TW202108144A - 供用於預防及/或治療周邊神經病變及其相關疾病的調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關於用於預防及/或治療尤其係眼睛中的周邊神經病變及其相關疾病之諸如3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物之二胺基吩噻嗪化合物之局部製劑的調配物及其使用方法。

Description

供用於預防及/或治療周邊神經病變及其相關疾病的調配物
相關申請案之交叉參考
此申請案主張於2019年8月20日申請之新加坡專利申請案第10201907677Q號之優先權，其內容以引用方式併入本文中。
發明領域
本發明係有關於用於預防及/或治療尤其係眼睛中的周邊神經病變及其相關疾病之調配物及其使用方法。
發明背景
針對本發明背景之以下討論旨在促進對本發明之理解。然而，應了解該討論並非承認或認可任何所提及之材料係公開的、已知的或者如在本申請案之優先權日期的任何司法管轄權中之常見通常知識的一部分。
我們的神經系統分為2個部分：中樞神經系統(central nervous system, CNS)，其包括腦及脊髓，以及周邊神經系統(peripheral nervous system PNS)，其包括背根神經節(dorsal root ganglions, DRG)，且亦包括在腦及脊髓之外的神經纖維及末端的神經接受器。PNS由2個部分所組成，傳入(感覺)部分將感覺信息傳送至CNS，而傳出(運動)部分將運動指令從CNS傳遞至效應目標(細胞、組織等等)。PNS允許CNS與外部環境溝通。
不同於被髓鞘層、脊椎及顱骨所保護之CNS的腦及脊髓，PNS的神經有時係無髓鞘的。神經元係構成神經系統的細胞體。每個神經元具有一長的突起，稱之為軸突，其傳遞神經元用於溝通之電化學訊息。此等軸突突起構成PNS。背根神經節係PNS的一部分，且其神經纖維將來自於感覺輸入之信息最終傳導至腦以進行處理。周邊神經在手、腳以及角膜神經中提供重要的感覺單元。周邊神經病變係對PNS的損傷。周邊神經病變通常會導致無力、麻木及疼痛。周邊神經病變可由創傷性傷害、感染、自體免疫狀況、代謝問題、遺傳原因、老化及暴露於毒素所造成。最常見的原因之一係糖尿病，其造成人體中的高血糖症/葡萄糖水平升高。高滲透壓症亦為高血糖症之後遺症，其可能會導致高滲透壓症所引發之周邊神經損傷。
糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)係一群代謝疾病，其特徵為長期的高血糖水平。截至2017年，全球估計有4.25億人患有糖尿病(Diabetes atlas 2017)。在糖尿病(DM)中，伴有周邊神經病變或PNS受損之相關併發症。糖尿病周邊神經病變係在DM中最常見的併發症之一，其影響包括感覺神經元及運動神經元的所有周邊神經，但較不影響自主神經系統。目前，除了良好控制血糖水平之外，尚無針對高血糖症(高葡萄糖)所引發之周邊神經傷害的明確管理。對於一些患者而言，尤其係必須注射胰島素之患者，由於成本高昂及注射疼痛，管理血糖水平可能非常困難。除了管理血糖水平之外，糖尿病神經病變的唯一治療方法係減少疼痛及其他症狀。 神經纖維之降解在第II型糖尿病中很常見，尤其係在具有增生性糖尿病視網膜病變的糖尿病患者中(Gao et al. Int J Ophthalmol, Vol 8, No.2, 2015, 358-364)。具有DM之患者表現出諸如角膜神經密度逐漸降低及角膜敏感性降低之跡象(Han et al.  Clinical interventions in Aging 2019: 14 p 53-63)。由共軛焦顯微術所測量之角膜神經纖維長度已被證明能夠預測糖尿病周邊神經病變的發展(Han et al 2019)。由於高血糖症，眼部表面環境亦會成為高滲透壓性，導致高滲透壓症所引發之角膜神經損傷。需要有更好的糖尿病神經病變的管理及治療，例如預防及/或治療眼睛中的周邊神經損傷，尤其是係角膜神經及其分支。
甲基噻嚀鎓氯化物(methylthioninium chloride, MTC) (亦稱為亞甲基藍(methylene blue, MB)；甲基噻嚀氯化物(methylthionine chloride)；四甲基噻嚀氯化物(tetramethylthionine chloride)；3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物(3,7-bis(dimethylamino) phenothiazin-5-ium chloride)；C.I.鹼性藍9 (C.I. Basic Blue 9)；四甲基噻嚀氯化物(tetramethylthionine chloride)；3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪鎓氯化物(3,7-bis(dimethylamino) phenazathionium chloride)；瑞士藍(Swiss blue)；C.I. 52015；C.I.溶劑藍8 (C.I. Solvent Blue 8)；苯胺紫(aniline violet)；及泌尿藍(Urolene Blue®))係一具有以下化學式之低分子量(319.86)、水溶性、三環有機化合物：
Figure 02_image001
已知MTC的各種合成方法，並已總結在WO 2006/032879中。WO 2006/032879亦揭露亞甲基藍的許多應用，包括作為一醫學染料、作為一氧化還原指示劑、作為一防腐劑、治療及預防腎結石、以及治療黑色素瘤、瘧疾及病毒感染之用途。被全身給藥之MTC亦已被使用作為一氧化/還原(氧化還原)劑，且在一氧化碳、亞硝酸鹽及苯胺中毒的情況下被使用作為一解毒劑。亦建議全身給藥MTC以治療阿茲海默氏症，其係一種會影響中樞神經系統之疾病。
MTC可溶於水及酒精。不建議將MTC溶解於鹽水中，因為已報導在使用0.9%氯化鈉鹽水稀釋亞甲基藍的情況下會發生沉澱(由於氯離子的存在，已證明會降低亞甲基藍的溶解度)。已報導MTC與苛性鹼、碘化物及重鉻酸鹽、以及氧化及還原物質係不相容。
已報導當MTC被注射至腦脊髓液的脊髓腔室時會造成大量周邊神經損傷，並導致全部截癱(Sharr et al. J. Neurol. Neurosur, and Psychiatry 1978, 41, 384-386)。
在白內障手術期間，在眼睛上意外使用較高濃度之MTC，而不是使用錐蟲藍(Trypan Blue)，會導致不可逆轉的失明、角膜水腫(Timucin et al. Arq. Bras. Oftalmol. vol.79 no.2, 2016)、大泡性角膜病變而導致角膜移植、以及眼內炎並發展為角膜衰竭。因此亞甲基藍通常被認為係一不用於眼睛的有毒染料。此外，由於MTC係一染料，因此使用在皮膚或黏膜上通常會造成不美觀的藍色變色及污漬。
因此，需要開發可改善上述缺點之至少一者的調配物方法及用途。
發明概要
本發明之一目的係改善一些上述難題，較佳地係透過調配物及使用調配物之方法來預防及/或治療周邊神經病變，尤其是在眼睛方面。
本發明之一態樣係有關於一種用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之局部製劑，其包含一有效量的二胺基吩噻嗪化合物(diaminophenothiazine)或式I的互變異構體：
Figure 02_image002
其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’係獨立地為氫、甲基或乙基。
本發明之另一態樣係有關於一種如本文上述之局部製劑，其供用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症。
本發明之另一態樣係有關於一種預防及/或治療周邊神經損傷之方法，其包含對一需要預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之受試者投予 (a)    一有效量的二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體
Figure 02_image002
其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’係獨立地為氫、甲基或乙基；或者 (b)    一如本文上述之局部製劑，或者 (c)    一局部製劑，其包含一有效量的二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體；以及一載體。
本發明之另一態樣係有關於一種式I化合物在製備一用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之局部製劑中的用途。
本發明之另一態樣係有關於一種用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之局部製劑，其包含少於或等於150 µM之3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物；以及一載體-介質(carrier-medium)，其調整該製劑之黏度至每秒約15至150毫帕斯卡的範圍。
本發明之另一態樣係有關於一種局部套組，其包含a) 一局部組成物，其包含一有效量的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物，以及b) 一容器，其用於容納所述供用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之方法的組成物，更具體地係用於與角膜神經傷害有關的眼睛上及其包括神經營養性角膜病變之相關病症。
本發明之另一態樣係有關於一種調配一局部組成物之方法，其包含：將3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物囊封於一微粒中。
在檢閱本發明之特定實施態樣的以下描述並結合所附圖式之後，本發明之其他態樣及特徵對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者將變得顯而易見。
較佳實施例之詳細說明
現在將參考所附圖式以描述本發明之特定實施態樣。在本文中所使用之術語僅用於描述特定實施態樣之目的，並不旨在限制本發明之範圍。此外，除非另有定義，否則在本文中所使用之所有技術及科學術語的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解的含義相同。為了清楚及一致性，在該等圖式中盡可能使用相同的參考符號。
各種實施態樣係有關於一種用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之局部製劑，其包含二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體：
Figure 02_image002
其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’係獨立地為氫、甲基或乙基。
在各種實施態樣中，式(1)化合物之形式，包括其藥學上可接受之鹽類、水合物及溶劑合物。
各種實施態樣係有關於一種用於保護預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之局部製劑，其包含一有效量的二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體：其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R1’、 R2’、R3’及R4’係獨立地為氫、甲基或乙基，少於或等於5 µM之3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物；以及一生理緩衝劑。
在本文中所使用之二胺基吩噻嗪化合物因為電子非定域化(electron delocalization)而帶正電，導致部分正電荷位於氮及硫原子兩者上。在各種實施態樣中，方案A顯示噻嚀之化學結構，其係最簡單的二胺基吩噻嗪，以及由電子非定域化所產生之噻嚀的3種互變異構體：
Figure 02_image005
在各種實施態樣中，R1 、R2 、R3 、R4 、R5 及R6 係氫，且R2 、R5 、R1 1 、R2 ’、R3 ’及R4 1 係獨立地為氫或甲基。
在各種實施態樣中，該二胺基吩噻嗪化合物，有時亦稱為噻嗪，係選自於由天藍染料A、天藍染料B、天藍染料C、噻嚀、甲苯胺藍、3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物(亞甲基藍)、新亞甲基藍，及1-9-二甲基亞甲基藍所組成之群組。
在各種實施態樣中，該二胺基吩噻嗪化合物包含3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
在各種實施態樣中，該二胺基吩噻嗪化合物包含少於或等於150 µM之3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
在各種實施態樣中，該3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物包含式II之化合物：
Figure 02_image007
(II)
儘管在任何與眼睛有關之情況下嚴禁或禁止使用亞甲基藍，但已設計一具有顯著較低濃度之亞甲基藍的溶液，其已被緩衝至一可被耐受的生理pH範圍。類似地，周邊神經可耐受該溶液。有利地，較低濃度之亞甲基藍可被用於管理周邊神經疾病，尤其係作為一局部製劑在各種實施態樣中在與眼睛有關之周邊神經疾病及其相關病症中，其可能由以下原因所造成：創傷性傷害、感染、自體免疫狀況、代謝問題、遺傳原因、老化、暴露於諸如化學療法之毒素、高血糖症及/或高滲透壓症所引發之周邊神經損傷，或本發明技術領域中任何其他已知原因所導致之周邊神經損傷及其相關病症。
在本文中所使用之術語「局部製劑」係指任何用於施用於身體內或身體上特定位置之製劑。其可以係指溶液、懸浮液、洗劑、軟膏、凝膠、粉末、糊劑、基質、經皮貼片或任何其他允許施用於身體內或身體上特定位置之調配物。在各種實施態樣中，身體內或身體上特定位置係指諸如皮膚或黏膜的身體表面。在各種實施態樣中，身體內或身體上特定位置直接地係指一神經部位，例如在角膜表面上的一神經部位。在各種實施態樣中，身體內或身體上特定位置係指眼睛。
在本文中所使用之術語「預防(prevention)」、「預防(preventing)」、「預防(prevent)」、「保護(protecting)」、「保護(protect)」或「保護(protection)」周邊神經損傷係指預防、阻止或降低神經細胞、纖維或PNS之延伸的損傷或死亡。在各種實施態樣中，這可以藉由降低因為葡萄糖流入神經細胞之粒線體中所導致之細胞傷害所造成的負面後遺症而達成。已知神經細胞比其他細胞具有較大的粒線體體積。在各種實施態樣中，這可以藉由降低非酶鍵結而達成，亦即葡萄糖對蛋白質或脂蛋白的糖化作用，其可能導致周邊神經的損傷。在各種實施態樣中，這可以藉由降低毒性效應或毒素，諸如降低化學治療藥物對神經的不良效應而達成。在各種實施態樣中，這可以藉由增加細胞的抗氧化防禦能力而達成。
在本文中所使用之術語「治療(treating)」、「治療(treat)」或「治療(treatment)」周邊神經損傷係指停止或降低神經細胞、纖維或PNS之延伸的進一步損傷或死亡，及/或提供一適合新的神經細胞、纖維或PNS之延伸形成及成長的環境。在各種實施態樣中，這可以藉由降低因為葡萄糖流入神經細胞之粒線體中所導致之細胞傷害所造成的負面後遺症而達成。已知神經細胞比其他細胞具有較大的粒線體體積。在各種實施態樣中，這可以藉由降低非酶鍵結而達成，亦即葡萄糖對蛋白質或脂蛋白的糖化作用，其可能導致周邊神經的損傷。在各種實施態樣中，這可以藉由降低毒性效應或毒素，諸如降低化學治療藥物對神經的不良效應而達成。在各種實施態樣中，這可以藉由增加細胞及/或其神經纖維的抗氧化防禦能力而達成。
在本文中所使用之術語「3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物」係指甲基噻嚀鎓氯化物(MTC) (亦稱為亞甲基藍(MB)；甲基噻嚀氯化物；四甲基噻嚀氯化物；C.I.鹼性藍9；四甲基噻嚀氯化物；3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪鎓氯化物；瑞士藍；C.I. 52015；C.I.溶劑藍8；苯胺紫；及泌尿藍)，其包含一具有以下化學式之低分子量(319.86)、水溶性、三環有機化合物：
Figure 02_image001
在各種實施態樣中，可藉由本發明技術領域中任何已知方法調配3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
在各種實施態樣中該局部製劑包含在0.0001 µM與150 µM之間的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。在各種實施態樣中該局部製劑包含149.5 µM或更少的MTC。在各種實施態樣中該局部製劑包含59.5 µM或更少的MTC。在各種實施態樣中該局部製劑包含4.5 µM或更少的MTC。在各種實施態樣中該局部製劑包含在0.0001 µM與50 µM之間的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。在各種實施態樣中該局部製劑包含在0.001 µM與90 µM之間，或在0.005 µM與0.5 µM之間，或在0.0059 µM與0.49 µM之間的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。在各種實施態樣中該局部製劑係選自於包含0.0005 µM、0.005 µM、0.05µM、0.5 µM、5 µM、50 µM、100 µM及150 µM的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物之群組。在各種實施態樣中該局部製劑包含0.05 µM的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
在各種實施態樣中，該局部製劑進一步包含一生理緩衝劑。
在各種實施態樣中該生理緩衝劑包含一氫離子水性溶液，其包含一酸及其共軛鹼之混合物，當其與添加劑或一生物環境之組分接觸時能夠將製劑維持在約pH 4至約pH 8的生理pH。在各種實施態樣中該生理緩衝劑係選自於包含碳酸氫鹽、二羥乙甘胺酸(bicine)、二甲基胂酸鹽(Cacodylate)、HEPES、MES、MOPS、PIPES、磷酸鹽、TEPS、TAPSO、TES、三羥乙甘胺酸(Tricine)及Tris之群組。在各種實施態樣中該生理緩衝劑包含碳酸氫鈉及氯化鈉。出乎意料地，儘管技術上禁止當氯化鈉與碳酸氫鈉一起存在於生理緩衝劑中時將MTC與氯化鈉一起使用，但諸如MTC之二胺基吩噻嗪化合物仍保留在溶液中，顯示出對周邊神經的保護作用，且具有一適合直接用於周邊神經及眼科用途的pH。在各種實施態樣中該溶液的pH為4至8。在各種實施態樣中該溶液的pH為4至7.5。在各種實施態樣中該溶液的pH為4。在各種實施態樣中該溶液的pH為5。在各種實施態樣中該溶液的pH為6。在各種實施態樣中該溶液的pH為7。在各種實施態樣中該溶液的pH為7.4。在各種實施態樣中該溶液的pH為7.5。在各種實施態樣中該溶液的pH為8。
在各種實施態樣中該生理緩衝溶液包含HEPES (4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸) (HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid))，較佳地係在碳酸氫鈉及氯化鈉的存在下。在各種實施態樣中該生理緩衝劑包含一神經基礎培養基(Neurobasal medium)。
在各種實施態樣中該局部製劑包含一載體。在各種實施態樣中該載體係一載體-介質，其本質上可以係液體及/或水性的。在各種實施態樣中該載體或載體-介質可包含聚合物，諸如高分子量之親水性聚合物、聚乙烯醇、泊洛沙姆(poloxamers)、玻尿酸、卡波姆(carbomers)、纖維素衍生物(結蘭膠、三仙膠)、***(dexamethasone)、毛果芸香鹼(pilocarpine)、2-羥丙基-β-環糊精、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、N-乙烯基吡咯啶酮及乙基丙烯酸酯或其等之組合。在各種實施態樣中該載體或載體-介質可包含能增加藥物遞輸至眼睛中的賦形劑，諸如螯合劑、界面活性劑或環糊精。在各種實施態樣中該載體或載體-介質可包含包容錯合物(inclusion complexes)，諸如奈米顆粒、微粒、類脂囊泡(niosomes)、盤狀體(discosomes)、樹狀體(dendrimers)、原位凝膠(in situ gels)、晶圓或嵌入隱形眼鏡中。在各種實施態樣中該載體或載體-介質可包含糖分子，諸如蔗糖、葡萄糖、乳糖、D-葡萄糖(右旋糖)。在各種實施態樣中在周邊神經環境中天然存在的內源性葡萄糖可以在溶液中形成該載體或載體-介質的一部分。這在具有涉及高葡萄糖濃度之高血糖症的DM受試者中係特別地重要。
在各種實施態樣中該載體或載體介質包含一微粒或微球。
在各種實施態樣中該有效量的二胺基吩噻嗪化合物包含預裝載在該微粒中的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
在各種實施態樣中，該微粒係塗覆有一諸如幾丁聚醣之黏膜黏著劑。 在各種實施態樣中，該微粒係懸浮於一液體介質中。在各種實施態樣中，該液體介質本質上是水性的，使得諸如3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物之二胺基吩噻嗪化合物能夠溶解於所述液體介質中。
在各種實施態樣中該載體或載體介質調整該局部製劑之黏度至每秒約15至150毫帕斯卡的範圍。
在各種實施態樣中該載體或載體介質調節該二胺基吩噻嗪化合物的釋放曲線。
在各種實施態樣中該載體或載體-介質在一預定時段內調節諸如3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物之二胺基吩噻嗪化合物的釋放曲線。任何已知能夠調節諸如MTC之二胺基吩噻嗪化合物釋放至周邊神經環境之速率的載體或載體-介質係合適的。在各種實施態樣中該載體或載體-介質調節3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物的釋放曲線至一低於或慢於3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物本身釋放速率的預定速率。在各種實施態樣中一合適的載體或載體-介質可包含聚合物，諸如高分子量之親水性聚合物、聚乙烯醇、泊洛沙姆、玻尿酸、卡波姆、纖維素衍生物(結蘭膠、三仙膠)、***、毛果芸香鹼、2-羥丙基-β-環糊精、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、N-乙烯基吡咯啶酮及乙基丙烯酸酯或其等之組合。在各種實施態樣中一合適的載體或載體-介質可包含包容錯合物，諸如奈米顆粒、微粒、類脂囊泡、盤狀體、樹狀體、原位凝膠、晶圓或可被嵌入隱形眼鏡中。在各種實施態樣中該載體或載體-介質在一預定時段內減慢或降低諸如3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物之二胺基吩噻嗪化合物的釋放曲線。
在各種實施態樣中該載體或載體-介質調整該局部製劑之黏度至每秒約15至150毫帕斯卡的範圍。在各種實施態樣中該載體或載體介質調整、增加該黏度以達到每秒約15至150毫帕斯卡的範圍。在各種實施態樣中該載體或載體-介質增加該黏度至每秒約15至100毫帕斯卡的範圍。在各種實施態樣中該載體或載體-介質調整、增加該黏度以達到每秒約15至50毫帕斯卡的範圍。在各種實施態樣中該等黏度係在室溫下的黏度。經增加之黏度可具有使諸如MTC之二胺基吩噻嗪化合物與角膜表面之間的接觸時間更長的優點，因此增加其生物利用率，尤其係針對角膜神經及其分支。在各種實施態樣中該等聚合物、糖分子、奈米顆粒、微粒、類脂囊泡、盤狀體、樹狀體載體或載體-介質可調整或增加該溶液之黏度。
在各種實施態樣中該載體或載體-介質調節諸如3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物之二胺基吩噻嗪化合物的釋放曲線。在各種實施態樣中該載體或載體-介質包含一具有一持續釋放曲線之微粒。這具有增加該製劑之黏度的優點，且其亦藉由增加該局部製劑之角膜前停留時間或滯留時間而降低頻繁施用眼藥水之需要。該持續釋放調配物亦具有減少皮膚上不美觀之藍色污漬的優點，因為該經增加之黏度減少滴落及/或帶有眼淚之釋放導致臉上的污漬及變色減少。在各種實施態樣中該具有一持續釋放曲線之載體或載體-介質微粒包含聚(乳酸交酯-共-乙醇酸交酯) (poly (lactide-co-glycolide), PLGA) 微球，然而在本發明技術領域中任何已知能夠提供一緩慢/持續釋放曲線之微粒係合適的。在各種實施態樣中該等PLGA微球包含PLGA(50:50)、PLGA(75:25)、或PLGA(85:15)之聚合物比率。該等比率可能能夠調節諸如MTC之二胺基吩噻嗪化合物的釋放曲線。在各種實施態樣中，可以利用微球中不同的聚合物比率或者微球不同的尺寸將諸如MTC之二胺基吩噻嗪化合物的持續釋放曲線調節至1、3或6個月。
在各種實施態樣中，該局部製劑進一步包含一或多種額外的化合物，包括藥物。
各種實施態樣係有關於一種如在本文中所述之局部製劑，其供用於預防及/或治療周邊神經損傷。
在各種實施態樣中該局部製劑係適用於包括人類之動物，且在醫學或獸醫學環境中係適用於預防及/或治療周邊神經損傷。
在各種實施態樣中該周邊神經損傷導致或包含神經營養性角膜病變。在各種實施態樣中該周邊神經損傷包含周邊神經病變，其由以下原因所造成：創傷性傷害、感染、自體免疫狀況、代謝問題、遺傳原因、老化、暴露於諸如化學療法之毒素、高血糖症所引發之周邊神經損傷，或本發明技術領域中任何其他已知原因所導致之周邊神經損傷。
在各種實施態樣中該局部製劑係用於眼科用途。在各種實施態樣中該局部製劑係以眼藥水或軟膏的形式存在。
各種實施態樣係有關於一種預防及/或治療周邊神經損傷之方法，其包含對一需要預防及/或治療周邊神經損傷之受試者投予 (a)  二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體
Figure 02_image002
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R1’、R2’、R3’及 R4’係獨立地為氫、甲基或乙基；或者 (b)    一如請求項1至13中任一項之局部製劑，或者 (c)    一局部製劑，其包含二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體；以及一載體或載體-介質。
各種實施態樣係有關於一種預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之方法，其包含對一需要預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之受試者投予 (a)    一有效量的二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體
Figure 02_image002
其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及 R4 ’係獨立地為氫、甲基或乙基；或者 (b)    一如請求項1至13中任一項之局部製劑，或者 (c)    一局部製劑，其包含一有效量的二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體；以及一載體-介質。
在各種實施態樣中該受試者可以係諸如哺乳動物之動物，包括人、馬、牛、狗、貓或任何其他需要預防及/或治療周邊神經損傷之動物。
各種實施態樣係有關於一種預防及/或治療周邊神經損傷之方法，其包含對一需要預防及/或治療周邊神經損傷之受試者投予(a) 一局部製劑，其包含少於或等於150 μM之3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物；以及一生理緩衝劑，或者(b) 一如在本文中所述之局部製劑，或者(c) 一局部製劑，其包含少於或等於150 μM之3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物；以及一載體或載體介質。
在各種實施態樣中該局部製劑係一眼用局部製劑。
在本文中所使用之一受試者係指一被診斷患有、處於高風險或具有或被懷疑具有周邊神經病變之患者或個體。在各種實施態樣中該患者或個體可能被診斷患有DM或糖尿病前期或被懷疑具有DM或有發展成DM之風險或係一患有乾眼症之個體。在各種實施態樣中該患者或個體可能被診斷患有神經營養性角膜病變或有發展成神經營養性角膜病變之風險。在各種實施態樣中該患者或個體可能具有周邊神經病變，其由以下原因所造成：創傷性傷害、感染、代謝問題、遺傳原因、老化、暴露於諸如化學療法之毒素、高血糖症及/或高滲透壓症所引發之周邊神經損傷，或本發明技術領域中任何其他已知原因所導致之周邊神經損傷。
在各種實施態樣中該局部製劑被直接地投予至周邊神經部位。在各種實施態樣中該局部製劑被投予至眼睛中。
在各種實施態樣中該方法進一步包含測量角膜神經之參數的步驟以在投予該局部製劑之前確定該受試者是否需要預防及/或治療周邊神經損傷。 在各種實施態樣中所測量之參數包含神經纖維長度、神經纖維密度。在各種實施態樣中係使用體內(in vivo )或原位(in situ )共軛焦顯微術測量該等角膜之參數。已證明角膜神經纖維之狀況係與DM及一受試者之身體其他部位的周邊神經病變相關(Han et al. 2019)。
在各種實施態樣中該方法進一步包含在投予該局部製劑之前及/或之後測量角膜神經之參數的步驟。在各種實施態樣中所測量之參數包含神經纖維長度、神經纖維密度。在各種實施態樣中係使用體內或原位共軛焦顯微術測量該等角膜之參數。這可以允許監測預防及/或治療之有效性。
各種實施態樣係有關於一種二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體在製備一用於預防及/或治療周邊神經損傷之局部製劑中的用途。
在各種實施態樣中該化合物係適用於包括人類之動物，且在醫學或獸醫學環境中可製備適用於預防及/或治療周邊神經損傷之局部製劑。
在各種實施態樣中該周邊神經損傷導致或包含神經營養性角膜病變。在各種實施態樣中該周邊神經損傷包含周邊神經病變，其由以下原因所造成：創傷性傷害、感染、自體免疫狀況、代謝問題、遺傳原因、老化、暴露於諸如化學療法之毒素、高血糖症所引發之周邊神經損傷，或本發明技術領域中任何其他已知原因所導致之周邊神經損傷。
各種實施態樣係關有於一種3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物在製備一局部製劑中的用途。包含少於或等於150 μM之3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物；以及一生理緩衝劑或一載體或載體-介質，用於預防及/或治療周邊神經損傷。
在各種實施態樣中該用於預防及/或治療周邊神經損傷之局部製劑係如在本文中所述。
在各種實施態樣中該用途係用於眼科用途。在各種實施態樣中該用途係用於治療乾眼。在各種實施態樣中該用途係用於預防角膜周邊神經病變。
各種實施態樣係有關於一種用於預防及/或治療周邊神經損傷之局部製劑，其包含少於或等於150 μM之3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物以及一可調整或增加該製劑之黏度至每秒約15至150毫帕斯卡之範圍的載體或載體-介質。
在各種實施態樣中該局部製劑包含一載體或載體-介質。在各種實施態樣中該載體或載體-介質可包含聚合物，諸如高分子量之親水性聚合物、聚乙烯醇、泊洛沙姆、玻尿酸、卡波姆、纖維素衍生物(結蘭膠、三仙膠)、***、毛果芸香鹼、2-羥丙基-β-環糊精、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、N-乙烯基吡咯啶酮及乙基丙烯酸酯或其等之組合。在各種實施態樣中該載體或載體-介質可包含能增加藥物遞輸或滲透至眼睛中的賦形劑，諸如螯合劑、界面活性劑或環糊精。在各種實施態樣中該載體或載體-介質可包含包容錯合物，諸如奈米顆粒、微粒、類脂囊泡、盤狀體、樹狀體、原位凝膠、晶圓或嵌入隱形眼鏡中。在各種實施態樣中該載體或載體-介質可包含糖分子，諸如蔗糖、葡萄糖、乳糖、D-葡萄糖(右旋糖)。在各種實施態樣中在周邊神經環境中天然存在的內源性葡萄糖可以在溶液中形成該載體或載體-介質的一部分。這在具有涉及高葡萄糖濃度之高血糖症的DM受試者中係特別地重要。
在各種實施態樣中該載體或載體-介質調節例如降低3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物的釋放曲線。任何已知能夠調節緩慢釋放曲線的載體或載體-介質，諸如任何能夠調節例如降低MTC釋放至周邊神經環境之速率的載體或載體-介質係合適的。在各種實施態樣中該載體或載體-介質調節例如降低3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物的釋放曲線至一低於或慢於3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物單獨釋放速率的預定速率。在各種實施態樣中一合適的載體或載體-介質可包含聚合物，諸如高分子量之親水性聚合物、聚乙烯醇、泊洛沙姆、玻尿酸、卡波姆、纖維素衍生物(結蘭膠、三仙膠)、***、毛果芸香鹼、2-羥丙基-β-環糊精、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、N-乙烯基吡咯啶酮及乙基丙烯酸酯或其等之組合。在各種實施態樣中一合適的載體或載體-介質可包含包容錯合物，諸如奈米顆粒、微粒、類脂囊泡、盤狀體、樹狀體、原位凝膠、晶圓或可被嵌入隱形眼鏡中。
在各種實施態樣中該載體或載體-介質調整例如增加該黏度至每秒約15至150毫帕斯卡的範圍。在各種實施態樣中該載體或載體-介質調整例如增加該黏度至每秒約15至100毫帕斯卡的範圍。在各種實施態樣中該載體或載體-介質調整例如增加該黏度至每秒約15至50毫帕斯卡的範圍。在各種實施態樣中該等黏度係在室溫下的黏度。經增加之黏度可具有使MTC與角膜表面之間的接觸時間更長的優點，因此增加其生物利用率。在各種實施態樣中該等聚合物、糖分子、奈米顆粒、微粒、類脂囊泡、盤狀體、樹狀體載體或載體-介質可調整或增加該溶液之黏度。
在各種實施態樣中該載體或載體-介質調節例如降低3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物的釋放曲線。在各種實施態樣中該載體或載體-介質包含一具有一緩慢釋放曲線之微粒。這具有增加該製劑之黏度的優點，且其亦降低頻繁施用眼藥水之需要，從而改善患者的服藥順從性。該緩慢釋放調配物亦具有減少皮膚上不美觀之藍色污漬的優點，因為該經增加之黏度減少滴落及/或帶有眼淚之釋放導致臉上的污漬及變色減少。在各種實施態樣中該具有一持續/緩慢釋放曲線之載體或載體-介質微粒包含聚(乳酸交酯-共-乙醇酸交酯) (PLGA) 微球，然而在本發明技術領域中任何已知能夠提供一持續/緩慢釋放曲線之微粒係合適的。在各種實施態樣中該等PLGA微球包含PLGA(50:50)、PLGA(75:25)、或PLGA(85:15)之聚合物比率。該等比率可能能夠進一步調節例如降低MTC的釋放曲線。在各種實施態樣中，可以利用微球中不同的聚合物比率或者微球不同的尺寸將MTC的釋放曲線調節至1、3或6個月。
在各種實施態樣中該載體或載體-介質包含一在本文中所述之微粒。
在各種實施態樣中該載體或載體-介質包含一水性液體介質，諸如一凝膠。
在各種實施態樣中該載體或載體-介質包含一在本文中所述之凝膠。
在本文中所使用之術語「凝膠」可以係指一包含3維半固體基質之交聯網絡，該3維半固體基質包含或能夠包含高百分比之液體含量。
一般而言從未證實局部亞甲基藍在PNS疾病中係有效的。該經設計之局部製劑可以管理周邊神經病變，其由以下原因所造成：創傷性傷害、感染、自體免疫狀況、代謝問題、遺傳原因、老化、暴露於諸如化學療法之毒素、高血糖症所引發之周邊神經損傷，或本發明技術領域中任何其他已知原因所導致之周邊神經損傷。這可以係預防性及/或治療性。
各種實施態樣係有關於一種局部套組，其包含a) 一局部組成物，其包含一有效量的諸如3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物之二胺基吩噻嗪，以及b) 一容器，其用於容納所述供用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之方法的組成物。在各種實施態樣中周邊神經損傷及其相關病症可包含與角膜神經傷害有關之眼睛的周邊神經損傷及其包括神經營養性角膜病變之相關病症。
在各種實施態樣中，該容器被配置成可容納一定量的所述局部組成物，其可支持一治療至少1、7、14、21或30天。
在各種實施態樣中，該套組包含一眼藥水套組。在各種實施態樣中，該容器可包含一可破壞之封口。
各種實施態樣係有關於一種調配一局部組成物之方法，其包含：將3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物囊封於一微粒中或任何其他能夠具有緩慢釋放曲線之載體-介質中。
在各種實施態樣中該能夠具有緩慢釋放曲線之微粒或載體-介質進一步包含一液體或水性介質。
在各種實施態樣中該載體-介質能夠承載一種以上之化合物。
在各種實施態樣中，該調配局部組成物之方法包含滿足至少一些以下條件：a) 不含有伊斯蘭教法所認為之非清真動物的任何部分或產品，或未根據伊斯蘭教法所屠宰之動物的任何部分或產品；b) 不含有伊斯蘭教法所認為之污穢物；c) 根據處方劑量對於人類健康係無害、無毒或無危害；d) 不使用被伊斯蘭教法所認為之污穢物污染之設備進行準備、加工或製造；e) 不含有伊斯蘭教法所禁止之任何人類部分或其衍生物；f) 在其準備、加工、處理、包裝、儲存及分配的過程中，該等清真藥品係與不符合在項目a)、b)、c)、d)或e)中所述之規定的任何其他藥品，或已被伊斯蘭教法認為係非清真及污穢物的任何其他物品進行物理上隔離。
在整個說明書中，除非另有相反指示，否則術語「包括(comprising)」、「由…構成(consisting of)」等等被解釋為非窮舉性(non-exhaustive)，或者換言之，其含義是「包括但不限於」。
在整個說明書中，除非上下文另外要求，否則詞語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變化形式將被理解為意指包括所述整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組。
在整個說明書中，除非上下文另外要求，否則詞語「包括(include)」或諸如「包括(includes)」或「包括(including)」之變化形式將被理解為意指包括所述整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組。
在本文中所使用之術語「約」典型地係指所述值之+/- 5%，更典型地係所述值之+/- 4%，更典型地係所述值之+/- 3%，更典型地係所述值之+/- 2%，甚至更典型地係所述值之+/- 1%，以及甚至更典型地係所述值之+/- 0.5%。
除非另有定義，否則在本文中所使用之所有技術及科學術語的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解的含義相同。如在本文中所使用，提供以下定義以促進對本發明之理解。
在整個文件中，除非另有相反指示，否則術語「包括(comprising)」、「由…構成(consisting of)」、「具有(having)」等等被解釋為非窮舉性，或者換言之，其含義是「包括但不限於」。
進一步，在整個說明書中，除非內容另外要求，否則詞語「包括(include)」或諸如「包括(includes)」或「包括(including)」之變化形式將被理解為意指包括所述整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組。
在說明書及所附發明申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a)」及「該(the)」包括複數引用，除非上下文另外明確指示。
實施例
實施例1：預防葡萄糖損害周邊神經。
以體外細胞測定法為基礎之實驗顯示，只需在傷害前培育1小時，亞甲基藍即具有保護背根神經節神經元及其神經延伸免受高葡萄糖濃度傷害之能力。
本研究之目的係使用一可反映作用機制之以多參數細胞為基礎的方案，探討亞甲基藍(MB)對於高葡萄糖水平所引發之神經毒性的劑量依賴性神經保護效應。該測定法係使用剛分離之大鼠背根神經節神經元(DRG)，在其持續48小時暴露於150 mM葡萄糖之前，先培養在預處理有不同濃度之MTC化合物(0.0005 μM、0.005 μM、0.05 μM、0.5 μM、5 μM及50 μM)的96孔盤中。
藉由48小時的葡萄糖處理(150 mM)在DRGs培養物中引發體外傷害。在葡萄糖處理之前，將DRGs與6種濃度遞增之測試化合物(0.0005 μM、0.005 μM、0.05 μM、0.5 μM、5 μM及50 μM)共培育1小時，接續與高劑量葡萄糖共培育48小時。在處理之後，將細胞固定並使用抗-β III微管蛋白染色，且然後使用BD Pathway 855 (Becton Dickinson)進行分析。藉由使用允許高通量篩選之HCS技術，可以在單細胞級別上測量與神經突生長(neurite outgrowth)相關之細胞參數，其為一致死前細胞毒性效應之指示。
為了比較該化合物在不同濃度下的神經保護程度，研究了該化合物之每種濃度的神經保護水平，並根據與對照細胞相比的變異水平建立了4個不同的神經保護分數：無神經保護、低神經保護、中神經保護及高神經保護。
大鼠背根神經節神經元的初代培養物係從新生8天的Sprague-Dawley大鼠的背根神經節所製備。在雙目顯微鏡下將神經節從脊柱移除，並在37ºC下在1小時內使用1.25 mg/ml之膠原酶I (Worthington)將神經元酶促地分散2次，並接種在聚-L-離胺酸(Sigma Aldrich＃Cat.P1524)的孔中，該等孔具有補充有B27 (Invitrogen＃Cat.17504-044)之神經基礎培養基(Invitrogen＃Cat.21103-049)，且每孔有30,000個細胞。在潮濕的5% CO2 環境中在37ºC下將細胞維持在補充有B-27成分之神經基礎培養基中8天。
將亞甲基藍化合物(Tocris)溶解於乙醇中至10 mM之最終濃度。然後在補充有20% B27 (Invitrogen＃Cat.17504-044)之神經基礎培養基(Invitrogen＃Cat.21103-049)中調整該測試化合物之濃度。
在第8天，在完全培養基中使用6種濃度遞增之亞甲基藍(0.0005 μM，0.005 μM，0.05 μM，0.5 μM，5 μM及50 μM)預處理細胞1小時。然後，培養基被無B27成分之神經基礎培養基(80%)加上補充有B27成分之神經基礎培養基(20%)替代48小時，且在150 mM葡萄糖的存在下與不同濃度之亞甲基藍共培育。參見圖1之測試時間表。
該神經基礎培養基係為滿足神經元細胞之特殊要求而調配的基礎培養基。其可以長期維持正常表型及神經元細胞之生長，並可以維持神經元細胞之純群體，而不需要無血清之星狀細胞滋養層。培養基的使用導致亞甲基藍溶液具有範圍在4至8之較高的pH，其適合與神經元細胞一起使用。該溶液會增加該黏度。
神經基礎培養基之成分 分子量 濃度 (mg/L) mM
胺基酸
甘胺酸 75.0 30.0 0.4
L-丙胺酸 89.0 2.0 0.02247191
L-精胺酸鹽酸鹽 211.0 84.0 0.39810428
L-天冬醯胺酸-H2 O 150.0 0.83 0.0055333334
L-半胱胺酸 121.0 31.5 0.2603306
L-組胺酸鹽酸鹽-H2 O 210.0 42.0 0.2
L-異白胺酸 131.0 105.0 0.8015267
L-白胺酸 131.0 105.0 0.8015267
L-離胺酸鹽酸鹽 183.0 146.0 0.7978142
L-甲硫胺酸 149.0 30.0 0.20134228
L-***酸 165.0 66.0 0.4
L-脯胺酸 115.0 7.76 0.06747826
L-絲胺酸 105.0 42.0 0.4
L-蘇胺酸 119.0 95.0 0.79831934
L-色胺酸 204.0 16.0 0.078431375
L-酪胺酸 181.0 72.0 0.39779004
L-纈胺酸 117.0 94.0 0.8034188
維生素
氯化膽鹼 140.0 4.0 0.028571429
D-泛酸鈣 477.0 4.0 0.008385744
葉酸 441.0 4.0 0.009070295
菸鹼醯胺 122.0 4.0 0.032786883
鹽酸吡哆醛 204.0 4.0 0.019607844
核黃素 376.0 0.4 0.0010638298
鹽酸噻胺 337.0 4.0 0.011869436
維生素B12 1355.0 0.0068 5.0184503E-6
i-肌醇 180.0 7.2 0.04
無機鹽
氯化鈣(CaCl2 ) (無水) 111.0 200.0 1.8018018
硝酸鐵(Fe(NO3 )3* 9H2 O) 404.0 0.1 2.4752476E-4
氯化鎂(無水) 95.0 77.3 0.8136842
氯化鉀(KCl) 75.0 400.0 5.3333335
碳酸氫鈉(NaHCO3 ) 84.0 2200.0 26.190475
氯化鈉(NaCl) 58.0 3000.0 51.724136
磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 -H2 O) 138.0 125.0 0.9057971
硫酸鋅(ZnSO4* 7H2 O) 288.0 0.194 6.736111E-4
其他成分
D-葡萄糖(右旋糖) 180.0 4500.0 25.0
HEPES 238.0 2600.0 10.92437
酚紅 376.4 8.1 0.021519661
丙酮酸鈉 110.0 25.0 0.22727273
高含量篩選測定法：藉由高含量篩選(high content screening, HCS)分析確定亞甲基藍(MB)的神經保護作用，該分析包括以下評估指標：神經突生長、細胞數量，及細胞存活率。
1.  細胞數量：為了確定細胞數量，使用hoechst 33342核酸染劑。 使用5 μg/ml之hoechst 33342 (Invitrogen＃Cat.H1399)將細胞染色，沖洗3次，並在380 nm之激發波長及460 nm之發射波長下測量螢光。此染料可藉由螢光顯微術確定敏銳的細胞數量。
在暴露於150 mM葡萄糖濃度之後，葡萄糖處理導致54%的神經元死亡率，且除了最高濃度(50 μM)之外，所有濃度的亞甲基藍共培育可以以劑量依賴之方式預防葡萄糖所引發之死亡率。再者，除了葡萄糖之外，亦觀察到該化合物的最高濃度引發死亡率進一步增加(圖2及表1)。 表1：HOECHST分析之數據。數值代表在每種條件下之平均值(三重複平均值)。
DAPI 使用Hoechst之細胞存活率 平均值 標準差   對照組的平均值% 標準差
對照組 223 224 218 221.666667 3.21455025 對照組 100 1.4545476
葡萄糖 (單獨) 125 104 81 103.333333 22.0075745 葡萄糖 (單獨) 46.7571644 9.9581784
MB 0.0005　μM (與葡萄糖) 187 236 242 221.666667 30.1717307 MB 0.0005　μM (與葡萄糖) 100.301659 13.652366
MB 0.005　μM (與葡萄糖) 255 290 218 254.333333 36.0046293 MB 0.005　μM (與葡萄糖) 115.082956 16.291687
MB 0.05　μM (與葡萄糖) 270 253 241 254.666667 14.571662 MB 0.05　μM (與葡萄糖) 115.233786 6.5935122
MB 0.5　μM (與葡萄糖) 234 217 273 241.333333 28.7112057 MB 0.5　μM (與葡萄糖) 109.200603 12.991495
MB 5 μM (與葡萄糖) 168 103 157 142.666667 34.7898453 MB 5 μM (與葡萄糖) 64.5550528 15.742011
MB 50 μM (與葡萄糖) 74 69 62 68.3333333 6.02771377 MB 50 μM (與葡萄糖) 30.9200603 2.7274723
在測試其餘濃度時觀察到不同等級的神經保護作用，因此，補充亞甲基藍可顯著地降低細胞死亡並改善神經元及神經突起之存活。
2. WST-8測定法：為了偵測存活的細胞，將10 μl的CCK-8試劑(WST-8)添加至每個孔，並在37ºC下培育該盤。1小時後，使用Synergy II微量盤式分析儀在450 nm下測量吸光度。
在暴露之後，當使用WST8測量時，葡萄糖處理導致DRGs的存活率降低22%，但是該化合物無法預防葡萄糖所引發之存活率降低(圖5)。除了葡萄糖之外，亦觀察到該化合物的最高濃度(50 μM)引發存活率降低。
3. β-III微管蛋白染色：β-III微管蛋白染色係藉由免疫組織化學(Immunohistochemistry, IHQ)所測定。使用PBS (Sigma Aldrich＃Cat.D8537)沖洗細胞並使用甲醇固定10分鐘。在固定步驟之後使用PBS沖洗該等樣品3次並使用PBS + 0.3% triton通透化10分鐘。然後使用PBS + 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumine, BSA)阻斷該等樣品30分鐘，且最後抗-β微管蛋白III抗體(Abcam＃Cat.ab7751)在室溫下以1/1000被添加至PBS + 0.5% BSA中60分鐘。在3個沖洗步驟之後，次級抗體抗-山羊-抗小鼠Alexa 633 (Abcam＃Cat.A21050)以1/100被添加60分鐘以與該初級抗體反應。然後沖洗該等樣品3次並在自動螢光顯微鏡下測量。為了研究神經突延伸(neurite extension)之角色，本研究主要採用2種幾何模式：總神經突長度(從一神經元體之路徑的總長度)，以及末端數量(number of extremities) (每個神經元之終端神經突段的數量)。
在該測定法結束時，為了測量存活的細胞，首先使用WST-8將細胞染色1小時然後使用甲醇固定以進行β-III微管蛋白染色並使用BD Pathway 855再次成像。為了獲得足夠的細胞以進行分析，每孔成像了9個視野。使用20x物鏡收集不同螢光通道之圖像。激發染料並使用合適的濾光片設置以在激發及發射波長下監測其螢光。在該程序之設置中，調整曝光時間以避免在不同探針之間的重疊發射。使用一允許同時定量次細胞結構之模組分析經收集之圖像，使用不同的分子探針將該等次細胞結構染色以測量與預定義之細胞核區室與細胞質區室相關的螢光強度。
為了研究神經突延伸之角色，本研究主要採用2種幾何模式；每個神經元之神經突總長度以及每個神經元之末端數。相較於未經處理之細胞，葡萄糖處理導致神經突總長度及神經突末端數分別降低38%及31%，且另一方面，0.05　μM濃度之亞甲基藍可以重建葡萄糖所引發之受影響的神經突生長(圖3、圖4、表2及表3)。因此，補充亞甲基藍可顯著地增加神經突生長並改善神經元之存活率。 表2：每個神經元之末端數之數據。數值代表在每種條件下之平均值(三重複平均值)。
  末端數 平均值 標準差   對照組的平均值% 標準差
對照組 1.14349776 1.28125 1.31192661 1.24555812 0.08970787 對照組 100 7.2345056
葡萄糖 (單獨) 0.82 0.9862069 0.78181818 0.86267503 0.10867178 葡萄糖 (單獨) 69.5705666 8.76385297
MB 0.0005　μM (與葡萄糖) 1.05839416 0.86129032 0.97836257 0.96601569 0.09913029 MB 0.0005　μM (與葡萄糖) 77.9044908 7.99437846
MB 0.005　μM (與葡萄糖) 0.86451613 1.18965517 1.00503145 1.01973425 0.16306741 MB 0.005　μM (與葡萄糖) 82.236633 13.1505972
MB 0.05　μM (與葡萄糖) 1.34468085 1.05940594 1.14076246 1.18161642 0.14695995 MB 0.05　μM (與葡萄糖) 95.2916466 11.8516091
MB 0.5　μM (與葡萄糖) 0.65671642 0.85520505 0.77838828 0.76343658 0.10008546 MB 0.5　μM (與葡萄糖) 61.5674662 8.07140792
MB 5 μM (與葡萄糖) 0.85588235 0.53694581 0.57770701 0.65684506 0.17357204 MB 5 μM (與葡萄糖) 52.9713756 13.997745
MB 50 μM (與葡萄糖) 0.28333333 0.23448276 0.2625 0.26010536 0.02451317 MB 50 μM (與葡萄糖) 20.976239 1.97686833
表3：總長度分析之數據。數值代表在每種條件下之平均值(三重複平均值)。
  總長度 平均值 標準差   對照組的平均值% 標準差
對照組 65.9581897 71.3820715 74.911945 70.7507354 4.51014107 對照組 100 6.3747577
葡萄糖 (單獨) 42.9495352 52.9692737 37.5623844 44.4937311 7.81866133 葡萄糖 (單獨) 62.8886659 11.0511114
MB 0.0005　μM (與葡萄糖) 50.9571179 40.1309287 59.35768 50.1485755 9.63884317 MB 0.0005　μM (與葡萄糖) 70.8813789 13.6238066
MB 0.005　μM (與葡萄糖) 45.834792 61.1928946 50.5044719 52.5107195 7.87315701 MB 0.005　μM (與葡萄糖) 74.2200982 11.1281371
MB 0.05　μM (與葡萄糖) 62.9112639 50.3896069 69.8008052 61.033892 9.84083578 MB 0.05　μM (與葡萄糖) 86.2669852 13.9093085
MB 0.5　μM (與葡萄糖) 37.3358324 47.7689148 34.0662692 39.7236721 7.15660239 MB 0.5　μM (與葡萄糖) 56.146533 10.1153391
MB 5 μM (與葡萄糖) 53.6118527 42.2031616 32.2964971 42.7038371 10.6664944 MB 5 μM (與葡萄糖) 60.3587804 15.0763172
MB 50 μM (與葡萄糖) 18.1810885 12.6422943 17.4525766 16.0919865 3.00964523 MB 50 μM (與葡萄糖) 22.7448572 4.25391551
除了葡萄糖之外，亦觀察到該化合物的最高濃度(5及50 μM)引發神經突生長降低。
對於所有被研究之參數，與未經處理之培養物相比，螢光強度或相應之形態參數至少有20%之變異。為了比較亞甲基藍的神經保護程度，根據與對照組細胞相比之變異水平建立4個不同的神經保護分數：0 (無神經保護或低於20%之變異)、1 (20-40%之變異)、2 (40-60%之變異)、3 (60-100%之變異)、4 (100-200%之變異)。再者，某些濃度會造成一定程度之傷害，可能係因為其具有毒性，或可能係因為其與葡萄糖結合時具有毒性，並根據與經葡萄糖處理之細胞相比之變異水平建立類似的傷害分數：-1 (20-40%之變異)、-2 (40-60%之變異)及-3 (40-60%之變異)。每個單獨分數之總和係每種化合物之神經保護總水平，並定義為其神經保護程度。由此計算可建立神經保護等級：高(＞ 6)、中(4-5)、低(1-3)及無神經保護(0)。
為了比較該經測試之化合物在不同濃度下的神經保護程度，根據變化之水平(在材料及方法部分中已描述群組形成標準)創造不同的分數，然後指派一數值給每個參數。計算每個參數及經測試之濃度的所有數值的總和，並根據其神經保護水平創造4個不同的群組。 由此分析可定義所研究之每種化合物的神經保護程度(表4)。 表4。亞甲基藍之神經保護程度，在分析每種濃度在經葡萄糖處理之DRGs中的數據之後。神經保護之分數係如在材料及方法中所述被建立。以紅色顯示之方框代表毒性。
  0.0005 µM 0.005 µM 0.05 µM 0.5 µM 5 µM 50 µM
HOECHST 3 3 3 3 1 -1
末端數 0 0 1 0 -1 -3
總長度 0 0 1 0 0 -1
WST8 0 0 0 0 0 -1
總 3 3 5 3 0 -6
神經保護程度 低 低 中 低 無 有毒性
簡言之，亞甲基藍在0.05 μM時可達到中神經保護作用，在0.0005 μM、0.005 μM及0.5 μM時具有低神經保護作用，在5 μM時無神經保護作用，在50 μM時具有毒性。
亞甲基藍之神經保護效應係如以下表5所示： 表5：在150 mM葡萄糖攻擊之前不同濃度之亞甲基藍所提供之神經保護程度的分類
  0.0005 μM 0.005 μM 0.05 μM 0.5 μM 5 μM 50 μM
神經保護程度 低 低 中 低 無 無毒性
根據所有被研究之參數，亞甲基藍在0.0005 μM至0.5 μM濃度下對於葡萄糖所引發之DRGs毒性具有一些神經保護作用，且在0.05 μM濃度下對於葡萄糖所引發之DRGs毒性具有中神經保護作用。
在本研究中，葡萄糖毒性導致神經突生長及細胞數量及存活率降低。亞甲基藍對於葡萄糖毒性的預防作用係與增加細胞存活率及恢復神經突生長有關。考慮到所有被研究之參數，補充0.05 μM亞甲基藍可達到中神經保護水平。
實施例2：在人類眼睛中測試局部亞甲基藍製劑耐受性(體內)
為了確定可用於人類眼睛之亞甲基藍局部製劑的濃度，包括且高達0.005% (160µM)，製備並測試一系列局部眼用製劑濃度。將亞甲基藍化合物(Bleu de Methylene 1%, STEROP)溶解於無菌潤滑眼用凝膠(Systane Gel Drop)中使其體積為10 mls，最終最高濃度為160 µM。將該等局部製劑之濃度調整為0.05 μM，0.5 μM，5 μM，50 μM，60 μM，150 μM及160 μM。使用該潤滑眼用凝膠(Systane Gel Drop)增加該等眼藥水之黏度。每日一次將一滴每種局部製劑施用於每個人類眼睛。在施用之後立即以及在施用之後6小時及24小時使用標準驗光掃描檢查眼睛，在所有時間點均未顯示不良影響。
在所有該等局部製劑中，包括在150µM及以下，觀察到眼睛對於亞甲基藍局部製劑完全耐受，不會造成任何損傷或不適。高於150µM時，其會給眼睛帶來輕微的刺痛感，造成暫時的輕微不適，其係自我限制本質。此凝膠狀局部製劑之黏度允許該等局部製劑停留在眼睛內，而不會從眼皮流下至臉上。此「不滴落(non drip)」效果係非常理想的。
實施例3：局部製劑之形成
製劑A
將亞甲基藍化合物(Tocris)溶解於無菌水中使其最終濃度為10 mM。在含有碳酸氫鈉及氯化鈉之10 mM HEPES緩衝劑中，將該測試化合物之濃度調整為0.05 μM、0.5 μM、5 μM、50 μM或100 μM。
製劑B
首先將低醯基結蘭膠(Kelco gel CG LA, Azelis, UK)溶解於去離子水中以產生液體凝膠。在室溫下將結蘭粉末以正確比率添加至去離子水中以產生1% (w/v)溶液。該溶膠在配備有磁力攪拌器之加熱板上在攪動下被加熱至70°C，直到所有聚合物溶解。一旦溶解，將結蘭溶膠添加至一配備有杯及葉片幾何構造(杯：35 mm直徑，葉片：28 mm直徑)之旋轉式流變儀的杯中。然後將該系統冷卻至40°C。將亞甲基藍化合物(Tocris)溶解於無菌水中使其最終濃度為10 mM。在磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline, PBS) (4.76 mg/ml)及水性氯化鈉(0.2 M)中，將該測試化合物之濃度調整為0.05 μM、0.5 μM、5 μM、50 μM或100 μM。此後，在剪切(450/s)下以1°C/min之速率將該混合物冷卻至20°C之最終溫度。然後將該樣品取出並在4°C下儲存直至進一步使用。在液體凝膠不具有亞甲基藍化合物的情況下，調整比率使得最終眼藥水具有0.9% (w/v)結蘭、10 mM NaCl之組成物。
製劑C
PLGA之囊封需要一在去離子水中具有高溶解度之化合物。因此測試MTC之溶解度。將20 ml的溶劑放置於玻璃小瓶及磁力攪拌器中。添加88.0%純度之亞甲基藍(Merck)直到飽和點或超過飽和點。進行攪拌一段時間，其對於88.0%純度之亞甲基藍(Merck)的緩慢溶解係必要的。測量88.0%純度之亞甲基藍(Merck)的量以獲得88.0%純度之亞甲基藍(Merck)在特定溶劑中的溶解度。
88.0%純度之亞甲基藍(Merck)在以下溶劑中的溶解度結果：
去離子水：41.432 mg/ml
二氯甲烷(Dichloromethane, DCM)：＜ 0.1 mg/ml
乙腈(Acetonitrile, ACN)：0.5675 mg/ml
亞甲基藍的溶解度結果表明與該PLGA載體之初期不相容性，但最終結果出乎意料地成功。
囊封
微球之產生係如下在3種情況下進行3次獨立運行。亞甲基藍的情況係獨特的；該染料具有明顯的顏色，且可以目視檢查以確認亞甲基藍被裝載至該等PLGA微球中。進行3次生產運行以優化亞甲基藍被裝載至該等微球中的裝載效率。
使用一玻璃毛細管微液體裝置產生水包油乳劑。使用一方形及圓形毛細管組裝軸對稱共軸玻璃毛細管流動聚焦裝置。使用氧電漿處理(100瓦特)120秒使圓形毛細管之表面為親水化。藉由將PVA (1% w/v)混合於水中而製備水性連續相(W)。分散相(O)係使用88.0%純度之亞甲基藍(Merck)進行。分別使用88.0%純度之亞甲基藍(Merck)的以下濃度之一：i) 0.5 µM，ii) 50 µM，150µM。在所有3種情況下，二氯甲烷(DCM)中的PLGA濃度(50 mg/mL)被保持恆定。使用注射泵(Harvard PHD 22/2000系列)分別以每分鐘150及50 μL之流速將W相及O相從該方形毛細管之兩端注入通過外共軸區域。該等液體係水動力地(hydro-dynamically)集中流過該圓形毛細管之噴嘴，導致乳劑液滴之形成。使用6 cm ID玻璃孔收集樣品。將大約300 μL的O/W乳劑直接地分配至一含有連續相之預分配膜(3 mL)的玻璃孔中，以預防液滴凝聚。在室溫(24°C)下進行溶劑蒸發。收集均勻的微球以囊封亞甲基藍並使用顯微鏡成像確認。
該等微球之表徵
為了最大化PLGA微球之性能，微球尺寸之範圍最佳為10-25 μm。 藉由使用ImageJ軟體測量100個微球並報告平均值及標準偏差進行表徵。
結果
由每次生產運行所製造之微球的尺寸如下：
運行1：25.45 ± 1.13 µm
運行2：20.46 ± 1.12 µm
運行3：16.69 ± 0.74 µm
每次運行之顯微照片係如圖6、圖7及圖8所示。運行2及運行3符合合格準則。
實施例4：製劑C之釋放曲線
由上述運行2所製造之5　mg的乾燥微球被用於一7天釋放研究。測量以下時間點以評估釋放曲線：0、3、6、9、12、24、48、72、96、120、144及168小時。
亦測量該等乾燥微球的一小部分樣品以評估亞甲基藍的裝載量。
使用HPLC以確定每個樣品中的濃度。
結果
在運行2中所產生之微球釋放亞甲基藍7天的結果如下： 表6：在7天內從運行2所產生之PLGA微球所釋放之亞甲基藍的質量。
時間 (h) 經釋放之亞甲基藍 (μg) 累積釋放 (%)
0 0.086 1.92
3 0.611 13.55
6 0.955 21.20
9 1.215 26.97
12 1.453 32.25
24 2.075 46.06
48 2.907 64.52
72 3.530 78.32
96 3.885 86.20
120 4.226 93.77
144 4.369 96.95
168 4.506 100.00
已達成在PLGA微球目標尺寸範圍內具有亞甲基藍囊封之成功的微球生產。該顯示亞甲基藍之穩定釋放的7天釋放研究證實該等結果。微球係塗覆有一黏膜黏著劑塗層。
該囊封導致在該等生產運行中大量的亞甲基藍被裝載至該等PLGA微球中。其已使用HPLC確認。該等釋放曲線係描繪於表6及圖9中。
實施例5：眼睛之周邊神經損傷的體內預防及/或治療。
將亞甲基藍化合物(Tocris)溶解於無菌水中使其最終濃度為10 mM。在含有碳酸氫鈉及氯化鈉之10 mM HEPES緩衝劑中，將該測試化合物之濃度調整為0.05 μM、0.5 μM、5 μM、50 μM或100 μM (製劑A)。一未經處理之群組僅包含含有碳酸氫鈉及氯化鈉之10 mM HEPES緩衝劑。製備該相同測試溶液的第二群組，並使用5 g/l結蘭膠調整增加該黏度(製劑B)。製備該相同測試溶液的第三群組，並使用一緩慢釋放之微粒調整增加該黏度(製劑C)。
每日1次持續2週將該等溶液滴入糖尿病小鼠的眼中。使用一經改良之海德堡視網膜斷層掃描儀羅斯托克角膜模組(Heidelberg Retina Tomograph Rostock Corneal Module)進行體內共軛焦顯微術。在掃描之前，單次注射50 mg/kg***(ketamine)及5 mg/kg甲苯噻嗪(xylazine)以及一滴局部丙美卡因(proparacaine) 0.5%眼用溶液(Bausch & Lomb, Tampa, FL)以麻醉小鼠。使用Refresh Plus (Allergan, Irvine, CA)以在對側眼維持潤滑。為了增強上皮的觀看效果，在TomoCap (Heidelberg, Germany)的外邊緣放置一矽墊圈以在TomoCap尖端與上皮表面之間產生一薄層的空間。17該墊圈的尺寸如下：1.2-cm外徑，3-mm內徑，及600-mm厚度 (Specialty Silicone Products, Inc., Ballston Spa, NY)。如前所述進行圖像收集。17以1-mm之增加步驟在每秒30 mm之透鏡速度下掃描角膜。每個角膜最少進行3次掃描。
該經重複之處理係預計以劑量依賴之方式增加該局部亞甲基藍眼用製劑之效應，且在5 μM，50 μM及100 μM下之溶液的黏度增加係預計可增加該亞甲基藍眼用溶液之效應。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者應進一步理解，可組合上述特徵之變化及組合，並非替代例或替代物，以形成落在本發明之範疇內的其他進一步實施態樣。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者可理解，每個實施態樣可以與其他實施態樣或一些實施態樣結合使用。
圖式簡單說明
在僅透過實例方式闡明的圖式中，本發明之實施態樣包括，
圖1. 測試時間表之示意圖。
圖2. 在葡萄糖毒性條件下在經亞甲基藍處理之細胞中藉由hoechst 33342核酸染色之細胞存活率。在使用150 mM葡萄糖1小時之前以亞甲基藍處理DRGs，並在48小時之後進行HTS測定法。
圖3. 在葡萄糖毒性條件下在經亞甲基藍處理之細胞中藉由β III微管蛋白染色之每個神經元的末端數目。在使用150 mM葡萄糖1小時之前以亞甲基藍處理DRGs，並在48小時之後進行HTS測定法。
圖4. 在葡萄糖毒性條件下在經亞甲基藍處理之細胞中藉由β III微管蛋白染色之每個神經元的總長度。在使用150 mM葡萄糖1小時之前以亞甲基藍處理DRGs，並在48小時之後進行HTS測定法。
圖5. 在葡萄糖毒性條件下在經亞甲基藍處理之細胞中藉由WST8染色之細胞存活率。在使用150 mM葡萄糖1小時之前以亞甲基藍處理DRGs，並在48小時之後進行HTS測定法。
圖6. 在運行1中所製造之微球的樣品顯微鏡圖像(40x放大率)。
圖7. 在運行2中所製造之微球的樣品顯微鏡圖像(40x放大率)。
圖8. 在運行3中所製造之微球的樣品顯微鏡圖像(40x放大率)。
圖9.  從運行2所產生之5 mg樣品之囊封有亞甲基藍之微球的7天釋放曲線(release profile)。

Claims (38)

  1. 一種用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之局部製劑，其包含一有效量的二胺基吩噻嗪(diaminophenothiazine)化合物或式I的互變異構體：
    Figure 03_image002
    其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’係獨立地為氫、甲基或乙基。
  2. 如請求項1之局部製劑，其中該二胺基吩噻嗪化合物包含3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物(3,7-bis(dimethylamino) phenothiazin-5-ium chloride)。
  3. 如請求項1之局部製劑，其中該二胺基吩噻嗪化合物包含少於或等於150 μM之3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
  4. 如請求項2之局部製劑，其中該局部製劑包含在0.0001 µM與60 µM之間的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
  5. 如請求項2之局部製劑，其中該局部製劑包含0.0005 µM、0.005 µM、0.05µM、0.5 µM、5 µM、50 µM或100 µM的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
  6. 如請求項1至5中任一項之局部製劑，其進一步包含一生理緩衝劑。
  7. 如請求項6之局部製劑，其中該生理緩衝劑包含碳酸氫鈉及氯化鈉。
  8. 如請求項6之局部製劑，其中該生理緩衝劑包含4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)。
  9. 如請求項6至8中任一項之局部製劑，其中該生理緩衝劑包含一神經基礎培養基。
  10. 如請求項1至9中任一項之局部製劑，其中該局部製劑包含一載體-介質。
  11. 如請求項10之局部製劑，其中該載體-介質調整該局部製劑之黏度至每秒約15至150毫帕斯卡的範圍。
  12. 如請求項10或11之局部製劑，其中該載體-介質調節該二胺基吩噻嗪化合物的釋放曲線(release profile)。
  13. 如請求項10至12中任一項之局部製劑，其中該載體-介質包含一微粒。
  14. 如請求項13之局部製劑，其中該有效量的二胺基吩噻嗪化合物包含預裝載在該微粒中的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
  15. 如請求項13或14之局部製劑，其中該微粒係塗覆有一諸如幾丁聚醣之黏膜黏著劑。
  16. 如請求項1至15中任一項之局部製劑，其供用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症。
  17. 如請求項16之局部製劑，其中該周邊神經損傷包含神經營養性角膜病變。
  18. 如請求項16之局部製劑，其中該用途係用於眼科用途。
  19. 一種預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之方法，其包含對一需要預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之受試者投予 (a)    一有效量的二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體
    Figure 03_image002
    其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及 R4 ’係獨立地為氫、甲基或乙基；或者 (b)    一如請求項1至13中任一項之局部製劑，或者 (c)    一局部製劑，其包含一有效量的二胺基吩噻嗪化合物或式I的互變異構體；以及一載體-介質。
  20. 如請求項19之方法，其中該局部製劑係一眼用局部製劑。
  21. 如請求項19之方法，其中該局部製劑被直接地投予至神經部位。
  22. 如請求項19至21中任一項之方法，其中角膜神經之參數被測量以在投予該局部製劑之前確定該受試者是否需要預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症。
  23. 如請求項19至22中任一項之方法，其中角膜神經之參數係在投予該局部製劑之前及之後被測量。
  24. 如請求項19至23中任一項之方法，其中該周邊神經損傷及其相關病症包含神經營養性角膜病變。
  25. 一種式I化合物在製備一如請求項1至15中任一項之局部製劑中的用途，其用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症。
  26. 如請求項25之用途，其中該周邊神經損傷及其相關病症包含神經營養性角膜病變。
  27. 如請求項25或26之用途，其用於眼科用途。
  28. 一種用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之局部製劑，其包含少於或等於150 μM之3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物以及一用於調節該製劑之黏度至每秒約15至150毫帕斯卡之範圍的載體-介質。
  29. 如請求項28之局部製劑，其中該載體-介質調節3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物的釋放曲線。
  30. 如請求項28或29之局部製劑，其中該載體-介質包含一微粒。
  31. 如請求項28或29之局部製劑，其中該載體-介質包含一凝膠。
  32. 如請求項28或29之局部製劑，其中該載體-介質包含係一持續釋放平台。
  33. 如請求項28至32中任一項之局部製劑，其進一步包含一或多種額外的化合物。
  34. 一種套組，其包含a) 一局部組成物，其包含一有效量的3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物，以及b) 一容器，其用於容納所述供用於預防及/或治療周邊神經損傷及其相關病症之方法的組成物。
  35. 如請求項34之套組，其中該容器被配置成容納一定量的所述局部組成物，其支持一治療至少1、7、14、21或30天。
  36. 一種調配一局部組成物之方法，其包含： a.       將3,7-雙(二甲基胺基)吩噻嗪-5-鎓氯化物囊封於一微粒中或任何其他能夠具有緩慢釋放曲線之載體-介質中。
  37. 如請求項36之方法，其中該載體-介質能夠承載一種以上之化合物。
  38. 如請求項16或28之局部製劑、如請求項19之方法、如請求項25之用途、如請求項34之套組，其用於醫學或獸醫學用途。
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