KR20210089179A - Cll1을 표적으로 하는 항체 및 이의 응용 - Google Patents

Cll1을 표적으로 하는 항체 및 이의 응용 Download PDF

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종하이 리
펭 왕
후아마오 왕
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카파 테라퓨틱스 리미티드
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Abstract

본 발명은 CLL1을 표적으로 하는 항체 및 이의 응용을 제공한다. 본 발명에서 제공하는 CLL1 특이적 항체는 CLL1에 대해 상대적으로 높은 친화성을 가지고, 키메라 항원 수용체 변형된 T 세포로 제조된 후, CLL1을 발현하는 세포에 대해 현저한 살상 작용이 있다.

Description

CLL1을 표적으로 하는 항체 및 이의 응용
본 발명은 종양 면역 치료 또는 진단 분야에 속하는 것으로, 더 구체적으로, 본 발명은 CLL1을 표적으로 하는 항체 및 이의 응용에 관한 것이다.
급성 골수성 백혈병(AML)은 성인 급성 백혈병 중 가장 흔한 유형이다. 가장 전통적인 치료 방법은 동종 조혈 줄기세포 이식이지만, 조기 또는 후기 이식 관련 합병증이 존재하는 동시에, 수술 후 재발할 확률이 있다. 현재 AML을 치료하는 화학 요법 약물은 주로 다우노루비신(DNR), 이다루비신(데메톡시다우노루비신), 시타라빈 등이 있고, 화학 요법 및 방사선 요법은 AML생성에 대해 어느 정도 현저한 억제 효과가 있지만, 강한 부작용과 쉬운 재발로 인해 임상 순응도에 영향을 주므로, AML에 대한 새로운 치료 방법이 시급하다.
인간 C-유형 렉틴-유사 분자 1(CLL1)은 발현이 골수성 세포 및 대부분의 AML 세포에 제한되는 II형 막 관통 단백질이다. 또한, CLL1은 백혈병 줄기세포(LSCs)에서 발현되지만, 조혈 줄기세포(HSCs)에서는 발현되지 않으므로, CLL1은 AML을 치료하는 잠재적 표적점이다.
현재 연구원들이 CN104736562B에서 공개한 항-CLL1 항체와 같은 항-CLL1 항체를 연구하고 있지만, 현재 시중에는 AML을 치료할 수 있는 항-CLL1 항체는 없다.
본 발명은 CLL1을 표적으로 하는 특이적 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
제1 양태에 따르면, 본 발명은 CLL1을 표적으로 하는 항체를 제공하고, 상기 항체는,
SYX1MX2로 표시되는 HCDR1, X3X4X5X6SGGSTX7YAX8X9X10X11G로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 40 또는 41로 표시되는 HCDR3, 및 RASQSISSX12LX13으로 표시되는 LCDR1, X14ASX15LX16S로 표시되는 LCDR2, QQX17YSX18PX19X20T로 표시되는 LCDR3을 가지고,
여기서, 상기 X1은 A 또는 Y로부터 선택되며, X2는 S 또는 H로부터 선택되고, X3은 A 또는 I이며, X4는 I 또는 F로부터 선택되고, X5는 S 또는 N으로부터 선택되며, X6은 G 또는 P로부터 선택되고, X7은 Y 또는 S로부터 선택되며, X8은 D 또는 Q로부터 선택되고, X9는 S 또는 K로부터 선택되며, X10은 V 또는 F로부터 선택되고, X11은 K 또는 Q로부터 선택되며, X12는 W 또는 Y로부터 선택되고, X13은 A 또는 N으로부터 선택되며, X14는 D 또는 V로부터 선택되고, X15는 N 또는 S로부터 선택되며, X16은 E 또는 Q로부터 선택되고, X17은 Y 또는 S로부터 선택되며, X18은 Y 또는 T로부터 선택되고, X19는 M 또는 L로부터 선택되며, X20은 I이거나 존재하지 않는다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체는,
중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 35 또는 36으로 표시되는 HCDR1을 포함하거나, 및/또는 SEQ ID NO: 37, 38 또는 39로 표시되는 HCDR2를 포함하거나, 및/또는 SEQ ID NO: 40 또는 41로 표시되는 HCDR3을 포함하는 항체 (1);
경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 42, 43 또는 44로 표시되는 LCDR1을 포함하거나, 및/또는 SEQ ID NO: 45, 46, 47 또는 48로 표시되는 LCDR2를 포함하거나, 및/또는 SEQ ID NO: 49 또는 50으로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (2);
항체 (1)의 중쇄 가변 영역 및 항체 (2)의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (3); 및
항체 (1) 내지 항체 (3) 중 어느 하나와 동일하거나 유사한 활성을 가지는 항체 (1) 내지 항체 (3) 중 어느 하나의 변이체 (4)로부터 선택된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체 LCDR1은 돌연변이되고, RASQSISSX12LX13에서 RASQWIARX12LX13으로 돌연변이되며, 바람직하게, 상기 돌연변이된 LCDR1의 서열은 SEQ ID NO: 44로 표시된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체 HCDR2의 X3X4X5X6은 AISG 또는 IFNP이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체 HCDR2는 돌연변이되고, X3X4X5X6SGGSTX7YAX8X9X10X11G에서 X3X4X5X6GGGSTX7YAX8X9X10X11G로 돌연변이되며, 바람직하게, 상기 돌연변이된 HCDR2의 서열은 SEQ ID NO: 39로 표시된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체는,
SEQ ID NO: 35로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 37로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 40으로 표시되는 HCDR3 및 SEQ ID NO: 42로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 45로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 49로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (1);
SEQ ID NO: 36으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 38로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 41로 표시되는 HCDR3 및 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 46으로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 50으로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (2);
SEQ ID NO: 35로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 37로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 40으로 표시되는 HCDR3 및 SEQ ID NO: 44로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 47로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 49로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (3);
SEQ ID NO: 36으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 38로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 41로 표시되는 HCDR3 및 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 48로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 50으로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (4);
SEQ ID NO: 36으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 39로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 41로 표시되는 HCDR3 및 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 48로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 50으로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (5); 및
항체 (1) 내지 항체 (5) 중 어느 하나와 동일하거나 유사한 활성을 가지는 항체 (1) 내지 항체 (5) 중 어느 하나의 변이체- 항체 (6)로부터 선택된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체는,
중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 67로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 68로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 69로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (1);
경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (2);
상기 항체 (1)의 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 (2)의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (3); 및
항체 (1) 내지 항체 (3) 중 어느 하나와 동일하거나 유사한 활성을 가지는 항체 (1) 내지 항체 (3) 중 어느 하나의 변이체 (4)로부터 선택된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체는,
중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (1);
중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (2);
중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (3);
중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (4);
중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (5); 및
항체 (1) 내지 항체 (5) 중 어느 하나와 동일하거나 유사한 활성을 가지는 항체 (1) 내지 항체 (5) 중 어느 하나의 변이체 (6)으로부터 선택된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 48로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 50으로 표시되는 LCDR3을 가지고;
바람직하게, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
더 바람직하게, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5, 13, 67, 68 또는 69로 표시되는 아미노산 서열을 가진다.
제2 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 항체와 동일한 항원 결정 부위를 식별하는 항체를 제공한다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명에서 제공하는 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체는 완전 인간 항체이다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명에서 제공하는 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체는 완전항체, scFv, 단일 도메인 항체, Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편이다.
제3 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
제4 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제3 양태에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
제5 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제4 양태에 따른 발현 벡터 또는 게놈에 통합된 본 발명의 제3 양태에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
제6 양태에 따르면, 본 발명은 종양을 치료하는 약물을 제조하거나, 또는 종양을 진단하는 시약을 제조하기 위한 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체의 용도를 제공한다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 종양은 급성 골수성 세포 백혈병(AML), 만성 골수성 세포 백혈병(CML), 만성골수단핵구백혈병(CMML), 골수형성이상증후군(MDS), 다발성 골수종 또는 골수섬유증이다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 종양은 CLL1 양성의 종양이다.
제7 양태에 따르면, 본 발명은 면역접합체를 제공하고, 상기 면역접합체는,
본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체, 및 이와 연결되는 기능성 분자를 포함하고; 상기 기능성 분자는 종양 표면 마커를 표적으로 하는 분자, 종양을 억제하는 분자, 면역 세포의 표면 마커를 표적으로 하는 분자, 및 검출 가능한 라벨로부터 선택된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 종양을 억제하는 분자는 항-종양 시토카인(cytokine) 또는 항-종양 독소이다, 바람직하게, 상기 시토카인은 IL-12, IL-15, I형 인터페론 및 TNF-alpha 중의 하나 또는 다수를 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 면역 세포의 표면 마커를 표적으로 하는 분자는 면역 세포 표면 마커와 결합하는 항체 또는 리간드(ligand)이다. 바람직하게, 상기 면역 세포 표면 마커는 CD3, CD16 및 CD28 중의 하나 또는 다수를 포함한다, 더 바람직하게, 상기 면역 세포 표면 마커와 결합하는 항체는 항-CD3 항체이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 면역 세포의 표면 마커를 표적으로 하는 분자는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포 표면 마커와 결합하는 항체이다.
제8 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제7 양태에 따른 다기능 면역접합체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
제9 양태에 따르면, 종양을 치료하는 약물을 제조하거나, 또는 종양을 진단하는 시약을 제조하기 위한 본 발명의 제7 양태에 따른 면역접합체의 용도를 제공한다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 종양은 급성 골수성 세포 백혈병(AML), 만성 골수성 세포 백혈병(CML), 만성골수단핵구백혈병(CMML), 골수형성이상증후군(MDS), 다발성 골수종 또는 골수섬유증이다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 종양은 CLL1 양성의 종양이다.
제10 양태에 따르면, 본 발명은 세포 외 영역, 막 관통 영역 및 세포 내 신호 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공하고, 상기 키메라 항원 수용체는 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체를 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체의 세포 내 신호 영역은 하나 또는 다수의 공동 자극 신호 영역 및/또는 일차 신호 영역을 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체는 경첩 영역을 더 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체의 막 관통 영역은 TCR의 alpha, beta, zeta 사슬, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD1 등 분자의 막 관통 영역의 하나 또는 다수로부터 선택되거나; 및/또는
상기 공동 자극 신호 영역은 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54, CD83, OX40, CD137, CD134, CD150, CD152, CD223, CD270, PD-L2, PD-L1, CD278, DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, FcεRIγ, MyD88 및 41BBL 등 분자의 세포 내 신호 영역의 하나 또는 다수로부터 선택되거나; 및/또는
상기 일차 신호 영역은 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278, CD66d 및 CD3ζ 등 분자의 일차 신호 영역의 하나 또는 다수로부터 선택된다.
바람직한 구체적인 일 실시형태에서,
상기 막 관통 영역은 CD8α, CD4, CD45, PD1, CD154 및 CD28 등 분자의 막 관통 영역의 하나 또는 다수로부터 선택되거나; 및/또는
상기 공동 자극 신호 영역은 CD137, CD134, CD28 및 OX40 등 분자의 세포 내 신호 영역의 하나 또는 다수로부터 선택되거나; 및/또는
상기 일차 신호 영역은 CD3ζ의 일차 신호 영역으로부터 선택된다.
더 바람직한 구체적인 일 실시형태에서, 상기 막 관통 영역은 CD8α 또는 CD28의 막 관통 영역으로부터 선택되고, 상기 공동 자극 신호 영역은 CD137 또는 CD28의 세포 내 신호 영역으로부터 선택되며, 상기 일차 신호 영역은 CD3ζ의 일차 신호 영역으로부터 선택된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체는,
본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체, CD8의 막 관통 영역 및 CD3ζ의 일차 신호 영역;
본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체, CD8의 막 관통 영역, CD137의 세포 내 신호 영역 및 CD3ζ의 일차 신호 영역;
본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체, CD28의 막 관통 영역, CD28의 세포 내 신호 영역 및 CD3ζ의 일차 신호 영역; 또는
본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체, CD28의 막 관통 영역, CD28의 세포 내 신호 영역, CD137의 세포 내 신호 영역 및 CD3ζ의 일차 신호 영역과 같이 순차적으로 연결된 항체, 막 관통 영역 및 세포 내 신호 영역을 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체는 SEQ ID NO: 9, 10, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 66으로 표시되는 서열을 가진다.
제11 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제10 양태에 따른 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
제12 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제11 양태에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
제13 양태에 따르면, 본 발명은 바이러스(virus)를 제공하고, 상기 바이러스는 본 발명의 제12 양태에 따른 벡터를 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 바이러스는 렌티바이러스(lentivirus) 또는 레트로바이러스(retrovirus)이다.
제14 양태에 따르면, 본 발명은 종양을 치료하는 약물의 제조를 위한 본 발명의 제10 양태에 따른 키메라 항원 수용체, 또는 본 발명의 제11 양태에 따른 핵산, 또는 본 발명의 제12 양태에 따른 발현 벡터, 또는 종양을 치료하는 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제13 양태에 따른 바이러스의 용도를 제공한다. 바람직하게, 상기 약물은 유전자 변형된 면역 세포를 함유하는 약물이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 종양은 구체적인 일 실시예에서 급성 골수성 세포 백혈병(AML), 만성 골수성 세포 백혈병(CML), 만성골수단핵구백혈병(CMML), 골수형성이상증후군(MDS), 다발성 골수종 또는 골수섬유증이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 종양은 CLL1 양성의 종양이다.
제15 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제11 양태에 따른 핵산, 또는 본 발명의 제12 양태에 따른 발현 벡터 또는 본 발명의 제13 양태에 따른 바이러스가 형질 도입되거나; 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 키메라 항원 수용체가 발현되는 유전자 변형된 면역 세포를 제공한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 면역 세포는 T 림프구, NK 세포 또는 NKT 세포로부터 선택되는 것이 바람직하다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 면역 세포는 본 발명의 제10 양태에 따른 키메라 항원 수용체 외에 제2 서열이 더 발현되고, 상기 제2 서열은 시토카인, 또는 다른 키메라 항원 수용체, 또는 케모카인(chemokine) 수용체, 또는 PD-1 발현을 감소시키는 siRNA, 또는 PD-L1을 차단시키는 단백질, 또는 TCR, 또는 안전 스위치를 포함하며;
바람직하게, 상기 시토카인은 IL-12, IL-15, IL-21 및 I형 인터페론 중의 하나 또는 다수를 포함하고;
바람직하게, 상기 케모카인 수용체는 CCR2, CCR5, CXCR2 및 CXCR4 중의 하나 또는 다수를 포함하며;
바람직하게, 상기 안전 스위치는 iCaspase-9, Truancated EGFR 및 RQR8 중의 하나 또는 다수를 포함한다.
제16 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제15 양태에 따른 면역 세포의 용도를 제공하고, 상기 유전자 변형된 면역 세포는 종양을 치료하는 약물을 제조하는데 사용된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 종양은 급성 골수성 세포 백혈병(AML), 만성 골수성 세포 백혈병(CML), 만성골수단핵구백혈병(CMML), 골수형성이상증후군(MDS), 다발성 골수종 또는 골수섬유증이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 종양은 CLL1 양성의 종양이다.
제17 양태에 따르면, 본 발명은,
본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 항체 또는 상기 항체를 코딩하는 핵산; 또는
본 발명의 제7 양태에 따른 면역접합체 또는 상기 접합체를 코딩하는 핵산; 또는
본 발명의 제15 양태에 따른 유전자 변형된 면역 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
이해해야 할 것은 본 발명의 범위 내에서, 위에서 언급한 본 발명의 각 기술 특징과 아래(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명하는 각 기술 특징은 서로 결합할 수 있으므로, 신규 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있다. 편폭의 제한으로 인해, 여기서 반복하지 않는다.
도 1은 항체 4F2 및 25H8의 ELISA 측정 결과이다.
도 2는 항체 4F2 및 25H8의 Biacore 측정 결과이다.
도 3은 FACs로 검출한 항체 4F2 및 25H8과 HL60/U937 세포 및 k562의 결합 상황이다.
도 4는 항체 7F8 및 12G4m의 ELISA 측정 결과이다.
도 5는 항체 7F8 및 12G4m의 Biacore 측정 결과이다.
도 6은 FACs로 검출한 항체 7F8 및 12G4m과 HL60/U937 세포 및 k562의 결합 상황이다.
도 7은 항체 7F8 및 12G4m와 인간 CLL1이 결합한 ELISA 측정 결과이다.
도 8은 항체 7F8 및 12G4m의 단량체 비율 검출 결과이다.
도 9는 SDS PAGE 분석으로 정제된 항-CLL1 scFv_Fc 항체(환원 조건)이다.
도 10은 FACs로 검출한 U937 세포와 결합하는 항체 7F8, 12G4m, 4F2, 25H8의 EC50이다.
도 11은 FACs로 검출한 CLL1-CAR T-바이러스가 T 림프구를 감염하는 양성률이다.
도 12는 본 발명의 항체 및 선행 기술 항체의 체외 살상 독성 실험 결과이다
도 13은 본 발명의 항체의 체외 살상 독성 실험 결과이다.
발명자는 광범위하고 깊은 연구를 거쳐, 특이성이 높고, 결합 능력이 우수한 항-CLL1 항체를 얻었다. 이 기초상에서 본 발명을 완성하였다.
본문에서 사용되는 과학 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미와 동일하거나 유사한 의미를 갖는다. 본 발명을 쉽게 이해하기 위해, 일부 용어는 아래와 같이 정의한다.
본 발명의 용어 "CLL1"은 "C-Type Lectin-Like Molec μLe-1"을 가리키고, II형 막 관통 단백질이다. 구체적인 실시예에서, CLL1은 인간 CLL1을 가리킨다.
본문에서 용어 "항체”는 면역체계의 항원 결합 단백질을 가리킨다. 본문에서 언급된 바와 같은 용어 "항체”는 항원 결합 영역을 가지는 완전한 전장 항체 및 그중 "항원 결합 부분” 또는 "항원 결합 영역”에 보유된 이의 임의의 단편, 또는 이의 단일 사슬(예를 들어 단일 사슬 가변 단편(scFv))을 포함한다. 천연 항체는 이황화 결합에 의해 연결되는 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 당단백질을 가리킨다. 용어 "항체”는 예를 들어 원핵 세포에서 발현되는 항체, 비글리코실화 항체 및 항원과 결합하는 항체 단편 및 아래에서 설명되는 유도체 등 항체 (특히 본문에 기재된 항체)의 모든 재조합 형식을 더 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본문에서 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본문에서 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. VH 및 VL은 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 초가변 영역으로 더 세분화될 수 있고, 프레임워크 영역(FR)으로 명명되는 보다 보존적인 영역에 배치될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 순서로 배열된다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 영역을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포들(예컨대 이펙터 세포) 및 클래시컬 보체계의 제1 성분(Clq)을 포함하는 숙주의 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체 단편은, (i) Fab' 및 Fab'-SH를 포함하고 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) 단일 가변 영역으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546); (v) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (vi) 단일 사슬 Fv 분자 항원 결합 사이트(Bird et al., 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A 85:58795883); (vii) 이중 특이적 단일 사슬 Fv 이량체(PCT/US92/09965); (viii) "2가 염색체” 또는 "3가 염색체”, 유전자 융합에 의해 이루어진 다가 또는 다중 특이적 단편(Tomlinson et al., 2000, Methods Enzymol.326:461-479; WO94/1380; Holliger et al., 1993,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 90:6444-6448); 및 (ix) 동일하거나 상이한 항체와 유전적으로 융합되는 scFv(Coloma&Morrison, 1997, Nature Biotechnology 15,159163)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본문에서 사용되는 용어 "모 항체” 또는 "모 면역글로불린”은 변형되지 않은 항체를 포함하고, 상기 항체는 이후 변형을 거쳐 변이체를 생성한다. 상기 모 항체는 천연적으로 존재하는 항체, 또는 천연적으로 존재하는 항체의 변이체 또는 개조된 버전일 수 있다. 모 항체는 항체 자체를 가리킬 수 있고, 상기 모 항체의 조성물을 포함하거나, 또는 아미노산 서열을 코딩한다. 본문에서 사용되는 용어 "모 항체” 또는 "모 면역글로불린”은 이후 변형을 거쳐 생성된 인간화 항체의 쥐 항체 또는 키메라 항체를 포함한다.
본문에서 사용되는 용어 "변이체 항체” 또는 "항체 변이체”는 모 항체에 비해 적어도 하나의 아미노산이 변형되어, 모 항체 서열과 상이한 항체 서열을 포함한다. 본문에서 변이체 항체 서열은 모 항체 서열과 적어도 약 80%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%, 더 바람직하게 적어도 약 95%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 것이 바람직하다. 항체 변이체는 항체 자체를 가리킬 수 있고, 상기 모 항체의 조성물을 포함하거나, 또는 이의 아미노산 서열을 코딩한다.
본문에서 사용되는 용어 "변이체”는 모 항체에 비해 적어도 하나의 아미노산이 변형되어, 모 항체 서열과 상이한 항체 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본문 중의 변이체 항체 서열은 모 항체 서열과 적어도 약 80%, 바람직하게 적어도 약 90%, 더 바람직하게 적어도 약 95%, 보다 더 바람직하게 적어도 약 97%, 더 바람직하게 적어도 약 98%, 가장 바람직하게 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 항체 변이체는 항체 자체를 가리킬 수 있고, 상기 모 항체의 조성물을 포함하거나, 또는 다른 아미노산 서열을 코딩한다. 용어 "아미노산 변형”은 아미노산의 치환, 추가 및/또는 결실을 포함한다. "아미노산 치환”은 다른 아미노산으로 모 폴리펩티드 서열 중 특정 위치에서의 아미노산을 대체하는 것을 의미한다. 예를 들어, 치환 R94K는 94 부위의 아르기닌이 라이신에 의해 대체되는 것을 가리킨다. 본문에서 사용되는 "아미노산 삽입”은 모 폴리펩티드 서열에서 특정 위치에 아미노산을 추가하는 것을 의미한다. 본문에서 사용되는 "아미노산 결실” 또는 "결실”은 모 폴리펩티드 서열에서 특정 위치에서의 아미노산을 제거함을 의미한다.
본 발명에서 논의되는 모든 면역글로불린 중쇄 불변 영역 위치는, 모두 Kabat의 EU 인덱스에 따라 넘버링된다(Kabat et al., 1991, sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed, United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 전문을 인용하여 통합됨). "Kabat의 EU 인덱스”는 예를 들어 Edelman et al., 1969, Biochemistry 63: 78~85에 기재된 것과 같은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호를 가리킨다.
본문에서 사용되는 용어 "항원 결정 부위”는 항원 에피토프라고도 하고, CLL1 단백질 서열의 연속 서열로 이루어지거나, CLL1 단백질 서열의 비연속적인 3차원 구조로 이루어질 수 있다.
용어 "단일 도메인 항체”는 항체의 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하거나, 또는 경쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 예를 들어, 하나의 중쇄 가변 영역(VHH)만을 포함한다.
용어 "면역 세포”는 "면역 이펙터 세포”라고도 하며, 면역 응답에 참여하고, 면역 이펙터를 생성하는 세포를 가리키며, 예를 틀어 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 수지상 세포, CIK 세포, 대식 세포, 비만 세포 등이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역 이펙터 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 T 세포는 자가 T 세포, 이종 T 세포, 동종 이계 T 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 NK 세포는 동종 이계 NK 세포일 수 있다.
본문에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체” 또는 "CAR"은 항원과 결합할 수 있는 세포 외 영역, 막 관통 영역 및 세포질 신호를 전달하는 도메인(즉 세포 내 신호 영역)을 포함하는 폴리펩티드를 가리킨다. 세포 내 신호 영역은 결정된 신호 전달 경로를 통해 2차 전달자를 생성하여 정보를 세포 내에 전송하여 세포 활성을 조절하는 단백질, 또는 이러한 전달자를 통해 이펙터로 작용하는 단백질을 가리키고, 일차 신호 영역을 포함하며, 아래에서 정의된 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호 전달 도메인(즉 공동 자극 신호 영역)을 더 포함할 수 있다. 세포 내 신호 영역은 CAR 세포(예를 들어 CART 세포)의 면역 이펙터 기능을 촉진할 수 있는 신호를 생성한다. 면역 이펙터 기능의 예로는, CART 세포에서, 세포 용해 활성 및 시토카인 분비를 포함하는 보조 활성을 포함한다.
용어 "일차 신호 영역”은 자극 방식으로 TCR 복합체의 초기 활성화를 조절한다. 일 양태에서, 일차 신호 영역은 예를 들어 TCR/CD3 복합체와 펩티드가 부가된 MHC 분자의 결합에 의해 개시되며, 이에 따라 T 세포 반응(증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 매개한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 신호 영역은 면역수용체 티로신 활성화 모티프 또는 ITAM의 신호 전달 모티프를 포함할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 ITAM 함유 일차 신호 영역의 예로는, TCR
Figure pct00001
, FcRγ, FcR
Figure pct00002
, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278("ICOS"라고도 함) 및 CD66d로부터 유래된 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 특정 예의 본 발명의 CAR에서, 임의의 하나 또는 다수의 본 발명의 CAR에서 세포 내 신호 전달 도메인은 세포 내 신호 전달 서열, 예를 들어 CD3
Figure pct00003
의 일차 신호 영역을 포함한다.
용어 "공동 자극 신호 영역”은 "공동 자극 분자”를 가리키고, T 세포 상의 관련 결합 파트너로서, 공동 자극 리간드에 특이적으로 결합하여, T 세포의 공동 자극 반응을 매개한다. 예를 들어 증식을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 공동 자극 분자는 효과적인 면역 반응에 필요한 비 항원 수용체의 세포 표면 분자 또는 이의 리간드이다. 공동 자극 분자는 MHCI클래스 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, 및 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 및 4-1BB(CD137)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 일 양태에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 단백질은 세포 외 항원 식별 도메인, 막 관통 도메인, 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호 전달 도메인을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 단백질은 세포 외 항원 식별 도메인, 막 관통 도메인, 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 공동 자극 분자의 기능적 신호 전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호 전달 도메인을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 단백질은 세포 외 항원 식별 도메인, 막 관통 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 하나 또는 다수의 공동 자극 분자로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호 전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호 전달 도메인을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노산(ND 말단)에서 선택 가능한 선도 서열을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포 외 항원 식별 도메인의 N 말단에서 선도 서열을 더 포함하고, 여기서 선도 서열은 CAR의 세포 가공 및 세포막으로의 위치 결정 과정에서 항원 식별 도메인(예를 들어 scFv)으로부터 임의로 절단된다.
본문에서 용어 "CD3
Figure pct00004
"은 GenBan 수탁 번호 BAG36664.1에서 제공되는 단백질, 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터 유래된 균등한 잔기로 정의된다. "CD3
Figure pct00005
도메인”은 T 세포 활성화에 필요한 일차 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한
Figure pct00006
사슬의 세포질 도메인로부터 유래된 아미노산 잔기로 정의된다. 일 양태에서,
Figure pct00007
의 세포질 도메인은 GenBan 수탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 및 이의 기능적 오르소로그(orthologs)로서, 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터 유래된 균등한 잔기를 포함한다.
본문에서 용어 "4-1BB"는 GenBankAcc.No.AAA62478.2의 아미노산 서열, 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터 유래된 균등한 잔기를 가지는 TNFR 슈퍼 패밀리의 멤버를 가리킨다. "4-1BB 공동 자극 도메인”은 GenBankACC.No.AAA62478.2의 아미노산 서열 214-255, 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터 유래된 균등한 잔기로 정의된다. 일 양태에서, "4-1BB 공동 자극 도메인”은 SEQIDNO:23에서 제공되는 서열, 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터 유래된 균등한 잔기이다.
본문에서 용어 "인터페론”은 전장 인터페론, 또는 전장 야생형 인터페론의 생물학적 활성을 기본적으로 유지(예를 들어 적어도 80%, 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 95%, 98% 또는 99%의 전장을 유지함)하는 인터페론 단편(절단된 인터페론) 또는 인터페론 돌연변이체를 가리킨다. 인터페론은 I형 인터페론(예를 들어, 인터페론 α 및 인터페론
Figure pct00008
) 및 II형 인터페론(예를 들어, 인터페론 γ)을 포함한다.
일부 상황에서, "T 세포”는 골수로부터 유래된 다기능 줄기세포일 수 있고, 흉선 내에서 면역 활성을 가지는 성숙된 T 세포로 분화 및 성숙된다. 일부 상황에서, "T 세포”는 특정 표현형 특징을 가지는 세포군, 또는 상이한 표현형 특징의 혼합 세포군체일 수 있고, 예를 들어 "T 세포”는 줄기세포 유사 기억 T 세포(stem cell-like memory T cells, Tscm 세포), 중심 기억 T 세포(Tcm), 이펙터 T 세포(Tef, Teff), 조절 T 세포(tregs) 및/또는 이펙터 기억 T 세포(Tem) 중 적어도 하나의 T 세포 하위 집단을 포함하는 세포일 수 있다. 일부 상황에서, "T 세포”는 γδ T 세포와 같은 어느 특정 하위 유형의 T 세포일 수 있다.
T 세포는 PBMC, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직 및 감염 부위 유래, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양의 조직으로부터 얻을 수 있다. 어떤 상황에서, 임의의 수량의 당업자에게 공지된 기술을 사용할 수 있고, 예를 들어 FicollTM 분리를 사용하여 개체로부터 수집된 혈액에서 T 세포를 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 성분채집술을 통해 개체의 순환 혈액으로부터의 세포를 얻는다. 성분채집 산물은 통상적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하여 림프구를 포함한다. 일 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분자를 제거하고 세포를 적합한 완충액 또는 배지에 넣어 후속 처리 단계에 적용할 수 있다. 또는, 건강한 기증자, 암 진단을 받은 환자의 유래 세포로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 변이체는 다양한 표적성 항-종양 약물 및 종양을 진단하는 약물에 응용될 수 있고, 특히 CLL1을 표적으로 하는 면역 이펙터 세포에 적용될 수 있다.
항-CLL1 항체
본 발명에서, 항체를 포함하고 scFv에 의한 항원 결합 영역을 가지는 항원 결합 단백질을 설명한다. 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리에서 scFv를 선택한다. 이런 분자는 세밀한 특이성을 시사한다. 예를 들어, 상기 항체는 안정적으로 HL60 및 U937 세포를 식별하고, k562 세포를 식별하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 scFv 서열을 가지는 항체를 포함하고, 상기 scFv 서열은 하나 또는 다수의 중쇄 불변 영역과 융합하여 인간 면역글로불린 Fc 영역을 가지는 항체를 형성하여 2가 단백질을 생성함으로써, 항체의 전체적인 친화성 및 안정성을 증가시킨다. 이 밖에, Fc 부분은 다른 분자(형광 염료, 세포 독소, 방사성 동위원소 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음)를 예를 들어 항원 정량 연구에 사용되는 항체와 직접 접합하는 것을 허용하여, 친화성 측정, 치료 약물의 표적 전달, 면역 이펙터 세포를 사용한 Fc 매개의 세포 독성의 테스트 및 다른 많은 응용에 사용되는 항체를 용이하게 고정한다.
본문에서 제공하는 결과는 본 발명의 항체가 CLL1을 표적할 때의 특이성, 감응성 및 유효성을 강조한다.
본 발명의 분자는 파지 디스플레이를 사용하여 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 감식하고 선택하며, 상기 단일 사슬 가변 단편의 아미노산 서열은 분자의 CLL1에 대한 특이성을 부여하고 본 발명의 모든 항원 결합 단백질의 기초를 형성한다. 따라서, 상기 scFv는 예를 들어 전장 항체, 이의 단편(예를 들어 Fab 및 F(ab')2), 융합 단백질(scFv_Fc를 포함함), 다가 항체를 포함하는 일련의 상이한 "항체” 분자를 설계하는데 사용될 수 있고, 즉, 동일한 항원 또는 상이한 항원에 대해 하나 이상의 특이성을 가지는 항체(예를 들어, 이중 특이성 T 세포 관여자(BiTE), 삼중 항체 등(Cuesta et al., M μLtivalent antibodies:when design surpasses evolution, Trends in Biotechnology 28:355-362,2010))를 가진다.
항원 결합 단백질이 전장 항체인 일 실시형태에서, 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장(예를 들어, 항체는 하나 이상 바람직하게는 2개의 완전한 중쇄, 및 하나 이상 바람직하게는 2개의 완전한 경쇄를 포함할 수 있음)이거나 또는 항원 결합 부분(Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv)을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE로부터 선택된다. 항체 유형은 설계된 항체에 의해 개시되는 면역 이펙터 기능에 따라 선택된다. 재조합 면역글로불린을 구축할 경우, 다양한 면역글로불린 아이소타입의 불변 영역의 적합한 아미노산 서열 및 다양한 종류의 항체를 생성하는 방법은 당업자에게 공지되었다.
제1 양태에서, 본 발명은 CLL1에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 항체는,
SYX1MX2로 표시되는 HCDR1, X3X4X5X6SGGSTX7YAX8X9X10X11G로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 40 또는 41로 표시되는 HCDR3, 및 RASQSISSX12LX13으로 표시되는 LCDR1, X14ASX15LX16S로 표시되는 LCDR2, QQX17YSX18PX19X20T로 표시되는 LCDR3을 가지고, 여기서, 상기 X1은 A 또는 Y로부터 선택되며, X2는 S 또는 H로부터 선택되고, X3은 A 또는 I이며, X4는 I 또는 F로부터 선택되고, X5는 S 또는 N으로부터 선택되며, X6은 G 또는 P로부터 선택되고, X7은 Y 또는 S로부터 선택되며, X8은 D 또는 Q로부터 선택되고, X9는 S 또는 K로부터 선택되며, X10은 V 또는 F로부터 선택되고, X11은 K 또는 Q로부터 선택되며, X12는 W 또는 Y로부터 선택되고, X13은 A 또는 N으로부터 선택되며, X14는 D 또는 V로부터 선택되고, X15는 N 또는 S로부터 선택되며, X16은 E 또는 Q로부터 선택되고, X17은 Y 또는 S로부터 선택되며, X18은 Y 또는 T로부터 선택되고, X19는 M 또는 L로부터 선택되며, X20은 I로부터 선택되거나 존재하지 않는다.
바람직한 일 실시형태에서, 이는 SEQ ID NO: 35, 36의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 37, 38, 39의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 40, 41의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 CLL1에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 이는 SEQ ID NO: 42, 43, 44의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 49, 50의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 CLL1에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 35, 36의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 37, 38, 39의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 40, 41의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하거나, 및/또는 SEQ ID NO: 42, 43, 44의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 49, 50의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 바람직하게, 상기 CLL1에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 35, 36의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및 SEQ ID NO: 37, 38, 39의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 40, 41의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 SEQ ID NO: 42, 43, 44의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및 SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 49, 50의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 더 바람직하게, 상기 CLL1에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 35, 36의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및 SEQ ID NO: 37, 38, 39의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 40, 41의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 SEQ ID NO: 42, 43, 44의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및 SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 49, 50의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 67, 68, 69로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 CLL1에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 CLL1에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
이런 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 각각 CLL1에 결합할 수 있는 것을 고려하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 "혼합 및 매칭”하여 본 발명의 항-CLL1 결합 분자를 생성할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CLL1에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 변이체를 제공한다. 따라서 본 발명은 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 서열과 적어도 80% 동일한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 가지는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 바람직하게, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 특히 96%, 더 특히 97%, 보다 더 특히 98%, 가장 특히 99%이고, 예를 들어 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%를 포함한다. 변이체는 본 발명에 따른 항체를 모 항체로 하고, 효모 라이브러리의 스크리닝, 파지 라이브러리의 스크리닝, 점 돌연변이 등 방법을 통해 얻을 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명에서 제공한 항체 LCDR1은 돌연변이되고, RASQSISSX12LX13에서 RASQWIARX12LX13으로 돌연변이되며, 예를 들어, 돌연변이된 LCDR1의 서열은 SEQ ID NO: 44로 표시된다.
또 다른 양태에서, 본 발명에서 제공한 항체 HCDR2"X3X4X5X6SGGSTX7YAX8X9X10X11G"의 X3X4X5X6은 AISG 또는 IFNP로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 상기 항체 HCDR2는 돌연변이되고, X3X4X5X6SGGSTX7YAX8X9X10X11G에서 X3X4X5X6GGGSTX7YAX8X9X10X11G로 돌연변이되며, 예를 들어, 돌연변이된 HCDR2의 서열은 SEQ ID NO: 39로 표시된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역에 대해 돌연변이를 진행할 수 있고, 예를 들어 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 13에서 SEQ ID NO: 67, 68 또는 69로 돌연변이된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술한 항-CLL1 항체와 동일한 항원 결정 부위를 식별하는 항체를 제공한다.
항-CLL1 항체 특성
항-CLL1 항체와 같은 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 측정은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 ELISA, biacore, 웨스턴 블롯 및 유세포 분석기에 의한 분석 등을 포함한다. 적합한 측정은 실시예에 상세히 기재되어 있다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 CLL1에 결합하는 항체 및 이의 단편을 코딩하여 분리된 핵산, 벡터 및 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 더 제공한다. 핵산은 완전한 세포 및 세포 용해물에 위치하거나, 또는 부분 정제 또는 기본적으로 정제된 형태일 수 있다.
표준적인 분자 생물학 기술을 이용하여 본 발명의 핵산을 얻을 수 있으며, 예를 들어 표준 PCR 확장 또는 cDNA 클론 기술을 통해, 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하거나 또는 VH 및 VL 구간을 코딩하는 cDNA를 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리에서 얻은 항체(예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용함)에 대해, 라이브러리에서 항체를 코딩하는 하나 또는 다수의 핵산을 회수할 수 있다. 숙주 세포에 외인성 핵산을 도입하는 방법은 일반적으로 본 분야에 공지되어 있고, 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 핵산 분자는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 SEQ ID NO: 2,6,14로부터 선택되는 것들 이거나, 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 SEQ ID NO: 4,8,12,16으로부터 선택되는 것들이다. 더 바람직하게 이런 핵산 분자는, 중쇄를 코딩하는 SEQ ID NO: 2 서열, 및 경쇄를 코딩하는 SEQ ID NO: 4 서열 또는 중쇄를 코딩하는 SEQ ID NO: 6 서열, 및 경쇄를 코딩하는 SEQ ID NO: 8 서열 또는 중쇄를 코딩하는 SEQ ID NO: 2 서열, 및 경쇄를 코딩하는 SEQ ID NO: 12 서열 또는 중쇄를 코딩하는 SEQ ID NO: 14 서열, 및 경쇄를 코딩하는 SEQ ID NO: 16 서열을 포함한다.
단백질의 발현을 위해, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산을 발현 벡터에 통합시킬 수 있다. 다양한 발현 벡터는 단백질 발현에 사용될 수 있다. 발현 벡터는 자가 복제된 염색체 외 벡터, 또는 숙주 게놈에 통합된 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용되는 발현 벡터는 포유동물 세포, 세균, 곤충 세포, 효모 및 체외 시스템에서 단백질을 발현시킬 수 있는 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 분야에 공지된 바와 같이, 다양한 발현 벡터는 상업적 또는 다른 방식으로 얻을 수 있다. 본 발명에 사용되어 항체를 발현할 수 있다.
면역접합체
본 발명은 본문에서 설명한 항체를 포함하고 적어도 하나의 다른 유형의 기능성 분자를 더 포함하는 다기능 면역접합체를 더 제공한다. 상기 기능성 분자는 종양 표면 마커를 표적으로 하는 분자, 종양을 억제하는 분자, 면역 세포의 표면 마커를 표적으로 하는 분자 또는 검출 가능한 라벨로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다. 상기 항체와 상기 기능성 분자는 공유 결합, 커플링, 부착, 가교 등 방식을 통해 접합체를 구성한다.
하나의 바람직한 수단으로서, 상기 면역접합체는 본 발명의 항체 및 적어도 하나의 종양 표면 마커를 표적으로 하는 분자 또는 종양을 억제하는 분자를 포함할 수 있다. 상기 종양을 억제하는 분자는 항-종양 시토카인, 또는 항-종양 독소일 수 있고; 바람직하게, 상기 시토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, I형 IFN, TNF-alpha를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 상기 종양 표면 마커를 표적으로 하는 분자는 본 발명의 항체가 표적하는 동일한 종양의 표면 마커를 표적으로 하는 분자이다. 예를 들어, 상기 종양 표면 마커를 표적으로 하는 분자는 종양 표면 마커에 결합하는 항체 또는 리간드일 수 있고, 예를 들어 본 발명의 항체와 협동 작용하여, 종양 세포를 더 정확하게 표적할 수 있다.
하나의 바람직한 수단으로서, 상기 면역접합체는 본 발명의 항체 및 검출 가능한 라벨을 포함할 수 있다. 상기 검출 가능한 라벨은 효소, 보결분자단, 형광 재료, 발광 재료, 생물 발광 재료, 방사성 재료, 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온과 같은 형광 라벨, 발색 라벨을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 라벨을 포함할 수도 있다. 검출 및/또는 분석 및/또는 진단 목적으로 항체를 표기하기 위해 사용되는 표기는 사용된 특정 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법, 예를 들어 면역 조직 화학 염색(조직) 샘플, 유세포 분석 기술 등에 의존한다. 본 분야에 공지된 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법에 적합한 표기는 당업자에게 잘 알려져 있다.
하나의 바람직한 수단으로서, 상기 면역접합체는 본 발명의 항체 및 면역 세포의 표면 마커를 표적으로 하는 분자를 포함할 수 있다. 상기 면역 세포의 표면 마커를 표적으로 하는 분자는 면역 세포 표면 마커와 결합하는 항체 또는 리간드일 수 있고, 면역 세포를 식별할 수 있으며, 이는 본 발명의 항체를 면역 세포에 운반하고, 동시에 본 발명의 항체는 면역 세포를 종양 세포에 표적화하여, 면역 세포가 종양을 특이적으로 살상하도록 할 수 있다. 상기 면역 세포 표면 마커는 CD3, CD16, CD28로부터 선택될 수 있고, 더 바람직하게, 면역 세포 표면 마커와 결합하는 항체는 항-CD3 항체이다. 면역 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포로부터 선택될 수 있다.
직접적 또는 간접적(예를 들어 링커에 의해)인 접합에 의해 면역접합체를 화학적으로 생성시키는 수단으로서, 상기 면역접합체는 융합 단백질로 생성될 수 있고, 상기 융합 단백질은 본 발명의 항체 및 적합한 다른 백질을 포함한다. 융합 단백질은 본 분야에 공지된 방법으로 생성될 수 있고, 예를 들어 프레임에 부합되는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 적합한 라벨을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 구축하고 다음 상기 핵산 분자를 발현하여 재조합적으로 생성된다.
본 발명의 다른 양태에서는 본 발명의 적어도 하나의 항체, 이의 기능 변이체 또는 면역접합체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일단 관련 서열을 얻게 되면, 재조합 방법으로 관련 서열을 대량으로 얻을 수 있다. 이는 통상적으로 벡터에 클로닝하고, 다시 세포에 옮긴 후, 통상적인 방법에 의해 증식시킨 후 숙주 세포 세포로부터 분리하여 관련 서열을 얻는다.
본 발명은 또한 상기 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터(promoter) 또는 제어 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이런 벡터는 적절한 숙주 세포를 형질 전환시켜, 단백질을 발현할 수 있도록 한다. 숙주 세포는 세균세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다.
항-CLL1 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체
본 발명은 다양한 키메라 항원 수용체(CAR)를 더 제공하고, 여기서 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 포함하며, 상기 CAR-T 세포는 항-종양 성질을 나타낸다. 일부 실시예에서, CAR을 코딩하는 바이러스 벡터를 사용하여 세포(예를 들어 T 세포)를 형질 도입한다. 일부 실시예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 세포는 CAR을 안정적으로 발현시킬 수 있다.
일 바람직한 예에서, CAR의 CLL1 결합 부분은 scFv 항체 단편이고, 이로부터 유래된 IgG 항체에 비해 동등한 친화성 결합성을 유지하며, 예를 들어 상응한 효능으로 동일한 항원에 결합한다. 상기 항체 단편은 기능적이고, 이에 의해 예를 들어 면역 반응 활성화, 이의 표적 항원에서 신호 전달 개시 억제, 키나아제 활성 억제 등 생화학적 반응를 제공한다. 따라서, 본 발명은 엔지니어링을 거쳐 T 세포에 도입되고 WT1 결합 영역을 포함하는 CLL1-CAR, 및 이를 입양 면역 요법에 사용하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, CAR의 항-CLL1 항원 결합 영역은, 이로부터 유래된 마우스 서열에 비해 scFv가 인간화된 scFv 항체 단편이다.
일 양태에서, 본 발명의 CAR은 특정 항체의 항원 결합 영역 및 세포 내 신호 전달 분자를 함께 조합한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 세포 내 신호 전달 분자는 CD3
Figure pct00009
사슬, 4-1BB 및 CD28 신호 전달 모듈 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일 양태에서, CLL1-CAR은 CD137(4-1BB) 신호 전달 도메인, CD28 신호 전달 도메인, CD3
Figure pct00010
신호 도메인, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일 양태에서, CLL1-CAR은 하나 또는 다수의 비 CD137(4-1BB) 또는 CD28의 공동 자극 분자로부터 유래되는 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다.
예시적으로, CLL1-CAR의 서열은 4F2 28Z (SEQ ID NO: 55), 4F2 BBZ (SEQ ID NO: 56), 4F2 28BBZ (SEQ ID NO: 57), 25H8 28Z (SEQ ID NO: 58), 25H8 BBZ (SEQ ID NO: 59), 25H8 28BBZ (SEQ ID NO: 60), 7F8 28Z (SEQ ID NO: 61), 7F8 BBZ (SEQ ID NO: 62), 7F8 28BBZ (SEQ ID NO: 63), 12G4m 28Z (SEQ ID NO: 64), 12G4m BBZ (SEQ ID NO: 65), 12G4m 28BBZ (SEQ ID NO: 66), 12G4m(M1331) 28Z (SEQ ID NO: 73), 12G4m(M1331) BBZ (SEQ ID NO: 9), 12G4m(M1331) 28BBZ(SEQ ID NO: 10) 일 수 있고, 상기 SEQ ID NO: 55-66, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 9-10의 막 관통 영역 및 세포 내 영역은 당업자에 의해 통상적인 막 관통 영역 및 세포 내 영역으로 대체될 수 있고, 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
키메라 항원 수용체 변형된 T 세포
본 발명은 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역 세포를 더 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체 변형된 T 세포는 또한 외인성 시토카인의 코딩 서열을 보유하고; 바람직하게, 상기 시토카인은 IL-12, IL-15 또는 IL-21을 포함한다. 상기 면역 세포는 T 림프구, NK 세포 또는 NKT 세포로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또 다른 양태에서, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체 변형된 T 세포는 천연 PD-1, 또는 PD-L1에 결합할 수 있는 돌연변이 PD-1, 또는 PD-L1에 결합할 수 있는 천연 또는 돌연변이 PD-1의 단편, 또는 항-PD-L1 항체와 같은 PD-L1 차단제 또는 PD-L1을 차단시키는 단백질을 더 보유한다.
약학 조성물
본 발명의 항체, 상기 항체를 포함하는 면역접합체 및 유전자 변형된 면역 세포는 약학 조성물 또는 진단 시약의 제조에 응용될 수 있다. 상기 조성물은 유효량의 상기 항체, 면역접합체 또는 면역 세포를 포함할 뿐만 아니라, 약학적으로 허용 가능한 벡터를 더 포함할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한”은 분자 본체 및 조성물이 동물 또는 인간에게 적절하게 투여될 경우, 불리하고, 민감하거나 다른 불량 반응이 일어나지 않는 것을 가리킨다.
약학적으로 허용 가능한 벡터 또는 성분으로서의 일부 물질의 구체적인 예로, 젖당, 포도당 및 수크로스와 같은 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 에틸셀룰로오스 및 케틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 구미 트라가칸타에(gummi tragacanthae) 분말; 맥아; 젤라틴(gelatin); 활석; 스테아르산 및 스테아린산 마그네슘과 같은 고체 윤활제; 황산칼슘; 땅콩기름, 면실유, 참기름, 올리브기름, 옥수수기름 및 카카오 기름과 같은 식물성 유지; 프로필렌글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다가 알코올; 알긴산; Tween과 같은 유화제; 황산 도데실 나트륨과 같은 습윤제; 착색제; 향미제; 타정제, 안정제; 산화 방지제; 방부제; 무열원수; 등삼투염 용액; 및 인산염 완충액 등이다.
본 발명의 조성물은 필요에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 환자의 종류, 나이, 체중 및 대체적인 질병 상황, 투여 방식 등 요소에 따라 환자에게 유익한 투여량은 의사에 의해 결정될 수 있다. 투여 방식은 예를 들어 주사 또는 다른 치료 방식을 사용할 수 있다.
본 발명의 이점:
1. 본 발명은 CLL1에 대해 특이적인 항체를 제공한다.
2. 본 발명의 항체는 CLL1에 대해 상대적으로 높은 친화성을 가지고, 키메라 항원 수용체 변형된 T 세포로 제조된 후, CLL1을 발현하는 세포에 대해 현저한 살상 작용이 있다. 및
3. 본 발명은 상기 항체를 이용하여 제조된 키메라 항원 수용체 변형된 T 세포를 제공하므로, 본 발명의 항체 및 면역 이펙터 세포는 급성 골수성 백혈병의 치료에 안전하며 효과적으로 응용될 수 있다.
아래에 구체적인 실시예를 결부하여, 본 발명을 더 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다. 아래 실시예에서 구제적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은, 일반적으로 J. Sambrook 등이 편집한 분자 복제 실험 가이드, 제3판, 과학출판사, 2002에 따른 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건과 같은 통상적인 조건을 따른다.
실시예 1: 완전 인간 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 CLL1에 대해 특이적인 scFv의 스크리닝
본 발명에서 사용한 파지 디스플레이 라이브러리는 본 회사에서 구축한 완전 인간의 천연 scFv 파지 라이브러리이고, 라이브러리 용량은 1E+11이다. 당업자에게 공지된 스크리닝 방법을 이용하여 CLL1에 대해 고도로 특이적인 scFv 단편을 얻었다. 간단히 말해서, 10 ug/ml의 항원 CLL1-huFc(진핵에 의해 발현된 후 protein A 충전제로 배양 상층액에 대해 친화성 정제를 진행하여 제조됨) 및 인간 Fc 단편을 면역 튜브에 각각 코팅한다. Fc 단편의 영향을 감소하기 위해, 파지 라이브러리를 인간 Fc 단편이 코팅된 면역 튜브에 넣어 1hr 결합시켰다. 상측액을 취하여 CLL1-huFc가 코팅된 면역 튜브에 넣어 1.5 시간 결합시킨 다음, 비 특이적인 파지를 세척하고, 결합된 파지를 용리시키며 대수기의 대장균 TG1을 감염시켰다. 용리된 파지를 확대 배양하고 PEG/NaCl 침전으로 확대된 파지 라이브러리를 정제하여 다음 라운드의 스크리닝에 사용하였다. 3~4회 순환의 패닝(panning)을 진행하여 CLL1과 특이적으로 결합하는 scFv 파지 클론을 축적하였다. CLL1-huFc에 대한 표준 ELISA 방법을 통해 양성 클론을 결정하고, ELISA 검출 맵은 도 1에 도시된 바와 같다. ELISA는 인간 Fc 단편을 무관 항원으로 사용하여 항체의 특이성을 검증하였다.
스크리닝 후 2개의 특이적으로 결합된 HL60 및 U937 세포(HL60/U937은 CLL1 양성 세포이고, k562는 CLL1 음성 세포임)(도 3)를 얻었고, 클론 명칭은 4F2 및 25H8이며, 4F2 및 25H8의 Biacore 맵은 도 2에 도시된 바와 같다. 시퀀싱 분석 결과, 4F2의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열이며; 25H8의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열이고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열이다.
Kabat의 EU 인덱스에 따라 분석하면, 4F2의 HCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 35로 표시되고, HCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 37로 표시되며, HCDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 40으로 표시되고, LCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 42로 표시되며, LCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 45로 표시되고, LCDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 49로 표시된다.
25H8의 HCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 36으로 표시되고, HCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 38로 표시되며, HCDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 41로 표시되고, LCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 43으로 표시되며, LCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 46으로 표시되고, LCDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 50으로 표시된다.
실시예 2: 항체의 친화성 성숙
파지 디스플레이 기술을 이용하여 친화성 성숙을 진행하였다.
4F2 및 25H8을 모 항체로 하고, 경쇄 가변 영역의 LCDR1 및 LCDR2에 대해 무작위로 돌연변이시켜, 친화성 성숙된 파지 라이브러리를 구축하였다. 2 라운드의 스크리닝 후 단일 클론을 선택하여 ELISA 검출을 진행하고, 양성 클론을 시퀀싱하고 발현 및 정제하였으며, 이상의 실험을 종합하여, 모두 2개의 높은 친화성 및 인간 CLL1에 특이적으로 결합하는 항체를 얻고, 7F8(4F2로 유래됨) 및 12G4(25H8로부터 유래됨)로 명명하였다.
시퀀스 분석 결과, 7F8의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열이며; 12G4의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열이고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열이다.
7F8의 LCDR1의 서열은 SEQ ID NO: 44로 표시되고, LCDR2의 서열은 SEQ ID NO: 47로 표시되며, LCDR3 및 중쇄의 CDR 영역의 서열은 모 항체(4F2)와 일치하다.
12G4의 LCDR1의 서열은 25H8과 동일하고, LCDR2의 서열은 SEQ ID NO: 48로 표시되며, LCDR3 및 중쇄의 CDR 영역의 서열은 모 항체(25H8)와 일치하다.
여기서 12G4는 중쇄의 CDR2 영역에서 하나의 글리코실화 사이트를 함유하고, 그중의 세린를 글리신으로 돌연변이시킨 후 새로운 항체를 얻었으며, 12G4m으로 명명하고, 12G4m의 HCDR2의 서열은 SEQ ID NO: 39로 표시된다.
12G4m의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:13으로 표시되는 아미노산 서열이고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열이다.
ELISA를 통해 7F8 및 12G4m의 scFV와 인간 CLL1의 결합 상황을 검출하고, 이는 현저한 결합을 나타내었다(도 4 참조).
7F8 및 12G4m의 scFv를 Biacore 검출하고, 결과는 도 5에 도시된 바와 같이, 모 항체에 비해 친화성이 10배 정도 향상되었음을 나타내었다.
ELISA는 인간 Fc 단편을 무관 항원으로 사용하여 항체의 특이성을 검증하였다. 항체 7F8 및 12G4m의 scFv과 CLL1 발현 양성 세포가 특이적으로 결합한 상황은 도 6에 도시된 바와 같이, 항체는 양성 세포에 특이적으로 결합할 수 있지만, 음성 세포(HL60 및 U937은 CLL1 발현 양성 세포이고, k562는 CLL1 비발현 음성 세포임)에는 결합하지 않았다.
실시예 3: ELISA에 의한 7F8 및 12G4m 항체와 상이한 종 CLL1의 결합 검출
표준 ELISA를 통해 항체 7F8 및 12G4m의 종 특이성을 검출하였다. 1 ug/ml의 인간 CLL1-hFc, 쥐 CLL1-hFc, 원숭이 CLL1-hFc를 4℃에서 ELISA 플레이트에 코팅하고 하룻밤 지냈으며, 2%의 MPBS를 넣어 실온에서 1 ~ 2시간 밀봉하고, 200 nM의 항체 7F8/12G4m(scFv)를 넣어 실온에서 1시간 인큐베이팅하였으며, 2차 항체는 항-His 쥐 단일 항체로 1:1000으로 희석하고, 3차 항체는 염소 항-쥐-HRP로 1:2000로 희석하여 사용하였으며, 실온에서 1시간 인큐베이팅한킨 후 발색하고, 1M의 농축 황산을 넣어 중지 시킨 후 OD450 수치를 읽었다(도 7 참조). 항체 7F8 및 12G4m은 인간 CLL1에만 결합하고, 쥐 CLL1 및 원숭이 CLL1에는 결합하지 않았다.
실시예 4: CLL1 항체 scFv-Fc 형태 구축 및 이의 단량체 비율의 검출
항-CLL1 항체 7F8 및 12G4m을 인간 IgG의 Fc 단편과 융합 발현시키고, 293Fectin 형질 전환 시약으로 293F 세포를 형질 전환시켰으며, 6일째에 상측액을 수집하고, Protein A 충전재를 사용하여 친화성 정제를 진행하였으며, 정제된 단백질은 GE XK16/40 빈 크로마토그래피 칼럼을 통과시키고, 단량체 피크를 수집하였으며, 단량체 비율을 측정하였고, 여기서 항체 7F8의 단량체 비율은 99.30%, 항체 12G4m의 단량체 비율은 58.50%이며, 결과는 도 8을 참조한다.
항체 7F8 단백질은 분획 분자량(molecular weight cutoff)이 10KD인 Millipore 한외 여과 원심 분리 튜브로 농축하여, OD280/흡광 계수를 통해 농도를 측정하였으며 결과는 표 1을 참조하고; 샘플을 취하여 SDS-PAGE에 통과시켰으며, 결과는 도 9를 참조한다.
단백질 부피(ml) 농도(mg/ml) 전체량(mg) 분자 스크리닝 전(mg) 회수율 단량체 비율
7F8-huFc 0.57 0.22 0.12 2.15 5.60% 99.30%
12G4m-huFc 0.54 1.57 0.85 2.6 32.70% 58.50%
12G4m에 대해 분해 및 중합 개조를 진행하였다. Discovery studio 소프트웨어를 통해 12G4m의 3D 모델을 구축하였고, 그중의 잠재적 응집 사이트를 분석하였으며, 소프트웨어 예측을 통해, 이런 사이트에 대해 점 돌연변이를 진행하였고, 돌연변이된 항체와 인간 IgG의 Fc 단편을 scFv-Fc 형태로 융합하였으며, 293F 세포를 통해 발현되었고, 발현 산물은 정제된 후 SEC에 의해 단량체 비율 검출을 진행하였으며, 결과에 따르면, 단량체 비율이 12G4m보다 현저히 높은 3개의 돌연변이체를 얻었고, 각각 중쇄 가변 영역 제9 부위의 알라닌에서 돌연변이된 프롤린(12G4m-A9P), 제93 부위의 발린에서 돌연변이된 L-아이소루신(12G4m-V93I), 및 제113 부위의 DL-메싸이오닌에서 돌연변이된 류신(12G4m-M133I)이며, 여기서, 12G4m-M133I의 단량체 비율은 95% 이상이다. 12G4m-A9P, 12G4m-V93I 및 12G4m-M133I의 돌연변이 사이트는 모두 중쇄 가변 영역에서 발생하였고, 이의 중쇄 가변 영역의 서열은 각각 SEQ ID NO: 67, 68, 69로 표시된다.
12G4m-A9P의 scFv 서열은 SEQ ID NO: 70으로 표시되고, 12G4m-V93I의 scFv 서열은 SEQ ID NO: 71로 표시되며, 12G4m-M133I의 scFv 서열은 SEQ ID NO: 72로 표시된다.
실시예 5: FACs를 이용한 항체와 U937 세포의 결합 EC50의 측정
실시예 4에서 얻은 scFv-Fc 융합 단백질을 이용하여, FACs에 의해 항-CLL1 항체의 EC50를 검출하였고, 구체적인 방법은 아래와 같다. U937 세포를 1Х105개/웰로 96웰의 U형 베이스판에 넣고, FcR blocking 시약을 이용하여 4℃에서 30분간 밀봉하였으며, 300 μL/웰 1%의 FBS로 세포를 2회 세척하였고, 다음 구배 희석된 100 μL의 CLL1 항체 7F8, 12G4m, 4F2, 25H8(1000 nMol/mL를 시작 농도로, 5배 희석, 7개의 농도 구배가 있음)을 넣었으며, 혼합 후 4℃에서 45분간 인큐베이팅시켰고, 원심 분리하여 상측액을 제거하였으며, 300 μL/웰 1%의 FBS로 세포를 2회 세척하였다. FITC 표기된 Goat anti human Fc(JacksonImmunoResearch, Code number:109-095-098)를 1%의 FBS로 200배 희석하고 세포에 추가하였으며, 4℃에서 45분간 인큐베이팅한 후, 원심 분리 작업을 진행하여, 상측액을 제거하였고, 300 μL/웰 1%의 FBS로 세포를 2회 세척하였다. 최종으로 200 μL/웰 1%의 FBS로 세포를 재현탁하고 유세포 분석기의 검출에 사용하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 항-인간 CLL1 항체 7F8, 12G4m, 4F2 및 25H8의 EC50 값은 각각 0.06474 nM, 0.4271 nM, 0.7370 nM 및 0.1638 nM이고, 이의 EC50 값은 모두 1 nM보다 작으며, 우수한 세포 살상 효과를 나타낸다.
실시예 6: 항-CLL1 키메라 항원 수용체 플라스미드(CAR)의 구축
a. 항-CLL1 항체 7F8 키메라 항원 수용체 플라스미드의 구축
PRRLSIN-cPPT.EF-1α(Addgene에서 구매함)를 벡터로 하여, 항체 7F8을 발현하고 PRRLSIN-cPPT.EF-1α-7F8-28Z, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-7F8-BBZ 및 PRRLSIN-cPPT.EF-1α-7F8-28BBZ를 포함하는 2세대 키메라 항원 수용체의 렌티바이러스 플라스미드를 구축하였다.
7F8-28Z 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 17), 7F8scFV(SEQ ID NO: 31), CD8 경첩(SEQ ID NO: 19), CD28 막 관통 영역(SEQ ID NO: 51) 및 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 53) 및 CD3
Figure pct00011
( SEQ ID NO: 25)로 구성되고; 7F8-BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 17), 7F8scFV(SEQ ID NO: 31), CD8 경첩(SEQ ID NO: 19) 및 막 관통 영역(SEQ ID NO: 21), CD137 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 23) 및 CD3
Figure pct00012
( SEQ ID NO: 25)로 구성되며; 7F8-28BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 17), 7F8scFV(SEQ ID NO: 31), CD8 경첩(SEQ ID NO: 19), CD28 막 관통 영역(SEQ ID NO: 51) 및 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 53), CD137 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 23) 및 CD3
Figure pct00013
( SEQ ID NO: 25)로 구성된다.
b. 항-CLL1 항체 12G4m 키메라 항원 수용체 플라스미드의 구축
PRRLSIN-cPPT.EF-1α를 벡터로 하여, 항체 12G4m을 발현하고 PRRLSIN-cPPT.EF-1α-12G4m-28Z, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-12G4m-BBZ 및 PRRLSIN-cPPT.EF-1α-12G4m-28BBZ를 포함하는 2세대 키메라 항원 수용체의 렌티바이러스 플라스미드를 구축하였다.
12G4m-28Z 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 17), 12G4m scFV(SEQ ID NO: 33), CD8 경첩(SEQ ID NO: 19), CD28 막 관통 영역(SEQ ID NO: 51) 및 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 53) 및 CD3
Figure pct00014
( SEQ ID NO: 25)로 구성되고; 12G4m-BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 17), 12G4m scFV(SEQ ID NO: 33), CD8 경첩(SEQ ID NO: 19) 및 막 관통 영역(SEQ ID NO: 21), CD137 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 23) 및 CD3
Figure pct00015
( SEQ ID NO: 25)로 구성되며; 12G4m-28BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 17), 12G4m scFV(SEQ ID NO: 33), CD8 경첩(SEQ ID NO: 19), CD137 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 23) 및 CD3
Figure pct00016
( SEQ ID NO: 25)로 구성된다.
c. 항-CLL1 항체 12G4m-M1331(본문에서 12G4m(M1331)로도 씀) 키메라 항원 수용체 플라스미드의 구축
PRRLSIN-cPPT.EF-1α를 벡터로 하여, 항체 12G4m-M1331을 발현하는 2세대 키메라 항원 수용체의 렌티바이러스 플라스미드, 즉 PRRLSIN-cPPT.EF-1α-12G4m(M1331)-BBZ를 구축하였다. 12G4m(M1331)-28Z 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 17), 12G4m (M1331) scFV(SEQ ID NO: 72), CD8 경첩(SEQ ID NO: 19), CD28 막 관통 영역(SEQ ID NO: 51) 및 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 53) 및 CD3
Figure pct00017
( SEQ ID NO: 25)로 구성되고; 12G4m(M1331)-BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 17), 12G4m (M1331) scFV(SEQ ID NO: 72), CD8 경첩(SEQ ID NO: 19) 및 막 관통 영역(SEQ ID NO: 21), CD137 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 23) 및 CD3
Figure pct00018
( SEQ ID NO: 25)로 구성되며; 12G4m(M1331)-28BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 17), 12G4m (M1331) scFV(SEQ ID NO: 72), CD8 경첩(SEQ ID NO: 19), CD137 세포 내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 23) 및 CD3
Figure pct00019
( SEQ ID NO: 25)로 구성된다.
실시예 7: CLL1 특이적 CAR 바이러스 패키징 및 CAR T 감염 양성률의 검출
먼저 제삼인산칼슘 방법으로 렌티바이러스를 패키징하였고, 바이러스 상층액을 PEG8000/NaCl로 정제하였으며, 정제한 후 FACS 법으로 바이러스에 대해 적정 농도 검출을 진행하였고, 유세포 분석기 검출 결과에 따르면, 7F8-CART, 12G4m-CART 및 12G4m-M1331 CART 바이러스 적정 농도는 각각 2.37E+08, 1.41E+08 및 7.99E+07이다.
다음 CD3/CD28 자성 비드에 의해 48시간 활성화한 후의 T 세포를 바이러스(바이러스 부피(mL)=세포 개수×MOI 값(MOI=10)/적정 농도)로 감염시켜, 7F8-BBZ CAR T, 12G4m-BBZ CAR T 및 12G4m(M1331)-BBZ-CART 세포를 얻었고, 감염 후 9일째에 FACS 방법을 이용하여 CAR 발현 양성률을 검출하였으며, 결과는 도 11을 참조한다. 7F8-BBZ CAR T의 CAR 양성률은 41.94%이고, 12G4m-BBZ CAR T의 CAR 양성률은 60.14%이며, 12G4m(M1331)-BBZ CAR T의 CAR 양성률은 55.64%이다.
실시예 8: CLL1을 표적으로 하는 양성 세포의 체외 살상 독성 검출
선행 기술에 보도된 항체 M26(CN104736562B)을 양성 대조로 하고, 통상적인 수단으로 M26-BBZ CAR T를 제조하였다. CytoTox 96 비방사성 세포 독성 검출 키트(Promega 회사)를 사용하여 실험을 진행하였다. 구체적인 방법은 CytoTox 96 비방사성 세포 독성 검출 키트의 설명서를 참조한다.
이펙터 세포: 이펙터-표적 비 3: 1, 1: 1, 1: 3 및 1:9에 따라 Untransduced(UTD) T 세포, 7F8-BBZ CART 세포, 12G4m-BBZ CART 세포를 96웰 판에 각각 접종시켰다.
표적 세포: 50 μL 2Х105/mL의 CLL1 발현 양성의 HL-60과 U937 세포 및 CLL1 발현 음성의 K562 세포를 각각 대응되는 96웰 판에 접종시켰다.
실험 결과는 도 12에 도시된 바와 같고, 본 발명의 7F8-BBZ CAR T, 12G4m-BBZ CAR T는 대조군 UTD에 비해, CLL1 발현 양성의 HL-60과 U937 세포에 대해 이펙터-표적 비가 3:1, 1:1 및 1:3일 때 모두 현저한 독성 살상 작용이 있지만, CLL1 발현 음성의 K562 세포에 대해 살상 작용이 거의 없다. 이 밖에, 12G4m-BBZ CAR T는 CLL1 발현 양성의 HL-60과 U937 세포에 대해, 모두 선행 기술 M26-BBZ CAR T보다 더 우수한 살상 작용을 나타내고, 7F8-BBZ CAR T는 HL-60에 대한 살상 작용도 M26-BBZ CAR T보다 우수하다.
실시예 9: 마우스 체내 세포 살상 실험
1) 실험군: 6 ~ 8주령 암컷 NPG 마우스를 무작위로 4군으로 나누고, 각각의 군은 6마리이며, 각각 Untransduced T(UTD), 12G4m-BBZ CART 군(1.0Х106/마리 마우스), 12G4m-BBZ CART 군(2.0Х106/마리 마우스), 12G4m-BBZ CART(4.0Х106/마리 마우스) 세포 치료군이다.
2) 피하 이식 종양의 접종: 대수기 및 성장 상태가 양호한 HL-60 세포를 수집하였고, 세포 밀도를 1.5Х107/mL로 조정하였으며, NPG 마우스의 오른쪽 겨드랑이 부분의 피하 부위에 접종시켰고, 부피가 200 μL인 세포 현탁액을 접종시켰으며, 즉 각 마우스에 3.0Х106의 종양 세포를 접종시켰고, 접종 일을 0일째로 기록하였다.
3) CAR-T 세포 재주입: 종양의 평균 부피가 122 mm3 정도일 때, 즉 종양을 접종한 후 8일째에, 상응한 량을 주사한 12G4m BBZ 세포 또는 형질 도입되지 않은 T 세포를 대조하였다. 결과에 따르면, CAR T를 주사하고 14일 후, UTD 대조군과 비교하면, 각 군은 모두 현저한 종양 억제 효과를 나타내었으며, 12G4m-BBZ 세포 농도가 2.0Х106일 때, 종양 억제율은 57.35%이고; 12G4m-BBZ 세포 농도가 4.0Х106일 때, 종양 억제율은 72.89%이다. 동시에 마우스 무게는 UTD 대조군에 비해 현저한 변화가 없다.
실시예 10: 12G4m(M1331)-BBZ CART의 체외 살상 결과
실시예 8의 방법을 참조하여, 12G4m(M1331)-BBZ CART의 체외 살상 효과를 검출하였다.
이펙터 세포: 이펙터-표적 비 9:1, 3:1 및 1:1에 따라 Untransduced(UTD) T 세포, 7F8-BBZ CART 세포, 12G4m-BBZ CART 세포, 12G4m(M1331)-BBZ CART 세포를 각각 96웰 판에 접종시켰다.
표적 세포: 50 μL 0 2Х105/mL의 CLL1 발현 양성의 HL-60과 U937 세포 및 CLL1 발현 음성의 K562 세포를 각각 대응되는 96웰 판에 접종시켰다.
실험 결과는 도 13에 도시된 바와 같고, 결과에 따르면, 본 발명의 7F8-BBZ CAR T, 12G4m-BBZ CAR T, 12G4m(M1331)-BBZ CART는 대조군 UTD에 비해, CLL1 발현 양성의 HL-60과 U937 세포에 대해 모두 현저한 독성 살상 작용이 있지만, CLL1 발현 음성의 K562 세포에 대해 살상 작용이 거의 없다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각각의 문헌이 단독으로 인용되는 것과 마찬가지로 본 발명에 참조로 인용된다. 이 밖에, 본 발명의 상기 설명된 내용을 열독한 후, 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 진행할 수 있으며, 이러한 등가 형태는 마찬가지로 본 발명의 청구범위에 의해 제한된 범위에 속함을 이해해야 한다.
본 발명에서 사용된 서열은 아래 표에 요약되어 있다.
서열 번호 명칭 서열
1 4F2, 7F8 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEYYFGYYGYLDYWGQGTLVTVSS
2 4F2, 7F8 중쇄 가변 영역 염기 서열 gaggtgcaattgctggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctccggattcacctttagcagttatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcagatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagaatactacttcggttactacggttacctggactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcgagt
3 4F2 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYPMITFGQGTKVEIKR
4 4F2 경쇄 가변 영역 염기 서열 gacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagaccgtgtcaccatcacttgccgtgccagtcagagtattagtagctggttggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgatgcctccagtttggaaagtggggtcccatcacgtttcagcggcagtggatccgggacagaattcactctcaccatcagcagcttgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtactactcttacccaatgatcacgtttggccagggcaccaaagtcgagatcaagcgt
5 25H8 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTMVTVSS
6 25H8 중쇄 가변 영역 염기 서열 gaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaacagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaatattcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggaactacatccgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
7 25H8 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR
8 25H8 경쇄 가변 영역 염기 서열 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtacccctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgt
9 12G4m(M1331) BBZ EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIDVASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
10 12G4m(M1331) 28BBZ EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIDVASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYM NMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
11 7F8 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQWIARWLAWYQQKPGKAPKLLIKDASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYPMITFGQGTKVEIKR
12 7F8 경쇄 가변 영역 염기 서열 gacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagaccgtgtcaccatcacttgccgtgccagtcagtggattgctcgatggttggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatcaaggacgcttccaatttggaaagtggggtcccatcacgtttcagcggcagtggatccgggacagaattcactctcaccatcagcagcttgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtactactcttacccaatgatcacgtttggccagggcaccaaagtcgagatcaagcgt
13 12G4m 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTMVTVSS
14 12G4m 중쇄 가변 영역 염기 서열 gaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaacagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaatattcaaccctggtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggaactacatccgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
15 12G4, 12G4m 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIDVASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR
16 12G4, 12G4m 경쇄 가변 영역 염기 서열 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatcgatgtcgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtacccctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgt
17 CD8α 신호 펩티드 MALPVTALLLPLALLLHAARP
18 CD8α 신호 펩티드 atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg
19 CD8 경첩 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
20 CD8 경첩 accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat
21 CD8 막 관통 영역 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
22 CD8 막 관통 영역 Atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcacc
23 CD137 세포 내 영역 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
24 CD137 세포 내 영역 aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
25 CD3Z 도메인 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
26 CD3Z 도메인 agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
27 4F2 scFv EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEYYFGYYGYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYPMITFGQGTKVEIKR
28 4F2 scFv GAGGTGCAATTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGAATACTACTTCGGTTACTACGGTTACCTGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGTGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTACTACTCTTACCCAATGATCACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGT
29 25H8 scFv EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR
30 25H8 scFv GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCAACAGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATATTCAACCCTAGTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAACTACATCCGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGT
31 7F8 scFv EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEYYFGYYGYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQWIARWLAWYQQKPGKAPKLLIKDASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYPMITFGQGTKVEIKR
32 7F8 scFv GAGGTGCAATTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGAATACTACTTCGGTTACTACGGTTACCTGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGTGCCAGTCAGTGGATTGCTCGATGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCAAGGACGCTTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTACTACTCTTACCCAATGATCACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGT
33 12G4m scFv EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIDVASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR
34 12G4m scFv gaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaacagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaatattcaaccctggtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggaactacatccgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcggacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatcgatgtcgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtacccctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgt
35 4F2, 7F8 HCDR1 SYAMS
36 25H8, 12G4, 12G4m HCDR1 SYYMH
37 4F2, 7F8 HCDR2 AISGSGGSTYYADSVKG
38 25H8, 12G4, HCDR2 IFNPSGGSTSYAQKFQG
39 12G4m HCDR2 IFNPGGGSTSYAQKFQG
40 4F2, 7F8 HCDR3 EYYFGYYGYLDY
41 25H8, 12G4, 12G4m HCDR3 GTTSDAFDI
42 4F2 LCDR1 RASQSISSWLA
43 25H8, 12G4, 12G4m LCDR1 RASQSISSYLN
44 7F8 LCDR1 RASQWIARWLA
45 4F2 LCDR2 DASSLES
46 25H8 LCDR2 AASSLQS
47 7F8 LCDR2 DASNLES
48 12G4, 12G4m LCDR2 VASSLQS
49 4F2, 7F8 LCDR3 QQYYSYPMIT
50 25H8, 12G4, 12G4m LCDR3 QQSYSTPLT
51 CD28 막 관통 영역 Fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv
52 CD28 막 관통 영역 ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg
53 CD28 세포 내 영역 Rskrsrllhsdym nMtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs
54 CD28 세포 내 영역 Aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggccaacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc
55 4F2 28Z EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEYYFGYYGYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYPMITFGQGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYM NMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
56 4F2 BBZ EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEYYFGYYGYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYPMITFGQGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
57 4F2 28BBZ EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEYYFGYYGYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYPMITFGQGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYM NMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
58 25H8 28Z EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYM NMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
59 25H8 BBZ EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
60 25H8 28BBZ EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYM NMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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67 12G4m A9P 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 Evqlvqsgpevkkpgasvkvsckasgytfnsyymhwvrqapgqglewmgifnpgggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargttsdafdiwgqgtmvtvss
68 12G4m V931 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 Evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfnsyymhwvrqapgqglewmgifnpgggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtaiyycargttsdafdiwgqgtmvtvss
69 12G4m M1331 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 Evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfnsyymhwvrqapgqglewmgifnpgggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargttsdafdiwgqgtlvtvss
70 12G4m A9P scFv Evqlvqsgpevkkpgasvkvsckasgytfnsyymhwvrqapgqglewmgifnpgggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargttsdafdiwgqgtmvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapkllidvasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystpltfgggtkveikr
71 12G4m V931 scFv Evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfnsyymhwvrqapgqglewmgifnpgggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtaiyycargttsdafdiwgqgtmvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapkllidvasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystpltfgggtkveikr
72 12G4m M1331scFv Evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfnsyymhwvrqapgqglewmgifnpgggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargttsdafdiwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapkllidvasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystpltfgggtkveikr
73 12G4m(M1331) 28Z EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIFNPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTSDAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIDVASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<110> CARSGEN THERAPEUTICS CO., LTD. <120> CLL1-TARGETING ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <130> P2019-1860 <150> CN2018112606877 <151> 2018-10-26 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Tyr Tyr Phe Gly Tyr Tyr Gly Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polynucleotide <400> 2 gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc 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gccaacagta ctactcttac ccaatgatca cgtttggcca gggcaccaaa 720 gtcgagatca agcgt 735 <210> 29 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 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Arg 465 <210> 63 <211> 513 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 63 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Tyr Tyr Phe Gly Tyr Tyr Gly Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Trp Ile Ala Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Lys Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser 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390 395 400 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 405 410 415 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 420 425 430 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 435 440 445 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 450 455 460 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 465 470 475 480 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 485 490 495 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 500 505 510 Arg <210> 64 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Asp Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 210 215 220 Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 245 250 255 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 260 265 270 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp 275 280 285 Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 290 295 300 Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 305 310 315 320 Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 325 330 335 Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 340 345 350 Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 355 360 365 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 370 375 380 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 385 390 395 400 Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 405 410 415 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 420 425 430 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 435 440 445 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 450 455 460 Pro Pro Arg 465 <210> 65 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Asp Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 210 215 220 Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 245 250 255 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 260 265 270 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 275 280 285 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 290 295 300 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 305 310 315 320 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 325 330 335 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 340 345 350 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 355 360 365 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 370 375 380 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 385 390 395 400 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 405 410 415 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 420 425 430 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 435 440 445 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 460 <210> 66 <211> 509 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Asp Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 210 215 220 Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 245 250 255 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 260 265 270 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp 275 280 285 Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 290 295 300 Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 305 310 315 320 Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 325 330 335 Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 340 345 350 Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 355 360 365 Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 370 375 380 Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 385 390 395 400 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 405 410 415 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 420 425 430 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg 435 440 445 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 450 455 460 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 465 470 475 480 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 485 490 495 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 500 505 <210> 67 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Asp Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 210 215 220 Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Arg <210> 71 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Asp Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 210 215 220 Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Arg <210> 72 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Asp Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 210 215 220 Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Arg <210> 73 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Asp Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 210 215 220 Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 245 250 255 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 260 265 270 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp 275 280 285 Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 290 295 300 Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 305 310 315 320 Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 325 330 335 Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 340 345 350 Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 355 360 365 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 370 375 380 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 385 390 395 400 Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 405 410 415 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 420 425 430 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 435 440 445 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 450 455 460 Pro Pro Arg 465

Claims (31)

  1. CLL1을 표적으로 하는 항체로서,
    상기 항체는,
    SYX1MX2로 표시되는 HCDR1, X3X4X5X6SGGSTX7YAX8X9X10X11G로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 40 또는 41로 표시되는 HCDR3, 및 RASQSISSX12LX13으로 표시되는 LCDR1, X14ASX15LX16S로 표시되는 LCDR2, QQX17YSX18PX19X20T로 표시되는 LCDR3을 가지고,
    상기 X1은 A 또는 Y로부터 선택되며, X2는 S 또는 H로부터 선택되고, X3은 A 또는 I이며, X4는 I 또는 F로부터 선택되고, X5는 S 또는 N으로부터 선택되며, X6은 G 또는 P로부터 선택되고, X7은 Y 또는 S로부터 선택되며, X8은 D 또는 Q로부터 선택되고, X9는 S 또는 K로부터 선택되며, X10은 V 또는 F로부터 선택되고, X11은 K 또는 Q로부터 선택되며, X12는 W 또는 Y로부터 선택되고, X13은 A 또는 N으로부터 선택되며, X14는 D 또는 V로부터 선택되고, X15는 N 또는 S로부터 선택되며, X16은 E 또는 Q로부터 선택되고, X17은 Y 또는 S로부터 선택되며, X18은 Y 또는 T로부터 선택되고, X19는 M 또는 L로부터 선택되며, X20은 I이거나 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는,
    중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 35 또는 36으로 표시되는 HCDR1을 포함하거나, 및/또는 SEQ ID NO: 37, 38 또는 39로 표시되는 HCDR2를 포함하거나, 및/또는 SEQ ID NO: 40 또는 41로 표시되는 HCDR3을 포함하는 항체 (1);
    경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 42, 43 또는 44로 표시되는 LCDR1을 포함하거나, 및/또는 SEQ ID NO: 45, 46, 47 또는 48로 표시되는 LCDR2를 포함하거나, 및/또는 SEQ ID NO: 49 또는 50으로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (2);
    항체 (1)의 중쇄 가변 영역 및 항체 (2)의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (3); 및
    항체 (1) 내지 항체 (3) 중 어느 하나와 동일하거나 유사한 활성을 가지는 항체 (1) 내지 항체 (3) 중 어느 하나의 변이체 (4) 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 LCDR1은 돌연변이되고, RASQSISSX12LX13에서 RASQWIARX12LX13으로 돌연변이되며;
    바람직하게, 상기 돌연변이된 LCDR1의 서열은 SEQ ID NO: 44로 표시되는 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 HCDR2의 X3X4X5X6은 AISG 또는 IFNP인 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 항체 HCDR2는 돌연변이되고, X3X4X5X6SGGSTX7YAX8X9X10X11G에서 X3X4X5X6GGGSTX7YAX8X9X10X11G로 돌연변이되며;
    바람직하게, 상기 돌연변이된 HCDR2의 서열은 SEQ ID NO: 39로 표시되는 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 항체는,
    SEQ ID NO: 35로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 37로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 40으로 표시되는 HCDR3, 및 SEQ ID NO: 42로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 45로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 49로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (1);
    SEQ ID NO: 36으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 38로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 41로 표시되는 HCDR3, 및 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 46으로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 50으로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (2);
    SEQ ID NO: 35로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 37로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 40으로 표시되는 HCDR3, 및 SEQ ID NO: 44로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 47로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 49로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (3);
    SEQ ID NO: 36으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 38로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 41로 표시되는 HCDR3 및 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 48로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 50으로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (4);
    SEQ ID NO: 36으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 39로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 41로 표시되는 HCDR3 및 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 48로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 50으로 표시되는 LCDR3을 포함하는 항체 (5); 및
    항체 (1) 내지 항체 (5) 중 어느 하나와 동일하거나 유사한 활성을 가지는 항체 (1) 내지 항체 (5) 중 어느 하나의 변이체 - 항체 (6) 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 항체는,
    중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 67로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 68로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 69로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (1);
    경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (2);
    상기 항체 (1)의 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 (2)의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (3); 및
    항체 (1) 내지 항체 (3) 중 어느 하나와 동일하거나 유사한 활성을 가지는 항체 (1) 내지 항체 (3) 중 어느 하나의 변이체 (4) 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항체는,
    중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (1);
    중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (2);
    중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (3);
    중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (4);
    중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항체 (5); 및
    항체 (1) 내지 항체 (5) 중 어느 하나와 동일하거나 유사한 활성을 가지는 항체 (1) 내지 항체 (5) 중 어느 하나의 변이체 (6)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 48로 표시되는 LCDR2, SEQ ID NO: 50으로 표시되는 LCDR3을 가지고;
    바람직하게, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    더 바람직하게, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5, 13, 67, 68 또는 69로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체와 동일한 항원 결정 부위를 식별하는 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 완전 인간 항체인 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 완전항체, scFv, 단일 도메인 항체, Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편인 것을 특징으로 하는 CLL1을 표적으로 하는 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산.
  14. 제13항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  15. 제14항에 따른 발현 벡터 또는 게놈에 통합된 제13항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  16. 종양을 치료하는 약물을 제조하거나, 또는 종양을 진단하는 시약을 제조하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  17. 면역접합체로서,
    상기 면역접합체는,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체, 및 이와 연결되는 기능성 분자를 포함하고;
    상기 기능성 분자는 종양 표면 마커를 표적으로 하는 분자, 종양을 억제하는 분자, 면역 세포의 표면 마커를 표적으로 하는 분자, 및 검출 가능한 라벨로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역접합체.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 종양을 억제하는 분자는 항-종양 시토카인(cytokine) 또는 항-종양 독소인 것을 특징으로 하는 면역접합체.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 면역 세포의 표면 마커를 표적으로 하는 분자는 면역 세포 표면 마커와 결합하는 항체 또는 리간드(ligand)인 것을 특징으로 하는 면역접합체.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 면역 세포의 표면 마커를 표적으로 하는 분자는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포 표면 마커와 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 면역접합체.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체를 코딩하는 핵산.
  22. 키메라 항원 수용체로서,
    상기 키메라 항원 수용체는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 항체는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  24. 제22항에 따른 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산.
  25. 제24항에 따른 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  26. 제25항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스(virus).
  27. 유전자 변형된 면역 세포로서,
    제24항에 따른 핵산이 형질 도입되거나, 또는 제22항에 따른 키메라 항원 수용체가 발현되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 면역 세포.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 면역 세포는 상기 키메라 항원 수용체 외에 제2 서열이 더 발현되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 면역 세포.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 제2 서열은 시토카인, 또는 다른 키메라 항원 수용체, 또는 케모카인(chemokine) 수용체, 또는 PD-1 발현을 감소시키는 siRNA, 또는 PD-L1을 차단시키는 단백질, 또는 TCR, 또는 안전 스위치를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 면역 세포.
  30. 종양을 치료하는 약물을 제조하기 위한 제28항에 따른 유전자 변형된 면역 세포의 용도.
  31. 약학 조성물로서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체를 코딩하는 핵산; 또는
    제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 또는 상기 접합체를 코딩하는 핵산; 또는
    제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 유전자 변형된 면역 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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