TW202245783A - 一種吡咯并嘧啶類化合物的應用 - Google Patents

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本發明提供了一種吡咯并嘧啶類化合物的應用。該吡咯并嘧啶類化合物的結構如式I所示，其具有抑制STAT磷酸化的作用，對化膿性脊髓炎、急性脊髓炎、腦脊髓炎或自體免疫性疾病具有良好的預防或治療作用。

Description

一種吡咯并嘧啶類化合物的應用
本申請主張申請日為2021/5/21的中國專利申請2021105572488和申請日為2022/5/9的中國專利申請2022105035016的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明涉及一種吡咯并嘧啶類化合物的應用。
中樞神經系統脫髓鞘疾病是以中樞神經系統(CNS)多灶性以及發炎性脫髓鞘為主的一種自體免疫系統疾病，其臨床特徵主要包括反復發作、多次緩解及復發。臨床較為常見的中樞神經系統脫髓鞘疾病包括多發性硬化症。
多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是最常見的一種中樞神經系統脫髓鞘疾病，也是在青壯年中最常見的非創傷性的神經系統疾病，全球現有兩百多萬患者，隨著對該病認識的越來越重視和診斷技術的提高，目前國內MS的診斷率逐年提高。但是，由於神經系統疾病較為複雜，多發性硬化病因不明，還未有多發性硬化的有效預防和治療方法。目前，用於治療多發性硬化的藥物多為激素類，但是激素類的副作用較大，會引起水、鹽、糖、蛋白質及脂肪代謝失調，而且還可能會出現肥胖、多毛、無力等。在一些情況下，MS的症狀包括身體一個或多個部分的麻木或虛弱、視力的部分或全部喪失、長期複視、麻刺或疼痛、萊爾米特徵、震顫、言語不清、疲勞、頭暈和腸及膀胱功能受損。
實驗性自體免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)從最初建立至今大概50年(Kabat et al.,1947)。EAE透過活化自體反應性T細胞對CNS髓鞘產生的免疫反應，它可以有效研究免疫系統在CNS發炎性脫髓鞘病變中所起的作用。其典型的病理特徵表現為：(1)血管周圍的發炎細胞(主要是淋巴細胞、巨噬細胞、活化的小膠質細胞)浸潤；(2)病灶區域的脫髓鞘，特點是髓鞘破壞、軸突保存(Rao and Segal,2004)。它的免疫發炎反應、臨床特徵和組織病理學改變與人類MS疾病有驚人的相似(Sosa andForsthuber,2011)。因此，它是目前MS研究中應用最廣泛的動物模型(Kipp et al.,2012)。MS和EAE兩者的CNS白質均出現T細胞、巨噬細胞和B細胞浸潤的脫髓鞘病灶。其中，病灶內出現吞噬了疏水的髓磷脂形成的泡沫樣巨噬細胞被認為是活動病灶。寡選植株IgG在EAE和MS患者腦脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)中均可見到。兩者的差異之處在於後者發病機制中還有基因、表觀遺傳和環境因素(包括感染和免疫系統之間的相互作用)的參與(Becher etal.,2016)。
因此，研究開發能夠安全、有效的預防和治療多發性硬化的藥物，以消除患者體內的神經免疫發炎的異常，對於臨床治療多發性硬化具有重要指導意義。
本發明所要解決的技術問題是尋找一種對化膿性脊髓炎、急性脊髓炎、腦脊髓炎或自體免疫性疾病具有良好的預防和/或治療作用的化合物，為此，本發明提供了一種吡咯并嘧啶類化合物的應用。
本發明提供了一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備STAT磷酸化抑制劑中的應用：
Figure 02_image001
。
本發明還提供了一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療和/或預防具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的化膿性脊髓炎、急性脊髓炎或腦脊髓炎的藥物中的應用：
Figure 02_image001
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本發明還提供了一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療和/或預防具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的自體免疫性疾病的藥物中的應用：
Figure 02_image001
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本發明還提供了一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療和/或預防化膿性脊髓炎、急性脊髓炎或腦脊髓炎的藥物中的應用：
Figure 02_image001
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本發明還提供了一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療和/或預防自體免疫性疾病的藥物中的應用：
Figure 02_image001
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在一些實施方案中，所述的STAT磷酸化可為STAT1磷酸化、STAT3磷酸化和STAT5磷酸化中的一種或多種，例如STAT3磷酸化。
在一些實施方案中，所述自體免疫性疾病可為中樞神經系統的自體免疫性疾病或視神經系統的自體免疫性疾病；所述中樞神經系統的自體免疫性疾病可以為視神經脊髓炎、多發性硬化，例如視神經脊髓炎、復發緩解多發性硬化、繼發進行性多發性硬化、原發進行性多發性硬化、進行性復發性多發性硬化、臨床單一症候群或放射學單一症候群；所述視神經系統的自體免疫性疾病可為視神經脊髓炎。
在一些實施方案中，所述腦脊髓炎可以為急性播散性腦脊髓炎、亞急性壞死性脊髓炎、急性壞死出血性腦脊髓炎、小兒急性播散性腦脊髓炎或結核性脊髓炎。
在一些實施方案中，所述具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的自體免疫性疾病可為中樞神經系統的自體免疫性疾病或視神經系統的自體免疫性疾病；所述具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的中樞神經系統的自體免疫性疾病可以為視神經脊髓炎、多發性硬化，例如視神經脊髓炎、復發緩解多發性硬化、繼發進行性多發性硬化、原發進行性多發性硬化、進行性復發性多發性硬化、臨床單一症候群或放射學單一症候群；所述視神經系統的自體免疫性疾病還可以為視神經脊髓炎。
在一些實施方案中，所述具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的腦脊髓炎、化膿性脊髓炎或急性脊髓炎，其中腦脊髓炎可以為急性播散性腦脊髓炎、亞急性壞死性脊髓炎、急性壞死出血性腦脊髓炎、小兒急性播散性腦脊髓炎或結核性脊髓炎。
在一些實施方案中，所述的如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽為所述抑制劑或所述藥物的有效成分之一或者唯一有效成分。
在一些實施方案中，向有需要的受試者可施用治療有效量的所述如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽。所述施用的方式可為任何合適的方式，例如口服。
在一些實施方案中，所述的如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽還可以進一步包含藥學上可接受的賦形劑。如式I所示化合物或其藥學上可接受的鹽可以製成各種合適的劑型，例如，片劑或皮下注射劑。
在一些實施方案中，所述如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽的施用劑量可為1~120 mg/kg/d，優選為3~100 mg/kg/d，例如為3 mg/kg/d、6 mg/kg/d、10 mg/kg/d、20 mg/kg/d、40 mg/kg/d、60 mg/kg/d或90 mg/kg/d。
在一些實施方案中，所述如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽的單次施用劑量可為1-400 mg，例如3 mg、6 mg、9 mg、100 mg或400 mg。
在一些實施方案中，所述如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽的施用頻率可為1次/日、2次/日或3次/日，優選1次/日或2次/日。除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義。一個特定的術語或短語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。
術語在“STAT磷酸化抑制劑”可用於哺乳動物生物體內；也可用於生物體外，主要作為實驗用途，例如：作為標準樣品或對照樣品提供比對，或按照本領域常規方法製成套組，為STAT磷酸化抑制效果提供快速檢測。
術語“具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的自體免疫性疾病”是指該自體免疫性疾病表現出高於正常位準的STAT磷酸化。本發明中，如式I所示化合物可透過抑制STAT磷酸化對自體免疫性疾病具有預防和/或治療作用。
術語“具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的化膿性脊髓炎、急性脊髓炎或腦脊髓炎”是指該化膿性脊髓炎、急性脊髓炎或腦脊髓炎表現出高於正常位準的STAT磷酸化。本發明中，如式I所示化合物可透過抑制STAT磷酸化對化膿性脊髓炎、急性脊髓炎或腦脊髓炎具有預防和/或治療作用。
這裡所採用的術語“藥學上可接受的”，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。
術語“藥學上可接受的鹽”是指本發明化合物與相對無毒的、藥學上可接受的酸或鹼製備得到的鹽。當本發明的化合物中含有相對酸性的功能團時，可以透過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的藥學上可接受的鹼與這類化合物的原型接觸的方式獲得鹼加成鹽。藥學上可接受的鹼加成鹽包括但不限於：鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋁鹽、鎂鹽、鋅鹽、鉍鹽、銨鹽、二乙醇胺鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能基時，可以透過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的藥學上可接受的酸與這類化合物的原型接觸的方式獲得酸加成鹽。所述的藥學上可接受的酸包括無機酸，所述無機酸包括但不限於：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、碳酸、磷酸、亞磷酸、硫酸等。所述的藥學上可接受的酸包括有機酸，所述有機酸包括但不限於：乙酸、丙酸、草酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、杏仁酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、水楊酸、酒石酸、甲磺酸、異煙酸、酸式檸檬酸、油酸、單寧酸、泛酸、酒石酸氫、抗壞血酸、龍膽酸、丁烯二酸、葡糖酸、糖酸、甲酸、乙磺酸、雙羥萘酸(即4, 4’-伸甲基-雙(3-羥基-2-萘甲酸))、胺基酸(例如麩胺酸、精胺酸)等。當本發明的化合物中含有相對酸性和相對鹼性的官能基時，可以被轉換成鹼加成鹽或酸加成鹽。具體可參見Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977)、或、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (P. Heinrich Stahl and Camille G. Wermuth, ed., Wiley-VCH, 2002)。
術語“治療”指治療性療法。涉及具體病症時，治療指：(1)緩解疾病或者病症的一種或多種生物學表現，(2)干擾(a)導致或引起病症的生物級聯中的一個或多個點或(b)病症的一種或多種生物學表現，(3)改善與病症相關的一種或多種症狀、影響或副作用，或者與病症或其治療相關的一種或多種症狀、影響或副作用，或(4)減緩病症或者病症的一種或多種生物學表現發展。
術語“預防”是指獲得或發生疾病或障礙的風險降低。
術語“受試者”是指根據本發明的實施例，即將或已經接受了該化合物給藥的任何動物，哺乳動物為優，人類最優。術語“哺乳動物”包括任何哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限於牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猴、人等，以人類為最優。
在不違背本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：本發明發現如式I所示化合物具有抑制STAT磷酸化的作用，對化膿性脊髓炎、急性脊髓炎、腦脊髓炎或自體免疫性疾病具有良好的預防和/或治療作用。
具體實施方式
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。本發明所使用的溶劑和試劑均可經市售獲得。
化合物Ⅰ由廣州嘉越醫藥科技有限公司提供，按照專利PCT/CN2020094534記載的製備方法製備得到
Figure 02_image005
。 實施例 1測試化合物Ⅰ對BV-2細胞株分泌CCL5和NO的抑制作用研究 1、實驗材料和方法 (1)細胞株 表1 細胞株
細胞名稱 組織類型 培養特性 培養基 每孔平盤培養數
BV-2 小鼠神經膠質瘤 貼附型 RPMI 1640 + 10%FBS 12000
備註：1. 細胞培養條件為：37℃，5% CO 2和95%濕度。 2. IC 50值：達到50%抑制效果時抑制劑的濃度。 3. BV-2購買於南京科佰生物科技有限公司。 4. 表1中10%FBS中的百分比為體積百分比。 (2)試劑
1)RPMI1640培養基(購於Gibco，產品號：C22400500BT)；2)FBS (胎牛血清)(購於ExCell，產品號：FND500)；3)DMSO(購於Sigma，產品號：D2650)；4)LPS脂多糖(購於Sigma，產品號：L4391)；5)Mouse IFN-gamma Protein (購於R&D，產品號：485-MI-100)；6)CellTiter-Glo (CTG)(購於Promega，產品號：G7572) ；7)Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA (R&D，產品號：DY478-05)；8)Griess Reagent System (Promega，產品號：G2930)。 (3)供試品和陽性對照品 表2 供試品和陽性對照品資訊
化合物 批號 純度 (%) 分子量 儲存條件 供應商
化合物Ⅰ H22005-035-P1 98.1 293 2-8℃-密封/遮光 廣州嘉越醫藥科技有限公司提供
西尼莫德 T6403 99.1 516.6 -20℃ 陶素生化
秤取化合物化合物Ⅰ及西尼莫德，分別加入DMSO(二甲亞碸)溶解成10mM儲備溶液，放入-20℃儲存待用。 (4)CTG方法測定化合物細胞增殖、上清液CCL5和NO檢測
具體步驟如下：
步驟1：收集處於指數生長期的BV-2細胞，並用Vi-Cell XR細胞計數儀進行活細胞計數。用培養基將細胞懸浮液調整到適當濃度。每孔加160 µl細胞懸浮液於96-孔細胞培養盤，最終細胞濃度為12000細胞/孔。將培養盤37℃，5% CO 2培養箱中培養24小時。
步驟2：使用DMSO將10 mM DMSO化合物儲存液按1:4比例梯度稀釋，配製系列1000X供試化合物溶液，然後用細胞培養基將1000X供試化合物溶液1:100稀釋後配製系列10X供試化合物溶液。最後，取出前一天已平盤培養的96-孔盤，按照實驗孔盤加入樣品設計，每孔細胞分別加入20 µl對應的10X溶液，每個藥物濃度各3個重複孔。本實驗最終測試所用化合物濃度(即1X溶液)範圍分別為10, 2.5, 0.625, 0.156, 0.0391, 0.0098, 0.0024 μM，每孔DMSO終濃度為0.1%。
化合物加入樣品完畢後，將96孔盤置於37℃，5% CO 2培養箱中培養半小時。
預培育結束之後，每孔分別加入20 µl 含有100 ng/ml LPS和100 ng/ml IFN-γ的培養基(最終濃度為10 ng/ml LPS和10 ng/ml IFN-γ)，用以誘導活化BV-2細胞。然後將培養盤置於37℃，5% CO 2培養箱中培養24小時。
步驟3：化合物處理24小時後，將培養盤離心1200轉5分鐘，吸上清液至另外培養盤中，錫紙密封於-20℃保存，將用於ELISA檢測和Griess試劑系統檢測。吸完上清液的細胞培養盤將立即用於CTG法檢測細胞增殖。
步驟4：在吸完上清液的細胞培養盤中每孔加入100 µl PBS，按照CTG套組操作說明，每孔加入50 µl預先融化並平衡到室溫的CTG溶液，用微孔盤震盪器混勻2分鐘，於室溫放置10分鐘後用Envision2104孔盤讀取儀測定螢光訊號值。
步驟5 (NO和CCL5檢測)：使用ELISA套組(Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA；R&D；DY478-05)，按照套組說明書，檢測上清液中CCL5位準；使用Griess試劑系統(Griess Reagent System；Promega；G2930)，按照套組說明書，檢測上清液中一氧化氮(NO)的含量。 (5)數據分析
1)CTG數據分析
步驟1：透過CTG螢光訊號值，計算各測試濃度相對於空白(DMSO)組的存活細胞百分比(surviving cells%)，計算公式為：surviving cells%=待測濃度組螢光值/空白組螢光值。
步驟2：以化合物濃度的對數值對存活細胞百分比作圖，然後採用非線性回歸算出擬和曲線，利用軟體GraphPad Prism 5公式log(inhibitor) vs. response -- Variable slope計算得到IC50值。
步驟3：抑制率的計算公式為：inh.(%) = {空白組螢光值-待測濃度組螢光值}/空白(DMSO)組螢光值。
2)CCL5和NO數據分析
步驟1：首先透過ELISA和Griess的光密度值，繪製標準曲線並計算出各樣品的絕對濃度。然後使用各樣品所對應的CTG螢光值進行校準，得到各樣品的校準濃度，計算公式為：校準濃度=絕對濃度/同一樣本CTG螢光值。
步驟2：根據各樣品校準濃度計算各測試濃度相對於空白(DMSO)組分泌CCL5或NO的相對百分比，即CCL5 production (%)或NO production (%)，計算公式為：相對百分比%=待測濃度組校準濃度/空白組校準濃度。
步驟3：最後，以化合物濃度的對數值對CCL5分泌相對百分比或NO分泌相對百分比作圖，採用非線性回歸算出擬和曲線，利用軟體GraphPad Prism 5公式log(inhibitor) vs. response -- Variable slope計算得到IC50值。
步驟4：抑制率的計算公式為：inh.(%)={空白組校準濃度-待測濃度組校準濃度} /空白組校準濃度。 (6)實驗結果 表3化合物Ⅰ和西尼莫德對BV-2細胞增殖的IC50和最大抑制率
細胞株 化合物Ⅰ 西尼莫德
IC50 (μM) 最大抑制率(%) IC50 (μM) 最大抑制率(%)
BV-2 NA -46.39% NA 4.44%
結論：化合物Ⅰ與BV-2細胞共培育24小時，對細胞增殖無抑制作用(表3)，最高測試濃度為10 μM。此外，化合物Ⅰ濃度在＞0.1 μM時，細胞數目較空白(DMSO)孔有所增加，最高細胞數目增長率為46.39%(表3)，接近未加LPS/IFNγ條件下的細胞數目，化合物Ⅰ可能提高活化的BV-2細胞的存活能力。化合物西尼莫德在所有測試濃度下，對細胞增殖亦無明顯抑制，最大抑制率為4.44%。 表4化合物Ⅰ和西尼莫德對BV-2細胞株分泌Mouse CCL5的IC50和最大抑制率
化合物對BV-2分泌CCL5的影響 化合物Ⅰ 西尼莫德
IC50 (μM) 最大抑制率(%) IC50 (μM) 最大抑制率(%)
0.863 80.29 ＞10 35.16
結論：CCL5 ELISA結果顯示，化合物Ⅰ與BV-2共培育24小時後，IC50為0.863 μM，最大抑制率為80.29%(表4)。同樣條件下，化合物西尼莫德最大抑制率為35.16%，IC50為＞10 μM(表4)。 表5化合物Ⅰ和西尼莫德對BV-2細胞株分泌NO的IC50和最大抑制率
化合物對BV-2分泌NO的影響 化合物Ⅰ 西尼莫德
IC50 (μM) 最大抑制率(%) IC50 (μM) 最大抑制率(%)
0.487 100.00 ＞10 7.71
結論：Griess試劑系統檢測結果顯示，化合物Ⅰ與BV-2共培育24小時後，IC50為0.487 μM，最大抑制率為100%(表5)。同樣條件下，化合物西尼莫德IC50為＞10 μM，最大抑制率為7.71%(表5)。
綜上所述，化合物Ⅰ能夠有效抑制LPS/IFNγ誘導產生的細胞激素(CCL5)及活性氮(NO)，並呈劑量反應關係：對細胞激素(CCL5)的最大抑制率為80.29%，IC50為0.863 μM；對活性氮(NO)的最大抑制率為100.00%，IC50為0.487 μM。西尼莫德在本實驗中的IC50均大於10 μM。
化合物Ⅰ可顯著抑制小膠質細胞(BV-2)過度活化導致的促發炎激素釋放，提示其為治療多發性硬化等神經發炎疾病的重要機制之一。 實施例 2研究化合物I對MOG35-55誘導的實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型的體內藥效學研究
實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型是研究多發性硬化的理想動物模型。
實驗目的：研究化合物I在MOG35-55誘導的小鼠實驗性自體免疫性腦脊髓炎模型中的藥效
實驗設計： (1)動物：C57BL/6小鼠，雌性，6-8周齡，無特定病原體(SPF)。由上海斯萊克實驗動物技術有限公司提供。 (2)受試化合物和試劑
1)MOG35-55購於吉爾生化，貨號：51716；2)IFA購於Sigma-Aldrich，貨號：F5506；3)結核分枝桿菌H37Ra，Difco，貨號：231141；4)PTX (Pertussis toxin)購於List Biological Laboratories, 貨號：180235AIA；5)醋酸***片由辰欣藥業提供，國藥准字：H37021898；6)醋酸***片的配製方法：取醋酸***片溶於生理鹽水；7)化合物Ⅰ由廣州嘉越醫藥科技有限公司提供；
化合物Ⅰ的配製方法：
秤取適量化合物Ⅰ直接溶於溶[(0.5%(w/v)羥丙甲基纖維素(HPMC) E5/0.5%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP/0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉SDS水溶液]，在室溫下超音波震盪、攪拌約1小時，得到均勻、不透明的細顆粒懸浮液。每三天一配，4℃保存。 (3)EAE模型建立方法：
1)動物適應期過後打耳標標記小鼠，將小鼠背部剃毛。提前1-2天準備無菌的玻璃瓶3個和勻漿機分散刀頭；
2)配製免疫乳劑(含1 mg/ml MOG35-55和 2mg/ml 結核分枝桿菌)和PTX溶液配製(PTX粉末每支50 μg，加入PBS 1 mL，配成50 μg/mL儲備溶液，用前使用PBS稀釋至1 μg/mL，現配現用)；
3)動物免疫
85隻小鼠，隨機挑出5隻作為正常對照組，另外80隻異氟烷麻醉，在皮下注射100 μL免疫乳劑(含1 mg/ml MOG35-55和2 mg/ml 結核分枝桿菌的IFA)，分別在三個位點，包括頸部和腹股溝兩側，每點各注射約33 μL乳劑。動物注射乳劑當天定義為第0天。於注射乳劑後0小時(第0天)和48小時後(第2天)，每隻小鼠腹腔注射200 ng(即200 μL)PTX溶液(1 μg/mL)。 (4)分組與給藥 表6 分組與劑量設計
組別 N c 受試物 劑量 (mg/kg) 給藥體積 (mL/kg) 濃度 (mg/mL) 給藥方式 給藥時間 d,e
G1：正常對照組 (Normal) 5 溶媒 a NA 10 NA 口服 每天2次×14天
G2：溶媒對照組 (Veh) 10 溶媒 a NA 10 NA 口服 每天2次×14天
G3：***組 (DEX) 10 *** b 1 10 0.1 口服 每天1次×14天 溶媒對照組×14天
G4：芬戈莫德組(Fingolimod) 10 芬戈莫德 b 0.5 10 0.05 口服 每天1次×14天 溶媒對照組×14天
G5：化合物Ⅰ 3 mg/kg BID組 10 化合物Ⅰ 3 10 0.3 口服 每天2次×14天
G6：化合物Ⅰ 10 mg/kg BID組 10 化合物Ⅰ 10 10 1 口服 每天2次×14天
G7：化合物Ⅰ 20 mg/kg BID組 10 化合物Ⅰ 20 10 2 口服 每天2次×14天
G8：化合物Ⅰ 20 mg/kg QD組 10 化合物Ⅰ 20 10 2 口服 每天1次×14天 溶媒對照組×14天
  a，所用溶媒對照為0.5%HPMC E5 /0.5%PVP K30/0.2%SDS水溶液。 b，溶媒為生理鹽水。 c，80隻模型建立小鼠中挑選出70隻小鼠進行藥效試驗。 d，所有每天1次(QD)給藥組每天加一次溶媒給藥，以保證每組操作的一致性。 e，每天2次(BID)給藥間隔為8小時。
(5)臨床指標測定
動物免疫當天為第0天，從第2天至第10天每週三次記錄動物體重，第11天開始每天密切觀察記錄體重和臨床評分，評分標準見下表7： 表 7. EAE 臨床評分標準
分值 臨床症狀
0 正常表現，沒有明顯的疾病徵兆
1 尾巴下垂無力，後肢單側無力
2 尾巴下垂無力，雙後肢均無力步態蹣跚
3 單側後肢無力麻痺癱瘓
4 雙後肢均無力麻痺癱瘓
5 死亡
(6)樣品收集
用於藥效評價的75隻動物終點收取樣品在第28天進行，收取樣品時間點為上午給藥0.25 h。
每組5隻小鼠，安樂死後生理鹽水心臟灌流，再等體積的10%福馬林灌流，取小鼠脊髓，用10%福馬林溶液浸泡後進行組織切片，H&E (蘇木精-伊紅染色)和LFB (固藍染色)染色和病理評分。病理評分標準見表8。 表 8. 脊髓 H&E 和 LFB 病理評分標準
發炎
0 正常
1 軟膜發炎，＜5灶/切片
2 軟膜發炎，＞5灶/切片
3 開始有腦脊髓實質的發炎，＜5灶/切片(從軟膜向實質累及)
4 實質發炎，＜5灶/切片
5 實質發炎，＞5灶/切片(實質病灶較小)
6 實質發炎，＞5灶/切片(實質病灶較大)
7 實質發炎，有大的病灶，組織出現空洞
病灶面積
Leision Area %, 病灶累及面積占截面的百分比
脫髓鞘
0 無脫髓鞘
1 少量，散在的裸露的軸索
2 小灶裸露的軸索
3 多灶性裸露的軸索
4 融合的脫髓鞘病灶
5 廣泛的脫髓鞘
(7)統計學處理
實驗數據用Graph Pad Prism 7作圖，用平平均值±標準誤差表示(Mean ± SEM)表示，臨床評分曲線下面積分析用單因子變異數分析(One-way ANOVA)，p ＜ 0.05認為和模型組對比有顯著性差異。 (8)實驗結果
1)臨床評分和發病率 表9 化合物Ⅰ連續給藥多次給藥對小鼠EAE臨床評分的影響 (給藥14天，第13天-第27天)
天數 G1正常組 G2模型組     (Bid*14) G3***    (Qd+V*14) G4芬戈莫德 0.5 mg/kg    (Qd+V*14) G5化合物Ⅰ 3 mg/kg     (Bid*14) G6化合物Ⅰ 10 mg/kg    (Bid*14) G7化合物Ⅰ 20 mg/kg     (Bid*14) G8化合物Ⅰ 20 mg/kg   (Qd+V*14)
平均值 標準誤差 平均值 標準誤差 平均值 標準誤差 平均值 標準誤差 平均值 標準誤差 平均值 標準誤差 平均值 標準誤差 平均值 標準誤差
0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
2 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
4 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
7 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
11 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
12 0.00 0.00 0.00 0.00 0.10 0.10 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
13 0.00 0.00 0.30 0.15 0.20 0.13 0.20 0.13 0.20 0.13 0.20 0.13 0.30 0.15 0.20 0.13
14 0.00 0.00 1.00 0.26 0.70 0.21 0.70 0.21 0.40 0.16 0.40 0.16 0.60 0.22 0.60 0.22
15 0.00 0.00 1.60 0.40 1.30 0.33 1.30 0.33 0.60 0.16* 0.50 0.17** 0.80 0.25 1.10 0.31
16 0.00 0.00 2.10 0.41 1.70 0.47* 1.70 0.47 0.90 0.23** 0.60 0.22**** 0.90 0.28** 1.30 0.40
17 0.00 0.00 2.50 0.34 1.70 0.47*** 1.70 0.47 1.50 0.34* 0.50 0.22**** 1.00 0.30**** 1.40 0.34**
18 0.00 0.00 2.70 0.37 1.40 0.43**** 1.40 0.43*** 1.90 0.38 0.60 0.31**** 1.10 0.23**** 1.30 0.37***
19 0.00 0.00 3.00 0.33 1.30 0.40**** 1.30 0.40**** 1.90 0.41** 0.40 0.31**** 1.10 0.23**** 1.10 0.31****
20 0.00 0.00 2.70 0.30 1.00 0.39**** 1.00 0.39**** 1.30 0.40*** 0.30 0.3**** 0.90 0.28**** 0.80 0.29****
21 0.00 0.00 2.20 0.29 0.90 0.41**** 0.90 0.41*** 1.10 0.38** 0.30 0.21**** 0.80 0.29*** 0.70 0.26****
22 0.00 0.00 1.80 0.20 0.80 0.39*** 0.80 0.39* 1.10 0.38 0.30 0.21**** 0.50 0.31*** 0.40 0.16***
23 0.00 0.00 1.70 0.21 0.70 0.40*** 0.70 0.40* 1.00 0.33 0.40 0.22*** 0.50 0.31** 0.40 0.16***
24 0.00 0.00 1.30 0.21 0.30 0.15* 0.50 0.40 0.80 0.33 0.40 0.22* 0.30 0.3* 0.30 0.15*
25 0.00 0.00 1.30 0.21 0.30 0.15* 0.50 0.40 0.80 0.33 0.40 0.22* 0.30 0.3* 0.30 0.15*
26 0.00 0.00 1.30 0.26 0.30 0.15* 0.50 0.40 0.80 0.33 0.40 0.22* 0.30 0.3* 0.30 0.15*
27 0.00 0.00 1.30 0.26 0.30 0.15* 0.50 0.40 0.60 0.34 0.30 0.15* 0.30 0.3* 0.30 0.15*
小鼠免疫後第12天，小鼠開始出現臨床症狀。第13天分組後開始給藥。如圖1的A和表9所示，溶媒對照組的平均臨床評分逐漸升高，至第19天達到峰值，平均分值約為3.0分，證明本實驗EAE模型成功建立(圖1的A和表9)。與溶媒對照(Veh control)組相比，陽性藥***(DEX)對疾病的發展有著明顯的抑制作用，臨床評分自第15天至第27天均與溶媒對照組有顯著性差異，臨床評分曲線下面積AUC下降率為65%(圖1的B)。陽性藥芬戈莫德組的臨床評分自第17天至第23天均與溶媒對照組呈顯著性差異，臨床評分AUC下降率為49%(圖1的B)。
受試物化合物Ⅰ各劑量組均顯著降低EAE小鼠的臨床評分，其中3 mg/kg 每天2次(BID)組於第15天至第21天、10 mg/kg 每天2次(BID)組於第15天至第27天、20 mg/kg 每天2次(BID)組於第16天至第27天、20 mg/kg 每天1次(QD)組於第17天至第27天分別與溶媒對照組呈顯著性差異。化合物Ⅰ各給藥組相對溶媒對照組臨床評分AUC的抑制率分別為44% (3 mg/kg每天2次(BID))、77% (10 mg/kg每天2次(BID))、63% (20 mg/kg每天2次(BID))和60% (0 mg/kg每天1次(QD))(圖1的B)。因此，化合物Ⅰ能顯著改善EAE模型臨床症狀，起效劑量為3 mg/kg每天2次(BID)，並呈一定的劑量反應關係。10 mg/kg 每天2次(BID)組的治療效果優於***和芬戈莫德，這兩個陽性藥對臨床評分AUC的抑制率分別為65%和49%。 表10 連續給藥多次給藥對EAE小鼠發病率的影響(%) (給藥14天，第13天-第27天)
天數 G2溶媒對照組 G3地塞 米松 1 mg/kg PO G4芬戈 莫德 0.5 mg/kg G5化合 物Ⅰ 3 mg/kg G6化合物Ⅰ 10 mg/kg G7化合 物Ⅰ 20 mg/kg G8化合 物Ⅰ 20 mg/kg G1正常對照組
0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 0 0 0
11 0 0 0 0 0 0 0 0
12 0 10 0 0 0 0 0 0
13 30 20 20 20 20 30 20 0
14 70 60 60 40 40 50 50 0
15 70 60 80 60 50 60 70 0
16 90 60 80 70 50 60 70 0
17 100 50 80 80 40 70 80 0
18 100 50 70 90 40 80 70 0
19 100 50 70 100 20 80 70 0
20 100 50 60 70 10 70 50 0
21 100 50 50 60 20 60 50 0
22 100 40 50 60 20 30 40 0
23 100 30 40 60 30 30 40 0
24 90 30 20 50 30 10 30 0
25 90 30 20 50 30 10 30 0
26 90 30 20 50 30 10 30 0
27 90 30 20 30 30 10 30 0
此外，發病率結果顯示(表10)，溶媒對照組於第17天發病率為100%，陽性藥***和芬戈莫德組發病率均有所降低(圖1的C)。化合物Ⅰ給藥組均表現出延後發病和發病率降低，其中10 mg/kg每天2次(BID)組發病率最低；20 mg/kg每天2次(BID) 組在發病後期展現了持續抑制發病率的優勢(圖1的C)。
2)脊髓病理分析
實驗終點收集小鼠的脊髓，其中正常對照組2隻，其餘各組每組5隻。脊髓固定於福馬林，進行石蠟包埋和切片，每隻小鼠取2張切片，透過H&E和FLB染色對脊髓進行病理觀察並對細胞浸潤，病灶區和脫髓鞘進行評分。實驗表明，模型溶媒對照(Veh)組呈現出顯著的病理損傷，脊髓白質出現發炎細胞的浸潤和多灶性裸露的軸索。具體地，如圖2所示，模型組的細胞浸潤評分達4分，病灶區達15%，脫髓鞘評分達3.2。與EAE臨床評分結果相一致，不同劑量的受試物化合物Ⅰ都顯著抑制了EAE建模對脊髓的損傷，其中10 mg/kg 每天2次(BID)組治療效果在細胞浸潤(圖2的A)、病灶區範圍(圖2的B)和脫髓鞘(圖2的C)三方面都顯著優於陽性藥芬戈莫德組(圖2)。其中，小鼠脊髓H&E染色後對脊髓切片中細胞浸潤(A)和病灶區面積(B)進行統計。LFB染色後對脊髓切片中脫髓鞘程度評分(C)。數據以平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示。*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001, ****p＜0.0001, vs. 溶媒對照組(Vehicle)，單因子變異數分析(One-way ANOVA)。
病理分析結果表明，化合物Ⅰ各劑量組均能改善EAE模型引起的病理改變，其中化合物Ⅰ 10 mg/kg每天2次(BID)組對發炎細胞浸潤、病灶區範圍和脫髓鞘三方面的改善都優於陽性藥芬戈莫德組。
本發明中，結果表明對小鼠實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)模型有較好的治療作用，本發明為治療多發性硬化症和腦脊髓炎提供了新的藥物，有較大的臨床應用價值。 實施例 3化合物Ⅰ各劑量組均顯著降低脊髓STAT3磷酸化位準 (1)動物：C57BL/6小鼠，雌性，6-8周齡，無特定病原體(SPF)。由上海斯萊克實驗動物技術有限公司提供。 (2)受試化合物和試劑：
MOG35-55購於吉爾生化，貨號：51716；
IFA購於Sigma-Aldrich，貨號：F5506；
結核分枝桿菌 H37Ra，Difco，貨號：231141；
PTX(Pertussis toxin)購於List Biological Laboratories, 貨號：180235AIA； 醋酸***片由辰欣藥業提供，國藥准字：H37021898；
醋酸***片的配製方法：取醋酸***片溶於生理鹽水。
化合物Ⅰ由廣州嘉越醫藥科技有限公司提供；
化合物Ⅰ的配製方法： 稱取適量化合物Ⅰ直接溶於溶媒[0.5%(w/v)羥丙甲基纖維素(HPMC) E5/0.5%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP/ 0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉SDS水溶液]，在室溫下超音波震盪、攪拌約1小時，得到均勻、不透明的細顆粒懸浮液。每三天一配，4℃保存。 (3)EAE模型建立方法：
1)動物適應期過後打耳標標記小鼠，將小鼠背部剃毛。提前1-2天準備無菌的玻璃瓶3個和勻漿機分散刀頭；
2)配製免疫乳劑(含1 mg/ml MOG35-55和2 mg/ml 結核分枝桿菌)和PTX溶液配製(PTX粉末每支50 μg，加入PBS 1 mL，配成50 μg/mL儲備溶液，用前使用PBS稀釋至1 μg/mL，現配現用)；
3)動物免疫
85隻小鼠，隨機挑出5隻作為正常對照組，另外80隻異氟烷麻醉，在皮下注射100 μL免疫乳劑(含1 mg/ml MOG35-55和2 mg/ml 結核分枝桿菌的IFA)，分別在三個位點，包括頸部和腹股溝兩側，每點各注射約33 μL乳劑。動物注射乳劑當天定義為第0天。於注射乳劑後0小時(第0天)和48小時後(第2天)，每隻小鼠腹腔注射200 ng(即200 μL)PTX溶液(1 μg/mL)。 (4)分組與給藥 表11分組與劑量設計
組別 N c 受試物 劑量 (mg/kg) 給藥體積 (mL/kg) 濃度 (mg/mL) 給藥方式 給藥時間 d,e
G1：正常對照組 (Normal) 5 溶媒 a NA 10 NA 口服 每天2次×14天
G2：溶媒對照組 (Veh) 10 溶媒 a NA 10 NA 口服 每天2次 ×14天
G3：***組 (DEX) 10 *** b 1 10 0.1 口服 每天1次×14天 溶媒對照組×14天
G4：芬戈莫德組(Fingolimod) 10 芬戈莫德 b 0.5 10 0.05 口服 每天1次×14天 溶媒對照組×14天
G5：化合物Ⅰ 3 mg/kg BID組 10 化合物Ⅰ 3 10 0.3 口服 每天2次×14天
G6：化合物Ⅰ 10 mg/kg BID組 10 化合物Ⅰ 10 10 1 口服 每天2次 ×14天
G7：化合物Ⅰ 20 mg/kg BID組 10 化合物Ⅰ 20 10 2 口服 每天2次×14天
G8：化合物Ⅰ 20 mg/kg QD組 10 化合物Ⅰ 20 10 2 口服 每天1次×14天 溶媒對照組×14天
  a，所用溶媒對照為0.5%HPMC E5 /0.5%PVP K30/0.2%SDS水溶液。 b，溶媒為生理鹽水。 c，80隻模型建立小鼠中挑選出70隻小鼠進行藥效試驗。 d，所有每天1次(QD)給藥組每天加一次溶媒給藥，以保證每組操作的一致性。 e，每天2次(BID)給藥間隔為8小時。
(5)樣本採集和檢測
用於藥效評價的75隻動物(其中，5隻作為正常對照組，80隻模型建立小鼠中挑選出70隻小鼠進行藥效試驗)終點收取樣品在第28天進行，收取樣品時間點為上午給藥0.25 h。共收集如下樣本：
每組5隻動物，異氟烷麻醉後心臟取血，不進行灌流，安樂死後取樣。
取脊髓，直接-80℃保存，用於Western blot實驗，檢測STAT3, pSTAT3 和GAPDH的蛋白表現位準。 (6)實驗結果
實驗第28天上午給藥0.25 h後終點收取樣品，收集小鼠脊髓，包括正常對照組(n=3)、溶媒對照組(n=5)、陽性對照芬戈莫德組(n=5)和所有化合物Ⅰ給藥組(每組n=5)，透過Western blot檢測STAT3、pSTAT3和GAPDH的蛋白位準並使用GE Healthcare 1D quant densitometry software對條帶進行定量。STAT3的磷酸化位準(p-STAT3/STAT3)反應了脊髓發炎細胞浸潤和發炎反應的位準。與正常組相比，EAE模型溶媒對照組脊髓樣品STAT3磷酸化顯著提高(圖3的A、B)。如圖3的A、B所示，陽性藥芬戈莫德可以顯著抑制STAT3磷酸化至正常動物位準。與臨床評分一致，受試物化合物Ⅰ各劑量組均顯著抑制脊髓STAT3磷酸化位準，其中10 mg/kg每天2次(BID)和20 mg/kg 每天2次(BID)抑制效果最好，抑制率達86%(圖3的C)。其中，數據以平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示。**p＜0.01, ***p＜0.001, vs.溶媒對照組(Vehicle),單因子變異數分析(One-way ANOVA)。
結論：化合物Ⅰ各劑量組均顯著降低脊髓STAT3磷酸化位準，其中10mg/kg 每天2次(BID)和20 mg/kg每天2次(BID)抑制效果最好，抑制率約86%。 實施例 4化合物Ⅰ對hPBMC pSTAT1、pSTAT5抑制的IC50值 (nM) 1.細胞 表12 細胞
名稱 供應商 貨號或編號 批號
hPBMC stemcell 70025.3 2009428002
2.主要試劑 表13主要試劑
名稱 供應商 貨號或編號 儲存條件
Human IL-6 absin abs00808 -807
Human IL-2 absin abs00804 -807
人 pSTAT1抗體 BD 612564 41
人 pSTAT5抗體 BD 562077 42
固定液 BD 558049 43
破膜液 BD 558050 -202
其中，pSTAT1指的是STAT1磷酸化、pSTAT5指的是STAT5磷酸化。 3.實驗方法 1.藥物培育及細胞激素刺激
1)配製培養液：1640培養基+10%胎牛血清+1%青/鏈黴素+1%非必需胺基酸(百分比皆為體積比)
2)細胞37℃水浴解凍後離心，然後用培養液將細胞濃度調整為5×10 5個/mL。
3)將細胞懸浮液200 μL/孔接種到96孔圓底盤，37℃培育90 min。
4)加入藥物，37℃培育30 min。
5)分別加入10 ng/mL IL-6、4 ng/mL IL-2刺激細胞，37℃培育15 min。 4.細胞染色及檢測
1)將刺激結束後的細胞離心，用染色緩衝液(DPBS+2%牛血清蛋白)洗滌一次後加入抗體4血染色30 min(IL-6、IL-2刺激的加CD4抗體)。
2)染色緩衝液洗滌兩次後，加入固定液固定細胞，4色固定20 min。
3)染色緩衝液洗滌一次後，加入-20沖預冷的破膜液，4冷破膜30 min。
4)染色緩衝液洗滌兩次後，加入抗體4色染色30 min (IL-6、IL-2)
5)用染色緩衝液洗滌細胞兩次並重新懸浮，用流式細胞儀檢測CD4或CD33陽性細胞中的pSTAT1或pSTAT5 MFI值。 5.數據處理
1)計算Response%=100重(加藥樣品孔MFI值-Control孔MFI平均值)/(DMSO孔MFI平均值-Control孔MFI平均值)；
2)將Response%值帶入Graphpad prism 8軟體，使用log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)方法繪製抑制曲線，並得到樣品對應的IC50值。 6.實驗結果
化合物Ⅰ對hPBMC中IL-6誘導的pSTAT1位準和IL-2誘導的pSTAT5位準均有抑制活性，其抑制IC50分別為73.1和36.3 nM(表14)。 表14 藥物對pSTAT1、pSTAT5抑制的IC50值 (nM)
組別 IC50值 (nM)
01 IL-6誘導的pSTAT1 73.1
02 IL-2誘導的pSTAT5 36.3
其中，IL-2為介白素2；IL-6為介白素6。
結論：化合物Ⅰ對hPBMCpSTAT1、pSTAT5位準均有抑制活性。 實施例 5
實驗目的：化合物Ⅰ對NMO-IgG所致星型膠質細胞損傷模型分泌IL-6的抑制作用研究
實驗設計 1.動物：Wistar大鼠(孕鼠)購自北京維通利華實驗動物有限公司 2.供試品和對照品資訊 表15 供試品和陽性對照品資訊
化合物 貨號 批號 純度(%) 分子量 儲存條件 供應商
化合物Ⅰ NA CPo126337-01-04P-01-68-01 99.7 293 室溫、密封保存 廣州嘉越醫藥科技有限公司提供
甲潑尼松 T6580 117788 98.07 372.46 -20℃ 陶素生化
BAY11-7082 T1902 147885 97.91 207.25 -20℃ 陶素生化
將化合物溶於DMSO配製化合物儲存液，使用DMSO將化合物儲存液按比例梯度稀釋，配製系列1000X供試化合物溶液，然後用細胞培養基將1000X供試化合物溶液1:100稀釋後配製系列10X供試化合物溶液。最後，按照實驗孔盤加入樣品設計，每孔細胞分別加入對應體積的10X溶液，每個藥物濃度各2個重複孔。本實驗最終測試溶液(即1X溶液)所用化合物Ⅰ濃度範圍分別為20, 2.222, 0.247, 0.027 μM;甲潑尼松化合物濃度(即1X溶液)為30 μM；BAY 11–7082濃度(即1X溶液)為5 μM；每孔DMSO終濃度為0.1%。空白對照孔加入不含化合物的DMSO，終濃度為0.1%。 3.實驗步驟： (1)大鼠原代星型膠質細胞萃取分離與培養
1)原代星型膠質細胞的萃取分離：取1日齡新生大鼠大腦皮層製備混合膠質細胞培養液。新生大鼠處死後浸於酒精，剪皮、取腦、分離大腦皮層、研磨，去除結締組織，將混合後的膠質細胞透過70 μm細胞過濾器過篩，接種於經多聚離胺酸包覆的細胞培養盤上，培養基含10%熱滅菌胎牛血清、100 U/mL青黴素和100 mg/mL鏈黴素的DMEM，體外培養約12天後細胞達到融合，透過振搖將小膠質細胞、內皮細胞和少突膠質細胞從混合膠質細胞中去除。隨後透過兩次胰蛋白酶消化和接種培養盤，提升星形膠質細胞純度，細胞純度＞95%。
2)星型膠質細胞的培養：分離得到的星型膠質細胞可在37 °C、5%二氧化碳培養箱中培養，每3~4天換液一次。星型膠質細胞也可經胰蛋白酶(0.25%)消化，凍存於液態氮中備用。 (2)NMO-IgG的獲得與分離純化
1)收集符合2015修訂後的NMOSD國際最新診斷標準的AQP4-IgG陽性NMOSD患者血清樣本12例(倫理批號：KY 2021-069-01)，符合NMOSD診斷標準的所有患者血清AQP4-IgG抗體檢測方法均採用目前國際認可的間接免疫螢光染色法(即cell based assay，CBA法)判定陰陽。血清樣品經0.22 μm無菌過濾，保存於−80°C，純化前經56℃滅菌30 min。
2)血清中抗體(IgG)純化
用HiTrap蛋白G-HP(GE Healthcare)管柱從無菌濾過的血清池(AQP4-IgG陽性的NMOSD)中分離人源NMO-IgG。血清樣品以結合緩衝液按1：1稀釋，以結合緩衝液填充純化管柱之後，加入血清樣品，隨後用結合緩衝液再次洗滌管柱，並按照說明書要求洗提抗體。最終，抗體集中在截止量為10,000 MW的Amicon Ultra-4離心機(微孔)上。濃縮的免疫球蛋白經0.22 μm濾膜過濾。用BCA法測定濃縮物的蛋白濃度，儲存在−80℃。由NMOSD患者血清萃取的總IgG為NMO-IgG(含AQP4-IgG)，實驗時以250 μg/ml的蛋白濃度刺激細胞。
3)Control-IgG：
Control-IgG (Jackson ImmunoResearch，009-000-002)為商品化試劑，儲存液濃度為11.5 mg/ml，實驗時工作濃度250 μg/ml。 (3)藥物培育和樣品檢測
1)藥物培育
星型膠質細胞培養或復蘇後培養至第2天接種於24孔盤，細胞密度(1.5×10 5個/孔)，受試化合物化合物Ⅰ、甲潑尼松、BAY11-7082按照上述濃度與細胞預先培育30 min。然後各組繼續以NMO-IgG(工作終濃度為250 μg/ml)刺激細胞24小時以引發星型膠質細胞損傷。正常人源Control-IgG (CON-IgG，工作終濃度為250 μg/ml)刺激作為陰性對照。
2)樣品收集檢測
NMO-IgG刺激細胞處理24小時後，收集上清液。應用酵素聯免疫吸附法(ELISA)，按照IL-6 ELISA套組說明書(美國R&D，#RD6000B)進行IL-6檢測，測定各組樣本的吸光度(OD值)，透過標準曲線擬合，計算得出各實驗組IL-6濃度。吸完上清液的細胞培養盤使用CCK8法檢測各組細胞存活率。按CCK8套組(北仁化工科技有限公司，#CK04)說明書操作步驟，測定各組細胞的吸光度(OD值)，計算得出各實驗組在培育結束後細胞存活率。 (4)數據分析
1)細胞可活性百分比：透過CCK8光密度值(OD值)，計算各測試濃度相對於空白對照組(NMO-IgG + DMSO)的細胞可活性百分比%，計算公式為：細胞可活性百分比%=(待測濃度孔OD值-空培養盤背景值)/(空白對照組OD值-空培養盤背景值)*100。
2)IL-6抑制率：
首先透過ELISA光密度值，繪製標準曲線並計算出各樣品的絕對濃度。
根據各樣品絕對濃度計算各測試濃度相對於空白對照組(NMO-IgG + DMSO)分泌IL-6的相對抑制百分比，即IL-6抑制率%，計算公式為：IL-6抑制率%=(空白對照組絕對濃度-待測濃度孔絕對濃度)/(空白對照組絕對濃度-陰性對照孔絕對濃度)*100。 (5)實驗結果
CCK8實驗結果顯示，在NMO-IgG損傷星型膠質細胞模型中，供試化合物、化合物Ⅰ與細胞共培育24小時，對細胞可活性無抑制作用(圖4和表16)，最高測試濃度為20 μM。甲潑尼松在測試濃度30 μM下，對細胞可活性有抑制趨勢。BAY化合物在測試濃度5 μM下，細胞可活性百分比顯著降低至39.5%。 表16化合物Ⅰ和對照化合物對星形膠質細胞可活性的影響
細胞可活性百分比% CON-IgG(陰性對照孔) NMO-IgG1 (空白對照孔) NMO-IgG2 (空白對照孔) 化合物Ⅰ (20μM) 化合 物Ⅰ (2.222μM) 化合 物Ⅰ (0.247μM) 化合 物Ⅰ (0.027μM) 甲潑尼松(30μM) BAY 11-7082 (5μM)
平均值 120.5 97.7 102.3 99.4 99.7 105.0 111.7 81.7 39.5
標準誤差 1.4 0.1 0.1 0.8 3.3 1.1 1.0 3.0 4.4
IL-6 ELISA結果顯示，化合物Ⅰ對NMO-IgG損傷星型膠質細胞所致IL-6釋放具有明顯抑制作用(圖5和表17)，在測試濃度20μM下，抑制率約為98.8%。甲潑尼松在測試濃度30μM下，對IL-6抑制率約為74.8%。BAY化合物在測試濃度5μM下，對IL-6抑制率約為104.2%。 表17化合物Ⅰ和對照化合物對星形膠質分泌IL-6的影響
IL-6抑制率% NMO-IgG1 (空白對照孔) NMO-IgG2 (空白對照孔) 化合 物Ⅰ (20μM) 化合 物Ⅰ (2.222μM) 化合 物Ⅰ (0.247μM) 化合 物Ⅰ (0.027μM) 甲潑尼松(30μM) BAY 11-7082 (5μM)
平均值 -6.3 6.3 98.8 94.3 54.0 30.4 74.8 104.2
標準誤差 0.3 0.3 15.7 13.9 23.0 18.7 7.4 2.6
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，在不違背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
圖1為受試物化合物Ⅰ連續多次給藥對小鼠EAE臨床評價的影響。(數據以平均值或平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示，*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001 VS G2)。
圖2為受試物化合物Ⅰ連續多次給藥對小鼠脊髓病理評分的影響(數據以平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示，*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001, ****p＜0.0001 VS G2)。
圖3為受試物化合物Ⅰ連續多次給藥對脊髓STAT3磷酸化位準的影響(數據以平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示，**p＜0.01, ***p＜0.001 VS G2)。
圖4為在NMO-IgG損傷星型膠質細胞模型中，化合物Ⅰ與細胞共培育24小時，對細胞可活性的影響。
圖5為化合物Ⅰ對NMO-IgG損傷星型膠質細胞所致IL-6釋放的影響。
Figure 111118989-A0101-11-0001-1

Claims (10)

  1. 一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備STAT磷酸化抑制劑中的應用：
    Figure 03_image001
    。
  2. 一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療和/或預防化膿性脊髓炎、急性脊髓炎或腦脊髓炎的藥物中的應用：
    Figure 03_image001
    。
  3. 如請求項2所述的應用，其特徵在於，所述腦脊髓炎為急性播散性腦脊髓炎、亞急性壞死性脊髓炎、急性壞死出血性腦脊髓炎、小兒急性播散性腦脊髓炎或結核性脊髓炎。
  4. 一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療和/或預防自體免疫性疾病的藥物中的應用：
    Figure 03_image001
    ； 所述自體免疫性疾病可為中樞神經系統的自體免疫性疾病或視神經系統的自體免疫性疾病；所述中樞神經系統的自體免疫性疾病可為視神經脊髓炎或多發性硬化，例如視神經脊髓炎、復發緩解多發性硬化、繼發進行性多發性硬化、原發進行性多發性硬化、進行性復發性多發性硬化、臨床單一症候群或放射學單一症候群；所述視神經系統的自體免疫性疾病可為視神經脊髓炎。
  5. 一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療和/或預防具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的化膿性脊髓炎、急性脊髓炎或腦脊髓炎的藥物中的應用：
    Figure 03_image001
    ； 所述具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的腦脊髓炎可以為急性播散性腦脊髓炎、亞急性壞死性脊髓炎、急性壞死出血性腦脊髓炎、小兒急性播散性腦脊髓炎或結核性脊髓炎。
  6. 一種如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療和/或預防具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的自體免疫性疾病的藥物中的應用：
    Figure 03_image001
    ； 所述具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的自體免疫性疾病可為中樞神經系統的自體免疫性疾病或視神經系統的自體免疫性疾病；所述具有STAT磷酸化位準異常升高特徵的中樞神經系統的自體免疫性疾病可為視神經脊髓炎或多發性硬化，例如視神經脊髓炎、復發緩解多發性硬化、繼發進行性多發性硬化、原發進行性多發性硬化、進行性復發性多發性硬化、臨床單一症候群或放射學單一症候群；所述視神經系統的自體免疫性疾病可為視神經脊髓炎。
  7. 如請求項1、5或6所述的應用，其特徵在於，所述的STAT磷酸化為STAT1磷酸化、STAT3磷酸化和STAT5磷酸化中的一種或多種。
  8. 如請求項1~7任一項所述的應用，其特徵在於，其滿足下述條件的一種或多種： (1)所述的如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽為所述如請求項1所述的抑制劑或如請求項2~6任一項所述的藥物的有效成分之一或者唯一有效成分； (2)所述如式I所示化合物或其藥學上可接受的鹽透過口服給予受試者； (3)所述的如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽包含藥學上可接受的賦形劑； (4)所述如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽的施用劑量為1~120 mg/kg/d； (5)所述如式I所示化合物或其藥學上可接受的鹽的單次施用劑量為1-400 mg； (6)所述如式I所示化合物或其藥學上可接受的鹽的施用頻率為1次/日、2次/日或3次/日。
  9. 如請求項1~7任一項所述的應用，其特徵在於，其滿足下述條件的一種或多種： (1)所述如式I所示化合物或其藥學上可接受的鹽製成的劑型為片劑或皮下注射劑； (2)所述如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽的施用劑量為3~100 mg/kg/d； (3)所述如式I所示化合物或其藥學上可接受的鹽的單次施用劑量為3 mg、6 mg、9 mg、100 mg或400 mg； (4)所述如式I所示化合物或其藥學上可接受的鹽的施用頻率為1次/日或2次/日。
  10. 如請求項1~7任一項所述的應用，其特徵在於，所述如式Ⅰ所示化合物或其藥學上可接受的鹽的施用劑量為3 mg/kg/d、6 mg/kg/d、10 mg/kg/d 、20 mg/kg/d、40 mg/kg/d、60 mg/kg/d或90 mg/kg/d。
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