中具有細胞增殖不受控制之跡象的構築體CAR#364相比，構築體CAR#365亦展示優良安全性型態。參見圖7A-7C。 Capan-2 異種移植 NSG 小鼠中所投與之 T 細胞的流式細胞術分析

為雌性NOG MHC I/II類 KO小鼠皮下接種間皮素陽性Capan-2腫瘤細胞之2百萬(M)個細胞。在腫瘤接種後第7天，靜脈內單次投與CAR-T細胞之5 M個CAR陽性細胞。所測試之CAR-T構築體為第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#364)及第2 28-28z_7x19 CAR-T細胞(CAR#365)。作為對照組，投與等效總細胞數目之UTD T細胞(12.5 M個細胞)。在第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)劑量組中，在CAR-T注射後第13天、第27天及第41天收集血液、脾臟及異種移植腫瘤組織。同樣在第2 28-28z_7x19 CAR-T (CAR#364)細胞劑量組中在CAR-T注射後第13天收集血液及組織，因為此組中之所有動物在CAR-T注射後第13天因仁慈終點被處死。對於腫瘤樣品，使用腫瘤及組織解離試劑套組(Tumor & Tissue Dissociation Reagent kit) (TTDR, BD Biosciences)收集細胞。將脾臟樣品解離且過濾以獲得細胞懸浮液。在室溫下在黑暗中，將細胞與his-標記之間皮素在FACS緩衝液(500 mL DPBS-/5 ml NaN3/10 mL FBS)中一起孵育30 min。洗滌細胞且離心，隨後在室溫下在黑暗中與zombie NIR一起在PBS中孵育15 min。將細胞與抗體混合物(CD3/FITC、CD8/BV510、CTLA4/PE-Cy7、LAG-3/Alexa Fluor 647、PD-1/BV421、TIM-3/PerCP-Cy5.5、抗his Ab/PE)一起孵育。將經洗滌之細胞與BD FACS溶解緩衝液(BD Biosciences)在蒸餾水(DW)中一起孵育。在洗滌步驟之後，將細胞再懸浮於FACS緩衝液(500 mL DPBS-/5 ml NaN3/10 mL FBS)中且用BD FACSLyricTM流式細胞儀分析。使用FlowJo軟體(BD Biosciences)進行數據分析。

血液、腫瘤及脾臟中之CD3+細胞上之耗竭標記物(CTLA4、PD-1、LAG-3及TIM3)表現顯示於圖8A-8C中。在外周部分(血液及脾臟)中，與CAR#364相比，CAR#365顯示更低之耗竭標記物表現。在腫瘤中，在#364與#365中LAG-3及TIM-3表現均為低的。對於CTLA-4及PD-1，與CAR#364相比，CAR#365顯示更慢之表現。 CAR-T 活化後可溶性人類間皮素之評估

為評估可溶性形式之MSLN對CAR-T功能之阻斷活性，將第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#349)及第2 28-28z_7x19 CAR-T細胞(CAR#345)分別與若干劑量(0.01、0.03、0.1、0.3及1 ug/mL)之可溶性MSLN (sMSLN)一起預孵育24小時，且將經洗滌之CAR-T細胞與MSLN陽性Capan-2腫瘤細胞一起孵育。在將腫瘤與CAR-T細胞共培養之後48小時，收集共培養上清液且藉由ELISA量測人類IFNγ分泌水準。

如圖9中所示，自使用媒劑PBS預孵育之Capan-2細胞及第2 28-28z_7x19 CAR-T (CAR#345)細胞之共培養上清液分泌約10,000 pg/mL之人類IFNγ。在相同條件下，第2 8-BBz_7x19 CAR-T細胞(CAR#349)之IFNγ分泌為約7,000 pg/mL。抗原刺激之第2 28-28z_7x19 CAR-T細胞(CAR#345)之IFNγ分泌因與sMSLN一起預孵育而劑量依賴性降低，儘管sMSLN不誘導對抗原刺激之第2 8-BBz_7x19 CAR-T細胞(CAR#349)之IFNγ分泌的劑量依賴性抑制。 CAR-T 細胞之 IL-7 及 CCL19 分泌水準之比較

使用自所培養之第2 8-BBz_7x19 CAR-T (具有P2A，CAR#349)細胞、第2 8-BBz_7x19 CAR-T (具有F2A，CAR#357)細胞及第2 8-BBz_7x19 CAR-T (具有T2A，CAR#358)細胞收集之培養物上清液藉由ELISA評估IL-7及CCL19之分泌水準。自各CAR-T細胞分泌之IL-7-CCL19融合蛋白的定量使用MSD系統進行。

將MSD GOLD 96孔鏈黴親和素SECTOR板(MSD目錄號：L15SA-5)與250微升/孔之含有3% BSA之1倍PBST一起孵育＞30分鐘。將板用1x PBST洗滌3次且吸乾以移除過量緩衝液(下文稱為洗滌步驟)。將來自U-PLEX人類MIP-3β抗體組(MSD，目錄號：B21VA-3)之生物素抗人類MIP-3β抗體用作捕獲試劑。添加25微升/孔之1倍捕獲抗體且在室溫下孵育1小時。在洗滌步驟之後，將樣品用相等體積之分析緩衝液(含有3% BSA之1倍PBST)稀釋。將50微升/孔之2倍稀釋樣品添加至板上且在室溫下在振盪器上在溫和振盪下孵育1.5小時。隨後進行洗滌步驟，藉由將來自U-PLEX人類IL-7抗體組(MSD目錄號：B21UP-3 )之偵測抗體用分析緩衝液(含有3% BSA之1倍PBST)稀釋100倍來製備1倍偵測抗體溶液。添加50微升/孔之1倍偵測抗體溶液且在室溫下在振盪器上在溫和振盪下孵育1.5小時。在洗滌步驟之後，添加150/uL之2倍MSD讀取緩衝液且將板即刻在MSD讀板儀上讀取。

來自各CAR-T細胞之培養物上清液之IL-7、CCL19及IL-7/CCL19融合蛋白分泌水準示於表2中。第2 8-BBz_7x19 CAR-T (具有P2A，CAR#349)細胞展現來自相同量之培養物上清液之最高IL-7及CCL19表現水準。第2 8-BBz_7x19 CAR-T (具有P2A，#349)顯示最高裂解IL-7及CCL19濃度。對於IL-7/CCL19融合蛋白，P2A構築體之裂解/未裂解融合蛋白之比率類似於第2 8-BBz_7x19 CAR-T (具有T2A，#358)且低於第2 8-BBz_7x19 CAR-T (具有F2A，#357)。表2. IL-7、CCL19及IL-7/CCL19融合蛋白之濃度及CAR-T細胞之培養物上清液中之彼等比率.

ID	2A	IL-7 濃度 (pg/mL)	CCL19 濃度 (pg/mL)	IL7-CCL19 融合物濃度 (pg/mL)	融合物/IL-7 比率	融合物/CCL19 比率
#349	P2A	7255	7690	152	2.1%	2.0%
#357	F2A	2516	5091	386	15.3%	7.6%
#358	T2A	4203	5304	72	1.7%	1.4%

使用腫瘤細胞之生物發光成像評估第 2 代及第 3 代 CAR-T 細胞之活體內抗腫瘤活性

為公平比較第3代7x19 CAR-T與第2代7x19 CAR-T之功效，使用如圖10A中所示包括P2A肽序列之相同逆轉錄病毒載體組分產生第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)及第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)細胞。為雌性NSG小鼠皮下接種間皮素陽性HepG2-RedFluc細胞之5百萬(M)個細胞。在接種之後第7天，以若干劑量靜脈內單次投與第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)及第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)細胞(0.3M、1M及3M作為CAR陽性細胞數目)。作為對照組，在UTD 3M組中投與媒劑對照磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或總T細胞數目等效於3M個CAR陽性細胞之對照未轉導(UTD) T細胞。每週量測一次總通量(TF)以評估CAR-T細胞之抗腫瘤功效，該總通量為與存在於動物中之腫瘤細胞數目成比例之HepG2-RedFluc細胞之發光的度量。

第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)與第3 8-28-BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)均展現平均總通量以劑量依賴性方式降低。在3M CAR-T組中，兩個組顯示類似之功效，但在第3 8-28-BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)組中5個小鼠中有3個到研究結束時因仁慈終點被處死。在兩個1M CAR-T組情況下到終點時亦觀測到TF顯著降低，而第3 8-28-BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)之5個小鼠中有1個在第14天之後發生腫瘤再生長。在0.3 M CAR-T組中，在兩個CAR-T組情況下在終點時觀測到類似水準之TF降低，然而，在所有所測試之小鼠中第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)顯示更佳之腫瘤控制，而來自第3 8-28-BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)組之5個所測試之小鼠中有1個在整個研究階段中均未展示腫瘤消退。此等結果表明，與第3 8-28BBz_7x19 CART (CAR#348)相比，第2 8-BBz_7x19 CART (CAR#365)具有更高且持久之抗腫瘤活性。參見圖10A-B、圖11及圖12A-H。實例 2 在患有表現間皮素之晚期或轉移性實體瘤之成人患者中對表現本文所描述之 CAR 、 IL-7 及 CCL19 之經修飾免疫細胞之開放標籤、劑量遞增、 1 期、首次在人類中進行之研究 研究設計 ：

此為用於對在患有沒有具有確定臨床益處之標準治療替代方案的表現間皮素之晚期或轉移性實體瘤之患者中靜脈內(IV)投與之表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞的安全性及耐受性進行評估之開放標籤、非隨機化、1期、首次在人類中進行之研究。卵巢癌、間皮瘤、胃癌及非小肺細胞癌癥(NSCLC)為表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞的高優先級目標群體。將基於研究者與資助方之間的討論招募患有其他癌癥類型之患者。在5個建議給藥隊列中之1個隊列中，將用表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞處理多至21個DLT可評估之患者。劑量遞增將藉由基於在各劑量水準所觀測之DLT率的貝葉斯最佳間隔(Bayesian Optimal Interval，BOIN)設計來指導。劑量遞增/減低判定將除DLT、功效及細胞動力學(CK)外將安全性考慮在內在根據BOIN之所建議劑量內來確定，且由資助方與研究者在會議(包括隊列結束會議)時共同進行判定。在可行時，亦可使用其他產生之轉化數據(例如可溶性間皮素、癌癥抗原125 [CA125])來幫助進行以給定劑量水準為其他患者給藥之決策。建議之2期劑量(RP2D)將基於各劑量水準下之安全性、功效、CK及生物標記物評估的集合觀測來確定。在任何劑量隊列中，第一及第二患者之表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞的輸注將相隔14 (或更多)天。可並行地為第二及後續患者給藥。劑量隊列將相隔最少28天(自前一隊列中之最後一次輸注至後續隊列中之第一次輸注)。毒性將根據國家癌癥協會有害事件通用術語準則(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events，NCI CTCAE) 5.0版進行評估。細胞因子釋放癥候群(CRS)及免疫效應細胞相關神經毒性癥候群(ICANS)將根據美國移植及細胞療法學會(American Society for Transplantation and Cellular Therapy，ASTCT)共識來評估。為監測、分級及管理與免疫效應細胞療法相關之毒性，將使用CARTOX (CAR-T細胞療法相關毒性)建議。

此研究由預篩選、篩選、預處理、處理及第一跟蹤及第二跟蹤階段組成。預篩選階段可在患者簽署關於腫瘤細胞中之間皮素表現評估的機構審查委員會/獨立倫理委員會(institutional review board/independent ethics committee，IRB/IEC)批准之知情同意書(ICF)的日期開始。篩選階段從進行篩選階段中之程序中之一者時的日期開始。在預篩選ICF之日期或主要ICF之日期(以先到者為凖)為患者提供研究特異性患者編號。篩選階段包括確認合格且招募至研究中，且以開始白細胞清除術程序結束。預處理階段定義為自開始白細胞清除術程序，完成調理化學療法，直至開始輸注為止之時間段。在預處理階段期間，將進行白細胞清除術、橋接療法及調理化學療法。治療及第一跟蹤階段從投與表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞開始且持續至第13個月。第二跟蹤階段從治療及第一跟蹤期結束時開始且持續至第37個月。在預處理、處理及第一跟蹤及第二跟蹤階段中，患者可因死亡、同意退出或其他預定情況完成研究參與。

將根據訪視時程跟蹤患者，以確保收集對於適當評估研究之主要及次要目標來說足夠之數據。患者可自願退出處理及第一跟蹤階段或根據研究者之判斷在任何時間從其中退出。患者預期可因包括以下之原因離開第一跟蹤且來到第二跟蹤： - 疾病進展 - 患者自願退出第一跟蹤

在第13個月之前停止處理及第一跟蹤階段之患者將在第二跟蹤階段中繼續跟蹤以收集衛生局要求之資料(例如方案定義之AE)，直至輸注表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞之後3年。

第二跟蹤階段中之第一次訪視根據處理及第一跟蹤階段中患者停止時之時間來確定。舉例而言，若患者在第7個月停止處理及第一跟蹤階段，則第二跟蹤階段中之第一次訪視將為第10個月。 主要目標：- 評估表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞的安全性及耐受性。 - 確定表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞的RP2D。 次要目標：- 為評估表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞的抗腫瘤活性。 - 為表徵表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞的CK。 - 確定具有具複製能力之逆轉錄病毒(RCR)陽性測試結果之實施例的數目及百分比。 個體群體：

患有表現間皮素之晚期或轉移性實體腫瘤的患者。研究將包括多至21個DLT可評估之患者。 劑量水準：

將測試具有上升劑量水準之以下隊列：隊列(-1)：每一者體內0.3×10 ⁷個嵌合抗原受體(CAR) (+)細胞。(在隊列1不可耐受情況下) 隊列1：每一者體內1×10 ⁷個CAR (+)細胞[起始劑量]。隊列2：每一者體內1×10 ⁸個CAR (+)細胞。隊列3：每一者體內5×10 ⁸個CAR (+)細胞。隊列4：每一者體內1×10 ⁹個CAR (+)細胞。 投藥途徑：靜脈內 處理持續時間：

單次靜脈內輸注。調理化學療法先於處理。(可對未施以調理化學療法之隊列進行測試。) 主要納入準則：1. 在簽署知情同意書時年齡≥20歲之男性或女性患者。 2. 以組織學或細胞學方式證實患有沒有具有經證實之臨床益處的標準療法之選擇或不能忍受具有經證實之臨床益處的標準療法之晚期或轉移性實體瘤。 3. 必須由資助方證實在當地使用經驗證之分析、得分及染色藉由免疫組織化學確定腫瘤上之間皮素表現(活腫瘤細胞上≥50%陽性，強度為2+及/或3+)。必須使用新鮮活組織切片樣品進行合格性評估，除非在白細胞清除術程序可獲得之前6個月內獲得存檔活組織切片樣品。 4. 預期壽命≥12週。 5. 東部腫瘤協作組(Eastern Cooperative Oncology Group)體力狀態為0或1。 6. 藉由如以下指定之臨床實驗室值證實的充足器官功能： a) 總膽紅素≤1.5 ×正常範圍上限(ULN)，除了在患有吉爾伯特氏癥候群(Gilbert's syndrome)之患者中。在直接膽紅素≤3 ×直接膽紅素ULN之情況下，可招募患有吉爾伯特氏癥候群之患者。允許歸因於輸血後溶血之間接膽紅素升高。 b) 丙胺酸轉胺酶(ALT)或天冬胺酸轉胺酶(AST)必須＜3 × ULN。若AST及ALT升高可適當地歸因於肝臟中存在轉移性疾病，則AST及ALT可升高至5 × ULN。 c) 經計算之肌酐清除率＞50 mL/min (科克羅夫特-高爾特公式(Cockcroft-Gault formula))。 d) 血紅蛋白必須≥9 g/dL。 e) 嗜中性白血球計數必須＞1000/mm ³。 f) 絕對淋巴細胞計數必須＞500/mm ³。 g) 血小板計數必須＞75,000/mm ³。 7. 患者必須患有如實體瘤反應評估準則(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) 1.1版(RECIST 1.1)所定義之放射照相術可量測之疾病。 8. 女性患者，該等女性患者： a) 在篩選訪視之前經絕後(自然閉經)持續至少1年，或 b) 為手術絕育的，或 c) 若其具有分娩潛能，同意自簽署知情同意書時起至輸注表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞後至少12個月實施1種高度有效之非激素避孕方法且同時實施1種其他有效(障壁)方法，或 d) 當符合個體更喜歡且平常之生活方式時，同意實施真正的禁欲。注意：週期性禁欲(例如日曆法、***法、癥狀體溫法、***後法)、戒斷、僅殺精劑及哺乳期閉經為不可接受之避孕方法。 9. 男性患者(即使手術絕育，亦即輸精管切除術後)，該等男性患者： a) 同意自簽署知情同意書時起至輸注表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞後至少12個月實施有效障壁避孕，或 b) 當符合個體更喜歡且平常之生活方式時，同意實施真正的禁欲。注意：週期性禁欲(例如日曆法、***法、癥狀體溫法、***後法)、戒斷、僅殺精劑及哺乳期閉經為不可接受之避孕方法。 10. 在進行不為標準醫療照護之一部分的任何研究相關程序之前必須給出自願書面同意書，並且瞭解患者可在不損害將來醫療照護之情況下在任何時間不再同意研究。 11. 願意且能夠遵從預定訪視及研究程序。 主要排除準則：1. 活動性全身感染。 2. 已知B型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性，或已知或疑似活動性C型肝炎病毒(HCV)感染。可招募具有陽性B型肝炎核心抗體(HBcAb)或B型肝炎表面抗體(HBsAb)之患者，但必須具有不可偵測之B型肝炎病毒(HBV)病毒負荷。具有陽性C型肝炎病毒抗體(HCVAb)之患者必須具有不可偵測之HCV病毒負荷。 3. 凝血障礙或其他重大醫學疾病，包括呼吸道或免疫系統及阻塞性/限制性肺病。 4. 患有定義為不穩定心絞痛、臨床顯著心律失常、心肌梗塞、充血性心臟衰竭之已知心血管及心肺疾病、左心室射血分數(LVEF) ＜45%、基於室內空氣基綫氧飽和＜93%之患者。良好控制之心房纖維性顫動將不為排除項，而不受控制之心房纖維性顫動將為排除項。 5. 在研究者看來可能會妨礙完成根據此方案之治療的任何嚴重醫學或精神病學疾病。 6. 除非黑素瘤皮膚癌或原位癌(例如子宮頸癌、膀胱癌、乳癌)外之惡性腫瘤史，除非無疾病≥3年。 7. 需要全身性類固醇治療之任何疾病。 8. 先前使用任何細胞及基因療法。 9. 在白細胞清除術程序之前14天或用調理化學療法或表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞治療之前28天內用任何研究產品治療(除了細胞或基因療法)。 10. 在白細胞清除術程序或用調理化學療法或表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞治療之前14天內使用全身性抗癌療法(包括免疫腫瘤學療法)及用放射療法治療。 11. 在白細胞清除術程序或用調理化學療法或表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞治療之前28天內用重大手術治療(諸如導管放置之微小手術程序不為排斥準則)。 12. 先前用任何間皮素靶向療法治療。 13. 來自先前抗癌療法之任何未解決之3級或更高級毒性。 14. 如由研究者所判斷患者具有出血風險。 15. 存在中樞神經系統轉移或其他顯著神經疾患(已在必要時有效治療且穩定之具有中樞神經系統轉移之患者可招募)。 16. 患者具有人類免疫缺陷病毒(HIV)血清陽性及/或人類T細胞嗜淋巴細胞性病毒(HTLV)血清陽性。 17. 患者具有器官移植史或正在等候器官移植。 18. 患者對包括環磷醯胺、氟達拉濱或鏈黴素之藥劑中之任一者具有重度即發性過敏。 19. 承認或有非法使用藥物、藥物濫用或酒精濫用之證據。 20. 在開始調理方案之前≤6週內接種了活疫苗。 21. 女性患者正在泌乳及母乳喂養或血清妊娠測試陽性(在用調理化學療法及表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞治療之前允許尿妊娠測試)。注意：若正在泌乳之女性患者在用表現本文所描述之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞治療之前停止母乳喂養，則其將為合格的。 主要評估及分析準則： 主要終點：

劑量限制毒性(DLT)之發生率。

治療緊急有害事件(TEAE)之發生率。

包括重度ICANS、CRS、血球吞噬淋巴組織細胞增生癥、巨噬細胞活化癥候群及腫瘤溶解癥候群之臨床相關有害事件(AE)的發生率。 次要終點：

如由研究者根據RECIST 1.1及iRECIST所評估之總反應率(ORR)、疾病控制率(DCR)、反應持續時間(DOR)、到進展之時間(TTP)及無進展存活(PFS)。

總存活(OS)。

藉由CAR載體拷貝數(C最大[在單次劑量投與之後在外周血藥物濃度中觀測到之最大(峰值)]、t最大[第一次出現最大所觀測外周血濃度之時間]、C最後[在外周血中最後一次觀測到之可定量濃度]、t持續[持久性：在外周血中最後一次觀測到可定量濃度之時間(天)]；AUC [血液濃度-時間曲線下面積])評估之CK相關參數。

具有RCR陽性測試結果之實施例的數目及百分比。 統計考慮：

DLT及TEAE之發生率及百分比將根據國際協調理事會(International Council for Harmonisation，ICH)之系統器官分類及優先項監管活動醫學詞典(Medical Dictionary for Regulatory Activities，MedDRA)且根據等級進行概述。此外，以下事件將以相同方法概述。 - 治療相關TEAE。 - 3級或更高級之TEAE。 - 3級或更高級之治療相關TEAE。 - 嚴重有害事件(相關的及無關的)。

臨床相關之AE及RCR將藉由計數及百分比來概述。

對於次要功效終點，將針對二元終點計算點估計值及雙側95%精確二項式置信區間，且將使用卡普蘭-梅爾方法(Kaplan-Meier method)描述性地分析到事件之時間終點。

CK參數將使用描述統計學來概述。個別濃度-時間數據及個別CK參數將呈現於列表中且根據劑量隊列使用概括統計量列入表內。個別及平均濃度-時間曲綫將根據劑量隊列繪製。

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習此技術所屬技術者通常所理解相同之含義。

本文中說明性描述之本發明技術可在不存在本文未特定揭示之任何元件、限制之情況下適當地進行實踐。因此，舉例而言，術語「包含」、「包括」、「含有」等應可擴展地解讀且不進行限制。另外，本文採用之術語及表述用作描述而非限制之術語，且在使用此類術語及表述時不意在排除所顯示及描述之特徵的任何等效物或其部分，但應認識到，在所主張之本發明技術範疇內各種修改均為可能的。

因此，應瞭解，在此提供之材料、方法及實例代表較佳態樣，為示例性的，且不旨在限制本發明技術之範疇。

本文已廣泛地且一般性地描述本發明技術。在一般揭示內容內之各個更窄之種類及亞屬分組亦形成本發明技術之一部分。此包括具有自屬中移除任何主題之附帶條件或負面限制的對本發明技術之一般描述，無論去除之材料在本文中是否特定地敘述。

此外，在根據馬庫西組描述本發明技術之特徵或態樣之情況下，熟習此項技術者將認識到，本發明技術亦從而根據馬庫西組之任何個別成員或成員亞組來描述。

本文提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻明確地以全文引用之方式併入本文中，其程度與各自以引用之方式個別地併入本文中相同。在矛盾之情況下，將以本說明書(包括定義)為凖。

其他態樣闡述於以下申請專利範圍內。

圖1A顯示包含編碼特異性識別間皮素之嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸、編碼IL-7之聚核苷酸及編碼CCL19之聚核苷酸的示例性載體之卡通圖示。圖1B顯示表現特異性識別間皮素之CAR、IL-7及CCL19之經修飾免疫細胞的卡通圖示。圖2說明本文所描述之經修飾免疫細胞對MSLN陽性腫瘤細胞的活體外殺傷作用。圖3顯示在Capan-2異種移植小鼠模型中使用表現示例性第2及第3代CAR-T系統之經修飾免疫細胞之活體內功效。圖4A說明與未轉導(UTD)之T細胞相比來自用示例性第2代CAR-T系統處理之小鼠的Capan-2異種移植腫瘤組織之組織病理學檢驗。圖4B顯示使用Capan-2異種移植小鼠模型之示例性第2代CAR-T系統之活體內功效。圖5A顯示在存在本文所描述之經修飾免疫細胞之情況下SKOV3-luc異種移植小鼠模型中之腫瘤細胞位置的生物發光圖像(BLI)。圖5B顯示使用SKOV3-luc BLI模型之示例性第2代CAR-T系統之活體內功效。圖6A顯示與未轉導(UTD) T細胞相比投與示例性第2代CAR-T系統之Capan-2異種移植小鼠模型的體重變化。圖6B顯示與未轉導(UTD) T細胞相比投與示例性第2代CAR-T系統之不帶腫瘤之小鼠的體重變化。圖7A顯示來自投與未轉導(UTD) T細胞之小鼠模型之肺組織的組織病理學圖像。UTD細胞在肺臟及脾臟中具有極低程度之推定CAR-T浸潤/炎癥。圖7B顯示來自投與CAR#364 (第2 28-28z_7x19)之小鼠模型之肺組織的組織病理學圖像。與投與UTD細胞之動物相比，在該等動物中在肺臟、脾臟及肝臟中觀測到更高之推定CAR-T浸潤/炎癥發生率。圖7C顯示來自投與CAR#365 (第2 8-BBz_7x19)之小鼠模型之肺組織的組織病理學圖像。在該等動物中觀測到較低之肺單核浸潤或混合細胞炎癥發生率且在脾臟及骨髓中觀測到較高之推定CAR-T細胞移植發生率。圖8A顯示在投與示例性第2代CAR-T系統之Capan-2異種移植小鼠之血液中所投與之T細胞的流式細胞術分析。圖8B顯示在投與示例性第2代CAR-T系統之Capan-2異種移植小鼠之腫瘤中所投與之T細胞的流式細胞術分析。圖8C顯示在投與示例性第2代CAR-T系統之Capan-2異種移植小鼠之脾臟中所投與之T細胞的流式細胞術分析。圖9顯示Capan-2腫瘤細胞及與可溶性hMSLN一起預孵育之示例性第2代CAR-T系統之共培養上清液的人類IFN-γ水準。圖10A顯示第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)及第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)之組分。圖10B顯示使用HepG2-RedFluc異種移植模型之第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)及第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)之活體內功效。圖10C顯示使用8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)及第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)之HepG2-RedFluc異種移植小鼠模型之體重變化。圖11顯示在存在第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)及第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)之情況下HepG2-RedFluc異種移植小鼠模型中之腫瘤細胞位置的生物發光圖像(BLI)。圖12A顯示HepG2-RedFluc異種移植小鼠組1 (G1)中PBS對照之活體內功效。圖12B顯示在HepG2-RedFluc異種移植小鼠組2 (G2)中在3M劑量下等效總T細胞數目之未轉導(UTD)對照之活體內功效。圖12C顯示在HepG2-RedFluc異種移植小鼠組3 (G3)中在0.3M劑量下第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)之活體內功效。圖12D顯示在HepG2-RedFluc異種移植小鼠組3 (G4)中在1M劑量下第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)之活體內功效。圖12E顯示在HepG2-RedFluc異種移植小鼠組3 (G5)中在3M劑量下第2 8-BBz_7x19 CAR-T (CAR#365)之活體內功效。圖12F顯示在HepG2-RedFluc異種移植小鼠組3 (G6)中在0.3M劑量下第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)之活體內功效。圖12G顯示在HepG2-RedFluc異種移植小鼠組3 (G7)中在1M劑量下第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)之活體內功效。圖12H顯示在HepG2-RedFluc異種移植小鼠組3 (G8)中在3M劑量下第3 8-28BBz_7x19 CAR-T (CAR#348)之活體內功效。

TW202321287A_111128411_SEQL.xml

Claims

一種經分離之核酸分子，其包含：編碼嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸，該嵌合抗原受體包含特異性識別人類間皮素之抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、4-1BB細胞內區域及CD3ζ細胞內區域；編碼IL-7之聚核苷酸；及編碼CCL19之聚核苷酸。
如請求項1中任一項之經分離之核酸分子，其中該IL-7為人類IL-7。
如請求項1或請求項2之經分離之核酸分子，其中該CCL19為人類CCL19。
如請求項1-3中任一項之經分離之核酸分子，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含含有SEQ ID NO: 1-3之三個互補決定區(CDR)，且其中該VL包含含有SEQ ID NO: 4-6之三個CDR。
如請求項1-4中任一項之經分離之核酸分子，其中該VH包含SEQ ID NO: 7且該VL包含SEQ ID NO: 8。
如請求項1-5中任一項之經分離之核酸分子，其中該抗體包含單鏈可變片段(scFv)形式。
如請求項1-6中任一項之經分離之核酸分子，其中該抗體包含SEQ ID NO: 9。
如請求項1-7之經分離之核酸分子，其中該4-1BB細胞內區域包含SEQ ID NO: 13。
如請求項1-8之經分離之核酸分子，其中該CD3ζ細胞內區域包含SEQ ID NO: 14。
如請求項1-9中任一項之經分離之核酸分子，其中該4-1BB細胞內區域在該經分離之核酸分子中之該CD3ζ細胞內區域的上游。
如請求項1-10中任一項之經分離之核酸分子，其中該CD8鉸鏈區包含SEQ ID NO: 11。
如請求項1-11中任一項之經分離之核酸分子，其中該CD8跨膜區包含SEQ ID NO: 12。
如請求項1-12中任一項之經分離之核酸分子，其中該核酸進一步包含連接該抗體與該CD8鉸鏈區之長度為3至10個胺基酸殘基之肽連接子。
如請求項13之經分離之核酸分子，其中該肽連接子包含AAA。
如請求項1-14中任一項之經分離之核酸分子，其中該經分離之核酸分子進一步包含信號傳導肽。
如請求項1-15中任一項之經分離之核酸分子，其中該信號傳導肽位於該經分離之核酸分子中該特異性識別人類間皮素之抗體的上游。
如請求項15或16之經分離之核酸分子，其中該信號傳導肽包含SEQ ID NO: 15。
如請求項1-17中任一項之經分離之核酸分子，其中該編碼IL-7之聚核苷酸及該編碼CCL19之聚核苷酸各自獨立地在包含編碼自裂解2A肽(2A肽)之聚核苷酸的啓動子下轉錄。
如請求項18之經分離之核酸分子，其中該2A肽為P2A，其視情況包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP。
如請求項18-19中任一項之經分離之核酸分子，其中肽連接子進一步添加至該2A肽之N端，其中該肽連接子包含GSG。
如請求項1-20中任一項之經分離之核酸分子，其中該IL-7包含SEQ ID NO: 18。
如請求項1-21中任一項之經分離之核酸分子，其中該CCL19包含SEQ ID NO: 19。
如請求項1-22中任一項之經分離之核酸分子，其中該編碼CAR之聚核苷酸、該編碼IL-7之聚核苷酸及該編碼CCL19之聚核苷酸在該核酸分子中自5'端至3'端排列為該編碼CAR之聚核苷酸-該編碼IL-7之聚核苷酸-該編碼CCL19之聚核苷酸。
如請求項1-23中任一項之經分離之核酸分子，其中該經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO: 16之多肽。
如請求項1-24中任一項之經分離之核酸分子，其中該經分離之核酸分子包含SEQ ID NO: 17。
一種載體，其包含如請求項1-25中任一項之核酸分子。
如請求項26之載體，其中該載體為病毒載體，視情況為表現載體。
如請求項27之載體，其中該病毒載體選自逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒(AAV)載體。
如請求項27或28之載體，其中該病毒載體為pSFG載體、pMSGV載體或pMSCV載體。
如請求項26之載體，其中該載體為質體。
一種免疫細胞，其來源於哺乳動物或自哺乳動物分離且包含如請求項1-25中任一項之核酸分子或如請求項26-30中任一項之載體。
一種免疫細胞，其來源於哺乳動物或自哺乳動物分離且表現a)嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含特異性識別人類間皮素之抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、4-1BB細胞內區域及CD3ζ細胞內區域，b) IL-7，及c) CCL19。
如請求項31或32之免疫細胞，其中該免疫細胞為T細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、抗原呈遞細胞或粒細胞，視情況為T細胞或NK細胞。
一種醫藥組合物，其包含如請求項31-33中任一項之免疫細胞及醫藥學上可接受之添加劑。
一種治療表現間皮素之癌癥的方法，該方法包括向有需要之個體投與如請求項31-33中任一項之免疫細胞或如請求項34之醫藥組合物。
如請求項35之方法，其中該表現間皮素之癌癥為實體瘤，視情況選自間皮瘤、結腸直腸癌、胰臟癌、胸腺癌、膽管癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、***癌、膀胱癌、***癌、頸癌、子宮癌、肝癌、腎癌、脾臟癌、氣管癌、支氣管癌、胃癌、食管癌、膽囊癌、睪丸癌、卵巢癌及骨癌。
如請求項35之方法，其中該表現間皮素之癌癥為造血系統癌癥。
如請求項35之方法，其中該表現間皮素之癌癥為肉瘤，視情況選自軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing' s sarcoma)、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤及軟組織肉瘤。
如請求項35-38中任一項之方法，其中該表現間皮素之癌癥為轉移性癌癥。
如請求項35-38中任一項之方法，其中該表現間皮素之癌癥為復發性癌癥或難治性癌癥。
如請求項35-40中任一項之方法，其中該方法進一步包括向該個體投與另一治療劑或另一治療方案。
如請求項41之方法，其中該另一治療劑包括化學治療劑、免疫治療劑、靶向療法、放射療法或其組合。
如請求項41之方法，其中該另一治療方案包括一綫療法。
如請求項41之方法，其中該另一治療方案包括手術。
如請求項41-44中任一項之方法，其中如請求項31-33中任一項之免疫細胞或如請求項34之醫藥組合物與該另一治療劑同時投與。
如請求項41-44中任一項之方法，其中如請求項31-33中任一項之免疫細胞或如請求項34之醫藥組合物與該另一治療劑依序投與。
如請求項46之方法，其中如請求項31-33中任一項之免疫細胞或如請求項34之醫藥組合物在投與該另一治療劑之前向該個體投與。
如請求項46之方法，其中如請求項31-33中任一項之免疫細胞或如請求項34之醫藥組合物在投與該另一治療劑之後向該個體投與。
如請求項35-48中任一項之方法，其中該個體為人類。
一種減少腫瘤細胞增殖之方法，該方法包括使該腫瘤細胞與如請求項31-33中任一項之免疫細胞接觸，從而減少該腫瘤細胞增殖。
如請求項50之方法，其中該方法為活體外方法。
如請求項50之方法，其中該方法為活體內方法。
一種用於產生表現特異性識別人類間皮素之細胞表面分子、IL-7及CCL19之免疫細胞的方法，該方法包括：將如請求項1-25中任一項之核酸分子或如請求項26-30中任一項之載體引入免疫細胞，以誘導該免疫細胞表現特異性識別人類間皮素之細胞表面分子、IL-7及CCL19。
如請求項53之方法，其中該免疫細胞為T細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、抗原呈遞細胞或粒細胞，視情況為T細胞或NK細胞。
一種套組，其包括如請求項1-25中任一項之核酸分子；如請求項26-30中任一項之載體、如請求項31-33中任一項之免疫細胞或如請求項34之醫藥組合物，及使用說明書。