CN116754763A - 基于半导体共轭聚合物荧光探针的单分子检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于半导体共轭聚合物荧光探针的单分子检测方法以及包含半导体共轭聚合物荧光探针和磁珠的试剂盒，可用于蛋白质的单分子级别的定量检测。本申请的检测方法通过普通荧光显微镜即可实现，并且检测灵敏度高，耗时短，检测动态范围宽。
Description
技术领域
本发明属于单分子检测领域，具体涉及基于半导体共轭聚合物荧光探针的单分子检测方法及相关试剂盒。
背景技术
单分子检测（SMD）是以单个分子的分析为基础构建的一种方法，到目前为止，它已经在生命科学的研究中备受关注。近几年来，该方法被应用于细胞成像、蛋白质相互作用的研究以及蛋白质和核酸的定量检测中。在上述提及的应用中，定量检测是以对目标物分子的一个接一个的计数来实现的，这种定量检测手段代表了检测的最终极限。传统的平均测定方法如免疫层析、化学发光、酶联免疫等是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的。信号强度越高，被测定目标物的浓度越高。与平均测定方法所不同的是，在SMD定量方法中，对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性。由于SMD定量检测方法具有平均测定所无法比拟的优点，目前，已经有工作将SMD应用到定量分析之中（参见专利文献1~3）。
具体而言，专利文献1为本申请发明人的在先申请，涉及利用具有特定粒径（180~400nm）的原位信号增强纳米粒子对待测分子进行标记，使得单分子信号能够被光学成像设备捕获和识别，实现待测分子的超高灵敏度定量检测。其说明书中，对于原位信号增强纳米粒子，提及了包含有发光材料和纳米粒子载体这两部分，对于发光材料，提及了荧光染料分子、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子，并教导优选为荧光素类（如异硫氰酸荧光素）、罗丹明类（如罗丹明绿、罗丹明B等）、香豆素类、量子点类（CdS、CdSe、CdTe、ZnSe）、稀土元素（如Eu、Ce）及其配合物等，未提及半导体共轭聚合物荧光探针。
专利文献2为深圳光与生物科技有限公司提出的申请，其涉及一种基于上转换荧光探针的单分子检测方法，具体而言，将被检测样品稀释后滴加到玻璃片或硅片这样的检测基板上，被检测物与生物活性分子B结合，完成后冲洗检测基板，然后滴加用稀释的免疫荧光探针，使生物活性分子A与已经和生物活性分子B结合的被检测物结合，完成后冲洗检测基板；将处理后的检测基板置于荧光显微镜下，对免疫荧光探针数目进行计数。该文献通过用高浓度稀土掺杂在上转换纳米材料颗粒中，使上转换纳米材料颗粒具有较大的反斯托克斯位移，相比传统使用的有机染料而言，激发光源和发射波段无重叠，且可有效抑制自发荧光背景噪声，能够显著提高检测信号的信噪比。其使用玻璃片或硅片作为载体，且关注的是高浓度稀土掺杂上转换纳米发光材料，不涉及半导体共轭聚合物荧光探针。
专利文献3为彩科（苏州）生物科技有限公司提出的申请，其涉及一种多重免疫分子检测方法，包括如下步骤：获得表面连接有捕获分子的编码微球；通过所述捕获分子捕获目标免疫分子并加入酶标试剂，在所述编码微球表面形成酶标记的免疫夹心复合物；将表面修饰有免疫夹心复合物的编码微球驱动到微孔板的微孔中并密封；预定时间后通过光激发所述微孔板进行检测所述微孔板。其原理与美国Quanterix公司的数字PCR技术类似，基于精密微孔板的微孔来实现对单个分子的分离及检测，同样未提及半导体共轭聚合物荧光探针。
由半导体共轭聚合物形成的半导体共轭聚合物荧光探针是一类新颖的有机光学探针，电子离域的π共轭体系是这类荧光材料的结构特征。半导体共轭聚合物荧光探针的光学性质大多由作为其构成单元的半导体共轭聚合物的化学结构决定，因此可以通过对其结构进行合理设计来调节其光学性能。迄今为止，半导体共轭聚合物荧光探针已被用于开发一系列的光学应用上，例如化学发光成像、长余辉成像、光声成像、光动力治疗等。与无机光学纳米材料例如贵金属纳米材料、半导体量子点等相比，避免了金属离子导致的生物毒性问题，与小分子光学探针相比，该类材料具有较大的吸光系数和优异的光稳定性（参见非专利文献1）。
专利文献4涉及一种多重单分子定量检测技术及其检测***，其使用粒径为50~150nm、优选50~100nm的半导体聚合物纳米材料作为荧光指示物，将修饰有标记分子的磁珠固定在微流控芯片中，其说明书0020段记载“常规的基于磁珠的检测方法往往对荧光材料的荧光强度和尺寸有着严格的限定，其荧光材料的颗粒尺寸要求至少为180nm以上，但这种尺寸下的荧光材料会产生空间位阻效应，影响生物分子之间的识别（抗原抗体识别，核酸分子杂交）。而且荧光分子斯托克斯有限，会导致可选荧光通道少，难以实现多重（多种分子同时）检测”。也即，专利文献4认为应当将荧光材料的粒径控制在低于180nm的范围内。
现有技术文献
专利文献1：CN111771126A；
专利文献2：CN111735964A；
专利文献3：CN111060683A；
专利文献4：CN114034856A；
非专利文献1：“半导体共轭聚合物光学探针的设计及在自发光成像和光声成像中的应用”，王鑫等，高分子学报，第52卷，第7期，2021年7月。
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献1开创性地提出了基于粒径的单分子检测策略，使用的发光材料为荧光素、量子点、荧光蛋白，获得了较高的检测灵敏度，但仍存在进一步提高的余地，另外，为了应对临床的通量需要，在检测效率和检测动态范围方面也要求进一步的改善。专利文献4需要结合微流控芯片才能实现高的灵敏度，考虑到微流控芯片高昂的价格，这将显著提升成本。
鉴于上述现有技术的状况，本申请的目的在于提供一种以低的成本（不使用微流控芯片，也不使用非常规荧光显微镜）实现优异的检测灵敏度、较宽的检测动态范围和较高的检测效率的单分子检测方法。
用于解决课题的手段
申请人对双抗夹心法中的荧光标记分子进行了深入研究，尤其对能够良好地适用于单分子检测的发光材料进行了研究，发现以特定含量包含半导体共轭聚合物荧光探针的具有特定粒径的原位信号增强粒子在以计数为特征的单分子检测中可获得非常优异的检测灵敏度、令人满意的检测动态范围，并且可以适当缩短孵育时间，提高检测效率。
本申请的一个技术方案如下。
一种基于半导体共轭聚合物荧光探针的单分子检测方法，其包括以下步骤：
（1）将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定到磁珠上，加入靶标分子，使靶标分子的第一位点与捕获抗体结合，从而捕获样品中的靶标分子；
（2）加入能够与靶标分子的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与靶标分子的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；
上述原位信号增强粒子的粒径为180nm~350nm，且含有1质量%以上且20质量%以下的半导体共轭聚合物荧光探针、及载体，
（3）用光学成像设备将上述原位信号增强粒子发出的发光信号成像；
（4）对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中靶标分子的浓度，
其中，步骤（1）和（2）可以分别替换为下述的步骤（1’）和（2’），
（1’）将检测抗体与样品混合，使其与样品中的靶标分子的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先使原位信号增强粒子与检测抗体结合而形成复合材料，再将该复合材料加入样品中，使该复合材料与样品中的靶标分子的第二位点结合；其中，所述原位信号增强粒子与所述步骤（1）中的原位信号增强粒子相同；
（2’）将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定至磁珠上，然后加入至步骤（1’）的体系中，使所述捕获抗体与所述靶标分子的第一位点结合，从而将靶标分子捕获。
本申请的该技术方案中，不使用微流控芯片，也不使用全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备等非常规荧光显微镜，也不使用体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔，检测成本较低。
优选地，上述半导体共轭聚合物荧光探针包含下述聚合物中的至少一种，
。
其中的n为PDHF（聚（9,9-n-二己基-2,7-芴））、PFO（聚（9,9-n-二辛基-2,7-芴））、PPE（聚（2,5-二癸基苯乙炔））、MEH-PPV（聚（5-甲氧基-2-辛氧基苯乙烯））、PFPV（[（9,9’-二辛基-2,7-二乙烯基-芴）-alt-2-甲氧基-5-（2-乙基己基氧基）-1,4-苯基]）、PFBT（聚[（9,9）-二辛基芴基-2,7-二基]-co-[1,4-苯并{2,1’,3}-噻二唑]）、CN-PPV（聚（5-甲氧基-2-辛氧基氰基苯乙烯））、PF-DBT5（（9,9-n-二辛基-2,7-芴）-co-（噻吩基-1,4-苯并{2,1’,3}-噻二唑-噻吩基））的聚合度。
优选地，原位信号增强粒子的粒径为200~300nm，粒径的变异系数（CV值）为1%~10%。
优选地，上述原位信号增强粒子还包含载体，所述载体为聚乳酸-聚乙二醇或苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物、二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺，优选为聚乳酸-聚乙二醇或苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物。
优选地，上述靶标分子为蛋白质、多糖或有生物活性的小分子，优选为cTnI、IL-6、p-Tau181蛋白、p-Tau217蛋白、Aβ40蛋白、Aβ42蛋白、GFAP蛋白或NF-L蛋白。
本申请还涉及基于单分子计数的试剂盒，其包含原位信号增强粒子和磁珠，特征在于，上述原位信号增强粒子包含1质量%以上且20质量%以下的半导体共轭聚合物荧光探针、和载体，且平均粒径为180~350nm，粒径的变异系数（CV值）为1%~10%。
本申请还涉及单分子检测方法在蛋白质检测中的应用，尤其涉及在cTnI、IL-6、p-Tau181蛋白、p-Tau217蛋白、Aβ40蛋白、Aβ42蛋白的浓度检测中的应用。
本申请中的粒径使用扫描电子显微镜（SEM），以在1个视野中可观察到约100个原位信号增强粒子的倍率来观察粒子，用卡尺测定随机选择的50个含半导体共轭聚合物荧光探针的原位信号增强粒子的最长直径，求出该值的数均值，将其作为平均粒径。上述原位信号增强粒子的粒径的变异系数通过下式来计算。
粒径的变异系数（CV值）＝粒径的标准偏差/平均粒径
本发明的效果
根据本发明，能够提供以低的成本（不使用微流控芯片，也不使用非常规荧光显微镜）实现优异的检测灵敏度、较宽的检测动态范围和较高的检测效率的单分子检测方法。
附图说明
图1示出实施例1中得到的标准曲线（纵坐标即CPN（copy number）为单分子信号数）。
图2示出实施例14中得到的标准曲线。
具体实施方式
基于半导体共轭聚合物荧光探针的单分子检测方法，其包括以下步骤：
（1）将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定到磁珠上，加入靶标分子，使靶标分子的第一位点与捕获抗体结合，从而捕获样品中的靶标分子；
（2）加入能够与靶标分子的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与靶标分子的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；
上述原位信号增强粒子的粒径为180nm~350nm，且含有1质量%以上且20质量%以下的半导体共轭聚合物荧光探针、及载体，
（3）用光学成像设备将上述原位信号增强粒子发出的发光信号成像；
（4）对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中靶标分子的浓度，
其中，步骤（1）和（2）可以分别替换为下述的步骤（1’）和（2’），
（1’）将检测抗体与样品混合，使其与样品中的靶标分子的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先使原位信号增强粒子与检测抗体结合而形成复合材料，再将该复合材料加入样品中，使该复合材料与样品中的靶标分子的第二位点结合；其中，所述原位信号增强粒子与所述步骤（1）中的原位信号增强粒子相同；
（2’）将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定至磁珠上，然后加入至步骤（1’）的体系中，使所述捕获抗体与所述靶标分子的第一位点结合，从而将靶标分子捕获。
上述检测方法基于双抗体夹心免疫法来检测蛋白质的浓度。磁珠用于检测样品及试剂的分离和清洗。上述捕获抗体通过物理吸附或化学修饰的方式固定在磁珠表面，并且能够与靶标分子（以下，有时也称为待测分子）的一个结合位点相结合，使靶标分子从样品中分离。
上述检测抗体能够与待测分子的另一个结合位点结合。上述的原位信号增强粒子直接与检测抗体结合，是指检测抗体通过物理吸附或化学修饰的方法，直接吸附或偶联在原位信号增强粒子上，实现原位信号增强粒子对待测分子识别和标记的功能化修饰。上述的“原位信号增强粒子间接与检测抗体结合”是指通过抗检测抗体（即二抗）或生物素-链霉亲和素体系进行结合，将原位信号增强粒子特异性标记在检测抗体上。
上述靶标分子包括蛋白质、多糖或有生物活性的小分子及小分子与蛋白质的复合物。具体而言，可举出cTnI抗原、IL-6抗原、PCT（降钙素原）抗原、Sema4D（信号素4D）抗原、Nt-proBNP（脑自然肽氨基端前体蛋白）抗原、肿瘤标志物、维生素D、维生素B、叶酸、维生素D-BSA复合物、叶酸-BSA复合物、p-Tau181蛋白、p-Tau217蛋白、Aβ40蛋白、Aβ42蛋白、细菌及病毒等，特别是在检测p-Tau181蛋白、p-Tau217蛋白、Aβ40蛋白、Aβ42蛋白等神经标志物蛋白方面获得了非常优异的灵敏度。
上述磁珠的表面修饰有能够与抗体进行共价偶联的活性官能团，例如羟基、羧基、氨基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基（如甲苯磺酰基）及它们的衍生基团中的一种或多种。
上述捕获抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。上述捕获抗体按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体、羊驼源抗体中的一种或多种。具体而言，可举出Hytest 19C7、Hytest 20C6、Hytest 16A11、Medix2703、Meridian M86101M、Biospacific A45160以及Biospacific G-131-C等。
所述检测抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。所述检测抗体按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。具体而言，可举出Hytest 16A11、Medix 2704、Meridian M86201M以及Biospacific A45502等。
上述抗检测抗体按照检测抗体来源分类，可以为抗鼠抗体、抗兔抗体、抗羊抗体、抗羊驼抗体中的一种或多种。所述抗检测抗体按照来源分类，可以为鼠源二抗、兔源二抗、羊源二抗以及羊驼源二抗中的一种或多种。
上述原位信号增强粒子是指在原位（in-situ）将发光信号增强至能够被常规光学成像设备（如荧光显微镜）检测到的水平的材料，其以1质量%以上且20质量%以下的含量含有上述半导体共轭聚合物荧光探针。
具体而言，所述半导体共轭聚合物荧光探针例如可以为下述化合物。
上述半导体共轭聚合物荧光探针可通过购买市售品或者化学合成而得到。关于化学合成，其制备方法主要分为两类，第一类是使低分子量的聚合物单体直接合成为聚合物纳米颗粒，也称为直接聚合，此方法在20世纪80年代应用于聚合物纳米颗粒的制备，不同于导电聚合物的氧化聚合法，绝大部分的半导体共轭聚合物需在过渡金属催化下利用偶联反应来合成。第二类是由高分子量聚合物合成纳米级颗粒，也称后聚合，此方法可将商品化的各类高分子聚合物直接制备成半导体聚合物纳米颗粒，主要包括微乳液法和再沉淀法。具体合成方法可参见文献（“半导体聚合物纳米颗粒的制备及荧光传感应用”，梅寒，硕士学位论文，2016年4月）及文献（“半导体聚合物纳米荧光探针的制备及生物应用研究进展”，张佳楠等，发光学报，2015年7月）。
本发明的原位信号增强粒子中，不仅必须含有上述半导体共轭聚合物荧光探针作为荧光材料，而且必须以规定范围的含量（质量含量）含有。具体而言，申请人发现，在将上述半导体共轭聚合物荧光探针作为荧光材料用于单分子检测的情况下，为了获得良好的检测灵敏度及发光稳定性，其在原位信号增强粒子中的含量必须控制在1质量%~20质量%之间。当其含量低于1质量%时，检测下限显著变高，即，检测灵敏度降低。当其含量高于20质量%时，原位信号增强粒子的整体发光强度反而显著下降，存在荧光淬灭的情况，甚至导致无法计数，而且粒子的CV值也变大，发光稳定性较差，实验结果的重复性不良。半导体共轭聚合物荧光探针的含量可以通过原料比例来进行调节。更优选地，上述半导体共轭聚合物荧光探针在原位信号增强粒子中的含量为2质量%~15质量%，进一步优选为5质量%~10质量%。原位信号增强粒子中的半导体共轭聚合物荧光探针的质量含量可以通过使用热解气相色谱（如日本电子公司制的Q1000）对0.01g原位信号增强粒子中所含的半导体共轭聚合物荧光探针的质量进行测定而得到。
上述的半导体共轭聚合物荧光探针可以其自身被包裹在原位信号增强粒子的内部，也可以以被引入作为载体的聚合物的主链、侧链的方式被包含在原位信号增强粒子内。从制备工艺的容易度的方面考虑，优选上述的半导体共轭聚合物荧光探针自身被包含在原位信号增强粒子内。
所述原位信号增强粒子还包含载体，所述载体按照材料分类，可以为聚乳酸-聚乙二醇或苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物、二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺等，其中，从使发光材料均匀分布、提高检测灵敏度的观点考虑，载体优选为聚乳酸-聚乙二醇或苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物。聚乳酸-聚乙二醇（PLA-PEG）可以购买市售品或者通过常规的共聚方法得到，本申请中，使用的聚乳酸-聚乙二醇购自广东星云生物技术有限公司，还可以进一步对其进行羟基修饰，以利于与检测抗体或检测探针的结合。苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物可以购买市售品或者通过常规的自由基共聚得到。
原位信号增强粒子的平均粒径优选为180~350nm。申请人意外地发现，对于包含上述半导体共轭聚合物荧光探针的原位信号增强粒子而言，以上述范围的粒径使用时能够获得较之其他范围更优异的检测灵敏度。原位信号增强粒子的粒径可以通过调节荧光材料与载体的质量比、反应温度、反应时间、搅拌的转速以及溶剂的用量等参数来控制。
关于原位信号增强粒子的制备方法，没有特别限定，当载体为聚乳酸-聚乙二醇时，可以采用下述方式制造。将聚乳酸-聚乙二醇共聚物和上述半导体共轭聚合物荧光探针溶于二氯甲烷等有机溶剂中，搅拌并微热使其溶解，将该溶液滴入含表面活性剂如Pluronic F-127的水溶液中，超声而形成乳液，再次与含表面活性剂的水溶液混合，磁力搅拌后蒸发除去有机溶剂，离心后洗涤，得到包埋有上述半导体共轭聚合物荧光探针的以聚乳酸-聚乙二醇为载体的原位信号增强粒子。在使用前可以与碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺反应而活化。
当载体为苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物时，原位信号增强粒子可以采用下述方法制造：（1）制备含有苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物的种粒子分散液的工序；（2）制备含有上述半导体共轭聚合物荧光探针和有机溶剂的乳化液的工序；（3）向上述种粒子分散液中加入上述乳化液，使上述种粒子吸收上述半导体共轭聚合物荧光探针和上述有机溶剂而得到溶胀粒子液滴分散液的工序；和（4）将上述溶胀粒子液滴中的上述有机溶剂干燥，得到包含上述半导体共轭聚合物荧光探针的以苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物为载体的原位信号增强粒子的工序。关于苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物的合成方法，没有特别限制，采用本领域中已知的共聚方法即可，优选为不使用乳化剂（表面活性剂）的无皂乳液聚合法。具体而言，向具备搅拌机、回流冷凝器、温度传感器、氮导入管的反应器中，添加水、甲基丙烯酸、苯乙烯、过硫酸钾（引发剂），进行氮气置换后，于一定温度下搅拌，聚合一定时间。聚合结束后，将溶液用滤纸过滤，取出胶乳粒子，然后用透析膜进行透析处理，得到作为种粒子的胶乳粒子。当载体为苯乙烯时，原位信号增强粒子可以参照苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物为载体时类似的方法来合成（将（甲基）丙烯酸省去），当载体为二氧化硅、或聚丙烯酰胺时，原位信号增强粒子的制造方法可以参见专利文献1中实施例的记载。
本申请中，所述原位信号增强粒子的表面修饰有能够与抗体共价偶联的活性官能团，包括羟基、羧基、氨基、巯基、烯基、炔基、琥珀酰亚胺酯基团及其衍生基团中的一种或多种。
本申请中，所述原位信号增强粒子的表面可以修饰有一定长度的连接臂，所述连接臂包括多碳直链、多碳支链、聚合物链、肽链、蛋白质。所述连接臂的长度优选为180~350nm，进一步优选为2~20nm，最优选为5~10nm。
本申请的步骤（1）中，样品与捕获抗体的孵育温度为10～50℃，优选为20～40℃，尤其优选为37℃，孵育时间为1min～60min，优选为3min～30min，尤其优选为10min～30min。本申请的步骤（2）中，检测抗体（或结合有检测抗体的原位信号增强粒子）与样品的孵育温度为10～50℃，优选为20～40℃，尤其优选为37℃，孵育时间为1min～60min，优选为2min～30min，尤其优选为15min～25min。
本申请中，作为测定对象，没有特别限定，可例举各种生物试样，例如血液、血清、血浆、尿、唾液、咳痰、鼻涕、鼻腔擦拭液、咽喉擦拭液、泪液等体液。
本申请中，所述光学成像设备主要包括以下部件：激发光源、物镜、滤光片、感光元件、数据采集模块、数据处理模块以及二向色镜（若为正置显微镜，则也可以没有二向色镜）。其中，所述激发光源是用于将反应后的样品激发出光学信号的光学发射装置。所述物镜用于待测样品的信号采集和放大。所述二向色镜用于激发光路的反射和样品光学信号的采集。所述滤光片用于激发光波段的过滤和样品发射光信号的过滤。所述感光元件用于样品光学信号的采集。所述数据采集模块配置为接收感光元件捕获的光学信号，并转换为数字信号。所述数据处理模块配置为数字信号的转换以及光学图像的形成和处理。
在该设备的一些实施方式中，所述激发光源包括气体激光器、固体激光器、半导体激光器、液体激光器以及自由电子激光器中的一种或几种。在该设备的一些实施方式中，所述物镜按照倍率分类，包括1X、2X、4X、5X、10X、20X、40X、50X以及100X中的一种或几种；所述物镜按照场曲校正分类，包括平面物镜或曲面物镜。在该设备的一些实施方式中，所述感光元件包CCD（Charge Coupled Device，电荷耦合装置）或CMOS（Complementary Metal-OxideSemiconductor，互补金属氧化物半导体）中的一种或两种。
本申请通过采用特定的检测体系，从而对光学成像设备的要求低，为常规的光学成像设备（即未突破光学衍射极限的光学成像设备）即可，无需全内反射荧光显微镜、落射荧光显微镜、扫描近场光学显微镜、共聚焦荧光显微镜等昂贵的、突破了光学衍射极限的成像设备。
本申请中，靶标分子浓度的计算方式有单分子计数模式和荧光强度积分模式这两种。其中，就所述单分子计数模式而言，直接对生成的图像中的由原位信号增强纳米粒子形成的亮斑个数进行分析和统计，通过亮斑个数直接或间接换算为靶标分子在样品中的浓度信息。所谓“直接换算为靶标分子在样品中的浓度信息”，是指绝对定量，也即，无需标准曲线校正即可换算为浓度信息。所谓“间接换算为靶标分子在样品中的浓度信息”，是指通过亮斑个数和标准曲线（或校正参数）换算为浓度信息。就所述荧光强度积分模式而言，对生成的图像中的由原位信号增强纳米粒子形成的亮斑面积进行统计和积分，通过将积分结果除以特定参数，例如平均每个原位信号纳米粒子所形成的平均亮斑面积或亮斑面积相关变量（例如幂方、开方以及多项式等），从而换算得到原位信号增强纳米粒子的近似个数，再将该数值换算为靶标分子在样品中的浓度信息。其中，平均亮斑面积是通过在较低浓度下对单个分子的亮斑面积进行统计并取平均值而得到的。从获得更大的检测动态范围的方面考虑，重要的是，在低浓度区间使用单分子计数模式、并在高浓度区间使用荧光强度积分模式，然后将这两种模式下绘制的标准曲线合并，从而绘制完整的标准曲线。需要说明，上述低浓度与高浓度的分界线一般为一个磁珠表面上结合有超过一个的待测分子时的浓度，也可以根据标准曲线拟合结果优选为一个磁珠表面上平均结合有0.5个待测分子时的浓度或2个待测分子时的浓度。
实施例
以下，举出实施例、参考例和比较例进一步详细地说明本申请，但本申请并不限定于此。
1、原位信号增强纳米粒子的粒径和变异系数的测定
以聚乳酸-聚乙二醇负载荧光粒子、苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物负载荧光粒子、二氧化硅负载荧光粒子为例，将各原位信号增强粒子用水稀释1000倍，然后取100μL滴加在洁净硅片表面，晾干，使用小型溅射仪在其表面溅射沉积5nm的铂，使用SEM（日本日立高新技术公司制SU3900）进行成像分析，求出粒径。
粒径的变异系数通过下式来计算。
粒径的变异系数（CV值）＝粒径的标准偏差/平均粒径
以聚丙烯酰胺负载荧光粒子为例，用纯水将得到的聚丙烯酰胺荧光纳米粒子稀释1000倍，使用马尔文粒度分析仪（Zetasizer Nano S90）测定粒子的粒径。
2、单分子成像
使用常规荧光显微镜例如尼康Eclipse Ti-U荧光显微镜进行单分子成像，此外，也可采用尼康Eclipse Ti系列的其他荧光显微镜、莱卡DMi8荧光显微镜等。
3、原位信号增强粒子中的发光材料含量测定
通过使用热解气相色谱（如日本电子公司制的Q1000）对0.01g原位信号增强粒子中所含的半导体共轭聚合物荧光探针的质量进行测定而得到。
4、标准曲线绘制方法
本申请中，联合使用单分子计数模式与荧光强度积分模式，具体实施方法如下：
在待测分子的浓度较低时，磁珠数量多于与磁珠结合的待测分子数量，因此使用单分子计数模式对不同浓度的待测分子样本进行标准曲线绘制；
当待测分子的浓度超过一定阈值时，一个磁珠表面可能结合有1个以上的待测分子，单分子信号容易叠加，导致检测结果出现偏差，因此更适合使用荧光强度积分模式。
具体而言，当一张成像图片中的单分子数量不超过设定的阈值时，使用单分子计数模式进行标准曲线的绘制；当一张成像图片中的单分子数量超过设定的阈值时，使用荧光强度积分模式，并将总荧光强度面积除以每个分子的平均荧光强度面积，换算为“近似单分子数量”，从而进行标准曲线绘制。
最后，将利用单分子计数模式得到的标准曲线与利用荧光强度积分模式得到的标准曲线合并，并利用拟合公式进行曲线拟合，绘制完整的标准曲线。
5、原位信号增强粒子的制备
（a）以聚乳酸-聚乙二醇为载体的原位信号增强粒子的制备为例，步骤如下。
将聚乳酸-聚乙二醇共聚物和半导体共轭聚合物荧光探针以规定的比例溶于二氯甲烷等有机溶剂中，搅拌并微热使其溶解，将该溶液滴入含表面活性剂如Pluronic F-127的水溶液中，超声而形成乳液，再次与含表面活性剂的水溶液混合，磁力搅拌后蒸发除去有机溶剂，离心后洗涤，得到包埋有上述半导体共轭聚合物荧光探针的以聚乳酸-聚乙二醇为载体的原位信号增强粒子，分别制备了半导体共轭聚合物荧光探针的质量含量为0.9%、1%、5%、10%、15%、20%和22%的以聚乳酸-聚乙二醇为载体的原位信号增强粒子。
（b）以苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物为载体的原位信号增强粒子可以采用下述方法制造：
（1）制备含有苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物的种粒子分散液的工序，具体而言，向具备搅拌机、回流冷凝器、温度传感器、氮导入管的反应器中，添加400g纯水、1g甲基丙烯酸、10g苯乙烯、0.20g过硫酸钾（引发剂），对容器进行氮气置换后，于65℃以200rpm的速度进行搅拌，聚合24小时。聚合结束后，将溶液用滤纸过滤，取出胶乳粒子，然后用透析膜进行48小时的透析处理，得到作为种粒子的胶乳粒子；
（2）制备含有上述半导体共轭聚合物荧光探针和有机溶剂的乳化液的工序，具体而言，使作为发光材料的半导体共轭聚合物荧光探针0.4g溶解于乙酸乙酯31g而制成溶液，将该溶液添加至溶解有0.1g苯乙烯磺酸钠的水溶液（水为150g）中，进行混合，由此制备乳化液；
（3）以半导体共轭聚合物荧光探针的质量成为种粒子质量的0.11倍的方式，向上述种粒子分散液中加入上述乳化液，使上述种粒子吸收上述半导体共轭聚合物荧光探针和上述有机溶剂而得到溶胀粒子液滴分散液的工序；
和（4）将上述溶胀粒子液滴的分散液一边在65℃下以200rpm的速度搅拌24h，一边将上述有机溶剂干燥，得到包含上述半导体共轭聚合物荧光探针的以苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物为载体的原位信号增强粒子的工序，其中，半导体共轭聚合物荧光探针的质量分数为10%。另外，通过调节原料比例，还制备了半导体共轭聚合物荧光探针的质量含量分别为0.9%、1%、5%、15%、20%、22%的原位信号增强粒子。
当载体为苯乙烯时，原位信号增强粒子可以参照苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物为载体时类似的方法来合成（将（甲基）丙烯酸省去），当载体为二氧化硅、或聚丙烯酰胺时，原位信号增强粒子的制造方法可以参见专利文献1中实施例的记载。
具体使用了PDHF、MEH-PPV、PF-DBTS作为上述半导体共轭聚合物荧光探针。
实施例1：用于人血清中cTnI抗原分子的检测（使用包含PDHF和聚乳酸-聚乙二醇的原位信号增强粒子，粒径为200nm，PDHF的质量含量为10%）。
1、实验组分
甲苯磺酰基活化M280磁珠（Thermo）、捕获抗体（Hytest 19C7）、检测抗体（Hytest16A11）、硅烷偶联剂（APTES）、氨水、正硅酸乙酯（TEOS）、前文制备的包含PDHF和聚乳酸-聚乙二醇的原位信号增强粒子（PDHF的质量含量为10%，平均粒径为300nm，粒径的CV值为5%）、丁二酸酐、待测血清样本、PBS缓冲液、Buffer C（3mM（NH4）2SO4溶于10mM PBS缓冲液，pH=7.4）、Buffer D（0.01%NaCl，0.5%BSA溶于10mM PBS，pH=7.4）、Buffer E（0.0088%NaCl，0.1%BSA溶于10mM PBS，pH=7.4）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、增强粒子保存液、样品稀释液以及PBS洗液。
2.1、磁珠与捕获抗体的共价偶联
（1）取166.6μL的30mg/mL经甲苯磺酰基活化的M280磁珠，使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，移除缓冲液。
（2）取100μg的捕获抗体（Hytest 19C7），用150μL的10mM PBS缓冲液稀释后加入到（1）的磁珠中，混合均匀，加入100μL的Buffer C，于37℃旋转混匀，反应45min。
（3）使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，加入1mL的Buffer D进行封闭反应。于37℃旋转混匀，反应45min。
（4）使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，使用250μL的Buffer E保存，待用。
2.3、检测抗体与原位信号增强粒子的共价偶联
（1）取12μL的保存于增强粒子保存液中的原位信号增强粒子，加入40μL的PBS缓冲液超声1min。
（2）取0.005g的EDC，溶于50μL的PBS缓冲液，另取0.0135g的NHS溶于150μL的PBS缓冲液。
（3）以10000rpm的速度将原位信号增强粒子离心，去除上清液，加入50μL的PBS缓冲液重悬，超声1min后加入2.5μL的EDC溶液，超声1min后再加入7.5μL的NHS溶液，混匀后于37℃旋转混匀反应15min，以12000rpm的转速离心15min，去除上清液，使用50μL的PBS缓冲液将纳米粒子重悬。
（4）加入20μg的检测抗体（Hytest 16A11），于37℃旋转混匀反应2h。
（5）加入25μL的Buffer D，于37℃封闭反应45min后，以12000rpm离心15min，使用100μL的Buffer E重悬保存。
3、实验方法
标准曲线的制作
（1）使用胎牛血清将cTnI抗原的浓度分别稀释为0、0.01、0.1、0.5、1、5、10以及100pg/mL。
（2）将标记有捕获抗体的磁珠稀释为1mg/mL，取50μL，分别加入50μL（1）中得到的各浓度的样品，于37℃孵育45min。使用100μL清洗缓冲液洗三次，洗去残余样品，吸干上清液。
（3）加入10μL结合有检测抗体的原位信号增强粒子，于37℃孵育45min，使用清洗缓冲液洗4次，洗去残余的原位信号增强粒子，去除上清液。
（4）加入5μL检测液将磁珠重悬，转移至检测孔，使用磁铁将磁珠吸引至检测孔的底部，使用荧光显微镜（尼康Eclipse Ti-U）进行单分子成像，联合使用单分子计数模式和荧光强度积分模式来完成后续单分子计数统计和分析。
（5）完成一系列浓度检测，每个浓度点重复6次，根据检测结果绘制标准曲线，计算每个点的CV%值。
4、实验结果
标准曲线的结果如图1所示，可知该实施例中，cTnI的检测范围为1fg/mL~100ng/mL，在该区间内单分子信号数（即CPN）与样品浓度呈良好的线性关系，其检测下限可达1fg/mL，检测灵敏度极高，达到了目前报道中最低的检测下限。而且，检测动态范围也宽，孵育时间也短（可缩短25%）。
参考例1
将原位信号增强粒子替换为专利文献1的实施例1记载的特定粒径的由二氧化硅负载异硫氰酸荧光素粒子而成的微球，各孵育时间延长为1h（以便尽可能与专利文献1的实施例1的条件相同），除此以外，与本申请的上述实施例1同样地操作，cTnI的检测范围为30fg/mL~10ng/mL，在检测灵敏度和检测动态范围方面虽然也优异，但劣于本申请的实施例1。并且检测效率也低于本申请的实施例1。
参考例2
将原位信号增强粒子替换为粒径大约100nm（这也是专利文献4中记载的优选粒径）的包含PDHF和聚乳酸-聚乙二醇的原位信号增强粒子，除此以外，与本申请的上述实施例1同样地操作，cTnI的检测范围为100fg/mL~10ng/mL，明显劣于本申请的实施例1。
比较例1
除了使用PDHF的质量含量为0.9%的原位信号增强粒子外，与本申请的上述实施例1同样地操作，cTnI的检测下限为8pg/mL，明显劣于本申请的实施例1。
比较例2
除了使用PDHF的质量含量为22%的原位信号增强粒子外，与本申请的上述实施例1同样地操作，cTnI的检测下限为10pg/mL，明显劣于本申请的实施例1。
实施例2~4（不同质量含量的实验）
除了将原位信号增强粒子分别替换为质量含量为1%、15%、20%的包含PDHF和聚乳酸-聚乙二醇的原位信号增强粒子以外，与上述实施例1同样地操作，得到各实施例的检测下限，将各实施例和比较例的结果示于下述表1中。由下述表1结果可知，半导体共轭聚合物荧光探针的含量在本发明请求保护的1质量%~20质量%范围内时能够获得非常优异的检测灵敏度，在上限值和下限值处显示出明显的临界效应。
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 比较例1 | 比较例2 | |
| 灵敏度 | 1fg/mL | 15fg/mL | 10fg/mL | 20fg/mL | 8pg/mL | 10pg/mL |
实施例5~7（不同粒径的以聚乳酸-聚乙二醇为载体的实验）
除了将原位信号增强粒子分别替换为平均粒径为180nm、250nm、350nm的包含PDHF和聚乳酸-聚乙二醇的原位信号增强粒子以外，与实施例1同样地操作，得到各实施例的检测下限，示于下述表2中。为便于比较，将实施例1的结果也一并示出。
表2
| 实施例1 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | |
| 灵敏度 | 1fg/mL | 25fg/mL | 5fg/mL | 20fg/mL |
实施例8~10（不同半导体共轭聚合物荧光探针的实验）
除了将原位信号增强粒子中的发光材料分别替换为MEH-PPV、PF-DBTS和PFBT（质量含量均为10%，粒径也约为200nm，载体均为聚乳酸-聚乙二醇）以外，与实施例1同样地操作，得到各实施例的检测下限，示于下述表3中。
表3
| 实施例1 | 实施例8 | 实施例9 | 实施例10 | |
| 灵敏度 | 1fg/mL | 4fg/mL | 8fg/mL | 25fg/mL |
实施例11~13（不同载体的实验）
除了将原位信号增强粒子中的载体分别替换为苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物、二氧化硅、聚苯乙烯以外，与实施例1同样地操作，得到各实施例的检测下限，示于下述表4中。
表4
| 实施例1 | 实施例11 | 实施例12 | 实施例13 | |
| 灵敏度 | 1fg/mL | 5fg/mL | 15fg/mL | 20fg/mL |
实施例14 用于IL-6抗原分子的检测（使用包含PDHF和聚乳酸-聚乙二醇的原位信号增强粒子，PDHF的质量含量为10%）
1、实验组分
甲苯磺酰基活化的M280磁珠（Thermo）、IL-6捕获抗体（Medix 2703）、IL-6检测抗体（Medix 2704）、琥珀辛酯磺酸钠、乙醇、待测血清样本、PBS缓冲液、Buffer C（3mM（NH4）2SO4溶于10mM的PBS缓冲液，pH=7.4）、Buffer D（0.01%NaCl，0.5%BSA溶于10mM的PBS，pH=7.4）、Buffer E（0.0088%NaCl，0.1%BSA溶于10mM PBS，pH=7.4）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、增强粒子保存液以及样品稀释液以及PBS洗液
2、制备方法
（1）取10μL的上文中制得的包含PDHF和聚乳酸-聚乙二醇的原位信号增强粒子的悬浮液，用10mM的PBS缓冲液将其稀释至100μL，加入10μL含有0.5%EDC的水溶液和5μL含有0.5%NHS的水溶液，于37℃活化1小时，使用100kD超滤管去除残余的活化剂，加入100μL的10mM的PBS缓冲液使其重悬，然后加入20μg的IL-6检测抗体（Medix 2704），于37℃反应1.5小时。使用150KD超滤管去除残余的抗体，并使用100μL的10mM PBS缓冲液使其重悬，将超滤和重悬步骤重复一次，将得到的原位信号增强粒子与检测抗体的复合物于4℃保存备用。
2.2、磁珠与捕获抗体的共价偶联
（1）取166.6μL的30mg/mL的经甲苯磺酰基活化的M280磁珠，使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，移除缓冲液。
（2）取100μg捕获抗体（Medix 2703），使用150μL的10mM PBS缓冲液稀释后加入到（1）的磁珠中，混合均匀，加入100μL的Buffer C，于37℃旋转混匀，反应45min。
（3）使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，加入1mL的Buffer D进行封闭反应。于37℃旋转混匀，反应45min。
（4）使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，使用250μL的Buffer E保存，待用。
3、实验方法
IL-6抗原检测
（1）使用胎牛血清将IL-6抗原的浓度分别稀释为0、0.01、0.1、0.5、1、5、10、50以及100pg/mL。
（2）将标记有捕获抗体的磁珠稀释为0.1mg/mL，取50μL，然后分别加入50μL的（1）中得到的各浓度的样品，于37℃孵育30min。使用100μL的清洗缓冲液洗三次，洗去残余样品，吸干上清液。
（3）加入10μL结合有检测抗体的原位信号增强粒子，于37℃孵育15min，使用清洗缓冲液洗4次，洗去残余的原位信号增强粒子，去除上清液。
（4）加入5μL检测液将磁珠重悬，转移至检测孔，使用磁铁将磁珠吸引至检测孔的底部，使用荧光显微镜（尼康Eclipse Ti-U）进行单分子成像，利用荧光强度积分模式来完成后续单分子计数统计与分析。
（5）完成一系列浓度检测，每个浓度点重复3次，根据检测结果绘制标准曲线，计算每个点的CV%值。
4、实验结果
IL-6抗原的检测结果如图2所示，可知浓度为0.01pg/mL的稀释样本能够有效地与背景区分开，经计算，该实施例的检测下限为2fg/mL，效果极优异。
实施例15~16（针对不同标志物的检测实验）
申请人还使用包含PDHF和聚乳酸-聚乙二醇的原位信号增强粒子分别对p-Tau181蛋白和Aβ40蛋白进行了检测，具体而言，在实施例14中，将捕获抗体和检测抗体分别替换为针对p-Tau181蛋白、Aβ40蛋白的捕获抗体和检测抗体，利用双抗免疫夹心法，与实施例14类似地进行了实验，检测灵敏度分别为0.04pg/mL和0.05pg/mL。需要说明，对于这些生物标志物，本领域中的现有市售抗体对的活性有限，无法达到像cTnI或IL-6这样的1fg/mL级别的检测灵敏度，但与现有文献报道的结果相比，由本申请检测方法所带来的接近0.05pg/mL（50fg/mL）级别的检测灵敏度已非常优异，这也证明本申请的检测体系在各项生物标志物上的广泛适用性。
Claims (7)
1.一种基于半导体共轭聚合物荧光探针的单分子检测方法，其包括以下步骤：
（1）将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定到磁珠上，加入靶标分子，使靶标分子的第一位点与捕获抗体结合，从而捕获样品中的靶标分子；
（2）加入能够与靶标分子的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与靶标分子的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；
所述原位信号增强粒子的粒径为180nm~350nm，且含有1质量%以上且20质量%以下的半导体共轭聚合物荧光探针、及载体，
（3）用光学成像设备将所述原位信号增强粒子发出的发光信号成像；
（4）对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中靶标分子的浓度，
其中，步骤（1）和（2）可以分别替换为下述的步骤（1’）和（2’），
（1’）将检测抗体与样品混合，使其与样品中的靶标分子的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先使原位信号增强粒子与检测抗体结合而形成复合材料，再将该复合材料加入样品中，使该复合材料与样品中的靶标分子的第二位点结合；其中，所述原位信号增强粒子与所述步骤（1）中的原位信号增强粒子相同；
（2’）将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定至磁珠上，然后加入至步骤（1’）的体系中，使所述捕获抗体与所述靶标分子的第一位点结合，从而将靶标分子捕获。
2.如权利要求1所述的单分子检测方法，其中，所述半导体共轭聚合物荧光探针包括下述聚合物中的至少一种，
。
3.如权利要求1或2所述的单分子检测方法，其中，所述原位信号增强粒子的粒径为200~300nm，粒径的变异系数（CV值）为1%~10%。
4.如权利要求1或2所述的单分子检测方法，其中，所述载体为聚乳酸-聚乙二醇或苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物、二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺，优选为聚乳酸-聚乙二醇或苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物。
5.如权利要求4所述的单分子检测方法，其中，所述靶标分子为蛋白质、多糖或有生物活性的小分子，优选为cTnI、IL-6、p-Tau181蛋白、p-Tau217蛋白、Aβ40蛋白、Aβ42蛋白、GFAP蛋白或NF-L蛋白。
6.基于单分子计数的试剂盒，其包含原位信号增强粒子和磁珠，其特征在于，所述原位信号增强粒子包含1质量%以上且20质量%以下的半导体共轭聚合物荧光探针、和载体，且平均粒径为180~350nm，粒径的变异系数（CV值）为1%~10%。
7.权利要求1~5中任一项所述的单分子检测方法在蛋白质检测中的应用。
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| CN202311012899.4A CN116754763A (zh) | 2023-08-12 | 2023-08-12 | 基于半导体共轭聚合物荧光探针的单分子检测方法 |
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