TW202102539A - 結合蛋白、其製備方法、其組合物、其用途、編碼其之核酸分子及包含核酸分子之宿主細胞 - Google Patents

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Abstract

提供結合IL-1β或IL-1R的雙特異性結合蛋白及檢查點蛋白，以及製備該蛋白的方法。 檢查點蛋白可以是PD-1或PD-L1。 結合蛋白可以具有包含人類Fab或scFv結構域的免疫球蛋白類結構。 提供了新穎的雙特異性抗體形式。 提供了製備結合蛋白的方法以及包含該蛋白的醫藥組合物。 結合蛋白及醫藥組合物可用於治療或預防疾病，例如癌症。

Description

針對腫瘤微環境之雙特異性連接分子及免疫檢查點蛋白
本申請提供可用於治療癌症或其他疾病的雙特異性結合分子。
免疫檢查點蛋白可作為免疫系統調節劑，並且是自我耐受機制的關鍵組成部分。抑制性免疫檢查點蛋白包括：程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）；程序性細胞死亡配體1（PD-L1）；腺苷A2A受體（A2AR）； B7-H3（CD276）;B7-H4（VTCN1），B和T淋巴細胞弱化子（Attenuator）（BTLA）；細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4，CD152）;吲哚胺2,3-二氧酶（Indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）;殺手細胞免疫球蛋白類受體（Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor, KIR）；淋巴細胞激活基因3（LAG3）; 菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH氧化酶同功型2（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NADPH oxidase isoform 2, NOX2）; T細胞免疫球蛋白結構域和黏蛋白結構域3（T-cell Immunoglobulin domain and Mucin domain 3, TIM-3）； T細胞活化的V域Ig抑製劑（V-domain Ig suppressor of T cell activation, VISTA）；唾液酸結合免疫球蛋白型凝集素7（Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin 7, SIGLEC7, CD328）;和唾液酸結合免疫球蛋白型凝集素9（SIGLEC9, CD329）。
程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）是在T細胞上表達的受體蛋白，可作為免疫檢查點。作為免疫耐受機制的一部分，PD-1的表達在活化的T細胞上被上調（upregulated）。PD-1的配體是程序性細胞死亡配體1（PD-L1），PD-L1與PD-1的結合會傳遞抑制信號，從而減少淋巴結中抗原特異性T細胞的活化和增生，並且減少調節性T細胞的細胞凋亡。腫瘤細胞通常過度表達PD-L1作為避免免疫監視（immune surveillance）的機制。通過結合配體或受體，抑制PD-1和PD-L1之間結合的單株抗體已顯示出在多種癌症的患者亞群中作為單一療法或與其他藥物聯用是有效的，然而在許多其他癌症中是無效或難以治療的（refractory）。帕博利珠單抗（Pembrolizumab）是一種人類化抗體（humanized antibody），於2014年首次獲得FDA批准，用於治療多種腫瘤細胞表達升高的PD-L1的癌症。請參照羅伯特（Robert）等人的文獻（N Engl. J Med. 372：2521-2532（2015））。保疾伏（Nivolumab）是一種完全人類化的抗體，於2014年首次獲得FDA批准，亦用於治療多種癌症。
腫瘤相關巨噬細胞（Tumor-associated macrophage, TAM）是一類大量存在於腫瘤微環境（tumor microenvironment, TME）中的免疫細胞，並與癌症相關的發炎相關。已經顯示PD-1在TAM細胞上的表達減少了腫瘤細胞的巨噬細胞吞噬作用，並賦予了腫瘤細胞「免疫性」。請參照高登（Gordon）等人的文獻（Nature 545：495（2017））。
介白素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）是一種促發炎細胞激素，與慢性和急性發炎相關，並且在多種發炎相關疾病中扮演重要角色。亦顯示出升高的IL-1β程度可將TAM細胞和骨髓來源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell, MDSC）吸收（recruit）至TME，並促進乳腺癌的腫瘤生長和轉移。請參照郭（Guo）等人的文獻（Sci. Rep. 6, 36107; doi: 10.1038/srep36107 （2016））。在其他研究中，肺損傷（lung lesion）已顯示為充滿（populated with）TAM，其促腫瘤活性（pro-tumor activity）通過NLRP3發炎小體（inflammasome）的活化和IL-1β的釋放而被上調。請參照Terlizzi等人的文獻（Oncotarget 7：58181（2016））。最後，IL-1β已顯示出可促進TAM細胞的促腫瘤表現型，並且細胞激素的程度與腎細胞癌的腫瘤大小和分期相關（Chittezhath等人，Immunity 41：815（2014））。
在缺乏IL-1β的小鼠中，較少的動物發展為腫瘤，並且腫瘤的發展較慢。請參照 Apte等人的文獻（European Journal of Cancer, 42：751（2006））。另外，顯示出肺癌風險基因型IL-1β-31TT導致IL-1β表達增加，從而提供發炎性刺激上升的微環境，並增加了肺癌風險。請參照Bhat等人的文獻（Meta Gene 2：123（2014））。IL-1受體拮抗劑通過抑制血管生成因子（如VEGF和IL-8）可抑制轉移和腫瘤增生。請參照 Konishi等人的文獻（Oncology 68：138（2005））；Kosman等人的文獻（Oncology 68：138）；Lewis等人的文獻（J.Transl. Med. 4:48（2006））。卡那單抗（Canakinumab）是一種抑制IL-1β活性的單株抗體，已被證明可以降低意外肺癌（incident lung cancer）和肺癌死亡率。請參照 Ridker等人的文獻（Lancet, 390：P1833-1842，（2017））。
工程化的雙特異性單株抗體是包含免疫球蛋白結構域（immunoglobulin domain）的非天然蛋白質，可以同時結合兩種不同類型的抗原。雙特異性抗體可以多種形式製備，並且已經用於例如癌症免疫療法和藥物傳遞。請參照下列文獻，例如，Fan等人的文獻(J.Hemat. Oncol. 8：130（2015）; Brinkmann和Kontermann的文獻（mAbs 9：182（2017））;以及Spiess等人的文獻（Molecular Immunology, 67：95-106（2015））。
本案提供了一種結合蛋白，其可以包含第一結合結構域（first binding domain）和第二結合結構域（second binding domain），其中第一結合結構域特異性結合並抑制免疫檢查點蛋白的活化，且其中第二結合結構域特異性結合並抑制IL-β或IL-1R的活性。免疫檢查點蛋白可以是例如PD-1或PD-L1。第一結合結構域與第二結合結構域可包含免疫球蛋白結合結構域，例如人類免疫球蛋白結合結構域。這些結合蛋白可以進一步包含特異性結合並抑制免疫檢查點蛋白（例如是PD-1或PD-L1）之活化的第三結合結構域，以及特異性結合並抑制IL-β或IL-1R的活性的第四結合結構域。第一結合結構域和第三結合結構域可以包含相同的互補決定區（CDR），第二結合結構域和第四結合結構域可以包含相同的CDR區。
在一實施例中，這些蛋白質的第一結合結構域可包含：a）SEQ ID NO.:1的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.:2的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.:3的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：4的輕鏈CDR1； （e）SEQ ID NO.：5的輕鏈CDR2； f）SEQ ID NO.:6的輕鏈CDR3。在結合蛋白中，第一結合結構域可包含SEQ ID NO.：37的重鏈可變區和SEQ ID NO.：38的輕鏈可變區。
在另一實施例，第一結合結構域可包含：（a）SEQ ID NO.:7的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.：8的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：9的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：10的輕鏈CDR1； （e）SEQ ID NO.：11的輕鏈CDR2；（f）SEQ ID NO.：12的輕鏈CDR3。在結合蛋白中，第一結合結構域可包含SEQ ID NO：39的重鏈可變區和SEQ ID NO.：40的輕鏈可變區。
在又一實施例中，第一結合結構域可包含：（a）SEQ ID NO.:13的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.15的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：15的重鏈CDR3； （d）SEQ ID NO.：16的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：17的輕鏈CDR2；以及（f）SEQ ID NO.：18的輕鏈CDR3。在結合蛋白中，第一結合結構域可包含SEQ ID NO：41的重鏈可變區和SEQ ID NO.：42的輕鏈可變區。
在又一實施方案中，第一結合結構域可包含（a）SEQ ID NO.：19的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.：20的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：21的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：22的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：23的輕鏈CDR2；（f）SEQ ID NO.：24的輕鏈CDR3。在結合蛋白中，第一結合結構域可包含SEQ ID NO：43的重鏈可變區和SEQ ID NO：44的輕鏈可變區。
在另一實施方案中，第一結合結構域可包含（a）SEQ ID NO.：25的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.：26的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：27的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：28的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：29的輕鏈CDR2；（f）SEQ ID NO.：30的輕鏈CDR3。在結合蛋白中，第一結合結構域可包含SEQ ID NO：45的重鏈可變區和SEQ ID NO：46的輕鏈可變區。
在又一實施例中，第一結合結構域可包含（a）SEQ ID NO：31的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.：32的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：33的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：34的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：35的輕鏈CDR2；（f）SEQ ID NO.：36的輕鏈CDR3。在結合蛋白中，第一結合結構域可包含SEQ ID NO：47的重鏈可變區和SEQ ID NO：48的輕鏈可變區。
在任何的這些結合蛋白中，第二結合結構域可包含（a）SEQ ID NO.：49的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.：50的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：51的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：52的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：53的輕鏈CDR2；（f）SEQ ID NO.：54的輕鏈CDR3。在結合蛋白中，第一結合結構域可包含SEQ ID NO：55的重鏈可變區和SEQ ID NO：56的輕鏈可變區。
本案進一步提供了結合蛋白，其中第一結合結構域是特異性結合並抑制PD-1或PD-L1活化的抗體結合結構域，並且第二結合結構域包含來自介白素-1-受體1型（IL-1R1）或介白素-1-受體2型（IL-1R2）的介白素-1β-結合結構域，可選地與IL-1R輔助蛋白的配體結合結構域耦接。例如，這樣的結合蛋白可以包含第一蛋白鏈以及第二蛋白鏈。第一蛋白鏈包含（a）IL-1R1的介白素-1β-結合結構域（b）結合並抑制PD-1或PD-L1的免疫球蛋白的VH域及（c）免疫球蛋白Fc域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）。第二蛋白鏈包含結合並抑制PD-1或PD-L1的免疫球蛋白的VL域。在另一實例中，結合蛋白可包含第一蛋白鏈及第二蛋白鏈。第一蛋白鏈包含（a）結合並抑制與PD-1或PD-L1的免疫球蛋白的VH域（b）IL-1R1的介白素-1β-結合結構域（c）免疫球蛋白Fc域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）。第二蛋白鏈包含結合和抑制PD-1或PD-L1的免疫球蛋白的VL域。在又一實例中，結合蛋白可包含兩條相同的蛋白鏈，其中每條蛋白鏈包含（a）IL-1R1的介白素-1β-結合結構域（b）免疫球蛋白Fc域（c）結合並抑制PD-1或PD-L1的活性的scFV域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）。在又一實施例中，結合蛋白可包含：第一蛋白鏈以及第二蛋白鏈。第一蛋白鏈包含（a）IL-1R1的介白素-1β-結合結構域（b）結合並抑制PD-1或PD-L1的免疫球蛋白的VL和CL域（c）免疫球蛋白Fc域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）。第二蛋白鏈包含結合和抑制PD-1或PD-L1的免疫球蛋白的VH和CH1域。在另一實施例中，結合蛋白可包含：第一蛋白鏈及第二蛋白鏈。第一蛋白鏈包含（a）結合並抑制PD-1或PD-L1的免疫球蛋白的VL和CL域（b）介白素-1β-結合結構域（c）免疫球蛋白Fc域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）。第二蛋白鏈包含結合和抑制PD-1或PD-L1的免疫球蛋白的VH和CH1域。
提供了編碼上述蛋白鏈的核酸分子以及載體，包括含有這些核酸分子的表達載體。
還提供了用於如上所述製備結合蛋白的方法，其中該方法包括以下步驟：a）用含有編碼第一結合結構域和第二結合結構域的核酸分子的載體轉化（transform）宿主細胞；b）在允許結合蛋白合成的條件下培養宿主細胞； c）從培養物中回收結合蛋白。宿主細胞可以包含含有編碼第一結合結構域和第二結合結構域的核酸分子的載體。
還提供了包含如上所述之結合蛋白以及藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。
還提供了包含第一蛋白鏈、第二蛋白鏈和第三蛋白鏈的雙特異性結合蛋白（「FAT」結合蛋白），其中第一蛋白鏈包含重鏈及第一Fab結構域（Fab1），重鏈具有VH結構域、CH1結構域、CH2結構域和CH3結構域的重鏈，第一Fab結構域位在CH2結構域、CH3結構域或在CH2結構域與CH3結構域的界面上的溶劑暴露環；其中第二鏈包含第二Fab結構域，其中第三鏈包含第三Fab結構域。在這些結合蛋白中，第二鏈Fab結構域與第一蛋白鏈的VH結構域和CH1結構域相連（associate with），形成第一結合結構域，第三鏈Fab結構域在第一蛋白中的溶劑暴露環上與第一Fab結構域相連，以形成第二個結合結構域。在這些結合蛋白中，溶劑暴露環可以包含來自CH2結構域的胺基酸序列，例如ISRTP（SEQ ID NO：57）。溶劑暴露環可包含來自CH3結構域的胺基酸序列，例如SNG。溶劑暴露環可以包含來自CH2結構域和CH3結構域的界面的胺基酸序列，例如AKGQP（SEQ ID NO：58）。CH1結構域可以經由抗體鉸鏈區連接至CH2結構域。 CH2結構域和CH3結構域可以包含Fc區，例如來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD的Fc區。第一蛋白鏈可進一步包含在第一Fab結構域的第一末端與CH2結構域、CH3結構域或CH2和CH3結構域的界面之間的第一肽連接體，及/或在第一Fab結構域的第二末端與CH2結構域、CH3結構域或CH2和CH3結構域的界面之間的第二肽連接體。第一肽連接體與第二肽連接體可以是，例如，（G4S）2 （SEQ ID NO：59）、（G4S）3 ，（SEQ ID NO：60）和（G4S）4 （SEQ ID NO：61）。在第一實施例中，第一蛋白鏈可包含從N末端到C末端的下列多肽結構域：VH1-CH1-鉸鏈-CH2（N末端）-Fab1-CH2（C末端）-CH3，或在第二實施例中，第一蛋白鏈可包含從N末端到C末端的下列多肽結構域：VH1-CH1-鉸鏈-CH2-CH3（N末端）-Fab1-CH3（C末端）。在第三實施例中，第一蛋白鏈可包含從N末端到C末端的下列多肽結構域：VH1-CH1-CH2-Fab1-CH3。第一結合結構域可以特異性結合PD-1或PD-L1，第二結合結構域可以特異性結合IL-1β或IL-1R，或者第一結合結構域可以特異性結合IL-1β或IL-1R，並且第二結合結構域可以與PD-1或PD-L1特異性結合。
在FAT結合蛋白的一些實施例中，第一結合結構域的CDR區可以選自由下列所組成的群組：SEQ ID NO：1-6的CDR結構域：SEQ ID NO：7-12的CDR結構域、 SEQ ID NO：13-18的CDR結構域、 SEQ ID NO：19-24的CDR結構域、SEQ ID NO：25-30的CDR結構域以及 SEQ ID NO：31-36的CDR結構域，第二結合結構域的CDR區域可以是SEQ ID NO：49-54的CDR結構域。
在FAT結合蛋白的其他實施例中，第一結合結構域的CDR區可以是SEQ ID NO：49-54的CDR結構域，並且第二結合結構域的CDR區可以選自由下列所組成的群組： SEQ ID NO：1-6的CDR結構域：SEQ ID NO：7-12的CDR結構域、 SEQ ID NO：13-18的CDR結構域、 SEQ ID NO：19-24的CDR結構域、SEQ ID NO：25-30的CDR結構域以及SEQ ID NO：31-36的CDR結構域。
本案提供了編碼上述FAT結合蛋白鏈的核酸分子，以及載體（vector），包括含有這些核酸分子的表達載體。
本案還提供了包含一種或多種FAT結合蛋白和藥學上可接受的載體（carrier）的藥物組合物。
本案提供了製備FAT結合蛋白的方法，該方法包括以下步驟：a）用可以包含編碼第一蛋白鏈、第二蛋白鏈和第三蛋白鏈的核酸分子的載體轉化宿主細胞；b）在允許結合蛋白合成的條件下培養宿主細胞；以及c）從培養物中回收FAT結合蛋白。載體可包含編碼FAT蛋白的第一蛋白鏈、第二蛋白鏈和蛋白鏈的核酸分子。
本案提供了受試者的癌症的方法，其包括向有此需要的受試者施用如上所述的結合蛋白或藥物組合物。這些方法任選地包括除了結合蛋白之外還向對象施用抗腫瘤劑。
在這些治療癌症的方法中，受試者可能先前已經接受過癌症免疫療法的治療或已發現對該療法具有抗性。該受試者可能先前已經接受過癌症免疫療法的治療，或者被發現對癌症免疫療法是難治的。癌症免疫療法可以是例如用至少一種免疫檢查點抑製劑治療。
治療癌症的方法還可以包括對受試者施用額外的抗腫瘤療法，例如化學療法、免疫療法、生物製劑或小分子療法、疫苗接種和/或細胞療法。
本案還提供了預防或降低處於風險中的受試者的癌症風險的方法，其包括向受試者施用有效量的如上所述的結合蛋白或藥物組合物。該受試者先前可能已經被診斷出患有癌症並且已經緩解，或者先前已經被治療過癌症。受試者由於環境暴露、香菸之使用或接觸、基因突變或癌症家族史而被認為處於患癌症的風險。
在這些癌症治療方法中，癌症可以是肺癌，例如小細胞肺癌，合併的小細胞肺癌和/或非小細胞肺癌。非小細胞肺癌可以是例如鱗狀細胞肺癌、大細胞肺癌、肺腺癌、肺多形性癌、肺類癌，唾液腺癌或未明確分類（NOS, not otherwise specified）的癌症。所述癌症可以是合併的小細胞肺癌、肺外小細胞癌、局限在淋巴結中的肺外小細胞癌或***小細胞癌，或者可以是微衛星不穩定性癌症。
根據以下詳細描述，本案的其他目的、特徵和優點將變得顯而易見。然而，應當理解，由於本案內容的精神和範圍內的各種改變和修飾對於本領域技術人員而言將是顯而易見的，因此，僅藉由說明的方式給出了詳細描述和具體示例。
本案提供了雙特異性結合蛋白，其包含特異性結合免疫檢查點蛋白的至少一第一結合結構域（first binding domain）和結合IL-1β的至少一第二結合蛋白。免疫檢查點蛋白可以是例如PD-1、PD-L1、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA、CTLA-4（CD152）、IDO. KIR、LAG3、NOX2、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、（CD328）或SIGLEC9（CD329）。有利地，檢查點蛋白是PD-1或PD-L1。
結合蛋白同時結合檢查點蛋白PD-1或PD-L1以及IL-1β或IL-1R，從而抑制CD8 T細胞上的PD-1與標靶細胞（例如腫瘤細胞）上的PD-L1之間的結合以及IL-1β活性。以這種方式同時抑制IL-1β活性和PD-1/PD-L1結合提供了改進的癌症治療方法。第一結合結構域和第二結合結構域有利地是人類抗體可變域。亦提供了新穎的雙特異性結合蛋白形式，其允許兩種抗原特異性結合，包括但不限於檢查點蛋白和細胞激素（cytokine）（例如IL-1β）。亦提供了使用雙特異性結合蛋白來治療疾病（例如癌症）的方法。
結合結構域（binding domain）
在本文所述之結合蛋白中使用的結合結構域可以是特異性結合標靶蛋白的任何形式。例如，為了結合IL-1β，可以使用介白素I型或II型受體的配體結合結構域，選擇性地與來自IL-1受體輔助蛋白的序列融合，如同利隆西普（Rilonacept）。然而，有利地，結合結構域衍生自人類免疫球蛋白分子的可變結構域。具體地，結合結構域可以源自結合檢查點蛋白的抗體和結合IL-1β或IL-1R的抗體。製備結合預選抗原的完全人源抗體的方法是本領域已知的。例如，人類抗體可以選自在絲狀噬菌體（filamentous phage）上顯示的大型抗體文庫，並且藉由已知的方法鑑定所選抗體的重鏈和輕鏈可變區。請參照，例如，Winter等人的文獻（Annual Review of Immunology 12：433-455（1994））。然後將編碼這些可變區的核酸用於構建編碼本文所述的雙特異性結合蛋白的基因。或者，可以使用來自已知抗體的抗體可變結構域。特別地，人類抗體再次被批准用於治療人類的多種疾病狀態中的IL-1β、PD-1和PD-L1，並且來自這些抗體的可變區可用於構建本文所述的雙特異性結合蛋白。合適的抗體的實施例顯示在下列表1和表6中。
或者，可以使用本領域熟知的互補決定區移植（CDR grafting）方法將來自具有已知的針對IL-1β、IL-1R、PD-1或PD-L1的特異性的抗體的CDR區***已知的人類框架區（human framework region）。請參照，例如，威廉斯與馬修斯（Williams和Matthews）的文獻（《抗體工程》（Antibody Engineering）中（Kontermann和Dübel編輯），pp 319-339（Springer，2010），“Humanising Antibodies by CDR Grafting”）。這些CDR區可以衍生自第1圖所示的CDR區或表6中描述的抗體的CDR區。本領域技術人員將認識到，除了本文所述的特異性結合IL-1β、IL-1R、PD-1或PDL-1之外的其他抗體，那些抗體的CDR區可用於構建本文所述之結合蛋白。
關於IL-1β，卡那單抗（canakinumab）是結合IL-1β的FDA批准的人類抗體，並且重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列是眾所周知的。請參照Rondeau等人的文獻(MAbs 7：1151（2015）)。卡那單抗的整個重鏈和輕鏈可變區可用於構建本文所述的雙特異性蛋白蛋白；或者，可以使用本領域眾所周知的CDR移植方法將卡那單抗的CDR區***替代的人類可變框架序列中。請參見，例如，Winter和Harris的文獻（Trends in Pharmacological Sciences 14:139-143 (1993)）。另一種IL-1β結合抗體是文獻WO1995/01997中所述的人源化SK48-E26抗體。
關於IL-1R，anakinra是FDA批准的人類介白素-1受體拮抗劑（IL-1Ra）的重組、非糖基化形式。與天然的人類IL-1Ra相比，anakinra包含一個額外的N末端甲硫胺酸殘基。 Anakinra競爭性地抑制IL-1α和IL-1β與1型IL-1受體的結合。IL-1R1結合結構域可用於構建雙特異性蛋白，以阻斷IL-1β與IL-1受體的結合。可以用作合適的結合結構域的anakinra的IL-1R1結合部分的序列為
MRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO:72)
關於PD-1，帕博利珠單抗（pembrolizumab）是一種人源化抗體，於2014年首次獲得FDA批准，用於治療腫瘤細胞表達升高的PD-1的多種癌症。納武利尤單抗（Nivolumab）是一種完全人類抗體，於2014年首次獲得FDA批准，也可用於治療多種癌症。Cemiplimab是一種人類抗體，於2018年首次批准用於治療轉移性皮膚鱗狀細胞癌。帕博利珠單抗、納武利尤單抗和Cemiplimab的重鏈和輕鏈可變結構域的胺基酸序列是已知的，CDR區的序列也是已知的。
關於PD-L1，durvalumab是一種人類抗體，於2017年首次獲批用於治療轉移性尿路上皮癌。 Atezolizumab於2016年首次獲得批准，用於治療肺癌。 durvalumab和atezolizumab的重鏈和輕鏈可變域的胺基酸序列以及CDR區的序列都是已知的。
帕博利珠單抗（Pembrolizumab）、納武利尤單抗（Nivolumab）、cemeplimab，atezolizumab、avelumab、durvalumab和canakinumab的可變域和CDR區的序列顯示在下列表1中。其他已知抗體的清單亦為IL-1β，PD-1和PD-L1，如第6圖所示。
表1:
抗體 結構域          序列 SEQ ID NO
Pembrolizumab     VH CDR1 NYYMY 1
  VH CDR2 GINPSNGGTNFNEKFKN 2
  VH CDR3 RDYRFDMGFDY 3
  VL CDR1 RASKGVSTSGYSYLH 4
  VL CDR2 LASYL 5
  VL CDR3 QHSRDLPLT 6
  VH QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS 37
  VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK 38
Nivolumab VH CDR1 NSGMH 7
  VH CDR2 VIWYDGSKRYYADSVKG 8
  VH CDR3 NDDY 9
  VL CDR1 RASQSVSSYLA 10
  VL CDR2 DASNRAT 11
  VL CDR3 QQSSNWPRT 12
  VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS 39
  VL s 40
Cemiplimab VH CDR1 GFTFSNFG 13
  VH CDR2 ISGGGRDT 14
  VH CDR3 VKWGNIYFDY 15
  VL CDR1 LSINTF 16
  VL CDR2 AAS 17
  VL CDR3 QQSSNTPFT 18
  VH EVQLLESGGVLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMTWVRQAPGKGLEWVSGISGGGRDTYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKGEDTAVYYCVKWGNIYFDYWGQGTLVTVSS 41
  VL DIQMTQSPSSLSASVGDSITITCRASLSINTFLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLHGGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRTLQPEDFATYYCQQSSNTPFTFGPGTVVDFR 42
SK48-E26 VH CDR1 SYDMS 62
  VH CDR2 YISSGGGGTYYPDTVKG 63
  VH CDR3 GGVRRGYFDV 64
  VL CDR1 RASGNIHNYLT 65
  VL CDR2 NAKTLAD 66
  VL CDR3 QHFWSIPYT 67
  VH EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFIFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGGTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARGGVRRGYFDVWGQGTPVTVSS 68
  VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLTWYQQTPGKAPKLLIYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQHFWSIPYTFGQGTKLQIT 69
Atezolizumab VH CDR1 GFTFSDSWIH 19
  VH CDR2 AWISPYGGST 20
  VH CDR3 RHWPGGFDY 21
  VL CDR1 RASQDVSTAVA 22
  VL CDR2 SASFLYS 23
  VL CDR3 QQYLYHPAT 24
  VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS 43
  VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK 44
Avelumab VH CDR1 SYIM 25
  VH CDR2 SIYPSGGITFYADTVKG 26
  VH CDR3 IKLGTVTTVDY 27
  VL CDR1 TGTSSDVGGYNYVS 28
  VL CDR2 DVSNRPS 29
  VL CDR3 SSYTSSSTRV 30
  VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS 45
  VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL 46
Durvalumab VH CDR1 RYWMS 31
  VH CDR2 NIKQDGSEKYYVDSVKG 32
  VH CDR3 EGGWFGELAFDY 33
  VL CDR1 RASQRVSSSYLA 34
  VL CDR2 DASSRAT 35
  VL CDR3 QQYGSLPWT 36
  VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS   47
  VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK   48
Canakinumab VH CDR1 VYGMN 49
  VH CDR2 IIWYDGDNQYYADSVKG 50
  VH CDR3 DLRTGP 51
  VL CDR1 RASQSIGSSLH 52
  VL CDR2 ASQSFS 53
  VL CDR3 HQSSSLP 54
  VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQGTLVTVSS   55
  VL EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGTKVDIK   56
IL-1受體類型具有如下之序列的結合結構域：
KCKEREEKIILVSSANEIDVRPCPLNPNEHKGTITWYKDDSKTPVSTEQASRIHQHKEKLWFVPAKVEDSGHYYCVVRNSSYCLRIKISAKFVENEPNLCYNAQAIFKQKLPVAGDGGLVCPYMEFFKNENNELPKLQWYKDCKPLLLDNIHFSGVKDRLIVMNVAEKHRGNYTCHASYTYLGKQYPITRVIEFITLEENKPTRPVIVSPANETMEVDLGSQIQLICNVTGQLSDIAYWKWNGSVIDEDDPVLGEDYYSVENPANKRRSTLITVLNISEIESRFYKHPFTCFAKNTHGIDAAYIQLIYPVTN (SEQID NO:70)
Rilonacept是一種免疫球蛋白融合蛋白，其中的結合結構域包含與I型IL-1受體融合的IL-1受體輔助蛋白（IL-1RAP）。Rilonacept的IL-1結合部分的序列（可以用作合適的結合結構域）為：
SERCDDWGLDTMRQIQVFEDEPARIKCPLFEHFLKFNYSTAHSAGLTLIWYWTRQDRDLEEPINFRLPENRISKEKDVLWFRPTLLNDTGNYTCMLRNTTYCSKVAFPLEVVQKDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVVGSPKNAVPPVIHSPNDHVVYEKEPGEELLIPCTVYFSFLMDSRNEVWWTIDGKKPDDITIDVTINESISHSRTEDETRTQILSIKKVTSEDLKRSYVCHARSAKGEVAKAAKVKQKVPAPRYTVEKCKEREEKIILVSSANEIDVRPCPLNPNEHKGTITWYKDDSKTPVSTEQASRIHQHKEKLWFVPAKVEDSGHYYCVVRNSSYCLRIKISAKFVENEPNLCYNAQAIFKQKLPVAGDGGLVCPYMEFFKNENNELPKLQWYKDCKPLLLDNIHFSGVKDRLIVMNVAEKHRGNYTCHASYTYLGKQYPITRVIEFITLEENKPTRPVIVSPANETMEVDLGSQIQLICNVTGQLSDIAYWKWNGSVIDEDDPVLGEDYYSVENPANKRRSTLITVLNISEIESRFYKHPFTCFAKNTHGIDAAYIQLIYPVTN (SEQ ID NO:71)
雙特異性結合蛋白結構
一旦選擇了合適的結合結構域，就將它們併入一種包含至少一特異性結合IL-1β或IL-1R的結合結構域和至少一特異性結合檢查點蛋白的結構域的格式。有利地，結合蛋白的形式是二價或多價雙特異性抗體的形式，其包含免疫球蛋白可變和恆定鏈結構域，其被安排為包含兩個不同的結合結構域，這與二價但單特異性的人類抗體的自然存在的同二聚體結構（homodimeric structure）相反。
製備雙特異性抗體的方法是本領域已知的，並且描述於下列文獻中，例如Brinkmann和Kontermann的文獻（mAbs 9：182（2017））和Spiess等人的文獻（Molecular Immunology，67：95-106（2015））。本文所述的雙特異性結合蛋白可以是本領域已知的任何穩定的形式，適合於對受試者給藥，並且包含結合IL-1β或IL-1R的至少一結合結構域和結合檢查點蛋白的至少一結合結構域。
本領域已知的合適的雙特異性結合蛋白形式的例子包括：
少量Fc（Fc-less）的雙特異性抗體形式包括：藉由連接體連接的兩個scFv分子（Kontermann, Acta Pharmacol Sin 26：1-9（2005））；雙特異性單結構域抗體融合蛋白（Weidle等人，Cancer Genomics Proteomics 10：155-68（2013;））；雙體（Diabody）（Atwell等人，Mol Immunol 33：1301-12（1996））； Fab融合蛋白（Schoonjans等人，J Immunol; 165：7050-7（2000）以及微型抗體（miniantibody）（Pluckthun 與 Pack，Immunotechnology 3：83-105（1997）及Muller等人，FEBS Lett 432：45 49（ 1998））；
具有來自兩種不同抗體的重鏈和輕鏈的不對稱IgG（Suresh等人，Methods Enzymol; 121：210-28（1986））；以及
具有不對稱Fc區的雙特異性IgG，例如使用「鈕入孔（knobs into holes）」方法形成不對稱的Fc區（Ridgway等人，Protein Eng； 9：617-21（1996）； Shatz等人，MAbs； 5：872-81（2013））； Sampei 等人，PLoS One；8:e57479 (2013); Spiess 等人，Biotechnol； 31：753-8（2013）;Juntilla等人，Cancer Res. 74：5561-71（2014）;和Sun等人，J Clin Invest.125）：4077-4090（2015））。
技術人員將認識到，除了上述特定形式之外，大量的雙特異性抗體形式可用於構建結合IL-1β或IL-1R與檢查點蛋白的雙特異性抗體。有利地，雙特異性抗體是基於2 + 2 scFv的結構或基於2 + 2 Fab的結構，如下文更詳細地描述。
基於2 + 2 scFv的結構
第一個基於2 + 2 scFv的結構是第1圖中所示的結構，在此稱為BiS2。如第1圖所示，BiS2格式包含兩條蛋白鏈：
（1）重鏈，包含（從N端到C端）單鏈Fv。單鏈Fv包含一第一VH結構域和一第VL結構域（排列為VH-VL或VL-VH，即這些結構域可以是任何順序）；一第二VH結構域；CH1、CH2和CH3結構域，其中單鏈Fv（scFv）結合第一個標靶（分別是IL-1β、IL-1R或檢查點蛋白）；以及
（2）包含（從N末端到C末端）第二VL結構域和CL結構域的輕鏈。
BiS2蛋白經由CH3結構域和CH2結構域的非共價同二聚體結合（homodimeric binding），以及重鏈上的CH1結構域和CL結構域與輕鏈上的第二VH結構域與VL結構域之間的異二聚體（heterodimeric binding）結合而組裝。CH1和CL結構域與VH和VL結構域之間的結合形成了一個Fab結構域，該結構域結合了第二標靶（分別是檢查點蛋白或IL-1β/ IL-1R）。有利地，雙硫鍵也以與自然存在的IgG分子中相同的方式在鉸鏈區（hinge region）之間以及CH1和CL結構域之間形成。
第二個基於2+2 sc Fv的結構是第2A圖中所示的結構，在此稱為BiS3。如第2A圖所示，BiS3格式亦包含兩條蛋白鏈：
（1）重鏈，其包含（從N端到C端）：第一VH結構域； CH1、CH2和CH3結構域；以及單鏈Fv，單鏈Fv包含第二VH結構域和第二VL結構域（其中VH和VL結構域可以是任意順序），其中scFv結合第一標靶（分別是IL-1β或檢查點蛋白）；
（2）包含（從N末端到C末端）第二VL結構域和CL結構域的輕鏈。
BiS3蛋白亦經由CH3和CH2結構域的同二聚體結合以及重鏈上的CH1和CL結構域與輕鏈上的第二VH和VL結構域之間的異二聚體結合而組裝。CH1和CL結構域與VH和VL結構域之間的結合形成了一Fab結構域，該結構域結合了第二標靶（分別是檢查點蛋白或IL-1β/ IL-1R）。有利地，雙硫鍵也以與自然存在的IgG分子中相同的方式在CH2結構域之間以及在CH1和CL結構域之間形成。
替代的結合蛋白結構是第2B圖中所示的同型二聚體結構，其中重鏈VH和CH1結構域被衍生自介白素1受體的細胞外配體結合結構域的結合結構域所取代。該結合結構域包含來自1型或2型IL-1R的全部或部分細胞外結合結構域，選擇性地結合（conjugate）至來自介白素-1輔助蛋白（IL-1RAcP）的細胞外蛋白結合結構域。IL-1RAcP是功能性IL-1受體的受體次單元（receptor subunit），與IL-1RI形成受體異二聚體。在第2B圖所示的結構中，結合蛋白經由CH3和CH2結構域的非共價同二聚體結合而組裝。有利地，雙硫鍵也以與自然存在的IgG分子中相同的方式在CH2結構域之間和鉸鏈結構域之間形成。
基於2 + 2 Fab的結構
第一個基於2 + 2 Fab的結構是第3A圖中所示的結構，在本文中稱為FIT-Ig（請參照Gong等人的文獻：MABS, 2017, 9:1118-1128（2017））。如第3A圖所示，FIT-Ig格式包含三個蛋白鏈：
（1）重鏈，其包含（從N端到C端）：第一VL結構域；第一CL結構域，第一VH結構域，第一CH1結構域以及CH2和CH3結構域；
（2）輕鏈，其包含（從N端至C端）：第二VL結構域和第二CL結構域；以及
（3）Fd鏈，其包含（從N端到C端）：第二VH結構域和第二CH1結構域。
在重鏈中，第一CL結構域可以經由肽連接體（例如具有序列（GGGGS）x （其中x為1-5）的柔性親水連接體）與第一VH結構域連接。然而，有利地，不存在連接體。
FIT-Ig蛋白經由以下方式組裝：CH3和CH2結構域的非共價同二聚體結合；重鏈上的第一VH和CH1結構域與輕鏈上的第二VL和CL結構域之間的異二聚結合；Fd鏈上第一VL和CL結構域與第二VH和CH1結構域之間的異源二聚結合。兩個相同的Fab結合結構域藉由重鏈與輕鏈的結合形成，兩個個別但相同的Fab結構域藉由重鏈與Fd鏈之間的結合形成，如第3圖中所示。有利地，雙硫鍵亦以與自然存在的IgG分子中相同的方式在CH2結構域之間以及鉸鏈結構域之間形成。
另一種2 + 2結合蛋白顯示在第3B~3E圖中，其中抗體Fab結合結構域之一被衍生自介白素-1受體的細胞外配體結合結構域的結合結構域所取代。該結合結構域包含來自1型或2型IL-1R的全部或部分細胞外結合結構域，任選地結合至來自介白素-1輔助蛋白（IL-1RAcP）的細胞外蛋白結合結構域。IL-1RAcP是功能性IL-1受體的受體次單元，與IL-1RI形成受體異二聚體。在第3B~E圖所示的結構中，結合蛋白經由CH3和CH2結構域的非共價同二聚體結合而組裝；一條鏈上的VH和CH1結構域與第二蛋白鏈上的VL和CL結構域之間的異源二聚體結合。有利地，雙硫鍵也以與自然存在的IgG分子中相同的方式在CH1和CL結構域之間，CH2結構域之間以及鉸鏈結構域之間形成。
第二基於2 + 2 Fab的結構是第4圖所示的新穎結構，在本文中稱為FAT-Ig。如第4圖所示，FAT-Ig格式包含三個蛋白鏈：
（1）重鏈，其包含（從N端到C端）：第一VH結構域；第一CH1結構域，以及CH2結構域和CH3結構域；加上第一VL結構域和第一CL結構域，其中第一VL結構域和第一CL結構域配置於CH2結構域、CH3結構域中的溶劑暴露環（solvent exposed loop）處，或配置於CH2和CH3結構域的界面處。有利地，第一CL結構域和第一CL結構域配置於CH3結構域中的溶劑暴露環處。
（2）輕鏈，其包含（從N端至C端）：第二VL結構域和第二CL結構域；和
（3）Fd鏈包含（從N端到C端）：第二VH結構域和第二CH1結構域。
在重鏈中，位於溶劑暴露環上的第一VL和CL經由柔性肽連接體連接到CH2結構域、CH3結構域，或CH2和CH3結構域的界面。連接體可具有4~25個胺基酸，並且有利地包含（GGGGS）x 單元，其中x＝1-5。如下面更詳細描述的，也可以使用其他連接體。
FAT-Ig蛋白的組裝如第4圖所示，經由下列方式：CH3和CH2結構域的非共價同二聚體結合；重鏈CH1和VH結構域與輕鏈CL和VL結構域的異二聚結合；以及重鏈CL和VL結構域與Fd鏈CH1和VH結構域的異二聚體結合。如第4圖所示，藉由重鏈與輕鏈的結合形成兩個相同的Fab結合結構域，經由重鏈與Fd鏈的結合形成兩個個別但相同的Fab結構域。有利地，雙硫鍵亦在鉸鏈結構域之間以及CH1和CL結構域之間以與自然存在的IgG分子相同的連接方式形成。本領中具有通常知識者將認識到，新穎FAT-Ig抗體形式可用於結合任何兩種所需抗原，並且不限於IL-1β/IL-1R和檢查點蛋白。
在上述四種特異性結合蛋白的每一種中，特異性結合IL-1β/IL-1R的結合結構域和檢查點蛋白不對稱地配置於結合蛋白內，亦即，相較於當第一結合結構域結合檢查點蛋白並且第二結合結構域結合IL-1β/IL-1R時的結構而言，當第一結合結構域結合IL-1β/IL-1R而第二結合結構域結合檢查點蛋白時的結構是有所不同。因此，對於任何給定的結合結構域之對（pair），四種特異性結合蛋白中的每一種可以兩種替代形式存在。
多肽連接體
可以使用連接體將本文所述的雙特異性結合蛋白的結構域連接成連續的蛋白鏈。連接體可用於例如連接scFv的可變重鏈及輕鏈，或將CL/VL結構域連接成FAT-Ig格式的重鏈恆定結構域。
合適的連接體是本領域已知的，並且當存在時，有利地包含至少四個胺基酸，儘管也可以使用更長或更短的連接體。所述連接體有利地是柔性的、親水的並且本身具有很少或沒有二級結構。連接體可能約為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、 40、45或大約50個殘基的長度。如本文所述，當多個連接體用於互連雙特異性蛋白的部分時，連接體可以相同，或具有不同的長度及/或胺基酸序列。
連接體促進所需雙特異性結合蛋白結構的形成。連接體可包含（Gly-Ser）X 單元，其中x = 1-5。如有必要，還可將麩胺酸（Glutamic acid）或離胺酸（lysine）殘基置於連接體序列中以增加溶解度。連接體的長度可以變化以促進蛋白質折疊、靶標結合及/或表達。例如，使用本領域已知的方法，可以使用（Gly-Ser）X 單位的不同倍數來改善或優化蛋白質折疊、標靶結合及/或表達。
雙特異性結合蛋白的製備
製備雙特異性結合蛋白的方法例如是少Fc的雙特異性抗體、具有來自兩種不同抗體的重鏈和輕鏈的不對稱IgG及具有不對稱Fc區的雙特異性IgG，在本領域中是已知的，並在上文提供的參考文獻中進行了描述。
可以使用重組宿主細胞中的合適表達構築體（construct）分別產生上述特定的2 + 2雙特異性抗體。編碼重、輕和Fd鏈的核酸可以使用例如商業基因合成供應商（例如Thermo Fisher（Carlsbad, CA））合成製備。有利地，宿主細胞是真核細胞，並且有利地用編碼N端信號序列的序列合成每個鏈的基因，該N端信號序列造成來自宿主細胞的轉譯的蛋白質的分泌。將每條鏈的基因***合適的表達載體，例如pTT5載體（Durocher等人，Nucleic Acids Res.30：E9（2002）），然後將得到的表達構築體轉染（transfect）到合適宿主的培養物中，以暫時表達。使用例如陽離子脂質將表達載體有效轉染到宿主細胞中的方法是本領域已知的（請參見Felgner等人的文獻，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877。 Nat’l Acad。 Sci USA 84：7413（1987））。將表達載體遞送到細胞中的其他方法也是本領域已知的。藉由將表達構築體整合至合適的宿主細胞的基因組中來製備能夠穩定表達所需蛋白質的宿主細胞的方法也是已知的，使用包含哺乳動物複製起點（作為宿主細胞核中的染色體外元件）的附加型載體（episomal vector）的穩定表達的方法也是已知的。
宿主細胞有利地是真核細胞，例如單細胞真核生物（例如酵母或其他真菌）、植物細胞（例如煙草或番茄植物細胞）、動物細胞（例如人類細胞、猴子細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞）或融合瘤（hybridoma）。宿主細胞的範例包括猴腎細胞的COS-7系（ATCC CRL 1651）（請參照Gluzman等人的文獻，1981，Cell 23：175）、L細胞、C127細胞，3T3細胞（ATCC CCL 163），在無血清培養基中生長的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞或其衍生物，例如Veggie CHO和相關細胞系（請參照Rasmussen等人的文獻，1998，Cytotechnology 28:31）或DHFR缺乏的CHO品系DX-B11（請參照Urlaub等人的文獻，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216-20）、希拉細胞（HeLa cell）、BHK（ATCC CRL 10）細胞系、源自非洲綠猴腎CV1細胞系（ATCC CCL 70）的CV1 / EBNA細胞系（請參照McMahan等人的文獻，1991，EMBO J. 10：2821）、人類胚胎腎細胞（例如293、293 EBNA或MSR 293）、人類表皮A431細胞、人類Colo205細胞、其他轉化的靈長類動物細胞系（transformed primate cell line）、正常二倍體細胞、源自原代組織體外培養的細胞株、原代外植體（primary explant）、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。有利地，宿主細胞是CHO細胞，例如CHO-3E7。
典型地，宿主細胞是可以用編碼多肽的核酸轉化或轉染的培養細胞，然後可以在宿主細胞中表達該多肽。「重組宿主細胞」的用語可用於表示已經用待表達的核酸轉化或轉染的宿主細胞。宿主細胞也可以是包含核酸但不以所需水平表達的細胞，除非將調控序列引入宿主細胞中，從而使其與核酸可操作地連接。如本文所使用的「宿主細胞」的術語不僅是指特定的個體細胞（subject cell），而且是指這種細胞的後代或潛在後代。因為某些修飾可能由於例如突變或環境影響而在後代中發生，所以這種後代實際上可能不會與母細胞相同，但仍包括在本文所用術語的範圍內。用於生長真核宿主細胞的合適的細胞培養基在本領域中是已知的，並且可以從例如Thermo Fisher（Grand Island，NY）商購獲得。
在合適的條件下培養宿主細胞，以使蛋白鏈在宿主細胞的內質網中組裝，然後將雙特異性結合蛋白分泌到細胞培養上清液中。藉由改變用於轉染宿主細胞的表達載體的相對比例，可以改善結合蛋白正確結構的組裝（例如，與導致非活性蛋白形成的鏈的非特異性配對相反） 。載體比例的這種變化也可以用來抵消，例如，與不同鏈相比，鏈之一的生產效率較低。本領域技術人員將認識到，優化載體比例的方法在本領域中是已知的。
以合適的時間長度在合適的表達培養基中培養宿主細胞之後，收集含有雙特異性結合蛋白的條件培養基，並使用本領域已知的方法純化雙特異性結合蛋白。例如，可以使用可包括離子交換色譜法、尺寸排除色譜法（size-exclusion chromatography）和親和性色譜法（例如是蛋白A親和色譜的方法）的方法來純化結合蛋白。蛋白質純化的方法例如是描述於Burgess和Deutscher（Eds）的文獻（“Guide to Protein Purification, Volume 436 (Methods in Enzymology) 2nd Edition (2009)）。可以使用本領域已知的方法（例如是反相高效液相色譜法（RT-HPLC）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及其他方法）來確認蛋白質的純度。
多鏈結合蛋白的正確組裝可以藉由例如非變性凝膠電泳來顯示，以顯示結合蛋白具有預期的分子量。 SDS-PAGE可用於顯示存在每個預期的蛋白鏈並具有預期的分子量。使用合適的抗人類IgG抗體的西方點墨法（western blotting）可以進一步顯示所測蛋白是免疫球蛋白鏈。
藥物組合物和給藥方法
製備雙特異性結合分子並將其給予有需要的受試者的方法是本領域技術人員已知的或容易確定的。結合分子的給藥途徑可以是例如口服、非口服、藉由吸入或局部給藥。本文所用的術語非口服包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸或***給藥。然而，在與本文的教導相容的其他方法中，可以將結合分子直接遞送至不良細胞群體的位點，從而增加患病組織對治療藥劑的暴露。
可以以藥物有效量施用結合分子以治療疾病，例如某些類型的癌症。藥物組合物可以包含藥學上可接受的載體，包括例如水、離子交換劑、蛋白質、緩衝物質和鹽。防腐劑和其他添加劑也可以存在。載體可以是溶劑或分散介質。下列文獻描述了適用於本文揭露的治療方法的製劑（Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co.）16th ed.（1980））。
在任何情況下，可以藉由將結合分子本身或與有效量的其他活性劑結合在適當的溶劑中，然後過濾滅菌來製備無菌注射溶液。製劑也可以以套組的形式包裝和出售。這種製品可以具有標籤或包裝插頁，表明相關的組合物可用於治療患有疾病或易患疾病的對象。
非口服製劑可以是單次推注劑量（single bolus dose）、輸注（infusion）或負荷推注劑量（loading bolus dose），然後是維持劑量（maintenance dose）。這些組合物可以以特定的固定或可變間隔施用，例如每週或每月一次，或在「根據需要」的基礎上施用。
該組合物可以以單劑量、多劑量或在輸注的確定時間段內給藥。劑量方案也可以調整以提供最佳的期望反應（例如，治療或預防反應）。
該組合物可用於治療細胞介導的疾病，例如某些類型的癌症（包括例如骨癌、胰腺癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、中樞神經系統癌（CNS）、卵巢癌、直腸癌、肛門區域癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、黑素瘤、結腸直腸癌、睾丸癌、霍奇金病、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、***癌、慢性或急性白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎上腺皮質癌、愛滋病相關癌症、兒童小腦星形細胞瘤、兒童腦星形細胞瘤、基底細胞癌、肝外膽管癌、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤骨癌、腦腫瘤、支氣管腺瘤/類癌、類癌腫瘤、胃腸道類癌腫瘤、小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、子宮頸癌、兒童期癌症、慢性骨髓單核細胞白血病（CMML）、慢性淋巴細胞性白血病，慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、顱外生殖細胞腫瘤（extracranial germ cell tumor）、性腺外生殖細胞腫瘤、外膽管癌、膽囊癌、胃腸道類癌腫瘤、生殖細胞腫瘤、妊娠滋養細胞腫瘤、神經膠質瘤、毛細胞白血病、肝細胞癌、下咽癌、下丘腦和視神經膠質瘤、胰島細胞癌、卡波濟氏肉瘤、喉癌、白血病、嘴唇和口腔癌、非小細胞肺癌（包括鱗狀細胞肺癌、大細胞肺癌、肺腺癌、肺多形性癌、肺類癌、唾液腺癌）、小細胞肺癌（包括合併的小細胞癌）、未明確分類的肺癌（not otherwise specified　 (NOS) lung cancer）、肺外小細胞癌（包括位於淋巴結內的肺外小細胞癌和***小細胞癌）、淋巴瘤、華氏巨球蛋白血症（Waldenstrom's Macroglobulinemia）、髓母細胞瘤、間皮瘤、口腔原發不明鱗狀細胞癌之頸部轉移（metastatic squamous neck cancer with occult primary）、多發性內分泌腫瘤綜合徵、多發性骨髓瘤/漿細胞瘤、蕈狀肉芽腫（mycosis fungoide）、骨髓增生不良症候群（myelodysplastic syndrome）、骨髓增生異常/骨髓增生性疾病、鼻腔和副鼻竇癌（nasal cavity and paranasal sinus cancer）、鼻咽癌、神經母細胞瘤、口腔癌、口咽癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、卵巢癌低惡性腫瘤、胰島細胞胰腺癌、副甲狀腺癌（parathyroid cancer）、嗜鉻細胞瘤（pheochromocytoma）、松果體母細胞瘤（pineoblastoma）、腦下垂體瘤、胸膜肺母細胞瘤（pleuropulmonary blastoma）、輸尿管移行細胞癌（ureter transitional cell cancer）、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌，塞札里綜合症（Sezary Syndrome）、皮膚癌、非黑素瘤皮膚癌、默克爾細胞皮膚癌（Merkel Cell Skin Carcinoma）、鱗狀細胞癌、睾丸癌、胸腺瘤、妊娠性滋養層細胞腫瘤（gestational trophoblastic tumor）、威爾姆氏腫瘤（Wilms' Tumor）和微衛星不穩定性癌症（cancers with microsatellite instability）。
關於食道癌，該癌症可以是例如食道鱗狀細胞癌（esophageal squamous-cell carcinomas, ESCC）或食道腺癌（esophageal adenocarcinomas, EAC）。關於胰腺癌，該癌症可以是例如外分泌癌、胰腺腺癌、胰腺導管癌、胰腺腺泡細胞癌、囊腺癌、胰臟母細胞瘤、腺鱗癌、未分化癌、胰腺黏液性囊性腫瘤、神經內分泌癌、或胰臟神經內分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumors , PanNETs）。關於肝癌，該癌症可以是例如肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）、肝母細胞瘤、膽管癌、膽管細胞囊腺癌、血管肉瘤或平滑肌肉瘤。關於大腸直腸癌，該癌症可以是腺癌、類癌腫瘤、胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumor, GIST）、淋巴癌、肉瘤、腺鱗癌（adenosquamous carcinoma, Ad-SCC）或鱗癌（squamous carcinoma, SCC）。關於乳癌，該癌症可以是原位癌、原位導管癌（ductal carcinoma in situ, DCIS）、浸潤性、浸潤性導管癌（invasive ductal carcinoma, IDC），浸潤性小葉癌（invasive lobular carcinoma, ILC）、三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer）、發炎性乳癌、血管肉瘤或***柏哲德氏症（Paget disease of the breast）。關於卵巢癌，該癌症可以是上皮腫瘤、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤、惡性上皮性卵巢腫瘤、生殖細胞腫瘤、畸胎瘤、胚芽細胞瘤（dysgerminoma）、內胚竇腫瘤和絨毛膜癌、原發性腹膜癌、輸卵管癌或卵巢間質細胞瘤。關於多發性骨髓瘤和癌前疾病，該癌症可能是輕鏈骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤、意義不明單株伽瑪球蛋白症（monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS）、無症狀多發性骨髓瘤（smoldering multiple myeloma, SMM）、免疫球蛋白D（IgD）骨髓瘤或免疫球蛋白E（IgE）骨髓瘤。
用於治療這些疾病的組合物的治療有效劑量取決於許多不同因素，包括給藥方式、標靶位點、患者的生理狀態、患者是人還是動物、所給予的其他藥物以及治療是預防性的還是治療性的。通常，患者是人類，但是也可以治療非人類哺乳動物，包括基因轉殖的哺乳動物。可以使用本領域技術人員已知的常規方法來滴定（titrate）治療劑量以優化安全性和功效。
至少一種結合分子的給藥量可以藉由本領域通常知識者容易地確定，而無需進行過多的實驗。影響給藥方式和至少一種結合分子的各自量的因素包括但不限於疾病的嚴重程度、疾病的病史、以及其年齡、身高、體重、健康狀況及正在接受治療的個人的身體狀況。類似地，要施用的結合分子的量將取決於施用方式以及受試者將接受單劑或者多劑的試劑。
結合分子還可以用於製備用於治療一種癌症（包括例如以上所列的癌症）的藥物。
在接受包含結合分子的藥物之前，用本文所述的組合物治療的受試者可以是未經治療的或可以用一種或多種其他療法（例如，至少一種其他抗癌療法）進行預處理。受試者不必是對先前療法或一些療法的預處理的反應者。因此，接受包含結合分子的藥物的受試者，可能已經反應、反應較差、最初有反應但是隨後卻沒有反應、或者可能對先前療法或預處理包括多種療法的一種或多種先前療法沒有反應。因此，本揭露提供了治療對其他療法反應差或無反應的患者的方法，包括施用本文所述的結合分子。還提供了克服或預防對癌症療法的抗性或預防或延遲復發的方法，其包括施用本文揭露的結合分子或本文所述的組合物。
即使患者先前已經用抗癌藥物治療過，本領域技術人員也可以確定該人是否對該藥物無反應或具有抗性（refractory）。例如，對抗癌藥物的無反應可能反應出罹患癌症的痛苦增加（例如，癌症/腫瘤的生長增加和/或腫瘤的大小增加，轉移的增加或轉移的數量或大小的增加）。無反應也可能是腫瘤的發展或轉移，例如在切除（resection）腫瘤之後，縮短疾病進展時間或增加一或多個腫瘤的大小和/或轉移，例如在新輔助治療中。基於這些參數或本領域已知的其他參數，可以確定對抗癌藥物的治療沒有反應的患者組，然後可以用本文所述的結合分子治療該組患者。
結合分子和包含結合分子的組合物還可用於治療例如對另一種療法的反應較差或無反應的患者。如本文所用，術語「無反應者」可以指不太可能對使用抗癌藥物的治療反應的個體/患者/受試者。如本文所用，「反應可能性較小」是指在用抗癌藥物治療的患者中發生病理完全反應的可能性降低。在一些方面，患者最初可以是良好的反應者，並且在用這種抗癌藥物治療期間可以產生對治療的抗性，導致對治療的反應較差或無反應。
如本文所用術語「良好反應者」是指其腫瘤在使用抗癌藥治療期間或之後（例如基於連續性的影像研究）未表現出生長、轉移、轉移的數量或大小的增加等的個體；是指在一段時間內（例如，初診後約1年）未經歷腫瘤生長、轉移、轉移的數量或大小增加等的個體，以及/或經歷一定壽命的個體（例如，最初診斷後大約2年或更長時間）。
如本文所用術語「不良反應者」是指在標準療法（例如使用抗癌藥物）期間或之後不久腫瘤生長或轉移，或經歷可歸因於腫瘤的不良臨床作用的個體。術語「不良反應者」還包括在使用抗癌藥物治療期間從「良好反應者」轉變為「不良反應者」的個人。
如果評估對像是「無反應者」、「反應較差」或「反應可能性較小」（例如，基於癌細胞中某些生物標記物的存在），受試者可以用本文所揭露的結合分子治療。
還提供了用於本文所述結合分子與至少一種其他療法的共同施用的方法。結合分子和至少一種其他療法可以在單一組合物中一起共同施用，或者可以在分開的組合物中同時或重疊時間一起共同施用。在一些方面，結合分子可以用作輔助療法。
結合分子還可以用於製備用於治療患有癌症的受試者的藥物，其中在已經用至少一種其他療法治療受試者之前施用結合分子。
藉由向受試者施用有效量的結合蛋白或含有該結合蛋白的組合物，結合分子還可用於預防或降低受試者癌症風險的方法中。癌症可以是肺癌，並且患者可以從先前診斷和/或先前治療的癌症中緩解。由於環境暴露、煙草使用或暴露、基因突變或癌症家族史，可以認為患者有患癌症的風險。
實施例： 在下列實施例中，結合結構域是基於人類抗體（已獲得監管機構批准可用於人類）的重鏈和輕鏈可變區。 「O」、「E」和「K」表示結合IL-1β的結構域，而「M」和「B」表示結合PD-1的結合結構域。結合蛋白鏈的胺基酸序列如第5圖所示。
實施例1：雙特異性抗體的表達
1.質體製備
合成編碼結合蛋白的標靶DNA序列，並將其亞克隆到pTT5載體中（Durocher等人，Nucleic Acids Res. 30：E9（2002），用於在CHO-3E7細胞中表達。結合蛋白鏈的胺基酸序列如第5圖所示。
2.細胞培養和瞬間轉染
CHO-3E7細胞在無血清FreeStyleTM CHO表達培養基（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）中生長。將細胞在迴轉式振盪機（VWR Scientific, Chester, PA）上在37℃和5％CO2 的條件下保持在錐形燒瓶（Corning Inc., Acton, MA）中。轉染前一天，將細胞接種在康寧錐形瓶中。轉染當天，將DNA和轉染試劑混合，然後添加到細胞培養物中，在此期間，將編碼標靶抗體的重組質體瞬間轉染到CHO-3E7細胞中。在第6天收集的細胞培養上清液是用於純化。表2列出了每種抗體的重鏈、輕鏈和Fd鏈組合以及所篩選的每種質體比例。. 每個抗體的重鏈（HC）、輕鏈（LC）和Fd鏈（Fd）組合以及質體比例的摘要。
表2. 每個抗體的重鏈（HC）、輕鏈（LC）和Fd鏈（Fd）組合以及質體比例的摘要。
抗體名稱 抗體形式 重鏈名稱 輕鏈名稱 Fd 比例 1 比例2 比例3 比例4
HC:LC:Fd HC:LC:Fd HC:LC:Fd HC:LC:Fd
ITA101 BiS2-OB BscFv-OHC OLC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITA102 BiS2-OM MscFv-OHC OLC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITA103 BiS2-PC OscFv-BHC BLC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITA104 BiS2-MO OscFv-MHC MLC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITA201 BiS3-OB OHC-BscFv OLC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITA202 BiS3-OM OHC-MscFv OLC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITA203 BiS3-BO BHC-OscFv BLC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITA204 BiS3-MO MHC-OscFv MLC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITA301 FiT-OB BLC-OHC OLC BFd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITA302 FiT-OM MLC-OHC OLC MFd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITA303 FiT-BO OLC-BHC BLC OFd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITA304 FiT-MO OLC-MHC MLC OFd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITA401 FAT-OB OHC-BLC OLC BFd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITA402 FAT-OM OHC-MLC OLC MFd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITA403 FAT-BO BHC-OLC BLC OFd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITA404 FAT-MO MHC-OLC MLC OFd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITB101 FP2-BK K BHC B LC / 1:1      
ITB102 FP2-MK K MHC M LC / 1:1      
ITB103 FFP1(FIT)- KM MFd-K-G4P M LC / 1:1      
ITB104 FFP1(FIT)-KB BFd-K-G4P B LC / 1:1      
ITB105 FFP3-KM K-G4P-MscFv / / N/A      
ITB106 FP1-(crossmab)BK K-BLC-Fc / B Fd 1:1      
ITB107 FP1- (crossmab) MK K-MLC-Fc / M Fd 1:1      
ITB108 FFP2-KM MLC-KG4P / M Fd 1:1      
ITB109 FFP2-KB BLC-K-G4P / B Fd 1:1      
ITC401 FAT-O/B 1+5 O HC-B LC 1+5 O LC B Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITC402 FAT-O/B 3+3 O HC-B LC 3+3 O LC B Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITC403 FAT-O/B 4+2 O HC-B LC 4+2 O LC B Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITC404 FAT-O/B 5+1 O HC-B LC 5+1 O LC B Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITC405 FAT-O/B 4+4 O HC-B LC 4+4 O LC B Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITC406 FAT-O/B 2+2 O HC-B LC 2+2 O LC B Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITD401 FAT-O/B 5+5 FAT-O/B 5+5 O LC B Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITD402 FAT-O/B 4+5 FAT-O/B 4+5 O LC B Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITD403 FAT-O/B 5+4 FAT-O/B 5+4 O LC B Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITE101 BiS2-O/M VH/VL DSB M scFv-O HC VH/VL DSB O LC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITE102 BiS2-O/M VL/VH DSB M scFv-O HC VL/VH DSB O LC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0 /
ITE201 BiS3-M/O VH/VL DSB M HC-O scFv_ VH/VL DSB M LC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0  
ITE202 BiS3-M/O VL/VH DSB M HC-O scFv_ VL/VH DSB M LC / 1:1:0 3:1:0 1:3:0  
ITE301 FIT-B/O-L3 O LC-B HC-L3 B LC O Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITE302 FIT-B/O-L7 O LC-B HC-L7 B LC O Fd 1:1:1 1:3:3 1:1:3 1:3:1
ITF101 BiS2-E/M VL/VH DSB BiS2-E /M VL/VH DSB E13 LC / 1:1:0, 1:3:0 3:1:0  
ITF102 BiS2-M/E VL/VH DSB BiS2-M/E VL/VH DSB M LC / 1:1:0, 1:3:0 3:1:0  
ITF103 BiS2-M/E VH/VL DSB BiS2-M/E VH/VL DSB M LC / 1:1:0, 1:3:0 3:1:0  
ITF201 BiS3-M/E VL/VH DSB BiS3-M/E VL/VH DSB M LC / 1:1:0, 1:3:0 3:1:0  
ITF202 BiS3-M/E VH/VL DSB BiS3-M/E VH/VL DSB M LC / 1:1:0, 1:3:0 3:1:0  
ITF301 FIT-B/E L3 FIT-B/E-L3 B LC E Fd 1:1:1 1:1:1, 1:1:1, 1:1:1,
ITF302 FIT-B/E L7 FIT-B/ E-L7 B LC E Fd 1:1:1 1:1:1, 1:1:1, 1:1:1,
ITF401 FAT-E/B FAT-E/B E13LC B Fd 1:1:1 1:1:1, 1:1:1, 1:1:1,
ITF402 FAT-B/E FAT-B/E B LC E Fd 1:1:1 1:1:1, 1:1:1, 1:1:1,
ITF403 FAT-M/E FAT-M/E M LC E Fd 1:1:1 1:1:1, 1:1:1, 1:1:1,
3.純化及結果
離心細胞培養上清液，然後過濾。將過濾的上清液以1.0ml / min的速度加載到1ml Monofinity A樹脂預填充柱上（GenScript, Cat.No.L00433-11）。洗滌步驟後，洗滌抗體，然後將緩衝液更換為pH 7.2的PBS。藉由標準技術進一步純化抗體。例如，一些樣品藉由尺寸排除色譜法（SEC）使用Superdex 200 Increase 10/300 GL管柱，或藉由陶瓷羥磷灰石色譜法（ceramic hydroxyapatite chromatography）使用CHT™陶瓷羥磷灰石管住（Bio-Rad）進一步純化。對於其他蛋白質，蛋白A親和性色譜用於初步純化，然後根據需要進行尺寸排除色譜法。
在還原和非還原條件下，藉由SDS-PAGE和西方點墨法（使用山羊抗人類IgG-HRP（GenScript，Cat. No.A00166））對每種表達的蛋白質進行了分析，結果表示蛋白質和組成鏈具有所需的分子量。使用尺寸排除高效能液相層析儀（HPLC）評估蛋白質的純度。
實施例2
使用流式細胞儀分析與細胞表面上的PD-1的結合的實施例1中描述的16種不同的雙特異性抗體中的9種。使用的細胞是CHO-K1細胞（陰性對照）和CHO-K1 / PD-1表達。使用的抗體是無關的人類的IgG（陰性對照）和市售的抗PD-1（陽性對照）。使用的二抗是山羊抗人類的IgG（H+L）iFluor 647（1μg/ ml）（數據未顯示）。為了證明雙特異性分子與PD1和IL-1β同時結合，進行了夾心式FACS分析。結合曲線顯示在第7圖中。表達PD1的CHO細胞被指定濃度的雙特異性抗體結合。洗去未結合的抗體，並用生物素化的IL-1β（2 ug/ml），然後用SA-iFluor 647（1 ug/ml）進行檢測。熒光強度既表示BiSAb固定在PD1 +細胞上，又表示其同時結合IL-1β的能力。抗IL-1βVH/VL結合結構域與兩對不同的抗PD-1 VH/VL結合結構域的各種組合被格式化為BiS2、BiS3、FIT-IG或FAT-IG分子。相較於包含由SEQ ID Nos：6-12的序列定義的CDR區的抗PD-1 VH/VL結合區的5個結合分子而言，在所測試的構築體（construct）中，包含由SEQ ID Nos：1-6的序列定義的CDR區的抗PD-1 VH/VL結合區的4個結合分子均達成更高的平均熒光強度。
第8~12圖顯示了另外的結合蛋白的另外的結合數據。第8圖顯示了在多劑量夾心測定中雙特異性抗體同時與細胞膜結合的PD-1及可溶性IL-1β結合的結合曲線，例如藉由流式細胞儀檢測。顯示了ITC、ITD與ITE系列雙特異性抗體的可變的結合親和力。所有的結合親和力均實質上高於對照組的人類IgG。
第9圖顯示了在多劑量夾心測定中與細胞膜結合的PD-1結合的結合曲線，例如是藉由流式細胞術儀檢測。顯示了ITB和ITF系列雙特異性抗體的可變結合親和力。所有結合親和力均實質上高於對照組的人類IgG。
第10圖顯示了藉由流式細胞儀檢測到的在多劑量夾心測定中同時與細胞膜結合的PD-1和可溶性IL-1β結合的結合曲線。顯示了ITB和ITF系列雙特異性抗體的可變結合親和力。所有結合親和力均實質上高於對照組的人類IgG。
第11圖顯示雙特異性抗體在PD-1/PD-L1報告分析中阻斷PD-1活性。顯示了針對ITA系列雙特異性抗體的可變阻斷活性。所有的阻斷活性均實質上高於對照組的人類IgG。
第12圖顯示雙特異性抗體在IL-1β功能測定中阻斷IL-1β活性。 ITA系列雙特異性抗體證明了可變的阻斷活性。所有的阻斷活性均實質上高於對照組的人類IgG。。
BiS2,BiS3,FIT-Ig,FAT-Ig:雙特異性抗體 CL,CH1,CH2,CH3,IL-1BD,VL,VH:結構域 CHAIN:鏈 LC:輕鏈 HC:重鏈
第1圖顯示BiS2雙特異性抗體的鏈結構； 第2A圖顯示BiS3雙特異性抗體的鏈結構； 第2B圖顯示包含（a）源自IL-1R1和IL-1R輔助蛋白的IL-1β結合結構域以及（b）抗體結合結構域的結合分子的鏈結構； 第3A圖顯示FIT-Ig雙特異性抗體的鏈結構； 第3B~3E圖顯示包含（a）源自IL-1R1和IL-1R輔助蛋白的IL-1β結合結構域以及（b）抗體結合結構域的4個結合分子的鏈結構； 第4圖顯示FAT-Ig雙特異性抗體的鏈結構； 第5圖顯示結合IL-1β和PD-1的雙特異性抗體的胺基酸序列； 第6A及6B圖顯示與IL-1β、IL-1R、PD-1或PD-L1結合的已知抗體和結合分子的表； 第7圖顯示雙特異性抗體在多劑量夾心測定（multiple-dose sandwich assay）中同時與細胞膜結合的PD-1和可溶性IL-1β的結合，例如是通過流式細胞儀所檢測的。證明了ITA系列雙特異性抗體的可變結合親和力，並且所有結合親和力均實質上高於對照組的人類IgG（control human IgG）； 第8圖顯示了雙特異性抗體在多劑量夾心測定中同時與細胞膜結合的PD-1和可溶性IL-1β結合，例如是通過流式細胞儀所檢測的。證明了ITC、ITD和ITE系列雙特異性抗體的可變結合親和力，並且所有結合親和力均實質上高於對照組的人類IgG； 第9A~C圖顯示在多劑量夾心測定中雙特異性抗體與細胞膜結合的PD-1的結合，例如是通過流式細胞儀所檢測的，證明了ITB和ITF系列雙特異性抗體的可變結合親和力，並且所有結合親和力均實質上高於對照組的人類IgG； 第10圖顯示雙特異性抗體在多劑量夾心測定中同時與細胞膜結合的PD-1和可溶性IL-1β結合，例如是通過流式細胞儀所檢測，證明了ITB和ITF系列雙特異性抗體的可變結合親和力，所有結合親和力均實質上高於對照組的人類IgG； 第11圖顯示雙特異性抗體在PD-1 / PD-L1報告基因分析中阻斷PD-1活性， ITA系列雙特異性抗體具有可變的阻斷活性，所有的阻斷活性均實質上高於對照組的人類IgG；及。 第12A及12B圖顯示雙特異性抗體在IL-1β功能測定中阻斷IL-1β活性，ITA系列雙特異性抗體證明了可變的阻斷活性，所有的阻斷活性均實質上高於對照組的人類IgG。
BiS2:雙特異性抗體
CL,CH1,CH2,CH3,VL,VH:結構域
CHAIN:鏈
LC:輕鏈
HC:重鏈

Claims (76)

  1. 一種結合蛋白，包含一第一結合結構域及一第二結合結構域，其中該第一結合結構域特異性結合且抑制PD-1或PD-L1的活化，並且其中該第二結合結構域特異性結合且抑制IL-β或IL-1R的活性。
  2. 如請求項1所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域及該第二結合結構域包含複數個免疫球蛋白結合結構域。
  3. 如請求項2所述之結合蛋白，其中該些免疫球蛋白結合結構域是人類免疫球蛋白結合結構域。
  4. 如前述請求項中任一項所述之結合蛋白，其中該結合蛋白包含一第三結合結構域及一第四結合結構域，該第三結合結構域特異性結合且抑制PD-1或PD-L1的活化，該第四結合結構域特異性結合且抑制IL-β或IL-1R的活性。
  5. 如請求項4所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域與該第三結合結構域包含相同複數個CDR區，且其中該第二結合結構域與該第四結合結構域包含相同的複數個CDR區。
  6. 如前述請求項中任一項所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含：a）SEQ ID NO：1的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.:2的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.:3的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：4的輕鏈CDR1； （e）SEQ ID NO.：5的輕鏈CDR2；以及（f）SEQ ID NO.:6的輕鏈CDR3。
  7. 如請求項1至5中任一項所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含：a）SEQ ID NO：7的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.8的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：9的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：10的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：11的輕鏈CDR2；以及（f）SEQ ID NO.：12的輕鏈CDR3。
  8. 如請求項1至5中任一項所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含：a）SEQ ID NO：13的重鏈CDR1；和（b）SEQ ID NO.14的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：15的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：16的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：17的輕鏈CDR2；以及（f）SEQ ID NO.：18的輕鏈CDR3。
  9. 如請求項1至5中任一項所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含（a）SEQ ID NO：19的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.：20的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：21的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：22的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：23的輕鏈CDR2；以及（f）SEQ ID NO.：24的輕鏈CDR3。
  10. 如請求項1至5中任一項所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含（a）SEQ ID NO：25的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.：26的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：27的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：28的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：29的輕鏈CDR2；以及（f）SEQ ID NO.：30的輕鏈CDR3。
  11. 如請求項1至5中任一項所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含（a）SEQ ID NO：31的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.：32的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：33的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：34的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：35的輕鏈CDR2；以及（f）SEQ ID NO.：36的輕鏈CDR3。
  12. 如請求項6所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含SEQ ID NO：37的重鏈可變區及SEQ ID NO：38的輕鏈可變區。
  13. 如請求項7所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含SEQ ID NO：39的重鏈可變區及SEQ ID NO：40的輕鏈可變區。
  14. 如請求項8所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含SEQ ID NO：41的重鏈可變區及SEQ ID NO：42的輕鏈可變區。
  15. 如請求項9所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含SEQ ID NO：43的重鏈可變區及SEQ ID NO：44的輕鏈可變區。
  16. 如請求項10所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含SEQ ID NO：45的重鏈可變區及SEQ ID NO：46的輕鏈可變區。
  17. 如請求項11所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含SEQ ID NO：47的重鏈可變區及SEQ ID NO：48的輕鏈可變區。
  18. 如前述請求項中任一項所述之結合蛋白，其中該第二結合結構域包含（a）SEQ ID NO：49的重鏈CDR1；（b）SEQ ID NO.：50的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：51的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：52的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：53的輕鏈CDR2；及（f）SEQ ID NO.：54的輕鏈CDR3。
  19. 如請求項18所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含SEQ ID NO：55的重鏈可變區及SEQ ID NO：56的輕鏈可變區。
  20. 如請求項1至17中任一項所述之結合蛋白，其中該第二結合結構域包含（a）SEQ ID NO：62的重鏈CDR1（b）SEQ ID NO：63的重鏈CDR2；（c）SEQ ID NO.：64的重鏈CDR3；（d）SEQ ID NO.：65的輕鏈CDR1；（e）SEQ ID NO.：66的輕鏈CDR2；及（f）SEQ ID NO.：67的輕鏈CDR3。
  21. 如請求項21所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域包含SEQ ID NO：68的重鏈可變區及SEQ ID NO：69的輕鏈可變區。
  22. 如請求項1所述之結合蛋白，其中該第一結合結構域是特異性結合且抑制PD-1或PD-L1活化的抗體結合結構域，並且其中該第二結合結構域包含介白素1受體1型（IL-1R1）或介白素1受體2型（IL-1R2）的介白素-1β結合結構域。
  23. 如請求項22所述之結合蛋白，包含：一第一蛋白鏈及一第二蛋白鏈， 該第一蛋白鏈包含（a）IL-1R1的介白素1β-結合結構域，（b）結合且抑制PD-1或PD-L1的一免疫球蛋白的VH結構域及（c）一免疫球蛋白Fc結構域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）;以及 該第二蛋白鏈包含結合且抑制PD-1或PD-L1的該免疫球蛋白的VL結構域。
  24. 如請求項22所述之結合蛋白，包含：一第一蛋白鏈及一第二蛋白鏈， 該第一蛋白鏈包含（a）結合且抑制PD-1或PD-L1的一免疫球蛋白的VH結構域，（b）IL-1R1的介白素1β-結合結構域及（c）一免疫球蛋白Fc結構域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）;以及 該第二蛋白鏈包含結合且抑制PD-1或PD-L1的該免疫球蛋白的VL結構域。
  25. 如請求項22所述之結合蛋白，包含2條相同的蛋白鏈，其中每個蛋白鏈包含（a）IL-1R1的介白素1β-結合結構域，（b）免疫球蛋白Fc結構域及（c）結合且抑制PD-1或PD-L1的活化的scFV結構域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）。
  26. 如請求項22所述之結合蛋白，包括：一第一蛋白鏈及一第二蛋白鏈， 該第一蛋白鏈包含（a）IL-1R1的介白素1β-結合結構域，（b）結合且抑制PD-1或PD-L1的一免疫球蛋白的VL結構域及CL結構域（c）一免疫球蛋白Fc結構域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）；以及 該第二蛋白鏈包含結合且抑制PD-1或PD-L1的該免疫球蛋白的VH結構域及CH1結構域。
  27. 如請求項22所述之結合蛋白，包括：一第一蛋白鏈及一第二蛋白鏈， 該第一蛋白鏈包含（a）結合且抑制PD-1或PD-L1的一免疫球蛋白的V1結構域及CL結構域，（b）IL-1R1的介白素1β-結合結構域及（c）一免疫球蛋白Fc結構域，其中（a）連接於（b），（b）連接於（c）；以及 該第二蛋白鏈包含結合且抑制PD-1或PD-L1的該免疫球蛋白的VH結構域及CH1結構域。
  28. 如請求項22至27中任一項所述之結合蛋白，其中IL-1R1的該介白素-1β結合結構域更包含IL-1R輔助蛋白。
  29. 一種如請求項1至28中任一項所述之結合蛋白的製備方法，包括以下步驟：a）用包含編碼該第一結合結構域及該第二結合結構域的核酸分子的載體轉化一宿主細胞； b）在允許該結合蛋白合成的條件下培養該宿主細胞； c）從培養物中回收該結合蛋白。
  30. 一種宿主細胞，包含複數個載體，該些載體包含編碼如請求項1至28中任一項所述之該第一結合結構域及該第二結合結構域的核酸分子。
  31. 一種藥物組合物，包含如請求項1至28中任一項所述之結合蛋白以及藥學上可接受的賦形劑。
  32. 一種在一受試者中治療癌症的方法，包括對有此需要的該受試者施用如請求項1至28中任一項所述之結合蛋白或如請求項31所述之組合物。
  33. 如請求項32所述的方法，更包括向該受試者施用抗腫瘤藥劑。
  34. 一種雙特異性結合蛋白，包含一第一蛋白鏈、一第二蛋白鏈及一第三蛋白鏈， 其中該第一蛋白鏈包含一重鏈，該重鏈包含VH結構域、結構域CH1、CH2結構域及CH3結構域，並且在該CH2結構域、該CH3結構域中的一溶劑暴露環或在該CH2結構域與該CH3結構域的一界面還包含一第一Fab結構域（Fab1）； 其中該第二鏈包含一第二Fab結構域及 其中該第三鏈包含一第三Fab結構域； 其中該第二鏈Fab結構域與該第一蛋白鏈的該VH結構域及該CH1結構域相連（associate with）以形成一第一結合結構域，以及 其中該第三鏈Fab結構域在該第一蛋白中的該溶劑暴露環與該第一Fab結構域相連以形成一第二結合結構域。
  35. 如請求項34所述之蛋白，其中該溶劑暴露環包含來自該CH2結構域的胺基酸序列。
  36. 如請求項35所述之蛋白，其中該溶劑暴露環包含胺基酸序列ISRTP（SEQ ID NO：57）。
  37. 如請求項34所述之蛋白，其中該溶劑暴露環包含來自該CH3結構域的胺基酸序列。
  38. 如請求項37所述之蛋白，其中該溶劑暴露環包含胺基酸序列SNG。
  39. 如請求項34所述之蛋白，其中該溶劑暴露環包含來自該CH2結構域與該CH3結構域的該界面的胺基酸序列。
  40. 如請求項39所述之蛋白，其中該溶劑暴露環包含胺基酸序列AKGQP（SEQ ID NO：58）。
  41. 如請求項34所述之蛋白，其中該CH1結構域經由一抗體鉸鏈區連接至該CH2結構域。
  42. 如請求項34至41中任一項所述之蛋白，其中該CH2結構域及該CH3結構域包含選自由下列所組成之群組的Fc區：來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE及IgD的Fc區。
  43. 如請求項34至41中任一項所述之蛋白，其中該第一蛋白鏈更包含一第一肽連接體，該第一肽連接體位在該第一Fab結構域的第一末端與該CH2結構域、該CH3結構域或該CH2與該CH3結構域的界面之間。
  44. 如請求項43所述之蛋白，更包括一第二肽連接體，該第二肽連接體位在該第一Fab結構域的一第二末端與該CH2結構域、該CH3結構域或該CH2結構域與該CH3結構域的界面之間。
  45. 如請求項43或44所述之蛋白，其中該第一肽連接體及該第二肽連接體獨立地選自由下列所組成的群組：（G4S）2 （SEQ ID NO：59）、（G4S）3 ， （SEQ ID NO：60）及（G4S）4 （SEQ ID NO：61）。
  46. 如請求項34至45中任一項所述之蛋白，其中該第一蛋白鏈包含從N末端到C末端的下列多肽結構域： VH1-CH1-鉸鏈-CH2（N-末端）-Fab1-CH2（C-末端）-CH3。
  47. 如請求項34至45中任一項所述之蛋白，其中該第一蛋白鏈包含從N末端到C末端的下列多肽結構域： VH1-CH1-鉸鏈-CH2-CH3（N末端）-Fab1-CH3（C末端）。
  48. 如請求項34至45中任一項所述之蛋白，其中該第一蛋白鏈包含從N末端到C末端的下列多肽結構域： VH1-CH1-CH2-Fab1-CH3。
  49. 一種如請求項34至48中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1或PD-L1，並且該第二結合結構域特異性結合IL-1β。
  50. 一種如請求項34至48中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該第一結合結構域特異性結合IL-1β，並且該第二結合結構域特異性結合PD-1或PD-L1。
  51. 一種如請求項49所述之雙特異性結合蛋白，其中該第一結合結構域的該些CDR區選自由下列所組成的群組：SEQ ID NO：1-6的CDR結構域：SEQ ID NO：7-12的CDR結構域、 SEQ ID NO：13-18的CDR結構域、 SEQ ID NO：19-24的CDR結構域、SEQ ID NO：25-30的CDR結構域以及SEQ ID NO：31-36的CDR結構域，其中該第二結合結構域的該些CDR區是SEQ ID NO：49-54的CDR結構域。
  52. 一種如請求項50所述之雙特異性結合蛋白，其中該第一結合結構域的該些CDR區是SEQ ID NO：49-54的CDR結構域，並且其中該第二結合結構域的該些CDR區選自由下列所組成的群組： SEQ ID NO：1-6的CDR結構域:SEQ ID NO：7-12的CDR結構域、SEQ ID NO：13-18的CDR結構域、SEQ ID NO：19-24的CDR結構域、SEQ ID NO：25-30的CDR結構域以及SEQ ID NO：31-36的CDR結構域。
  53. 一種醫藥組合物，包含請求項34至52中任一項所述之結合蛋白及藥學上可接受的載體（carrier）。
  54. 一種如請求項34至52中任一項所述之結合蛋白的製備方法，包括下列步驟：a）用包含編碼該第一蛋白鏈、該第二蛋白鏈及該第三蛋白鏈的核酸分子的載體轉化一宿主細胞； b）在允許該結合蛋白合成的條件下培養該宿主細胞；以及 c）從培養物中回收該結合蛋白。
  55. 一種宿主細胞，包含載體，該載體包含編碼如請求項34至52中任一項所述之第一蛋白鏈、第二蛋白鏈及的核酸分子。
  56. 一種治療一受試者的癌症的方法，包括向有此需要的該受試者施用如請求項34至52中任一項所述之結合蛋白或如請求項53所述之組合物。
  57. 如請求項56所述之方法，更包括向該受試者施用抗腫瘤劑。
  58. 如請求項32或請求項56所述之方法，其中該癌症是肺癌。
  59. 如請求項58所述之方法，其中該肺癌為小細胞肺癌。
  60. 如請求項59所述之方法，其中該小細胞肺癌是合併的小細胞肺癌。
  61. 如請求項59所述之方法，其中該肺癌是非小細胞肺癌。
  62. 如請求項61所述之方法，其中該非小細胞肺癌選自由下列所組成的群組：鱗狀細胞癌、大細胞肺癌、肺腺癌、肺多形性癌、肺類癌、唾液腺癌或未明確分類（NOS, not otherwise specified）的癌症。
  63. 如請求項32或請求項56所述之方法，其中該癌症是合併的小細胞肺癌、肺外小細胞癌、局限在淋巴結中的肺外小細胞癌或***的小細胞癌。
  64. 如請求項32或請求項56所述之方法，其中該癌症是微衛星不穩定性癌症。
  65. 如請求項32或請求項56所述之方法，其中該受試者先前已經用癌症免疫療法治療或已經發現對該療法有抗性。
  66. 如請求項32或請求項56所述之方法，其中該受試者先前已經接受過癌症免疫療法的治療或被發現對癌症免疫療法是難治的。
  67. 如請求項65或請求項66所述之方法，其中該癌症免疫療法是用至少一種免疫檢查點抑製劑的治療。
  68. 如請求項32或請求項56所述之方法，更包括向該受試者施用額外的抗腫瘤療法。
  69. 如請求項68所述之方法，其中該抗腫瘤療法是化學療法、免疫療法、生物製劑或小分子療法、疫苗接種或細胞療法。
  70. 一種預防或降低處於風險中的受試者的癌症風險的方法，包括向該受試者施用有效量的如請求項1至28或34至52中任一項所述之結合蛋白或如請求項31或53所述之組合物。
  71. 如請求項70所述之方法，其中該癌症是肺癌。
  72. 如請求項70所述之方法，其中該受試者先前被診斷出患有癌症並且處於緩解狀態。
  73. 如請求項72所述之方法，其中該受試者先前接受過癌症治療。
  74. 如請求項70所述之方法，其中該受試者由於環境暴露、香菸之使用或暴露、基因突變或癌症的家族史而被認為處於患癌症的風險。
  75. 一種核酸分子，該核酸分子編碼如請求項1至28或34至52中任一項所述之結合蛋白的結合結構域。
  76. 如請求項32或56所述之方法，其中該癌症選自由下列所組成的群組：食道癌、胰腺癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巢癌、或多發性骨髓瘤或癌前病狀。
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