TW202118787A

TW202118787A - 抗４－１ｂｂ抗體、其抗原結合片段及雙特異性抗體

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Publication number: TW202118787A
Application number: TW109124769A
Authority: TW
Inventors: 張偉; 陳思萌; 王蕾蕾; 姜福偉; 吳建權; 郭新; 楊翠青; 廖成; 林�源; 胡齊悅; 張連山
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2021-05-16
Also published as: WO2021013142A1

Abstract

本公開提供抗4-1BB抗體、其抗原結合片段及雙特異性抗體。具體而言，本公開提供一種4-1BB抗體、其抗原結合片段，以及一種針對4-1BB和PD-L1的重組雙特異性抗體，編碼所述抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體的核酸分子，包含所述核酸分子的載體和宿主細胞，以及製備所述抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體的方法。還提供了包含所述抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體的醫藥組成物及相關製藥用途。

Description

抗4-1BB抗體、其抗原結合片段及雙特異性抗體

本公開涉及生物醫藥領域，特別是預防、治療與4-1BB和/或PD-L1相關疾病的領域。具體而言，本公開涉及4-1BB抗體及其抗原結合片段，特異性結合4-1BB和/或PD-L1的雙特異性抗體，其醫藥組成物醫藥組成物和相關製藥用途。

4-1BB(CD137，TNFRSF9)是腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRS)的一種跨膜蛋白質。4-1BB在細胞表面以單體或二聚體形式表達，與其配體(4-1BBL)結合後藉由三聚體化以進行信號傳導，是CD8⁺和CD4⁺T細胞、調節性T細胞(Tregs)、NK細胞和NKT細胞、B細胞和中性粒細胞等的共刺激分子。在T細胞上，4-1BB並非組成型表達，而是在T細胞受體(TCR)激活後誘導的，藉由其天然配體4-1BBL或抗體激動劑的刺激，經由TNFR相關因子(TRAF)-2和TRAF-1進行信號傳導。4-1BB的早期信號傳導涉及K-63的多泛素化，激活核因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，信號傳導導致T細胞的共刺激，細胞增殖，細胞因子產生，成熟和CD8⁺ T細胞存活延長。

研究顯示，針對4-1BB的抗體激動劑在小鼠中促進T細胞的抗腫瘤控制(Murillo等，Clin Cancer Res.2008；14(21)：6895-906)。激活4-1BB的抗體在許多模型中可以增加共刺激分子的表達，誘導T細胞的存活和增殖，從而增強抗腫瘤免疫應答，引起抗腫瘤功效。現有技術中已有的4-1BB激活抗體包括BMS公司的urelumab，其是一種人IgG4抗體(WO2005035584)；以及Pfizer公司utomilumab，其是一種人IgG2抗體(Fisher等，Cancer Immunol.2012；61：1721-1733)。其他的4-1BB抗體相關專利包括WO2000029445、WO2012032433、WO2003049755、WO2017205745A等。BMS公司和Pfizer公司的4-1BB抗體均已進入I/II期臨床試驗階段，而Pieris公司的同類產品也已在I期臨床試驗之中。

程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)屬CD28家族，主要表達在活化的T細胞、B細胞和髓系細胞上。PD-1有兩個配體，分別為程序性死亡配體1(PD-L1，CD274，B7H1)和程序性死亡配體2(PD-L2)。PD-L2表達較局限，主要表達在抗原呈遞細胞上，如活化的巨噬細胞和樹突狀細胞。PD-L1屬免疫球蛋白(Ig)超家族，含有一個Ig樣C2型結構域和一個Ig樣V型結構域，是一種單次I型跨膜蛋白，經可變剪切後有三種亞型。新鮮分離的T細胞和B細胞表達可忽略量的PD-L1，部分(約16%)CD14⁺單核細胞組成型表達PD-L1。已知干擾素-γ(IFNγ)能上調腫瘤細胞的PD-L1，而PD-L1能阻礙抗腫瘤免疫，方式包括：藉由與活化T細胞上的受體PD-1結合來耐受腫瘤反應性T細胞；使腫瘤細胞對CD8⁺T細胞具有抗性，並藉由腫瘤細胞表達的PD-L1，藉由PD-1信號傳導進行Fas配體介導的裂解；藉由T細胞表達的CD80(B7-1)，反向信號傳導耐受T細胞；以及，促進經誘導的Tregs的發育和維持。

研究顯示，乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌等人類腫瘤組織中檢測到高PD-L1蛋白的表達，且PD-L1的表達水平和患者的臨床及預後緊密相關。PD-L1的阻斷型抗體已在幾種已知過度表達PD-L1(包括黑色素瘤，NSCLC)的癌症中顯示出臨床活性。例如，Roche公司針對PD-L1的人源化IgG1單株抗體atezolizumab，在臨床試驗中作為幾種適應症的免疫療法，包括各種類型的實體瘤(參見例如Rittmeyer等，Lancet，2017；389：255-265)，並且被批准用於轉移性非小細胞肺癌和轉移性膀胱癌。另一種PD-L1抗體默沙東(Merck Serono SA)公司的avelumab，已被FDA批准用於治療Merkel細胞癌、膀胱癌、轉移性腎細胞癌，目前正處於非小細胞肺癌、卵巢癌和腎癌等的臨床試驗階段(例如參見Cortellis數據庫)。以及，MedImmune公司的PD-L1抗體Durvalumab，被批准用於轉移性非小細胞肺癌、轉移性膀胱癌，並且正在多種實體瘤和血液癌中進行臨床開發(例如參見Cortellis數據庫)。PD-L1抗體的相關專利包括：WO0139722、WO2013173223、WO2014195852、WO2013181634、WO2015048520、WO2015036511、US2014335093、WO2014100079、WO2014055897、US6803192B1、WO2014022758、US8617546B2和WO2010089411A2。

現有技術中有4-1BB抗體和PD-L1抗體的聯用的報導，例如4-1BB抗體作為激動劑與中和性PD-L1抗體的組合(Horton等，J Immunother Cancer.2015；3(Suppl 2)：O10)。utomilumab和avelumab的聯合治療也在測試(Chen等，J Clin Oncol 35，2017 suppl；abstr TPS7575，和clinical trial NCT02554812)。雖然兩個抗體聯用有可能增強臨床的抗腫瘤活性，擴大適應症。然而，本領域仍然需要能夠同時結合PD-L1和4-1BB的雙、多特異性抗體，因為雙特異性抗體具有兩個單抗聯用所不具備的活性特點。比如，雙特異性抗體可以使腫瘤部位特異性激活4-1BB，降低傳統激活型單抗在臨床所引起的肝毒性。雙特異性抗體(BsAb)是一類具有雙親嗜性的組合抗體，通常是雙價的(也有四價和六價的)，即有兩條抗原結合臂，具有結合兩種不同特異性抗原的功能。該抗體將同時結合表達PD-L1的抗原呈遞細胞(APC)或腫瘤細胞和表達4-1BB的T細胞，導致細胞毒性T細胞的條件活化。PD-L1與活化T細胞上表達的PD-1結合將導致T細胞抑制。涉及4-1BB抗體和PD-L1抗體的聯用或雙、多特異性抗體的專利包括：WO2019025545、WO2019104716、WO2018114754、WO2019072870、WO2019072869、WO2019072868、WO2019089753、WO2019005639。INHIBRx LLC公司的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體INBRX-105目前處於非小細胞肺癌、黑色素瘤、頭頸癌、腎細胞癌、胃癌、食管癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、晚期實體瘤等的腫瘤或癌症的I期臨床階段。Genmab公司的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體GEN-1046目前處於子宮頸腫瘤、子宮內膜樣癌、轉移性非小細胞肺癌、晚期實體瘤等的II期臨床階段。Merus公司的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體MCLA-145也處於晚期實體瘤、實體瘤的I期臨床階段。

本領域中對於腫瘤或自身免疫性疾病等疾病仍有未滿足的需求，提供新結構的、更有效的、副作用更小的治療方法和藥物仍然是迫切而必要的。本公開的4-1BB/PD-L1雙特異性抗體保留了正常的Fc段，因此該抗體具有較長的半衰期。另外，本公開的4-1BB/PD-L1雙特異性抗體對人PD-L1蛋白的親和力比對人4-1BB蛋白高約50倍，這極大的保證了該雙抗在腫瘤部位的有效富集，同時，極大的降低了4-1BB端可能引起的毒副作用，提升了藥物的安全性，具有重大臨床價值。

此外，本文以全文引入的方式併入4-1BB抗體和PD-L1抗體的相關申請，包括PCT/CN2019/072484、CN201680027181.4、CN201710341680.7、CN201811248478.0、CN201811396143.3、CN201811526262.6。

本公開提供了一種抗4-1BB抗體及其抗原結合片段，以及一種能夠結合4-1BB和PD-L1的雙特異性抗體。本公開還提供了編碼該抗體的核酸分子、包含該核酸分子的載體、製備該抗體的方法、包含該抗體的醫藥組成物醫藥組成物、該抗體在製備藥物中的用途、該抗體在治療/診斷與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病(例如腫瘤或自身免疫性疾病或傳染病)中的用途或方法、以及包含該抗體的試劑盒。

抗4-1BB抗體及其抗原結合片段

本公開提供了一種抗4-1BB抗體及其抗原結合片段，其包含：

重鏈可變區，其包含至少1個選自如以下序列所示的重鏈互補決定區(HCDR)：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，和SEQ ID NO：3；和/或

輕鏈可變區，其包含至少1個選自如以下序列所示的輕鏈互補決定區(LCDR)：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7。

一些實施方案中，該抗4-1BB抗體及其抗原結合片段包含：

重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和/或

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；或該輕鏈可變區包含分別SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：6所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。

一些實施方案中，該抗4-1BB抗體及其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。在一些實施方案中，該抗4-1BB抗體或片段進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈框架區(FR區)或輕鏈恆定區。在一些實施方案中，該抗4-1BB抗體或片段進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈框架區(FR區)或重鏈恆定區。

在一些具體的實施方案中，該抗4-1BB抗體及其抗原結合片段為嵌合抗體或其片段。在一些實施方案中，該抗4-1BB抗體或片段進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。在一些實施方案中，該抗4-1BB抗體或片段進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。

在一些具體的實施方案中，該抗4-1BB抗體及其抗原結合片段為人源化抗體、人抗體或其片段。在一些實施方案中，重鏈FR區來源於人種系重鏈IGHV3-30序列或人種系重鏈IGHV1-46序列。在一些實施方案中，輕鏈FR區來源於人種系輕鏈IGkV3-11或人種系輕鏈IGkV4-1序列。IGHV3-30、IGKV3-11、IGHV1-46、IGKV4-1的胺基酸序列信息可如SEQ ID NO：27-30所示。

在一些實施方案中，根據本公開的抗4-1BB抗體及其抗原結合片段包含：

重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：6所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，根據本公開的抗4-1BB抗體及其抗原結合片段的重鏈可變區包含或由SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列組成；和/或，輕鏈可變區包含或由SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列組成。

在一些實施方案中，根據本公開的抗4-1BB抗體及其抗原結合片段的重鏈包含或由SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列組成；和/或，輕鏈包含或由SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列組成。

在一些實施方案中，根據本公開的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區有0至10個(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸變化；輕鏈可變區有0至10個(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸變化。在一些具體實施方案中，該胺基酸變化為保守的替換、取代或修飾，和/或不影響功能的缺失、添加。

在一些具體實施方案中，根據本公開的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段重鏈可變區(VH)的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示的重鏈可變區的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性；和/或，該抗體的輕鏈可變區(VL)的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性。

在一些具體實施方案中，根據本公開的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性；和/或，該抗體的輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性。

雙特異性抗體

本公開提供了一種雙特異性抗體，其結合PD-L1抗原和4-1BB抗原。

在一些具體實施方案中，該雙特異性抗體包含：

1)特異性結合第一抗原的第一抗體或其抗原結合片段；和

2)特異性結合第二抗原的第二抗體或其抗原結合片段；

該第一抗原為4-1BB，並且該第二抗原為PD-L1；或，該第一抗原為PD-L1，並且該第二抗原為4-1BB；

當該第一抗原或第二抗原是4-1BB時，該第一抗體、第二抗體或第一抗體、第二抗體的抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或，分別如SEQ ID NO：4、7和6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

一些實施方案中，上述雙特異性抗體的第一抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈；和/或第二抗體或其抗原結合片段包含scFv；

其中，該scFv連接於第一抗體或其抗原結合片段的重鏈或輕鏈的N端或C端；

較佳地，該第一抗體或其抗原結合片段包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中該第一抗體或其抗原結合片段的一條重鏈的重鏈可變區與一條輕鏈的輕鏈可變區形成抗原結合部位，另一條重鏈的重鏈可變區與另一條輕鏈的輕鏈可變區形成抗原結合部位。

一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體包含：

1)特異性結合第一抗原的第一抗體或其抗原結合片段，該第一抗體或其抗原結合片段包括重鏈(HC)和輕鏈(LC)；和

2)特異性結合第二抗原的包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的抗體片段；

其中，該抗體片段連接於第一抗體的重鏈或輕鏈的N端或C端；

該第一抗原為4-1BB，並且該第二抗原為PD-L1；或，該第一抗原為PD-L1，並且該第二抗原為4-1BB。

在一些實施方案中，該抗體片段為Fv、scFv或di-scFv。在一些具體實施方案中，該抗體片段為scFv。

在一些實施方案中，該雙特異性抗體分子包含1個該第一抗體或其抗原結合片段和2個該scFv；並且，該第一抗體或其抗原結合片段包括兩條HC和兩條LC，其中該第一抗體或其抗原結合片段的一條HC的重鏈可變區(VH)與一條LC的輕鏈可變區(VL)形成抗原結合部位，另一條HC的重鏈可變區(VH)與另一條LC的輕鏈可變區(VL)形成抗原結合部位。

在一些實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段為IgG型抗體，更佳地，為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4型抗體，更佳地，為IgG1型抗體。

在一些實施方案中，一個該scFv連接於該第一抗體或其抗原結合片段的一條重鏈或輕鏈的N端，另一個該scFv連接於該第一抗體或其抗原結合片段的另一條重鏈或輕鏈的C端。

在一些實施方案中，兩個該scFv分別連接於該第一抗體或其抗原結合片段的兩條重鏈或兩條輕鏈的N端或C端。在一些具體實施方案中，兩個該scFv分別連接於該第一抗體或其抗原結合片段的兩條重鏈的N端。在一些具體實施方案中，每個該scFv分別連接於該第一抗體或其抗原結合片段的兩條重鏈的C端。

在一些具體實施方案中，第一抗原為PD-L1，第二抗原為4-1BB，且該結合第二抗原的scFv連接於該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈的N端或C端。在一些具體實施方案中，第一抗原為4-1BB，第二抗原為PD-L1，且該結合第二抗原的scFv連接於該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈的N端或C端。

在一些實施方案中，兩個該scFv分別連接於該第一抗體或其抗原結合片段的兩條輕鏈的N端。在一些具體實施方案中，兩個該scFv分別連接於該第一抗體或其抗原結合片段的兩條輕鏈的C端。在一些具體實施方案中，一個該scFv連接於該第一抗體或其抗原結合片段的一條重鏈或輕鏈的N端，另一個該scFv連接於該第一抗體或其抗原結合片段的另一條重鏈或輕鏈的C端。

在一些實施方案中，當該第一抗原或第二抗原是4-1BB時，該第一抗體或scFv包含分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或，分別如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些具體的實施方案中，根據本公開的雙特異性抗體包含：

1)特異性結合第一抗原的第一抗體或其抗原結合片段，該第一抗體包括重鏈(HC)和輕鏈(LC)；和

2)特異性結合第二抗原的scFv；該雙特異性抗體包含1個該第一抗體或其抗原結合片段和2個該scFv；並且，該第一抗體或其抗原結合片段包括兩條HC和兩條LC，其中該第一抗體或其抗原結合片段的一條HC的VH與一條LC的VL形成抗原結合部位，另一條HC的VH與另一條LC的VL形成抗原結合部位；兩個該scFv分別連接於該第一抗體或其抗原結合片段的兩條重鏈的N端；或者，兩個該scFv分別連接於該第一抗體或其抗原結合片段的兩條重鏈的C端；該第一抗原為4-1BB，並且該第二抗原為PD-L1；或者該第一抗原為PD-L1，並且該第二抗原為4-1BB。

在一些具體實施方案中，該scFv的VH與VL藉由連接子1連接。在一些具體實施方案中，該兩個scFv藉由連接子2分別與該第一抗體或其抗原結合片段的兩條重鏈的N端或C端連接。在一些具體實施方案中，該scFv的結構為NH₂-VL-連接子1-VH-COOH或NH₂-VH-連接子1-VL-COOH。

在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈包含重鏈可變區(VH)和CH1結構域，並且該輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)。該第一抗體的抗原結合片段可以為Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)，並且該輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)。該第一抗體可以為全長抗體。

在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈為IgG同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈為人IgG1或IgG2同種型。在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈為Kappa同種型。

在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的兩條HC包含相同的CDR；和/或，該第一抗體或其抗原結合片段的兩條LC包含相同的CDR。

在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的兩條HC包含相同的VH；和/或，該第一抗體或其抗原結合片段的兩條LC包含相同的VL。

在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的兩條HC具有相同的胺基酸序列；和/或，該第一抗體或其抗原結合片段的兩條LC具有相同的胺基酸序列。

在一些具體實施方案中，兩個該scFv具有相同或不相同的胺基酸序列。在一些具體實施方案中，兩個該scFv具有相同的胺基酸序列。

在一些實施方案中，雙特異性抗體包含兩條第一多肽鏈和兩條第二多肽鏈，其中：

a)該兩條第一多肽鏈各自獨立地包含該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈(HC)和該scFv；和

b)該兩條第二多肽鏈各自獨立地包含該第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈(LC)；

其中，該scFv藉由連接子2與該第一抗體或其抗原結合片段的HC的N端或C端相連。

在一些具體實施方案中，該雙特異性抗體包含兩條第一多肽鏈和兩條第二多肽鏈，其中：

i)該兩條第一多肽鏈各自獨立地包含該第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈(LC)和該scFv；和

ii)該兩條第二多肽鏈各自獨立地包含該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈(HC)；

其中，該scFv藉由連接子2與該第一抗體或其抗原結合片段的LC的N端或C端相連。

在一些具體實施方案中，該scFv具有結構：NH₂-VH-連接子1-VL-COOH或NH₂-VL-連接子1-VH-COOH。

在一些具體實施方案中，該連接子1和/或連接子2為肽接頭，例如具有如(G_mS_n)_x所示的胺基酸序列，其中m、n各自獨立地選自1-8的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x獨立地選自1-20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。在一些具體實施方案中，該連接子1和/或連接子2具有如(G₄S)_x所示的胺基酸序列，x獨立地選自1-6的整數。

在一些具體實施方案中，該連接子1的胺基酸序列為(G₄S)₃(即“GGGGSGGGGSGGGGS”)，和/或連接子2的胺基酸序列為(G₄S)₄(即“GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS”)。

在一些具體實施方案中，該scFv的VH與VL之間存在二硫鍵。在抗體的VH和VL之間引入二硫鍵的方法是本領域熟知的(例如參見US5747654；Rajagopal等，Prot.Engin.10(1997)1453-1459；Reiter等，Nature Biotechnology.14(1996)1239-1245；Reiter等，Protein Engineering.8(1995)1323-1331；Webber等，Molecular Immunology.32(1995)249-258；Reiter等，Immunity.2(1995)281-287；Reiter等，JBC.269(1994)18327-18331；Reiter等，Inter.J.of Cancer.58(1994)142-149；Reiter等，Cancer Res.54(1994)2714-2718，其藉由全文引用併入本文)。

在一些具體的實施方案中，當該第一抗體或scFv結合的是4-1BB時，其包含分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或，分別如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段特異性結合4-1BB，並且該scFv特異性結合PD-L1，其中：

該第一抗體或其抗原結合片段包含：

如SEQ ID NO：1、2、3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1，如SEQ ID NO：5或7所示的LCDR2；以及，如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

在一些實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段特異性結合PD-L1，並且該scFv特異性結合4-1BB，其中，該第一抗體或其抗原結合片段包含：

如SEQ ID NO：19、20、21所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；如SEQ ID NO：22、23、24所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。

在一些實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段特異性結合4-1BB，並且該scFv特異性結合PD-L1，其中，該scFv包含：

在一些實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段特異性結合PD-L1，並且該scFv特異性結合4-1BB，其中，該scFv包含：

如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1，如SEQ ID NO：5或7所示的LCDR2；以及，如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段特異性結合4-1BB，並且該scFv特異性結合PD-L1，其中，該第一抗體或其抗原結合片段包含：

如SEQ ID NO：1、2、3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；如SEQ ID NO：4、7、6所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；和，該scFv包含：

在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區(VH)的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示的重鏈可變區的胺基酸序列具有至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性；並且，該第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區(VL)的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區的胺基酸序列具有至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性；和，該scFv的重鏈可變區(VH)的胺基酸序列與SEQ ID NO：25所示的重鏈可變區的胺基酸序列具有至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性；並且，該scFv的的輕鏈可變區(VL)的胺基酸序列與SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變區的胺基酸序列具有至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性。

在一些實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區選自SEQ ID NO：8所示胺基酸序列，和/或，輕鏈可變區選自SEQ ID NO：9所示胺基酸序列。在一些實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區選自SEQ ID NO：25所示胺基酸序列，和/或，輕鏈可變區選自SEQ ID NO：26所示胺基酸序列。

在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區選自SEQ ID NO：8所示胺基酸序列，輕鏈可變區選自SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區；和，該scFv的重鏈可變區選自SEQ ID NO：25所示胺基酸序列，輕鏈可變區選自SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變區。

在一些具體實施方案中，該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區選自SEQ ID NO：25所示胺基酸序列，輕鏈可變區選自SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變區；和，該scFv的重鏈可變區選自SEQ ID NO：8所示胺基酸序列，輕鏈可變區選自SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區。

在一些具體實施方案中，該雙特異性抗體包含兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。

在一些具體實施方案中，當第一抗體或scFv結合PD-L1時，該第一抗體或scFv可以是現有技術中已有的PD-L1抗體或其scFv片段，其生物仿製藥，及其抗原結合片段。例如，阿特珠單抗(商品名TECENTRIQTM)是針對PD-L1的IgG1同種型的完全人源化的Fc-修飾的單株抗體；MDX-1105，其為結合於PD-L1的完全人單株抗體；阿維魯單抗(MSB0010718C，Merck KGaA，Darmstadt，Germany&Pfizer)，其為同種型IgG1的完全人單株PD-L1抗體；度伐單抗(MedImmune/AstraZeneca)，其為Fc優化的抗PD-L1mAb。

在一些具體實施方案中，該第一多肽鏈具有選自下列的胺基酸序列：SEQ ID NOs：12-13和15-17中任一項所示的胺基酸序列；和/或，該第二多肽鏈具有選自下列的胺基酸序列：SEQ ID NOs：14和18中任一項所示的胺基酸序列。

在一些具體實施方案中，該雙特異性抗體包含：

(1)如SEQ ID NO：12所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：14所示的第二多肽鏈；或

(2)如SEQ ID NO：13所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：14所示的第二多肽鏈；或

(3)如SEQ ID NO：15所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：18所示的第二多肽鏈；或

(4)如SEQ ID NO：16所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：18所示的第二多肽鏈；或

(5)如SEQ ID NO：17所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：18所示的第二多肽鏈。

在一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體具有抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性，和/或，具有補體依賴的細胞毒性(CDC)活性。在一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體具有降低的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性，和/或具有降低的補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在一些具體實施方案中，該降低的ADCC和/或CDC活性是由雙特異性抗體的第一抗體CH發生突變導致。IgG1的Fc突變比如D265A、N297A、L234A/L235A、L234F/L235A、P329G等可以降低ADCC，P331S或附近的突變可降低CDC。IgG2的突變以及IgG2/4的Fc雜交抗體也可以降低ADCC和CDC。IgG4的核心鉸鏈區包含S228P突變，可增強核心鉸鏈區內的二硫鍵連接，從而阻止IgG4 Fab臂交換，大大減少了半分子抗體的形成，進一步引入F234A和L235A突變，此種形式的IgG4突變抗體改變CH2結構域，降低與Fc受體的相互作用而達到降低ADCC活性的效果。

一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體對4-1BB和PD-L1具有親和力。在一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體對4-1BB和PD-L1具有與其各自的親本抗體相比同等親和力。在一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體對PD-L1具有與其親本抗體相比同等的親和力。在一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體對4-1BB具有與其親本抗體相比同等的親和力。在一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體對4-1BB具有與其親本抗體相比更弱的親和力。在一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體對PD-L1具有與其親本抗體相比同等的親和力，對4-1BB具有與其親本抗體相比更弱的親和力。

另一方面，本公開的雙特異性抗體具有良好的熱穩定性。在一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體具有與親本抗體相比基本相同的熱穩定性。

抗4-1BB抗體及其抗原結合片段、雙特異性抗體的表達

本公開提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼本公開的抗4-1BB抗體及其抗原結合片段的核苷酸序列。

本公開提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼本公開的特異性結合4-1BB和PD-L1的雙特異性抗體的核苷酸序列。

在一些具體實施方案中，該分離的核酸分子包含編碼本公開的第一多肽鏈的核苷酸序列，和/或包含編碼本公開的第二多肽鏈的核苷酸序列。在一些具體實施方案中，該分離的核酸分子包含編碼本公開的第一多肽鏈的核苷酸序列和編碼本公開的第二多肽鏈的核苷酸序列。

在另一個方面，本公開提供了一種載體(例如純株載體或表達載體)，其包含本公開的分離的核酸分子。在一些具體實施方案中，該載體包含編碼本公開的第一多肽鏈和/或第二多肽鏈的核苷酸序列。

在一些具體實施方案中，本公開的載體是例如質粒、黏粒、噬菌體等。在一些具體實施方案中，該載體能夠在受試者(例如哺乳動物，例如人)體內表達本公開的抗4-1BB抗體及其抗原結合片段、雙特異性抗體、第一多肽鏈或第二多肽鏈。

在另一個方面，本公開提供了一種宿主細胞，其包含本公開的分離的核酸分子或本公開的載體。此類宿主細胞包括但不限於，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞和動物細胞(如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等)。在一些具體實施方案中，本公開的宿主細胞是哺乳動物細胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHO DG44)或HEK、HEK293、HEK-293F、Expi293F、PER.C6、NSO細胞或淋巴細胞。

在另一個方面，本公開提供了製備本公開的抗4-1BB抗體及其抗原結合片段或本公開的雙特異性抗體的方法，其包括，在允許該抗4-1BB抗體及其抗原結合片段、或本公開的雙特異性抗體表達的條件下，培養本公開的宿主細胞，和從培養的宿主細胞培養物中回收該抗4-1BB抗體及其抗原結合片段、或本公開的雙特異性抗體。

在一些具體實施方案中，抗4-1BB抗體或其抗原結合片段的方法包括：構建包含編碼抗4-1BB抗體及其抗原結合片段的核苷酸序列的表達載體，轉化至宿主細胞並進行培養，從培養物中回收抗體或其抗原結合片段。

在一些具體實施方案中，製備本公開的雙特異性抗體方法包括：

(1)構建包含編碼第一多肽鏈的核苷酸序列和編碼第二多肽鏈的核苷酸序列的表達載體；

(2)將步驟(1)中所述的表達載體轉化至宿主細胞；

(3)在允許本公開的雙特異性抗體表達的條件下，培養步驟(2)中所述的宿主細胞；和

(4)從培養的宿主細胞培養物中回收該雙特異性抗體。

可選地，製備本公開的雙特異性抗體方法包括：

(1)構建包含編碼第一多肽鏈的核苷酸序列的第一表達載體和包含編碼第二多肽鏈的核苷酸序列的第二表達載體；

(2)將步驟(1)中所述的第一表達載體和第二表達載體轉化至宿主細胞；

(4)從培養的宿主細胞培養物中回收該雙特異性抗體。

治療方法和醫藥組成物

本公開提供一種醫藥組成物，其含有如上所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段和可藥用的賦形劑、稀釋或載體。

本公開提供一種治療或預防疾病的方法，包括給予受試者治療或預防有效量的前述抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，或醫藥組成物，或抗體藥物偶聯物。在一些實施方案中，該疾病為癌症。在一些具體方案中，該癌症選自：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸癌、甲狀腺癌、食管癌、宮頸癌、肉瘤、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、膽囊癌和膠質母細胞瘤。

另一方面，本公開提供了前述抗4-1BB抗體或其抗原結合片段在製備藥物中的用途；在一些具體的實施方案中，該藥物用於治療癌症。在另一些具體的實施方案中，該藥物用於治療黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸癌、甲狀腺癌、食管癌、宮頸癌、肉瘤、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、膽囊癌和膠質母細胞瘤。

本公開的雙特異性抗體可用於體外或在受試者體內中抑制4-1BB和PD-L1的活性，阻斷4-1BB和/或PD-L1信號通路，以及用於預防和/或治療與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病(例如自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病)。

因此，在另一個方面，本公開提供了一種醫藥組成物，其含有本公開的雙特異性抗體，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。在某些具體實施方案中，該醫藥組成物還可以包含另外的藥學活性劑。在某些具體實施方案中，該另外的藥學活性劑是用於預防和/或治療與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病(例如自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病)的藥物。

在另一個方面，本公開提供了本公開的雙特異性抗體或本公開的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於在受試者(例如人)中治療與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病(如自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病)，和/或用於體外或在受試者(例如人)體內抑制4-1BB和/或PD-L1的活性。

在另一個方面，本公開提供了一種用於在受試者(例如人)中預防和/或治療與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病(如自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病)，和/或用於體外或在受試者(例如人)體內抑制4-1BB和/或PD-L1的活性的方法，其中該方法包括，給有此需要的受試者施用有效量的本公開的雙特異性抗體，或者本公開的醫藥組成物。

在本公開中，該與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病包括但不限於如自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病病，例如腫瘤，包括但不限於：腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，或包括但不限於腎上腺、膽囊、骨、骨髓、腦、乳腺、膽管、胃腸道、心臟、腎臟、肝臟、肺、肌肉、卵巢、胰腺、副甲狀腺、陰莖、***、皮膚、唾液腺、脾臟、睾丸、胸腺、甲狀腺和子宮相關的腫瘤。

本公開的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體或者本公開的醫藥組成物可以配製成醫學領域已知的任何劑型，較佳注射劑(包括注射液、注射用無菌粉末與注射用濃溶液)、吸入劑、噴霧劑等。較佳劑型取決於預期的給藥方式和治療用途。本公開的醫藥組成物應當是無菌的並在生產和儲存條件下穩定。一種具體劑型是注射劑。注射劑中可以含有緩衝劑，其濃度可以是1-100mM。此外，可以將無菌注射溶液製備為無菌凍乾粉劑(例如，藉由真空乾燥或冷凍乾燥)以便於儲存和使用。此類無菌凍乾粉劑可在使用前分散於合適的載體中，例如無菌無熱原水。

此外，本公開的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體可以以單位劑量形式存在於醫藥組成物中，以便於施用。在某些實施方案中，該單位劑量可以為0.1-2000mg、1-500mg，較佳1-200mg，在該醫藥組成物液體的情況下，其可以包含濃度為1-500mg，較佳1-200mg的活性成分。在一些具體實施方式中，該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的本公開的4-1BB抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體。

本公開的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體或醫藥組成物可以藉由本領域已知的任何合適的方法來施用，較佳地給藥途徑/方式是胃腸外給藥(例如靜脈注射，皮下注射，腹膜內注射，肌內注射)。技術人員應理解，給藥途徑和/或方式將根據預期目的而發生變化。在一個具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體或醫藥組成物藉由靜脈輸注或注射給予。

在本公開中，可調整給藥方案以獲得最佳目的反應(例如治療或預防反應)。例如，可以單次給藥，可以在一段時間內多次給藥，或者可以隨治療情況的緊急程度按比例減少或增加劑量。

在本公開中，受試者可以為哺乳動物，例如人。

檢測/診斷方法和試劑盒

本公開的雙特異性抗體能夠特異性結合4-1BB和/或PD-L1，從而可用於檢測4-1BB和/或PD-L1在樣品中的存在或其水平，以及診斷受試者是否患有與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病(如自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病)。

在另一個方面，本公開提供了一種試劑盒，其包括本公開的4-1BB抗體或其抗原結合片段，或雙特異性抗體。在一些實施方案中，4-1BB抗體或其抗原結合片段，或雙特異性抗體帶有可檢測的標記。在一些具體實施方案中，含有前述雙特異性抗體的試劑盒還包括第二抗體，其特異性識別本公開的雙特異性抗體的第一抗體或scFv。一些具體實施方案中，該第二抗體還包括可檢測的標記。該可檢測的標記可以是可藉由螢光、光譜、光化學、生物化學、免疫學、電學、光學或化學手段檢測的任何物質。此類標記能夠適用於免疫學檢測(例如，酶聯免疫測定法、放射免疫測定法、螢光免疫測定法、化學發光免疫測定法等)。這類標記是本領域熟知的，包括但不限於酶(例如，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、螢光染料(例如，異硫氰酸螢光素(FITC)、螢光素、異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)、藻紅蛋白(PE)、德克薩斯紅、羅丹明、量子點或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、吖啶酯類化合物、磁珠、測熱標記物例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠、以及用於結合上述標記物修飾的親和素(例如，鏈黴親和素)的生物素。本公開中涵蓋的標記物可藉由本領域已知的方法檢測。例如，放射性標記可使用攝影膠片或閃爍計算器檢測，螢光標記物可使用光檢測器檢測，以檢測發射的光。酶標記物一般藉由給酶提供受質及檢測藉由酶對受質的作用產生的反應產物來檢測，及測熱標記物藉由簡單可視化著色標記物來檢測。在一些實施方案中，可藉由不同長度的接頭將如上該的可檢測的標記連接至本公開的雙特異性抗體，以降低潛在的位阻。

在另一個方面，本公開提供了檢測4-1BB和/或PD-L1在樣品中的存在或其水平的方法，其包括使用本公開的4-1BB抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體的步驟。在一個較佳地實施方案中，本公開的4-1BB抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體還帶有可檢測的標記。在另一個較佳地實施方案中，該方法還包括，使用帶有可檢測的標記的試劑來檢測本公開的4-1BB抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體段。該方法可以用於診斷目的，或者非診斷目的(例如，該樣品是細胞樣品，而非來自患者的樣品)。

在另一個方面，本公開提供了診斷受試者是否患有與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病(如自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病)的方法，其包括：使用本公開的雙特異性抗體檢測4-1BB和/或PD-L1在來自該受試者的樣品中的存在或其水平。在一個較佳地實施方案中，本公開的雙特異性抗體還帶有可檢測的標記。在另一個較佳地實施方案中，該方法還包括，使用帶有可檢測的標記的試劑來檢測本公開的4-1BB抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體的步驟。

在另一個方面，提供了本公開的4-1BB抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體在製備試劑盒中的用途，該試劑盒用於檢測4-1BB和/或PD-L1在樣品中的存在或其水平，或用於診斷受試者是否患有與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病(如自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病)。

術語定義

為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

本公開該的“抗體”指免疫球蛋白，通常是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ(kappa)鏈或λ(lambda)鏈。

在本公開中，本公開所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本公開中，本公開所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本公開中，“PD-L1”也被稱為“程序性死亡配體1(Programmed death-ligand 1)”、“程序性細胞死亡配體1(Programmed cell death ligand 1)”、“蛋白質PD-L1”、“PD-L1”、“PDL1”、“PDCDL1”、“hPD-L1”、“hPD-LI”、“CD274”及“B7-H1”，並且可互換的使用。人類，獼猴(食蟹猴)，非洲象，野豬和小鼠PD-L1序列可以藉由Genbank登錄號找到，分別為NP_054862.1、XP_005581836、XP_003413533、XP_005665023和NP_068693。

術語“抗體”不受任何特定的產生抗體的方法限制。例如，其包括，重組抗體、單株抗體和多株抗體。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。

本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳人源化抗體。

術語“鼠源抗體”在本公開中為如本領域知識和技能製備的對人PD-L1的單株抗體。製備時用PD-L1抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本公開一個較佳地實施方案中，該鼠源PD-L1抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再如需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後***人載體中，最後在真核工業***或原核工業***中表達嵌合抗體分子。在一個實施方案中，前述4-1BB/PD-L1的雙特異性抗體包含人源IgG1，或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG4。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的强烈的抗體可變抗體反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。

本公開中所述的“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體peptibody、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、diabody、triabody和tetrabody、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。一些實施方案中，“抗原結合片段”包含本公開所述抗體的選自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6中的一個或多個CDR區；或包含選自SEQ ID NO：1、2、3、4、7、6的一個或多個CDR區；或包含選自SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24的一個或多個CDR區。

“Fv片段”是指含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(scFv)。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

術語“與PD-L1結合”，指能與人PD-L1相互作用。術語“與4-1BB結合”，指能與人4-1BB相互作用。本公開的術語“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本公開抗體或其抗原結合片段識別的三維空間位點。

術語“親本抗體”是指，用於製備本公開的雙特異性抗體的抗PD-L1抗體或4-1BB抗體，該抗體所具有的胺基酸序列可藉由例如胺基酸置換或結構改變等方式以用於製備本公開的雙特異性抗體所包含的第一抗體或scFv。

本公開的雙特異性抗體所包含的CDR、VH、VL、CH、CL、HC、LC還可以來自其他被本領域所知曉的能夠特異性結合PD-L1或4-1BB的抗體或其抗體片段替代，或者與上述已知抗體、其抗體片段或其CDR、VH、VL、CH、CL、HC、LC具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的抗體。

“連接子”是指，由多個胺基酸殘基藉由肽鍵連接形成的線性多肽。本公開的連接子可以為人工合成的胺基酸序列，或天然存在的多肽序列，例如具有鉸鏈區功能的多肽。此類連接子多肽是本領域眾所周知的(參見例如，Holliger P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90：6444-6448；Poljak R.J.等(1994)Structure 2：1121-1123)。

“特異性結合”是指，兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。在某些實施方式中，特異性結合某抗原的抗體(或對某抗原具有特異性的抗體)是指，抗體以小於大約10^-5M，例如小於大約10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的親和力(K_D) 結合該抗原。在本公開中，術語“K_D”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。通常，抗體(例如，本公開的抗體)以小於大約10^-5M，例如小於大約10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解離平衡常數(K_D)結合抗原(例如，HBsAg)，例如，如使用表面等離子體共振術(SPR)在BIACORE儀中測定的。術語“k_d”(sec^-1)是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率常數，也稱為k off值。

“ADCC”即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變，如選自IgG1的N297A、L234A、L235A、P329G；IgG2/4chimera，IgG4的F234A/L235A突變。

“CDC”即Complement-dependent cytotoxicity，補體依賴的細胞毒性，是指藉由使補體成分C1q與抗體Fc結合來激活補體級聯的細胞毒性形式。檢測抗體的ADCC、CDC活性的方法是本領域已知的，例如可藉由測定待測抗體與Fc受體(例如C1q)之間的結合活性來評價CDC。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，老鼠可以用人PD-L1、4-1BB或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。公開所述的抗體或其抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

本公開中，工程化的抗體或其抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，可以將編碼重鏈和/或輕鏈的cDNA序列，選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。穩定表達抗體的陽性純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可如多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”或“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“藥學上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的，包括但不限於：pH調節劑、表面活性劑、佐劑、離子強度增強劑、稀釋劑、維持滲透壓的試劑、延遲吸收的試劑、防腐劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液。表面活性劑包括但不限於陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80。離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。防腐劑包括但不限於各種抗細菌試劑和抗真菌試劑，例如對羥苯甲酸酯、三氯第三丁醇、苯酚、山梨酸等。維持滲透壓的試劑包括但不限於糖、NaCl及其類似物。延遲吸收的試劑包括但不限於單硬脂酸鹽和明膠。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

本公開中，“受試者”是指哺乳動物，例如靈長類哺乳動物，例如人。在一些實施方式中，該受試者(例如人)患有與4-1BB和/或PD-L1相關的疾病，或者，具有患有上述疾病的風險。通常而言，這類疾病或疾病狀態的特徵是其將受益於4-1BB和/或PD-L1水平的降低或4-1BB和/或PD-L1活性的抑制從而得到緩解或治癒。

與現有技術相比，本公開的技術方案至少具有以下有益效果：

本公開中4-1BB抗體B1E7藉由引入N53Q突變，從而得到抗體HR137-07，使抗體親和力降低約2.8倍，降低抗原抗體的親和力，同時H137-07的激活活性增強。

此外，本公開的雙特異性抗體不僅能夠特異性識別/結合4-1BB和PD-L1，對4-1BB的親和力比其親本抗體減弱，在體外和受試者體內能夠顯著且同時激活4-1BB和抑制PD-L1的活性，激活4-1BB和阻斷PD-L1信號通路。而且該雙抗對人PD-L1蛋白的親和力比對人4-1BB蛋白高約50倍，這極大地保證了該雙抗在腫瘤部位的有效富集，另外也極大地降低了4-1BB端可能引起的毒副作用。由於9EN-FM具有PD-L1依賴的4-1BB靶點交聯，在細胞水平及體內實驗中，本公開的雙特異性抗體甚至展現出了明顯優於其親本抗體聯合用藥的活性和降低的抗體毒性反應，提升了藥物的安全性。因此，本公開的雙特異性抗體具有用於治療與4-1BB和PD-L1相關的疾病(如自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病)的潛力，具有重大的臨床價值。

圖1為抗體HR137-07的4-1BB/NF-κB信號通路激活實驗結果圖。

圖2A至圖2D為抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體結構示意圖。圖2A為8E的抗體結構示意圖；圖2B為8EN的抗體結構示意圖；圖2C為9E-FM的抗體結構示意圖；圖2D為9EN-FM和9EN-FM-1的抗體結構示意圖。

圖3為雙特異性抗體9EN-FM的SDS-PAGE電泳圖。

圖4A為雙特異性抗體9EN-FM與PD-L1蛋白的結合ELISA檢測結果圖；圖4B為雙特異性抗體9EN-FM與4-1BB蛋白的結合ELISA檢測結果圖。

圖5A為雙特異性抗體9EN-FM與4-1BB蛋白的親和力測定的SPR檢測結果圖；圖5B為9EN-FM與PD-L1蛋白的親和力測定的SPR檢測結果圖。

圖6為雙特異性抗體9EN-FM的41BB-NFκB信號通路激活實驗的螢光素酶報告基因系統檢測結果圖。

圖7為螢光素酶報告系統檢測雙特異性抗體9EN-FM對PD-1/PD-L1信號通路封閉效果的實驗結果圖。

圖8為檢測雙特異性抗體9EM-FM對T淋巴細胞激活的實驗結果圖。

圖9為9EN-FM-1在Balbc PD-L1和4-1BB雙人源化小鼠上的抗腫瘤活性結果。

以下結合實施例用於進一步描述本公開，但這些實施例並非限制本公開的範圍。

本公開實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1. 抗4-1BB抗體的製備

採用全基因合成的方法在抗4-1BB抗體B1E7(源自PCT/CN2019/072484)序列的輕鏈的CDR2部分引入N53Q突變，從而得到抗體HR137-07的序列。

抗體HR137-07的製備過程包括：

重鏈載體設計如下：信號肽+突變的重鏈可變區序列+人的IgG1恆定區序列。輕鏈載體設計如下：信號肽+突變的輕鏈可變區序列+人的Kappa 恆定區序列。分別將上述序列***pCEP4載體。請第三方基因合成公司按照上述設計合成表達載體，得到載體質粒後，送測序驗證。將驗證合格的質粒用PEI轉染至人293F細胞中，連續培養，將293F細胞用無血清培養液(上海奧浦邁生物，OPM-293 CD03)培養至對數生長期，用於細胞轉染。將21.4μg人源化抗體輕鏈質粒和23.6μ人源化抗體重鏈質粒溶解在10mL Opti-MEM® I Reduced Serum Medium(GIBCO，31985-070)中混勻，然後加入200ug PEI，混勻，室溫孵育15min，加入50mL細胞中。細胞培養條件為：5% CO2，37℃，125rpm/min。培養期間，第1天和第3天加補料，直到細胞活率低於70%，收取細胞上清，離心過濾。將離心過濾後的細胞培養液上樣到抗體純化親和管柱，經磷酸緩衝液洗管柱，甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)洗脫，1M Tris鹽酸pH9.0中和，以及磷酸緩衝液透析，最終獲得純化的抗體。經SDS-PAGE和SEC-HPLC檢測，確認該抗體為HR137-07。

B1E7的CDR序列如表1所示：

其中，HCDR為重鏈CDR，LCDR為輕鏈CDR。其中，CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合Kabat和chothia的編號規則(HCDR1)，表2中CDR的編號規則與表1相同。

HR137-07的CDR序列如表2所示：

HR137-07的重鏈可變區序列如下所示(下劃線為CDR)：

SEQ ID NO：8

HR137-07的輕鏈可變區序列如下所示(下劃線為CDR)：

SEQ ID NO：9

HR137-07的重鏈序列如下所示：

SEQ ID NO：10

HR137-07的輕鏈序列如下所示：

SEQ ID NO：11

抗體HR137-07與B1E7的區別僅在於，HR137-07在LCDR2中有N53Q突變。

實施例2. 抗體HR137-07的抗原結合親和力檢測

採用Octet檢測抗4-1BB抗體HR137-07與其抗原人4-1BB蛋白之間的親和力。首先，將親和素探針浸入緩衝液PBS中10分鐘，達到平衡。然後，浸入20μg/mL生物素化的抗原人4-1BB蛋白中360秒，使抗原固定至探針上，浸入緩衝液中360秒，洗去多餘的抗原。將待檢測的抗體分別稀釋到100nM、33nM、10nM、3.3nM和1nM，分別加入到黑色96孔板中，體積為200μL/孔，將96孔板放入Octet儀器中。將探針分別置於含有抗體的各孔中，結合120秒。然後再置於緩衝液中，解離360秒。所得的親和力如表3所示，結果顯示，HR137-07與抗原人4-1BB的親和力為11.4nM。與B1E7相比，HR137-07與4-1BB的親和力降低約2.8倍。

實施例3. 抗體HR137-07的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測實驗

在HEK293細胞株(Thermo fisher scientific)中穩定轉染人4-1BB全長基因(Genbank Accession NO：NM_001561.5)，製成人4-1BB蛋白陽性的HEK293細胞株HEK293F-h4-1BB。在該人4-1BB蛋白陽性的HEK293F細胞株中穩定轉染NF-κB螢光素酶報告基因質粒，製成人4-1BB蛋白陽性的，有NF-κB螢光素酶報告基因的穩定細胞株HEK293F-h4-1BB-NFκB。接種50μL 4-1BB-NFκB HEK293細胞(5×10⁵/mL)於96孔板中。藉由抗人IgG的F(ab)₂(Jackson ImmunoResearch)交聯待測抗體。具體的交聯方法是在抗體加入細胞前與抗人IgG的F(ab)2(Jackson Immuno Research)以1：1.5摩爾濃度比例在37℃孵育30分鐘。並加入細胞中溫育5小時。加入螢光素酶檢測試劑ONE-GLUTM luciferase assay reagent(Promega)，用Envision(PerkinElmer，2150)讀取螢光值。結果如圖1所示。結果顯示，相比B1E7，HR137-07展示出更強的激活活性，說明N53Q降低了抗體與4-1BB的親和力，同時提高了抗體對4-1BB的激動活性。類似親和力降低提高抗體激活活性的現象在同TNFR家族中Fas受體激動劑中也有報道(Cell Death and Differentiation(2012)19,1187-1195)。N53Q提高了抗體對4-1BB的激動活性，能增強抗體對T細胞的激活，增強抗腫瘤效果。

實施例4. 抗4-1BB抗體HR137-07在食蟹猴中的血藥濃度

採用食蟹猴3隻(普通級，動物來源：廣西桂東靈長類開發實驗有限公司、廣州相觀生物科技有限公司)，分為兩組。第一組兩隻，一雄一雌，靜脈注射B1E7-IgG1。第二組一隻，雄性，靜脈注射HR137-07。每週給藥一次，劑量設置為5mg/kg，給藥容量為10mL/kg(以0.9%氯化鈉注射液稀釋)。在以下時間點採集血液：第一次給藥給藥後的0h、0.08或2h、4h或6h或8h、24h、48h、96h；第8天的0h，第二次給藥後的2h；第15天的0h，第三次給藥後的2h；第21天的0h，第四次給藥後的0h、0.08h、0.08或2h、4h或6h或8h、24h、48h、96h、168h。對血藥濃度藉由ELISA的方法進行檢測。採用生物素標記的4-1BB包被板子，25℃溫育1小時。300μL PBS清洗三次後，加入待測血清，25℃溫育1小時。300μL PBS清洗三次後，每孔加入100μL羊抗人IgG fab溶液，封板膜封板，25℃溫育1小時。二抗檢測濃度1：30000，稀釋液為1% BSA-PBST+1%猴血清。

結果顯示，在給藥第一週時，B1E7和HR137-07的血藥濃度趨勢基本一致。但是在第四週給藥後，B1E7的血藥濃度隨時間迅速降低，HR137-07的血藥濃度降低緩慢，HR137-07給藥後8h的血藥濃度是B1E7給藥後6h的血藥濃度的43.8-113.8倍，顯示HR137-07的半衰期顯著延長，參見表4。

實施例5. 結合4-1BB/PD-L1的雙特異性抗體的製備

1、結合4-1BB/PD-L1的雙特異性抗體的結構

以下設計並製備了結合4-1BB/PD-L1的雙特異性抗體8E、8EN、9E-FM、9EN-FM和9EN-FM-1，其均為IgG-scFv型雙抗。

雙抗中使用的連接子1(linker-1)和連接子2(linker-2)的序列結構為：

連接子1為3個G4S重複(即，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：38))；

連接子2為4個G4S重複(即，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：39))。

其中，8E和8EN的Fc部分為野生型人IgG1，8E和8EN抗體的第一多肽鏈序列分別如SEQ ID NO：12和13所示，第二多肽鏈序列如SEQ ID NO：14所示。而9E-FM、9EN-FM和9EN-FM-1的Fc部分均進行了突變以消除Fc介導的細胞殺傷作用。其中，9E-FM和9EN-FM的突變為：L234A，L235A和P329G。9EN-FM-1的突變為：L234A，L235A。9E-FM、9EN-FM、9EN-FM-1的抗體的第一多肽鏈序列分別如SEQ ID NO：15、16和17所示，第二多肽鏈序列如SEQ ID NO：18所示。

8E的抗體結構如圖2A所示。其中IgG部分為抗人PD-L1抗體(anti-PD-L1 IgG)，scFv部分由抗人4-1BB抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)組成(anti-4-1BB scFv)，重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之間由連接子1連接，抗4-1BB scFv由連接子2連接在抗PD-L1IgG的C末端。

8EN的抗體結構如圖2B所示。其與8E的區別在於，抗4-1BB scFv是由連接子2連接在抗PD-L1 IgG的N末端。

抗體8E的第一多肽鏈如下所示(下劃線處為連接子)：

SEQ ID NO：12

抗體8EN的第一多肽鏈如下所示：

SEQ ID NO：13

抗體8E和8EN的第二多肽鏈如下所示：

SEQ ID NO：14

9E-FM的抗體結構如圖2C所示。其中IgG部分為抗人4-1BB抗體(anti-4-1BB IgG)，scFv部分由抗人PD-L1抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)組成(anti- PD-L1 scFv)，重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之間由連接子1連接，抗PD-L1 scFv由連接子2連接在抗4-1BB IgG的C末端。

9EN-FM和9EN-FM-1的抗體結構如圖2D所示。其與9E-FM的區別在於，抗PD-L1 scFv是由連接子2連接在抗4-1BB IgG的N末端。

抗體9E-FM的第一多肽鏈如下所示(下劃線處為連接子，灰色處為L234A、L235A和P329G突變)：

SEQ ID NO：15

抗體9EN-FM的第一多肽鏈如下所示(下劃線處為連接子，灰色處為L234A、L235A和P329G突變)：

SEQ ID NO：16

抗體9EN-FM-1的第一多肽鏈如下所示(下劃線處為連接子，灰色處為L234A、和L235A突變)：

SEQ ID NO：17

抗體9E-FM、9EN-FM、9EN-FM-1的第二多肽鏈如下所示：

SEQ ID NO：18

PD-L1抗體(HRP00052)的CDR序列如表5所示：

其中，CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則。

PD-L1抗體(HRP00052)的重鏈可變區序列(下劃線為CDR)：

SEQ ID NO：25

PD-L1抗體(HRP00052)的輕鏈可變區序列(下劃線為CDR)：

SEQ ID NO：26

2、結合4-1BB/PD-L1的雙特異性抗體的製備

用生長狀態良好，處於對數生長期的CHO-S細胞(購自Thermo公司，貨號A29133)，離心並按照6×10⁶細胞/mL接種250mL。將溶液2(用培養液9.2mL稀釋800ul轉染試劑，混勻)加入溶液1(用培養液10mL稀釋250ug質粒，混勻)中，總體積為20mL，輕柔混勻後室溫孵育1-5分鐘，不超過5分鐘，將混合轉染液逐滴加入細胞液中，邊搖邊加。然後將培養瓶置於5% CO₂，32℃的搖床培養，18-22個小時加輔料Feed(購自Thermo公司，貨號A29133)16mL，增強劑Enhancer(購自Thermo公司，貨號A29133)0.6mL。第五天加輔料Feed(購自Thermo公司，貨號A29133)16mL，123rpm，5% CO₂，32℃培養，待第12-14天離心收集上清。藉由親和層析法(Protein A)和離子交換兩步法進行重組抗體的純化。純化中使用的介質分別是GE公司生產的MabSelect SuRe column(GE，17-5438)和HiTrap Q HP column(GE，17515601)。製備獲得了PD-L1/4-1BB雙特異性抗體9EN-FM，經10%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測，如圖3所示。

結果顯示，該雙抗分子理論分子量為200kDa，第一多肽鏈為75kDa，第二多肽鏈為25kDa，由SDS-PAGE凝膠電泳的非還原條帶大小和還原條帶大小來判斷，條帶大小符合預期，說明該重組雙特異性抗體能夠正確裝配和表達，而且無明顯聚集降解。

實施例6. 抗PD-L1/4-1BB雙特異抗體的抗原結合活性的檢測

用ELISA方法檢測PD-L1/4-1BB雙特異性抗體9EN-FM分別與PD-L1蛋白和4-1BB蛋白的結合活性。實驗開始前將96孔板做好相應的標記，以1ug/mL抗原濃度，每孔50ul，4℃冰箱過夜包被。次日，將前天包被好的抗原板取出，洗板機清洗一次(清洗液：1 x PBST)。清洗後以1 x PBST配置的1% BSA封閉液37℃封閉1小時。1x PBST清洗液洗板3次後，加入不同稀釋濃度的待檢雙抗9EN-FM，37℃溫箱孵育1小時。1 x PBST清洗液洗板3次後，加入100ul 1：5000稀釋的羊抗人IgG二抗，37℃溫箱孵育0.5小時洗板後，取TMB顯色液A液和B液1：1比例混合後顯色。15分鐘用1M鹽酸終止顯色反應。在Spectra Max M5多功能讀板機上，檢測450nm的螢光值。結果如圖4A和圖4B所示。

結果顯示，PD-L1/4-1BB雙特異性抗體9EN-FM分別與PD-L1蛋白和4-1BB蛋白的結合活性均保持了與原來的親本單抗相同的結合活性。

實施例7. 抗PD-L1/4-1BB雙特異抗體的抗原結合親和力的檢測

採用表面等離子共振技術(surface plasmon resonance，SPR)，檢測PD-L1/4-1BB雙特異性抗體9EN-FM分別與其抗原人PD-L1蛋白和人4-1BB蛋白之間的親和力(儀器Biacore，。將抗原人PD-L1蛋白和人4-1BB蛋白分別固定至CM5芯片。偶聯水平設定在100RU，運用儀器Biacore進行檢測(T200，GE Healthcare，BIAC-B20-03)。運行緩衝液為HBS-EP+(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%表面活性劑P20)。將稀釋好的抗體(6.25、12.5、25、50、100nM)在30μl/min的流速下流過實驗通道和對比通道(100nM抗原人PD-L1蛋白/抗原人4-1BB)3分鐘，解離5分鐘。然後用再生緩衝液10mM甘胺酸pH1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)在30μl/min的流速下運行30秒。數據用Biacore 8K評估軟體進行分析。結果見圖5A和圖5B。

結果顯示，該雙特異性抗體與人4-1BB蛋白的親和力是3.2nM，而與人PD-L1蛋白的親和力是0.07nM，該雙抗對人PD-L1蛋白的親和力比對人4-1BB蛋白高約50倍，這極大地保證了該雙抗在腫瘤部位的有效富集，另外也極大地降低了4-1BB端可能引起的毒副作用。

實施例8. 抗PD-L1/4-1BB雙特異抗體在NF-κB螢光素酶報告基因實驗中檢測依賴於PD-L1的4-1BB信號激活

在實施例3中所使用的人4-1BB蛋白陽性的HEK293細胞株中，穩定轉染NF-κB螢光素酶報告基因質粒(Promega，pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector)，製成人4-1BB蛋白陽性的，有NF-κB螢光素酶報告基因的穩定細胞株4-1BB/NF-κB HEK293。將不同濃度待測抗體與該4-1BB/NF-κB HEK293細胞共培養6個小時，加入螢光素酶檢測試劑ONE-GLUTM luciferase assay reagent(Promega)，用Envision(PerkinElmer，2150)讀取螢光值。為了檢測PD-L1介導的4-1BB的激活，將穩定高表達PD-L1的Hep3B的細胞株與4-1BB/NF-κB HEK293共同孵育。9EM-FM在PD-L1陽性細胞存在的情況下對4-1BB信號通路有很強的激活活性，如圖6所示。在沒有PD-L1陽性細胞存在的情況下，9EN-FM對於4-1BB的信號無激活作用。對於雙特異性抗體中使用的4-1BB的單抗HR137-07在藉由外源***聯後可激活4-1BB的信號通路，具體的交聯方法是在抗體加入細胞前與抗人IgG的F(ab)₂(Jackson ImmunoResearch)以1：1.5摩爾濃度比例在37℃孵育30分鐘。Urelumab(BMS-663513，全人IgG4)可以單獨激活4-1BB的信號通路，加入外源***聯後激活程度增強。

以上結果表明，9EN-FM在體內應用時，只有在PD-L1高表達的區域如腫瘤組織，才能激活4-1BB的活性。

實施例9. 抗PD-L1/4-1BB雙特異抗體對PD-1/PD-L1信號通路的封閉實驗

在Jurkat細胞中穩定轉染PD-1和NFAT螢光素酶報告基因質粒(Promega，pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro] Vector)，製成帶有PD-1表達的並帶NFAT螢光素酶報告基因的穩定細胞株。同時加入穩定高表達PD-L1的Hep3B的細胞株。加入不同濃度待測抗體後培養6個小時，加入螢光素酶檢測試劑ONE-GLUTM螢光素酶檢測試劑(Promega)，用Envision(PerkinElmer，2150)讀取螢光值，結果如圖7所示。

結果顯示，9EN-FM能劑量依賴性的解除PD-1/PD-L1信號通路介導的對NFAT螢光信號的抑制。與9EN-FM抑制活性要略低於雙特異性抗體中使用的PD-L1單抗(HRP00052)。

實施例10. T淋巴細胞激活實驗

將人外周血單核淋巴細胞(StemExpress)中加入100ng/mL SEB(康博貝擃)，同時加入待測抗體。為了驗證PD-L1介導的4-1BB的激活，在外周血單核淋巴細胞中加入了高表達PD-L1的HEK293細胞。HEK293細胞瞬時轉染PD-L1質粒(Lipofectemine 2000，Invitrogen)，轉染後24小時，用10g/mL絲裂黴素C(TGI)作用1小時。再用PBS清洗三遍後加入用SEB刺激的人外周血單核淋巴細胞。共同培養72小時後，用ELISA的方法檢測上清中的IL-2(human IL-2 kit，cisbio)的分泌。結果如圖8所示。

結果顯示，在沒有加入PD-L1高表達HEK293細胞時，9EM-FM對於T細胞的激活要強於兩個單抗HR137-07，PD-L1單抗(HRP00052)單獨作用以及兩個單抗聯用。當在SEB實驗中加入PD-L1高表達的HEK-293細胞時，9EN-FM對於T細胞的活性要進一步增強。進一步說明9EN-FM介導了PD-L1依賴的T細胞激活。

實施例11. 4-1BB/PD-L1雙抗小鼠體內抗腫瘤活性

將MC38-hPD-L1細胞以5×10⁵個/0.1mL濃度接種於Balbc-hPD-L1/h4-1BB雙人源化小鼠(百奧賽圖公司提供)的右側皮下，待腫瘤生長到大約120mm³時按腫瘤體積挑選42隻隨機分組，每組6隻，共7組，分別為：人IgG(7.5mg/kg)、HRP00052(2.25mg/kg)、HR137-07(0.225mg/kg)、HPR00052(2.25mg/kg)+HR137-07(0.225mg/kg)、9EN-FM-1(0.3mg/kg)、9EN-FM-1(3mg/kg)和9EN-FM-1(10mg/kg)。每週給藥2次，給藥和觀察期間每週測量2次小鼠體重和腫瘤體積如圖9所示，並記錄測量值。

計算T/C值，公式如下：

T/C%=給藥組腫瘤體積平均值/對照組腫瘤平均體積%；

CR%(腫瘤完全消退比例)=腫瘤完全消退的小鼠數量/入組小鼠數量。

結果顯示，9EN-FM具有劑量依賴地抗腫瘤活性，0.3mpk，3mpk和10mpk組的腫瘤的T/C%值分別為132.2、69.9以及10.7(見表6)。在高劑量10mpk給藥組的抗腫瘤T/C與兩藥聯用組的T/C相類似分別為10.7和19.6，但是從腫瘤完全消退的比例來說(CR%)，9EN-FM-1 10mpk 組為83.3%。說明9EN-FM-1具有比HR137-07和HRP00052聯用更好的抗腫瘤活性。

實施例12. 4-1BB/PD-L1雙特異性抗體在食蟹猴中的單劑量藥物代謝動力學研究

採用2-4.5歲雄性食蟹猴3隻(普通級，動物來源：廣西桂東靈長類開發實驗有限公司、廣州相觀生物科技有限公司)，靜脈推注射9EN-FM。單次給藥，劑量設置為5mg/kg，給藥容量為10mL/kg(以0.9%氯化鈉注射液稀釋)。在以下時間點採集血液：第一次給藥給藥後的0h、0.25h、2h、8h、24h、48h、96h、168小時、240小時、336小時、504小時、672小時。對血藥濃度藉由ELISA的方法進行檢測。採用生物素標記的4-1BB 包被板子，25℃溫育1小時。300μL PBS清洗三次後，加入待測血清，25℃溫育1小時。300μL PBS清洗三次後，每孔加入100μL羊抗人IgG fab溶液，封板膜封板，25℃溫育1小時。二抗檢測濃度1：30000，稀釋液為1% BSA-PBST+1%猴血清。

結果顯示，9EN-FM-1在5mpk的劑量下半衰期為37.3小時，這與HRP00052同劑量下抗體半衰期類似見表7，提示這是主要是在抗體未達到靶點飽和濃度的條件下，PD-L1這一端介導的抗體分佈。

其他序列信息如下：

人種系重鏈模板IGHV3-30序列：

SEQ ID NO：27

人種系輕鏈模板IGKV3-11序列：

SEQ ID NO：28

人種系重鏈模板IGHV1-46序列：

SEQ ID NO：29

人種系輕鏈模板IGKV4-1序列：

SEQ ID NO：30

抗體8E的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列：

SEQ ID NO：31

抗體8EN的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列：

SEQ ID NO：32

抗體8E、抗體8EN的第二多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列：

SEQ ID NO：33

抗體9E-FM的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列：

SEQ ID NO：34

抗體9EN-FM的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列：

SEQ ID NO：35

抗體9EN-FM-1的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列：

SEQ ID NO：36

抗體9E、抗體9EN-FM、抗體9EN-FM-1的第二多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列：

SEQ ID NO：37

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司

<120> 抗4-1BB抗體、其抗原結合片段及雙特異性抗體

<130> 702073CPCT

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(10)

<223> B1E7和HR137-07 HCDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(17)

<223> B1E7和HR137-07 HCDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(11)

<223> B1E7和HR137-07 HCDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(15)

<223> B1E7和HR137-07 LCDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(7)

<223> B1E7 LCDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(9)

<223> B1E7和HR137-07 LCDR3

<400> 6

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(7)

<223> HR137-07 LCDR2

<400> 7

<210> 8

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(120)

<223> HR137-07重鏈可變區

<400> 8

<210> 9

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(114)

<223> HR137-07輕鏈可變區

<400> 9

<210> 10

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(450)

<223> HR137-07重鏈

<400> 10

<210> 11

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(218)

<223> HR137-07輕鏈

<400> 11

<210> 12

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(715)

<223> 8E的第一多肽鏈

<400> 12

<210> 13

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(715)

<223> 8EN的第一多肽鏈

<400> 13

<210> 14

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(218)

<223> 8E和8EN的第二多肽鏈

<400> 14

<210> 15

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(715)

<223> 9E-FM的第一多肽鏈

<400> 15

<210> 16

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(715)

<223> 抗體9EN-FM的第一多肽鏈

<400> 16

<210> 17

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(715)

<223> 9EN-FM-1的第一多肽鏈

<400> 17

<210> 18

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(218)

<223> 9E-FM、9EN-FM、9EN-FM-1的第二多肽鏈

<400> 18

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(5)

<223> PD-L1抗體(HRP00052)HCDR1

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(17)

<223> PD-L1抗體(HRP00052)HCDR2

<400> 20

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(10)

<223> PD-L1抗體(HRP00052)HCDR3

<400> 21

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(15)

<223> PD-L1抗體(HRP00052)LCDR1

<400> 22

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(7)

<223> PD-L1抗體(HRP00052)LCDR2

<400> 23

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(9)

<223> PD-L1抗體(HRP00052)LCDR3

<400> 24

<210> 25

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(119)

<223> PD-L1抗體(HRP00052)的重鏈可變區

<400> 25

<210> 26

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(111)

<223> PD-L1抗體(HRP00052)的輕鏈可變區

<400> 26

<210> 27

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(98)

<223> 人種系重鏈模板IGHV3-30

<400> 27

<210> 28

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(95)

<223> 人種系輕鏈模板IGKV3-11

<400> 28

<210> 29

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(98)

<223> 人種系重鏈模板IGHV1-46

<400> 29

<210> 30

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(101)

<223> 人種系輕鏈模板IGKV4-1

<400> 30

<210> 31

<211> 2148

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(2148)

<223> 抗體8E的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列

<400> 31

<210> 32

<211> 2148

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(2148)

<223> 抗體8EN的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列

<400> 32

<210> 33

<211> 657

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(657)

<223> 抗體8E、抗體8EN的第二多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列

<400> 33

<210> 34

<211> 2148

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(2148)

<223> 抗體9E-FM的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列

<400> 34

<210> 35

<211> 2148

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(2148)

<223> 抗體9EN-FM的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列

<400> 35

<210> 36

<211> 2148

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(2148)

<223> 抗體9EN-FM-1的第一多肽鏈胺基酸序列的編碼核酸序列

<400> 36

<210> 37

<211> 657

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(657)

<223> 抗體9E、抗體9EN-FM、抗體9EN-FM-1的第二多肽鏈胺基酸序列的编編碼核酸序列

<400> 37

<210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(15)

<223> 連接子1

<400> 38

<210> 39

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> 連接子2

<400> 39

Claims

一種抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，包含：

重鏈可變區，其包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或

輕鏈可變區，其包含分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如請求項1所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，其為鼠源抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或其片段。
如請求項1或2所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，其中：

該抗體或其抗原結合片段的重鏈框架區源自SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列；和/或，輕鏈框架區源自SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
如請求項2所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈可變區包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈框架區；

較佳地，包含人源IgG1、IgG2或IgG4的重鏈框架區；

更佳地，包含人源IgG1的重鏈框架區。
如請求項1所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，其中：

重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，和/或輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
如請求項1至5中任一項所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，其中：

I)該抗4-1BB抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：10所示的重鏈，和/或如SEQ ID NO：11所示的輕鏈；

II)該抗4-1BB抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：10的變體所示的重鏈，和/或如SEQ ID NO：11的變體所示的輕鏈；較佳地，該SEQ ID NO：10的變體是指在如SEQ ID NO：8所示的重鏈可變區包含1至10個胺基酸變化，和/或，該SEQ ID NO：11的變體是指在如SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區包含1至10個胺基酸變化，該胺基酸變化為保守性的修饰、置换或取代；

III)該抗4-1BB抗體或其抗原結合片段包含與SEQ ID NO：10所示的序列具有至少90%序列同一性的重鏈，和/或，與SEQ ID NO：11所示的序列具有至少90%的序列同一性的輕鏈；

IV)該抗4-1BB抗體或其抗原結合片段具有降低或消除的ADCC效應；較佳地，該抗體是Fc區具有D265A、N297A、L234A或F/L235A、P329G中的一項或幾項突變的IgG1型抗體，或是IgG2/4的Fc區雜交抗體，或是具有S128P、F234A/L235A中的一項或幾項突變的IgG4型抗體；或者

V)該抗4-1BB抗體具有降低或消除的CDC效應；較佳地，該抗體在IgG1的Fc具有P331S的突變，或是IgG2/4的Fc區雜交抗體。
一種抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，其與請求項1至6中任一項所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段競爭結合相同的表位。
一種多核苷酸，其編碼請求項1至7中任一項所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段。
一種表達載體，其含有請求項8所述的多核苷酸。
一種宿主細胞，其轉化有請求項9所述的表達載體；較佳地，該宿主細胞選自細菌、酵母和哺乳動物細胞；更佳地，該宿主細胞為大腸桿菌、畢赤酵母、中國倉鼠卵巢細胞或人胚腎293細胞。
一種用於製備抗4-1BB抗體或其抗原結合片段的方法，包括步驟：

在請求項10所述的宿主細胞中表達請求項9所述的表達載體，以及從該宿主細胞中分離表達的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段。
一種醫藥組成物，其含有請求項1至7中任一項所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
一種如請求項1至7中任一項所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段在製備藥物或醫藥組成物中的用途，該藥物或醫藥組成物用於治療疾病；

較佳地，該疾病為癌症；

更佳地，該癌症選自：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸癌、甲狀腺癌、食管癌、宫頸癌、肉瘤、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、膽囊癌和膠質母細胞瘤。
一種治療疾病的方法，該方法包括：

向受試者施用治療有效量的請求項1至7中任一項所述的抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，或請求項12所述的醫藥組成物；

較佳地，該疾病為癌症；

更佳地，該癌症選自：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸癌、甲狀腺癌、食管癌、宫頸癌、肉瘤、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、膽囊癌和膠質母細胞瘤。
一種雙特異性抗體，其包含：

1)特異性結合第一抗原的第一抗體或其抗原結合片段；和

2)特異性結合第二抗原的第二抗體或其抗原結合片段；

該第一抗原為4-1BB，並且該第二抗原為PD-L1；或，該第一抗原為PD-L1，並且該第二抗原為4-1BB；

當該第一抗原或第二抗原是4-1BB時，該第一抗體、第二抗體或第一抗體、第二抗體的抗原結合片段包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或，分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如請求項15所述的雙特異性抗體，其中：

第一抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈；和

第二抗體或其抗原結合片段包含scFv；

其中，該scFv連接於第一抗體或其抗原結合片段的重鏈或輕鏈的N端或C端；

較佳地，該第一抗體或其抗原結合片段包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中該第一抗體或其抗原結合片段的一條重鏈的重鏈可變區與一條輕鏈的輕鏈可變區形成抗原結合部位，另一條重鏈的重鏈可變區與另一條輕鏈的輕鏈可變區形成抗原結合部位。
如請求項15或16所述的雙特異性抗體，其中每個雙特異性抗體分子包含1個該第一抗體或其抗原結合片段和2個該scFv；

並且，一個該scFv連接於該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈或輕鏈的N端，另一個該scFv連接於該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈或輕鏈的C端；或者，兩個該scFv分别連接於該第一抗體或其抗原結合片段的兩條重鏈或兩條輕鏈的N端；或者，兩個該scFv分别連接於該第一抗體或其抗原結合片段的兩條重鏈或兩條輕鏈的C端。
如請求項15至17中任一項所述的雙特異性抗體，其中：

該scFv的重鏈可變區與輕鏈可變區藉由連接子1連接，和/或該兩個scFv藉由連接子2與分別該第一抗體或其抗原結合片段的兩條重鏈的N端或C端連接；

更佳地，該scFv的結構為NH2-VL-連接子1-VH-COOH或NH2-VH-連接子1-VL-COOH，該連接子1和連接子2可以相同或不同。
如請求項15至18中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗體或其抗原結合片段為IgG同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳地，為IgG1同種型；和/或，該第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈為Kappa同種型。
如請求項15至19中任一項所述的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含兩條第一多肽鏈和兩條第二多肽鏈，其中：

a)該兩條第一多肽鏈各自獨立地包含該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈和該scFv；和

b)該兩條第二多肽鏈各自獨立地包含該第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈；

其中，該scFv藉由連接子2與該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈的N端或C端相連；

或者，

i)該兩條第一多肽鏈各自獨立地包含該第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈和該scFv；和

ii)該兩條第二多肽鏈各自獨立地包含該第一抗體或其抗原結合片段的重鏈；

其中，該scFv藉由連接子2與該第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈的N端或C端相連；

較佳地，該scFv具有結構：NH2-VH-連接子1-VL-COOH或NH2-VL-連接子1-VH-COOH；

較佳地，該雙特異性抗體包含兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈，該連接子1和連接子2可以相同或不同。
如請求項15至20中任一項所述的雙特異性抗體，具有與該第一抗體或其抗原結合片段的親本抗體相比同等或更弱的結合第一抗原的活性；

較佳地，該雙特異性抗體，具有與該scFv的親本抗體相比同等或更弱的結合第二抗原的活性；

更佳地，該雙特異性抗體，具有與該第一抗體或其抗原結合片段的親本抗體相比同等或更弱的結合第一抗原的活性，且具有與該scFv的親本抗體相比同等或更弱的結合第二抗原的活性；

更佳地，該雙特異性抗體，具有與結合PD-L1的親本抗體相比同等的結合活性；

更佳地，該雙特異性抗體，具有與結合4-1BB的親本抗體相比更弱的結合活性；

更較佳地，該雙特異性抗體，具有與結合PD-L1的親本抗體相比同等的結合活性，且具有與結合4-1BB的親本抗體相比更弱的結合活性。
如請求項15至21中任一項所述的雙特異性抗體，其中該連接子1和/或連接子2為肽接頭，較佳地，該連接子1和/或連接子2具有如(G_mS_n)_x所示的胺基酸序列，其中m、n各自獨立地為選自1-8的整数，x為選自1-20的整数；

較佳地，該連接子1和/或連接子2具有如(G₄S)_x所示的胺基酸序列，x為選自1-6的整数；

較佳地，該連接子1和/或連接子2為(G₄S)₃或(G₄S)₄；

較佳地，該連接子1為(G₄S)₃，連接子2為(G₄S)₄。
如請求項15至22中任一項所述的雙特異性抗體，其中該scFv的VH與VL之間存在二硫键。
如請求項15至23中任一項所述的雙特異性抗體，其中該第一抗體或其抗原結合片段特異性結合4-1BB，並且該scFv特異性結合PD-L1，其中，該第一抗體或其抗原結合片段包含：如SEQ ID NO：1、2、3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和/或，如SEQ ID NO：4、7、6所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；並且，該scFv包含：分别如SEQ ID NO：19、20、21所示的HCDR、HCDR2、HCDR3，和/或，分别如SEQ ID NO：22、23、24所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
如請求項15至23中任一項所述的雙特異性抗體，其中該第一抗體或其抗原結合片段特異性結合PD-L1，並且該scFv特異性結合4-1BB，其中

該第一抗體或其抗原結合片段包含：分别如SEQ ID NO：19、20、21所示的HCDR、HCDR2、HCDR3，和/或，分别如SEQ ID NO：22、23、24所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；並且，該scFv包含如SEQ ID NO： 1、2、3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和/或，如SEQ ID NO：4、7、6所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
如請求項15至23中任一項所述的雙特異性抗體，其中，該scFv包含：

I)如SEQ ID NO：25所示的VH，和/或，如SEQ ID NO：26所示的VL；或

II)如SEQ ID NO：8所示的VH，和/或，如SEQ ID NO：9所示的VL。
如請求項15至23中任一項所述的雙特異性抗體，其中：

I)該第一抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：8所示的VH和如SEQ ID NO：9所示的VL；並且，該scFv包含如SEQ ID NO：25所示的VH和如SEQ ID NO：26所示的VL；或

II)該第一抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：25所示的VH和如SEQ ID NO：26所示的VL；並且，該scFv包含如SEQ ID NO：8所示的VH和如SEQ ID NO：9所示的VL。
如請求項15至27中任一項所述的雙特異性抗體，具有降低的ADCC活性，和/或降低的CDC活性。
如請求項15至28中任一項所述的雙特異性抗體，其中該第一抗體的Fc區含有突變；

較佳地，第一抗體或其抗原結合片段的Fc區具有以下的一個或多個突變：在第265位突變為A、在第297位突變為A、在第234位突變為A或F、在第235位突變為A或E、在第329位突變為G；

更佳地，第一抗體或其抗原結合片段的Fc區具有以下的一個或多個突變：D265A、N297A、L234A或L234F、L235A或L235E、P329G；

更佳地，第一抗體或其抗原結合片段的Fc區具有以下突變：L234A/L235A。
如請求項15至29中任一項所述的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含：

I)如SEQ ID NO：12所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：14所示的第二多肽鏈；或

II)如SEQ ID NO：13所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：14所示的第二多肽鏈；或

III)如SEQ ID NO：15所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：18所示的第二多肽鏈；或

IV)如SEQ ID NO：16所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：18所示的第二多肽鏈；或

V)如SEQ ID NO：17所示的第一多肽鏈和如SEQ ID NO：18所示的第二多肽鏈。
一種分離的核酸分子，其包含編碼請求項15至30中任一項所述的雙特異性抗體的核苷酸序列；

較佳地，該分離的核酸分子包含編碼請求項20至30中任一項所述的雙特異性抗體的第一多肽鏈的核苷酸序列，和/或編碼請求項20至30中任一項所述的雙特異性抗體的第二多肽鏈的核苷酸序列；更佳地，該分離的核酸分子包含SEQ ID NO：31-32、34-36所示的序列；和/或SEQ ID NO：33、37所示的序列。
一種載體，其包含請求項31所述的分離的核酸分子。
一種宿主細胞，其包含請求項31所述的分離的核酸分子或請求項32所述的載體。
一種製備請求項15至30中任一項所述的雙特異性抗體的方法，其包括，在允許該雙特異性抗體表達的條件下，培養請求項33所述的宿主細胞，和從培養的宿主細胞培養物中回收該雙特異性抗體。
一種醫藥組成物，其含有請求項15至30中任一項所述的雙特異性抗體，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
一種如請求項15至30中任一項所述的雙特異性抗體或請求項35所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於在受試者中治療疾病；

較佳地，該疾病為自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病，例如腫瘤，包括但不限於實體瘤或血液癌症，或包括但不限於腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，或包括但不限於腎上腺、膽囊、骨、骨髓、腦、乳腺、膽管、胃腸道、心臟、腎臟、肝臟、肺、肌肉、卵巢、胰腺、副甲狀腺、陰莖、***、皮膚、唾液腺、脾臟、睾丸、胸腺、甲狀腺和子宫相關的腫瘤、傳染病包括但不限於B型肝炎、A型肝炎、HIV；

較佳地，該受試者可以為哺乳動物，例如人。
一種用於在受試者中治療疾病的方法，其中該方法包括，給有此需要的受試者施用有效量的請求項15至30中任一項所述雙特異性抗體，或者請求項35所述的醫藥組成物；

較佳地，該疾病為自身免疫性疾病或腫瘤或傳染病，例如腫瘤，包括但不限於實體瘤或血液癌症，或包括但不限於腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，或包括但不限於腎上腺、膽囊、骨、骨髓、腦、乳腺、膽管、胃腸道、心臟、腎臟、肝臟、肺、肌肉、卵巢、胰腺、副甲狀腺、陰莖、***、皮膚、唾液腺、脾臟、睾丸、胸腺、甲狀腺和子宫相關的腫瘤、傳染病包括但不限於B型肝炎、A型肝炎、HIV；

較佳地，該受試者可以為哺乳動物，更佳地，該受試者為人。