TW202207957A - 具有優異的耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果的新型短雙歧桿菌idcc 4401菌株及其死菌體id-bbr4401 - Google Patents

具有優異的耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果的新型短雙歧桿菌idcc 4401菌株及其死菌體id-bbr4401 Download PDF

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Abstract

本發明關於具有優異的耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果的新型短雙歧桿菌IDCC 4401菌株及其死菌體ID-BBR4401，本發明的新菌株短雙歧桿菌IDCC 4401菌株不僅具有優秀的減少體內膽固醇的效果，而且與現有公知的短雙歧桿菌不同，具有很高水準的耐酸性及耐膽汁性，因此在動物消化道內很好地表現出菌株所具有的功能性並且繁殖的能力優秀，提供持續有效地減少體內膽固醇的功能性。並且，通過熱處理上述菌株製備的死菌體(ID-BBR4401)的膽固醇結合能力與活菌的水準相當甚至更為優秀，而且具有很高水準的與膽汁酸的結合能力，表現出向體外排出膽汁酸的顯著功效。

Description

具有優異的耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果的新型短雙歧桿菌IDCC　4401菌株及其死菌體ID-BBR4401
本發明要求申請日為2020年6月30日的韓國專利申請10-2020-0080588的優先權。本發明引用上述韓國專利申請的全文。
本發明關於具有優異的耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果的新型短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）及其死菌體ID-BBR4401，更詳細地，關於上述新型短雙歧桿菌IDCC 4401菌株或其死菌體ID-BBR4401的預防、改善及治療血脂異常症的用途和包含上述菌株作為有效成分的清腸用組合物、益生菌組合物、飼料用組合物以及發酵製品。
血脂異常症是指血中總膽固醇、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)膽固醇、中性脂肪增加的狀態，或者高密度脂蛋白(High density lipoprotein, HDL)膽固醇減少的狀態。血脂異常症是包括高脂血症、高膽固醇血症、高中性脂肪血症在內的廣義的疾病名稱，其中，高膽固醇血症是指因血中膽固醇增加的狀態而總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇顯高的疾病。因膽固醇的代謝障礙或膽固醇的攝取過多而使血清總膽固醇達到最高值時，稱為高膽固醇血症。
雖然膽固醇是人體必需的成分，但其代謝異常與成人病，尤其與動脈硬化症的發病有很大關係。已知成人體內約有140g的膽固醇，其中每天代謝約1％，其重要的代謝產物是膽汁酸。膽汁酸不止是膽固醇的代謝產物那麼簡單，它還在消化道內形成包括膽固醇在內的脂質和微胞(micelle)並起到促進其吸收的作用。在上述微胞的形成中，膽汁酸是必不可少的，因此若沒有膽汁酸，會引起脂質或維生素等脂溶性物質的吸收障礙。分泌的膽汁酸表現出從腸道吸收後回到肝，再次分泌到膽汁中的腸-肝迴圈。已知在上述迴圈中，若膽汁酸未被再次吸收而***出去，則為了生物合成膽汁酸，作為前體的膽固醇的需求量增加，從而使體內的膽固醇數值降低。
通常，將血清（血漿）中的膽固醇濃度為220mg/dL～250mg/dL以上，或者低密度脂蛋白膽固醇的濃度為160mg/dL以上的情況判斷為高膽固醇血症。若高膽固醇狀態長期延續，則沉積於動脈壁引起粥樣硬化，成為心肌梗塞或腦血栓症的病因。並且，沉積於結合組織引起黃瘤，或者引起包括膽固醇結石在內的膽結石症。
部分高膽固醇血症可以根據患者的情況和其症狀的程度使用藥物治療，其中最常用的藥物是他汀類藥物。他汀類藥物作為3-羥基-3甲基戊二醯輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，具有抑制膽固醇合成的效果（韓基勳等，他汀類藥物臨床研究的根據，韓國脂質動脈硬化學會治療方針委員會(2010)14頁～15頁）。他汀類藥物依賴容量地減少低密度脂蛋白膽固醇和中性脂肪，並部分增加高密度脂蛋白膽固醇。上述他汀類藥物有消化不良、頭痛、疲倦、關節痛等副作用，由於有肌肉萎縮的危險，因此若出現肌肉症狀需接受血液檢查，可能誘發肝功能障礙，因此要在藥物處方前、服用2個月至3個月後進行肝功能檢查，並且在此後每隔一年檢查一次。
因此，一直在研究無副作用並更為安全的材料，近來，正在進行很多有關與飲食療法並行的功能食品等的研究。與此相應地，使用益生菌菌株的研究領域中的嘗試成為致力於改善高膽固醇血症的研究中的組成部分。
另一方面，乳酸菌死菌體作為與活菌相反的概念，是指對通過發酵獲得的活菌及其代謝產物進行熱處理等來使菌處於不能生長的狀態(Jae-GuSeo, etal.，Development of Probiotic Productsand Challenges, KSBB Journal 2010. 25：303～310)。實際上，活菌在經口服後到達腸道之前就已死去很多數量了。這種情況在上述菌對耐酸性及耐膽汁性之類的消化器官內部環境沒有抵抗性時尤為突出。若以常規方式滅活化活菌，活菌所具有的多種活性中的一部分或全部會通過體內消化器官的環境等因素引起變化。因此，在期待所要達成的特定生理活性的優點而給藥活菌時，可能無法根據所要達成的具體生理活性的種類和菌來按照所要實現的那樣在體內穩定地實現相關活性。這雖可以通過過度的給藥量來延續，但可能因此造成副作用等問題。並且，由於在保管時活菌會因溫度而導致菌體的變質，因此，從保存性的層面來看，可以說保持活菌製劑活性的穩定性是個問題。
雖有報告說有為了克服上述活菌製劑的問題而利用死菌體的技術，但實質上在利用死菌的技術中，根據所要獲得的生理活性的種類，上述技術根據具體菌體的種類、滅活的方法等多種因素而需要高度的特異性。
於是，本發明人在研究導入體內時穩定並且表現出高水準的降低膽固醇的能力的乳酸菌材料製劑的過程中，發掘出膽固醇結合能力突出的新菌株—短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP），上述菌不僅耐酸性及耐膽汁性非常突出，而且由其製備的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株的死菌體（即ID-BBR4401）在血脂異常症動物模型中表現出異常高水準的降低膽固醇的功效，從而完成了本發明。
由此，本發明的目的在於提供短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）或其死菌體，具有耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果。
本發明的再一目的在於，提供用於預防或治療血脂異常症的藥學組合物，包含短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）、其培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體中的一種以上作為有效成分。
本發明的另一目的在於，提供用於預防或改善血脂異常症的食品組合物，包含短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）、其培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體中的一種以上作為有效成分。
本發明的又一目的在於，提供清腸用組合物、益生菌組合物、飼料用組合物以及發酵製品，包含短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）或其培養物作為有效成分。
為了實現上述目的，本發明提供具有耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）或其死菌體。
為了實現本發明的再一目的，本發明提供用於預防或治療血脂異常症的藥學組合物，包含短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）、其培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體中的一種以上作為有效成分。
為了實現本發明的另一目的，本發明提供用於預防或改善血脂異常症的食品組合物，包含短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）、其培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體中的一種以上作為有效成分。
為了實現本發明的又一目的，本發明提供清腸用組合物、益生菌組合物、飼料用組合物以及發酵製品，包含短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）或其培養物作為有效成分。
以下，詳細說明本發明。
本發明提供短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）或其死菌體，具有耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果。
在本發明中，術語「血脂異常症」是指血中總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、中性脂肪增加的狀態，或者高密度脂蛋白膽固醇減少的狀態，是包括高脂血症、高膽固醇血症、高中性脂肪血症全部在內的含義。優選地，上述血脂異常症可以為高膽固醇血症。
短雙歧桿菌IDCC 4401菌株的特徵在於，不僅對膽固醇本身的吸附能力突出，而且具有膽鹽水解酶(BSH)的活性，與以膽固醇為前體的膽汁酸的結合能力也很優秀。因此，其特徵在於，不僅具有優異的減少（降低）體內膽固醇的功能性，還具有優異的耐酸性及耐膽汁性。上述特徵將在本發明的說明書通過實施例很好的表現出來。
在本發明的一實施例中，通過與現有的表現出具有膽固醇結合能力的其他菌種及相同的菌種相比較，確認本發明的新菌株短雙歧桿菌(B. breve)IDCC 4401具有非常優秀的膽固醇結合能力。
在另一實施例中，通過與其他短雙歧桿菌相比較，確認本發明的新菌株短雙歧桿菌IDCC 4401不僅在pH2.5高酸性環境中具有優秀的繁殖能力，而且在0.5％的高濃度的膽汁環境中也表現出優秀的繁殖能力。考慮到已知小腸中的膽汁通常為0.06％，本發明的新菌株具有非常優秀的耐膽汁性。
上述「短雙歧桿菌IDCC 4401菌株」不僅為使用培養基獲得的活菌本身，還包括本發明所屬技術領域已知的乳酸菌的任意加工形態（尤其是活菌的加工形態），包括例如乾燥物、冷凍品等，但不限定於此。
在本發明中，上述「短雙歧桿菌IDCC 4401菌株的死菌體」也可以稱為「ID-BBR4401」，本發明的死菌體可以為通過包括熱處理在內（通過熱處理的）的滅活化方式製備的。上述熱處理可以僅以從培養液分離獲得的活菌體為物件來進行，或能夠以包含上述活菌體的培養液為對象來進行。上述熱處理溫度只要是在保持菌體的性狀的前提下滅菌其他普通細菌的條件就不受特別限制，可以在80℃至150℃的溫度下進行，優選地，可以在80℃至110℃的溫度下進行。
上述熱處理的時間只要是在考慮上述溫度條件的前提下能夠獲得本發明所屬技術領域具有通常知識者所要達成的製備品質的條件就不受特別限制，優選地，可以進行1小時至2小時。若小於1小時，則菌不會被完全殺死，若大於2小時而進行長時間的加熱，則會在菌的表面引起變性而無法表現出所要達成的效果。
在用於製備上述死菌體的熱處理過程中，本發明所屬技術領域具有通常知識者可以在不給本發明死菌的減少膽固醇的能力帶來影響的情況下附加用於製備效率的任意前處理或追加條件。作為一例，在上述熱處理前，可以向活菌體加入蒸餾水來混合。若蒸餾水的量小於菌體的重量或者不加入蒸餾水，則菌體受熱的影響多而使原料的顏色變深，相反，若加入菌體重量1倍至2倍的蒸餾水，則原料的顏色不會變質，使感官上變得優秀。
最優選地，本發明的死菌體可以通過將活菌體在水中加熱至80℃至90℃來製備。更具體地，上述死菌體可以通過如下方法製備：離心分離短雙歧桿菌IDCC 4401菌株的培養液來分離為活菌體和培養濾液，加入上述的短雙歧桿菌IDCC 4401活菌體的重量1倍至2倍的蒸餾水懸浮後，加熱至80℃至90℃而製備。
上述滅活化的菌體可以經過用於製備死菌製劑（劑型）的任意追加過程，作為一例，可以進行濃縮、乾燥等。只要是本發明所屬技術領域中用來乾燥乳酸菌的方法，上述乾燥的種類就不受特別限制，可以為例如熱（風）乾燥、冷凍乾燥等方法。
上述本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株的死菌體(ID-BBR4401)的特徵在於，表現出穩定並高水準的降低膽固醇的功效。尤其是本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株與其他短雙歧桿菌菌株不同，其特徵在於，即使通過熱處理進行滅活化，（在活菌的情況下，當考慮培養期間菌體數量的增加時）與膽固醇的結合能力與活菌體同樣優秀。不僅如此，上述死菌體(ID-BBR4401)與膽汁酸也具有高水準的結合能力，在膽汁酸體的體外排出中表現出的顯著功效。ID-BBR4401也與結合膽汁酸(conjugated bile acid)結合來向體外排出的這一事實，與現有已知具有降低膽固醇能力的乳酸菌活菌體的機制不同的，該機制是上述乳酸菌活菌體通過膽鹽水解酶(BSH，bile salt hydrolase)活性與向小腸分泌的膽汁酸結合(deconjugation)而轉換為游離膽汁酸(bile acid)，上述游離膽汁酸比結合膽汁酸的再吸收能力降低，從而向體外排出。
因此，本發明的死菌體(ID-BBR4401)不僅對體內膽固醇，尤其是對低密度脂蛋白膽固醇的降低效果非常突出，而且在體內（尤其是在肝中）減少中性脂肪的效果顯著，因此在血脂異常症的預防及治療中表現出優秀的功效。
這將通過本發明說明書中的實施例很好的表現出來。
在本發明的一實施例中，將現有的具有降低膽固醇的效果的短雙歧桿菌菌株與本發明的IDCC 4401菌株的活菌以相同的方法進行熱處理並滅活化後，測定它們降低膽固醇的能力（膽固醇附著能力）。其結果，考慮到在活菌在培養期間生長而使菌體數比死菌多的情況，在相同的單位菌體數量的前提下，剩餘膽固醇最低的為本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體(ID-BBR4401)，與其他短雙歧桿菌死菌體相比，確認到表現出非常卓越的降低膽固醇的能力（膽固醇附著能力），尤其是本發明的ID-BBR4401與其他短雙歧桿菌菌株的活菌相比，表現出顯著優秀的降低膽固醇的能力。
在本發明的另一實施例中，確認上述死菌體(ID-BBR4401)對血脂異常症（高脂血症）動物模型的效果。其結果，確認到本發明的ID-BBR4401表現出減少體內膽固醇(TC)，尤其是減少低密度脂蛋白膽固醇的效果，不僅如此，還確認到在肝中減少中性脂肪(TG)水準的效果。
由此，本發明提供用於預防、改善或治療血脂異常症的組合物，包含短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）、其培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體中的一種以上作為有效成分。
在本發明中，術語「培養」是指為了在適當地人工調節的環境條件下繁殖微生物的所有行為，在本發明中，作為包括「發酵」在內的概念，上述術語「培養物」為包括「發酵物」在內的含義，包括在培養基中培養的培養液本身（即包含菌的培養液本身），或者對上述培養液施加熱處理的加工物等從培養液中派生出來的加工物。優選地，本發明的培養物可以為包含短雙歧桿菌IDCC 4401菌的培養液或對上述培養液施加熱處理的加工物。
在本發明中，上述組合物可以包括包含短雙歧桿菌IDCC 4401（寄存編號：KCTC13169BP）、其培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體的任意形態的組合物，優選地，上述組合物可以為食品組合物或藥學組合物，但不限定於此。
在上述組合物為食品組合物的情況下，可以直接添加短雙歧桿菌IDCC 4401（寄存編號：KCTC13169BP）、其培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體，或者與其他食品或食品成分一同使用，可以根據常規方法適當地使用。
本發明的食品組合物包括常規意義上的所有食品，包括功能食品(functional food)、營養補充劑(nutritional supplement)、保健食品(health food)以及食品添加劑(food additives)等所有形態。上述類型的食品組合物可以根據本發明所屬技術領域公知的常規方法製備為各種形態。
本發明的食品組合物可以包括保健功能食品。本發明所使用的術語「保健功能食品」是指使用具有對人體有益的功能性的原料或成分製備及加工為片劑、膠囊、粉末、顆粒、液體及丸等形態的食品。其中，所謂「功能性」是指對人體的結構及功能的調節營養素或生理學作用等之類的保健用途有益的效果。本發明的保健功能食品可以通過本發明所屬技術領域通常使用的方法製備，在上述製備過程中可以添加本發明所屬技術領域通常添加的原料及成分。
並且，上述保健功能食品的劑型只要是認可為保健功能食品的劑型就可以不受限地製備。本發明的食品用組合物可以製備為多種形態的劑型，與普通藥品不同，以食品為原料具有不會發生長期服用藥品時可能發生的副作用等的優點，並且可攜帶性突出，因此本發明的保健功能食品可以作為用於促進改善或治療血脂異常症的效果的輔助劑來攝取。
例如，可以將保健功能食品製備為包含本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401或其死菌體的茶、果汁及飲劑的形態來飲用，或者通過顆粒化、膠囊化及粉末化來攝取。並且，本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401或其死菌體可以與公知的具有預防、改善或治療血脂異常症的效果的物質或活性成分混合來製備為組合物的形態。
並且，本發明的食品組合物可以包含多種營養劑、維生素、電解質、風味劑、著色劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體增稠劑、pH調節劑、穩定劑、防腐劑、甘油、酒精、碳酸飲料中使用的碳酸化劑等。此外，還可以包含天然果汁、用於製備果汁飲料及蔬菜飲料的果肉。上述成分可以單獨或混合使用。上述添加劑的比例不是很重要，相比於100重量份的本發明的食品組合物，通常在0.01重量份～0.3重量份的範圍內選擇，但不限定於此。
並且，與普通飲料相同，本發明的食品組合物可以包含多種香味劑或天然碳水化合物作為追加成分。上述碳水化合物為葡萄糖、果糖之類的單糖，麥芽糖、蔗糖之類的二糖以及糊精、環糊精之類的多糖，木糖醇、山梨糖醇、赤蘚糖醇等糖醇。甜味劑可以使用索馬甜、甜葉菊提取物之類的天然甜味劑，或者糖精、阿巴斯甜之類的合成甜味劑等。上述天然碳水化合物的比例通常可以為每100mL的本發明的組合物包含約0.01g～0.04g，優選地，可以包含0.02g～0.03g，但不限定於此。
本發明的食品組合物中短雙歧桿菌IDCC 4401活菌或其死菌體的混合量可以根據其使用目的（預防、保健或治療性處置）而適當地決定。作為一例，在將本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401活菌或其死菌體製備為食品或飲料時，每1g（或ml）上述特定食品材料中可以添加1×105 個至1×1011 個（菌數）量的本發明的菌，優選地，可以添加1×106 個至1×1010 個量的本發明的菌，但不限定於此。並且，包含短雙歧桿菌IDCC 4401活菌或其死菌體的食品組合物的一天攝取量，以菌體數為基準，為1×105 CFU/kg至1×1010 CFU/kg，優選地，為1×106 CFU/kg至1×109 CFU/kg，可一日攝取一次，也可以分為多次攝取，但不限定於此。
在本發明的食品組合物中，菌株的有效用量能夠以藥學組合物的有效用量為準來使用，在以保健及衛生或健康調節為目的為長期服用的情況下，可以為上述範圍以下，有效成分在安全性層面毫無問題，因此也能夠以上述範圍以上的量來使用。
在本發明中，若上述組合物為藥學組合物，則可以單獨包含短雙歧桿菌IDCC 4401（寄存編號：KCTC13169BP）、其的培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體，或者還包含一種以上的藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
藥學上可接受的載體還可以包括例如口服給藥用載體或胃腸外給藥用載體。口服給藥用載體可以包括乳糖、澱粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。並且，胃腸外給藥用載體可以包括水、適當的油、生理鹽水、液體葡萄糖及乙二醇等，還可以包含穩定劑及保存劑。適當的穩定劑有亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸之類的抗氧化劑。適當的保存劑有苯扎氯銨、對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯及三氯叔丁醇。此外的藥學上可接受的載體可以參考如下文獻中記載的內容：Remington's Pharmaceutical Sciences, 19thed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995。
本發明的藥學組合物可以通過任意方法向包括人類在內的哺乳動物給藥。例如，可以口服或胃腸外給藥。胃腸外給藥可以通過靜脈內、肌肉內、動脈內、骨髓內、硬膜內、心臟內、經皮、皮下、腹腔內、鼻腔內、腸道、病灶、舌下或直腸內給藥。
本發明的藥學組合物可以根據上述給藥途徑劑型化為口服給藥用製劑或胃腸外給藥用製劑。在口服給藥用製劑的情況下，本發明的組合物可以使用本發明所屬技術領域公知的方法劑型化為粉末、顆粒、片劑、糖衣片劑、膠囊劑、液劑、凝膠劑、糖漿劑、漿劑、懸浮液等。例如，口服用製劑可以通過將活性成分與固體賦形劑配合後將其粉碎，而後添加適當的輔助劑後加工為顆粒混合物來獲得片劑或糖的提純物。適當的賦形劑的例有包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇及麥芽糖醇等在內的糖類和包括玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉及馬鈴薯澱粉等在內的澱粉類，包括纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及羥丙甲基纖維素等在內的纖維素類，包括明膠、聚乙烯吡咯烷酮在內的填充劑。並且，還可以根據情況添加交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或海藻酸鈉等作為崩解劑。進而，本發明的藥學組合物還可以包含抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑及防腐劑等。
在胃腸外給藥用製劑的情況下，可以使用本發明所屬技術領域公知的方法劑型化為注射劑、霜劑、乳劑、外用軟膏劑、油劑、保濕劑、凝膠劑、氣霧劑及鼻腔吸入劑的形態。上述劑型記錄在作為在所有製藥化學中通常公知的處方書的文獻「Remington's Pharmaceutical Science，15th Edition, 1975. Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania 18042，Chapter 87：Blaug, Seymour」中。
本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401或其死菌體的總有效量可以作為單次給藥量(single dose)來向患者給藥，也可以通過以多次給藥量(multiple dose)進行長期給藥的分次治療方法(fractionated treatment protocol)來給藥。本發明的藥學組合物的有效成分的含量可根據疾病的程度而不同。優選地，短雙歧桿菌IDCC 4401或其死菌體的全部用量，以固體成分含量為基準，可以每天給藥患者每公斤體重約0.01ug至1000mg的量，最優選地，可以每天給藥患者每公斤體重0.1ug至100mg的量。然而，上述本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401或其死菌體的用量不僅要考慮藥學組合物的給藥途徑及治療次數，還要考慮患者的年齡、體重、健康狀態、性別、疾病的嚴重程度、飲食及代謝等多種因素來決定對患者的有效用量，在考慮上述因素的情況下，本發明所屬技術領域具有通常知識者可以根據將上述本發明的菌株及其死菌體用作預防、改善或治療血脂異常症的製劑的特定用途來決定適當有效的給藥量。只要能夠體現本發明的效果，本發明的藥學組合物在劑型、給藥途徑及給藥方法上不受特別限制。
並且，本發明提供清腸用組合物、益生菌組合物、飼料用組合物及發酵製品，包含上述菌株或其培養液作為有效成分。在上述組合物提供為清腸用或飼料用的情況下，本發明的上述菌株不僅能以活菌的形態提供，還能夠以死菌體的形態提供。
本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株可以用於增進人類及動物的健康的用途，即，可以用作清腸用、益生菌或飼料用組合物。上述組合物包含上述菌株本身或其培養物等作為有效成分，還可以包含賦形劑或載體。組合物內上述短雙歧桿菌IDCC 4401菌株的含量可以根據組合物的用途及劑型的不同而不同。本發明的清腸用或益生菌組合物可以製備為多種劑型，並通過多種方法以多種劑型給藥。例如，可以將短雙歧桿菌IDCC 4401菌株或其培養物與藥劑學領域通常使用的載體載體及香料混合製備為片劑(tablet)、藥片(troche)、膠囊(capsule)、藥水(elixir)、糖漿(syrup)、散劑(powder)、懸浮劑(suspension)或顆粒劑(granule)等形態並給藥。可以使用結合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、可溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮化劑等作為載體。
給藥方式可以使用口服、胃腸外或塗敷法，優選地，可以使用口服給藥。並且，給藥用量可以根據活性成分的吸收度、滅活率及代謝速度、被給藥者的年齡、性別、狀態等適當地選擇。
並且，本發明的飼料用組合物可以製備為發酵飼料、配合飼料、顆粒形態及青貯飼料(silage)等形態。上述發酵飼料可以通過添加本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株和多種微生物菌或酶使有機物發酵來製備，上述配合飼料可以通過混合多種普通飼料與本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株來製備。顆粒形態的飼料可以使用顆粒機將上述發酵飼料或配合飼料劑型化來製備，青貯飼料可以使用本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株發酵青飼料來製備。
本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株或其培養物可以用作泡菜、飲料、輔食等食品的食品添加劑。同時，本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株可以用作製備發酵製品的發酵劑(starter)。在本說明書中，上述「發酵製品」可以用作與「發酵食品」混用的稱呼。上述發酵製品只要是在本發明所屬技術領域中已知的在製備時需要發酵過程的食品，種類就不受特別限制，包括例如乳酪、優酪乳、黃油、奶油、冰淇淋、乳酸菌飲料、開菲爾(kefir)、發酵乳、泡菜、發酵生食製品等。利用本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株的發酵製品可以通過本發明所屬技術領域公知的常規方法製備。發酵製品的製備方法通常由原料的準備、添加乳酸菌、發酵、回收完成的製品等過程組成。準備原料的步驟是準備發酵物件並準備發酵條件來使發酵很好形成的步驟。添加乳酸菌是根據發酵物件的量來添加適量的菌，在本發明中，其特徵在於，使用短雙歧桿菌IDCC 4401菌株。發酵是根據通常的發酵菌發酵條件來進行的，例如，可以在20℃至40℃的溫度下進行1小時至168小時。回收完成的製品的步驟包括從去除發酵物中的不需要的副產物或未發酵的材料開始到為便於儲存、運輸的所有後處理過程及包裝等。
作為具體的一例，本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株可以用於製備乳酸菌飲料。可以為培養本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株後，在乳酸發酵的製品中放入殺菌水稀釋後，添加糖分、香料等之後裝入容器內的製品。上述飲料中通常含有活的乳酸菌，飲用後可以期待在腸中起到清腸的作用。
並且，可以使用本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株或包含其的2種至3種混合乳酸菌處理糙米和薏仁等穀類後，在適當的溫度下發酵後，適當地配合大豆、糯米、高粱等多種農產品使營養的均衡與口味偏好達到最佳來製備發酵生食製品。
本發明的新菌株短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）不僅具有優秀的減少體內膽固醇的效果，而且與現有公知的短雙歧桿菌不同，具有高水準的耐酸性及耐膽汁性，因此在動物（尤其是人類）的消化道內很好地表現出菌株所具有的功能性並且繁殖的能力優秀，提供持續有效地減少體內膽固醇的功能性。
並且，不僅是上述菌株，通過熱處理上述菌株製備的死菌體(ID-BBR4401)的膽固醇結合能力與活菌的水準相當甚至更為優秀，而且具有高水準的與膽汁酸的結合能力，表現出向體外排出膽汁酸的顯著功效。由此，本發明的菌株或其死菌體ID-BBR4401不僅降低體內膽固醇，尤其是降低低密度脂蛋白膽固醇的效果非常突出，而且減少體內（尤其肝中的）中性脂肪的效果顯著，從而在血脂異常症的預防及治療中表現出優秀的功效。
寄存編號
寄存機構名稱：韓國生命工學研究院。
寄存編號：KCTC13169BP。
寄存日期：2016年12月02日。
以下，詳細說明本發明。
但是，下述實施例僅用於例示本發明，本發明的內容不限定於下述實施例。
實施例1：新菌株的分離及鑑定
為了開發乳酸菌株，本發明人通過十倍稀釋法使用生理鹽水依次稀釋幼兒糞便後，塗抹在MRS培養基（BD公司，288210），在37℃的溫度下進行2天的厭氧培養並觀察菌，分離及確認生成菌落的菌。
在分離的多種菌株中，最終篩選IDCC 4401菌株並進行鑑定分析。使用API 50 CH鑑定試劑盒（bioMerieuxVitex公司，法國）確定篩選菌株的碳水化合物的發酵模式，以16S rRNA gene序列為基礎鑑定上述菌株。
IDCC 4401菌株的碳水化合物發酵模式如下述表1所示，16SrRNA分析結果確認由序列1的序列構成，表現出99％的與短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )的同源性，從而鑑定為相同種類。上述鑑定的本發明的新型微生物以「Bifidobacterium breve IDCC 4401」的名稱於2016年12月2日寄存於位於韓國大田廣域市儒城區魚隱洞52號的韓國生命工學研究生院生物資源中心(Korean Collection for Type Cultures)(KCTC 13169BP)。 表1 碳水化合物的酸化(Acidification of Carbohydrates)
碳水化合物(Carbohydrates) 酸化(Acidification)
L-***糖(L-Arabinose) -
D-木糖(D-Xylose) -
甘露糖(Mannose) +
甘露醇(Mannitol) +
山梨糖醇(Sorbitol) +
α-甲基葡萄糖苷(α-Metylglucoside) -
苦杏仁苷(Amygdalin) +
熊果苷(Arbutin) W
水解七葉苷(Esculin hydrolysis) +
水楊苷(Salicin) -
海藻糖(Trehalose) -
松三糖(Melezitose) -
澱粉(Starch) +
糖原(Glycogen) +
＋：陽性，－：陰性，W：弱陽性
實施例2：篩選降低膽固醇的效果優秀的菌株
為了篩選降低膽固醇的效果優秀的菌株，以包括上述實施例1中鑑定的菌株和20種日東製藥具有的益生菌為物件進行膽固醇結合能力的一次確認。以其中確認具有膽固醇結合能力的8種益生菌為限，進行二次試驗（參照下述表2及圖1）。
通過如下方法測定下述表2中記錄的菌製劑的降低膽固醇的效果。首先，將各菌（實驗組）以1％(v/v)的濃度接種於含有10％的膽固醇的10ml的MRS培養基（BD公司，MRS培養液(broth)）中。接種48小時(hr)後，進行離心分離後只回收上層液並測定各剩餘膽固醇的濃度。
實驗結果如圖1所示，剩餘膽固醇最低的是上述實施例1中鑑定的短雙歧桿菌IDCC 4401活菌實驗組。各菌株的膽固醇剩餘率測定結果如表2所示。 表2 不同菌株的膽固醇剩餘率
試驗組 菌株名稱 劑型 膽固醇剩餘率 ％(w/w)
對照組(Control) - - 100
BR4401(L) 短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve ) IDCC4401 活菌(Livecell) 9.6±0.5
LO4101(L) 長雙歧桿菌(Bifidobacterium breve ) IDCC4101 活菌(Livecell) 48.3±2.4
SA3551 唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius ) IDCC3551 活菌(Livecell) 27.4±0.7
PL3502 植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum ) IDCC3502 活菌(Livecell) 35.6±0.5
RH3201 鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus ) IDCC3201 活菌(Livecell) 26.3±0.9
CA3451 乾酪乳桿菌 (Lactobacillus casei ) IDCC3451 活菌(Livecell) 74.8±2.2
KUA2301 乳酸桿菌 (Lactobacillus lactis ) IDCC2301 活菌(Livecell) 97.3±1.0
FA2102 屎腸球菌 (Enterococcus faecium ) IDCC2102 活菌(Livecell) 96.4±0.8
實施例3：死菌體的製備過程
為了製備膽固醇結合能力優秀的最佳短雙歧桿菌IDCC4401死菌體(ID-BBR4401)，進行了有關加熱(70℃～110℃)條件的實驗。向經過離心分離的菌體加入相比於重量1倍～2倍的蒸餾水懸浮後，在如表3所示的各個溫度條件下加熱1小時，之後進行冷凍乾燥來製備不同加熱條件下的死菌體。以此種方式通過使用血細胞計數器測定的菌數和普通細菌檢查來選定滅活化的最佳條件，測定結果如下述表3所示。 表3 不同加熱條件的菌數及普通細菌檢查的結果
條件 溫度(℃) 菌數(×1011 cells/g) 普通細菌
1 70 5.712 +
2 80 5.696 -
3 90 5.680 -
4 100 4.967 -
5 110 4.688 -
實驗結果，如上述表3所示，在80℃至90℃的加熱條件下，不但去除了普通細菌，還使本發明的短雙歧桿菌IDCC4401保持很高水準的勻質的性狀，因此確認上述條件為最佳。在本說明書中，將在上述80℃至90℃的溫度下加熱製備的死菌體稱為ID-BBR4401。
將通過上述方式篩選的短雙歧桿菌IDCC 4401死菌稱為「ID-BBR4401」（參照圖2），其掃描電子顯微鏡拍攝圖片如圖3所示。並且，通過掃描電子顯微鏡拍攝ID-BBR4401與膽固醇結合的模樣的結果如圖4所示。
實施例4：比較相同菌種間的減少（降低）膽固醇的能力效果
為了確認本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401活菌及死菌體(ID-BBR4401)優秀的降低膽固醇的效果，與現有的已知具有降低膽固醇的效果的相同菌種的其他菌株就膽固醇結合能力進行比較實驗。具體以下述表4及表5所示的5種菌株為物件進行實驗，向各菌的菌體加入相比於重量1倍～2倍的蒸餾水懸浮後，在80℃至90℃下進行1小時加熱，然後以冷凍乾燥的方式滅活化後，評價活菌及上述死菌的效果。以與上述實施例2相同的方法確認降低膽固醇的效果。將各菌株的活菌及死菌以1％(v/v)的濃度接種於10ml的含有膽固醇的MRS培養基。接種48小時後進行離心分離，只回收上層液，測定各菌株的剩餘膽固醇濃度。 表4 相同菌種間的膽固醇剩餘率比較
菌株名稱 剩餘率(％)
活菌 死菌
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )IDCC4401 9±0.1 14.3±1.0
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )MorinagaB-3 71.8±1.3 75.0±2.6
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )ATCC15700 31.1±0.87 36.2±1.4
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )ATCC15698 87±2.1 91.4±2.8
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )NCIMB8807 23.8±0.6 33.0±1.5
實驗結果，各菌株的膽固醇剩餘率測定結果如上述表4所示。死菌的菌體數雖然可以保持最初放入時的水準，但活菌在培養期間持續生長，其菌體數比死菌多，因此在數值上其膽固醇剩餘量會顯得略低，考慮上述原因後在相同的菌體單位數中剩餘膽固醇最低的是本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體(ID-BBR4401)，確認與其他菌株有相當水準的顯著差異。
而且，在短雙歧桿菌NCIMB8807菌株的情況下，比起活菌，滅活化時的膽固醇結合能力表現得相當低下。與此相比，本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體(ID-BBR4401)表現出與其活菌相同的膽固醇結合能力，或以更增加的水準表現出更好的膽固醇結合能力，尤其是本發明的ID-BBR4401與其他短雙歧桿菌菌株的活菌相比也表現出顯著優秀的降低膽固醇的能力。因此，確認短雙歧桿菌IDCC 4401活菌及死菌(ID-BBR4401)製劑具有非常優秀的膽固醇結合能力，並且認為穩定性也很優秀。
實施例5：比較相同菌種間的膽汁酸減少（降低）能力效果
為了確認本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401活菌及死菌體(ID-BBR4401)優秀的降低膽汁酸的效果，與相同菌種的其他菌株進行了比較實驗。將總共5種菌株全部滅活化後，評價各菌株的活菌及上述死菌的效果。將各菌株的活菌及死菌以1％(v/v)的濃度接種於10ml的含有膽汁酸的MRS培養基。接種48小時後進行離心分離，只回收上層液，測定各菌株的剩餘膽汁酸濃度。實驗結果，各菌株的膽汁酸剩餘率測定結果如下述表5及圖6所示。在所有活菌死菌中，剩餘膽汁酸最低的是本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401，確認與其他菌株具有顯著差異。 表5 相同菌種間膽汁酸剩餘率比較
菌株名稱 剩餘率(％)
活菌 死菌
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )IDCC4401 32.57±1.4 57.6±2.8
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )MorinagaB-3 80.4±1.5 79.2±2.8
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )ATCC15700 33.7±1.6 62.9±3.8
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )ATCC15698 89.9±5.0 96.3±1.5
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )NCIMB8807 54.9±0.4 68.6±6.5
實施例6：確認耐酸性及耐膽汁性特性
為了確認本發明的短雙歧桿菌IDCC 4401不受酸性及膽汁酸的影響，進行了耐酸性及耐膽汁性實驗。若活菌受胃酸和膽汁酸的影響小，那麼在死菌的狀態下受胃酸和膽汁酸的影響也應該小。因此，實驗中使用了短雙歧桿菌IDCC 4401活菌，如表6及表7所示，與相同菌種的其他菌株進行了比較評價。
在耐酸性實驗中，將各菌株以1％(v/v)的濃度分別接種於使用鹽酸將酸鹼度調節為pH2.5、pH3.0以及pH7.0的10ml的MRS培養基中。接種24小時後，確認各培養液的菌數來比較他們的差異。測定結果如下述表6所示。
在耐膽汁性實驗中，將各菌株以1％(v/v)的濃度接種於分別放入0.1％～0.5％(w/v)牛膽汁(Oxgall)的10ml的MRS培養基中。接種24小時後，確認各培養液的菌數來比較他們的差異。測定結果如下述表7所示。 表6 短雙歧桿菌菌株間耐酸性比較測試(test)(×109 cfu/ml)
菌株名稱 pH
2.5 3.0 7.0
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )IDCC4401 5.9±0.7 5.9±0.4 6.0±0.2
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )MorinagaB-3 2.7±0.5 3.5±1.1 6.1±1.5
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )ATCC15700 4.8±1.2 5.1±0.7 6.2±0.8
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )ATCC15698 2.9±1.3 3.7±0.3 5.9±0.7
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )NCIMB8807 3.0±0.6 4.0±0.5 5.9±1.2
表7 短雙歧桿菌菌株間耐膽汁性比較測試(test)(×109cfu/ml)
菌株名稱 牛膽汁濃度(％)
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5  
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve ) IDCC4401 6.1±0.5 6.0±0.2 5.8±0.4 5.9±0.3 5.9±0.6
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve ) MorinagaB-3 5.8±0.5 4.8±0.2 2.9±0.3 1.8±0.3 1.7±0.2
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve ) ATCC15700 6.0±0.3 5.0±0.7 3.2±0.6 2.1±0.7 2.0±0.2
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve ) ATCC15698 6.2±0.7 4.9±0.7 3.5±0.3 2.2±0.4 1.9±0.2
短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve ) NCIMB8807 5.9±0.2 5.1±0.6 3.3±0.5 2.7±0.2 2.0±0.1
如上述表6及表7所示，與其他菌對照，確認本發明的短雙歧桿菌IDCC4401菌株顯出高水準的耐酸性及耐膽汁性。
實施例7：熱穩定性確認測試
為了確認膽固醇結合能力優秀的作為短雙歧桿菌IDCC4401死菌體的ID-BBR4401組合物在各種溫度環境下長期保管時，組合物中含有的菌數和與膽固醇結合的活性是否變化，進行了相關實驗。通過血細胞計數器測定菌數，比較了不同保管時間的菌數。以與實施例2相同的方法進行降低膽固醇的效果測試，通過其剩餘率來比較活性。其結果如下述表8所示。 表8
時間 （月） (month) 4℃ 25℃ 45℃
菌數 (×1010 cells/g) 剩餘率(％) 菌數 (×1010 cells/g) 剩餘率(％) 菌數 (×1010 cells/g) 剩餘率(％)
0 1.15±0.07 14.3±0.5 1.15±0.07 14.3±0.5 1.15±0.07 14.3±0.5
3 1.11±0.03 14.9±0.6 1.09±0.04 14.0±0.1 1.10±0.04 14.6±0.7
6 1.09±0.09 14.8±0.7 1.12±0.09 14.1±0.3 1.11±0.09 14.7±1.2
9 1.07±0.04 14.4±0.4 1.10±0.11 14.9±1.1 1.13±0.11 14.2±0.7
12 1.11±0.05 14.9±0.8 1.05±0.03 14.7±0.9 1.09±0.05 14.5±0.9
18 1.12±0.03 14.3±0.2 1.08±0.02 14.9±1.2 1.14±0.10 14.6±0.2
24 1.01±0.02 14.8±0.7 1.14±0.11 14.5±0.3 1.10±0.07 14.2±0.2
實驗結果如上述表8所示，確認本發明的ID-BBR4401的長期穩定性及熱穩定性優秀。
實施例8：在血脂異常症動物模型中的功效評價
8-1）確立血脂異常症（高脂血症）動物模型
購入5週齡的雄性SD大鼠(rat)（ORIENTBIO公司）並經過1週的馴化時間後使用。本實驗在保持常溫(22±2℃)、恆濕(50％～60％)並保持間隔12小時的光週期(08:00～20:00)及暗週期(20:00～08:00)的動物室內進行。試驗動物收容於按每組3隻的數量設置的飼育籠內，自由供給滅菌的飼料及一次蒸餾水。試驗物質按每組9隻分為6組進行實驗，共使用54隻，各組分別為正常組(normal)(ND)、對照組(vehicle)（只供應高脂肪飲食的組，HCD）、陽性對照組（給藥10mg/kg/2mL的瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)HCD+R）、1×106 cells/rat的ID-BBR4401給藥組(HCD+L)、1×107 cells/rat的ID-BBR4401給藥組(HCD+M)、1×108 cells/rat的ID-BBR4401給藥組(HCD+H)。在試驗期間提供飼料的飲食結構中總熱量的43％由脂肪來構成的，添加1.25％的膽固醇、0.5％的膽汁酸(cholic acid)的高脂飲食(high cholesterol diet，HCD)作為用於誘發高膽固醇血症的飼料。飲食每週供應2次，以不致飲食不足的方式提供。
8-2）血脂異常症（高脂血症）動物模型試驗
在供給高脂飲食期間，以每週5次（週一～週五）共口服給藥6週的方式向陽性對照組給藥10mg/kg/day的瑞舒伐他汀，向實驗組分別給藥製備為1×106 cells/rat/day、1×107 cells/rat/day、1×108 cells/rat/day的ID-BBR4401。在對結束6週給藥的動物進行解剖檢查12小時前使其絕食後，在吸入***(ether)麻醉後從腹腔靜脈採取血液。之後，放入15ml的錐形管(cornicaltube)中在4℃的溫度下以3000rpm的轉速離心分離10分鐘後獲得血清(serum)。並且，分離肝並測定重量後，摘出一部分在液氮中冷凍後在-70℃的溫度下保管。
8-3）測定血脂指標
通過甘油三酯(triglyceride、TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)確認血脂指標。血脂數值利用了解剖檢查時獲得的血清。血液指標使用甘油三酯試劑盒、總膽固醇試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒（牙山製藥）根據試劑盒使用指南(kitprotocol)來測定，低密度脂蛋白膽固醇則利用試劑盒測定的甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇的結果數值通過Fridewald公式（低密度脂蛋白膽固醇＝總膽固醇－高密度脂蛋白膽固醇－（甘油三酯/5））來計算。
測定血脂的結果，如圖7所示，給藥1×107 cells/rat/day的ID-BBR4401的組(HCD+M)及給藥1×108 cells/rat/day的ID-BBR4401組(HCD+H)相比於對照組(vehicle)，血中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇顯著減少，確認在高脂血症及高膽固醇血症的改善中表現出優秀的效果。
8-4）測定肝脂肪指標
肝脂肪指標通過肝臟甘油三酯(hepatictriglyceride，hepatic-TG)、肝臟總膽固醇(hepatic total cholesterol，hepatic-TC)確認。向解剖檢查時獲得的肝組織添加相比於肝組織重量10倍體積(volume)的三氯甲烷：甲醇(chloroform：methanol)為2：1的溶液，利用均質機(homogenizer)破碎後，加入等量的生理鹽水(0.9％的NaCl)和甲醇渦旋(vortexing)1分鐘後，使用離心機(centrifuge)(2000rpm、20分鐘)獲得三氯甲烷層。向獲得的三氯甲烷層添加相同量的三氯甲烷：甲醇：膽酸鈉(chloroform：methanol：3mMsodiumcholate)為3：24：25的溶液渦旋1分鐘後，利用離心機分離出三氯甲烷層。將獲得的三氯甲烷層在80℃的溫度、水浴(waterbath)的條件下蒸發30分鐘獲得脂質提取物(lipidextract)。使用牙山製藥公司的甘油三酯試劑盒、總膽固醇試劑盒根據試劑盒使用指南測定獲得的脂質中的甘油三酯、總膽固醇。
肝脂質測定結果如圖8所示，在給藥ID-BBR4401的組中，給藥1×107 cells/rat/day的ID-BBR4401的組(HCD+M)及給藥1×108 cells/rat/day的ID-BBR4401組(HCD+H)中的肝臟總膽固醇顯著減少，確認具有高膽固醇血症改善效果。不僅如此，在給藥本發明的ID-BBR4401的組中，肝臟甘油三酯（中性脂肪）的量依賴給藥濃度地減少了，尤其在給藥1×108 cells/rat/day的組中，表現出非常好的減少肝臟甘油三酯的效果。
8-5）測定糞便膽汁酸指標
在結束試驗3天前，獲得各個體的糞便測定重量後冷凍。冷凍的糞便通過冷凍乾燥去除水分。以與上述實施例8至4相同的方法從乾燥的糞便中獲得脂質提取物。使用膽汁酸測定試劑盒（RatTotalBileAcidsAssayKit，CrystalChem公司）根據試劑盒使用指南測定獲得的脂質。
實驗結果如圖9所示，在各實驗組中，給藥ID-BBR4401的組相比於對照組(vehicle)，糞便中的膽汁酸含量全都增加了，與瑞舒伐他汀給藥組相比也表現出較高的數值，膽汁酸的量依賴濃度地增加，在給藥1×108 cells/rat/day的組(HCD+H)中，表現出排出最多的膽汁酸。由此確認，ID-BBR4401通過與將膽固醇作為前體的膽汁酸結合向體外排出來減少膽固醇數值。這一事實，與現有已知具有降低膽固醇能力的乳酸菌活菌體的機制不同的，該機制是上述乳酸菌活菌體通過膽鹽水解酶活性與向小腸分泌的膽汁酸結合而轉換為游離膽汁酸，上述游離膽汁酸比結合膽汁酸的再吸收能力降低，從而向體外排出。由於作為死菌製劑的本發明的ID-BBR4401沒有膽鹽水解酶活性，上述資料顯出本發明的ID-BBR4401製劑與膽汁酸的結合能力非常優秀。
通過前述的實施例確認本發明的ID-BBR4401死菌製劑的特徵在於具有高出其活菌水準的吸附膽固醇的能力，而且與膽汁酸的結合能力優秀，因此確認其減少體內膽固醇（尤其是低密度脂蛋白膽固醇）的能力非常顯著，不僅如此，其減少體內（尤其是肝臟）中性脂肪的效果顯著，從而顯出優秀的預防及治療血脂異常症的效果。
產業上的可應用性
綜上所述，本發明關於具有優異的耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果的新型短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）及其死菌體ID-BBR4401，本發明的新菌株短雙歧桿菌IDCC 4401菌株（寄存編號：KCTC13169BP）不僅具有優秀的減少體內膽固醇的效果，而且與現有公知的短雙歧桿菌不同，具有很高水準的耐酸性及耐膽汁性，因此在動物（尤其是人類）的消化道內很好地表現出菌株所具有的功能性並且繁殖的能力優秀，提供持續有效地減少體內膽固醇的功能性。並且，不僅是上述菌株，通過熱處理上述菌株製備的死菌體(ID-BBR4401)的膽固醇結合能力與活菌同樣優秀，而且具有高水準的與膽汁酸的結合能力，表現出向體外排出膽汁酸的顯著功效。由此，本發明的菌株或其死菌體ID-BBR4401不僅降低體內膽固醇，尤其是降低低密度脂蛋白膽固醇的效果非常突出，減少體內（尤其肝中的）中性脂肪的效果顯著，從而在血脂異常症的預防及治療中表現出優秀的功效，因此在醫藥及保健功能食品等相關領域中的可應用性很高。
圖1示出對包括本發明的新菌株在內的多種菌種的活菌與膽固醇的特異性結合能力進行比較評價的結果。 圖2為作為具有高膽固醇血症改善效果的短雙歧桿菌IDCC 4401的死菌體的ID-BBR4401的原料照片。 圖3為具有高膽固醇血症改善效果的ID-BBR4401的掃描電子顯微鏡照片。 圖4為與膽固醇結合的ID-BBR4401的掃描電子顯微鏡照片。 圖5為對包括本發明的新菌株在內的多種菌種的減少膽固醇的能力進行比較評價的結果。 圖6為對包括本發明的新菌株在內的多種菌種的膽汁酸減少能力進行比較評價的結果。 圖7為示出作為短雙歧桿菌IDCC 4401的死菌體的ID-BBR4401在血脂異常症（高脂血症）動物模型中給血脂帶來的影響的照片。 圖8為示出作為短雙歧桿菌IDCC 4401的死菌體的ID-BBR4401在血脂異常症（高脂血症）動物模型中給肝的脂質帶來的影響的照片。 圖9為示出作為短雙歧桿菌IDCC 4401的死菌體的ID-BBR4401在血脂異常症（高脂血症）動物模型中給糞便內的膽汁酸量帶來的影響的照片。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (11)

  1. 一種具有耐酸性和耐膽汁性且對血脂異常症具有預防或治療效果的寄存編號為KCTC13169BP的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株或其死菌體。
  2. 如請求項1所述之寄存編號為KCTC13169BP的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株或其死菌體，其中，上述血脂異常症為高脂血症。
  3. 如請求項1所述之寄存編號為KCTC13169BP的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株或其死菌體，其中，上述死菌體通過包括熱處理的滅活化方式製備。
  4. 如請求項1所述之寄存編號為KCTC13169BP的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株或其死菌體，其中，上述菌株或其死菌體通過吸附排出膽汁酸來減少膽固醇濃度。
  5. 如請求項1所述之寄存編號為KCTC13169BP的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株或其死菌體，其中，上述菌株或其死菌體的長期穩定性及熱穩定性優異。
  6. 一種用於預防或治療血脂異常症的藥學組合物，包含請求項1所述之寄存編號為KCTC13169BP的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株、其培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體中的一種以上作為有效成分。
  7. 一種用於預防或改善血脂異常症的食品組合物，包含請求項1所述之寄存編號為KCTC13169BP的短雙歧桿菌IDCC 4401菌株、其培養物或短雙歧桿菌IDCC 4401死菌體中的一種以上作為有效成分。
  8. 一種清腸用組合物，包含請求項1所述之菌株、其培養物或其死菌體作為有效成分。
  9. 一種益生菌組合物，包含請求項1所述之菌株或其培養物作為有效成分。
  10. 一種飼料用組合物，包含請求項1所述之菌株、其培養物或其死菌體作為有效成分。
  11. 一種發酵製品，包含請求項1所述之菌株或其培養物作為有效成分。
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