TW202034776A - 長雙歧桿菌長亞種、含其的組合物及用途 - Google Patents

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Abstract

一種長雙歧桿菌長亞種（Bifidobacterium longum subsp. longum ）、含其的組合物及用途，本發明首次發現，長雙歧桿菌長亞種具有預防和/或治療炎症或炎症相關疾病的作用。

Description

長雙歧桿菌長亞種、含其的組合物及用途
本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一種長雙歧桿菌長亞種（Bifidobacterium longum subsp. longum ）、含其的組合物及用途。
人體腸道由大量的微生物組成，這些微生物種類繁多，數量龐大，在人腸道中形成一個複雜的生態系統，其中的微生物的組成與人體健康息息相關。大量研究表明，腸道微生物與很多疾病有著密切的關聯，比如糖尿病、肥胖、高血脂等代謝性疾病和結腸炎、類風濕性關節炎等炎症性疾病。健康人體的腸道中有絕大多數的微生物屬於有益菌，是人體健康不可缺少的種類，其中雙歧桿菌是人腸道中一類重要的菌，雙歧桿菌從出生開始在嬰兒腸道中定殖，隨著年齡的增長，雙歧桿菌的含量逐漸下降。雙歧桿菌具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老以及抑制有害菌等重要功效，同時雙歧桿菌也可以藉由產生短鏈脂肪酸（SCFA）和有機酸刺激腸道蠕動，防止便秘等疾病。
潰瘍性腸炎（Ulcerative colitis，UC）是炎症性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）的一種，是一種發病機制不明的慢性腸道炎症性疾病。臨床病理研究認為UC的發病主要與個體易感基因以及腸道微生物引發的腸黏膜免疫反應有關，其症狀主要表現為持續腹痛、腹瀉和黏液血便，且病情反復，發病可見任何年齡階段。
目前，臨床上針對UC的用藥主要有水楊酸類、糖皮質激素、免疫製劑。水楊酸類藥物可以比較好地抑制***素合成，清除氧自由基從而達到緩解炎症反應的目的，臨床上治療UC常見的水楊酸類西藥主要是柳氮磺胺吡啶（SASP），主要針對輕度、中度以及慢性UC患者；糖皮質激素是重症或者爆發性UC患者的首選用藥，比如倍他米松；免疫抑制劑如環孢素可以藉由抑制T細胞IL-2的產生，影響免疫反應的進展，從而對UC進行抑制。
現有針對UC的三類藥物均可以一定程度上對UC進行緩解，但是也都存在一定的副作用，水楊酸類的副作用是引發消化道反應、頭痛、網狀紅血球增多、***減少及過敏反應引起的皮疹、肝毒性、白血球減少、貧血等。糖皮質激素會導致機體代謝紊亂，水瀦留等副作用，僅可作為應急用藥，不能長期服用。免疫抑制劑治療對藥物依賴性較大，治療週期長，容易引起腎毒性及二次感染，只能作為一種輔助治療的手段。
本發明提供一種長雙歧桿菌長亞種，具有預防和/或治療炎症或炎症相關疾病的作用。本發明進一步提供含長雙歧桿菌長亞種的組合物及其用途。
根據第一方面，一種實施例中提供一種長雙歧桿菌長亞種（Bifidobacterium longum subsp. longum ）。
在較佳實施例中，上述長雙歧桿菌長亞種的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.:1所示或與SEQ ID NO.:1所示的序列有99%以上的相似度。
在較佳實施例中，上述長雙歧桿菌長亞種是Bifidobacterium longum subsp. Longum TM12-24，寄存於廣東省微生物菌種寄存中心，其寄存編號為GDMCC 60408。
在另有一較佳實施例中，上述長雙歧桿菌長亞種來自腸道、動物糞便、發酵池、和/或厭氧反應器。
在較佳實施例中，上述長雙歧桿菌長亞種來源於人或非人哺乳動物。
在較佳實施例中，上述非人哺乳動物包括齧齒動物(如小鼠、大鼠)、靈長類動物(如猴)。
根據第二方面，一種實施例中提供一種組合物，該組合物包括：(a)安全有效量的第一方面的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物；以及(b)食品上可接受的載體或藥學上可接受的載體。
在較佳實施例中，上述組合物用於預防和/或治療炎症或炎症相關疾病；其中炎症較佳為炎性腸病（IBD），更佳為潰瘍性腸炎（UC）、胃炎、普通腸炎等，特別是潰瘍性腸炎（UC）。
在較佳實施例中，上述組合物還包括生長因子(較佳地，牛奶生長因子)。
在較佳實施例中，上述組合物選自下列群組：食品組合物、保健組合物、藥物組合物、飲料組合物、飼料組合物、或它們的組合。
在較佳實施例中，上述組合物為口服製劑。
在較佳實施例中，上述組合物為液態製劑、固態製劑、半固態製劑。
在較佳實施例中，上述組合物的劑型選自下列群組：粉末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、滴劑、舌下含片、或其組合。
在較佳實施例中，上述食品組合物包括乳液製品、溶液製品、粉末製品、或懸浮液製品。
在較佳實施例中，上述食品組合物包括乳品、乳粉、或乳液。
在較佳實施例中，上述液態製劑選自下列群組：溶液製品或懸浮液製品。
在較佳實施例中，上述組合物是益生菌劑、微生態製劑或藥物製劑。
在較佳實施例中，上述益生菌劑是益生菌奶製品或益生菌片。
在較佳實施例中，按組合物的總體積或總重量計，上述組合物含有1×10-1 至1×1020 cfu/mL或1×10-1 至1×1020 cfu/g的長雙歧桿菌長亞種。
在較佳實施例中，按組合物的總體積或總重量計，上述組合物含有1×104 至1×1015 cfu/mL或1×104 至1×1015 cfu/g的長雙歧桿菌長亞種。
在較佳實施例中，上述組合物中，含有0.0001-99wt%，較佳地0.1-90wt%的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物，以上述組合物的總重量計。
在較佳實施例中，上述組合物為單元劑型(一片、一粒膠囊或一小瓶)，每個單元劑型中上述組合物的質量為0.05-5g，較佳地為0.1-1g。
在較佳實施例中，上述組合物還含有其它益生菌和/或益生元。
在較佳實施例中，上述益生菌選自下列群組：乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、或其組合。
在較佳實施例中，上述益生元選自下列群組：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或其組合。
在較佳實施例中，上述組合物還含有有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）。
在較佳實施例中，上述有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）選自下列群組：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羥基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹葉抗氧化物、D-異抗壞血酸及其鈉鹽、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、磷脂、維生素C(抗壞血酸)、維生素E、或其組合，特別是維生素C。
在較佳實施例中，上述有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）的重量比為0.1-2%，較佳地，0.5-1.5%，更佳地，0.5-1.0%，以上述組合物的總重計。
在較佳實施例中，以組合物1g計，上述有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）的含量為1mg-20mg，較佳地，5mg-15mg，更佳地，5mg-10mg。
根據第三方面，一種實施例中提供一種第一方面的長雙歧桿菌長亞種、或第二方面的組合物在製備用於預防和/或治療炎症或炎症相關疾病的組合物中的用途，其中炎症較佳為炎性腸病（IBD），更佳為潰瘍性腸炎（UC）、胃炎、普通腸炎等，特別是潰瘍性腸炎（UC）。
根據第四方面，一種實施例中提供一種第一方面的長雙歧桿菌長亞種、或第二方面的組合物在製備用於選自下列群組的一種或多種用途的組合物中的用途：
(i) 降低哺乳動物的血脂水平；
(ii) 控制哺乳動物體重的降低；
(iii) 降低哺乳動物的疾病活動指數(DAI)；
(iv) 改善哺乳動物的腸道病變。
在較佳實施例中，上述降低哺乳動物的血脂水平包括降低膽固醇水平。
在較佳實施例中，上述控制哺乳動物體重的降低指與模型組哺乳動物相比，實驗組哺乳動物體重的降低幅度為不超過10%，較佳地，不超過5%，更佳地，不超過2%。
在較佳實施例中，上述改善哺乳動物的腸道病變包括減緩結腸長度的縮短、和/或減輕結腸炎症反應。
在較佳實施例中，上述哺乳動物包括人或非人哺乳動物。
在較佳實施例中，上述非人哺乳動物包括齧齒動物(如小鼠、大鼠)、靈長類動物(如猴)。
根據第五方面，一種實施例中提供一種製備第二方面的組合物的方法，包括：
將第一方面的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物與食品上可接受的載體或藥學上可接受的載體混合，從而形成第二方面的組合物。
在較佳實施例中，上述製備組合物的方法還包括與生長因子混合的步驟。
在較佳實施例中，上述製備組合物的方法還包括與有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）混合的步驟。
在較佳實施例中，上述有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）選自下列群組：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羥基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹葉抗氧化物、D-異抗壞血酸及其鈉鹽、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、磷脂、維生素C(抗壞血酸)、維生素E、或其組合。
在較佳實施例中，上述製備組合物的方法還包括與益生菌、和/或益生元混合的步驟。
在較佳實施例中，上述益生菌選自下列群組：乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、或其組合。
在較佳實施例中，上述益生元選自下列群組：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或其組合。
在較佳實施例中，上述生長因子為牛奶生長因子。
在較佳實施例中，上述生長因子選自下列群組：維生素類物質、嘌呤類物質、嘧啶類物質、或其組合。
在較佳實施例中，上述組合物為口服製劑。
根據第六方面，一種實施例中提供一種用於實現選自下列群組的一種或多種目的的方法，該方法包括：給受試對象施用第二方面的組合物：
(i) 降低哺乳動物的血脂水平；
(ii) 控制哺乳動物體重的降低；
(iii) 降低哺乳動物的疾病活動指數(DAI)；
(iv) 改善哺乳動物的腸道病變。
在較佳實施例中，上述降低哺乳動物的血脂水平包括降低膽固醇水平。
在較佳實施例中，上述控制哺乳動物體重的降低指與模型組哺乳動物相比，實驗組哺乳動物體重的降低幅度為不超過10%，較佳地，不超過5%，更佳地，不超過2%。
在較佳實施例中，上述改善哺乳動物的腸道病變包括減緩結腸長度的縮短、和/或減輕結腸炎症反應。
在較佳實施例中，上述哺乳動物包括人或非人哺乳動物。
在較佳實施例中，上述非人哺乳動物包括齧齒動物(如小鼠、大鼠)、靈長類動物(如猴)。
在較佳實施例中，上述施用包括口服。
在較佳實施例中，上述施用劑量為0.01-5g/50kg體重/天，較佳地，0.1-2g/50kg體重/天。
經過研究發現，本發明的長雙歧桿菌長亞種（Bifidobacterium longum subsp. longum ），可以有效地降低膽固醇。藉由本發明的長雙歧桿菌長亞種的治療，可以有效地控制DSS誘導的UC小鼠體重的下降，抑制小鼠疾病活動指數（DAI）的升高，改善小鼠結腸的變化，對潰瘍性腸炎有明顯的緩解作用，能夠顯著改善潰瘍性結腸炎小鼠的表觀狀態，降低小鼠炎症性反應。因此，本發明的長雙歧桿菌長亞種可以製成藥物組合物、食品組合物、保健品、輔料添加劑或微生態製劑等產品，用於炎症或炎症相關疾病的預防和/或治療之中。
寄存訊息
菌株名稱：Bifidobacterium longum subsp. longum TM12-24
寄存日期：2018年8月24日
寄存單位：廣東省微生物菌種寄存中心（GDMCC）
寄存地址：廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓
寄存編號：GDMCC 60408
下面藉由具體實施方式結合圖式對本發明作進一步詳細說明。在以下的實施方式中，很多細節描述是為了使得本申請能被更好的理解。然而，所屬技術領域具有通常知識者可以毫不費力的認識到，其中部分特徵在不同情況下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。
另外，說明書中所描述的特點、操作或者特徵可以以任意適當的方式結合形成各種實施方式。同時，方法描述中的各步驟或者動作也可以按照所屬技術領域具有通常知識者所能顯而易見的方式進行順序調換或調整。因此，說明書和圖式中的各種順序只是為了清楚描述某一個實施例，並不意味著是必須的順序，除非另有說明其中某個順序是必須遵循的。
本發明人經過廣泛而深入的研究和實驗，意外地發現，長雙歧桿菌長亞種（Bifidobacterium longum subsp. longum ）具有預防和/或治療炎症相關疾病（如炎症性腸病，例如潰瘍性腸炎、胃炎、普通腸炎）的作用，將含有本發明的長雙歧桿菌長亞種的活性組合物飼餵食實驗對象，發現該組合物能夠控制體重降低，降低血脂，降低疾病活動指數(DAI)，改善腸道病變，可有效減輕炎症相關疾病（如炎症性腸病，例如潰瘍性腸炎、胃炎、普通腸炎）等病症。在此基礎上，本發明人完成了本發明。
如本文所用，術語“含有”、“包含”表示各種成分可一起應用於本發明的混合物或組合物中。因此，術語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術語“含有”中。
如本文所用，術語“生長因子”包括牛奶生長因子，具體地，包括維生素類物質、嘌呤類物質、嘧啶類物質、或其組合的營養物質。其中，維生素類物質包括(但並不限於)：維生素C、維生素E、維生素A、維生素A前體、維生素B6 、維生素D3 、維生素K、葉酸、或其組合；嘌呤類物質包括(但並不限於)：嘌呤核苷，其中嘌呤核苷包括嘌呤核苷的5’-磷酸酯；嘌呤核苷的5’-磷酸酯選自下列群組：肌苷酸(肌苷-5’-磷酸酯；IMP)、鳥苷酸(鳥苷-5’-磷酸酯；GMP)、黃苷酸(黃嘌呤核苷-5’-磷酸酯；XMP)、腺苷酸(腺苷-5’-磷酸酯；AMP)、或其組合；嘧啶類物質包括所有含嘧啶結構的物質。
如本文所用，術語“控制哺乳動物體重的降低”、“減緩哺乳動物體重的降低”、“控制哺乳動物體重的下降”、“減緩哺乳動物體重的下降”可互換使用，是指哺乳動物在進行潰瘍性腸炎模型構建過程中由於炎症的不斷嚴重，實驗動物的體重也隨之下降，體重下降的百分比為下降體重占原始體重的百分比。體重下降的程度越高，疾病越嚴重，本發明的長雙歧桿菌長亞種在對哺乳動物潰瘍性腸炎治療過程中可以控制實驗動物體重的降低，減緩疾病的症狀。
疾病活動指數(DAI)
如本文所用，術語“疾病活動指數”是指結合患者（或患病動物）的體重下降百分率、大便黏稠度和大便出血等3種情況進行綜合評分。
長雙歧桿菌長亞種及其應用
如本文所用，術語“長雙歧桿菌長亞種”，“Bifidobacterium longum subsp. longum ”、“本發明的長雙歧桿菌長亞種”可互換使用。在一個較佳實施例中，上述菌株為Bifidobacterium longum subsp. longum TM12-24，寄存號為GDMCC 60408，分離自人（較佳地，健康男性）的糞便中。長雙歧桿菌長亞種的生理特性如下：長雙歧桿菌長亞種Bifidobacterium longum subsp. longum TM12-24採用PYG培養基進行分離，分離條件為37℃厭氧條件。TM12-24在PYG培養基培養2天的菌落為白色，凸起，菌落較黏稠，直徑約2mm。菌體的顯微形態為桿狀分歧，革蘭氏陽性、不產芽孢和鞭毛。過氧化氫酶和氧化酶的測試結果均為陰性，能發酵多種碳水化合物，包括葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、麥芽糖、柳醇、木糖、***糖、纖維二糖、甘露醇、松三糖、棉籽糖、山梨醇，主要產生乙酸、甲酸、乳酸，可少量產生異丁酸、異戊酸、戊酸、3-甲基丁酸、苯甲酸、丁二酸、己二酸和檸檬酸。並且本發明的長雙歧桿菌長亞種Bifidobacterium longum subsp. longum TM12-24對苯唑西林、卡那黴素和新黴素有抗性，對表3中的其他17種抗生素比較敏感。
本發明提供了長雙歧桿菌長亞種在治療和/或預防炎症相關疾病（如炎症性腸病，例如潰瘍性腸炎、胃炎、普通腸炎）的應用。受試者用DSS(葡聚糖硫酸鈉)進行誘導造模，菌株Bifidobacterium longum subsp. longum TM12-24具有選自下列群組的一個或多個用途：(i)控制該受試者體重的降低； (ii) 降低疾病活動指數(DAI)；(iii) 改善腸道病變程度；(iv) 降低血脂水平。根據本發明的一個較佳實施例，採用C57bl/6小鼠作為試驗小鼠，用DSS(葡聚糖硫酸鈉)進行誘導造模，從而獲得潰瘍性腸炎(UC)模型小鼠，經Bifidobacterium longum subsp. longum TM12-24治療的UC模型小鼠，與未接受治療的對照組(模型組)相比，其體重降低幅度減緩且血脂下降，並且各種與炎症相關疾病（如炎症性腸病，例如潰瘍性腸炎、胃炎、普通腸炎）的指標也得到改善，如改善腸道病變程度(包括減緩結腸長度縮短、減輕結腸炎症反應等)、降低疾病活動指數(DAI)等。因此，本發明的菌株能夠用以預防和/或治療炎症相關疾病（如炎症性腸病，例如潰瘍性腸炎、胃炎、普通腸炎）。
組合物及其應用
本發明還提供了一種組合物，較佳地，本發明的組合物包括食品組合物、保健組合物、藥物組合物、飲料組合物、或飼料組合物，較佳地，為藥物組合物。本發明的組合物包括有效量的長雙歧桿菌長亞種，在一個較佳實施例中，本發明的組合物還包括生長因子(如牛奶生長因子)。在一個較佳實施例中，本發明的組合物還包括選自下列群組的益生菌：乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、或其組合；和/或選自下列群組的益生元：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或其組合。在一個較佳實施例中，本發明的組合物還包括選自下列群組的有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羥基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹葉抗氧化物、D-異抗壞血酸及其鈉鹽、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、磷脂、維生素C（抗壞血酸）、維生素E、或其組合。以組合物的總重計，有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）的重量比為0.1-2%，較佳地，0.5-1.5%，更佳地，0.5-1.0%。
在一較佳實施例中，本發明的組合物為液態製劑、固態製劑、半固態製劑。
在一較佳實施例中，本發明的液態製劑選自下列群組：溶液製品或懸浮液製品。
在一較佳實施例中，本發明的組合物的劑型選自下列群組：粉末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、滴劑、舌下含片、或其組合。
本發明的組合物可以以口服液、片劑、針劑、口崩片、凍乾粉製劑或膠囊的任一種形式給藥，較佳為腸溶劑型（如膠囊），在本發明中，如無特別說明，本發明所用的賦形劑、藥物允許的媒介和載體主要是根據適合菌或其代謝產物特性和所需的特定給藥方式進行選擇，有利於菌或其代謝產物順利藉由胃而被給藥者吸收。這些物質可根據給藥途徑進行選擇。
本發明的組合物可進一步包含那些通常用於藥物製劑的賦形劑中任何附加的賦形劑，為的是例如穩定組合物自身，或使其容易地分散或賦予其適宜的味道。
在上述賦形劑當中，菊粉、果糖、澱粉、低聚木糖、二氧化矽、緩衝試劑以及風味劑是合適的實例。
本發明中藥物製劑可進一步包含輔助的活性組份。
乳糖、麥芽糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、澱粉、***膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、細結晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂或礦物油等都可用作本發明中藥物組合物的載體、賦形劑或稀釋劑等。
此外，本發明的藥物組合物可進一步包括潤滑劑、潤濕劑、乳化劑、懸浮液穩定劑、防腐劑、甜味劑和香料等。本發明的藥物組合物可藉由多種公知的方法以腸衣製劑生產，以便於藥物組合物的活性成分即微生物能順利藉由胃而不被胃酸所破壞。
另外，本發明的微生物可以常規方法製備的膠囊形式使用。例如，標準賦形劑和本發明的冷乾微生物混合製成小球藥丸，然後將藥丸裝填入明膠膠囊中。此外，本發明的微生物和藥物允許使用的賦形劑如液體膠、纖維素、矽酸鹽或礦物油等混合製作懸浮液或分散液，這種懸浮液或分散液可裝入軟的明膠膠囊中。
本發明的藥物組合物可製成腸衣片供口服使用。本申請中的術語-“腸衣”，包括所有常規藥物允許使用的包衣，這些包衣不被胃酸降解，但在小腸中能充分分解並快速釋放出本發明的微生物。本發明的腸衣能在合成胃酸如pH=1的HCl溶液中在36-38℃維持2小時以上，並較佳在合成腸液如pH=7.0的緩衝液中在1.0小時內分解。
本發明的腸衣為以每片約16-30mg進行包衣，較佳地16-25mg，更佳地16-20mg進行包衣。本發明中腸衣厚度為5-100μm，理想的厚度為20-80μm。腸衣成分選自己公開知曉的常規聚合物。
本發明較佳的腸衣由纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯聚合物或偏苯三酸酯聚合物以及異丁烯酸的共聚物(例如，含有40%以上異丁烯酸和含有甲基纖維素鄰苯二甲酸羥丙酯或其酯類衍生物的異丁烯酸的共聚物)製備。
本發明中腸衣所使用的纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯的黏度為約45-90cp，乙醯含量17-26%，鄰苯二甲酸含量30-40%。用於腸衣中的纖維素乙酸偏苯三酸酯黏度為約5-21cp，乙酞含量17-26%。纖維素乙酸偏苯三酸酯由Eastman科達公司生產，可用於本發明中的腸衣材料。
用於本發明腸衣中的羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，分子量一般為20,000-130,000道爾頓，理想分子量為80,000-100,000道爾頓，羥丙基含量為5-10%，甲氧基含量為18-24%，鄰苯二甲醯基含量為21-35%。
用於本發明腸衣中的羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯為HP50，由日本Shin-Etsu Chemidnl Co. Ltd.生產。HP50含有6-10%羥丙基，20-24%甲氧基，21-27%的丙基，其分子量為84,000道爾頓。另一種腸衣物質為HP55，HP55含有5-9%的羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，18-22%甲氧基，27-35%的鄰苯二甲酸，其分子量為78,000道爾頓。
本發明腸衣如下製備：使用常規方法將腸衣溶液噴霧到核心上。該腸包衣方法中所有溶劑為醇類(如乙醇)、酮類(如丙酮)、鹵代烴化合物(如二氯甲烷)、或其組合物。將軟化劑如二-正丁基鄰苯二甲酸酯和三乙酸甘油酯加入到腸衣溶液中，其比例為1份包衣物對約0.05份或約0.3份軟化劑。噴霧方法較佳為連續執行，所噴霧的料量可根據包衣所採用的條件進行控制。噴霧壓力可隨意調節，一般而言，能在平均1-1.5巴壓力下獲得理想的結果。
說明書中“藥物有效量”、“安全有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。比如，在本發明中，可製備含有1×10-1 至1×1020 cfu/mL或cfu/g，較佳為1×10至1×1015 cfu/ml或cfu/g (特別的，可含有1×104 至1×1010 cfu/ml或cfu/g；更特別地，可含有1×106 至1×1010 cfu/ml或cfu/g)的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物的製劑。
當用於製備藥物組合物時，所用的長雙歧桿菌長亞種或其代謝產物的有效劑量可隨施用的模式和待治療的疾病的嚴重程度而變化。適用於內服的劑量形式，包含與固態或液態藥學上可接受的載體密切混合的約1×10-1 至1×1020 cfu/mL或cfu/g，較佳為1×10至1×1015 cfu/ml或cfu/g（較佳地，可含有1×104 至1×1010 cfu/ml或cfu/g；更佳地，可含有1×106 至1×1010 cfu/ml或cfu/g）的活性長雙歧桿菌長亞種或發酵產生的活性成分。可調節此劑量方案以提供最佳治療應答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。
上述的長雙歧桿菌長亞種或其代謝產物可藉由口服等途徑給予。固態載體包括：澱粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態載體包括：培養基、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要適合長雙歧桿菌長亞種或其代謝產物特性和所需的特定給藥方式。在製備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素E、維生素C、BHT和BHA。
從易於製備和給藥的立場看，較佳的藥物組合物是固態組合物，尤其是片劑和/或固體填充或液體填充的膠囊。口服給藥是較佳的。
將本發明組合物施用給受試對象/受試者，每天給藥1次或多次。給藥劑量單位表示其形式上能分開且適用於人類或其他所有哺乳動物個體的劑量。每一單位含有藥物允許的載體和有效治療量的本發明微生物。給藥量隨病人的體重和炎症相關疾病(如炎症性腸病，例如潰瘍性腸炎、胃炎、普通腸炎）的嚴重程度、所包括的補充活性組份和所使用的微生物而變化。此外如可能，可分開給藥，並且如需要可連續給藥。因此，上述給藥量不會對本發明造成限制。此外，本發明中的“組合物”不僅意味著藥品而且表示可作為功能性食品和健康補充食品。在一個較佳實施例中，上述組合物包括：飲料、食品、藥品、動物飼料等。
在本發明的一個較佳實施例中，還提供了一種食品組合物，它含有有效量的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物，以及餘量的食品上可接受的載體，上述的食品組合物的劑型選自固體、乳品、溶液製品、粉末製品、或懸浮液製品。在一較佳實施例中，上述食品組合物還可含有生長因子(如牛奶生長因子)。在一較佳實施例中，上述組合物還包括選自下列群組的益生菌：乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、或其組合；和/或選自下列群組的益生元：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或其組合。在一個較佳實施例中，上述組合物還包括選自下列群組的有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羥基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹葉抗氧化物、D-異抗壞血酸及其鈉鹽、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、磷脂、維生素C（抗壞血酸）、維生素E、或其組合。
在一較佳實施例中，上述組合物的配方如下：
1×10至1×1015 cfu/mL的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物；以及食品上或藥學上可接受的載體，和/或賦形劑。
在另一較佳實施例中，上述組合物的配方如下：
1×104 至1×1010 cfu/mL的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物；以及食品上或藥學上可接受的載體，和/或賦形劑。
微生態製劑
微生態製劑是一種包含益生菌及代謝產物的生物製劑或者是可以增加益生菌的膳食補充劑，可以藉由調節、維持腸道內微生態平衡，達到提高人體健康水平的目的。主要包括益生菌、益生元和合生元。
在本發明中，上述微生態製劑包括(a)安全有效量的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物；以及(b)食品上可接受的載體或藥學上可接受的載體。在一較佳實施例中，上述製劑還包括生長因子(如牛奶生長因子，較佳地，包括維生素類物質、嘌呤類物質、和/或嘧啶類物質)。在一個較佳實施例中，上述製劑還包括選自下列群組的益生菌：乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、或其組合；和/或選自下列群組的益生元：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或其組合。在一個較佳實施例中，上述組合物還包括選自下列群組的有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質（如保護劑）：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羥基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹葉抗氧化物、D-異抗壞血酸及其鈉鹽、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、磷脂、維生素C（抗壞血酸）、維生素E、或其組合。
長雙歧桿菌長亞種的生產方法
通常，長雙歧桿菌長亞種可以用常規方法製得。
在本發明中，提供了一種能夠大規模生產長雙歧桿菌長亞種的方法，具體地，包括如下步驟：
(a)在適合培養的條件下，對本發明的長雙歧桿菌長亞種進行培養，從而獲得培養產物；
(b)任選地，從培養產物分離長雙歧桿菌長亞種菌體和/或其代謝產物；和
(c)任選地，將上一步驟獲得的培養產物或長雙歧桿菌長亞種菌體和/或其代謝產物與食品上可接受的載體或藥學上可接受的載體混合，從而製得組合物。
在本發明中，上述適合培養的條件指任何適於培養本發明的長雙歧桿菌長亞種的條件，在一較佳實施方式中，上述適合培養的條件指採用PYG培養基於37℃厭氧培養24h-72h。
改善哺乳動物腸道病變的方法
在另一較佳實施例中，改善哺乳動物腸道病變的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、飲料組合物、或其組合。上述實驗對象包括哺乳動物，如人。
在另一較佳實施例中，改善哺乳動物腸道病變的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、或動物飼料，或其組合。上述實驗對象為動物，較佳地為鼠類、兔類。
控制哺乳動物體重的下降的方法
在另一較佳實施例中，控制哺乳動物體重的下降的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、飲料組合物、或其組合。上述實驗對象包括哺乳動物，如人。
在另一較佳實施例中，控制哺乳動物體重的下降的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、或動物飼料，或其組合。上述實驗對象為動物，較佳地為鼠類、兔類。
降低哺乳動物的疾病活動指數(DAI)的方法
在另一較佳實施例中，降低哺乳動物的疾病活動指數(DAI)的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、飲料組合物、或其組合。上述實驗對象包括哺乳動物，如人。
在另一較佳實施例中，降低哺乳動物的疾病活動指數(DAI)的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、或動物飼料，或其組合。上述實驗對象為動物，較佳地為鼠類、兔類。
降低哺乳動物血脂的方法
在另一較佳實施例中，降低哺乳動物血脂的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、飲料組合物、或其組合。上述實驗對象包括哺乳動物，如人。
在另一較佳實施例中，降低哺乳動物血脂的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、或動物飼料，或其組合。上述實驗對象為動物，較佳地為鼠類、兔類。
預防和/或治療炎症相關疾病的方法
在另一較佳實施例中，預防和/或治療炎症相關疾病的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、飲料組合物、或其組合。上述實驗對象包括哺乳動物，如人。
在另一較佳實施例中，預防和/或治療炎症相關疾病的方法包括：攝取本發明的藥物組合物、食品組合物、或動物飼料，或其組合。上述實驗對象為動物，較佳地為鼠類、兔類。
菌種寄存
本發明的菌種長雙歧桿菌長亞種Bifidobacterium longum subsp. longum TM12-24 (與寄存名稱相同)已於2018年8月24日寄存在廣東省微生物菌種寄存中心（GDMCC），地址廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，寄存號：GDMCC 60408。
本發明的主要優點包括：
(a) 本發明的長雙歧桿菌長亞種能夠顯著改善與炎症相關疾病(如炎症性腸病，例如潰瘍性腸炎、胃炎、普通腸炎)相關的指標(如控制體重下降、改善腸道病變程度(包括減緩結腸長度縮短、減輕結腸炎症反應等)、降低疾病活動指數(DAI)等)。
(b) 本發明的長雙歧桿菌長亞種能夠顯著降低血脂（如膽固醇水平）。
(c) 本發明的長雙歧桿菌長亞種Bifidobacterium longum subsp. longum TM12-24對UC小鼠的治療具體表現為：可有效控制DSS誘導的UC小鼠體重的下降，抑制小鼠疾病活動指數（DAI）的升高，改善小鼠結腸的變化，並對膽固醇具有降解作用。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York：Cold Spring  Harbor Laboratory Press，1989)中的條件，或按照《微生物：實驗手冊》(James Cappuccino和Natalie Sherman編，Pearson Education出版社)中的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
如無特別說明，實施例所用的材料和試劑均為市售產品。
實施例1：長雙歧桿菌長亞種TM12-24的分離鑒定
1、樣品收集
分離樣品來自於一位14歲健康的男性糞便，將糞便採集至無菌的樣品管中，1h內帶回實驗室進行分選。
2、雙歧桿菌的分離純化
收集的新鮮樣品立刻轉移至厭氧操作箱中，取0.2g樣品於1ml無菌的PBS（磷酸緩衝液）中，充分震盪混勻，然後進行梯度稀釋塗布，培養基採用PYG培養基（購自環凱微生物科技公司），具體配方是（1L）：蛋白腖5g，胰化酪蛋白5g，酵母粉10g，牛肉膏5g，葡萄糖5g，K2 HPO4 2g，Tween 80 1mL，Cysteine-HCl·H2 O 0.5g，血紅素5mg，維生素K1 1uL，無機鹽溶液（每L無機鹽溶液含有CaCl2 ·2H2 O 0.25g，MgSO4 ·7H2 O 0.5g，K2 HPO4 1g，KH2 PO4 1g，NaHCO3 10g，NaCl 2g）40mL，刃天青1mg，蒸餾水950mL，調節pH至6.8~7.0，115℃滅菌25min。固體培養基加入1.5%的瓊脂，在厭氧操作箱中傾倒。塗布的平板置於37℃厭氧培養，厭氧的氣體組分為N2 ：CO2 ：H2 =90：5：5。培養3天後，挑取單菌落進行劃線分純，獲得每株單菌的純培養。
3、菌種寄存
對獲得的純培養菌株進行培養，至濃度約為1×109 cfu/ml，取400ul菌液添加40%甘油400ul，使其甘油濃度達到20%，然後進行-80℃超低溫寄存。
4、16S rDNA鑒定
將獲得的分離菌株在液體PYG培養基中培養24h，取1ml菌液進行10000r/min離心5min，收集菌體，提取基因組DNA。以基因組DNA作為模板，使用16S rDNA通用引子（8F-AGAGTTTGATCATGGCTCAG（SEQ ID NO：2）和1492R-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT（SEQ ID NO：3））進行PCR擴增，擴增體系為：10×PCR緩衝液，3uL；dNTP，2.5uL；27F，0.5uL；1492R，0.5uL；Taq酶，0.3uL；模板，1uL；ddH2 O，18.2uL。PCR擴增條件為：95℃預變性4min，然後95℃變性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min 30s，30個循環。將獲得的16S rDNA擴增產物進行電泳檢測、純化、3730測序，獲得長度為1400bp的16S rDNA序列（見序列表中SEQ ID NO：1）。將這段序列在Genebank中進行比對分析，獲得TM12-24的鑒定結果為長雙歧桿菌長亞種Bifidobacterium longum subsp. longum 。
5、TM12-24的生理生化特徵
在PYG培養基上培養48小時，TM12-24的菌落是白色、圓形、凸起，菌落直徑約1.5 mm。在1000倍的顯微鏡下觀察，菌體呈現分歧長桿狀，革蘭氏染色為陽性，沒有芽孢和鞭毛產生。TM12-24的過氧化氫酶反應為陰性，氧化酶陰性，嚴格厭氧，碳源利用情況使用API 20A試劑盒（購自法國梅裡埃）進行檢測。結果如表1（+，表示陽性反應；−，表示陰性反應；±表示弱陽性反應）。 表1
編號 反應 結果 編號 反應 結果
1 吲哚產生 − 11 明膠水解 −
2 脲素（脲酶） − 12 七葉靈 −
3 葡萄糖 + 13 甘油 −
4 甘露醇 ± 14 纖維二糖 ±
5 乳糖 + 15 甘露糖 +
6 蔗糖 + 16 松三糖 ±
7 麥芽糖 + 17 棉籽糖 +
8 柳醇 + 18 山梨醇 ±
9 木糖 + 19 鼠李糖 −
10 ***糖 + 20 海藻糖 −
實施例2：長雙歧桿菌長亞種TM12-24的生物活性物質
TM12-24的生物活性物質主要考察代謝產物中的短鏈脂肪酸（SCFA）和有機酸產生情況。
1、樣品預處理
將TM12-24培養48h，取1ml菌液進行10000r/min離心5min，取上清，準備進行短鏈脂肪酸（SCFA）和有機酸的檢測。
2、SCFA的測定
SCFA的檢測主要檢測乙酸、丙酸、丁酸、戊酸這4種物質的含量。採用安捷倫氣相層析儀(GC-7890B, Agilent)，選用HP-INNOWax(Cross-Linked PEG)，30m×0.25mm×0.25um的毛細管柱進行分析，檢測器為氫火焰離子檢測器，GC參數設置為柱溫：180～200℃；氣化室溫度：240℃；檢測溫度：210℃；進樣量：2μL；載氣流量：N2 ，50mL/min；氫氣流量：50 mL/min；空氣流量：600～700 ml/min。
3、有機酸的測定
有機酸的檢測標準品選用：3-甲基丁酸，戊酸，奎寧酸，乳酸，草酸，丙二酸，苯甲酸，馬來酸，丁二酸，反富馬酸，蘋果酸，己二酸，酒石酸，莽草酸，檸檬酸，異檸檬酸和L-抗壞血酸。仍然採用安捷倫氣相層析儀(GC-7890B, Agilent)，層析柱選用122-5532G DB-5ms (40m × 0.25mm × 0.25um)，柱溫：270～290℃；進樣口溫度：250℃；氣體流量: 0.86 ml/min。
4、實驗結果 結果如表2所示 表2
產物 乙酸 甲酸 丙酸 異丁酸 丁酸
含量（mmol/L） 81.35 15.12 0 0.35 0
產物 異戊酸 戊酸 苯甲酸 3-甲基丁酸 戊酸
含量（mmol/L） 0.71 0.66 0 0.41 0.37
產物 奎寧酸 乳酸 草酸 丙二酸 苯甲酸
含量（mmol/L） 0 26.37 0 0 1.70
產物 馬來酸 丁二酸 反富馬酸 蘋果酸 己二酸
含量（mmol/L） 0 0.27 0 0 0.14
產物 酒石酸 莽草酸 檸檬酸 D，L-異檸檬酸三鈉 L-維C
含量（mmol/L） 0 0 0.05 0 0
實施例3：長雙歧桿菌長亞種TM12-24的抗生素敏感情況
考察TM12-24對常見20種抗生素的敏感情況，採用藥敏紙片法進行實驗，取培養至對數期的TM12-24的菌液100ul進行平板塗布，將抗生素藥敏片貼在平板表面，37℃培養48h，測量抑菌圈大小，其結果如表3。 表3
抗生素 抑菌圈直徑 （cm） 抗生素 抑菌圈直徑 （cm）
青黴素 2.5 頭孢曲松鈉 2.2
苯唑西林 0.0 頭孢呱酮 2.1
氨苄西林 2.0 丁胺卡那(阿米卡星) 1.8
羧苄西林 2.8 慶大黴素 1.2
卡那黴素 0.0 複達欣(頭孢他啶) (頭孢噻甲羧肟) 1.6
頭孢氨苄 1.0 新黴素 0.0
頭孢唑林 1.3 四環素 2.2
頭孢拉定 1.1 多西環素 2.8
呱拉西林 3.2 美滿黴素(二甲胺四環素)(米諾環素) 2.8
頭孢呋辛 3.2 紅黴素 2.0
結果顯示，TM12-24對苯唑西林、卡那黴素和新黴素有抗性，對其他17種抗生素比較敏感。
實施例4：長雙歧桿菌長亞種TM12-24的降膽固醇特性
1、TM12-24的膽鹽水解酶活性
膽鹽水解酶採用TDCA（牛磺去氧膽酸鈉）法進行檢測，配製TDCA平板，PYG固體培養基中添加4%的TDCA和0.37g/L的CaCl2 ，將TM12-24培養至濃度約108 cfu/ml，取10ul菌液滴在直徑為0.6mm的濾紙片上，濾紙片置於TDCA平板表面，37℃培養2天，觀察濾紙片周邊產生的白色沉澱情況，白色沉澱的直徑代表膽鹽水解酶的活性。
藉由測量，TM12-24的白色沉澱的直徑為10 mm，表明TM12-24具有膽鹽水解酶的活性。
2、TM12-24的體外降膽固醇情況
膽固醇的含量測定方法採用鄰苯二甲醛比色法（OPA法），藉由菌株在含一定濃度的膽固醇培養基中培養一段時間的膽固醇含量前後的變化來考察對膽固醇的降解能力。具體方法如下：
（1）膽固醇培養基的配製和實驗菌株的培養
稱取一定質量的膽固醇溶解於乙醇中，濃度為10mg/mL，過濾除菌。將配置好的PYG培養基分別加入10mg/mL的膽鹽（高壓滅菌），10%質量濃度的巰基乙酸鈉（過濾除菌）和膽固醇，充分混勻，然後按照3%的接種量將待測菌株接種至該培養基中，待測菌株除了TM12-24，還選用另外一株商業降膽固醇益生菌植物乳桿菌Lp299v（購自瑞典Probi公司）作比較，兩種菌都在37℃厭氧條件下培養72h。
（2）標準曲線的製作
精確量取0.5mg/mL的膽固醇標準溶液40uL，80uL，120uL，160uL，200uL於乾淨試管中，加入無水乙醇定容至1mL，每個試管中加入OPA 4 mL（0.5mg鄰苯二甲醛加入到1mL冰醋酸），震盪混勻，室溫靜置10min，然後加入2mL的濃硫酸混勻，靜置反應10min，於550nm處測定吸光度。以濃度作為橫坐標，吸光度作為縱坐標繪製標準曲線（第1圖），藉由計算，線性回歸的方程式為：y = 0.0085x + 0.0072；相關係數R2 為0.9992。
（3）培養基中膽固醇的測定
將含有膽固醇的PYG培養基培養好的菌液進行10000r/min的離心，收集上清，進行膽固醇檢測，同時以未接種的膽固醇PYG培養基作為空白對照組。取1ml待測樣品於乾淨的試管中，加入95%乙醇6ml和50%的KOH 4ml，震盪混勻，然後在60℃水浴中進行皂化反應10min，迅速進行冷卻，加入10ml正己烷進行萃取，充分混勻，室溫靜置20min，量取8ml有機相（正己烷層）到另一潔淨試管中，然後在60℃水浴中進行氮氣吹乾，加入4ml 0.5g/L鄰苯二甲醛乙酸溶液，室溫靜置10min，添加2ml濃H2 SO4 反應10min，最後測量在550nm處的吸光值。
（4）膽固醇降解率的計算
根據標準曲線計算培養前後培養基中膽固醇的含量，膽固醇的降解率按以下公式進行計算：
L=(A-B)/A×100％
L：膽固醇降解率；A：未接種菌的膽固醇培養基中膽固醇的含量；B：待測菌株培養48h培養液中膽固醇的含量。
（5）膽固醇降解結果
藉由計算，得到TM12-24的膽固醇降解率為74%，而Lp299v降解率為70%，由此說明TM12-24比Lp299v具有更強的膽固醇降解能力。
實施例5：長雙歧桿菌長亞種TM12-24對UC小鼠的治療
本實施例所選取的小鼠模型為：DSS誘導的潰瘍性腸炎小鼠模型，採用C57bl/6小鼠（購自湖北醫學實驗動物中心），8周齡，體重20g±2g，小鼠飼養環境為SPF級，適應性餵養1周進行DSS誘導，連續給小鼠飲用0.2%的DSS（葡聚糖硫酸鈉，分子量36000-50000）7天。藉由採用VSL#3（購自美國Sigma Tau）作為陽性對照，比較TM12-24和VSL#3的治療效果。
試驗小鼠總計48只，隨機分為4組，每組12只，其中包括對照組（control組），DSS誘導的模型組（每只每天灌胃0.2ml PBS），TM12-24治療組和VSL#3治療組。TM12-24處理過程為：培養24h的TM12-24菌液，離心收集菌體，用PBS進行懸浮，調整菌濃度至1×109 cfu/ml，每只小鼠每天灌胃200ul的TM12-24。VSL#3也採用PBS進行懸浮，同樣調節濃度至1×109 cfu/ml，每只小鼠每天灌胃200ul。治療方法採用邊造模邊給藥的方式，每天記錄小鼠體重、飲食和飲水情況，同時觀察小鼠的糞便性狀及糞便隱血情況，分別在第1天、第3天、第5天和第7天計算小鼠的疾病活動指數（DAI），DAI評分詳見表4。實驗持續7天，益生菌和PBS的日灌胃量為200ul。實驗結束後處死小鼠，所有小鼠取血、脫頸、取結腸、拍照、秤重、量取結腸長度。結腸組織保存於-80℃冰箱和多聚甲醛中。 表4. DAI指數評分表
體重下降（%） 大便性狀 大便隱血/肉眼血便 積分
0 正常 正常 0
1-5 1
5-10 鬆散 隱血陽性 2
10-15 3
＞15 稀便 肉眼血便 4
表中的大便性狀：正常大便-成形大便；鬆散大便-不黏附於肛門的糊狀、半成型大便；稀便-可黏附於肛門的稀樣水便。其中便血情況：正常小鼠便血為陽性；肉眼血便為紅色或褐色；隱血陽性為不明顯的肉眼血便，使用四甲基聯苯胺進行檢測。DAI指數等於體重、大便性狀以及大便隱血/肉眼血便三個積分之和。
治療前後小鼠的體重變化如下表5和第2圖所示： 表5
分組 第1天(g) 第3天(g) 第5天(g) 第7天(g)
對照組 23.12±0.78 23.71±1.08 24.96±1.34 25.56±1.58
模型組 23.40±0.88 22.43±1.64* 21.21±2.16** 19.22±1.27**
TM12-24 23.22±0.76 22.65±1.49 21.89±1.74 20.92±2.08▲
VSL# 3 23.49±0.76 22.08±1.54 21.28±1.96 20.64±2.18▲
從表5和第2圖中的結果可以得知，對照組小鼠的體重基本維持緩慢升高的趨勢，DSS誘導的模型組小鼠的體重逐漸下降，第3天開始體重下降的比較顯著（*P＜0.05），第5天開始，二者之間的差異顯著程度更加明顯（**P＜0.01）。而TM12-24和VSL# 3的治療可以減緩UC小鼠體重的下降，在第7天，TM12-24和VSL# 3小鼠的體重下降的控制相對於模型組比較顯著（▲ P＜0.05）。說明這兩組益生菌可以控制UC引起的體重下降情況。藉由比較第7天各組的體重數值可以發現TM12-24組小鼠的體重略高於VSL# 3，說明TM12-24在控制UC小鼠體重降低的能力好於VSL# 3。
DSS誘導的潰瘍性腸炎的小鼠由於體重下降、大便性狀和便血情況的變化引起DAI指數的變化，小鼠DAI指數在治療前後的變化如表6和第3圖： 表6
分组 第1天 第3天 第5天 第7天
對照组 1.0±0.6 1.2±0.6 1.1±0.6 1.8±0.5
模型组 1.3±0.6 3.4±1.2** 6.4±1.5** 8.2±0.9**
TM12-24 1.3±0.5 3.0±1.0 5.7±1.4 6.6±1.8▲
VSL# 3 1.4±0.6 3.1±1.1 6.1±1.8 7.2±1.0▲
表6和第3圖數據表明，對照組小鼠的DAI維持一個正恆定的低水平，而DSS誘導的小鼠由於出現一系列病理，導致DAI逐漸升高，第3天開始模型組小鼠DAI相對對照組變得極顯著（**P＜0.01），第7天模型組小鼠DAI達到最高水平。益生菌的干預可以控制DAI的升高，TM12-24和VSL# 3組小鼠在第7天的DAI相對於模型組得到了一定程度的控制（▲ P＜0.05）。藉由第7天的DAI數值可以發現TM2-14組小鼠的DAI略低於VSL# 3，可以說明TM12-24在控制UC小鼠DAI升高的效果優於VSL# 3。
UC模型小鼠的結腸組織會發生改變，主要是因為潰瘍和炎症的發生導致結腸組織縮短，治療結束後，藉由解剖測量的小鼠結腸長度見表7。 表7
分組 結腸長度
對照組 8.16±0.52
模型組 5.18±0.91**
VSL# 3組 6.43±0.90▲
TM12-24組 6.70±0.85▲
表7結果顯示，在進行DSS誘導7天後的小鼠（模型組）的結腸組織縮短情況比較嚴重，與對照組相比較差異極顯著（**P＜0.01）。而益生菌TM12-24和VSL# 3的干預可以顯著控制小鼠結腸的縮短（相對於模型組▲ P＜0.05）。藉由表中數據可以發現TM12-24組小鼠的結腸長度比VSL# 3組小鼠結腸長度長，可以說明TM12-24在控制UC小鼠結腸縮短的能力強於VSL# 3。
實施例6：含長雙歧桿菌長亞種TM12-24的食品組合物
原料配比如表8。 表8
原料 質量百分比(%)
長雙歧桿菌長亞種TM12-24 0.5
牛奶 90.0
白糖 9.0
維生素C 0.5
按照上述配方比例混合牛奶、白糖，攪拌至完全混合，預熱，20Mpa壓力均質，90℃左右殺菌5-10分鐘，冷卻至40-43℃，混入保護劑維生素C，接種1-100×106 cfu/g的長雙歧桿菌長亞種TM12-24菌，即製成含長雙歧桿菌長亞種TM12-24菌的食品組合物。
實施例7：含長雙歧桿菌長亞種TM12-24的藥物組合物
原料配比見表9。 表9
原料 質量百分比(%)
長雙歧桿菌長亞種TM12-24 1.0
乳糖 2.0
酵母粉 2.0
蛋白腖 1.0
純淨水 93.5
維生素C 0.5
按照比例將乳糖、酵母粉、蛋白腖以純淨水混合均勻，預熱到60-65℃，20Mpa壓力均質，90℃左右殺菌20-30分鐘，冷卻至36-38℃，混入保護劑維生素C，接入長雙歧桿菌長亞種TM12-24活菌(1-500×106 cfu/mL)，36-38℃發酵至pH值為6.0，離心，冷凍乾燥至水份含量小於3%，即製備長雙歧桿菌長亞種TM12-24菌冷凍乾燥物。秤取0.5克長雙歧桿菌長亞種TM12-24冷凍乾燥物與麥芽糊精等量混合後裝入膠囊中，即製成含長雙歧桿菌長亞種TM12-24菌的藥物組合物。
實施例8：用於治療潰瘍性腸炎（UC）的藥物的製備方法
1、菌液準備：將長雙歧桿菌長亞種TM12-24（1×109 cfu/ml）進行厭氧培養，厭氧培養基採用PYG培養基，經過37℃厭氧發酵2-3天。
2、生長因子製備：將脫脂牛奶、酪蛋白進行混合、離心、超濾獲得牛奶生長因子粗提物（含有維生素類物質、嘌呤類物質、嘧啶類物質等成分）。
3、藥物劑型製作：將5體積生長因子和1體積的保護劑維生素C加入到100體積的TM12-24發酵的菌液中，充分攪拌混勻，然後加入澱粉輔料（如麥芽糊精）製備藥物劑型。
以上應用了具體個例對本發明進行闡述，只是用於幫助理解本發明，並不用以限制本發明。對於所屬技術領域具有通常知識者，依據本發明的思想，還可以做出若干簡單推演、變形或替換。
無
第1圖顯示了膽固醇標準曲線，採用鄰苯二甲醛比色法（OPA法）進行膽固醇的檢測，藉由使用不同濃度（20ug/mL，40ug/mL，60ug/mL，80ug/mL）的膽固醇與OPA進行反應顯色，得到標準曲線，線性回歸的方程式為：y = 0.0085x + 0.0072；相關係數R2 為0.9992。
第2圖顯示了對照組、模型組、VSL# 3和TM12-24治療組小鼠的體重的變化。
第3圖顯示了對照組、模型組、VSL# 3和TM12-24治療組小鼠的DAI指數的變化。
寄存訊息 菌株名稱：Bifidobacterium longum subsp. longum TM12-24 寄存日期：2018年8月24日 寄存單位：廣東省微生物菌種寄存中心（GDMCC） 寄存地址：廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓 寄存編號：GDMCC 60408
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (10)

  1. 一種長雙歧桿菌長亞種（Bifidobacterium longum subsp. longum ），較佳地，該長雙歧桿菌長亞種的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.:1所示或與SEQ ID NO.:1所示的序列有99%以上的相似度；更佳地，該長雙歧桿菌長亞種是Bifidobacterium longum subsp. Longum TM12-24，寄存於廣東省微生物菌種寄存中心，其寄存編號為GDMCC 60408。
  2. 一種組合物，其包括：(a)安全有效量的如申請專利範圍第1項所述的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物；以及(b)食品上可接受的載體或藥學上可接受的載體。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的組合物，其中該組合物用於預防和/或治療炎症或炎症相關疾病； 較佳地，該炎症為炎性腸病（IBD）； 更佳地，該炎症為潰瘍性腸炎。
  4. 如申請專利範圍第2項所述的組合物，其中該組合物選自下列群組：食品組合物、保健組合物、藥物組合物、飲料組合物、飼料組合物、或它們的組合； 較佳地，該組合物是益生菌劑、微生態製劑或藥物製劑； 更佳地，該益生菌劑是益生菌奶製品或益生菌片。
  5. 如申請專利範圍第2項所述的組合物，其中該組合物進一步含有有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質； 較佳地，該有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質選自半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羥基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹葉抗氧化物、D-異抗壞血酸或其鈉鹽、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、磷脂、維生素C和維生素E中的至少一種； 更佳地，該有助於保持長雙歧桿菌長亞種活力的物質是維生素C； 較佳地，該組合物進一步含有其它益生菌和/或益生元； 更佳地，該益生菌選自乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌中的至少一種； 更佳地，該益生元選自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚乳果糖、大豆低聚糖、菊粉和寡聚糖中的至少一種。
  6. 如申請專利範圍第2項所述的組合物，其中，按該組合物的總體積或總重量計，該組合物含有1×10-1 至1×1020 cfu/mL或1×10-1 至1×1020 cfu/g的長雙歧桿菌長亞種； 較佳地，按該組合物的總體積或總重量計，該組合物含有1×104 至1×1015 cfu/mL或1×104 至1×1015 cfu/g的長雙歧桿菌長亞種。
  7. 一種如申請專利範圍第1項所述的長雙歧桿菌長亞種、或如申請專利範圍第2項至第6項中任一項所述的組合物在製備用於預防和/或治療炎症或炎症相關疾病的組合物中的用途； 較佳地，該炎症為炎性腸病（IBD）； 更較佳地，該炎症為潰瘍性腸炎。
  8. 一種如申請專利範圍第1項所述的長雙歧桿菌長亞種、或如申請專利範圍第2項至第6項中任一項所述的組合物在製備用於選自下列群組的一種或多種用途的組合物中的用途： (i) 降低哺乳動物的血脂水平； (ii) 控制哺乳動物體重的降低； (iii) 降低哺乳動物的疾病活動指數(DAI)； (iv) 改善哺乳動物的腸道病變。
  9. 一種製備如申請專利範圍第2項至第6項中任一項所述的組合物的方法，其包括： 將如申請專利範圍第1項所述的長雙歧桿菌長亞種和/或其代謝產物與食品上可接受的載體或藥學上可接受的載體混合，從而形成如申請專利範圍第2項至第6項中任一項所述的組合物。
  10. 一種用於實現選自下列群組的一種或多種目的的方法，其包括：給受試對象施用如申請專利範圍第2項至第6項中任一項所述的組合物： (i) 降低哺乳動物的血脂水平； (ii) 控制哺乳動物體重的降低； (iii) 降低哺乳動物的疾病活動指數(DAI)； (iv) 改善哺乳動物的腸道病變。
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