TW202107981A - 低溫生長性經改良之細胞質雄性不稔萵苣（Ｌａｃｔｕｃａ）屬植物 - Google Patents

低溫生長性經改良之細胞質雄性不稔萵苣（Ｌａｃｔｕｃａ）屬植物 Download PDF

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Abstract

本發明課題在於提供一種可改善習知CMS萵苣( Lactuca)屬植物所顯現之低溫下的生長性不良，而具有低溫生長性的CMS萵苣(Lactuca)屬植物。 本發明係有關於一種細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其具有與具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物同等的低溫生長性。

Description

低溫生長性經改良之細胞質雄性不稔萵苣（Ｌａｃｔｕｃａ）屬植物
本發明係有關於一種低溫生長性經改良之細胞質雄性不稔萵苣屬植物。
植物品種有固定種與雜種第一代(以下記述為「F1」)品種，在主要作物中，F1品種較為普及。F1品種有因雜交強勢(雜交優勢，heterosis)而生長旺盛、生長快速且產量性提高等顯著的優點。而且，F1品種因生長旺盛而可望提升對病蟲害的耐性及耐寒/耐熱性等的環境適應性。 此外，由於F1品種之基因型雖為異質體但為相同的基因型，其表現型顯示極高的均等性。因此，可提高生產物的市場性。再者，由於F1品種的雙親可集合顯性基因占優勢的有用性狀，而能夠迅速地育種。
由於具有如以上之優越性，F1品種在主要作物中漸為栽培品種之主流。
進行F1品種的採集時，一般而言雙親係選用自交受孕(近交)系統，且於雜交強勢效果較大的組合等當中選定種子親與花粉親。
為了防止自體受精，種子親需進行去雄，而透過人手進行去雄則需耗費極大的勞力。因此，若將屬先天雄性不稔性的細胞質雄性不稔(Cytoplasmic Male Sterility(以下記為「CMS」))系統使用於種子親，則不需要透過人手進行去雄之作業，而能夠經濟且大量地生產F1種子。利用CMS之F1種子的生產已於向日葵、甜菜、馬鈴薯、小麥、胡蘿蔔、洋蔥、蔥、高麗菜、青花菜、白蘿蔔及白菜等當中確立其商業生產系統。
在萵苣(Lactuca)屬植物中，不存在近親具有CMS之植物種。因此，有人透過以關係極為遙遠的向日葵之CMS作為素材，利用非對稱細胞融合技術將CMS導入萵苣(Lactuca)屬植物中，而開發出世界首創的CMS萵苣(Lactuca)屬植物(專利文獻1)。此外，此習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物既經國際寄存。習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物其雄性不稔性之穩定性極高，不需要透過人手進行去雄，而能夠有效地採集F1種子。
在利用CMS的F1育種時，重要的是表現雄性不稔性之細胞質盡可能地不對雄性不稔性以外的性狀造成影響。
例如以玉米而言，有人培育導入有T型雄性不稔細胞質的F1品種，但於1970年出現胡麻葉枯病菌之T菌種，由於T型雄性不稔細胞質會特異性地因此病原菌而患病，而受到極大的打擊。因此，T型雄性不稔細胞質的利用隨即中止，而被迫返回習知的人工去雄法(非專利文獻1)。
此外，矮牽牛之CMS自古以來已為人所熟知，其起源基因之S-pcf係作為研究材料而經常被利用。然而，利用此CMS的F1品種由於會引起開花延遲或花蕾停止發育等，目前幾乎未利用(非專利文獻1)。
就白蘿蔔之CMS，一般最常利用的是秋葵CMS。然而，由於種內存在稔性恢復基因，在某些育種系統中有不易導入CMS的問題。其後，就白蘿蔔而言，有人開發出CMS之因子不同的新型NWB-CMS，而提升CMS的導入率(專利文獻2)。再者，以白蘿蔔而言，亦有人開發出可生產少量的不稔花粉，而改善花粉媒介昆蟲的引誘效率的新穎CMS(專利文獻3)。此等新穎白蘿蔔CMS係以白蘿蔔之野生種作為素材，藉由連續回交法所開發出來者。
如此等實例，即使早已發現出CMS，但仍有該CMS伴有不良性狀或引起稔性回復的情形，而有不易利用CMS或其利用有限的情形。
然而，由於CMS的利用價值依然極高，在不易利用既有的CMS時，有人便探尋CMS的新穎素材，而上述案例般開發出缺點經改良之CMS。
前述專利文獻1所記載之習知CMS萵苣( Lactuca)屬植物(系統名「50125-3-V1」)在適溫條件(20℃)下之發芽後的生長性係與具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物同等。然而，在專利文獻1的記載當時雖仍未闡明，惟習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物，根據其後之研究已判明低溫生長性可能較差。由於發芽後之生長性的優劣也會大幅影響之後的種苗之品質，故為極為重要的農業特徵。從而，若可開發出低溫生長性經改良之CMS萵苣，則可進一步擴大其適用範圍，而能夠大幅提高產業上有用性。
專利文獻1所記載之習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物其低溫生長性可能較差，除此之外則具有極為優良的性狀。因此，有人研判開發之捷徑在於以此CMS萵苣(Lactuca)屬植物作為素材來改良低溫生長性之問題性狀。 然而，改良CMS之不良性狀的有效方法，包含所有的植物在內迄今仍無其報導實例，從而研判低溫生長性經改良之CMS萵苣的開發係極為困難。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 國際公開公報WO2007/049730號小冊 [專利文獻2] 日本專利第3964368號 [專利文獻3] 日本專利第5089764號 [非專利文獻]
[非專利文獻1] 細胞質雄性不稔暨育種技術, 1985年CMC股份有限公司出版發行 [非專利文獻2] C. RAMBAUD, A. BELLAMY, A. DUBREUCQ, J.-C. BOURQUIN, and J. VASSEUR(1997) Plant breeding Volume 116, Issue 5 p481-486“Molecular analysis of the fourth progeny of plants derived from cytoplasmic male sterile chicory cybrid”
[發明所欲解決之課題]
本發明係有鑑於如上述之習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物之低溫生長性較差的情形，而以提供一種具有低溫生長性之CMS萵苣(Lactuca)屬植物，及提供一種利用該CMS萵苣(Lactuca)屬植物之具有低溫生長性之萵苣(Lactuca)屬植物的F1種子之生產方法為其目的。 [解決課題之手段]
本案發明人等近來致力進行研究的結果發現，藉由將習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質提供親體，並將具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體來進行非對稱細胞融合(以下有稱為「非對稱回融合」)，可改良細胞質，尤為粒線體基因組，而製作出具有低溫生長性之CMS萵苣(Lactuca)屬植物，且利用該CMS萵苣(Lactuca)屬植物，而能夠有效獲得具有低溫生長性之萵苣(Lactuca)屬植物的F1種子。 本發明係基於此等見解而成者。
亦即，根據本發明，係提供以下之發明。
＜1＞ 一種細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其具有與具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物同等的低溫生長性。
＜2＞ 如前述＜1＞之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其係於粒線體基因組內具有源自向日葵(Helianthus)屬植物之粒線體基因組的DNA。
＜3＞ 如前述＜1＞或＜2＞之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其係藉由進行使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合多次而得。
＜4＞ 如前述＜1＞～＜3＞中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其係藉由進行使用既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質提供親體，並使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合而得。
＜5＞ 一種細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其係於粒線體基因組內具有源自向日葵(Helianthus)屬植物之粒線體基因組的DNA的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代， 其係藉由進行使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合多次而得，或 藉由進行使用既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質提供親體，並使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合而得。
＜6＞ 如前述＜1＞～＜5＞中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其中細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物係源自於萵苣(Lactuca sativa L.)、或萵苣(Lactuca)屬植物之種間雜交植物。
＜7＞ 一種細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其具有由寄存編號FERM BP-22373所界定之植物的粒線體基因組。 ＜8＞ 一種細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其係由寄存編號FERM BP-22373所界定。
＜9＞ 一種如前述＜1＞～＜8＞中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代之植物體的一部分。 ＜10＞ 一種如前述＜1＞～＜8＞中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代之種子。
＜11＞ 一種粒線體基因組，其係包含於如前述＜1＞～＜8＞中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代、如前述＜9＞之植物體的一部分、或如請求項10之種子。
＜12＞ 一種植物之非對稱回融合方法，其包含： 藉由非對稱細胞融合而得之植物或其後代為細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物，將其作為細胞質提供親體使用，並且， 使用於前述初次非對稱細胞融合之植物的一者為具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物，將其作為細胞質接受親體使用，來進行非對稱細胞融合1次或多次。
＜13＞ 一種方法，其係藉由如前述＜12＞之方法，來改良萵苣(Lactuca)屬植物之細胞質內的粒線體基因組。
＜14＞ 一種具有與具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物同等的低溫生長性之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代之製造方法，其包含： 進行使用既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質提供親體，並使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合。 ＜15＞ 如前述＜14＞之方法，其中細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物係源自於萵苣(Lactuca sativa L.)、或萵苣(Lactuca)屬植物之種間雜交植物。
＜16＞ 一種雜種第一代種子之製造方法，其包含將如前述＜1＞～＜8＞中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代作為種子親，並將可與該植物交配之萵苣(Lactuca)屬植物作為花粉親進行交配，而由交配後之種子親採取雜種第一代種子。 ＜17＞ 如前述＜16＞之方法，其中花粉親為萵苣( Lactuca sativa L.)、或萵苣(Lactuca)屬植物之種間雜交植物。
＜18＞ 一種雜種第一代種子、或由該種子所生長出之雜種第一代植物、其後代，或者該等植物體的一部分，其係藉由如前述＜16＞或＜17＞之方法所作出。
＜19＞ 一種具有前述有用性狀，而表現細胞質雄性不稔性之萵苣(Lactuca)屬植物之製造方法，其包含使如前述＜1＞～＜8＞中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代與具有有用性狀之萵苣(Lactuca)屬植物進行連續回交，而進行細胞質取代。 ＜20＞ 如前述＜19＞之方法，其中具有有用性狀之萵苣(Lactuca)屬植物係源自於萵苣(Lactuca sativa L.)。 [發明之效果]
根據本發明，可提供一種低溫生長性經改善之改良型CMS萵苣(Lactuca)屬植物。透過利用本發明之改良型CMS萵苣(Lactuca)屬植物，可有效地採集具有低溫生長性之萵苣(Lactuca)屬植物的F1種子。
又，根據本發明之非對稱回融合方法，可改良細胞質，尤為粒線體基因組。
[實施發明之形態]
以下就本發明詳細加以說明。
低溫生長性經改善之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物及其後代 本發明係有關於一種與以往相比低溫生長性經改善之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代。如前述，其可表現為與具有具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物同等的低溫生長性之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代。
於本說明書中，「低溫生長性」係指幼苗在低溫條件下的生長性。此處所稱低溫，係指低於萵苣(Lactuca)屬植物原本在生長上屬適當的溫度條件之狀態，除一天當中的平均氣溫偏低的情形外，亦包含僅有一天當中的一部分時間帶(例如夜間)呈低溫的情形。具體而言，當晝溫為20℃時，低溫可舉出例如夜溫低於晝溫之例如如夜溫為5～0℃的情形。 低溫生長性可藉由在同一低溫條件下栽培對象植物，量測幼苗之地上部分的重量並進行比較，另一方面與在適當的溫度條件下栽培之結果比較來定量性地評定。
於本發明中，典型上「正常細胞質」係以對顯示雄性不稔性之植物的細胞質，亦即雄性不稔細胞質未顯示不稔性而為正常之意義使用。
又，所稱「與具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物同等的低溫生長性」時的「同等」，係指以幼苗之地上部分的重量計量低溫生長性時，與具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物的值相比，對象植物的量測值處於可於25%以內(較佳為20%以內，更佳為15%以內，再更佳為10%以內)變動的範圍。從而，相對於例如「具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物」之幼苗的地上部重量值，對象植物的量測值為正常植物之值的90%的值時，係相當於前述變動為10%。「同等」並未排除超過「具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物」的低溫生長性的情形。
於本說明書中所稱「後代」，除包含採用細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物之維持系統的後代外，亦包含使本發明之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物與可和該植物交配之萵苣(Lactuca)屬植物進行交配而得的雜交種。從而，「後代」亦包含例如藉由將本發明之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物作為種子親(雌親)，並將可和該植物交配之萵苣(Lactuca)屬植物作為花粉親(雄親)進行交配而得者。又，「後代」亦包含例如本發明之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物與可和該萵苣(Lactuca)屬植物融合之植物的細胞融合所成之植物或種屬間雜交植物。
於此，「萵苣(Lactuca)屬植物」較佳為Lactuca sativa L.、L. serriola、L. aculeate、L. scarioloides、L. azerbaijanica、L. georgica、L. dregeana、L. altaica、L. saligna、L. virosa、L. tatarica、L. indica，或者L. debilis、或該等之種間雜交植物，其中，較佳為作為萵苣(Lactuca)屬植物之栽培種的L. sativa L.或萵苣(Lactuca)屬植物之種間雜交植物，更佳為L. sativa L.。
根據本發明較佳樣態，本發明之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代係於粒線體基因組內具有源自向日葵(Helianthus)屬植物之粒線體基因組的DNA。 於此，「向日葵(Helianthus)屬植物」較佳為具有源自向日葵(Helianthus)屬植物當中屬向日葵之栽培品種的Helianthus annuus L.或H. petiolaris、H. argophyllus、H. debilis、H. decapetalus、H. giganteus、H. rigidus、H. salicifolius、H. anomalus、H. bolanderi、H. exilis、H. maximiliani、H. neglectus、H. praecox，或者H. tuberosus之細胞質的H. annuus L.之細胞質取代系統。
於本說明書中，非對稱細胞融合係指在使細胞融合所使用之分離之原生質體的其中一個核基因組融合前預先使其去活化後，使用其進行細胞融合。於此非對稱細胞融合中，係將融合時使核基因組去活化，並藉由細胞融合將其細胞質提供至融合細胞者稱為細胞質提供親體。又，將融合時未使核基因組去活化而維持，並接受來自前述細胞質提供親體之細胞質者稱為細胞質接受親體。
此外，此處所稱非對稱回融合(或非對稱回細胞融合)，係指使用藉由非對稱細胞融合而得之植物或其後代作為細胞質提供親體，另一方面使用初次非對稱細胞融合所使用之植物的一者的細胞質接受親體，並進一步進行非對稱細胞融合1次以上(較佳為1次)。亦即，於非對稱回融合中，若包含初次，則進行非對稱細胞融合2次以上。
要獲得本發明之細胞質雄性不稔萵苣( Lactuca)屬植物時，在非對稱細胞融合中，作為細胞質接受親體，宜使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物。從而，根據本發明較佳樣態，本發明之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物可藉由進行使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合多次，亦即2次以上而得。或者，根據本發明其他較佳樣態，本發明之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物可藉由進行使用既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質提供親體，並使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合而得。此處所稱既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物，於本發明中係指經改良前的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物，亦即習知細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物。於本發明中，較佳的是既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物係指有改善為低溫生長性之空間者，亦即低溫生長性與具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物相比較差者。
從而，根據本發明其他樣態，本發明之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代係於粒線體基因組內具有源自向日葵(Helianthus)屬植物之粒線體基因組的DNA的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代， 其係藉由進行多次使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合而得，或 藉由進行使用既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質提供親體，並使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合而得。
根據本發明更佳樣態，本發明之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代係具有由寄存編號FERM BP-22373(後述)所界定之植物的粒線體基因組的萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，更佳為由寄存編號FERM BP-22373所界定之萵苣(Lactuca)屬植物或其後代。
根據本發明其他樣態，係提供一種植物之非對稱回融合方法。此非對稱回融合方法包含進行1次或多次使用藉由非對稱細胞融合而得之植物或其後代，與使用於前述初次非對稱細胞融合之植物的一者的非對稱細胞融合。於此，較佳的是前述藉由非對稱細胞融合而得之植物或其後代為細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物，將其作為細胞質提供親體使用，並且，使用於初次非對稱細胞融合之植物的一者為具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物，將其作為細胞質接受親體使用，來進行非對稱細胞融合。
進而根據本發明之其他樣態，係提供一種方法，其係藉由前述之非對稱回融合方法，進而來改良植物之細胞質內的粒線體基因組。
於本說明書中，細胞質雜種萵苣(Lactuca)屬植物或其後代之「植物體的一部分」係包含該植物體的1個以上之細胞或來自1個以上之細胞的細胞質，具體而言係指花、葉、莖、根等器官或組織，或者來自此等器官或組織之細胞(包含由細胞所調製之原生質體)或細胞質、或前述細胞或者細胞質之集合體。
低溫生長性經改善之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物的作出方法 本發明之改良型細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物可例如依循以下程序而作出。 (1)原生質體的調製 (i)具有正常細胞質之植物之原生質體的分離 (ii)細胞質雄性不稔植物之原生質體的分離 (2)原生質體的融合處理 (3)融合雜種細胞的培養 (4)植物體從癒合組織的再生 (5)細胞質雜種植物的選拔 (6)優良系統的選拔 (7)優良系統的連續回交 (8)細胞質雄性不稔植物的利用與F1種子的生產
此外，於本說明書中，「製造方法」亦可改稱為「作出方法」。亦即，此處所稱「作出」與「製造」之用語係以相等的意義使用。
此等各步驟，更具體而言係如以下所述。
(1)原生質體的調製 (i)具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物之原生質體的分離 於本發明中，作為細胞質接受親體(接受者)使用的萵苣(Lactuca)屬植物較佳為Lactuca sativa L.、L. serriola、L. aculeate、L. scarioloides、L. azerbaijanica、L. georgica、L. dregeana、L. altaica、L. saligna、L. virosa、L. tatarica、L. indica或者L. debilis、或該等之種間雜交植物；其中，較佳為屬萵苣(Lactuca)屬植物之栽培種的L. sativa L.。
就用以獲得原生質體之細胞組織，宜將產量性高且***活性高的葉肉組織供予測試，惟胚軸或莖、癒合組織等其他組織亦可作為材料使用。
分離出原生質體之方法可為該技術領域中所熟知之一般使用的方法(例如Matsumoto,E, Plant cell reports, 1991. vol9(10)等所記載之方法)，不特別限制 。以下示出作為具體例之程序，惟本發明未必由該等所限制。
首先，將萵苣(Lactuca)屬植物的細胞組織切細，使用原生質體分離用酵素溶液進行酵素處理而分離出原生質體。 此溶液係主要包含細胞壁分解酵素、滲透壓調整劑的無機鹽緩衝液。作為細胞壁分解酵素，只要是可使用於植物之細胞壁的分解者則不特別限制，可舉出例如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等。於本發明中，較佳為纖維素酶Y-C與離析酶(macerozyme)R-10之組合。滲透壓調整劑可使用一般的糖醇類，例如甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖等，較佳為甘露糖醇，特佳為濃度0.3M～0.7M的甘露糖醇。再者，酵素溶液中，為了穩定原生質體的膜，宜添加無機鹽，例如較佳添加下述表1所記載之組成的CPW鹽(Cocking and Peberdy, 1974)。酵素處理較佳於25～30℃進行8～20小時的靜置處理。
Figure 02_image001
將藉由酵素處理而分離的原生質體以孔徑30～100μm的尼龍網過濾，進行離心分離收集原生質體並去除酵素液。接著將原生質體懸浮於清洗液中來清洗原生質體。清洗液可使用對一般所使用之CPW鹽溶液添加作為滲透壓調整劑之糖醇類者。
其次，為了防止萵苣(Lactuca)屬植物原生質體單獨***，宜進行去活化處理。去活化處理可藉由使原生質體懸浮於溶有碘乙酸、碘乙醯胺等碘化合物的CPW鹽溶液等中來進行。於本發明中，宜懸浮於碘乙醯胺經調整為濃度5mM～30mM的CPW溶液而進行5～20分鐘的處理。
其次較佳利用離心分離重複CPW鹽溶液中的清洗操作1～3次。原生質體的懸浮液中，由於也會混入導管或細胞的碎片，因此較佳進一步藉由密度梯度離心分離法等將原生質體純化。純化所使用之試劑可舉出糖類、合成膠體等，於本發明中較佳利用蔗糖液，特佳利用15%～20%的蔗糖液。原生質體經純化後，藉由血球計算盤量測細胞密度，並使用CPW鹽溶液調整液量，以使其成為適於細胞融合的細胞密度。原生質體的細胞密度較佳為1×105 ～1×107 細胞/ml，液量的調整較佳利用CPW鹽溶液。
(ii)習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物之原生質體的分離 作為細胞質提供親體(提供者)使用的CMS萵苣( Lactuca)屬植物，只要是具有細胞質雄性不稔性者則不特別限制，較佳為具有穩定的CMS之萵苣(Lactuca)屬植物。具體而言，例如作為細胞質提供親體，較佳使用專利文獻1所記載之習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物(寄存編號FERM BP-10647)。
習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物之原生質體的分離可例如依循與上述之萵苣(Lactuca)屬植物之原生質體的分離同樣的方法來進行。
分離之習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物原生質體宜使用藉由放射線處理而使核基因去活化者。 供放射線處理用所照射之放射線可舉出X射線、γ射線、紫外線等；只要可使核基因去活化，則不特別限定。照射線量係以在可使核基因去活化的範圍內盡可能地以低照射量進行為佳。例如，於本發明中照射軟X射線時較佳為100Gy～900Gy的照射量。
(2)原生質體的融合處理 其次，將前述所得之兩種原生質體混合，而進行細胞融合。 融合方法可舉出慣用方法，例如可舉出週知之電融合法(Planta, 151, 26-32, 1981)、PEG(聚乙二醇)法(Planta, 120, 215-227, 1974)、葡聚糖法(Jap. J. Genet., 50, 235, 1975)等，但不特別限定。於本發明中，較佳採用PEG法。
(3)融合雜種細胞的培養 經融合處理所得之細胞較佳以適於源自萵苣(Lactuca)屬植物之原生質體的培養之培養基進行培養。 源自萵苣(Lactuca)屬植物之原生質體的培養方法已知有各種方法，不予限定，於本發明中，較佳使用改變專利文獻1之方法的方法。
就專利文獻1之實施例1，係藉由向日葵( Helianthus)屬原生質體與萵苣(Lactuca)屬植物原生質體的組合來進行非對稱細胞融合。另一方面，於本發明中由於為萵苣(Lactuca)屬植物原生質體彼此之組合的非對稱細胞融合，就其融合細胞的培養，透過研究最佳之植物生長調節物質的種類與濃度，可更合宜地進行培養。 作為此種最佳條件，具體而言，藉由適當組合植物生長調節物質NAA(α-Naphthaleneacetic Acid),4-CPPU(N-(2-Chloro-4-pyridyl)-N’-phenylurea),TDZ(Thidiazuron)，可有效地培養融合細胞。
(4)植物體從癒合組織的再生 進行融合細胞的培養，在細胞開始***而能以目視確認癒合組織的階段，將癒合組織移植至再分化培養基使其再分化。 再分化培養基可使用慣用品，隨材料之萵苣(Lactuca)屬植物或癒合組織的狀態的不同會有反應差異，而較佳使用例如含有0.3～1.0mg/l之4-CPPU的MS培養基等。將再生的芽體(shoot)移植至生根培養基，例如1/2濃度的MS培養基等使其生根，而使植物體再生。再生之植物體係經馴化而於溫室內生長。
(5)細胞質雜種植物的選拔 由上述程序中所再生之植物體，以及材料所使用之習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物及具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物的葉抽取出DNA。為了有效地選出細胞質雜種植物，較佳使用可特異性地擴增能區分習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物與具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物的粒線體DNA序列之標記(marker)，並藉由PCR法予以檢測出來。
此處可使用之標記，只要是可僅特異性地擴增源自習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物之粒線體DNA序列的標記則不特別限制。於本發明中，較佳為如上述使用專利文獻1所記載之習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物(寄存編號FERM BP-10647)作為細胞質提供親體，此時，可使用可特異性地擴增源自向日葵之atp6基因的標記，並藉由PCR法予以檢測出來。
細胞質雜種植物可透過使用可特異性地擴增上述粒線體DNA序列的標記並進行PCR分析，而有效地選出細胞質雜種植物。 此外，就細胞質雜種植物的選拔，可視需求適宜參考專利文獻1之手法來實施。
採用以上之PCR法的確認較佳在癒合組織之階段進行，惟亦可於其他階段，例如馴化之植物體進行。又，較佳進一步藉由流式細胞儀測定DNA含量或觀察染色體等，由此進行倍數性的檢定而選出2倍體，而預先排除高階多倍體。藉由非對稱細胞融合之粒線體基因組的重組由於係高頻率且隨機(random)地發生，因此宜作出300個體以上之2倍體的細胞質雜種植物。
(6)優良系統的選拔 使所得細胞質雜種植物生長、開花，而選出具有雄性不稔性狀，且其他器官未伴有形態異常的系統。使選出之雄性不稔個體與正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物的花粉進行交配，並採集後代種子。 此外，就優良系統的選拔，可視需求適宜參考專利文獻1之手法來實施。
其次，為了選出低溫生長性優良的系統，而於低溫條件下進行播種；就溫度條件，宜設定夜溫0～5℃、晝溫15～20℃之條件。以正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為控制組，與作出之CMS系統的低溫生長性進行比較，而選出顯示同等或更高之低溫生長性的個體。 若無法獲得顯示同等或更高之低溫生長性的個體時，宜選擇低溫生長性相對較高的個體，並再度作為非對稱細胞融合之細胞質提供親體使用。若可獲得具有與正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物同等或更高之低溫生長性的個體時，則前進至下一個連續回交步驟。
(7)優良系統的連續回交 藉由細胞融合而得之細胞質雜種植物由於呈異質( heteroplasmy)狀態，縱為回交後代，其性狀仍常參差不齊。從而，細胞質雜種的後代可能在細胞層次上性質不同，因此優良CMS系統的選拔較佳按每個個體來進行。於前述之非專利文獻2中提示，細胞質需進行5世代以上的連續回交至呈現純質(homoplasmy)的狀態為止。 從而，為了作出具有低溫生長性之CMS系統，宜重複以低溫生長性為指標之選拔與回交達5世代以上至低溫生長性呈穩定為止。
於低溫條件下獲得在系統內之低溫生長性呈穩定的CMS系統後，將該系統選定為利用於實際育種的改良CMS系統(即低溫生長性經改善之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物)。
(8)細胞質雄性不稔植物的利用與F1種子的生產 進行F1種子的採集時，一般而言雙親系統係採用自交受孕(近交)系統。其雙親系統需確定種子親與花粉親，並於雙親系統間以人工進行交配。從而，為了防止種子親的自交受孕，而需要進行去雄；而就萵苣(Lactuca)屬植物而言，由於不易由花的構造以人為方式進行去雄，因此宜利用CMS。
改良CMS系統之雄性不稔性由於會進行細胞質遺傳，因此，藉由將任意的優良萵苣(Lactuca)屬植物作為花粉親、改良CMS系統作為種子親而進行連續回交，可進行核取代，而將任意的優良萵苣(Lactuca)屬植物(即具有有用性狀之萵苣(Lactuca)屬植物)容易地CMS化。亦即，只要使用本發明中所寄存的改良CMS系統，無需使用需要熟練之技術的非對稱回融合技術，即可使可進行交配的各種萵苣(Lactuca)屬植物成為優良的CMS植物。
只要藉由連續回交，將經CMS化之任意的優良萵苣(Lactuca)屬植物作為種子親，在與任意的花粉親之間藉由人手或昆蟲進行交配，則可有效地獲得具有低溫生長性之萵苣(Lactuca)屬植物的F1種子。
藉由上述程序將萵苣F1品種化，可迅速地培育具有低溫生長性且可賦予優良性狀的萵苣品種，而得以作出生產物之均等性或環境適應性等優良且市場性高的萵苣品種。 [實施例]
根據以下實施例具體地說明本發明，惟本發明非限定於此等實施例。
實施例1：改良CMS萵苣(Lactuca)屬植物的作出 (1)原生質體的調製 (i)具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物的原生質體的分離 具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物係使用萵苣品種「STEADY」(可由TSURUTA SEED股份有限公司購入)。 首先，將經殺菌之種子鋪設於添加有蔗糖10g/l、洋菜8g/l的MS培養基中，於20℃、照光16小時下培養1個月。採取約1g之開展之本葉(true leaf,真葉)，細切成約2mm的大小後予以浸漬於包含0.4%纖維素酶Y-C，0.4%離析酶R-10，甘露糖醇的CPW鹽溶液10ml中，於25℃下靜置16小時。
將含有葉組織的酵素液以92μm的尼龍網過濾，去除細胞殘渣。將所得原生質體懸浮液移至離心管中，以800rpm進行5分鐘的離心分離。將去除上清液而得之原生質體懸浮於含有15mM的碘乙醯胺的CPW鹽溶液5ml中，於25℃培養15分鐘。培養後，將經碘乙醯胺處理之原生質體懸浮液以800rpm進行5分鐘的離心分離後，去除上清液。對原生質體懸浮液添加CPW鹽溶液10ml，以800rpm進行5分鐘的離心分離而去除上清液，重複上述操作3次來清洗原生質體。
將經清洗之原生質體懸浮液以800rpm進行5分鐘的離心分離，去除上清液並加入2ml的CPW鹽溶液而使原生質體懸浮。對新的離心管加入添加有20%之蔗糖的CPW鹽溶液5ml，使上述原生質體的懸浮液重疊於其上，並以800rpm進行5分鐘的離心分離。由於細胞殘渣會沉入離心管的底部，且經純化之原生質體會上浮至上層的CPW鹽溶液層中，因此以巴氏吸量管予以移至新的離心管。取少量懸浮液使用血球計算板求取原生質體的細胞密度，加入CPW液調製成1×106 個/ml。
(ii)習知CMS萵苣之原生質體的分離 習知CMS萵苣係使用專利文獻1所記載之系統名稱「50125-3-V1」(寄存編號FERM BP-10647)。 此外，此處「50125-3-V1」係使CMS萵苣系統「50125-3」與「V萵苣」(可由KANEKO SEEDS股份有限公司購入)進行交配所得之後代，「50125-3-V1」的種子係於2006年7月31日經國際寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)(附記有寄存者之識別用標示SSC-LET-06-001，寄存編號FERM BP-10647)(專利文獻1)。
首先，將經殺菌之種子鋪設於添加有蔗糖10g/l、洋菜8g/l的MS培養基中，於20℃、照光16小時下培養1個月。採取約1g之開展之本葉，細切成約2mm的大小後予以浸漬於包含0.4%纖維素酶Y-C，0.4%離析酶R-10，甘露糖醇的CPW鹽溶液10ml中，於25℃下靜置16小時。
將含有葉組織的酵素液以92μm的尼龍網過濾，去除細胞殘渣。以巴氏吸量管將原生質體移至塑膠培養皿中，照射900Gy的軟X射線。
將所得原生質體懸浮液移至離心管，以800 rpm進行5分鐘的離心分離，去除上清液並加入2ml的CPW鹽溶液而使原生質體懸浮。對新的離心管加入添加有20%之蔗糖的CPW鹽溶液5ml，使上述原生質體的懸浮液重疊於其上，並以800rpm進行5分鐘的離心分離。由於細胞殘渣會沉入離心管的底部，且經純化之原生質體會上浮至上層的CPW鹽溶液層中，因此以巴氏吸量管予以移至新的離心管。取少量懸浮液使用血球計算板求取原生質體的細胞密度，加入CPW液調製成1×106 個/ml。
(2)原生質體的融合處理 將經碘乙醯胺處理之萵苣原生質體懸浮液與經照射軟X射線之習知CMS萵苣原生質體懸浮液以1:3的比率混合，對9cm培養皿的底面中央滴加2ml的混合液。靜置30分鐘後，將PEG溶液(聚乙二醇#6000(nacalai tesque Inc.)500 g/l，CaCl2 ･2H2 O 1,500mg/l，KH2 PO4 100mg/l，pH5.5)3ml滴加至原生質體混合液的周邊。
1分鐘後將CPW鹽溶液3.5ml滴加至原生質體混合液的周邊。進而於2分鐘後將CPW鹽溶液3.5ml滴加至原生質體混合液的周邊。5分鐘後由培養皿的邊緣平穩地吸取滴加的液體而予以去除，並由培養皿的邊緣添加CPW鹽溶液20ml。每隔5分鐘重複此用CPW鹽溶液的清洗之操作3次。
(3)融合雜種細胞的培養 去除清洗液後，添加包含琥珀酸二鈉六水合物2.7g/l，酪蛋白胺基酸0.5g/l，NAA 0.1mg/l，4-CPPU 1.0mg/l，TDZ 0.1mg/l及0.3M蔗糖且NH4 NO3 經降低至200 mg/l之1/2濃度的MS培養基(下稱萵苣原生質體培養用培養基)10ml(pH5.8)，於25℃暗處進行培養。
自開始培養3日後，藉由混合包含4倍濃度的萵苣原生質體培養用培養基(0.3M蔗糖濃度)5ml與0.6%結蘭膠的0.3M蔗糖溶液5ml(pH5.8)，而調製半固化狀態的凝膠培養基，並於其中持續進行培養。
於開始培養10日後，將含有融合雜種細胞的培養基10ml與凝膠共同移至蔗糖濃度經改為0.15M的萵苣原生質體培養用培養基10ml中。於開始培養20日後，由於逐漸能以肉眼確認癒合組織，而將培養出來的癒合組織移植至包含0.2M蔗糖、0.3%結蘭膠的萵苣原生質體培養用培養基(固體培養基，pH5.8)中。
(4)植物體從癒合組織的再生 開始培養30日後，在癒合組織成為2mm左右的大小時，予以移植至包含4-CPPU 0.3mg/l，1.0%蔗糖，0.8%洋菜的MS培養基(pH5.8)中。
開始培養40～60日後，透過將由癒合組織再分化的芽體移植至包含1.0%蔗糖，0.8%洋菜的1/2MS培養基(pH5.8)使其生根，而使約300個體以上之細胞質雜種植物再生。
細胞質雜種植物係移植至蛭石而進行馴化，並於溫室內進行栽培。
(5)具有對習知CMS萵苣具特異性之粒線體基因的細胞質雜種植物的選拔 為了藉由PCR法檢測出對習知CMS萵苣具特異性的DNA，而由週知之鹼基序列資訊(Gene Bank註冊號 X82387.1)設計對atp6基因具特異性的引子(表2)。
以抽取出之全部基因組DNA為模板，使用引子atp6-F與atp6-R之組合來進行PCR。PCR係重複熱變性(94℃、1分鐘)、黏合(60℃、2分鐘)、延長反應(72℃、2分鐘)達35循環。 PCR產物係以1.8%瓊脂膠體進行電泳並浸漬於溴化乙錠溶液後，在UV照射下進行照片拍攝以確認有無預設大小(209bp)的擴增產物，選出確認有擴增的個體。
如以上方式，而得到低溫生長性經改善之CMS系統「BF2MS1S」。
Figure 02_image003
實施例2：改良CMS系統的詳細生長過程 使藉由實施例1所作出之CMS系統「BF2MS1S」與具正常細胞質之萵苣(品種「STEADY」)進行交配，而得到156粒之BC1(回交後代第1代)的種子。將所得之BC1種子1系統156粒播種於288孔盤，在設定為夜溫0℃、晝溫20℃的溫室中進行育苗。BC1的幼苗全體顯示高低溫生長性，但發芽略可看出參差不齊。由BC1種子156粒之發芽個體當中選出低溫生長性優良的24個系統，進行STEADY之回交，而得到BC2的種子。
將所得之BC2種子24個系統各20粒播種於200孔盤，在同條件的溫室中進行育苗。BC2的幼苗全體顯示高低溫生長性。發芽雖略可看出參差不齊，但比BC1的幼苗更獲得改善。由BC2種子480粒之發芽個體當中選出低溫生長性優良的38個系統，進行STEADY之回交，而得到BC3的種子。
將所得之BC3種子38個系統各20粒播種於200孔盤，在同條件的溫室中進行育苗。BC3的幼苗全體顯示高低溫生長性，發芽幾乎未看出參差不齊。由BC3種子760粒之發芽個體當中選出低溫生長性優良的49個系統，進行STEADY之回交，而得到BC4的種子。
將所得之BC4種子49個系統各20粒播種於200孔盤，在同條件的溫室中進行育苗。BC4的幼苗全體顯示高低溫生長性，發芽幾乎未看出參差不齊。亦即，隨著世代的發展，細胞質愈來愈純質，研判每個個體的低溫生長性的差異縮小。由BC4種子980粒之發芽個體當中選出低溫生長性優良的4個系統，進行STEADY之回交，而得到BC5的種子。
將所得之BC5種子4個系統各96粒播種於288孔盤，在同條件的溫室中進行育苗。BC5的幼苗顯示高低溫生長性，發芽亦幾乎未看出參差不齊。由BC5種子384粒之發芽個體當中選出低溫生長性優良的5個系統，進行STEADY之回交，而得到BC6的種子。
將所得之BC6種子5個系統各96粒播種於288孔盤，在同條件的溫室中進行育苗。BC6的幼苗顯示高低溫生長性，發芽亦完全未看出參差不齊。由於研判細胞質純質化，故判斷不需要隨後之多個系統的選拔。由BC6種子480粒之發芽個體當中選出低溫生長性優良的1個系統，進行STEADY之回交，而得到BC7的種子。
將所得之BC7種子1個系統96粒播種於288孔盤，在同條件的溫室中進行育苗。BC7的幼苗顯示高低溫生長性，發芽亦完全未看出參差不齊。由BC7種子96粒之發芽個體當中對低溫生長性優良的1個系統進行STEADY之回交，而得到BC8的種子。
將所得之BC8種子1個系統96粒播種於288孔盤，在同條件的溫室中進行育苗。由於BC8的幼苗其低溫生長性高，且發芽亦完全未看出參差不齊，故研判細胞質經純質化而呈穩定。由BC8種子96粒之發芽個體當中對低溫生長性優良的1個系統進行STEADY之回交，而得到BC9的種子。
此外，使由BC9的種子所生長之「BF2MS1S 」與「STEADY」進行交配所得的後代之「BF2MS1S」系統的BC10種子係於2019年2月1日經國際寄存(原寄存)於獨立行政法人 製品評定技術基礎機構 專利生物寄存中心(千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8 120號室)(附記有寄存者之識別用標示：SSC-LET-19-001，寄存編號：FERM BP-22373)。
實施例3：根據發芽試驗之改良CMS萵苣的特性的確認 為確認藉由實施例1所作出之改良CMS系統的有用性，而進行各種正常細胞質、具有CMS細胞質之萵苣的發芽試驗。 由於萵苣可能隨著採種環境的不同而導致種子品質、發芽能力產生差異，因此在本實施例所使用的所有系統係於同一環境下進行採種。又，由於萵苣的種子有可能會休眠，因此本實施例的所有發芽試驗係將播種後的育苗盤在4℃的冰箱中冷藏2日而進行確實的打破休眠後實施。
首先，確認專利文獻1所記載之習知CMS萵苣之系統「1216-2-T1」(寄存編號FERM BP-10421)，與系統「50125-3-V1」之回交後代的低溫生長性。
此外，此處「1216-2-T1」係使CMS系統「1216-2」與「TERUMI」(SAKATA股份有限公司之種子)進行交配所得之後代，「1216-2-T1」的種子係於2005年9月29日經國際寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)(附記有寄存者之識別用標示SSC-LET-05-001，寄存編號FERM BP-10421)(專利文獻1)。
將具有正常細胞質之「TERUMI」與專利文獻1所記載之CMS萵苣之「1216-2-T1」、具有正常細胞質之「V萵苣」與專利文獻1所記載之CMS萵苣之「50125-3-V1」各以64粒播種於128孔的育苗盤。對經播種之育苗盤(cell tray)在設定為夜溫0℃、晝溫20℃的溫室(靜岡縣掛川市)中進行控管。
圖1表示「TERUMI」與「1216-2-T1」於播種後第17日的發芽試驗的結果。 「1216-2-T1」與「TERUMI」相比，發芽的整齊性極差，依目視確認低溫生長性較差。
為進行定量性評定，而沿地際切除各系統之幼苗的地上部分，進行其每株之重量的比較。 結果係如表3所示。
如表3之No.1及No.2所示，「1216-2-T1」之地上部分的每株之重量，相對於「TERUMI」之地上部分的每株之重量，其重量比為25%。 由於「1216-2-T1」之核基因組與「TERUMI」相同，故研判「1216-2-T1」在低溫的生長性不良係CMS細胞質的影響。
圖2表示「V萵苣」與「50125-3-V1」於播種後第17日的發芽試驗的結果。 「50125-3-V1」與「V萵苣」相比，發芽的整齊性較差，依目視確認低溫生長性較差。
為進行定量性評定，而沿地際切除各系統之幼苗的地上部分，進行其每株之重量的比較。 結果係如表3所示。
如表3之No.3及No.4所示，「50125-3-V1」之地上部分的每株之重量，相對於「V萵苣」之地上部分的每株之重量，其重量比為55%。 由於「50125-3-V1」之核基因組與「V萵苣」相同，故研判「50125-3-V1」在低溫的生長性不良係習知CMS細胞質的影響。
如以上所述，在低溫條件下之溫室中的發芽試驗中確認，習知CMS萵苣其低溫生長性較差。
然而，由於溫室中的試驗研判容易受到自然環境的影響，因此在不會受到自然環境的影響之使用人工氣候器的人工環境下亦同樣地進行發芽試驗。
首先，專利文獻1所記載之習知CMS萵苣之「50125-3-V1」在生長適溫條件下的發芽試驗係使用人工氣候器來進行。人工氣候器的設定係設定為對萵苣的發芽、生長為適溫的固定溫度20℃、照光12小時。
圖3表示將人工氣候器設定為生長適溫條件時之「V萵苣」與「50125-3-V1」於播種後第16日的發芽試驗的結果。 於適溫條件下之「50125-3-V1」與「V萵苣」相比，依目視顯示完全不遜色的生長性。
為進行定量性評定，而沿地際切除各系統之幼苗的地上部分，進行其每株之重量的比較。 結果係如表3所示。
如表3之No.5及No.6所示，「50125-3-V1」之地上部分的每株之重量，相對於「V萵苣」之地上部分的每株之重量，其重量比為116%，於適溫條件下顯示略高於具有正常細胞質之「V萵苣」的生長性。
其次，使用人工氣候器以人工方式作出低溫條件，進行發芽試驗。 人工氣候器的設定係設定為夜溫5℃、晝溫20℃、照光12小時。由於夜溫在人工氣候器的性能上無法設定為0℃，因此將下限設定為5℃。
圖4表示將人工氣候器設定為低溫條件時之「V萵苣」與「50125-3-V1」於播種後第17日的發芽試驗的結果。 「50125-3-V1」與「V萵苣」相比，發芽的整齊性較差，依目視確認低溫生長性較差。
為進行定量性評定，而沿地際切除各系統之幼苗的地上部分，進行其每株之重量的比較。 結果係如表3所示。
如表3之No.7及No.8所示，「50125-3-V1」之地上部分的每株之重量，相對於「V萵苣」之地上部分的每株之重量，其重量比為66%。可確認「50125-3-V1」在低溫的生長性不良，在以人工氣候器所作出之低溫條件下下可予以重現。又，在使用人工氣候器的試驗中，由於晝溫為適合生長的20℃，顯然低溫的生長性不良係僅由夜溫為低溫條件所引起。
如以上所示，專利文獻1所揭示之CMS萵苣在適溫條件下雖顯示高於具有正常細胞質之「V萵苣」的生長性，但顯然在夜溫為低溫的條件下，生長性較差。亦即，在專利文獻1的申請當時係未著眼於任何習知CMS萵苣(Lactuca)屬植物在低溫條件下的生長性不良，而未予以闡明。理所當然，專利文獻1中對於此點亦未有任何記載或指示。
其次，除具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物使用「V萵苣」以外，係以與實施例1同樣的方式獲得改良CMS系統「BF2MS4V」。 「BF2MS4V」係進行非對稱細胞融合時的細胞質提供親體使用「50125-3-V1」，且細胞質接受親體使用「V萵苣」而得者。
依循實施例1所作出之改良CMS系統之「BF2MS4V」由於係以「50125-3-V1」作為細胞質提供親體並藉由非對稱細胞融合而作出者，故其核基因組係與「V萵苣」相同。
圖5表示在設定夜溫0℃、晝溫20℃之溫室環境下「V萵苣」與「BF2MS4V」於播種後第17日的發芽試驗的結果。 就「BF2MS4V」，依目視顯示與「V萵苣」同等的發芽整齊性與低溫生長性。
為進行定量性評定，而沿地際切除各系統之幼苗的地上部分，進行其每株之重量的比較。 結果係如表3所示。
如表3之No.3及No.9所示，「BF2MS4V」之地上部分的每株之重量，相對於「V萵苣」之地上部分的每株之重量，其重量比為90%。「BF2MS4V」在低溫條件下之地上部分的每株之重量，與正常細胞質之情形相比差10%左右；而由表3之No.4與No.9的比較，「BF2MS4V」相較於專利文獻1之CMS萵苣的「50125-3-V1」，地上部分的每株之重量比提升至165%。 由此結果可知，伴有低溫下的生長性較差等不良性狀的CMS萵苣，透過與具正常細胞質之萵苣進行連續非對稱細胞融合，可改良CMS細胞質。
其次，除具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物使用育種系統之「M8-039」(SAKATA股份有限公司之種子)以外，係以與實施例1同樣的方式獲得改良CMS系統「BF2MS2M」。 「BF2MS2M」係在進行非對稱細胞融合時，細胞質提供親體使用「50125-3-V1」，且細胞質接受親體使用「M8-039」而得者。
圖6表示在設定夜溫0℃、晝溫20℃之溫室環境下育種系統之「M8-039」與「BF2MS2M」於播種後第17日的發芽試驗的結果。
如圖所示，「BF2MS2M」依目視顯示與「M8-039」同等的低溫生長性。
為進行定量性評定，而沿地際切除各系統之幼苗的地上部分，進行其每株之重量的比較。 結果係如表3所示。
如表3之No.10及No.11所示，「BF2MS2M」之地上部分的每株之重量，相對於「M8-039」之地上部分的每株之重量，其重量比為93%。地上部分之每株之重量的差，與正常細胞質之情形相比僅減少7%，與專利文獻1之CMS萵苣的「1216-2-T1」減少75%、「50125-3-V1」減少45%相比，研判可大幅改良CMS細胞質。
從而，可確認即使核基因組不同時，仍可藉由非對稱回融合來改良細胞質。
其次，圖7表示設定夜溫0℃、晝溫20℃之溫室環境下「STEADY」與「BF2MS1S」於播種後第17日的發芽試驗的結果。 「BF2MS1S」的育成過程係如實施例1中詳細顯示，將「50125-3-V1」作為細胞質提供親體藉由非對稱細胞融合而作出，且進行非對稱細胞融合時的細胞質接受親體使用「STEADY」者。 依目視可看出高於「STEADY」的發芽整齊性，且低溫生長性亦同等。
為進行定量性評定，而沿地際切除各系統之幼苗的地上部分，進行其每株之重量的比較。 結果係如表3所示。 如表3之No.12及No.13所示，「BF2MS1S」之地上部分的每株之重量，相對於「STEADY」之地上部分的每株之重量，其重量比為101%。
又，亦為了在人工環境下確認「BF2MS1S」之細胞質的特性，而使用人工氣候器進行發芽試驗。人工氣候器係設定為夜溫5℃、晝溫20℃、照光12小時。之所以將夜溫與溫室同樣地設為0℃，係人工氣候器的設定下限溫度為5℃之故。
圖8表示使用人工氣候器之「STEADY」與「BF2MS1S」於播種後第17日的發芽試驗的結果。 依目視，「STEADY」與「BF2MS1S」的低溫生長性係同等。
為進行定量性評定，而沿地際切除各系統之幼苗的地上部分，進行其每株之重量的比較。
結果係如表3所示。 如表3之No.14及No.15所示，「BF2MS1S」之地上部分的每株之重量，相對於對「STEADY」之重量，其重量比為106%，在人工環境下，「BF2MS1S」的低溫生長性，相較於具有正常細胞質之「STEADY」，亦顯示同等或更高的低溫生長性。 由於「BF2MS1S」其核基因組與具有正常細胞質之「STEADY」與相同，可確認「BF2MS1S」之細胞質，就低溫生長性而言具有與正常細胞質同等或更高的能力。
如實施例2所記載，「BF2MS1S」係進行連續回交而長成BC7。 將「BF2MS1S」之BC7定植於農地(長野縣安曇野市)，進行結球期之性狀的調查。
結果係如圖9所示。 未看出與正常細胞質之「STEADY」之形態上的差異，確認「BF2MS1S」係極優良的CMS。又，在經過BC7前未發現引起稔性恢復的個體，確認CMS的性質極為穩定。
Figure 02_image005
A：重量測定個體數(育苗盤3行份) B：幼苗地上部分的每株之平均重量 C：作為地上部分重量之比較的控制組的編號 D：將各正常細胞質之幼苗地上部分的平均重量設為100%時之CMS細胞質之幼苗地上部分的平均重量的比率 N：正常細胞質 S：雄性不稔細胞質 a：在溫室(設定夜溫0℃、晝溫20℃)中實施 b：人工氣候器(夜溫20℃、晝溫20℃、照光12小時) c：人工氣候器(夜溫5℃、晝溫20℃、照光12小時)
實施例4 為分析實施例1中所作出之改良CMS萵苣「BF2MS1S 」的細胞質型，而基於週知之向日葵粒線體基因組之鹼基序列資訊(Gene Bank 註冊號 KF815390)來設計表4所示之44種引子組。 就引子而言，在可擴增基因間區域時，係優先以其部位為目標而設計標記；就其他區域，則以標記間的物理距離成為5,000～10,000bp間隔的方式進行設計。
作為待測樣品，係使用具有正常細胞質之「V萵苣」、CMS向日葵「IB5」、專利文獻1所記載之CMS萵苣之「1216-2-T1」及「50125-3-V1」，以及根據本發明所作出之改良CMS萵苣「BF2MS1S」。
由各待測樣品抽取出全部基因組DNA並以其為模板，使用表4所記載之引子組來進行PCR。PCR係重複熱變性(94℃、1分鐘)、黏合(60℃、2分鐘)、延長反應(72℃、2分鐘)達35循環。 在具有正常細胞質之「V萵苣」與CMS向日葵「IB5」之間未檢測出多型性(polymorphism)時，為了進行PCR-RFLP分析，而藉由表4所記載之限制酶對其PCR產物進行處理。此等PCR產物係以1.8%瓊脂膠體進行電泳後，浸漬於溴化乙錠溶液，在UV照射下進行照片拍攝來調查有無PCR產物及多型性。
將使用PCR法及PCR-RFLP法之細胞質的分析結果示於表5。表5中的“Ha”表示為H. annuus型，“Ls”表示為L. sativa型，“Hetero”則表示為兩種異型。“0”表示於該標記中未檢測出。 檢測出向日葵型之多型性，在44種引子組中，「 1216-2-T1」為24組(含異質體)，「50125-3-V1」為10組，「BF2MS1S」為3組。
由此結果確認，CMS萵苣之源自向日葵之粒線體的基因組區域，每當藉由非對稱細胞融合進行回融合時比例減少，確認「BF2MS1S」其大部分的粒線體基因組係重組為源自萵苣之粒線體基因組。
如以上所述，「BF2MS1S」之低溫生長性的改良，藉由採非對稱細胞融合的回融合，可殘留與CMS有關之源自向日葵之基因組區域，且其他粒線體基因組區域的大部分係取代為萵苣型，由此可消除核基因組與粒線體基因組的不親和性，研判可在維持CMS之性狀的狀態下改良低溫生長性。
惟，表5之結果係表示表現細胞質雄性不稔性之個體的分析結果的一例，低溫生長性經改良之CMS萵苣未必僅表示此種粒線體基因組之構造。
Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
(表中之記號的說明) Ha：H. annuus型 Ls：L. sativa型 Hetero：兩種異型 0：於該標記中未檢測出
[圖1] 圖係表示在設定夜溫0℃、晝溫20℃之溫室環境下具有正常細胞質之「TERUMI」(A)與具有習知CMS細胞質之「TERUMI」(B)於播種後第17日的發芽試驗結果。 [圖2] 圖係表示在設定夜溫0℃、晝溫20℃之溫室環境下具有正常細胞質之「V萵苣」(A)、具有習知CMS細胞質之「V萵苣」(B)於播種後第17日的發芽試驗結果。 [圖3] 圖係表示將人工氣候器設定為生長之適溫條件(夜溫20℃、晝溫20℃、照光12小時)時具有正常細胞質之「V萵苣」(A)與具有習知CMS細胞質之「V萵苣」(B)於播種後第16日的發芽試驗結果。 [圖4] 圖係表示將人工氣候器設定為低溫條件(夜溫5℃、晝溫20℃、照光12小時)時具有正常細胞質之「V萵苣」(A)與具有習知CMS細胞質之「V萵苣」(B)於播種後第17日的發芽試驗結果。 [圖5] 圖係表示在設定夜溫0℃、晝溫20℃之溫室環境下具有正常細胞質之「V萵苣」(A)與具有改良CMS細胞質之「V萵苣」(B)於播種後第17日的發芽試驗結果。 [圖6] 圖係表示在設定夜溫0℃、晝溫20℃之溫室環境下具有正常細胞質之「M8-039」(A)與具有改良CMS細胞質之「M8-039」(B)於播種後第17日的發芽試驗結果。 [圖7] 圖係表示在設定夜溫0℃、晝溫20℃之溫室環境下具有正常細胞質之「STEADY」(A)與具有改良CMS細胞質之「STEADY」(B)於播種後第17日的發芽試驗結果。 [圖8] 圖係表示在人工氣候器(夜溫5℃、晝溫16℃、照光12小時)低溫環境下具有正常細胞質之「STEADY」(A)與具有改良CMS細胞質之「STEADY」(B)於播種後第17日的發芽試驗結果。 [圖9] 圖係表示將具有正常細胞質之「STEADY」(A)與「BF2MS1S」(B)的BC7世代定植於農地(長野縣安曇野市)，使其生長至結球期時的情形。
國外寄存資訊 1.日本　　　　　　 ; NITE-IPOD ; 2019/02/01 ; FERM BP-22373
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Claims (20)

  1. 一種細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其具有與具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物同等的低溫生長性。
  2. 如請求項1之細胞質雄性不稔萵苣( Lactuca)屬植物或其後代，其係於粒線體基因組(mitogenome)內具有源自向日葵(Helianthus)屬植物之粒線體基因組的DNA。
  3. 如請求項1或2之細胞質雄性不稔萵苣( Lactuca)屬植物或其後代，其係藉由進行多次使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合而得。
  4. 如請求項1～3中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其係藉由進行使用既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質提供親體，並使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合而得。
  5. 一種細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其係於粒線體基因組內具有源自向日葵(Helianthus)屬植物之粒線體基因組的DNA的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代， 其係藉由進行多次使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合而得，或 藉由進行使用既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質提供親體，並使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合而得。
  6. 如請求項1～5中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其中細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物係源自於萵苣(Lactuca sativa L.)、或萵苣(Lactuca)屬植物之種間雜交植物。
  7. 一種細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其具有由寄存編號FERM BP-22373所界定之植物的粒線體基因組。
  8. 一種細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代，其係由寄存編號FERM BP-22373所界定。
  9. 一種如請求項1～8中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代之植物體的一部分。
  10. 一種如請求項1～8中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代之種子。
  11. 一種粒線體基因組，其係包含於如請求項1～8中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代、如請求項9之植物體的一部分、或如請求項10之種子。
  12. 一種植物之非對稱回融合方法，其包含： 藉由非對稱細胞融合而得之植物或其後代為細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物，將其作為細胞質提供親體使用，並且， 使用於前述初次非對稱細胞融合之植物的一者為具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物，將其作為細胞質接受親體使用，來進行非對稱細胞融合1次或多次。
  13. 一種方法，其係藉由如請求項12之方法，來改良萵苣(Lactuca)屬植物之細胞質內的粒線體基因組。
  14. 一種具有與具正常細胞質之萵苣( Lactuca)屬植物同等的低溫生長性之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代之製造方法，其包含： 進行使用既有的細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質提供親體，並使用具正常細胞質之萵苣(Lactuca)屬植物作為細胞質接受親體的非對稱細胞融合。
  15. 如請求項14之方法，其中細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物係源自於萵苣(Lactuca sativa L.)、或萵苣(Lactuca)屬植物之種間雜交植物。
  16. 一種雜種第一代種子之製造方法，其包含將如請求項1～8中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代作為種子親，並將可與該植物交配之萵苣(Lactuca)屬植物作為花粉親進行交配，而由交配後之種子親採取雜種第一代種子。
  17. 如請求項16之方法，其中花粉親為萵苣(Lactuca sativa L.)、或萵苣(Lactuca)屬植物之種間雜交植物。
  18. 一種雜種第一代種子、或由該種子所生長出之雜種第一代植物、其後代，或者該等植物體的一部分，其係藉由如請求項16或17之方法所作出。
  19. 一種具有有用性狀，而表現細胞質雄性不稔性之萵苣(Lactuca)屬植物之製造方法，其包含使如請求項1～8中任一項之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物或其後代與具有有用性狀之萵苣(Lactuca)屬植物進行連續回交，而進行細胞質取代。
  20. 如請求項19之方法，其中具有有用性狀之萵苣(Lactuca)屬植物係源自於萵苣(Lactuca sativa L.)。
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Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0731307A (ja) * 1993-07-14 1995-02-03 Sakata No Tane:Kk 雄性不稔植物の育種方法及び増殖方法
DE69507146T3 (de) * 1995-11-02 2007-05-10 Enza Zaden Beheer B.V. Zytoplasmische männliche-sterile Pflanzenzelle der Compositae Familie und Verfahren zur Herstellung der Pflanze
KR100399333B1 (en) 2002-10-10 2003-09-26 Nong Woo Bio Co Ltd Novel genotype cms radish family plant, method for producing hybrid seeds using the same, and dna marker for selecting the nwb-cms radish family plant
JP4139429B2 (ja) * 2005-10-26 2008-08-27 株式会社サカタのタネ 細胞質雑種Ｌａｃｔｕｃａ属植物およびその作出方法
FR2913304A1 (fr) * 2007-03-05 2008-09-12 Vilmorin Sa Production de graines lactuca sativa hybrides
GB2478682B (en) 2007-04-06 2012-10-24 Dongbu Hitek Co Ltd A method for producing a hybrid seed using plant of novel cytoplasmic-genic male sterility raphanus sativus line and dna markers for selecting the plant...
CN101084735A (zh) * 2007-07-06 2007-12-12 陈振志 紫色苣荬菜的育种方法

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