TW202120476A - 用於體外及體內診斷之螢光奈米顆粒及其共軛物的製備 - Google Patents

用於體外及體內診斷之螢光奈米顆粒及其共軛物的製備 Download PDF

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Abstract

本發明提供了螢光奈米顆粒及其共軛物以及將其用於體內和體外診斷以及其他應用的方法。在一些具體實例中，本發明提供了具有高固態量子産率的螢光奈米顆粒。在一些具體實例中，本發明提供了製造此類奈米顆粒的方法。奈米顆粒可包含單體（例如苯乙烯）和螢光團（例如AIEgen™亮綠）。

Description

用於體外及體內診斷之螢光奈米顆粒及其共軛物的製備
本發明涉及可以使用多種方法製備的聚合物奈米顆粒，以用作體外和體內診斷的訊號分子（reporter）。
奈米材料可以與生物識別分子連接創作出一種特殊的分子診斷探針。奈米技術的最新發展提出了一系列具有獨特特性的奈米感測平臺，以提高生物檢測組件的檢測能力、靈敏度、易操作性和便攜性，這正在徹底改變醫療保健領域的診斷技術。這種新穎的奈米診斷方法可以進一步開發即時診斷和檢測技術。
免疫標記是用於檢測和定位靶抗原（例如蛋白質）的成熟技術。該技術已廣泛用於分子生物學、生物化學和體外診斷工業等不同領域。免疫標記技術有直接和間接兩種方法。在直接方法中，目標抗原是通過與螢光標簽或酶共軛的一級抗體檢測的，而在間接方法中，目標抗原是先被一級抗體識別的，然後再通過標記的第二級抗體體進行檢測，該抗體特異地與一級抗體結合抗體。直接和間接方法均可應用於免疫印跡、免疫組織化學、免疫螢光、酶聯免疫吸附測定（ELISA）和螢光活化細胞篩選（FACS）。常規來說，直接方法可以使由二級抗體體潜在引起的物種交叉反應 最小化。但是，直接免疫標記的靈敏度遠低於間接方法，因爲一級抗體可以與幾種標記的二級抗體結合，從而導致訊號放大。
側流分析法（LFA）的工作原理與ELISA基本相似。LFA已廣泛用於醫院和臨床實驗室以及獸藥、環境評估以及食品生産過程中的安全性測試。這樣的測定是廉價的、靈敏的、特異性高的、用戶友好的、快速且穩定的。添加樣本（例如尿液和血液）後，無需額外的設備或使用最少的設備，即可在幾分鐘內獲得結果。
訊號標記物是側流分析的關鍵。這些顆粒或分子具有顏色或其他能使其被檢測的特性，並耦合到結合分子或檢測分子上。金奈米顆粒已廣泛用於側流分析中。這些顆粒的特徵在於易於製備和功能化、良好的生物相容性以及成本效益。金奈米顆粒産生不需要任何設備進行可視化的顔色讀數。[1] 但是，該方法通常是定性或半定量的、訊號強度低、靈敏度差。
尋找具有更好分析性能的新型標記物是一項持續的挑戰。儘管據報導螢光標記可促進痕量分析物的靈敏和定量檢測，但大多數螢光標記的發光量子效率太低而無法應用於側流分析。此外，在給定的重量/體積條件下，通常是（奈克每毫升或毫克每毫升）或（毫國際單位/毫升），當前的螢光側流分析法的檢測範圍很窄（100 –102 ）。[1]
再者，螢光強度淬滅效應是螢光材料的共同缺點。[2] 因此，非常需要找到一種表現出非淬滅螢光並且可以被封裝到奈米顆粒或奈米簇中的材料。不表現出螢光強度淬滅作用的訊號標記物可以有效提高檢測靈敏度並實現定量分析，卻同時仍保留普通側流免疫分析法的簡便性、快速性和便攜性。
最有前途的螢光標記之一是量子點（QD）。它們具有多種獨特的物化特性，包括高量子産率、可調發射波長和較高的光穩定性。但是，量子點的缺點包括毒性高、刺激性強、合成過程複雜以及膠體不穩定。基於CdSe（硒化鎘）的量子點具有劇毒且需要穩定的聚合物外殼。此外，在目前的技術階段，很難實現超過一公斤的蛋白質功能化量子點的大規模生産。[3] 儘管已經證明它們在製備成奈米顆粒時顯示出良好的螢光性質，但是它們在較高濃度和固態下具有發射淬滅作用。此外，根據先前的結果，量子點的檢測範圍非常窄。[4-6]
上轉換磷光體是一類含稀土的晶體顆粒，能夠將低能紅外光的光子轉換成高能可見光。但是，這些材料的發光量子産率低。鑭系元素標記（例如Eu）在紅色區域發出，且絕對量子産率效率通常低於40%。[7]
聚集誘導發光（AIE）材料也可以充當訊號分子。[8]
此處報導的螢光奈米顆粒具有獨特的特性，例如不低於20%的發光量子産率、可調的發光顔色和均勻的尺寸分布。更重要的是，螢光奈米顆粒的大量生産相對容易且便宜。在適當的組合中，功能化的奈米顆粒探針可在緊湊的即時醫療平臺中用於定量的單次和多重分析。AIE奈米顆粒也可以代替免疫標簽中抗體共軛的常規標簽。結合AIE的抗體可以解決直接免疫標記法靈敏度低的問題，並且可以進一步提高間接免疫標記法的靈敏度。
因此，我們報導的奈米顆粒可用於例如早期疾病檢測、基因組技術、體內診斷以及個人化和預測性醫學。
技術方案
在一些具體實例中，本發明提供了獨特的螢光奈米顆粒和官能化的奈米顆粒，其顯示了不少於 20% 的高固態絕對量子産率。在一些具體實例中，螢光芯的發射波長可以是紫外線（ 200-420 奈米）、可見光（ 420-780 奈米）或紅外線（ 780-1200 奈米） 。可以爲不同的診斷目的選擇合適的發射波長。在一些具體實例中，即使在半年後，螢光奈米顆粒的抗體共軛物在開放環境中也出乎意料地穩定。在一些具體實例中，檢測範圍是100 -104 （毫國際單位/毫升），其比常規産品寬兩個數量級。 螢光顆粒的製備
螢光團可以與單體混合，然後進行聚合或可以被大分子直接包覆 。這些方法允許在聚集態、聚集簇或高濃度狀態下維持高螢光量子産率。例如，可以將螢光團與單體例如苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯（MMA）和丙烯酸混合，然後使其聚合。螢光奈米顆粒還可以通過其他方法，例如微流體和超聲方法，在有或沒有化學反應的情況下進行製造。例如，可以使用典型的涉及化學反應的微流控流裝置製造螢光奈米顆粒（圖1）。 螢光顆粒的獨特性質
本發明報導的螢光顆粒可以具有寬範圍的尺寸。本發明的螢光顆粒的直徑可以在幾毫米（10-3 m）（毫米顆粒）至微米（10-6 m）（微米顆粒）至奈米（10-9 m）（奈米顆粒）的範圍內，且在尺寸、形狀和表面特性方面具有良好的同質性。在大多數情況下，我們指的是螢光奈米顆粒，但是，應當理解，也可以使用具有合適特性的毫米顆粒和微米顆粒。
眾所周知，奈米顆粒的適當尺寸和良好的均質性在生物醫學應用中很重要。由於奈米顆粒的化學和物理性質取決於尺寸，因此需要最佳化奈米顆粒的尺寸，以使其功能適合於不同的生物醫學應用。另外，奈米顆粒應具有窄的尺寸分布，以避免檢測上的任何差異。例如，應用於側流免疫分析的奈米顆粒的尺寸應盡可能小。結合分子和抗體通常具有5-15奈米的尺寸，並且由於它們的小尺寸，其比固定在奈米顆粒表面上的結合分子的複合共軛物更容易從共軛墊釋放。與現有的螢光團相比，本發明報導的奈米顆粒具有較大的斯托克斯位移（＞50奈米），這使得可以通過光學濾光片容易地去除背景螢光。另外，本發明的螢光顆粒在較高濃度或聚集狀態下不具有淬滅作用。[8] 奈米顆粒的功能化以用於不同的診斷目的
爲了將奈米顆粒的獨特物理性質用於不同的診斷目的，必須用感測分子對奈米顆粒進行進一步的功能化。分子可以是小分子（例如，生物素 ）、適體 、對分析物具有較大親和力的肽 、或者是生物大分子，例如核糖核酸、脫氧核糖核酸或蛋白質（例如，抗體或酶）。通過（i）靜電相互作用、（ii）化學吸附（例如，通過硫醇或胺基）、（iii）共價結合和（iv）基於親和力的系統已經實現了具有感測分子的奈米顆粒的功能化。例如，使用諸如1-乙基-3-（3-二甲基胺基丙基）-碳二亞胺（EDC）或EDC/N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）的交聯劑 ，可以將諸如抗體或其他蛋白質的分子共價結合至奈米顆粒。
一種具有核-殼結構的螢光奈米顆粒被製成，該核-殼結構具有親水表面，該親水表面具有用於生物修飾的官能團（例如，羧基、胺基、硫醇基等）。例如，可以通過將附著於奈米顆粒表面的官能團與所述蛋白質的N-末端或C-末端胺基酸連接，從而將諸如抗體之類的蛋白質附著至奈米顆粒。與抗體連接的螢光奈米顆粒可用於免疫分析。圖2描繪了螢光奈米顆粒的一個具體實例的示意圖。本領域技術人員可以根據蛋白質和其他感測分子的特定需求來選擇它們。
在一個具體實例中，本發明提供了一種固態發光量子産率高於20%的奈米顆粒，其包括纏繞在聚合物網中的發光體。在另一個具體實例中，所述固態發光量子産率爲20、25、30、40、45、50、55或60%。在另一個具體實例中，發光體的濃度爲1-50重量百分數(w/w%)。
在一個具體實例中，所述發光體的可調發射波長爲400奈米至850奈米，激發波長爲220奈米至800奈米。在一具體實例中，可調發射波長是400、450、500、550、600、650、700、750、800或850奈米。在一實施例中，激發波長爲220、300、400、500、600、700或800奈米。
在一個具體實例中，所述發光體是N-5-硝基水楊亞基-4-四苯基乙烯基胺。在一個具體實例中，所述N-5-硝基水楊亞基-4-四苯基乙烯基胺是發黃的。
在一個具體實例中，所述發光體包含螢光團，所述螢光團包含選自以下一個或多個組成之群的主鏈結構：
Figure 02_image001
其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 和R6 各自獨立地選自由氫、烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基組成之群；和 其中每個X獨立地選自氧、硫、硒、碲、碳、矽、鍺、磷、砷和銻，其中X可以進一步被氫、烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基取代。
在一具體實例中，所述奈米顆粒的直徑在20-1000奈米的範圍。
在一個具體實例中，所述聚合物由選自苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸、乙酸乙烯酯和乙二醇組成之群的單體組成。
在一具體實例中，所述奈米顆粒可以與一種或多種抗體共軛。
在一個具體實例中，本發明進一步描述了一種製備固態發光量子産率高於20%的奈米顆粒的方法，其包含以下步驟：a）將發光體溶解在一種或多種單體中以形成單體混合物，所述單體混合物具有1-500克每升的發光體；b）將起始劑溶解在去離子水中以形成起始劑溶液；c）將表面活性劑溶解在去離子水中以形成反應混合物；d）將所述單體混合物和所述起始劑溶液加入到所述反應混合物中；和e）加熱步驟（d）的總混合物直至其變成乳白色，其中形成了所述奈米顆粒。在另一個具體實例中，所述固態發光量子産率爲20、25、30、40、45、50、55或60%。
在一個具體實例中，在步驟（c）之後，在100至4000相對離心力的攪拌下，將來自步驟（a）的一部分所述單體混合物加入到所述反應混合物中，其中剩餘的單體混合物用於步驟（d）。
在另一個具體實例中，所述部分按體積計爲所述單體混合物的≥1至＜99%。
在一個具體實例中，將所述單體混合物和所述起始劑溶液同時加入到所述反應混合物中。
在一個具體實例中，所述發光體是N-5-硝基水楊亞基-4-四苯基乙烯基胺。
在一個具體實例中，所述發光體包含螢光團，所述螢光團包含選自以下一個或多個組成之群的主鏈結構：
Figure 02_image001
其中每個R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 可以相同或不同，並且獨立地選自氫、烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基組成之群；和 其中每個X獨立地選自氧、硫、硒、碲、碳、矽、鍺、磷、砷和銻，並且可以進一步被一個或多個氫、烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基取代。
在一個具體實例中，所述一種或多種單體選自苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸、乙酸乙烯酯和乙二醇組成之群。
在一個具體實例中，步驟（c）之後是在400至2000瓦的超聲處理下將一部分所述單體混合物加入到所述反應混合物中。
在一個具體實例中，在步驟（d）中使用了微流體裝置。
在一個具體實例中，所述起始劑選自過硫酸銨、過硫酸銨（APS），2,2'-偶氮二（異丁腈）（AIBN）、過氧化苯甲醯（BPO）、過硫酸鉀和4,4'-偶氮雙（4-氰基戊酸）組成之群。
在一個具體實例中，所述起始劑溶液中的所述起始劑的濃度爲0.1至1%。
在一個具體實例中，所述表面活性劑選自癸基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、多庫酯鈉、全氟辛烷磺酸、全氟丁烷磺酸、硬脂酸鈉、四級銨陽離子、烷基多糖苷、單硬脂酸甘油酯或壬基苯氧基聚乙氧基乙醇組成之群。
在一個具體實例中，所述反應溶液中的所述表面活性劑的濃度爲3-12 g/L。
在一個具體實例中，步驟（e）的加熱是在70到90℃。
在一個具體實例中，步驟（e）進一步包含一個純化的過程。
在一個具體實例中，所述奈米顆粒的多分散性指數在0.009到1的範圍。
在一個具體實例中，本發明進一步提供了一種包含本發明的奈米顆粒的側流分析條。在另一個具體實例中，側流測試條被調配用於促進通過本發明的方法産生的共軛奈米顆粒的發光強度。
在一個實施例中，由於所述發光體具有從400奈米至850奈米的可調發射波長和激發波長從220奈米至800奈米，所以側流測試條可以發出400奈米至800奈米的發射。
在一個具體實例中，側流分析條可包含一條或多條測試線。
在一個具體實例中，本發明包含一種通過測量螢光發光強度以產生分析物濃度的定量讀數來定量側流分析條的方法。
在一個具體實例中，本發明提供了一種包含本發明的奈米顆粒的抗體測試試劑盒。
在一個具體實例中，本發明提供了一種包含本發明的奈米顆粒的細胞標記試劑盒。
在一個具體實例中，本發明提出供了一種通過促進本發明的奈米顆粒的螢光訊號的成像工具的應用。 螢光奈米共軛物的應用
螢光奈米顆粒共軛物可用於西方墨點法（WB）作爲間接或直接指示劑、用於免疫組織化學（IHC）、用於免疫細胞化學/免疫螢光（ICC/IF）、用於流式細胞術（FC）、用於側流分析（LFA）。
在一些具體實例中，我們的發明可以有效地提高側流分析的檢測靈敏度並能夠進行定量分析。此類分析可用於例如醫療保健監控、緊急情況和資源匱乏地區的醫學診斷、食源性疾病的食品品質控制以及有害離子汙染的水監控。
本發明的一個具體實例是一種單步側流分析法，其包括樣品墊、共軛物墊、反應膜（例如，硝酸纖維素膜（NC））、吸附劑墊和至少一種螢光共軛物，其不會在共軛墊上表現出較高濃度的發射淬滅。所有這些組件都安裝在底板上。在本發明的一些具體實例中，可以使用固體支持基質代替底板。圖3和圖4描繪了側流分析的一些具體實例。
一個具體實例由按以下順序安裝在底板或固體支持基質上的重疊膜組成：樣品墊、共軛墊、反應膜和吸附墊。共軛物墊由至少一種對目標分析物具有特異性的螢光奈米顆粒共軛物組成，其在較高濃度下不會有發光淬滅現象。將樣品施加到樣品墊上，然後通過毛細作用力沿著膜移動，到達包含與生物識別分子結合的螢光奈米顆粒的共軛墊。然後樣品到達包含用於目標分析物的測試線和控制線的反應膜，且最後到達保留了廢物的吸附墊。取決於目標分析物的性質，可以將不同的捕獲分子固定在條的測試線或對照線上。例如，測試線和對照線分別包括用於基於抗體的側流分析的夾心形式的一級抗體和二級抗體。一級抗體特異結合靶分析物的第二抗原位點，而二級抗體特異結合標記的抗體。
本發明可用於側流免疫分析中以檢測抗原，例如人絨毛膜***（hCG）和黃體生成激素（LH）。可以將體液（例如血液、血清、尿素、唾液、鼻液和眼泪）施加到樣品墊上，並將通過共軛物墊遷移，共軛物墊中含有對目標分析物具有特異性的螢光抗體共軛物。樣品與結合到目標分析物的抗體共軛物一起沿著條移動到NC膜的檢測區域，其中特定抗體排成一行固定以與結合到共軛物抗體的分析物反應（夾心分析法）。樣品分析物的識別會在測試線上産生適當的回應，而控制線上的回應表明通過條的液體流量適當。可以使用專用分析儀評估以不同強度的線表示的讀數。測試線的強度用於確定樣品中分析物的量。
根據目的，各種分析器可以與本發明的不同具體實例一起使用。例如，在一些具體實例中，可以使用互補金屬氧化物半導體（CMOS）或電荷耦合器件（CCD）來將螢光圖像記錄到（x，y，z）的顔色矩陣值上，其中x代表紅色，y代表綠色，z代表藍色。然後，使用圖像處理算法處理圖像，該算法根據測試線和控制線的螢光強度及其強度之比確定分析物的濃度。在一些具體實例中，螢光訊號被收集並且通過諸如光電二極管的光電轉換器被轉換成電子訊號。對於這兩種方法，分析儀應包括：（i）激發光源，例如發光二極管（LED）；（ii）電子移動電源或電源驅動器，用於在通過CMOS/光電二極管捕獲螢光訊號期間使LED燈保持點亮狀態；（iii）傳輸模組，用於將數據傳輸到智能平臺，例如智能手機或個人計算機；（iv）用於儲存數據的儲存器；（v）與所有組件完全積體的印刷電路板；（vi）可選地，光纖/光波導玻璃/濾光片。
在一些具體實例中，本發明對於多種可檢測的蛋白質具有寬的檢測範圍。例如，對於hCG，檢測範圍可以是100 至104 毫國際單位/毫升。對於LH，檢測範圍可以是100 毫國際單位/毫升至103 毫國際單位/毫升。在一些具體實例中，半年後可以觀察到用過的膜上的螢光帶沒有明顯降解（圖5），這表明螢光抗體共軛物具有出色的光穩定性，可以保持測試記錄很長時間。
在一些具體實例中，可以使用在較高濃度或聚集狀態下不會淬滅的發光團代替螢光團。
奈米顆粒可以通過疊氮化物和炔基之間的「點擊」反應或通過巰基與溴化物與無金屬催化劑的反應而交聯至生物檢測分子。可以使用其他合適的交聯方法
在一些具體實例中，使用的分析儀能夠檢測電發光、機械發光、力發光、化學發光、壓電發光和機械變色等。
在一些具體實例中，發光體可以包含螢光團。在一些具體實例中，螢光團可以具有以下主鏈結構：
Figure 02_image001
其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 和R6 各自獨立地選自氫、烷基、不飽和烷基、雜元素烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜元素芳基組成之群；和 其中每個X獨立地選自氧、硫、硒、碲、碳、矽、鍺、磷、砷和銻，其中X可以進一步被氫、烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基取代。本領域技術人員會理解，取決於X的化合價，它可能帶有0-3個取代基。例如，如果爲X選擇元素周期表第IV組元素（例如Si），它可能與兩個質子、或與另兩個其他取代基（例如烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基）、或與質子和另一個取代基鍵合。 在一些具體實例中，具有大於20%的發光量子産率的奈米顆粒包含纏繞在聚合物網中的發光體，其中在所述聚合物網中的發光體的量可以在1-50重量/重量百分比(w/w%)的範圍內的任何範圍內。 經由聚合製備螢光奈米顆粒的程序
在本發明的一些具體實例中，可以根據以下程序製備螢光奈米顆粒。
較佳地，在聚合反應之前，所有單體應例如通過氧化鋁（Al2 O3 ）柱純化，並且氧應從去離子（DI）水中除去，例如通過用氮氣鼓泡30分鐘。
組裝包括兩頸燒瓶、機械攪拌裝置和油浴的裝置。將兩頸燒瓶浸入油浴中。在進行機械攪拌時，請勿搖動兩頸燒瓶。在兩頸燒瓶中加入0.01-0.2克的十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、0.05-0.5克的碳酸氫銨（NH4 HCO3 ）和5-20毫升的去離子水，以100-1000轉每分鐘的速度打開機械攪拌器，且油浴溫度升至60-80℃。
通過將0.01-0.1克過硫酸銨[(NH4 )2 S2 O8 ]溶於去離子水中製備起始劑水溶液。
單體混合物是通過溶解4,4'-（1,2-雙（二苯并[b,d]噻吩-2-基）乙烯-1,2-二基）-雙（N，N-二苯基苯胺）（商業化名稱命名爲AIEgenTM 亮綠，以前稱爲NSTPE））在0.1-900毫升[苯乙烯（St）/甲基丙烯酸甲酯（MMA）/丙烯酸（AA）（v/v 1：0.02-1：0.02-1）的系統內。
當反應混合物變爲透明時，將3-5%體積的製備的單體混合物加入到反應混合物中進行預乳化。在一些具體實例中，可以將1%至＜100%體積的製備的單體混合物加入到用於預乳化的反應混合物中。10-60分鐘後，將起始劑水溶液和剩餘的單體混合物在數分鐘內以2-10滴的速度同時加入到燒瓶中，值得注意的是，起始劑的添加較佳比單體混合物的加入稍晚些。將反應混合物保持在70-90℃加熱直至變成乳白色。反應混合物冷卻後接著將粗産物純化。
在一些具體實例中，用於製備反應混合物的表面活性劑可以是以下的一種或多種：癸基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉(
Figure 02_image005
)、全氟辛烷磺酸(
Figure 02_image007
)、全氟丁烷磺酸(
Figure 02_image009
)、硬脂酸鈉(
Figure 02_image011
)、四級銨陽離子(
Figure 02_image013
)，其中R基團可以是烷基或芳基中的一個或多個[例如，苯扎氯銨(
Figure 02_image015
)和二硬脂基二甲基氯化銨(
Figure 02_image017
)]、烷基多糖苷(
Figure 02_image019
)，其中m可能在1到100之間變化，[例如癸基葡糖苷(
Figure 02_image021
)]、單硬脂酸甘油酯(
Figure 02_image023
或
Figure 02_image025
)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(
Figure 02_image027
)，其中n可以從1到100等的整數中選擇。
在一些具體實例中，爲了實現奈米顆粒的小尺寸和良好的均勻性，使用完全溶於單體溶液中的螢光團。如表1所示，螢光團在單體溶液中的溶解度從投料1到投料3降低。如果螢光團不溶於單體溶液（投料3），則不會發生聚合反應。雖然當螢光團部分溶於單體溶液（投料2）時會發生聚合反應，但奈米顆粒的尺寸小及均勻性好卻未能實現。只有當螢光團完全溶於單體溶液中時，奈米顆粒的尺寸才會非常小（＜50奈米）並且具有良好的均勻性。表 1. 一些螢光團在一些單體中的溶解度
投料 螢光團 螢光團在單體中的溶解度 ( 例如 苯乙烯、聚苯烯酸或聚甲基丙烯酸甲酯 ) 乳化 聚合 後的尺寸大小
1
Figure 02_image029
商業名AIEgenTM 亮綠		 良好，其中混合物是完全透明的 50奈米，PDI 0.02
2
Figure 02_image031
 部分溶解，其中混合物是半透明的 250奈米，PDI 1.2
3
Figure 02_image033
 差，其中混合物是渾濁的 無法形成聚合物反應
使用微流體裝置製造螢光奈米顆粒的程序
在一些具體實例中，典型的微流體聚流裝置可用於製造螢光奈米顆粒（圖1）。微流體裝置可使用標準的微成型方法由聚（二甲基矽氧烷）（PDMS）製造。或者，可以使用深反應離子蝕刻或濕法蝕刻在矽晶圓中蝕刻所有特定尺寸的微通道。然後可以通過陽極鍵合將蝕刻的矽晶圓與玻璃基板黏合在一起。可以在玻璃基板上製造加熱器（鉑）可以爲微通道提供熱量。可以在玻璃基板上製造溫度感測器（例如鉑感測器）以記錄微通道內部的溫度。可以通過更改流量參數來調整螢光奈米顆粒的粒徑。 純化螢光奈米顆粒的程序
在本發明的一些具體實例中，可以根據以下程序純化奈米顆粒。
將粗産物在5000-15000轉每分鐘下離心3-30分鐘以除去游離的AIEgen™亮綠。將上層轉移至試管中，並以1：0.1-10的體積比添加乙醇以去乳化。數小時後可觀察到明顯的沉澱。然後將混合物在5000-15000轉每分鐘下離心3-30分鐘以得到固體産物。然後將分離出的産物用1倍磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）藉助超聲儀重新分散。最終溶液將在室溫下保存以備進一步使用。
標記反應的 程序
在一些具體實例中，可以如下所述進行標記反應。
146微升的2-乙磺酸（MES）緩衝液[酸碱值(pH)6.0]、50微升的奈米顆粒（粒徑＜200奈米）溶液、2微升的1-乙基-3-（3-二甲基胺基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶液（20毫克每毫升）以及2微升的N-羥基磺基琥珀醯亞胺（磺基-NHS）溶液（55毫克每毫升）加入1.5毫升的試管中，在使用前用MES緩衝液（pH 6.0）製備EDC和磺基-NHS溶液。將混合物在室溫下以100-1000 rpm每分鐘Eppendorf Centrifuge 5424R）搖動15-60分鐘，在管中加入1.4微升的2-巰基乙醇以使EDC去活化。然後將反應混合物在5000-15000轉每分鐘下離心3-30分鐘。收集固體産物，並用200微升的MES緩衝液洗滌幾次。
將純化的固體産物重新分散在600微升的1倍PBS緩衝液（pH 7.4）中以製備活化的螢光奈米顆粒溶液。200微升活化的螢光奈米顆粒溶液和200微升的抗體轉移至1.5的毫升管中。保持反應混合物在室溫下以100-1000轉每分鐘搖動1-4小時。然後在0-4℃和5000-15000轉每分鐘離心1-60分鐘，並收集固體産物。將固體産物再分散在200微升1%牛血清白蛋白（BSA）溶液（在1倍PBS緩衝液中）中，且將混合物在0-4℃下以100-1000轉每分鐘搖動。1-24小時後，將混合物在0-4℃和5000-15000下離心轉每分鐘3-30分鐘，並收集固體産物。將固體産物藉助超聲儀在200微升的TBS-T緩衝液（Tween-20 0.05%）中重新分散而得到奈米顆粒抗體共軛物。標記的奈米顆粒的溶液儲存在4-8 ℃下以備進一步使用。 製備側流分析測試條的程序
在本發明的一些具體實例中，可以根據以下描述的步驟來製備側流測試條。 （i）製備共軛墊：
共軛溶液是通過用TBS-T緩衝液（pH 7.4）稀釋標記的奈米顆粒而製成的，該緩衝液含有0.1-1莫耳每升的氯化鈉（NaCl）、1-20毫莫耳每升的乙二胺四乙酸（EDTA）、1-10%（w/v）的BSA、1-10%（w/v）的蔗糖和0.01-0.1%（w/v）的疊氮化鈉（NaN3 ）至終濃度1-100微克/毫升。5-25微升的共軛物溶液加入到尺寸爲3×6毫米的共軛墊中，然後在37℃下乾燥3小時。
（ii）固定捕獲試劑：
用於LH條的0.1-2毫克每毫升的小鼠抗人alpha-LH-mAB（或用於hCG條的小鼠抗人alpha-hCG-mAB）和0.1-2毫克每毫升的山羊抗小鼠IgG（用於LH和hCG檢測）分別塗在硝酸纖維素膜上作爲測試線和對照線。測試線和對照線都設置在距膜中心5毫米處。在9微升-1 厘米-1 處形成點狀，並在37℃下乾燥1-2小時。最後，使用0.1-5%（w/v）BSA封閉膜，然後乾燥並密封保存。
（iii）製備樣品和吸附墊：
樣品墊和吸附墊由100%純纖維素不織布製成（Millipore）。15 x 300毫米的樣品墊被pH 8.0的緩衝液飽和，緩衝液中含有0.5-5.0%（w/v）的BSA，0.5-5.0%（w/v）的蔗糖，2-20毫莫耳每升的硼酸鈉和0.01-0.1%（w/v）的NaN3 ，然後乾燥儲存。將吸附墊切成40×300毫米的尺寸。
（iv）積體側流測試條的組裝：
將樣品墊、共軛墊、NC膜和吸附墊依次以1-2毫米的動圈組裝在塑料背襯支撐板上，並在其兩端都塗上彩色膜。使用CM4000將主卡切成3毫米的寬度條。然後將測試條密封在乾燥劑凝膠形式的塑料袋中，並在4℃下保存。 實施例 實施例 1. 螢光奈米顆粒的製備
表2總結了聚合反應的一系列化學物質和反應條件。表3列出了通過動態光散射（DLS）機測量的奈米顆粒參數。
組裝包括兩頸燒瓶、機械攪拌裝置和油浴組成的裝置。浸入油浴的兩頸燒瓶在進行機械攪拌時不應搖動。然後將0.2克的SDBS（十二烷基苯磺酸鈉）、0.5克的NH4 HCO3 （碳酸氫銨）和20毫升的去離子水加入兩頸燒瓶中。以1000轉每分鐘的速度打開機械攪拌器，並將油浴溫度升至60℃。
然後在燒瓶中加入0.2克的SDBS、0.5克的NH4 HCO3 和20毫升的去離子水，以1000轉每分鐘的速度打開機械攪拌器，並將油浴溫度升至60℃。或者使用細胞破碎器（SCIENTZ-95E）代替機械攪拌器在600瓦下持續3分鐘（表3中的P5）。
通過將0.01克的過硫酸銨[（NH4 ）2 S2 O8 ]溶解在1毫升的去離子水中製備起始劑水溶液。通過將0.001克AIEgen™亮綠溶解在0.1毫升的St/MMA/AA（v/v）中來製備單體混合物，其中St/MMA/AA（v/v）具有以下體積比：1：0.1：0.1（表3中指定爲P2）；1：1：1（表3中指定爲P3）；1：0.02：0.18（表3中指定爲P4）; 1：0.1：0.1（表3中的P5）。將混合物在60℃加熱5分鐘後，螢光團完全溶於單體溶液中，且溶液變爲透明。然後將3%體積的所製備的單體混合物加入反應混合物中預乳化。在10分鐘後，將起始劑水溶液和剩餘的單體混合物以每分鐘10滴的速度同時加入到兩頸反應燒瓶中。值得注意的是，起始劑的添加在比單體混合物的添加稍晚的時間完成。將反應混合物保持在70℃加熱直至變成乳白色。然後，將反應混合物冷卻後，將粗産物純化。 實施例 2. 螢光奈米顆粒的製備
奈米顆粒P6、P7和P8的製備按照與P2-P4相同的程序進行，不同之處在於，純單體溶液的使用如下：P6:僅苯乙烯；P7：僅MMA；P8：僅AA。P6的粒徑爲80奈米，多分散性指數(PDI)爲0.035；P7的粒徑爲98奈米，PDI爲0.05；P8的粒徑爲103奈米，PDI爲0.045。表 2. 聚合反應的化學組分和反應條件
化學組分 反應條件範圍
St/MMA/AA(毫升) 1:0.02-1:0.02-1
過硫酸銨(克,在2毫升去離子水) 0.01-0.1
SDBS (克) 0.01-0.2
NH4 HCO3 (克) 0.05-0.5
去離子水(毫升) 5-20
AIEgen™亮綠(毫克) 1-100
機械攪拌速度(轉每分鐘) 100-1000
溫度(℃) 70-90
時間(小時) 1-4
實施例 3. 螢光奈米顆粒的製備
表4總結了聚合反應的一系列化學物質和反應條件。表3列出了用動態光散射（DLS）儀測量的奈米顆粒參數。將0.1克的SDBS、0.5克的NH4 HCO3 和15毫升的去離子水添加到一個兩頸燒瓶。將燒瓶置於油浴中，且將油浴溫度升至70℃以溶解固體。移開燒瓶，將反應混合物冷卻。通過溶解0.02克的過硫酸銨[（NH4 ）2 S2 O8 ]於1毫升的去離子水中來製備起始劑水溶液。通過將0.01克的AIEgen™紅溶解在0.6毫升的St/MMA/AA體積比（v/v）中來製備單體混合物，其中St/MMA/AA的體積比爲1：0.1：0.1（在表3中指定爲P9）。將製備的單體混合物添加到反應混合物中，以通過細胞破碎器（SCIENTZ-95E）在500瓦下預乳化0.5小時。組裝包括兩頸燒瓶、機械攪拌裝置和油浴的裝置。將兩頸燒瓶浸入70℃的油浴中並以300轉每分鐘的機械攪拌進行攪拌。在進行機械攪拌時不應搖動裝置。10分鐘後，將起始劑水溶液以每分鐘5滴的速度加入到兩頸反應燒瓶中。此後，將反應混合物在70℃下再加熱1小時。然後將反應混合物冷卻後，將粗産物純化。 實施例 3. 螢光奈米顆粒的純化
將得自實例1的粗産物在3千相對離心力(rcf)下離心3分鐘以除去游離的AIEgen™亮綠。將上層轉移至試管中，並以1：0.1的體積比加入乙醇進行去乳化。數小時後可見明顯沉澱。然後將混合物以5千轉每分鐘離心3分鐘得到固體産物。然後將分離出的産物藉助超聲儀（Guanboshi GS1530P-30L-900W），再次分散在1倍磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中，其中超聲儀在900瓦下持續1分鐘。最終溶液在室溫下保存以備進一步使用。圖6示出了在自然光和紫外線365奈米下的螢光奈米顆粒的光發光。表 3. 選定實施例的顆粒尺寸
投料 St/MMA/AA ( 毫升 ) DLS[z average ( 奈米 ), PDI]
粗産物 純化産物
P2 1:0.1:0.1 82, 0.076 87, 0.046
P3 1:1:1 135, 0.19 156, 0.09
P4 1:0.02:0.18 91, 0.20 91, 0.042
P5a 1:0.1:0.1 84, 0.132 106, 0.098
P9 1:0.1:0.1 145, 0.179 135, 0.056
a 超聲預乳化10分鐘表 4. 聚合反應的化學組分和反應條件
化學 組分和反應條件 範圍
St/MMA/AA(毫升) 1:0.02-1:0.02-1
過硫酸銨(克,在2毫升去離子水) 0.01-0.1
SDBS(克) 0.01-0.2
NH4 HCO3 (克) 0.05-0.5
去離子水(毫升) 1-1000
AIEgen™紅(毫克) 0.001-1000
機械攪拌速度(轉每分鐘) 10-2000
溫度(℃) 70-90
時間(小時) 1-4
預乳化功率(瓦) 10–1000
預乳化時間(小時) 0.01–30
表 5. 選定實施例的 抗體標記反應式
投料 EDC (20 毫克 / 毫升 ) NHS (55 毫克 / 毫升 ) 螢光奈米顆粒 MES 緩衝液 (pH = 6.0) 抗體 (200 微升 )
NL10 2微升 2微升 50微升(P2 ) 146微升 β-hCG-mAb (10毫克 / 毫升 )
LH3 2微升 2微升 50微升(P2 ) 146微升 β-LH-mAb (1毫克 / 毫升 )
實施例 4. 螢光奈米顆粒的純化
將得自實施例1的粗産物在3千rcf下離心3分鐘以除去游離的AIEgen™亮綠。將上層轉移至試管中，並以1：0.1的體積比加入乙醇以進行去乳化。數小時後可見明顯沉澱。然後將混合物以5千轉每分鐘離心3分鐘得到固體産物。然後將分離出的産物藉助超聲儀（Guanboshi GS1530P-30L-900W））再次分散在1倍磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中在900瓦下放置1分鐘。最終溶液在室溫下保存以備進一步使用。圖8示出了在自然光下和在365奈米紫外線激發下的螢光奈米顆粒的光發光。
實施例 5. 螢光奈米顆粒的純化
將得自實施例3的粗産物在3千rcf下離心10分鐘兩次，以除去游離的AIEgen™紅。將上層轉移至試管中，並以1：4的體積比加入粗乙醇（粗産物：乙醇，v/v）進行去乳化。然後將混合物在6600 rcf離心50分鐘以得到固體産物。將固體産物通過簡短的超聲處理再分散在DDI水中。在21000 rcf離心30分鐘後，將獲得的固體産物再次分散在DDI水中。在21000 rcf下再次離心30分鐘後，將純化的産物在超聲儀（Guanboshi GS1530P-30L-900W）的輔助下重新分散在0.1M的2-（N-𠰌啉）乙烷磺酸（MES，pH 6.0）中，其中超聲儀在900瓦下持續20分鐘。最終分散液在室溫或4℃的冰箱中保存以備進一步使用。圖8示出了在自然光下和在365奈米紫外線激發下的螢光奈米顆粒的光發光。
實施例 6.NL10 和 LH3 的標記反應
146微升的2-乙磺酸（MES）緩衝液（pH 6.0）、50微升的P2溶液奈米顆粒、2微升的1-乙基-3-（3-二甲基胺基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶液（20毫克每毫升）和2微升（55毫克每毫升）的N-羥基磺基琥珀醯亞胺溶液（磺基-NHS）加入到1.5毫升的試管中。提前使用MES緩衝液（pH 6.0）製備EDC和磺基-NHS溶液。在室溫下，搖勻後再以轉每分鐘300轉的速度（Eppendorf Centrifuge 5424R）離心15分鐘，在管中加入1.4微升的2-巰基乙醇以使EDC去活化。然後將反應混合物在5千轉每分鐘下離心5分鐘。收集固體産物並用洗滌200微升的MES緩衝液幾次。表5列出了抗體標記的選定實施例。
將純化的固體産物重新分散在600微升1倍PBS緩衝液（pH 7.4）中以製備活化的螢光奈米顆粒溶液。200微升活化的螢光奈米顆粒溶液和200微升的抗體（NL10與β-hCG-mAb或LH3與β-LH-mAb，如表5所示）轉移至1.5毫升的試管中。將反應混合物在室溫下以150轉每分鐘的速度振盪3小時。然後在0℃和6千轉每分鐘的條件下離心8分鐘，然後收集固體産物。將其再分散於200微升1%的牛BSA溶液（在1倍PBS緩衝液中）中，並將混合物在0-4℃下以240轉每分鐘的頻率搖動。3小時後，將混合物在0-4℃和6千轉每分鐘下旋轉4分鐘，並收集固體産物。將固體産物藉助超聲儀在200微升的TBS-T緩衝液（Tween-20 0.05%）中重新分散，以産生奈米抗體共軛物。標記的奈米顆粒溶液在8℃下保存以備進一使用。 實例 7. 側流分析測試條的製備
共軛墊的製備： 通過用含有0.1 莫耳每升的NaCl、20毫莫耳每升的EDTA、1%（w/v）的BSA、1%（w/v）的蔗糖、和0.02%（w/v）的NaN3 的TBS-T緩衝液（pH 7.4）稀釋標記的奈米顆粒來製備共軛物溶液至終濃度爲50微克/毫升。將20微升的共軛物溶液添加到尺寸爲3x6毫米的共軛物墊中，然後在37℃下乾燥3小時。
（ii）固定捕獲試劑： 用於LH條的0.1的毫克每毫升小鼠抗人alpha-LH-mAB（或用於hCG條的小鼠抗人alpha-hCG-mAB）和0.5毫克每毫升的山羊抗小鼠IgG（同時對於LH和hCG檢測）分別在硝酸纖維素膜上作爲測試線和對照線。將測試線和對照線都設置在距膜中心5毫米處。塗有這些試劑的膜在9微升-1 厘米-1 處形成點狀，並在37℃下乾燥1小時。最後，用5%（w/v）BSA封閉膜，然後乾燥並密封保存。
(iii)樣品和吸附墊的製備: 樣品墊和吸附墊由100%的純非織造纖維素纖維製成（Millipore）。15 x 300 毫米的樣品墊被pH 8.0緩衝液飽和，緩衝液中含有0.5%（w/v）的BSA、0.5%（w/v）的蔗糖、2毫莫耳每升的硼酸鈉和0.01%（w/v）的NaN3 ，且乾燥後進行儲存。將吸附墊切成40×300毫米的尺寸。
(iv)側流分析條的組裝: 將樣品墊、共軛墊、NC膜和吸附墊依次裝在塑料背襯支撐板上，並用2毫米的動子組裝，並在其兩端都塗上彩色膜。使用CM4000 Cutter (Bio-Dot)將主卡切成3毫米寬的條。然後將測試條密封在乾燥劑凝膠形式的塑料袋中，並在4℃下保存。 實施例 8. 蛋白標準品溶液的檢測的程序
使用實施例5進行測試。通過在TBS-T緩衝液（pH 7.4）中稀釋製備濃度爲0至200毫國際單位/毫升的LH標準溶液。將100微升的樣品加載到測試條的樣品墊上，然後在10-60分鐘後將其***光電二極管分析儀中。所有實驗均一式三份進行，且一式三份的平均值用於分析。hCG標準溶液的檢測範圍爲0至10000毫國際單位/毫升相似。圖7顯示了在365奈米紫外線激發下不同濃度的hCG和LH測試條。 實施例 9. α-hCG-mAb 的標記反應的程序
130微升的2-乙磺酸（MES）緩衝液（pH 7.0）、60微升的P2奈米顆粒溶液、1-4微升的EDC溶液（15-25毫克每毫升）以及1微升的N-羥基磺基琥珀醯亞胺（磺基-NHS）溶液（50毫克每毫升）加入1.5毫升的試管中。使用前以MES緩衝液（pH 6.0）製備EDC和磺基-NHS溶液。在室溫下以200轉每分鐘（Eppendorf Centrifuge 5424R）搖動反應混合物10分鐘後，在管中加入1微升2-巰基乙醇使EDC去活化。然後將反應混合物在5千轉每分鐘下離心5分鐘。收集固體產物並用2微升的MES緩衝液洗滌數次。將純化的固體産物再分散在1000微升1倍PBS緩衝液中以製備活化的螢光奈米顆粒溶液。將200微升活化的螢光奈米顆粒溶液和700微升的抗體（α-hCG-mAB）轉移至1.5毫升的管中。將反應混合物在室溫下以150轉每分鐘保持振盪3小時。然後，以6千轉每分鐘離心5分鐘，並收集固體産物。將固體産物再分散於700微升2%的BSA溶液（在1倍PBS緩衝液中），並將混合物中在0℃下以200轉每分鐘的速度搖動。3小時後，將混合物以6千轉每分鐘離心3分鐘並收集固體産物。將固體産物重新分散在200微升的TBS-T緩衝液（Tween-20 0.05%）中，在超聲機的幫助下，製備出奈米抗體共軛物。標記的奈米顆粒溶液在4℃下保存以備進一步使用。 實施例 10. 同時檢測兩種蛋白的側流分析測試條的製備
共軛墊的製備：用含0.1莫耳每升的NaCl、20毫莫耳每升的EDTA、1%（w/v）的BSA、1%（w/v）的蔗糖和0.02%（w/v）的NaN3 的TBS-T緩衝液稀釋標記的奈米顆粒至最終濃度爲50微克/毫升。將20微升的共軛物溶液添加到尺寸爲3x6毫米的共軛物墊中，然後在37℃下乾燥3小時。（ii）固定捕獲試劑：用於LH檢測的0.1毫克每毫升的小鼠抗人alpha-LH-mAB、用於hCG檢測的小鼠抗人beta-hCG-mAB和0.5毫克每毫升的山羊抗小鼠IgG（對於LH和hCG檢測）分別作爲硝化纖維素膜作爲測試線1、測試線2和控制線。測試線和控制線均設置在距膜中心4毫米處。塗有這些試劑的膜在9微升-1 厘米-1 處形成點狀，並在37℃下乾燥1小時。最後，用5%（w/v）的BSA封閉膜，然後乾燥並密封保存。（iii）樣品墊和吸附墊的製備：樣品墊和吸附墊由100%的純纖維素不織布（Millipore）製成。15 x 300毫米的樣品墊被pH 8.0緩衝液浸透，緩衝液含有0.5%（w/w）的BSA、0.5%（w/v）的蔗糖、2毫莫耳每升的硼酸鈉和0.01%（w/v）的NaN3 ，且乾燥後儲存。將吸附墊切成40×300毫米的尺寸。iv）側流測試條的組裝：將樣品墊、共軛墊、NC膜和吸附墊依次安裝在塑料背襯支撐板上，並以2毫米的動子組裝，並在其兩端都塗上彩色膜。用CM4000 Cutter（Bio-Dot）將其切成3毫米寬的條。然後將測試條密封在乾燥劑凝膠形式的塑料袋中，並在4℃下保存。 實施例 11. 同時檢測兩種蛋白標準溶液的程序
使用實施例8進行測試。通過在PBS緩衝液（pH 7.4）中稀釋製備LH和hCG標準溶液的濃度分別爲0至100毫國際單位/毫升和0至1000毫國際單位/毫升的不同組合。在10至60分鐘後，將100微升的樣品加載到測試條的樣品墊上，然後***到分析儀中，該分析儀爲光電二極管機器。所有實驗均一式兩份進行，將重複的平均值用於分析。圖9顯示了在365奈米紫外線激發下不同蛋白質濃度的測試條。 實施例 12. 新冠病毒核衣殼蛋白的標記反應的程序
130微升的2-乙磺酸（MES）緩衝液（pH 6.0）、50微升的奈米級P2溶液、1-4微升的1-乙基-3-（3-二甲基胺基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶液（15-25毫克每毫升）以及1微升的N-羥基磺基琥珀醯亞胺（磺基-NHS）溶液（50-60 毫克每毫升）加入1.5毫升的試管中。使用前以MES緩衝液（pH 6.0）製備EDC和磺基-NHS溶液。在室溫下以200轉每分鐘（Eppendorf Centrifuge 5424R）搖動反應混合物10分鐘後，在管中加入1微升的2-巰基乙醇使EDC去活化。然後將反應混合物在5千轉每分鐘下離心5分鐘。收集固體產物産物並用200微升的MES緩衝液洗滌數次。將純化的固體産物重新分散在500-1000微升1倍PBS緩衝液（pH 7.4）中以製備活化的螢光奈米顆粒溶液。將200-700微升的活化螢光奈米顆粒溶液和200-700微升的蛋白質（2019-nCov核衣殼蛋白）轉移至1.5毫升的試管中。將混合物在室溫下以150-300轉每分鐘搖動1-3小時。然後以6-8千轉每分鐘離心5-10分鐘並收集固體産物。將固體産物重新分散在200-700微升中0.5-2%的BSA溶液（在1倍PBS緩衝液中）中，且將混合物在0-4℃下以200-300轉每分鐘搖動。1-3小時後，將混合物離心並在6-8千轉每分鐘下離心3-10分鐘後收集固體産物。將固體産物藉助超聲儀在200-700微升TBS-T緩衝液（Tween-20 0.05-1%）中重新分散，以得到奈米抗體共軛物。標記的奈米顆粒儲存在4-8℃下以備進一步使用。 實施例 13. 製備對新冠病毒核衣殼蛋白的 IgG 和 IgM 檢測的側流分析測試條
(i)共軛墊的製備：用含0.1莫耳每升的NaCl、20毫莫耳每升的EDTA、1%（w/v）的BSA、1%（w/v）的蔗糖和0.02%（w/v）的NaN3 的TBS-T緩衝液（pH 7.4）稀釋標記的奈米顆粒，以製備結合液至終濃度50微克/毫升。將20 uL的共軛溶液加入大小爲3x6毫米的共軛墊中，然後在37℃下乾燥3小時。（ii）固定捕獲試劑：用於IgM檢測的0.1毫克每毫升的小鼠抗人IgM-mAB、IgG檢測的0.1毫克每毫升的小鼠抗人IgG-mAB和0.5毫克每毫升的小鼠抗nCov核衣殼將蛋白mAB分別塗在硝酸纖維素膜上作爲測試線1、測試線2和控制線。測試線和控制線都設置在距膜中心4毫米處。塗有這些試劑的膜以9微升-1 厘米-1 的形式形成點，並在37℃下乾燥1小時。最後，用5%（w/v）的BSA封閉膜，然後乾燥並密封保存。(iii）樣品墊和吸附墊的分離:
樣品墊和吸附墊由100%的純非織造纖維素纖維製成（Millipore）。15 x 300毫米的樣品墊被pH 8.0緩衝液飽和，緩衝液中含有0.5%（w/v）的BSA、0.5%（w/v）的蔗糖、2毫莫耳每升的硼酸鈉和0.01%（w/v）的的NaN3 ，然後乾燥以儲存。吸附墊切成40×300毫米的尺寸。（iv）側流測試條的組裝：樣品墊、共軛墊、NC膜和吸附墊依次安裝在塑料背襯支撐板上，並以2毫米的移動器組裝，並在其兩端都塗上彩色膜。使用CM4000 Cutter (Bio-Dot)，將主卡切成3毫米寬的條（然後將測試條密封在乾燥劑凝膠形式的塑料袋中，並在4°C下保存。 實施例 14. 對新冠病毒核衣殼蛋白的 IgG 和 IgM 檢測的程序
使用實施例11進行測試。將患者的陽性血清樣品或正常個體的陰性血清樣品加載到測試條的樣品墊上，然後在10-60分鐘後，將條***有光電轉換器的讀取儀。計算測試線強度的比率。表6顯示了陽性和陰性血清樣品的結果。 表6
樣品 IgM/IgG比例
陰性血清樣本 0.55
陽性血清樣本 1.44
實施例 15. 在免疫印記方面 AIE 共軛抗體的應用
AIE共軛抗體可以增強免疫標記的敏感性。在免疫印跡上進行了使用AIE結合的抗體直接免疫標記與使用傳統的螢光團結合（例如FITC）抗體間接免疫標記的性能測試。在兩張硝酸纖維素膜上吸取一定量的蛋白質。將一張膜（A）上的蛋白質與AIE共軛的一級抗體結合並檢測。另一膜（B）上的蛋白質與等量的未結合的一級抗體結合並通過FITC結合的二級抗體檢測。在相同條件下，使用AIE結合的抗體通過直接方法檢測目標蛋白質的訊號強度免疫印跡遠強於使用FITC共軛的二級抗體間接法檢測到的印跡（圖10）。 參考文獻 [1]   S. Thalhammer, E. Linares,Novel cluster for the detection of an analyte, 2016 ,PCT/EP20 15/068 193 . [2]   J. S. Lee, S. Lee, M. H. Choi, H. Soo, S. K. Kim, J. Y. Kim,Enhanced Infrared Ray Absorbing/Emitting Nanoparticles and On-Site Diagnosis Kit Using Same, 2018, PCT/KR2018/002616 . [3]   J. W. Moon, T. J. Phelps, C. L. Fitzgerald, Jr., R. F. Lind, J. G. Elkins, G. G. Jang, P. C. Joshi, M. Kidder, B. L. Armstrong, T. R. Watkins, I. N. Ivanov, D. E. Graham,Appl Microbiol Biotechnol 2016 ,100 , 7921. [4]   S. Wang, N. Mamedova, N. A. Kotov, W. Chen, J. Studer,Nano Letters 2002 ,2 , 817. [5]   W. J. Parak, D. Gerion, T. Pellegrino, D. Zanchet, C. Micheel, S. C. Williams, R. Boudreau, M. A. L. Gros, C. A. Larabell, A. P. Alivisatos,Nanotechnology 2003 ,14 , R15. [6]   G. M. Whitesides,Nature Biotechnology 2003 ,21 , 1161. [7]   A. Care, N. Sayyadi, R. Connally, A. Try, P. L. Bergquist, A. Sunna,Luminescent biomolecular complex and use thereof, 2016 ,PCT/AU2016/000263 . [8]   J. Luo, Z. Xie, J. W. Y. Lam, L. Cheng, B. Z. Tang, H. Chen, C. Qiu, H. S. Kwok, X. Zhan, Y. Liu, D. Zhu,Chemical Communications 2001 , 1740.
無
[圖 1 ]說明爲用於製造螢光奈米顆粒的微流體裝置的具體實例。使用下文的簡寫：甲基丙烯酸甲酯（MMA）、丙烯酸（AA）、十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、醇乙氧基化物（AEO，重複單元爲3/5/7）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、過硫酸銨（APS）、2,2'-偶氮二（異丁腈）（AIBN）、過氧化苯甲醯（BPO）。
[圖 2 ]說明了具有核殼結構的奈米顆粒，其具有用於生物修飾的連接的官能團。
[圖 3 ]說明代表本發明一些具體實例的側流條的側視圖。
[圖 4 ]說明代表本發明一些具體實例的側流條的頂視圖。
[圖 5 ]描述了測試的第一天（左圖）和六個月（右圖）後分別以0、2、5、5、10、25、100、200、500、1000、10000毫國際單位/毫升濃度測量的hCG測試條的照片，照片使用相同的相機設置，在365奈米的光激發下進行拍攝。
[圖 6 ]如實施例1所述製備的螢光奈米顆粒在自然光和365奈米紫外線激發下的光發光。
[圖 7 ]照片爲hCG（左）和LH測試條（右）在樣品體積爲100微升、365奈米紫外光激發下的圖像，hCG濃度爲0、20、200、2000、10000毫國位/毫升；LH的濃度爲0、20、200、2000毫國際單位/毫升濃度。
[圖 8 ]含有AIEgen™紅的螢光奈米顆粒在自然光下（左）和在365奈米紫外線激發下的照片（右）。
[圖 9 ]在365奈米激發下有兩條測試線的紙條照片，其中T1和T2分別用於促LH和hCG檢測。
[圖 10 ]AIE共軛抗體的性能測試。（A）使用1：5000 AIE共軛的小鼠抗β-LH抗體（箭頭）在免疫印跡上直接檢測7奈克的LH蛋白。（B）使用1：5000未共軛的小鼠抗β-LH抗體（箭頭）和1：5000螢光素(FITC)共軛的山羊抗小鼠第二級抗體體（箭頭）間接檢測7奈克的LH蛋白。A與B圖的收集采用相同拍攝參數
Figure 109125926-A0101-11-0002-1

Claims (13)

  1. 一種具有大於20%的固態量子產率的奈米顆粒，其包含以1-50%（重量百分比）的濃度纏繞在聚合物網中的發光體，其中該等發光體包含螢光團，該螢光團包含選自以下一種或多種組成之群的主鏈結構：
    Figure 03_image001
    其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 和R6 各自獨立地選自氫、烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基組成之群；和 其中每個X獨立地選自氧、硫、硒、碲、碳、矽、鍺、磷、砷和銻，其中X可以進一步被氫、烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基取代。
  2. 如請求項1的奈米顆粒，其中該等發光體具有400奈米至850奈米的可調發射波長和220奈米至800奈米的激發波長。
  3. 如請求項1的奈米顆粒，其中該等發光體是具有淡黃色發光的N-5-硝基水楊亞基-4-四苯基乙烯基胺。
  4. 如請求項1的奈米顆粒，其中該聚合物由選自苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸、乙酸乙烯酯和乙二醇組成之群的單體組成。
  5. 一種製備具有大於20%的固態量子產率的奈米顆粒的方法，其包括以1-50%（重量百分比）的濃度纏繞在聚合物網中的發光體，其中該等發光體包含螢光團，該螢光團包含選自以下一種或多種組成之群的主鏈結構：
    Figure 03_image001
    其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 和R6 各自獨立地選自氫、烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基組成之群；和 其中每個X獨立地選自氧、硫、硒、碲、碳、矽、鍺、磷、砷和銻，其中X可以進一步被氫、烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基取代； 該方法包含以下步驟： a.將發光體溶解在一種或多種單體中以形成單體混合物，其中該單體混合物中具有1-500 g/L的發光體； b.將起始劑溶於去離子水中以形成起始劑溶液； c.將表面活性劑溶解在去離子水中以形成反應混合物； d.將該單體混合物和該起始劑溶液加入該反應混合物中；和 e.加熱步驟（d）的全部混合物直至其變成乳白色，其中形成了該等奈米顆粒。
  6. 如請求項5的方法，其中該步驟（c）之後是在100至4000相對離心力的攪拌下將來自步驟（a）的一部分該單體混合物加入到該反應混合物中，其中使用剩餘的單體混合物在步驟（d）中。
  7. 如請求項5的方法，其中，該等發光體是N-5-硝基水楊亞基-4-四苯基乙烯基胺。
  8. 如請求項5的方法，其中該一種或多種單體選自苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸、乙酸乙烯酯和乙二醇組成之群。
  9. 如請求項5的方法，其中步驟（c）之後是在400至2000瓦的超聲處理下將一部分該單體混合物加入到該反應混合物中。
  10. 如請求項5的方法，其中在步驟（d）中使用微流體裝置。
  11. 如請求項5的方法，其中所該起始劑選自過硫酸銨、過硫酸銨（APS）、2,2'-偶氮二（異丁腈）（AIBN）、過氧化苯甲醯（BPO）、過硫酸鉀和4,4'-偶氮雙（4-氰基戊酸）組成之群。
  12. 如請求項5的方法，其中該表面活性劑選自癸基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、多庫酯鈉、全氟辛烷磺酸、全氟丁烷磺酸、硬脂酸鈉、四級銨陽離子、烷基多糖苷、單硬脂酸甘油酯或壬基苯氧基聚乙氧基乙醇組成之群。
  13. 如請求項5的方法，其中步驟（e）的該加熱是在70至90℃。
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