TW202038997A

TW202038997A - 胜肽之血中動態改善方法

Info

Publication number: TW202038997A
Application number: TW108140296A
Authority: TW
Inventors: 西宮大祐; 矢野秀法
Original assignee: 日商第一三共股份有限公司
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2020-11-01
Also published as: WO2020095922A1; EP3878469A4; IL282952A; CA3118879A1; KR20210088571A; JPWO2020095922A1; US20220002385A1; EP3878469A1; AU2019375422A1; CN112969477A; BR112021008908A2

Abstract

本發明之課題係提供胜肽之血中動態改善方法。其解決手段係一種改善胜肽之血中動態的方法，其包含調製具有改變胺基酸序列的胜肽的步驟。

Description

胜肽之血中動態改善方法

本發明係關於改善胜肽或包含該胜肽的結合物之血中動態的方法、血中動態被改善的胜肽或包含該胜肽的結合物、含有血中動態被改善的胜肽或包含該胜肽的結合物的醫藥組成物等。

抗體醫藥、重組蛋白質等生物製劑之研究開發係引人注目的，被美國食品藥物管理局(FDA)認可的生物製劑超過200種(非專利文獻1)。已顯示彼等之適應症以癌症為首，擴展於類風溼性關節炎或多發性硬化症等之自體免疫疾病、皮膚疾病、神經性病變疼痛(neuropathic pain)等各式各樣的疾病。近年來由於蛋白質工程學的進歩，片段抗體或非抗體支架(non-antibody scaffold)等之重組蛋白質的開發亦日益盛行。此等之分子係與抗體醫藥同樣地，對於成為標的的蛋白質X具有高結合活性，因此藉由使用作為治療藥，期待高藥效及減低副作用。相對於抗體醫藥之分子量為150kDa左右，此等係特徵為小至5~50kDa左右。重組蛋白質、荷爾蒙胜肽等顯示高生物活性的一方面，由於分子量小而血中半衰期短。為了於更長期間內維持低分子量蛋白質或胜肽的活性，需要使此等之血中半衰期延長的途徑。

一般而言，除了由於標的細胞的特異消失路徑，更高分子量之蛋白質接續胞飲作用(pinocytosis)或受體媒介性胞吞作用(acceptor-mediated endocytosis)而經由細胞內分解，又，較低分子量之蛋白質或胜肽係經由腎臟的絲球體過濾及再吸收時之分解而自體內消失。已知低分子量蛋白質或胜肽的分子量、形狀、電荷等係對於清除率(clearance)有大的影響。因此，為了改善低分子量蛋白質或胜肽之血中半衰期，一般考慮增大分子量、或與血清中所含的蛋白質結合的途徑(非專利文獻2)。作為增大低分子量蛋白質或胜肽之分子量的途徑，可列舉與聚乙二醇(PEG)或糖鏈、生物可分解性聚合物等之結合。作為使低分子量蛋白質或胜肽與血清蛋白質結合的途徑，可列舉與白蛋白或白蛋白結合分子之融合。再者，與免疫球蛋白Fc區域的結合亦對於血中半衰期延長為有效。抗體係除了分子量大之外，因顯示即使被攝入血管內皮細胞等免疫球蛋白Fc部分藉由與位於胞內體(endosome)的胎兒性Fc受體(FcRn)結合而被排出至血液中的再循環效果，而顯示較其它蛋白質更長的血中半衰期(非專利文獻3)。藉由著眼於Fc區域之該特徵的性質，Fc融合體已被開發作為低分子量蛋白質或胜肽之血中半衰期延長工具。亦已有報告任一修飾法對蛋白質或胜肽的適應例，已有複數項目達至上市。

低分子量蛋白質或胜肽係藉由與Fc區域的融合，期待血中半衰期的延長效果，但大多為較IgG的血中半衰期短的例，而留有血中曝露量改善的課題(非專利文獻4)。為了使作為治療藥之藥效持續，冀求進一步改善此等Fc融合體的血中曝露量。迄今，已報告使單株抗體及Fc融合體之血中半衰期或血中曝露量變化的方法。可列舉例如，藉由使抗體與FcRn之親和性變化，而使血中半衰期變化的方法(非專利文獻3、5)。於抗體或受體Fc融合體，藉由於Fc區域以外之部分(於抗體為可變區域，於受體Fc融合體為受體部分)附加糖鏈，而達成更高曝露(非專利文獻3)，但適用於50~60kDa以下之較小蛋白質的情形，未獲得充分效果。又，作為知悉蛋白質之電荷的方法，可列舉等電點(pI)。抗體之pI為高的情形，因體內顯示中性附近的pH，抗體帶正電荷。因此，抗體容易與帶負電的細胞膜相互作用，對組織的攝入或清除率增大，血中半衰期或血中曝露量降低、減少。相反地，已知藉由降低抗體之pI，與血中半衰期的延長有關(非專利文獻3)，但尚未知悉彼等方法可適用於抗體以外的蛋白質。另一方面，已報告藉由於N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶之N末端側附加4~15個酸性胺基酸，使於血中之穩定性改善的例(專利文獻1)。

然而，任一周知之方法皆未顯示對無論分子量為何之任意蛋白質的泛用性，現狀係在個別情況下摸索改善血中半衰期或血液曝露的方法。

SPINK2(絲胺酸蛋白酶抑制劑Kazal第2型(Serine Protease Inhibitor Kazal-type 2))為具有3個雙硫鍵的類Kazal域，作為胰蛋白酶(trypsin)/精帽粒蛋白(acrosin)抑制劑機能(非專利文獻6)。其分子量係小至7kDa，將SPINK2或SPINK2突變體投予至個體的情形，推測自體內的消失快速。 [先前技術文獻]

[專利文獻1] JP4750718B2 [非專利文獻1] Usmani SS等人(Usmani SS, et al.)(2017年刊) PLoS One (PLoS One)12卷(7號)：e0181748 [非專利文獻2] Protein Cell等人(Strohl WR)(2015年刊) BioDrugs (BioDrugs)29卷(4號)：215-239頁 [非專利文獻3] Liu L等人(Liu L)(2018年刊) Protein Cell (Protein Cell)9卷(1號)：15-32頁 [非專利文獻4] Unverdorben F等人(Unverdorben F, et al.)(2016年刊) MAbs (MAbs)8卷(1號)：120-128頁 [非專利文獻5] Saxena A等人(Saxena A, et al.)(2016年刊) Frontiers in Immunology (Front Immunol.)7卷：580 [非專利文獻6] Chen T等人(Chen T, et al.)(2009年刊) Proteins (Proteins.)77卷(1號)：209-219頁

[發明所欲解決的課題]

提供改善胜肽之血中動態的方法。 [用以解決課題之手段]

本發明係關於下列各項等： (1)一種屬於下述(i)或(ii)的胜肽之結合物： (i)胜肽之結合物，其自胺基末端向羧基末端，依序包含1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸、該胜肽所包含的胺基酸序列、及免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列； (ii)胜肽之結合物，其自胺基末端向羧基末端，依序包含1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸、免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列、及該胜肽所包含的胺基酸序列。 (2)如(1)記載之結合物，其中該胜肽為SPINK2突變體胜肽。 (3)如(1)記載之結合物，其中該胜肽為抗體或其抗原結合片段。 (4)如(1)至(3)中任一項記載之結合物，其中該胜肽所包含的胺基酸序列係通過連接子序列而附加於Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。 (5)如(1)至(3)中任一項記載之結合物，其中該胜肽所包含的胺基酸序列係直接附加於Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。 (6)如(1)至(5)中任一項記載之結合物，其中1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸係通過連接子序列而附加於該胜肽所包含的胺基酸序列或Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。 (7)如(1)至(5)中任一項記載之結合物，其中1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸係直接附加於該胜肽所包含的胺基酸序列或Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。 (8)如(1)至(7)中任一項記載之結合物，其中免疫球蛋白或其片段為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、及/或IgE之Fc區域或其片段。 (9)如(1)至(8)中任一項記載之結合物，其中免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。 (10)如(1)至(9)中任一項記載之結合物，其中免疫球蛋白為人類IgG1。 (11)如(1)至(10)中任一項記載之結合物，其中免疫球蛋白為野生型或突變型。 (12)如(1)至(11)中任一項記載之結合物，其與於胺基末端欠缺1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸的結合物比較，具有血中濃度隨時間降低或血中曝露量增加。 (13)如(1)至(12)中任一項記載之結合物，其與人類疾病相關標的分子結合。 (14)如(13)記載之結合物，其中該胜肽為SPINK2突變體，該胜肽所包含的胺基酸序列為序列識別號2(圖8)所表示者。 (15)一種組成物，其包含如(1)至(14)中任一項記載之結合物。 (16)如(1)至(13)記載之結合物，其中該胜肽抑制、阻礙、激動或活化人類疾病相關標的分子之活性。 (17)如(16)記載之結合物，其中該胜肽為SPINK2突變體，該胜肽所包含的胺基酸序列為序列識別號2(圖8)所表示者。 (18)一種醫藥組成物，其包含如(16)或(17)記載之結合物。 (19)一種製造如(1)記載之結合物之方法，其包含下述之步驟(i)或(ii)而成： (i)於包含該胜肽及免疫球蛋白之Fc區域或其片段的融合體之胺基末端側附加1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸的步驟； (ii)胺基酸序列(c)包含該融合體所包含的胺基酸序列(a)、及由1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸而成的胺基酸序列(b)，且胺基酸序列(b)位於胺基酸序列(a)，將包含胺基酸序列(c)的多核苷酸導入細胞，培養該細胞，自該培養物回收包含該融合體的結合物的步驟。 (20)如(19)記載之方法，其中該胜肽為SPINK2突變體胜肽。 (21)如(19)記載之方法，其中該胜肽為抗體或其抗原結合片段。 (22)如(19)至(21)中任一項記載之方法，其中Fc區域或其片段係位於該胜肽之羧基末端側。 (23)如(19)至(21)中任一項記載之方法，其中Fc區域或其片段係位於SPINK2突變體胜肽之胺基末端側。 (24)如(19)至(23)中任一項記載之方法，其中Fc區域或其片段係通過連接子而融合於該胜肽，或該胜肽所包含的胺基酸序列係通過連接子序列而附加於免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。 (25)如(19)至(23)中任一項記載之方法，其中Fc區域或其片段係與該胜肽直接融合，或該胜肽所包含的胺基酸序列係直接附加於免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。 (26)如(19)至(25)中任一項記載之方法，其中免疫球蛋白為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、及/或IgE之Fc區域或其片段。 (27)如(19)至(26)中任一項記載之方法，其中免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。 (28)如(19)至(27)中任一項記載之方法，其中免疫球蛋白為人類IgG1。 (29)如(19)至(28)中任一項記載之方法，其中免疫球蛋白為野生型或突變型。 (30)如(19)至(29)中記載之方法，其中與於胺基末端欠缺1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸的結合物比較，具有血中濃度隨時間降低或血中曝露量增加。 (31)如(19)至(30)中任一項記載之方法，其中1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸通過連接子而附加於該融合體之胺基末端側，或由1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸而成的胺基酸序列通過連接子序列而附加於該融合體所包含的胺基酸序列之胺基末端側。 (32)如(19)至(30)中任一項記載之方法，其中1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸直接附加於該融合體之胺基末端側，或由1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸而成的胺基酸序列係直接附加於該融合體所包含的胺基酸序列之胺基末端側。 (33)如(19)至(32)中任一項記載之方法，其中該胜肽係與人類疾病相關標的分子結合。 (34)如(19)至(33)中任一項記載之方法，其中該胜肽係抑制、阻礙、激動或活化人類疾病相關標的分子之活性。 (35)如(34)記載之方法，其中該胜肽為SPINK2突變體胜肽，該胜肽所包含的胺基酸序列為序列識別號2(圖8)所表示者。

(1A)一種抑制含有SPINK2突變體胜肽的結合物之血中濃度隨時間降低及/或使含有SPINK2突變體胜肽的結合物之血中曝露量增加的方法，其包含下述之步驟(i)或(ii)而成： (i)將由1至數個之天冬胺酸及/或麩胺酸而成的寡肽附加於SPINK2突變體胜肽與免疫球蛋白之Fc區域或其片段融合而成的結合物之胺基末端側的步驟； (ii)調製含有下列胺基酸序列之結合物的步驟，該胺基酸序列係將1至數個之天冬胺酸及/或麩胺酸附加至包含SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列及免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列而成的胺基酸序列之胺基末端側而成。 (2A)如(1A)記載之方法，其中Fc區域或其片段位於SPINK2突變體胜肽之羧基末端側。 (3A)如(1A)記載之方法，其中Fc區域或其片段位於SPINK2突變體胜肽之胺基末端側。 (4A)如(1A)至(3A)中任一項記載之方法，其中Fc區域或其片段係通過連接子與SPINK2突變體胜肽融合，或SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列係通過連接子序列附加於免疫球蛋白之Fc區域所包含的胺基酸序列。 (5A)如(1A)至(3A)中任一項記載之方法，其中Fc區域或其片段係與SPINK2突變體胜肽直接融合，或SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列係直接附加於免疫球蛋白之Fc區域所包含的胺基酸序列。 (6A)如(1A)至(5A)中任一項記載之方法，其中免疫球蛋白為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、及/或IgE之Fc區域或其片段。 (7A)如(1A)至(6A)中任一項記載之方法，其中免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。 (8A)如(1A)至(7A)中任一項記載之方法，其中免疫球蛋白為人類IgG1。 (9A)如(1A)至(8A)中任一項記載之方法，其中免疫球蛋白為野生型或突變型。 (10A)如(1A)至(9A)中任一項記載之方法，其中該寡肽通過連接子而附加於(i)記載之結合物之胺基末端側，或1至數個之天冬胺酸及/或麩胺酸係通過連接子序列而附加於(ii)記載之包含SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列及免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列而成的胺基酸序列之胺基末端側。 (11A)如(1A)至(9A)中任一項記載之方法，其中該寡肽係直接附加於(i)記載之結合物之胺基末端側，或者1至數個之天冬胺酸及/或麩胺酸係直接附加於(ii)記載之包含SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列及免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列而成的胺基酸序列之胺基末端側。 (12A)如(1A)至(11A)中任一項記載之方法，其特徵為SPINK2突變體胜肽係與人類疾病相關標的分子結合。 (13A)如(1A)至(12A)中任一項記載之方法，其特徵為SPINK2突變體胜肽阻礙或抑制人類疾病相關標的分子之活性。 (14A)如(1A)至(13A)中任一項記載之方法，其中SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列為下述(i)或(ii)： (i)以序列識別號2(圖8)表示，且與人類疾病相關標的分子結合，或阻礙或抑制該分子之活性的胜肽所包含的胺基酸序列； (ii)包含與(i)記載之胺基酸序列為90%以上相同的胺基酸序列，且與該分子結合或阻礙或抑制該分子之活性的胜肽所包含的胺基酸序列。 (15A)一種為下述(i)或(ii)的SPINK2突變體之結合物： (i)該SPINK2突變體之結合物，其自胺基末端向羧基末端，依序包含1至數個之天冬胺酸及/或麩胺酸、SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列、及免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列； (ii)該SPINK2突變體之結合物，其自胺基末端向羧基末端，依序包含1至數個之天冬胺酸及/或麩胺酸、免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列、及SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列。 (16A)如(15A)記載之結合物，其中SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列係通過連接子序列而附加於Fc區域所包含的胺基酸序列。 (17A)如(15A)記載之結合物，其中SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列係直接附加於Fc區域所包含的胺基酸序列。 (18A)如(15A)至(17A)中任一項記載之結合物，其中1至數個之天冬胺酸及/或麩胺酸係通過連接子序列而附加於SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列或Fc區域所包含的胺基酸序列。 (19A)如(15A)至(17A)中任一項記載之結合物，其中1至數個之天冬胺酸及/或麩胺酸係直接附加於SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列或Fc區域所包含的胺基酸序列。 (20A)如(15A)至(19A)中任一項記載之結合物，其中免疫球蛋白為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、及/或IgE之Fc區域或其片段。 (21A)如(15A)至(20A)中任一項記載之結合物，其中免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。 (22A)如(15A)至(21A)中任一項記載之結合物，其中免疫球蛋白為人類IgG1。 (23A)如(15A)至(22A)中任一項記載之結合物，其中免疫球蛋白為野生型或突變型。 (24A)如(15A)至(23A)中任一項記載之結合物，其與於胺基末端欠缺1至數個之天冬胺酸及/或麩胺酸的結合物比較，具有經抑制的血中濃度隨時間降低或增加的血中曝露量。 (25A)如(15A)至(24A)中任一項記載之結合物，其特徵為SPINK2突變體胜肽與人類疾病相關標的分子結合。 (26A)如(15A)至(25A)中任一項記載之結合物，其特徵為SPINK2突變體胜肽阻礙或抑制人類疾病相關標的分子之活性。 (27A)如(15A)至(26A)中任一項記載之結合物，其中SPINK2突變體胜肽所包含的胺基酸序列為下述(i)或(ii)： (i)序列識別號2(圖8)所表示之與人類疾病相關標的分子結合或者阻礙或抑制該分子之活性的胜肽所包含的胺基酸序列； (ii)包含與(i)記載之胺基酸序列為90%以上相同的胺基酸序列，且與該分子結合或者阻礙或抑制該分子之活性的胜肽所包含的胺基酸序列。 (28A)一種組成物，其包含如(15A)至(27A)中任一項記載之結合物。及 (29A)一種醫藥組成物，其包含如(25A)至(27A)中任一項記載之結合物。 [發明之效果]

本發明之提供的血中動態改善方法係造成胜肽或含有該胜肽的結合物之血中濃度隨時間降低的抑制、血中曝露量的增加等，含有該胜肽或該結合物的醫藥可適合地使用於各種疾病之治療或預防等。

[用以實施發明之形態]

1.定義於本發明中，「基因」係意指包含編碼蛋白質所含的胺基酸序列之核苷酸序列的核酸分子或其互補股，且包含單股、雙股或三股以上，而DNA股與RNA股的集合體、於一條鏈上混合存在核糖核苷酸與去氧核糖核苷酸者及包含該種之鏈的雙股或三股以上的核酸分子，亦包含在「基因」的定義中。

於本發明中，「基因」、「多核苷酸」及「核酸分子」係同義，並不因彼等之構成單元的核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、核苷酸、核苷等之個數而受任何限定，例如，DNA、RNA、mRNA、cDNA、cRNA、探針、寡核苷酸、引子等亦包含在其範圍中。「核酸分子」有被簡稱為「核酸」的情形。

於本發明中，「多肽」、「胜肽」及「蛋白質」係同義。

於本發明中，可將辨識標的分子X、或與標的分子X結合(以下，將該辨識或結合作用統稱為「結合X之活性」)之胜肽稱為「X結合胜肽」。再者，可將辨識標的分子X、或與標的分子X結合，且阻礙或抑制標的分子X所具有的1個或2個以上之活性或機能(以下，將彼等之阻礙或抑制作用統稱為「X抑制活性」)之胜肽稱為「抑制X之胜肽」。

於本發明中，「SPINK2」意指絲胺酸蛋白酶抑制劑Kazal第2型(Serine Protease Inhibitor Kazal-type 2)，包含具有3個雙硫鍵的類Kazal域的7kDa之蛋白質。適合的SPINK2係來自人類。於本發明中，除於其它段落有記載的情形，有時將人類SPINK2(序列識別號1：圖7)僅稱為「SPINK2」。

於本發明中，胜肽所結合的「部位」，即胜肽所辨識的「部位」係意指胜肽所結合或辨識的標的分子上之連續的或斷續的部分胺基酸序列或部分高階結構。於本發明中，可將該部位稱為標的分子上之抗原決定位或結合部位。

於本發明中，於「細胞」中亦包含來自動物個體的各種細胞、繼代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、重組細胞、酵母、微生物等。

於本發明中，「SPINK2突變體」係意指於野生型SPINK2所具有的胺基酸序列，包含有1個或2個以上之胺基酸被與野生型不同的胺基酸取代、1個或2個以上之野生型之胺基酸缺失、1個或2個以上之野生型中沒有的胺基酸被***(以下，總稱為「突變」)而成的胺基酸序列的胜肽。

於本發明中，「1至數個」中的「數個」係指3至10個。

於本發明中，「在嚴苛條件下進行雜交」係意指在含5×SSC的溶液中以65℃進行雜交，接著，各自在含2×SSC-0.1%SDS的水溶液中以65℃進行20分鐘、在含0.5×SSC-0.1%SDS的水溶液中以65℃進行20分鐘、以及在含0.2×SSC-0.1%SDS的水溶液中以65℃進行20分鐘的洗淨條件或與其同等的條件下進行雜交。SSC係意指150mM NaCl-15mM檸檬酸鈉之水溶液，n×SSC係意指n倍濃度之SSC。

於本發明中，「特異性地」及「特異性」的用語係與「選擇性地」及「選擇性」各自同義，有互換性。

「血中動態」係意指血液循環中的藥物動態，即被投予至個體的藥物隨著時間的經過，將於血液循環採取的動態(吸收、分布等)及消失(代謝、***等)，血中藥物濃度之經時的變化(PK)或血中曝露量(AUC)、藥物消失半衰期(t_1/2 )、藥物最高血中濃度(C_max )、達到最高血中濃度為止的時間(t_max )等作為指標而評價。

「血中曝露量」係意指將一定時間中的血中藥物濃度替換為血中濃度-時間曲線下面積而表示的數値。

「血中動態之改善」係意指血中藥物濃度之經時的減少的抑制、PK之延長、AUC之增加、t_1/2 之延長、C_max 之上升、及/或t_max 之縮短。

2.胜肽 2-1.胺基酸「胺基酸」係包含胺基及羧基的有機化合物，適合地為蛋白質中作為構成單元而包含的α-胺基酸，更適合地為天然之蛋白質中作為構成單元而包含的α-胺基酸。於本發明中，更適合的胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val，只要未特別述明，則「胺基酸」意指此等之共計20個胺基酸。可將彼等共計20個胺基酸稱為「天然胺基酸」。

於本發明中，「胺基酸殘基」有被略記為「胺基酸」的情形。

又，於本發明中，胺基酸為L-胺基酸、D-胺基酸、或其混合物(DL-胺基酸)，但只要未特別述明，則意指L-胺基酸。

天然胺基酸可基於其共通的側鏈性質，分成例如以下的群組。 (1)疏水性胺基酸群組：Met、Ala、Val、Leu、Ile (2)中性親水性胺基酸群組：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln (3)酸性胺基酸群組：Asp、Glu (4)鹼性胺基酸群組：His、Lys、Arg (5)對主鏈的方向造成影響之胺基酸的群組：Gly、Pro (6)芳香族胺基酸群組：Trp、Tyr、Phe 惟，天然胺基酸的分類並未被限定於此等。

於本發明中，天然胺基酸可受到保存性胺基酸取代。

「保存性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」係意指與機能上等價或類似之胺基酸的取代。胜肽中的保存性胺基酸取代係會對該胜肽之胺基酸序列帶來靜態的變化。例如，具有相同極性的一個或個以上之胺基酸係機能上等價地作用，對該胜肽之胺基酸序列帶來靜態的變化。一般而言，可認為某群組內的取代係對於結構及機能為保存性。然而，如所屬技術領域中具通常知識者所知，特定之胺基酸殘基所扮演的角色可在包含該胺基酸之分子的三維結構的意義上來決定。例如，半胱胺酸殘基係可採取與還原型之(硫醇)型比較而極性較低的氧化型之(雙硫)型。精胺酸側鏈之長的脂肪族部分係可於結構上及機能上構成重要的特徵。又，含芳香環的側鏈(色胺酸、酪胺酸、***酸)可有助於離子-芳香族相互作用或陽離子-π相互作用。於該情形，即使將此等之具有側鏈的胺基酸與屬於酸性或非極性群組的胺基酸進行取代，於結構上及機能上可為保存性。脯胺酸、甘胺酸、半胱胺酸(雙硫・形式)等之殘基有對主鏈的立體結構賦予直接性效果之可能性，而通常無法無結構性形變地進行取代。

保存性胺基酸取代係如以下所示，包含基於側鏈之類似性的特異性取代(Lehninger，生化學，改訂第2版，1975年刊行，73至75頁：L. Lehninger， Biochemistry， 2^nd edition， pp73-75， Worth Publisher， New York (1975))及典型的取代。

(1)非極性胺基酸群組：丙胺酸(以下，記載為「Ala」或僅記載為「A」)、纈胺酸(以下，記載為「Val」或僅記載為「V」)、白胺酸(以下，記載為「Ile」或僅記載為「I」)、異白胺酸(以下，記載為「Ile」或僅記載為「I」)、脯胺酸(以下，記載為「Pro」或僅記載為「P」)、***酸(記為「Phe」或僅記載為「F」)、色胺酸(以下，記載為「Trp」或僅記載為「W」)、甲硫胺酸(以下，記載為「Met」或僅記載為「M」)

(2)不帶電極性胺基酸群組：甘胺酸(以下，記載為「Gly」或僅記載為「G」)、絲胺酸(以下，記載為「Ser」或僅記載為「S」)、蘇胺酸(以下，記載為「Thr」或僅記載為「T」)、半胱胺酸(以下，記載為「Cys」或僅記載為「C」)、酪胺酸(以下，記載為「Tyr」或僅記載為「Y」)、天冬醯胺酸(以下，記載為「Asn」或僅記載為「N」)、麩醯胺酸(以下，記載為「Gln」或僅記載為「Q」)

(3)酸性胺基酸群組：天冬胺酸(以下，記載為「Asp」或僅記載為「D」)、麩胺酸(以下，記載為「Glu」或僅記載為「E」)

(4)鹼性胺基酸群組：離胺酸(以下，記載為「Lys」或僅記載為「K」)、精胺酸(以下，記載為「Arg」或僅記載為「R」)、組胺酸(以下，記載為「His」或僅記載為「H」)

於本發明中，胺基酸亦可為天然胺基酸以外的胺基酸。可列舉例如，於天然之胜肽或蛋白質被發現的硒基半胱胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、吡咯啶、焦麩胺酸、胱胺酸、羥基脯胺酸、羥基離胺酸、甲狀腺素、O-磷絲胺酸、鎖鏈素(desmosine)、β-丙胺酸、肌胺酸(sarcosine)、鳥胺酸、肌酸(creatine)、γ胺基丁酸、冠癭鹼(opine)、茶胺酸、口蘑酸(tricholomic acid)、紅藻胺酸(kainic acid)、軟骨藻酸(domoic acid)、肢端酸(acromelic acid)等，可列舉包含正白胺酸、Ac-胺基酸、Boc-胺基酸、Fmoc-胺基酸、Trt-胺基酸、Z-胺基酸等之N末端保護胺基酸、胺基酸三級丁酯、苄酯、環己酯、茀酯等的C端保護胺基酸、二胺、ω胺基酸、β胺基酸、γ胺基酸、胺基酸之Tic衍生物、胺基膦酸之其它天然界未發現的胺基酸等，但未限定於彼等，上述20個之「天然胺基酸」以外之胺基酸，於本發明中為了方便，總稱為「非天然胺基酸」。

2-2.胜肽於本發明中，胜肽係若為任意之胜肽之野生型、突變型、改變型、人工設計的胜肽等，則未特別限定，惟適合地為與標的分子結合的胜肽；賦活化、促進、抑制或阻礙標的分子之活性的胜肽；及/或與標的分子拮抗或激動的胜肽。更合適的胜肽為SPINK2突變體。

於本發明，「標的分子」係意指本發明之胜肽所結合之存在於人類或非人類動物的個體的物質或能被攝入至活體內的外因性的物質。胜肽為SPINK2突變體的情形，本發明之標的分子，適合地為SPINK2之內在性標的的胰蛋白酶及/或精帽粒蛋白以外之分子，更適合地為胰蛋白酶以外之分子，進一步適合地為源自人類之胰蛋白酶以外的源自人類的分子。更進一步適合地為可直接或間接參與該人類個體可罹患的疾病之發病或惡化、或顯示與該疾病相關或逆相關之內在或外因性的酵素、受體、該受體之配位體、細胞介素等之液性因子、其它之生物體高分子、訊息傳導物質、細胞、病原體、毒素、或、源自彼等之任一者或其以上的物質，例如，其片段、分解物、代謝產物、加工物等(以下，稱為「疾病相關標的分子」)。又，於本發明之某態樣，合適的標的分子為胰蛋白酶及/或精帽粒蛋白以外之蛋白酶，更適合地為胰蛋白酶以外之蛋白酶。該蛋白酶係較佳為疾病相關標的分子。

與標的分子結合、及/或賦活化、促進或抑制標的分子的活性、及/或與標的分子拮抗或激動的胜肽，藉由自胜肽・庫，以與標的分子結合的活性、賦活、促進、阻礙或抑制標的分子的活性、及/或對標的分子拮抗或激動的活性(以下總稱為「對標的分子的活性」)作為指標，實施所屬技術領域中具通常知識者周知之篩選，可進行鑑定或濃縮(WO2014/024914A1、WO2018/117244A1)。鑑定或濃縮的胜肽之胺基酸序列，可藉由周知之定序來確定。辨明胺基酸序列的胜肽係可藉由重組、化學合成或活體外轉譯而調製。

就疾病相關標的分子而言，可列舉例如，胰凝乳蛋白酶、血管舒緩素、EGFR、HER2、KLK1、KLK4、KLK5、KLK8、HTRA1、MMP-9等，但未限定於彼等。

就對疾病相關標的分子具有活性的SPINK2突變體胜肽而言，可列舉例如，胰凝乳蛋白酶結合胜肽(WO2014/024914A1)、血管舒緩素結合胜肽、EGFR結合胜肽及HER2結合胜肽(以上，WO2014/024914A1)、抑制人類KLK5之具有的蛋白酶活性的胜肽(以下稱為「KLK5抑制胜肽」)的K50055(序列識別號4：圖10)及K51028(序列識別號5：圖11)、HTRA1抑制胜肽(WO2018/117244A1)、MMP-9結合胜肽(WO2019/017338A1)、以及KLK1抑制胜肽、KLK4抑制胜肽及/或KLK8抑制胜肽(WO2019/049933A1)等，但未被限定於彼等。

KLK5為包含N末端前肽(N-terminal propeptide)與蛋白酶活性域，3處之N型糖鏈附加的顯示類胰蛋白酶之蛋白酶活性的蛋白質，適合地為人類KLK5(序列識別號3：圖9)。KLK5抑制劑係有用於Netherton氏症候群(Netherton syndrome)、異位性皮膚炎、酒渣(rosacea)、紫外線所致的皮膚傷害、乾癬、氣喘、脊髓損傷、癌症、巴瑞特氏食道(Barrett esophagus)等之治療及/或預防。又，K51028亦抑制人類KLK7所具有的蛋白酶活性(資料未呈示)。

對疾病相關標的分子具有活性的SPINK2突變體，與在該領域作為醫藥及診斷藥所使用之抗體等的其它生物高分子比較而分子量小，且其製造比較容易，在對保存穩定性或熱穩定性等之物性方面優異，具有被使用作為醫藥組成物的情形的投予路徑、投予方法、製劑等之選擇寬度廣等之優點。SPINK2突變體胜肽之分子量係小於10,000，適合地為小於8,000，更適合地為約7,000~7,200。又，序列識別號2(圖8)之包含第15號Cys~第31號Cys的可變環部分(variable loop moiety)或包含第15號Cys~第63號Cys的胜肽片段(以下稱為「包含6個Cys的部分」)亦包含於本發明之胜肽之範圍，可變環部分之分子量係小於2,500，適合地為約1,800~2,000，包含6個之Cys的部分之分子量係小於6,000，適合地為約5,300~5,500。又，生物高分子或聚合物之附加等，藉由適用周知之方法而增大本發明之胜肽的分子量，亦可更長期地調節作為醫藥組成物使用的情形之血中半衰期。

於本發明中，「突變」係意指於與天然存在的核酸分子或胜肽比較之核苷酸序列或胺基酸序列，有1個或2個以上之核苷酸或核苷酸殘基或胺基酸或胺基酸殘基之取代、缺失或***而成。本發明之SPINK2突變體之胺基酸序列與人類SPINK2之胺基酸序列比較，1個或2個以上之胺基酸或胺基酸殘基有突變。

於本發明之某態樣，SPINK2突變體之胺基酸序列係人類SPINK2之胺基酸序列(序列識別號1：圖7)之：第16號Ser~第22號Gly之中1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個之胺基酸被其它胺基酸或胺基酸殘基取代；第24號Pro~第28號Asn之中1個、2個、3個、4個或5個胺基酸被其它胺基酸或胺基酸殘基取代；第15號Cys、第23號Cys、第31號Cys、第42號Cys、第45號Cys及第63號Cys係為了維持天然型之雙硫鍵，較佳為與野生型相同地為Cys，而為了使天然型之雙硫鍵消失、使產生非天然型之雙硫鍵，亦可將彼等之中1個、2個、3個、4個、5個或6個取代為其它胺基酸。於SPINK2突變體，係於與天然型相同的該6處Cys被維持，並保留雙硫鍵。於該胜肽中更適合的一部分之態樣，第15號Cys-第45號Cys、第23號Cys-第42號Cys、及第31號Cys-第63號Cys係各自形成雙硫鍵；野生型SPINK2的胺基酸序列所包含的第16號Ser至第30號Val的環結構、由包含第31號Cys及第32號Gly的β股(1)以及包含第57號Ile至第59號Arg的β股(2)所構成的β褶板、包含第41號Glu至第51號Gly的α螺旋、或由類似彼等或至少部分對應彼等(之位置)的環結構、β褶板、α螺旋等所構成的立體結構係被維持在可發揮對標的分子之活性的程度為較佳。

3.對胜肽的變更或突變之導入於本發明之胜肽(或結合物：後述)之具有的胺基酸序列有1個或2個以上(例如，1至數個)之胺基酸缺失、取代、附加或***而成的胜肽(或結合物)之突變體、及具有原本之胜肽(或結合物)之具有的胺基酸序列之80%、85%、90%、95%、98%或99%以上相同的胺基酸序列的胜肽(或結合物)之突變體亦包含於本發明之胜肽(或結合物)之範圍，合適的胜肽(或結合物)突變體係保持原本之胜肽(或結合物)具有的對標的分子的活性之一部分或全部。

於本發明之胜肽之胺基末端及/或羧基末端有1個或2個以上(例如，1至數個)之胺基酸取代、附加及/或缺失而成，且保持原本的胜肽之具有的對標的分子的活性之一部分或全部的胜肽，亦包含於本發明之胜肽的範圍。

於本發明之SPINK2突變體之具有的胺基酸序列，序列識別號2(圖8)之X₁ 至X₁₂ 以外的部分，即野生型人類SPINK2之胺基酸序列(序列識別號1：圖7)中的第2號Pro~第15號Cys、第23號Cys及第29號Pro~第63號Cys之位置，可包含天然型之胺基酸或突變的胺基酸或胺基酸序列。例如，SPINK2突變體例如，SPINK2突變體，係只要至少不會部分妨礙或干涉對標的分子的活性或折疊，可於1個或2個以上(例如，1至數個)之位置上突變。此種突變係可藉由使用所屬技術領域中具通常知識者周知之標準方法而成。就胺基酸序列中之典型的突變而言，可列舉1個或2個以上(例如，1至數個)之胺基酸之取代、缺失或***，就取代而言，可例示保存性取代。藉由保存性取代，而某個胺基酸殘基會被不僅是大小類似，關於極性方面亦為化學性特徵類似的胺基酸殘基取代。保存性取代之例係被記載於本說明書的其它部分。另一方面，X₁ 至X₁₂ 以外之部分，只要至少不會部分地妨礙或干涉對標的分子的活性或折疊，亦能容許1個或2個以上(例如，1至數個)之胺基酸之非保存性取代。

因此，能適用於本發明之血中動態改善方法的胜肽或結合物(後述)中所包含的胜肽具有的胺基酸序列係下列任一者：(a1)由包含序列識別號2(圖8)的胺基酸序列而成的胺基酸序列；(a2)於包含序列識別號2(圖8)的胺基酸序列中有1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2、或1個之胺基酸取代、缺失、附加及/或***而成且保持包含(a1)記載之胺基酸序列的胜肽之具有的對標的分子的活性之一部分或全部的胜肽所包含的胺基酸序列；(a3)由核苷酸序列所編碼的胺基酸序列，該核苷酸序列於嚴苛條件下和與編碼包含序列識別號2(圖8)的胺基酸序列的核苷酸序列互補的核苷酸序列雜交，且編碼保持包含(a1)記載之胺基酸序列的胜肽之具有的對標的分子的活性之一部分或全部的胜肽所包含的胺基酸序列：及(a4)與包含序列識別號2(圖8)的胺基酸序列為60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%以上相同，且保持包含(a1)記載之胺基酸序列的胜肽之具有的對標的分子的活性之一部分或全部的胜肽所包含的胺基酸序列；但未限定於彼等。

以改善其折疊穩定性、熱穩定性、保存穩定性、水溶性、生物活性、藥理活性、次要的作用等的目的，可於胜肽中導入突變。例如，為了使與聚乙二醇(PEG)、羥基乙基澱粉(HES)、生物素等結合，可藉由突變導入如Cys的新的反應性基。

4.含有胜肽的結合物於本發明中，於胜肽有其它之部分融合、連結或附加等，將此種融合、連結或附加等型式稱為「胜肽之結合物」。於本發明，「結合物」係意指於胜肽或其片段有其它之部分結合而成的分子。「結合(conjugate)」或「接合(conjugation)」係包含下述形態：某部分經由交聯劑等之化學物質，而透過將適於將某部分連結於胺基酸之側鏈的作用物質等，於胜肽之N末端及/或C末端，藉由合成化學的手法或基因工程的手法等，而胜肽被連結或結合的形態。對於此種「部分」，作為改善血中半衰期者，可例示聚乙二醇(PEG)等之聚伸烷基二醇分子、羥乙基澱粉(HES)、棕櫚酸等之脂肪酸分子、免疫球蛋白的Fc區域、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、白蛋白或其片段、白蛋白結合肽、鏈球菌蛋白質G等之白蛋白結合蛋白質、運鐵蛋白。就其它的「部分」而言，該「部分」係可透過胜肽連接子等之連接子而與本發明之胜肽連結。

於本發明之某態樣中，結合物係SPINK2突變體胜肽、與抗體之Fc區域或其片段的融合體。抗體之起源係人類、及非人類動物，可列舉例如，小鼠、大鼠、兔子等之齧齒類；牛、豬、犬、食蟹猴、狨、恒河猴等其它之哺乳類；雞等之鳥類，適合地為人類。就抗體而言，可例示IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE，適合地為IgG1。更適合地，結合物為本發明之胜肽與人類IgG1之Fc區域或其片段的融合體。有時將本發明之胜肽與抗體之Fc區域或其片段的融合體記載為「Fc融合體」或「Fc結合物」，但任一者皆同義。

就人類IgG1之Fc區域而言，可列舉例如，包含序列識別號34(圖40)所表示的胺基酸序列或由該序列所構成者或其片段，但未被限定於彼等。抗體之Fc區域或其片段可為野生型、突變型之任一者。

藉由將抗體之Fc區域之胺基酸殘基的一部份進行取代，可調整效應子(effector)機能(參照WO88/007089、W094/28027、W094/29351)。就使效應子機能減弱的IgG1的突變體而言，可列舉IgG1 LALA(IgG1-L234A、L235A)、IgG1 LAGA(IgG1-L235A，G237A)等。人類IgG2，於5種存在的人類IgG亞群中，經由補體結合的CDC活性、抗體依存性的細胞毒性這樣的效應子機能非常弱(Bruggemann et al.，J.Exp.Med.，1351-1361，1987)。人類IgG4，於5種存在的人類IgG亞群中，經由補體結合的CDC活性、抗體依存性的細胞毒性這樣的效應子機能非常弱(Bruggemann et al.，J.Exp.Med.，1351-1361，1987)。使用IgG4的情形，藉由將恆定區域之胺基酸殘基的一部份進行取代，IgG4特有之分割被抑制，且可延長半衰期(Mol.Immunol.，30，105-108，1993)。就IgG4之突變體而言，可列舉IgG4P(IgG4-S241P)或IgG4P FALA(IgG4-S241P，F234A，L235A)等。人類IgG4P係表示一種突變體，係將參與由H鏈彼此的結合的H2L2四聚體形成的人類IgG4之第241號絲胺酸殘基取代為人類IgG1之如與人類IgG2同樣的序列的脯胺酸，而抑制H2L2四聚體形成，血中之穩定性提高的突變體(Angal et al.，Mol.Immunol.，30，105-108，1993)。IgG4P FALA，藉由將與存在於CH2域的FcγRIII之相互作用上必要的胺基酸殘基2個取代為丙胺酸，進一步使效應子機能減弱(Parekh et al.，MAbs，310-318，2012)。彼等之不僅經人工改變的Fc區域，於天然發現的Fc區域序列之多型亦包含於「突變型」之範圍。

結合物可為SPINK突變體胜肽以外之胜肽與抗體之Fc區域或其片段的融合體，可列舉人類腫瘤壞死因子Ⅱ型受體(Tumor Necrosis Factor Receptor(腫瘤壞死因子受體)：TNFR)之細胞外域蛋白質與Fc之結合物(依那西普(etanercept))、人類細胞毒性T淋巴球抗原-4(Cytotoxic T Lymphocyte-associated Antigen 4(細胞毒性T淋巴球相關抗原4)：CTLA4)之細胞外域蛋白質與Fc之結合物(阿巴西普(abatacept))、人類血管內皮增殖因子受體(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor(血管內皮生長因子受體)：VEGFR)之細胞外域蛋白質與Fc之結合物(阿柏西普(aflibercept))、人類血液凝固第Ⅷ因子與Fc之結合物(依伐凝血素α(efraloctocog alfa))、人類血液凝固第Ⅸ因子與Fc之結合物(埃夫曲那科α(eftrenonacog alfa))、人類促血小板生成素(thrombopoietin)受體結合胜肽與Fc之結合物(羅米司亭(romiplostim))、人類類升糖素胜肽-1(Glucagon-Like Peptide(升糖素類似胜肽)：GLP-1)類似物與Fc之結合物(度拉糖肽(dulaglutide))等，但未被限定於彼等。

於某態樣，於結合物所包含的胜肽，可列舉心房利鈉肽(Atrial Natriuretic Peptide(ANP))、瘦素(Leptin)、介白素-2(IL-2)、IL-22、分泌素、β- 腦內啡、GLP-1、纖維母細胞生長因子-2(FGF-2)等，但未被限定於彼等。

於某態樣，結合物所包含的胜肽可為抗體之抗原結合片段。於本發明，「抗體之抗原結合片段」係意指保持辨識抗原的機能的抗體之部分片段，與「抗體之機能性片段」同義。就抗體之抗原結合片段而言，可列舉例如，Fab、F(ab’)2、scFv、Fab’、單股免疫球蛋白等，但未被限定於彼等。該抗體之機能性片段係除了藉由將抗體之全長分子以木瓜酵素、胃蛋白酶等酵素處理而獲得者之外，亦可為使用重組基因而於適當宿主細胞所產生的重組蛋白質。

於SPINK2突變體等之胜肽的Fc結合物，該胜肽可位於Fc區域或其片段之胺基末端側，Fc區域亦可為位於該胜肽之胺基末端側，任一者皆可，但適合地為前者。又，該胜肽與Fc區域或其片段可直接融合，亦可通過連接子等而間接地融合，任一者皆可。連接子為胜肽及/或非胜肽。又，SPINK2突變體等之胜肽的Fc結合物係除了該胜肽、Fc區域或其片段、及任意之存在於兩者之間的部分(連接子等)，可含有其它之胜肽或非胜肽。

對於胜肽，為了發揮或增強藥理活性，可結合有其它之藥物。於抗體領域中作為抗體-藥物結合物(antibody-drug conjugate：ADC)而所屬技術領域中具通常知識者周知之技術或態樣，係藉由將抗體取代為本發明之胜肽，而可成為本發明之一部分的態樣。

再者，胜肽係亦可進一步包含發揮對其它之標的分子的活性的1個或2個以上之部分，可為與此種部分結合。就該「部分」而言，可例示抗體或其片段、具有如SPINK2突變體的抗體以外之骨架的蛋白質或其片段。作為於抗體領域中多重特異性抗體及雙特異性抗體(multispecific antibody、bispecific antibody)而所屬技術領域中具通常知識者周知之技術或態樣，係藉由將彼等所包含的2個以上之「抗體」之中至少1個取代為本發明的胜肽，而成為本發明之結合物之一部分的態樣。

又，胜肽或其前驅物可包含訊息序列。存在或附加於某胜肽或其前驅物之N末端的訊息序列係有用於將該胜肽送達至細胞的特定區域，例如，若為大腸桿菌則為周質，若為真核細胞則為內質網，對於所屬技術領域中具通常知識者有許多的訊息序列為周知，可因應宿主細胞來選擇。就於大腸桿菌的周質中使所欲之胜肽分泌的訊息序列而言，可例示OmpA，包含訊息序列的形態亦被包含在於本發明之結合物的範圍。

又，藉由對於胜肽事先附加標籤，可藉由親和性層析而將該胜肽純化。例如，可於其C末端包含生物素、Strep‐標籤(註冊商標)、Strep‐標籤II(註冊商標)、His6等之寡組胺酸、多組胺酸、免疫球蛋白域、麥芽糖結合蛋白質、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、攜鈣蛋白(calmodulin)結合胜肽(CBP)、長葉毛地黃配質(digoxigenin)或二硝基酚等之半抗原(hapten)、FLAG(註冊商標)等之抗原決定位標籤、myc標籤、HA標籤等(以下統稱為「親和性標籤(affinity tag)」)。標籤加成物亦可作為其一部分之態樣而被包含於本發明之結合物中。本發明之結合物亦可全體為胜肽(多胜肽)。

又，胜肽係可包含用以標識的部分，具體而言，可結合酵素標識、放射性標識、著色標識、螢光標識、發色標識、發光標識、半抗原、長葉毛地黃配質、生物素、金屬複合體、金屬、膠態金等之標識部分。包含用以標識的部分的態樣亦包含於本發明之結合物的範圍。

再者，於胜肽，亦可包含天然胺基酸及非天然胺基酸之任一者，就天然胺基酸而言，亦可包含L-胺基酸及D-胺基酸之任一者。

又，胜肽可呈單體、二聚體、三聚體以上之寡聚物或多聚物而存在。二聚體、三聚體以上之寡聚物及多聚物可為由單一之單體構成的均聚物、及由2個以上之不同單體構成的異聚物之任一者。單體係有例如會迅速地擴散且對組織的滲透優異之情形。二聚體、寡聚物及多聚物例如可具有於局部對標的分子的活性優異、或具有慢的解離速度等之有利面。除了自發的二聚體化、寡聚物化及多聚物化以外，刻意進行的二聚體化、寡聚物化及多聚物化，亦可藉由將jun-fos域、白胺酸拉鍊等導入本發明之胜肽而成。

再者，胜肽能夠以單體、二聚體、三聚體以上的寡聚體或多聚體而發揮對1個或2個以上之標的分子的活性。

又，就胜肽可採取的形態而言，可列舉被單離之形態(冷凍乾燥樣品、溶液等)、上述之結合物體、結合於其它分子的形態(固相化的形態、與異分子之集合體、與標的分子結合的形態等)等，但未受限於彼等，且可任意地選擇適合表現、純化、使用、保存等之形態。

就血中動態被改善之本發明之結合物所包含的SPINK2突變體所具有的胺基酸序列而言，可列舉前述之(a1)、(a2)、(a3)、(a4)等。又，血中動態被改善之本發明之SPINK2突變體Fc結合物之胺基酸序列中，就附加於胺基末端的1個或2個以上，適合地為除去1至數個之胺基酸的胺基酸序列而言，若為包含作為SPINK2突變體之胺基酸序列之前述之(a1)、(a2)、(a3)或(a4)、及作為抗體之Fc區域之胺基酸序列之前述之各種Ig的Fc區域或其片段之胺基酸序列，則未特別限定，可列舉例如，可例示如下列的胺基酸序列：(b1)包含由序列識別號2(圖8)而成的胺基酸序列及人類IgG1之Fc區域之胺基酸序列(例如，序列識別號34、圖40)的胺基酸序列；(b2)於前述(b1)記載之胺基酸序列中有1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2、或1個之胺基酸取代、缺失、附加及/或***而成且保持對包含(b1)記載之胺基酸序列的結合物之具有的標的分子的活性之一部份或全部的胜肽或結合物所包含的胺基酸序列；(b3) 由核苷酸序列所編碼的胺基酸序列，該核苷酸序列於嚴苛條件下和與編碼前述(b1)記載之胺基酸序列的核苷酸序列互補的核苷酸序列雜交，且編碼保持對包含(b1)記載之胺基酸序列的結合物之具有的標的分子的活性之一部份或全部的胜肽或結合物所包含的胺基酸序列；及(b4)與前述(b1)記載之胺基酸序列為60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%以上相同且保持對包含(b1)記載之胺基酸序列的結合物之具有的標的分子的活性之一部份或全部的胜肽或結合物所包含的胺基酸序列。

5.胜肽或結合物之血中動態改善本發明係提供一種胜肽或含有胜肽之結合物之血中動態改善方法。本發明之胜肽(包含結合物所包含者，適合地為具有對疾病相關標的分子的活性)之具有的胺基酸序列之第1號胺基酸(與胺基末端之胺基酸相同)之進一步於胺基末端側可附加1個或2個以上、適合地為1至數個之胺基酸(可為天然胺基酸以外之胺基酸)。就此種胺基酸之附加而言，可列舉適合地為酸性胺基酸，更適合地為Asp及/或Glu有1至數個附加者(可包含Asp與Glu兩者)，進一步適合地為Asp有1至數個附加者或Glu有1至數個附加者。附加的Asp及/或Glu等之胺基酸之個數，適合地為1至5個，或1至4個，更適合地為1至3個，進一步適合地為2或3個，最適合地為3個。

藉由該對胺基末端之胺基酸附加，可改善胜肽或結合物之血中動態。血中動態之改善，若為被投予至個體的胜肽或結合物伴隨時間的經過，顯示於血液循環採取的動態(吸收或分布等)與消失(代謝或***等)被改善的指標之改善，則未特別限定，但適合地為可藉由血中藥物濃度之經時的減少的抑制(亦稱為「PK之延長」)、血中曝露量(AUC)之增大、藥物消失半衰期(t1/2)之延長、藥物最高血中濃度(C_max )之上升、及/或達到最高血中濃度為止的時間(t_max )之縮短縮而判定，更適合地為血中藥物濃度之經時的減少的抑制(PK之延長)或血中曝露量(AUC)之增加。於SPINK2突變體等之胜肽有抗體之Fc區域或其片段融合而成的結合物(適合地為Fc區域位於該胜肽之羧基末端側)之胺基末端，可附加1個或2個以上、1至數個、1至5個、或1至4個，更適合地為附加1至3個，進一步適合地為附加2或3個，最適合地為附加3個之胺基酸，就合適的胺基酸而言，為Asp及/或Glu，更適合地為Asp或Glu，進一步適合地為3個之Asp或Glu，最適合地為3個Asp。此種胺基酸附加的形態係包含於本發明之結合物之範圍。

若為1個或2個以上、適合地為1至數個之胺基酸、適合地為Asp及/或Glu附加於胜肽或結合物(適合地為Fc融合體)之胺基末端，雖局部地為有負電荷的帶電，但對胜肽或結合物之等電點(pI)並無大的影響，抑制投予後初期中的胜肽或結合物之血中濃度低下，與原本之胜肽或結合物比較，可將時間血中濃度較長時間保持高濃度。由於負電荷胺基酸之附加未對於胜肽或結合物之pI有大影響，不僅血中動態，可最小化對生物學的或藥理學的活性、物理化學的性質等之影響。

本發明亦提供血中動態被改善的胜肽及結合物。分別可列舉附加有1個Asp的結合物之例(D1-K51028-Fc、序列識別號7、圖13：D1-K50055-Fc、序列識別號14、圖20：D1-K51028-Fc(IgG2)、序列識別號44、圖50：D1-K51028-Fc(IgG4P)、序列識別號47、圖53)、附加有2個Asp的結合物之例(D2-K51028-Fc、序列識別號8、圖14)、附加有3個Asp的結合物之例(D3-K51028-Fc、序列識別號9、圖15：D3-K51028-Fc(IgG2)、序列識別號45、圖51：D3-K51028-Fc(IgG4P)、序列識別號48、圖54)、附加有4個Asp的結合物之例(D4-K51028-Fc、序列識別號10、圖16)、附加有5個Asp的結合物之例(D5-K51028-Fc、序列識別號11、圖17)、附加有1個Glu的結合物之例(E1-K51028-Fc、序列識別號13、圖19)，但血中動態被改善的結合物並未限定於彼等，於具有對任意之標的分子的活性的胜肽(適合地為該胜肽之Fc融合體)，藉由適用上述之血中動態改善方法，可改善具有所冀望之藥理活性的胜肽之血中動態，且可獲得血中動態被改善的胜肽或結合物。

6.胜肽或結合物之調製本發明亦提供包含編碼胜肽或包含該胜肽的結合物所包含的胺基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下，稱為「編碼基因」)、有***編碼基因的重組載體、有導入該基因或載體的細胞(以下，「含有編碼基因的細胞」)、產生胜肽或結合物的細胞(以下僅稱為「產生細胞」)、包含培養含有編碼基因的細胞或產生細胞的步驟之胜肽或結合物之製造方法。

對於設計編碼胺基酸序列的核苷酸序列，可使用1種或2種以上對應於各胺基酸的密碼子。因此，編碼某胜肽所具有的單一之胺基酸序列的鹼基序列係可具有複數之變化。於該密碼子之選擇之際，可因應包含該核苷酸序列的多核苷酸或含其之載體被導入的表現用之宿主細胞的密碼子使用(codon usage)而選擇適當密碼子，或者適當調節複數的密碼子的使用頻率或比例。例如，使用大腸桿菌作為宿主細胞之情形，可使用在大腸桿菌中使用頻率高的密碼子而設計核苷酸序列。

編碼基因可與一個或二個以上的調節序列機能性連結。所謂「機能性連結」意指可使所連結之編碼基因表現、或使編碼基因所包含的核苷酸序列能表現。調節序列包含含有與轉錄調節及/或轉譯調節相關之資訊的序列元件(sequence element)。調節序列依據品種而為各式各樣，但一般而言，包含啟動子，且包含由原核生物的-35/-10匣(box)及夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno sequence)、真核生物的TATA匣(box)、CAAT序列、及5’加帽序列(capping sequence)等所例示之與轉錄及轉譯的起始相關之5’非編碼序列。該序列亦可包含強化元件及/或抑制元件(repressor element)、以及用於將天然型或成熟型的胜肽送達至宿主細胞內外的特定的區塊且能被轉譯的訊息序列、前導序列等。又，調節序列可包含3’非編碼序列，該序列中，能包含與結束轉錄或多腺核苷酸化等相關之元件。惟，與結束轉錄相關之序列，於在特定的宿主細胞中未充分發揮機能之情形，能以適於該細胞的序列取代。

作為啟動子序列，於原核生物可例示tet啟動子、lacUV5啟動子、T7啟動子等，於真核細胞可例示SV40啟動子、CMV啟動子等。

編碼基因可為經單離的形態、包含於載體或其它之選殖媒介物(vehicle)(以下，僅稱為「載體」：質體、噬菌體質體(phagemid)、噬菌體、桿狀病毒(baculovirus)、黏接質體等)中或染色體中的形態，但未限定於彼等之形態。載體，除了上述調節序列之外，亦可含有適於表現所使用的宿主細胞的複製序列及控制序列、以及賦予表現型的選擇標記(selective marker)，該表現型係能選擇藉由轉形等而導入有核酸分子的細胞之表現型。

編碼基因、或包含編碼基因的載體，可藉由轉形等所屬技術領域中具通常知識者周知之方法導入至可表現該基因或為其轉譯產物的胜肽的宿主細胞。導入編碼基因或該載體的宿主細胞係可於適合該基因或胜肽之表現的條件下進行培養。宿主細胞可為原核及真核的任一者，於原核可例示大腸桿菌、枯草桿菌等，於真核可例示啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等酵母、SF9、High5等昆蟲細胞、HeLa細胞、CHO細胞、COS細胞、NS0等動物細胞。藉由使用真核細胞等作為宿主細胞，可對所表現之本發明之胜肽施予所冀望的轉譯後修飾。就轉譯後修飾而言，可例示糖鏈等官能基添加、胜肽或蛋白質的添加、胺基酸的化學性質的變換等。又，亦能人工地對本發明的胜肽施予所冀期望的修飾。此種胜肽之修飾體亦包含於本發明的胜肽或結合物的範圍中。

本發明亦提供胜肽或結合物之製造方法。於該方法，包含：培養含有編碼基因之細胞或產生細胞的步驟1、及/或自步驟1獲得的培養物回收胜肽或結合物的步驟2。於步驟2，可適用所屬技術領域中具通常知識者周知之分劃(fractionation)、層析、純化等操作，例如，能適用後述之藉由利用本發明之抗體的親和性層析而純化。

本發明之胜肽或結合物係亦可藉由梅里菲爾德(Merrifield)等人的胜肽固相合成法、以及利用三級丁氧羰基(t-Butoxycarbonyl：Boc)或9-茀基甲氧羰基(9-Fluorenylmethoxycarbonyl：Fmoc)等之有機合成化學的肽合成法所例示之化學合成、體外轉譯等的其它所屬技術領域中具通常知識者周知之方法而製造。

7.醫藥組成物本發明亦提供包含胜肽或結合物的醫藥組成物。

本發明之醫藥組成物係對於下述各種疾病的治療及/或預防有用，該疾病係由疾病相關標的分子所引起或進一步惡化，且可藉由阻礙或抑制該標的分子之表現或機能，而能抑制、治癒該引起或進一步惡化，能維持或改善症狀，能回避二次性疾病等。醫藥組成物係適合地為包含具有對疾病相關標的分子的活性的原本之胜肽或結合物之血中動態被改善的胜肽或結合物。

於本發明之醫藥組成物，可使其含有治療或預防上有效量之具有對疾病相關標的分子的活性的胜肽或結合物與藥學上可容許的稀釋劑、擔體、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或佐劑。

「治療或預防上有效量」係意指對特定的疾病、投予形態及投予途徑會發揮治療或預防效果之量，與「藥理學上有效之量」同義。

於本發明之醫藥組成物，可使其含有用以使pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、該組成物或其所包含的胜肽、結合物等之穩定性、溶解性、緩釋性、吸收性、滲透性、劑型、強度、性狀、形狀等變化、維持、保留的物質(以下，稱為「製劑用之物質」)。就製劑用之物質而言，若為藥理學上可容許的物質，則未特別限定。例如，為非毒性或低毒性，係製劑用的物質所適合具備之性質。

作為製劑用的物質，可列舉例如以下之物，但並不受限於此等；甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類；抗菌劑；抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑；磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、Tris-鹽酸(Tris-HCl)溶液等之緩衝劑；甘露醇或甘胺酸等之填充劑；乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑；咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精等之錯合劑；葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑；單醣類、雙醣類或葡萄糖、甘露糖或糊精等之其它碳水化合物；著色劑；香味劑；稀釋劑；乳化劑；聚乙烯吡咯啶等之親水聚合物；低分子量多胜肽；鹽形成相對離子；氯化苄烷銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、洛赫西定(Chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑；甘油、丙二醇或聚乙二醇(PEG)等之溶媒；甘露醇或山梨醇等之糖醇；懸浮劑；山梨醇酐酯(sorbitan ester)、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等之聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、三木甲胺(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑；蔗糖或山梨醇等之穩定化增強劑；氯化鈉、氯化鉀、甘露醇或山梨醇等之彈性增強劑；輸送劑；稀釋劑；賦形劑；及/或藥學上之佐劑。含有使胜肽或結合物含有於微脂體中者、該胜肽或結合物與微脂體結合而成的修飾體的醫藥組成物亦包含於本發明。

賦形劑或擔體通常為液體或固體，只要為注射用之水、生理食鹽水、人工腦脊髓液、其它能用於經口投與或非經口投與用的製劑之物質，則未特別限定。作為生理食鹽水，可列舉中性者、包含血清白蛋白者等。

作為緩衝劑，可例示以醫藥組成物的最終pH成為7.0至8.5之方式所調製的Tris緩衝液、同樣地以成為4.0至5.5之方式所調製的乙酸緩衝液、同樣地以成為5.0至8.0之方式所調製的檸檬酸緩衝液、同樣地以成為5.0至8.0之方式所調製的組胺酸緩衝液等。

本發明之醫藥組成物係固體、液體、懸浮液等。作為本發明之另外的醫藥組成物之例，可列舉冷凍乾燥製劑。對於將冷凍乾燥製劑成型，可使用蔗糖等的賦形劑。

作為本發明之醫藥組成物之投予路徑，可為點眼、經腸投予、局部投予及非經口投予之任一者，可列舉例如，對結膜上的點眼、玻璃體內投予、靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。

該醫藥組成物之組成可因應投予方法、對標的的活性、結合親和性等而確定。對標的的活性越強，則可以越少投予量而發揮其藥效。

本發明之胜肽或結合物之投予量係只要為藥理學上有效量則未限定，可因應個體的品種、疾病種類、症狀、性別、年齡、慢性病、該胜肽之對標的的抑制活性、結合親和性、其它要素而適當確定，通常可將0.01至1000mg/kg，適合地為0.1至100mg/kg，於1至180日之間投予1次，或1日2次或3次以上投予。

作為醫藥組成物的形態，可例示注射劑(包含冷凍乾燥製劑、點滴劑)、栓劑、經鼻型吸收製劑、經皮型吸收製劑、舌下劑、膠囊、錠劑、軟膏劑、顆粒劑、氣霧劑、丸劑、散劑、懸浮劑、乳劑、點眼劑、活體植入型製劑等。

胜肽、結合物、含有彼等的醫藥組成物係可與其它之醫藥同時或分別投予。例如，可投予其它之醫藥後，投予含有胜肽或結合物作為有效成分的醫藥組成物，或投予該醫藥組成物後，投予其它之醫藥、或同時投予該醫藥組成物與其它之醫藥。同時投予的情形，胜肽或結合物與其它之醫藥可被含有在單一製劑、及各別製劑(複數的製劑)之任一者。

彼等之其它醫藥亦有為1個的情形，亦可投予或接受2個、3個或者其以上。將彼等統稱為本發明之醫藥組成物「與其它醫藥的併用」或「與其它醫藥的組合」，除本發明之胜肽或其結合物之外，包含其它醫藥或與其它療法組合而被使用的本發明之醫藥組成物亦作為「與其它醫藥的併用」或「與其它醫藥的組合」之態樣而包含於本發明。 [實施例]

於以下之實施例，針對本發明之一部分態樣進一步詳述，但本發明未被限定於彼等。

又，於下述實施例中與基因操作有關的各操作只要未特別明示，則依據「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.，Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，Cold SpringHarbor Laboratory Press於1982年發刊或1989年發刊)記載之方法及其它之所屬技術領域中具通常知識者所使用的實驗書中記載之方法進行，或者於使用市售的試藥或套組的情形，按照市售品之指示書進行。

實施例1.KLK5抑制SPINK2-Fc融合體之調製 (1-1)KLK5抑制SPINK2-Fc融合體表現載體之構築將各抑制SPINK2之序列(序列表)作為模板，藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 20秒)×30循環)而將抑制劑片段(D0~D5、E1)增幅。

抑制劑片段 (D0) 用引子 引子1：5’-AGATGGGTGTTGTCTGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3’(序列識別號15：圖21) 引子2：5’-GCAGGGGCCATTCCGGAT-3’(序列識別號16：圖22)

抑制劑片段 (D1) 用引子 引子3：5’-AGATGGGTGTTGTCTGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3’(序列識別號17：圖23) 引子2(序列識別號16：圖22)

抑制劑片段 (E1) 用引子 引子4：5’-AGATGGGTGTTGTCTGAAGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3’(序列識別號18：圖24) 引子2(序列識別號16：圖22)

抑制劑片段 (D2) 用引子 引子5：5’-AGATGGGTGTTGTCTGACGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3’(序列識別號19：圖25) 引子2(序列識別號16：圖22)

抑制劑片段 (D3) 用引子 引子6：5’-AGATGGGTGTTGTCTGATGACGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3’(序列識別號20：圖26) 引子2(序列識別號16：圖22)

抑制劑片段 (D4) 用引子 引子7：5’-AGATGGGTGTTGTCTGATGATGACGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3’(序列識別號21：圖27) 引子2(序列識別號16：圖22)

抑制劑片段 (D5) 用引子 引子8：5’-AGATGGGTGTTGTCTGACGATGATGACGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3’(序列識別號22：圖28) 引子2(序列識別號16：圖22)

藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 10秒)×30循環)而增幅片段A。引子9：5’-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCT-3’(序列識別號23：圖29) 引子10：5’-AGACAACACCCATCTAGGAGCGGCCACCAGCAGCAGAAAGAACC-3’(序列識別號24：圖30)

藉由將人類IgG1之Fc區域(序列識別號34：圖40)作為模板而使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30循環)，增幅含有人類IgG1之Fc區域的片段B。引子11：5’-ATCCGGAATGGCCCCTGCGAACCCAAGAGCTGCGAC-3’(序列識別號25：圖31) 引子12：5’-AAAAGTTTAAACTCATTTGCCGGGGCTCAG-3’(序列識別號26：圖32)

藉由上述增幅的抑制劑片段與片段A、使用片段B、引子9(序列識別號23：圖29)、引子12(序列識別號26：圖32)及KOD-plus-(TOYOBO)的重疊PCR法，而增幅所冀望的DNA片段。

於將所增幅的片段供給於瓊脂糖凝膠電泳後，切出所冀望的DNA片段，藉由Qiaquick凝膠萃取套組(QIAquick Gel Extraction Kit)(QIAGEN)而調製DNA。將調製的DNA片段及哺乳細胞表現載體pCMA使用限制酵素XbaI(NEB)及PmeI(NEB)，於37℃處理1小時以上，於瓊脂糖凝膠電泳後，切出所冀望的DNA片段，藉由QIAquick PCR純化套組(QIAquick PCR Purification Kit)(QIAGEN)純化。使用LigaFast快速DNA連接系統(LigaFast Rapid DNA Ligation System)(Promega)，於室溫使各自的純化片段反應10分鐘而實施連接(ligation)反應。連接溶液(Ligation solution)係添加至大腸桿菌JM109(TOYOBO)，在冰上靜置30分鐘後，在42℃進行45秒鐘的熱處理，再於冰上靜置5分鐘，接種至包含0.1mg/ml胺苄青黴素(ampicillin)的2YT盤後，於37℃靜置培養一晩，藉此轉形大腸桿菌。隔日，將經轉形的大腸桿菌，植菌至包含0.1mg/ml胺苄青黴素之Terrific Broth培養基(Invitroge)，於37℃培養一晩後，使用QIAprep 96渦輪式小量製備套組(QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit)(QIAGEN)回收質體DNA(以下，稱為「小量製備(miniprep)處理」)，藉由實施序列解析，而構築哺乳細胞表現載體pCMA＿KLK5抑制SPINK2-Fc融合體(各殖株之ID係記載於圖1)。

再者，將KLK5抑制SPINK2殖株pCMA＿K51028-Fc作為模板，使用下述引子及KOD-Plus突變套組(KOD-Plus-Mutagenesis Kit)(TOYOBO)，將於KLK5抑制SPINK2與人類IgG1之Fc區域之間***5個Asp的片段進行增幅，自己環狀化。依據上述記載之方法而實施大腸桿菌之轉形與序列解析，構築哺乳細胞表現載體pCMA＿K51028-D5-Fc。

引子13：5’-GATGACGACGAACCCAAGAGCTGC-3’(序列識別號27：圖33) 引子14：5’-ATCGTCGCAGGGGCCATTCCG-3’(序列識別號28：圖34)

(1-2)KLK5抑制SPINK2-Fc融合體之表現純化 (1-1)所構築的表現載體係使用PEI MAX 40000(Polysciences)而轉染於Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific)，培養6日後回收培養上清液。使用MabSelect SuRe(GE healthcare)，自培養上清液回收所冀望之Fc融合體，使用Amicon Ultra NMWL 10,000(Merck 微孔)而對PBS進行緩衝液交換，而調製KLK5抑制SPINK2-Fc融合體(圖1)。

實施例2.KLK5抑制SPINK2-Fc融合體之KLK5抑制活性評價 (2-1)KLK5之調製藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 10秒)×30循環)而增幅片段C。引子15：5’-GGCGATTATAAAGATGACGATGATAAACACCATCACCACCATC-3’(序列識別號29：圖35) 引子16：5’-GTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGTTTATCATCGTCAT-3’(序列識別號30：圖36)

其次，分別將編碼人類pro-KLK5(Uniprot：Q9Y337)的核苷酸序列作為模板，藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 60秒)×30循環)而增幅片段。引子17：5’-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGCCACAGCTAGACCCCCT-3’(序列識別號31：圖37) 引子18：5’-CGTCATCTTTATAATCGCCGCTGTTGGCCTGGATGGTTTCCTG-3’(序列識別號32：圖38)

藉由上述增幅的片段與片段C、使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的重疊PCR法，增幅所冀望之DNA片段。引子17(序列識別號31：圖37) 引子19：5’-AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGT-3’(序列識別號33：圖39)

再者，藉由使用限制酵素XbaI(NEB)及PmeI(NEB)的選殖，構築於各基因之C末端附加有Flag tag及His tag的哺乳細胞表現載體pCMA＿pro-KLK5。

(2-2)KLK5之表現純化 (2-1)所構築的表現載體係使用PEI MAX 40000(Polysciences)而轉染Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific)，培養3日後回收培養上清液。使用HisTrap excel(GE healthcare)而自培養上清液回收所冀望之His tag融合蛋白質，使用Amicon Ultra NMWL 10,000(Merck 微孔)而對PBS進行緩衝液交換，而純化KLK5。

(2-3)KLK5抑制SPINK2-Fc融合體之KLK5抑制活性評價將基質胜肽以DMSO溶解成10mM，以試驗緩衝液(Assay buffer)(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)稀釋而以終濃度100μM使用。各自將以試驗緩衝液稀釋的KLK5與KLK5抑制SPINK2-Fc融合體各25μL混合，於37℃使反應20分鐘後，添加50μL的以試驗緩衝液稀釋的基質，以Enspire(PerkinElmer)測定螢光訊號。各酵素與基質之組合係使用如以下者。又，各抑制胜肽Fc融合體係終濃度0.022~1,300nM，於反應及測定，使用PROTEOSAVE(註冊商標)SS96F黑色盤(Sumitomo Bakelite股份有限公司)。

人類KLK5抑制活性評價；終濃度20nM KLK5、終濃度100μM 基質胜肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC(R&D 系統；ES011)、螢光訊號激發380nm/發射460nm

算出各濃度中的各SPINK2-Fc融合體之基質胜肽分解速度，將抑制劑濃度0nM之分解速度設為100%，使用GraphPad Prism(5.0版；GraphPad Software Inc.)，以四參數邏輯曲線(4-parameter logistic curve)回歸為S字型。任一個SPINK2-Fc融合體皆於低濃度抑制KLK5酵素活性，於設計之間未觀察到於KLK5抑制活性有變化(圖2)。

實施例3.SPINK2-Fc融合體之小鼠PK試驗 (3-1)動物試驗將實施例1製作的KLK5抑制SPINK2-Fc融合體以PBS調製成0.75mg/mL，作為投予液。對於到貨後馴化4~8日的4.5週齡至8週齡之雄性C57BL/6J小鼠(日本Charles River股份有限公司)，以5mg/kg之投予量進行靜脈內投予。靜脈內投予係以頸靜脈內投予、尾靜脈內投予之任一者來實施。頸靜脈內投予係如以下所示進行。對小鼠實施異氟醚(isoflurane)吸入麻醉，頸部體毛以毛髮推剪器剃毛後將皮膚切開而使頸靜脈露出。將注滿投予液的胰島素皮下投予用附針注射筒(29G)之針頭由露出的頸靜脈自下部的肌肉穿刺，以目視確認針頭進入頸靜脈內後，壓入栓塞而投予。尾靜脈內投予係如以下所示進行。對小鼠施予異氟醚吸入麻醉，藉由尾部以微量溫水沾濕的布溫暖或以酒精綿擦拭尾部而使靜脈擴張，將注滿投予液的胰島素皮下投予用附針注射筒的針頭***尾靜脈內。拉出些許栓塞而確認注射筒內有無靜脈血的回流後，壓入栓塞而投予。於胰島素皮下投予用附針注射筒一次吸入肝素鈉注射液而使吐出，作為採血用注射筒。於投予後5分鐘、1小時、3小時、6小時及24小時，使用採血用注射筒而於異氟醚吸入麻醉下自非投予側的頸靜脈採血各0.05mL。將血液移至1.5mL容量的聚丙烯管，冷卻下，藉由於21,600×g之離心力施加3分鐘離心分離，而獲得上清液(血漿)。

(3-2)測定血漿中KLK5抑制SPINK2-Fc融合體之濃度測定係使用全自動免疫分析平台(fully automatic immunoassay platform)、Gyrolab xP Workstation(GYROS PROTEIN Technologies)來實施。將KLK5抑制SPINK2-Fc融合體以含有1%空白小鼠血漿的RexxipAN(GYROS PROTEIN Technologies)由2,000ng/mL以2倍公比作8階段稀釋，調製校準曲線用試料。實驗所獲得的血漿以RexxipAN作100倍稀釋，作為測定用試料。經生物素標識的抗SPINK2抗體(Atlas 抗體)以含有0.1%Tween20(註冊商標)的PBS調製為350nM，作為捕捉抗體。以DyLight650標識的自社製抗SPINK2抗體6D8以RexxipF緩衝液調製為20nM，作為檢測抗體。將校準曲線試料、測定用試料、捕捉抗體、檢測抗體及Wash緩衝液(含有0.1%Tween20(註冊商標)的PBS)置入96井PCR盤，與Gyrolab Bioaffy 200一起設置於Gyrolab xP workstation，以3-StepC-A-D(wizard 方法)測定。校準曲線使用Gyrolab Evaluator軟體而以四參數邏輯模式(加權；反應)進行回歸。使用Phoenix WinNonlin 6.3(Certara L.P.)而實施非腔室(Non-compartment)解析，算出投予後0至24小時中的血漿中濃度-時間曲線下面積(AUC_0-24h )(計算方法；線性上升-對數下降(Linear Up Log Down))。

(3-3)SPINK2-Fc融合體之PK KLK5抑制SPINK2-Fc融合體K51028-Fc係於小鼠投予後7日顯示圖3(A)所示的血中動態，投予後至3小時為止觀察到大幅的血中濃度的降低(圖3(B))。藉由於K51028-Fc之N末端使附加1殘基之Asp或Glu，於投予後至3小時為止觀察到的大幅的投予檢體之血中濃度降低係被抑制(圖4)。此效果與序列無關，於D1-K51028-Fc、D1-K50055-Fc任一序列皆觀察到同樣的效果(圖5)。再者，將K51028-Fc於對象將N末端Asp之附加數設為1~5殘基，任一者之設計亦抑制於投予後至3小時為止觀察到的投予檢體之血中濃度大幅降低(圖6)。再者，藉由投予後至3小時為止之血中濃度大幅降低的改善，觀察到投予後至24小時為止之血液曝露亦大幅增加(表1)。血中曝露量之亢進效果係Asp附加數3(D3)為最高，Asp附加數2(D2)、Asp附加數1(D1)的順序。然而，於將Asp5個配置於SPINK2與Fc區域之間的K51028-D5-Fc，投予後至3小時為止觀察到的大幅降低投予檢體之血中濃度的抑制及投予後至24小時為止的血液曝露之增加無關聯。由以上之結果，於SPINK2-Fc之N末端部分，藉由***1~5個之Asp或Glu，抑制了於投予後初期所觀察到的血中濃度的降低，達成大幅增加血液曝露。

於Fc融合體之N末端部分配位負電荷胺基酸係對作為Fc融合體之pI無大影響，因使局部帶負電荷電，沒有對活性或物性等之影響。藉由此設計，並無對於對SPINK2突變體胜肽之活性或物性等的大影響，抑制投予後初期中的SPINK2突變體胜肽Fc融合體之血中濃度降低，以高濃度保持投予後之Fc融合體而成功。

[表1] 投予後0至24小時中的血漿中濃度-時間曲線下面積(AUC_0-24h )

ID	AUC _0-24h ( μ g ・ h/mL)
K51028-Fc	13
D1-K51028-Fc	440
D2-K51028-Fc	530
D3-K51028-Fc	598
D4-K51028-Fc	390
D5-K51028-Fc	370
K51028-D5-Fc	77

實施例4.KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體之調製與評價 (4-1)KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體表現載體之構築將(1-1)所構築的哺乳細胞表現載體pCMA＿K51028-Fc、pCMA＿D1-K51028-Fc或pCMA＿D3-K51028-Fc作為模板，藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 75秒)×30循環)而將抑制劑片段(D0-K51028、D1-K51028、D3-K51028)增幅。抑制劑片段 (D0-K51028 、 D1-K51028 、 D3-K51028) 用引子 引子20：5’-TGAGTTTAAACTTTTAAACGGGGG-3’(序列識別號35：圖41) 引子21：5’-GCAGGGGCCATTCCGGATGATCTT-3’(序列識別號36：圖42)

藉由將人類IgG2之Fc區域(序列識別號37：圖43)作為模板而使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30循環)，將含人類IgG2之Fc區域的片段D增幅。引子22：5’-CGGAATGGCCCCTGCGAGCGTAAGTGTTGTGTGGAGTGT-3’(序列識別號38：圖44) 引子23：5’-CCCCGTTTAAACTCACTTTCCAGGGCTCAGGGAAAGGCT-3’(序列識別號39：圖45)

藉由將人類IgG4P之Fc區域(序列識別號40：圖46)作為模板而使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30循環)，將含人類IgG4P之Fc區域的片段E增幅。引子24：5’-CGGAATGGCCCCTGCGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGC-3’(序列識別號41：圖47) 引子25：5’-CCCCGTTTAAACTCATTTGCCCAGGCTCAGAGACAGGGA-3’(序列識別號42：圖48)

於將所增幅的片段供給於瓊脂糖凝膠電泳後，切出所冀望的DNA片段，藉由QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)而調製DNA。於調製的各抑制劑片段，添加片段D或片段E，使用In-Fusion HD選殖套組(TAKARA BIO)，於50℃使反應15分鐘而將片段連結。連結的片段係添加於大腸桿菌JM109(TOYOBO)，於冰上靜置30分鐘後，於42℃熱處理45秒，再於冰上靜置5分鐘，接種至包含0.1mg/ml胺苄青黴素(ampicillin)的2YT盤後，於37℃靜置培養一晩，藉此轉形大腸桿菌。隔日，將經轉形的大腸桿菌，植菌至包含0.1mg/ml胺苄青黴素之Terrific Broth培養基(Invitroge)，於37℃培養一晩後，使用QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(QIAGEN)回收質體DNA(以下，稱為「miniprep處理」)，藉由實施序列解析，構築哺乳細胞表現載體pCMA＿KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體。

(4-2)KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體之表現純化 (4-1)所構築的表現載體，使用PEI MAX 40000(Polysciences)而轉染Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific)，培養6日後回收培養上清液。使用MabSelect SuRe(GE healthcare)，自培養上清液回收所冀望的Fc融合體，使用Amicon Ultra NMWL 10,000(Merck 微孔)，藉由與PBS進行緩衝液交換，調製KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體。

(4-3)KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體之KLK5抑制活性評價將基質胜肽以DMSO溶解成10mM，以試驗緩衝液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)稀釋而以終濃度100μM使用。各自將以試驗緩衝液稀釋的KLK5與KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體各25μL混合，於37℃使反應20分鐘後，添加50μL的以試驗緩衝液稀釋的基質，以Enspire(PerkinElmer)測定螢光訊號。各酵素與基質之組合係使用如以下者。又，各KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體係終濃度1.6~100nM，於反應及測定，使用PROTEOSAVE(註冊商標)SS96F黑色盤(Sumitomo Bakelite股份有限公司)。

算出各濃度中的各KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體之基質胜肽分解速度，將抑制劑濃度0nM之分解速度設為100%，使用GraphPad Prism (5.0版；GraphPad Software Inc.)，以四參數邏輯曲線回歸為S字型。任一者之KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體皆於低濃度抑制KLK5酵素活性，於設計之間未觀察到於KLK5抑制活性有變化(圖55)。

實施例5.KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體之小鼠PK試驗 (5-1)動物試驗將(4-2)製作的KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體以PBS調製成1mg/mL，作為投予液。對於到貨後馴化7日的6週齡之雄性C57BL/6J小鼠(日本Charles River股份有限公司)，以5mg/kg之投予量如以下所示進行頸靜脈內投予。對小鼠施予異氟醚吸入麻醉，頸部體毛以毛髮推剪器剃毛後將皮膚切開而使頸靜脈露出。將注滿投予液的胰島素皮下投予用附針注射筒(29G)之針頭由露出的頸靜脈自下部的肌肉穿刺，以目視確認針頭進入頸靜脈內後，壓入栓塞而投予。於胰島素皮下投予用附針注射筒一次吸入肝素鈉注射液而使吐出，作為採血用注射筒。於投予後5分鐘、1小時、3小時、6小時及24小時，使用採血用注射筒而於異氟醚吸入麻醉下自非投予側的頸靜脈採血各0.03mL。將血液移至1.5mL容量的聚丙烯管，冷卻下，藉由於21,600×g之離心力施加3分鐘離心分離，而獲得上清液(血漿)。

(5-2)測定血漿中KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體之濃度測定係使用全自動免疫分析平台、Gyrolab xP Workstation(GYROS PROTEIN Technologies)而實施。將KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體以含有1%空白小鼠血漿的RexxipAN(GYROS PROTEIN Technologies)由1,000ng/mL以2.7倍公比作7階段稀釋，調製校準曲線用試料。實驗所獲得的血漿係以RexxipAN作100倍稀釋，作為測定用試料。經生物素標識的抗SPINK2抗體(Atlas 抗體)以含有0.1%Tween20(註冊商標)的PBS調製為350nM，作為捕捉抗體。以DyLight650標識的自社製抗SPINK2抗體6D8以RexxipF緩衝液調製為20nM，作為檢測抗體。將校準曲線試料、測定用試料、捕捉抗體、檢測抗體及Wash緩衝液(含有0.1%Tween20(註冊商標)的PBS)置入96井PCR盤，與Gyrolab Bioaffy 200一起設置於Gyrolab xP workstation，以3-StepC-A-D(wizard 方法)測定。校準曲線使用Gyrolab Evaluator軟體而以四參數邏輯模式(加權；反應)進行回歸。使用Phoenix WinNonlin 6.3(Certara L.P.)而實施非腔室(Non-compartment)解析，算出投予後0至24小時中的血漿中濃度-時間曲線下面積(AUC_0-24h )(計算方法；線性上升-對數下降(Linear Up Log Down))。

(5-3)KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2，IgG4P)融合體之PK KLK5抑制SPINK2-Fc(IgG2)融合體D0-K51028-Fc(IgG2)係於小鼠投予後24小時顯示圖56所示的血中動態，投予後至3小時為止觀察到血中濃度的大幅降低。藉由於D0-K51028-Fc(IgG2)之N末端使附加1殘基Asp，投予後至3小時為止觀察到的大幅血中濃度降低係被抑制(圖56)。將N末Asp之附加數作成3殘基亦抑制於投予後3小時為止觀察到的血中濃度大幅降低(圖56)。此效果係與Fc的序列無關，於IgG4P亦同樣地被觀察(圖57)。再者，藉由投予後至3小時為止之血中濃度大幅降低的改善，觀察到投予後至24小時為止之血液曝露亦大幅增加(表2)。由以上之結果，於SPINK2-Fc融合體之N末端部分，藉由附加1殘基之Asp，於SPINK2-Fc融合體之投予後初期觀察到的血中濃度的降低及與其附隨的血中低曝露改善，於融合同型(isotype)之不同的IgG之Fc序列的情形亦發揮相同效果。

於Fc融合體之N末端部分配位負電荷胺基酸，即使採用作為Fc融合體之Fc序列之效應子機能非常弱的IgG2或IgG4P，亦對作為Fc融合體之pI無大影響，因使局部帶負電荷電，沒有對活性或物性等之影響。藉由此設計，並無對於對SPINK2突變體胜肽之活性或物性等的大影響，抑制投予後初期中的SPINK2突變體胜肽Fc融合體之血中濃度降低，以高濃度保持投予後之Fc融合體而成功。

[表2] 投予後0至24小時中的血漿中濃度-時間曲線下面積(AUC_0-24h )

ID	AUC _0-24h ( μ g ・ h/mL)
D0-K51028-Fc(IgG2)	67.8
D1-K51028-Fc(IgG2)	519
D3-K51028-Fc(IgG2)	829
D0-K51028-Fc(IgG4P)	41.7
D1-K51028-Fc(IgG4P)	694
D3-K51028-Fc(IgG4P)	782

[產業上之利用可能性]

本發明之提供的血中動態改善方法係造成含有胜肽或該胜肽的結合物之血中半衰期的延長、血中曝露量之增大等，含有該胜肽或該結合物的醫藥可適合使用於各種疾病之治療或預防等。 [序列表非關鍵詞文字]

序列識別號1：人類SPINK2之胺基酸序列(圖7) 序列識別號2：SPINK2突變體胜肽之通式(圖8) 序列識別號3：人類KLK5之胺基酸序列(圖9) 序列識別號4：KLK5抑制胜肽K50055之胺基酸序列(圖10) 序列識別號5：KLK5抑制胜肽K51028之胺基酸序列(圖11) 序列識別號6：KLK5抑制胜肽Fc融合體D0-K51028-Fc之胺基酸序列(圖12) 序列識別號7：KLK5抑制胜肽Fc融合體D1-K51028-Fc之胺基酸序列(圖13) 序列識別號8：KLK5抑制胜肽Fc融合體D2-K51028-Fc之胺基酸序列(圖14) 序列識別號9：KLK5抑制胜肽Fc融合體D3-K51028-Fc之胺基酸序列(圖15) 序列識別號10：KLK5抑制胜肽Fc融合體D4-K51028-Fc之胺基酸序列(圖16) 序列識別號11：KLK5抑制胜肽Fc融合體D5-K51028-Fc之胺基酸序列(圖17) 序列識別號12：KLK5抑制胜肽Fc融合體K51028-D5-Fc之胺基酸序列(圖18) 序列識別號13：KLK5抑制胜肽Fc融合體E1-K51028-Fc之胺基酸序列(圖19) 序列識別號14：KLK5抑制胜肽Fc融合體D1-K50055-Fc之胺基酸序列(圖20) 序列識別號15：引子1之核苷酸序列(圖21) 序列識別號16：引子2之核苷酸序列(圖22) 序列識別號17：引子3之核苷酸序列(圖23) 序列識別號18：引子4之核苷酸序列(圖24) 序列識別號19：引子5之核苷酸序列(圖25) 序列識別號20：引子6之核苷酸序列(圖26) 序列識別號21：引子7之核苷酸序列(圖27) 序列識別號22：引子8之核苷酸序列(圖28) 序列識別號23：引子9之核苷酸序列(圖29) 序列識別號24：引子10之核苷酸序列(圖30) 序列識別號25：引子11之核苷酸序列(圖31) 序列識別號26：引子12之核苷酸序列(圖32) 序列識別號27：引子13之核苷酸序列(圖33) 序列識別號28：引子14之核苷酸序列(圖34) 序列識別號29：引子15之核苷酸序列(圖35) 序列識別號30：引子16之核苷酸序列(圖36) 序列識別號31：引子17之核苷酸序列(圖37) 序列識別號32：引子18之核苷酸序列(圖38) 序列識別號33：引子19之核苷酸序列(圖39) 序列識別號34：人類IgG1之Fc區域之胺基酸序列(圖40) 序列識別號35：引子20之核苷酸序列(圖41) 序列識別號36：引子21之核苷酸序列(圖42) 序列識別號37：人類IgG2之Fc區域之胺基酸序列(圖43) 序列識別號38：引子22之核苷酸序列(圖44) 序列識別號39：引子23之核苷酸序列(圖45) 序列識別號40：人類IgG4P之Fc區域之胺基酸序列(圖46) 序列識別號41：引子24之核苷酸序列(圖47) 序列識別號42：引子25之核苷酸序列(圖48) 序列識別號43：KLK5抑制胜肽Fc融合體D0-K51028-Fc(IgG2)之胺基酸序列(圖49) 序列識別號44：KLK5抑制胜肽Fc融合體D1-K51028-Fc(IgG2)之胺基酸序列(圖50) 序列識別號45：KLK5抑制胜肽Fc融合體D3-K51028-Fc(IgG2)之胺基酸序列(圖51) 序列識別號46：KLK5抑制胜肽Fc融合體D0-K51028-Fc(IgG4P)之胺基酸序列(圖52) 序列識別號47：KLK5抑制胜肽Fc融合體D1-K51028-Fc(IgG4P)之胺基酸序列(圖53) 序列識別號48：KLK5抑制胜肽Fc融合體D3-K51028-Fc(IgG4P)之胺基酸序列(圖54)

無。

圖1係供給於PK試驗的SPINK2-Fc融合體。圖2係以胜肽基質之分解速度作為指標，呈示KLK5抑制胜肽Fc融合體之KLK5抑制活性(50%抑制濃度：IC₅₀ )的圖。於KLK5抑制活性評價，使用終濃度20nM之KLK5及終濃度100μM之Boc-Val-Pro-Arg-AMC(R&D系統；ES011)。基於K51028-Fc，即使於(A)附加1~5個Asp的情形，或於(B)附加Asp或Glu的情形，亦於KLK5抑制活性無變化。圖3係將5mg/kg之K51028-Fc靜脈內投予至C57BL/6J小鼠，經時地測定血漿中之K51028-Fc濃度的圖。血漿中之K51028-Fc濃度係使用經生物素標識的抗SPINK2抗體(Atlas 抗體)、以DyLight650標識的抗SPINK2抗體6D8(第一三共股份有限公司)及Gyrolab xP Workstation(GYROS PROTEIN Technologies)，(A)測定投予後至1週為止之血漿中之K51028-Fc濃度，(B)測定投予後至24小時為止之血漿中之K51028-Fc濃度。圖4係藉由附加Asp或Glu於K51028-Fc，呈示SPINK2-Fc融合體之血中動態改善的圖。將5mg/kg之受驗物質靜脈內投予至C57BL/6J小鼠，投予後至24小時為止測定血漿中之受驗物質濃度。受驗物質為K51028-Fc、D1-K51028-Fc或E1-K51028-Fc，於受驗物質濃度之測定使用經生物素標識的抗SPINK2抗體、以DyLight650標識的抗SPINK2抗體6D8及Gyrolab xP Workstation。圖5係呈示與K51028-Fc同樣地，於K50055-Fc亦藉由Asp附加而SPINK2-Fc融合體之血中動態改善的圖。圖6係基於K51028-Fc，將對SPINK2-Fc融合體之血中動態改善有效果的Asp附加數最適化的圖。Asp附加數1~5個係任一者皆顯示改善效果，Asp附加數3個顯示最高效果。圖7係人類SPINK2之胺基酸序列(序列識別號1)。圖8係SPINK2突變體胜肽之通式(序列識別號2)。圖9係人類KLK5之胺基酸序列(序列識別號3)。圖10係KLK5抑制胜肽K50055之胺基酸序列(序列識別號4)。圖11係KLK5抑制胜肽K51028之胺基酸序列(序列識別號5)。圖12係KLK5抑制胜肽Fc融合體D0-K51028-Fc之胺基酸序列(序列識別號6)。圖13係KLK5抑制胜肽Fc融合體D1-K51028-Fc之胺基酸序列(序列識別號7)。圖14係KLK5抑制胜肽Fc融合體D2-K51028-Fc之胺基酸序列(序列識別號8)。圖15係KLK5抑制胜肽Fc融合體D3-K51028-Fc之胺基酸序列(序列識別號9)。圖16係KLK5抑制胜肽Fc融合體D4-K51028-Fc之胺基酸序列(序列識別號10) 圖17係KLK5抑制胜肽Fc融合體D5-K51028-Fc之胺基酸序列(序列識別號11)。圖18係KLK5抑制胜肽Fc融合體K51028-D5-Fc之胺基酸序列(序列識別號12)。圖19係KLK5抑制胜肽Fc融合體E1-K51028-Fc之胺基酸序列(序列識別號13)。圖20係KLK5抑制胜肽Fc融合體D1-K50055-Fc之胺基酸序列(序列識別號14)。圖21係引子1之核苷酸序列(序列識別號15)。圖22係引子2之核苷酸序列(序列識別號16)。圖23係引子3之核苷酸序列(序列識別號17)。圖24係引子4之核苷酸序列(序列識別號18)。圖25係引子5之核苷酸序列(序列識別號19)。圖26係引子6之核苷酸序列(序列識別號20)。圖27係引子7之核苷酸序列(序列識別號21)。圖28係引子8之核苷酸序列(序列識別號22)。圖29係引子9之核苷酸序列(序列識別號23)。圖30係引子10之核苷酸序列(序列識別號24)。圖31係引子11之核苷酸序列(序列識別號25)。圖32係引子12之核苷酸序列(序列識別號26)。圖33係引子13之核苷酸序列(序列識別號27)。圖34係引子14之核苷酸序列(序列識別號28)。圖35係引子15之核苷酸序列(序列識別號29)。圖36係引子16之核苷酸序列(序列識別號30)。圖37係引子17之核苷酸序列(序列識別號31)。圖38係引子18之核苷酸序列(序列識別號32)。圖39係引子19之核苷酸序列(序列識別號33)。圖40係人類IgG1之Fc區域之胺基酸序列(序列識別號34)。圖41係引子20之核苷酸序列(序列識別號35)。圖42係引子21之核苷酸序列(序列識別號36)。圖43係人類IgG2之Fc區域之胺基酸序列(序列識別號37)。圖44係引子22之核苷酸序列(序列識別號38)。圖45係引子23之核苷酸序列(序列識別號39)。圖46係人類IgG4P之Fc區域之胺基酸序列(序列識別號40)。圖47係引子24之核苷酸序列(序列識別號41)。圖48係引子25之核苷酸序列(序列識別號42)。圖49係KLK5抑制胜肽Fc融合體D0-K51028-Fc(IgG2)之胺基酸序列(序列識別號43)。圖50係KLK5抑制胜肽Fc融合體D1-K51028-Fc(IgG2)之胺基酸序列(序列識別號44)。圖51係KLK5抑制胜肽Fc融合體D3-K51028-Fc(IgG2)之胺基酸序列(序列識別號45)。圖52係KLK5抑制胜肽Fc融合體D0-K51028-Fc(IgG4P)之胺基酸序列(序列識別號46)。圖53係KLK5抑制胜肽Fc融合體D1-K51028-Fc(IgG4P)之胺基酸序列(序列識別號47)。圖54係KLK5抑制胜肽Fc融合體D3-K51028-Fc(IgG4P)之胺基酸序列(序列識別號48)。圖55係以胜肽基質之分解速度作為指標，呈示KLK5抑制胜肽Fc(IgG2，IgG4P)融合體之KLK5抑制活性(50%抑制濃度：IC₅₀ )的圖。於KLK5抑制活性評價，使用終濃度20nM之KLK5及終濃度100μM之Boc-Val-Pro-Arg-AMC(R&D 系統；ES011)。(A)基於D0-K51028-Fc(IgG2)，附加1或3個Asp的情形，(B)基於D0-K51028-Fc(IgG4P)，附加1或3個Asp的情形，KLK5抑制活性皆無變化。圖56係藉由附加1個以上之Asp於D0-K51028-Fc(IgG2)，呈示SPINK2-Fc(IgG2)融合體之血中動態改善的圖。將5mg/kg之D0-K51028-Fc(IgG2)、D1-K51028-Fc(IgG2)或D3-K51028-Fc(IgG2)靜脈內投予至C57BL/6J小鼠，投予後至24小時為止測定血漿中之D0-K51028-Fc(IgG2)、D1-K51028-Fc(IgG2)或D3-K51028-Fc(IgG2)濃度。於濃度測定，使用經生物素標識的抗SPINK2抗體、以DyLight650標識的抗SPINK2抗體6D8及Gyrolab xP Workstation。圖57係呈示與D0-K51028-Fc(IgG2)同樣地，於D0-K51028-Fc(IgG4P)亦藉由Asp附加而SPINK2-Fc(IgG4P)融合體之血中動態改善的圖。

無。

Claims

一種胜肽之結合物，其係屬於下述(i)或(ii)的胜肽之結合物： (i)胜肽之結合物，其自胺基末端向羧基末端，依序包含1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸、該胜肽所包含的胺基酸序列、及免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列； (ii)胜肽之結合物，其自胺基末端向羧基末端，依序包含1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸、免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列、及該胜肽所包含的胺基酸序列。
如請求項1之結合物，其中該胜肽為SPINK2突變體胜肽。
如請求項1之結合物，其中該胜肽為抗體或其抗原結合片段。
如請求項1至3中任一項之結合物，其中該胜肽所包含的胺基酸序列係通過連接子序列而附加於Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項之結合物，其中該胜肽所包含的胺基酸序列係直接附加於Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。
如請求項1至5中任一項之結合物，其中1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸係通過連接子序列而附加於該胜肽所包含的胺基酸序列、或Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。
如如請求項1至5中任一項之結合物，其中1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸係直接附加於該胜肽所包含的胺基酸序列、或Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。
如請求項1至7中任一項之結合物，其中免疫球蛋白或其片段為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、及/或IgE之Fc區域或其片段。
如請求項1至8中任一項之結合物，其中免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。
如請求項1至9中任一項之結合物，其中免疫球蛋白為人類IgG1。
如請求項1至10中任一項之結合物，其中免疫球蛋白為野生型或突變型。
如請求項1至11中任一項之結合物，其與於胺基末端欠缺1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸的結合物比較，具有經抑制的血中濃度隨時間降低或增加的血中曝露量。
如請求項1至12中任一項之結合物，其與人類疾病相關標的分子結合。
如請求項13之結合物，其中該胜肽為SPINK2突變體，該胜肽所包含的胺基酸序列為序列識別號2(圖8)所表示者。
一種組成物，其包含如請求項1至14中任一項之結合物。
如請求項1至13之結合物，其中該胜肽抑制、阻礙、激動或活化人類疾病相關標的分子之活性。
如請求項16之結合物，其中該胜肽為SPINK2突變體，該胜肽所包含的胺基酸序列為序列識別號2(圖8)所表示者。
一種醫藥組成物，其包含如請求項16或17之結合物。
一種製造如請求項1之結合物之方法，其包含下述之步驟(i)或(ii)而成： (i)於包含該胜肽及免疫球蛋白之Fc區域或其片段的融合體之胺基末端側附加1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸的步驟； (ii)將多核苷酸導入至細胞，培養該細胞，並自該培養物回收包含該融合體的結合物的步驟；該多核苷酸包含該融合體所包含的胺基酸序列(a)、及由1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸構成的胺基酸序列(b)，且包含胺基酸序列(b)位於胺基酸序列(a)的胺基酸末端側而成的胺基酸序列(c)。
如請求項19之方法，其中該胜肽為SPINK2突變體胜肽。
如請求項19之方法，其中該胜肽為抗體或其抗原結合片段。
如請求項19至21中任一項之方法，其中Fc區域或其片段係位於該胜肽之羧基末端側。
如請求項19至21中任一項之方法，其中Fc區域或其片段係位於SPINK2突變體胜肽之胺基末端側。
如請求項19至23中任一項之方法，其中Fc區域或其片段係通過連接子而融合於該胜肽，或該胜肽所包含的胺基酸序列係通過連接子序列而附加於免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。
如請求項19至23中任一項之方法，其中Fc區域或其片段係與該胜肽直接融合，或該胜肽所包含的胺基酸序列係直接附加於免疫球蛋白之Fc區域或其片段所包含的胺基酸序列。
如請求項19至25中任一項之方法，其中免疫球蛋白為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、及/或IgE之Fc區域或其片段。
如請求項19至26中任一項之方法，其中免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。
如請求項19至27中任一項之方法，其中免疫球蛋白為人類IgG1。
如請求項19至28中任一項之方法，其中免疫球蛋白為野生型或突變型。
如請求項19至29中任一項之方法，其中與於胺基末端欠缺1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸的結合物比較，具有經抑制的血中濃度隨時間降低或增加的血中曝露量。
如請求項19至30中任一項之方法，其中1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸通過連接子而附加於該融合體之胺基末端側，或由1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸而成的胺基酸序列通過連接子序列而附加於該融合體所包含的胺基酸序列之胺基末端側。
如請求項19至30中任一項之方法，其中1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸直接附加於該融合體之胺基末端側，或由1至3個之天冬胺酸及/或麩胺酸而成的胺基酸序列係直接附加於該融合體所包含的胺基酸序列之胺基末端側。
如請求項19至32中任一項之方法，其中該胜肽係與人類疾病相關標的分子結合。
如請求項19至33中任一項之方法，其中該胜肽係抑制、阻礙、激動或活化人類疾病相關標的分子之活性。
如請求項34之方法，其中該胜肽為SPINK2突變體胜肽，該胜肽所包含的胺基酸序列為序列識別號2(圖8)所表示者。