TW202031677A

TW202031677A - Ｐｄｅ３調節劑反應性癌症之鑑定

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Publication number: TW202031677A
Application number: TW108139730A
Authority: TW
Inventors: 吳曉筠; 海蒂格魯李奇
Original assignee: 美商博得學院股份有限公司
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2020-09-01
Also published as: US20210371935A1; WO2020092998A1; CA3122378A1; EP3873922A1; EP3873922A4

Abstract

本發明係有關於患有對磷酸二酯酶3(PDE3)及許拉芬(schlafen)家族成員12(SLFN12)複合物形成具有反應性的過度增生性疾病、病症、或病況的患者之鑑定方法。患者的過度增生性疾病、病症、或病況可以是癌症，包括膠質母細胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、肉瘤、或造血性癌症，諸如急性骨髓性白血病。該等反應性疾病、病症、或病況可使用生物標記AIP及/或TRRAP組合磷酸二酯酶3及許拉芬家族成員12複合物(其可使用某些活性化合物的PDE3調節而形成)相關性的該等生物標記加以鑑定。業已顯示此等生物標記組合的表達係與活性化合物(例如，PDE3調節劑、PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)敏感度關聯。

Description

PDE3調節劑反應性癌症之鑑定

[參考相關申請案]

此申請案主張U.S.App.No.62/901,090，申請日期2019年9月16日及U.S.App.No.62/754,290，申請日期2018年11月1日依據35 U.S.C.§ 119之優先權益，各案全文係爰引於此並融入本說明書之揭示。

本發明係有關於藉由鑑識表達涉及複合物形成的某些生物標記的細胞，而鑑定對某些磷酸二酯酶3蛋白(例如，PDE3A、PDE3B)與許拉芬家族成員12(SLFN12)蛋白間之複合物形成具有反應性的細胞(例如，癌細胞)。特定言之，被鑑識為表達芳基烴受體交互作用蛋白(AIP)及/或轉形/轉錄域相關蛋白(TRRAP)的細胞係涉及複合物形成，其結果導致細胞凋亡。也提供與此等細胞相關的過度增生性疾病、病症、或病況之治療或預防方法，該方法包含對被鑑識為對複合物形成具反應性的該等細胞投予某些化學劑(例如，PDE3A調節劑)。

發明背景

每年因癌症致死的人數，美國超過550,000人，全球超過八百萬人。新穎作用劑，包括小分子、影響組織特異性生長需求的分子、及免疫調節劑，已經顯示為有利於一小組患者，該等患者的癌症具有獨特基因體突變或其它特性。不幸地，許多癌症患者仍無有效的治療選項。

一種鑑定新穎抗癌劑的辦法為表現型篩檢，以發現在癌細胞株間表現出強力選擇性的新穎小分子；隨後接著為前瞻化學基因體學，以鑑定與藥物反應相關的細胞特質。於1990年代，Weinstein及其同僚驗證：化合物的胞毒性側繪，可被使用來鑑定與藥物敏感度關聯的細胞特性，諸如基因表達側繪及DNA套數。隨著細胞株的大型自動化高通量化學敏感度測試，加上該等細胞株的全面性基因體及表現型特徵化，近年來，鑑定癌細胞株特質(媒介其對小分子的反應)的能力已經大增。小分子敏感度的表現型觀察能被連結到表達形式或體細胞的變化。

儘管標靶療法和免疫療法的進展，某些癌症，諸如轉移性黑色素瘤，仍為致命性疾病。舉例言之，轉移性黑色素瘤的五年存活率只有20%。因此需要有新的治療方式。此等新穎方式可能基於殺死癌細胞的新機轉。舉例言之，有些磷酸二酯酶3A(PDE3A)調節劑，可能在癌細胞內，造成PDE3A肽與許拉芬家族成員12(SLFN12)間之複合物形成、或PDE3B肽與許拉芬家族成員12(SLFN12)間之相似的複合物形成。此複合物形成可能導致誘導細胞凋亡。然而，單獨抑制PDE3酶活性係不足以造成殺死癌細胞，原因在於PDE3基因剔除或使用大半先前已特徵化的PDE3A抑制劑皆無法殺死癌細胞。因此，相對於藉基因體變化所生成的癌細胞依賴性發揮槓桿作用的傳統標靶療法，此等PDE3調節療法透過 PDE3A-SLFN12或PDE3B-SLFN12(「PDE3A/B-SLFN12」)複合物形成而引發誘導型細胞凋亡。再者，此種細胞凋亡誘導不會出現在表達PDE3A及SLFN12的全部癌細胞，指示對此種細胞死亡機轉的基礎尚未完全明瞭。

在分子層級將惡性病加以特徵化之方法，有用於將患者分層，藉此快速地導引患者到有效療法。迫切需要用於預測患有癌症個體的反應性之改良方法。

根據前述目的及其它，本揭示提供鑑定過度增生性疾病、病症、或病況的細胞，諸如對PDE3A-SLFN12複合物形成或PDE3B-SLFN12複合物形成具有反應性的癌症細胞之方法；用於已鑑定為對複合物形成具有反應性的過度增生性疾病、病症、或病況之治療或預防的方法；及用於已鑑定為對複合物形成具有反應性的過度增生性疾病、病症、或病況之判定與治療的套組。不欲受理論所限，相信缺乏芳基烴受體交互作用蛋白(AIP)及/或轉形/轉錄域相關蛋白(TRRAP)的細胞對複合物形成具有減低的敏感度或不具敏感度，或在該細胞與典型地誘導此種形成的活性化合物接觸之後，具有減低的複合物形成或無複合物形成。當該等細胞表達AIP及/或TRRAP時，某些PDE3調節化合物(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑、DNMDP、WO2019/025562(該案全文揭示爰引於此並併入本發明之揭示)中揭示的化合物，及特別係通式(1)之相關化合物)可能有能力誘導在癌細胞內PDE3A與SLFN12之間、或PDE3B與SLFN12之間的複合物形成，其可能導致癌細胞的細胞凋亡。

可在表達AIP多肽或多核苷酸的細胞，特別係有關表達許拉芬家族成員12(SLFN12)及磷酸二酯酶3A(PDE3A)的細胞、或表達許拉芬家族成員12(SLFN12)及磷酸二酯酶3B(PDE3B)的細胞中，誘導細胞凋亡，原因在於AIP係涉及PDE3A-SLFN12或PDE3B-SLFN12複合物形成。也已發現可在有關表達許拉芬家族成員12(SLFN12)及磷酸二酯酶3A(PDE3A)的細胞、或表達許拉芬家族成員12(SLFN12)及磷酸二酯酶3B(PDE3B)的細胞之表達轉形/轉錄域相關蛋白(TRRAP)多肽或多核苷酸的細胞中誘導細胞凋亡，原因在於TRRAP也係涉及複合物形成的形成作用或對複合物形成的反應。

提供患有諸如癌症之對PDE3A-SLFN12複合物形成或PDE3B-SLFN12複合物形成具有反應性的過度增生性疾病、病症或病況的對象之鑑定方法，該方法包含檢測：

(i)芳基烴受體交互作用蛋白(AIP)多肽或多核苷酸及/或轉形/轉錄域相關蛋白(TRRAP)多肽或多核苷酸的表達，

(ii)相對於參考，磷酸二酯酶3A(PDE3A)多肽或多核苷酸及/或磷酸二酯酶3B(PDE3B)多肽或多核苷酸在細胞的表達，及

(iii)相對於參考，許拉芬家族成員12(SLFN12)多肽或多核苷酸在細胞的表達；

其中該過度過度增生性疾病、病症、或病況係被特徵化為對該複合物形成具有反應性者若：

(i)AIP及/或TRRAP被表達，

(ii)相對於參考，PDE3A及/或PDE3B的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。

於某些實務操作中，該方法可包含從該對象獲得該過度增生性疾病、病症、或病況的一個或多個細胞(例如，癌細胞)及檢測：

其中該過度增生性疾病、病症、或病況係被特徵化為對該複合物形成具有反應性若：

(i)AIP及/或TRRAP被表達，

(ii)相對於參考，PDE3A及/或PDE3B的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。

於若干具體例中，若AIP及TRRAP兩者皆係在細胞表達，則該過度增生性疾病、病症、或病況係被特徵化為對該複合物形成具有反應性。於某些實務操作中，AIP及/或TRRAP的表達可藉由比較對於參考的表達而予判定，及該過度增生性疾病、病症、或病況係被特徵化為對該複合物形成具有反應性若：

(i)相對於參考，AIP及/或TRRAP的表達並無損失(例如，AIP及/或 TRRAP在細胞的表達程度係大於參考之表達程度的50%，或大於參考之表達程度的90%，或大於參考之表達程度的100%)，

(ii)相對於參考，PDE3A的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。於若干具體例中，患有諸如癌症之對PDE3A-SLFN12複合物形成具有反應性的過度增生性疾病、病症、或病況的個體之鑑定方法，可包含從該個體獲得該過度增生性疾病、病症、或病況的一個或多個細胞(例如，癌細胞)及檢測：

(ii)相對於參考，磷酸二酯酶3A(PDE3A)多肽或多核苷酸的表達，及

(iii)相對於參考，許拉芬家族成員12(SLFN12)多肽或多核苷酸的表達；

(i)AIP及/或TRRAP被表達，

(ii)相對於參考，PDE3A的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。於若干具體例中，若AIP及TRRAP兩者皆被表達，則該過度增生性疾病、病症、或病況係被特徵化為對該複合物形成具有反應性。

於各種實務操作中，患有諸如癌症之對PDE3A-SLFN12複合物形成具有反應性的過度增生性疾病、病症、或病況的對象之鑑定方法，可包含從該對象獲得該過度增生性疾病、病症、或病況的一個或多個細胞(例如，癌細胞)及檢測：

(ii)相對於參考，磷酸二酯酶3B(PDE3B)多肽或多核苷酸的表達，及

(i)AIP及/或TRRAP被表達，

(ii)相對於參考，PDE3B的表達為增加，及

對象的細胞可收集自組織樣本、血液樣本、或血漿樣本。

也提供殺死細胞(例如，癌細胞)或減低其存活之方法，其中該癌細胞係經選擇為對PDE3A/B-SLFN12複合物形成具有反應性，該方法包含使得癌細胞與PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)接觸，其中當該細胞表達AIP及/或TRRAP多肽或多核苷酸，相對於參考具有SLFN12多肽或多核苷酸的表達增加，及相對於參考具有PDE3A或PDE3B的表達增加時，該細胞係經選擇為對PDE3A/B-SLFN12複合物形成具有反應性。典型地，PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、 PDE3B調節劑)可能可以誘導PDE3A/B-SLFN12複合物形成，導致接觸後的細胞凋亡。於若干具體例中，若相對於參考，該細胞具有PDE3A的表達增加及SLFN12的表達增加，則該癌細胞係經選擇為對PDE3A-SLFN12複合物形成具有反應性。於若干具體例中，若相對於參考，該細胞具有PDE3B，及SLFN12的表達增加，則該細胞係經選擇為對PDE3B-SLFN12複合物形成具有反應性。許多PDE3A調節劑也直接結合PDE3B蛋白，及PDE3A調節劑可使用來誘導SLFN12與PDE3B間之複合。

於若干具體例中，提供於對象治療或預防過度增生性疾病、病症、或病況(例如，癌症)之方法，其包含對該對象投予PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)，其中藉由從該對象獲得過度增生性疾病、病症、或病況(例如，癌症)的一個或多個細胞，及檢測以下各項，該對象係經鑑定為患有對PDE3調節劑具有反應性的過度增生性疾病、病症、或病況：

(i)AIP及/或TRRAP被表達，

(ii)相對於參考，PDE3B的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。於若干具體例中，若AIP及TRRAP兩者皆被表達，則該過度增生性疾病、病症、或病況係被特徵化為對PDE3調節劑具有反應性。PDE3A調節劑可包含例如，6-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫嗒嗪-3(2H)-酮(DNMDP)。於某些實務操作中，AIP及/或TRRAP的表達可經由比較對參考的表達而予判定，及該過度增生性疾病、病症、或病況係被特徵化為對該複合物形成具有反應性若：

(i)相對於參考，AIP及/或TRRAP的表達並無損失(例如，AIP及/或TRRAP在細胞內的表達程度係大於參考之表達程度的50%，或大於參考之表達程度的90%，或大於參考之表達程度的100%)，

(ii)相對於參考，PDE3A的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。

任何生物標記(例如，AIP、TRRAP、PDE3A、PDE3B、SLFN12)的表達可藉選自於由下列所組成之組群中之方法加以檢測：免疫墨點、質譜術、免疫沈澱定量PCR、北方墨點、微陣列、酵素連結免疫吸附分析試驗(ELISA)、原位雜交、及其組合。於某些實務操作中，AIP及/或TRRAP的表達可藉由比較參考而予判定。若比較參考而表達並無損失，則癌細胞可視為表達AIP及/或TRRAP。於某些實務操作中，AIP及/或TRRAP的表達可藉由比較參考而予判定，及若在癌細胞的表達與參考間有小差異(例如，癌細胞套數係在參考的套數之10%以內，癌細胞套數係在參考的5%以內)，則該細胞可被視為表達AIP及/或TRRAP。基因體學可被使用來判定表達程度及相對表達程度。舉例言之，若每個細胞基因體的生物標記之套數係少於1或少於2^-1或少於2^-2或少於2^-3或少於2^-4或少於2^-5，則該細胞可視為不表達AIP及/或TRRAP。相反地，若每個細胞基因體的生物標記之套數係大於1或大於2^-1或大於2^-2或大於2^-3或大於2^-4或大於2^-5，則該細胞可被視為表達AIP及/或TRRAP。

此等方法使得能夠治療及/或預防由對複合物形成(特別為由PDE3調節所誘發的複合物形成)具有反應性的細胞增生所引起的過度增生性疾病、病症、或病況。於若干具體例中，細胞為癌細胞。舉例言之，過度增生性疾病、病症、或病況可選自於膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、膠質母細胞瘤、腎癌、白血病(例如，急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、肝癌(例如，肝細胞癌、肝內膽管癌、血管肉瘤、血管瘤、肝母細胞瘤)、肺癌(例如，非小細胞肺癌、小細胞肺癌、間皮瘤)、黑色素瘤、卵巢癌、胰癌、***癌、多發性骨髓瘤、肉瘤(例如，骨肉瘤、軟組織肉瘤)、甲狀腺癌、泌尿道癌、或子宮癌。於某些實務操作中，癌症可以是造血性癌症，諸如急性淋巴母細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性單核細胞性白血病、何杰金氏淋巴瘤、或非何杰金氏淋巴瘤。

各種投予途徑皆可使用於治療模式。於若干具體例中，PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)係經口投予。於其它具體例中，PDE3調節劑係經靜脈注射投予。

也提供患有對複合物形成，包括化學誘導複合物形成，具有反應性的癌症(例如，對PDE3調節劑具反應性的細胞、對PDE3A調節劑具反應性的細胞、對PDE3B調節劑具反應性的細胞)之對象的鑑定套組，其中該套組包含結合AIP多肽的第一捕獲試劑、及/或結合TRRAP多肽的第二捕獲試劑。於若干具體例中，該套組包含結合PDE3A多肽的第三捕獲試劑、及/或結合SLFN12多肽的第四捕獲試劑、及/或結合PDE3B多肽的第五捕獲試劑。於若干具體例中，該套組進一步包含PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)，諸如DNMDP或WO2019/025562之化合物。須瞭解捕獲試劑的數字識別符(例如，第一、第二、第三、第四、第五)並非指示各個套組中之捕獲試劑的總量。PDE3調節劑可以足夠遞送治療有效量給有需要的患者而存在於藥物配方中。

第1圖闡明針對經測定PDE3A敏感度的49個細胞株之每千個鹼基的轉錄物每百萬映射讀取(RPKM)的讀值，及鑑定除了HeLa細胞之外的生物標記陽性癌細胞株。高比例的生物標記陽性細胞株係來自黑色素瘤患者。

第2A圖顯示針對HeLa細胞及7個顯示DNMDP敏感性的黑色素瘤細胞株之DNMDP 72小時Cell Titer-Glo分析試驗劑量反應曲線。如圖可知，C32及RVH421只有部分敏感。第2B圖顯示針對數個對DNMDP處理敏感的細胞株之DNMDP 72小時Cell Titer-Glo分析試驗劑量反應曲線。第2C圖顯示針對數個對DNMDP處理部分敏感或不敏感的細胞株之DNMDP 72小時Cell Titer-Glo分析試驗劑量反應曲線。

第3A圖顯示比較有SLFN12之CRISPR KO的細胞，在各種DNMDP濃度的細胞存活。A2058及SKMEL3為代表性黑色素瘤細胞株。存活係使用72小時Cell Titer-Glo分析試驗測量，及CRISPR係使用sg4，SLFN12 CRISPR指引RNA #4進行。第3B圖顯示比較PDE3A剔除細胞(有及無異位PDE3B表達)之HeLa細胞之存活。

第4圖鑑定該等CRISPR基因標靶，其導致在HeLa細胞中對殺死DNMDP癌細胞的敏感度減低。於25nM DNMDP存在下，AIP、SLFN12、及PDE3A基因剔除造成細胞存活的最大增高。結果係作圖為比較-log p值之全部基因中之基因CRISPR指引RNA表示型態的對數倍數變化(LFC)，指示顯著性的機率。TRRAP也具有於25nM DNMDP存在下細胞存活的顯著增高。

第5圖比較在所測量的細胞株中之基因套數與AIP的表達，及鑑定UACC257細胞株為缺乏AIP表達。如於第2A圖中顯示，UACC257對DNMDP不具有敏感度。

第6A圖闡明在HeLa細胞中使用獨立AIP CRISPR gRNAs(sg)的72小時Cell Titer-Glo分析試驗結果。第6B圖顯示在A2058黑色素瘤細胞中使用獨立AIP CRISPR gRNAs(sg)的72小時Cell Titer-Glo分析試驗結果。第6C圖為顯示在DNMDP敏感細胞株中，AIP基因剔除減低PDE3A蛋白質程度的免疫墨點。

第7圖為闡明AIP基因剔除防止DNMDP誘導複合物形成的免疫墨點。來自HeLa細胞的PDE3A免疫沈澱，暫時性地以V5加標籤的SLFN12轉染，及以10μM DNMDP處理。

定義

本發明的具體例細節係於本文中揭示；但須瞭解所揭示的具體例僅只闡明可以各種形式具體實施的揭示內容。此外，連結本揭示之各個具體例指示的各個實施例係意圖為闡明性，而非限制性。

除非另行載明，否則本文中使用的全部術語具有其尋常意義。除非另行定義，否則全部濃度係以特定成分重量相對於局部用組成物之總重的重量百分比表示。

如於本文中使用，「一(a)」或「一(an)」係表示一個或多個。如於本文中使用，結合「包含」一詞使用時，「一(a)」或「一(an)」等字係意指一個或多於一個。如於本文中使用，「另一」係表示至少第二個或多個。

如於本文中使用，全部的數值範圍包括端點及在所揭示值間揭露的全部可能值。也預期特別揭示全部的半整數數值的確切值，及作為所揭示範圍的全部子集之極限。舉例言之，0.1%至3%之範圍特別揭示0.1%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、及3%等百分比。此外，0.1%至3%之範圍包括原先範圍的子集，包括0.5%至2.5%，1%至3%，及0.1%至2.5%。須瞭解個別成分之全部重量百分比之和將不超過100%。

「PDE3A多核苷酸」係表示編碼PDE3A多肽或其片段的任何核酸分子。例示性PDE3A核酸序列係提供於NCBI Ref：NM_000921.4：

(SEQ ID NO：1)

「PDE3A多肽」一詞係表示對NCBI Ref No.NP_000912.3提供的序列(其催化環狀腺苷單磷酸(cAMP)及環狀鳥苷單磷酸(cGMP)的水解)，具有至少85%胺基酸序列相同度的蛋白質或其片段。例示性人全長PDE3A胺基酸序列為：

(SEQ ID NO：2)

已知若干PDE3A同功異形體，包括PDE3A1、PDE3A2、及PDE3A3。PDE3A1包含全長PDE3A胺基酸序列之胺基酸146-1141，PDE3A2同功異形體包含胺基酸299-1141，及PDE3A3包含胺基酸483-1141。此外，已針對PDE3A，觀察得編碼多個同功異形體的剪接轉錄物變異體。一個此種轉錄物變異體具有NCBI Ref No.NM_001244683，其具有相關蛋白質序列(NP_001231612.1)：

(SEQ ID NO：3)。於若干具體例中，PDE3A之同功異形體在細胞的表達可予量測。

「PDE3B多核苷酸」一詞係表示編碼PDE3B多肽或其片段的任何核酸分子。例示性PDE3B核酸序列係提供於NCBI Ref：NM_000922.3：

(SEQ ID NO：4)

「PDE3B多肽」一詞係表示相對於NCBI Ref No.NP_000913.2提供的序列，具有至少85%胺基酸序列相同度的蛋白質或其片段。例示性人全長PDE3A胺基酸序列為：

(SEQ ID NO：5)

「SLFN12多核苷酸」一詞係表示編碼SLFN12多肽或其片段的任何核酸分子。例示性SLFN12核酸序列係提供於NCBI Ref：NM_018042.4：

(SEQ ID NO：6)

「SLFN12多肽」一詞係表示相對於NCBI Ref No.NP_060512.3提供的序列(當其結合至DNMDP及其它複合物誘導化合物時係與PDE3A交互作用)，具有至少85%胺基酸序列相同度的蛋白質或其片段。例示性人SLFN12胺基酸序列為：

(SEQ ID NO：7)

「AIP多核苷酸」一詞係表示編碼AIP多肽或其片段的任何核酸分子。例示性AIP核酸序列係提供於NCBI Ref：NM_003977.2：

(SEQ ID NO：8)

「AIP多肽」一詞係表示相對於NCBI參考序列：NP_003968.2提供的序列(其能結合芳基烴受體)，具有至少85%胺基酸序列相同度的蛋白質或其片段。AIP多肽可調節許多異生性代謝酶的表達，及特異性結合到B型肝炎病毒且抑制其活性。針對此基因已發現編碼不同的同功異形體之三個轉錄物變異體。例示性人AIP胺基酸序列為：

(SEQ ID NO：9)

「TRRAP多肽」一詞係表示相對於NCBI參考序列：NP_001231509.1提供的序列(其具有組織蛋白腖乙醯基轉移酶複合物招募活性)，具有至少85%胺基酸序列相同度的蛋白質或其片段。例示性人TRRAP胺基酸序列為(其編碼較長的同功異形體)：

(SEQ ID NO：11)

「TRRAP多核苷酸」一詞係表示編碼TRRAP多肽或其片段的任何核酸分子。例示性TRRAP核酸序列係提供於NCBI Ref：NM_001244580.1：

(SEQ ID NO：10)

於某些實務操作中，檢測多核苷酸的標記可以是編碼蛋白質的多核酸區。

「變化」一詞係表示如藉標準技術已知方法，諸如本文中描述的方法，檢測得基因或多肽的表達程度或活性之變化(增或減)。如於本文中使用，變化包括表達程度至少10%改變，例如，表達程度至少25%改變、40%改變化、及50%或以上改變。

「化學誘導」複合物(例如，化學誘導PDE3A-SLFN12複合物、化學誘導PDE3B-SLFN12複合物)為在與活性化合物(諸如PDE3A調節劑或PDE3B調節劑)接觸之後，由指示的劑所生成的複合物。典型地，本文中描述之活性化合物為誘導PDE3A-SLFN12或PDE3B-SLFN12的化學化合物，諸如DNMDP或WO2019/025562之化合物。

「調節劑」一詞係表示結合至多肽，且變化多肽的生物功能或活性的任何劑。調節劑包括，但非限制性，增加多肽結合至另一劑的劑。舉例言之，調節劑可促進多肽結合至另一多肽。於若干具體例中，PDE3A或PDE3B之調節劑促進此等蛋白質結合至SLFN12。於若干具體例中，PDE3A多肽之調節劑為DNMDP。於其它具體例中，PDE3A之調節劑為WO2019/025562之例舉化合物。

術語「捕獲試劑」係指能夠結合生物樣本中之標靶分子或欲檢測的分析物的試劑，例如抗體或抗原結合蛋白。捕獲試劑可被固定在例如分析試驗表面，諸如固體酶基質或反應容器。本文中描述之捕獲試劑可結合至PDE3A、PDE3B、SLFN12、AIP、及TRRAP中之一者或多者。

「檢測」係指鑑定欲檢測的分析物的存在與否或含量。於特定具體例中，分析物是AIP、TRRAP、PDE3A、PDE3B、或SLFN12多肽。

「有效量」或「治療有效量」表示相對於未經處理患者，改善疾病症狀(例如，治療或預防)所需的本文中描述之化合物之量。用以實施本文揭示用於治療性處理疾病的活性化合物的有效量係取決於投予方式、個體年齡、體重、及一般健康狀況而改變。最終，主治醫師或獸醫師將決定適當用法用量。於若干具體例中，該化合物為DNMDP或WO2019/025562之化合物。

術語「健康」、「正常」、及「非贅生的瘤」係於本文中互換使用，指稱完全沒有(至少至檢測極限沒有)疾病病況，諸如贅瘤的個體或特定細胞或組織。於若干具體例中，參考可以是健康細胞。

本揭示提供可使用於發展高度專一性治療用藥物的多個標靶，或藉本文闡述的方法加以特徵化的病症。此外，本揭示之方法提供以高體積通量、高敏感度、與低複雜度，實質上分析任何數目之化合物有關其用於本文中描述之疾病的效果之分析途徑。

「片段」一詞係表示多肽或核酸分子的一部分。此部分含有參考核酸分子或多肽的全長之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。一片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90，或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000個核苷酸或胺基酸。

「標記」一詞係表示相對於與疾病或病症相關聯的參考，表達程度或活性有變化的任何蛋白質或多核苷酸。於特定具體例中，本揭示的標記為AIP(例如，AIP多肽、AIP多核苷酸)、TRRAP(例如，TRRAP多肽、TRRAP多核苷酸)、PDE3A(例如，PDE3A多肽、PDE3A多核苷酸)、PDE3B(例如，PDE3B多肽、PDE3B多核苷酸)、或SLFN12(例如，SLFN12多肽、SLFN12多核苷酸)。於某些實務操作中，標記可包含編碼多肽(例如，AIP多肽、TRRAP多肽、PDE3A多肽、PDE3B多肽、SLFN12多肽)的多核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1、4、6、8、10)之部分。於若干具體例中，標記可具有SEQ ID NO：1-11中之任一者。於若干具體例中，標記可包含與SEQ ID NO：2、3、5、7、9、或11至少75%或至少80%或至少85%之序列相同度。

於本揭示之方法中有用的核酸分子(例如，多核苷酸)包括編碼本揭示之多肽或其片段的任何核酸分子。此等核酸分子無需與內生性核酸序列100%相同，但將典型地具有實質相同度。具有與內生性序列實質相同度的多核苷酸典型地能與雙股核酸分子的至少一股雜交。於本揭示之方法中有用的核酸分子包括編碼本揭示之多核苷酸或其片段的任何核酸分子。此等核酸分子無需與內生性核酸序列100%相同，但將典型地具有實質相同度。典型地，當多核苷酸雜交且核酸分子的至少一股雜交時，其能夠在各種嚴苛條件下配對，而在互補多核苷酸序列(例如，本文中描述之基因)間形成雙股分子或其部分。

舉例言之，「嚴苛」鹽濃度通常將為少於約750mM NaCl及75mM檸檬酸三鈉，或少於約500mM NaCl及50mM檸檬酸三鈉，或少於約250mM NaCl及25mM檸檬酸三鈉。低嚴苛度雜交可於有機溶劑，例如，甲醯胺之不存在下獲得；而高嚴苛雜交可於至少約35%甲醯胺或至少約50%甲醯胺之存在下獲得。嚴苛溫度條件通常將包括至少約30℃或至少約37℃或至少約42℃之溫度。改變額外參數，諸如雜交時間、清潔劑濃度(例如，十二烷基硫酸酯鈉(SDS))、及涵括或不涵括載體DNA，為熟諳技藝人士眾所周知。視需要，藉將此等各種條件組合，可達成不同的嚴苛程度。於特定具體例中，雜交將發生於30℃在750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉、及1%SDS。於若干具體例中，雜交將發生於37℃在500mM NaCl、50mM檸檬酸三鈉、1%SDS、35%甲醯胺、及100微克/毫升變性鮭魚***DNA(ssDNA)。於某些態樣中，雜交可發生於42℃在250mM NaCl、25mM檸檬酸三鈉、1%SDS、50%甲醯胺、及200微克/毫升ssDNA。此等條件之有用變化將為熟諳技藝人士方便地顯然易知。

針對大部分應用，雜交後之洗滌步驟的嚴苛度也將改變。洗滌嚴苛度條件可由鹽濃度且由溫度加以界定。如前述，洗滌嚴苛度可藉降低鹽濃度或藉升高溫度而予提升。舉例言之，洗滌步驟的嚴苛鹽濃度可以是少於約30mM NaCl及3mM檸檬酸三鈉，或多少於約15mM NaCl及1.5mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴苛溫度條件通常將包括至少約25℃，例如至少約42℃，或至少約68℃溫度。於若干具體例中，洗滌步驟將發生於25℃在30mM NaCl、3mM檸檬酸三鈉、及0.1%SDS中。於某些具體例中，洗滌步驟將發生於42℃在15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉、及0.1%SDS中。於特定實務操作中，洗滌步驟可發生於68℃在15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉、及0.1%SDS中。此等條件之額外變化將為熟諳技藝人士方便地顯然易知。雜交技術為熟諳技藝人士眾所周知，及係描述於例如，Benton及Davis(Science 196：180,1977)；Grunstein及Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72：3961,1975)及Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger及Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；及Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York。

典型地，實質上相同的多肽或核酸與參考胺基酸序列(例如，本文中描述之胺基酸序列中之任一者)或核酸序列(例如，本文中描述之核酸序列中之任一者)具有至少50%相同度。於某些實務操作中，對於用來比較的序列，於胺基酸層面或核酸，此種序列為至少60%，或至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少99%相同度。

序列相同度典型地係使用序列分析軟體(例如，Genetics Computer Group的Sequence Analysis Software Package，威斯康辛大學生技中心，威州馬里森53705，大學大道1710號，BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程式)測量。藉由對各種取代、刪除、及/或其它修飾指定同源度，此軟體匹配相同的或相似的序列。保留性取代可包括於下列組群中之取代：

甘胺酸、丙胺酸；

纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；

天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺；

天冬胺酸、麩胺酸；

天冬醯胺、麩胺醯胺；

絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及

***酸、酪胺酸。

於判定相同度的例示性辦法中，可使用BLAST程式，e^-3至e^-100間之概率分數指示為密切相關的序列。

如於本文中使用，術語「醫藥組成物」表示使用醫藥上可接受之賦形劑調配的含化合物(例如，PDE3調節劑)的組成物。於若干具體例中，醫藥組成物係以政府管理機構核准製造或銷售，作為哺乳動物疾病之處理的治療計畫之部分。醫藥組成物可被調配，例如，供口服投予的單位劑型(例如，錠劑、膠囊、膠囊型錠劑、粒狀膠囊)；供局部投予(例如，呈乳膏劑、膠漿劑、洗劑、軟膏劑)；供靜脈投予(例如，呈不含微粒栓子及於適合靜脈使用的溶劑系統中之無菌溶液劑)；或呈本文中描述的任何其它調配物。

用於製備本揭示之組成物的有用的醫藥載劑可以是固體、液體、或氣體。因此，組成物可呈型式為錠劑、丸劑、膠囊、栓劑、粉劑、腸衣調配物或其它經保護的調配物(例如，結合於離子交換樹脂)、持續釋放調配物、溶液劑、懸浮劑、酏劑、及噴霧劑。載劑可選自於多種油類，包括石油、動物、植物或合成來源的油類，例如，花生油、大豆油、礦油、及芝麻油。水、鹽水、水性右旋糖、及二醇類為特別地(當與血液呈等張性時)適用於注射溶液劑的液體載劑。舉例言之，靜脈投予調配物包含活性化合物之無菌水性溶液，其製備方式係經由將固體活性化合物溶解於水以生產水性溶液，及使得該水性溶液變無菌。合宜的醫藥賦形劑包括澱粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、滑石、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、二氧化矽、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、一硬脂酸甘油酯、氯化鈉、乾燥脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、及乙醇。組成物可添加習知醫藥添加劑，諸如保藏劑、安定劑、保濕劑或乳化劑、調節滲透壓之鹽、及緩衝劑。合宜的醫藥載劑及其調配物係描述於Remington’s Pharmaceutical Sciences，作者E.W.Martin。總而言之，此等組成物含有有效量之活性化合物連同合宜載劑，以製造用來投予接受者的適當劑型。

如於本文中使用，術語「醫藥上可接受之鹽」係指本文所述任何化合物之鹽類，其在明智醫藥判定範圍內，係適用來與人體及動物的組織接觸，而無不當的毒性、刺激性、過敏反應，且係與合理效益/風險比相稱。醫藥上可接受之鹽為業界眾所周知。舉例言之，醫藥上可接受之鹽係描述於：Berge et al.,J.Pharmaceutical Sciences 66：1-19,1977及Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use,(Eds.P.H.Stahl and C.G.Wermuth),Wiley-VCH,2008。鹽類可製自醫藥上可接受之無毒的酸及鹼，包括無機及有機的酸及鹼。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、褐藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二氯乙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、麩胺酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、馬尿酸鹽、氫溴酸鹽、氫氯酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、羥乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲烷磺酸鹽、黏液酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、帕莫酸鹽、泛酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、及戊酸鹽。代表性鹼鹽包括鹼金屬或鹼土金屬鹽類，包括鈉、鋰、鉀、鈣、及鎂鹽；以及無毒銨、第四銨、及胺陽離子，包括，但非限制性，銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、咖啡因、及乙基胺。

如於本文中使用，術語「對象」係指可被投予依據本揭示之組成物的任何有機體，例如，用於實驗、診斷、預防、及/或治療用途。典型對象包括任何動物(例如，哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類、及人類)。對象可以是家畜(例如，牛、小牛、羊、小羊、馬、小馬、豬、小豬)，或鼠科的動物(例如，大鼠、小鼠)。對象可能尋求或需要處理、要求處理、或接受處理、未來可能接受處理、或正由熟練專業人員針對特定疾病或病況接受照護的人類或動物。

如於本文中使用，「有需要的患者」係指可經鑑定為患有對複合物形成具反應性的疾病、病症、或病況的人類個體。如於本文中描述，於若干具體例中，有需要的個體係罹患過度增生性病症，諸如癌症。於若干具體例中，有需要的個體已由醫師診斷為患有需要處理的過度增生性病症。有需要的患者或有需要的個體於本文中係互換使用。

如於本文中使用，術語「參考」或「參考程度」係指，其可被關注用於比較目的之指定的生物標記(例如，SLFN12、PDE3A、PDE3B、AIP、TRRAP)之量或濃度。舉例言之，參考程度可以是指定的生物標記之程度，該程度係表達為得自取自於健康對象的對照族群之樣本的生物標記之程度之平均值。於若干具體例中，參考程度可以是指定的生物標記之程度，該程度係表達為自多個癌細胞株(例如，第5圖中測量的癌細胞株)測量的生物標記之程度之平均值。於一個具體例中，「參考」為標準情況或對照情況。用於測定參考程度的合宜樣本或參考包括：健康細胞、對化學誘導複合物形成不具反應性的細胞(例如，對PDE3A調節不具反應性的細胞、對PDE3B調節不具反應性的細胞)、非癌性細胞、正常組織等。於各種實務操作中，參考可以是癌性細胞的平均表達程度。於若干具體例中，測定指定的生物標記之參考程度的該參考可衍生自該對象、已知未患有癌症的對象，諸如健康對象、或對象之族群。合宜參考包括同時處理的對照，或可藉分析試驗一個或多個癌細胞及收集生物標記數據所生成的標準。因此，對照樣本可視需要地為所生成的且連續使用的標準。標準例如包括，得自非癌對照組的樣本中之生物標記平均程度。於某個具體例中，參考係衍生自已知未患有癌症的對象之樣本。

如於本文中使用，及也如業界瞭解，「治療」病況或病況(例如，本文中描述之病況，諸如癌症)之「治療」乃獲得有利的或期望的結果諸如臨床結果的辦法。對象的治療可包括減少對象體內癌細胞的增生。有利的或期望的結果可包括，但非限制性，一個或多個症狀或病情的緩解或改善；疾病、病症、或病況之範圍的縮減；疾病、病症、或病況的狀態穩定(亦即，不惡化)；防止疾病、病症、或病況的擴散；延遲或減慢疾病、病症、或病況的進展；疾病、病症、或病況的改善或減輕；及緩和(包括部分緩和或全部緩和)，包括可檢測的或不可檢測的。「減輕」疾病、病症、或病況表示比較於無治療存在下的範圍或時程，疾病、病症、或病況之範圍及/或非期望的臨床表徵減少，及/或進展時程減慢或延長。

PDE3A/B-SLFN12複合物之化學誘導劑

不欲受任何理論所限，相信某些化學劑能在AIP及TRRAP存在下，於某個反應性細胞中，誘導特定磷酸二酯酶與許拉芬蛋白質間之複合。如亦於WO 2017/027854(該案全文揭示爰引於此並併入本發明之揭示)，PDE3A及SLFN12之表達增加，業已顯示與某些化學劑(亦即，「複合物誘導劑」或「複合物誘導性活性化合物」)，諸如PDE3A調節劑的胞毒性有關連。如示於本文，只有惡性生物標記陽性細胞的選擇性細胞凋亡，可能出現在PDE3A/B-SLFN12形成之化學誘導之後。本揭示之部分前提假設：發現AIP及TRRAP肽係涉及癌細胞的細胞凋亡反應。此等生物標記的組合之表達業已顯示與複合物誘導性活性化合物(例如，PDE3調節劑、PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)敏感度有關連。使用AIP及TRRAP作生物標記，允許對PDE3A-SLFN12或PDE3B-SLFN12複合物形成，及特別地化學誘導複合具反應性的細胞進一步分層。此增加的分層允許更有效地鑑定對該患者族群具有反應性細胞的疾病、病症、或病況之治療或預防用之特定化學劑。再者，其有助於鑑定將自使用可操作的經由PDE3A-SLFN12或PDE3B-SLFN12複合物形成之如PDE3A調節劑、PDE3B調節劑之PDE3調節劑處理而獲益的患者。

一旦藉本文中描述之方法(例如，藉AIP及/或TRRAP之表達；及相對於參考，諸如健康對照細胞或癌性細胞(諸如第5圖中測量之該等細胞)的平均表達程度，PDE3A或PDE3B的表達增加；及相對於參考，諸如健康對照細胞或癌性細胞的平均表達程度，SLFN12的表達增加)鑑定細胞對複合物形成具反應性，則可藉利用一個或多個PDE3調節劑化學誘導複合物形成，而出現該細胞之細胞凋亡。複合物誘導性活性化合物可被遞送到反應性細胞株，以誘導PDE3A-SLFN12及/或PDE3B-SLFN12間之複合，其可在只對複合物形成易感的該等細胞(例如，癌細胞)導致細胞凋亡。於若干具體例中，PDE3A-SLFN12複合物誘導性活性化合物為PDE3調節劑，諸如PDE3A調節劑或PDE3B調節劑。於各種實務操作中，PDE3B-SLFN12複合物誘導性活性化合物為PDE3調節劑，諸如PDE3A調節劑或PDE3B調節劑。舉例言之，複合物誘導性活性化合物可以是DNMDP或WO2019/025562之化合物。

適合用作為治療劑以誘導PDE3A/B-SLFN12複合物形成的複合物誘導性活性化合物(包括PDE3(例如，PDE3A、PDE3B)調節劑)的鑑定，可使用經設計以鑑定胞毒性小分子的表現型篩檢進行，該等胞毒性小分子當投予時，透過PDE3A-SLFN12或PDE3B-SLFN12之複合物形成，而偏好殺死癌細胞優於健康細胞。前瞻化學基因體學辦法可互補標靶驅動的藥物發展計畫，其典型地由廣泛性活體外及活體內標靶驗證所組成。許多美國食物藥物管理局(FDA)核准的標靶療法已藉此方式發展出，於其中，為靶定於致癌的體驅動因子突變的小分子激酶抑制劑。然而，標靶療法的發現及發展經常因標靶之生物功能、其作用機轉、選擇性地調節標靶的可用化學物質的知識的限制而受到妨礙。本揭示係有關於增加該知識基礎。

表現型篩檢可探索癌症療法的新穎標靶，該癌症療法的特定分子機轉經常係藉未來研究加以闡明。舉例言之，發展用來鑑定造成tp53 突變株癌細胞的合成致死之小分子的表現型篩檢，使其能偶然地發現一類癌症選擇性胞毒劑，其作為磷酸二酯酶3A(PDE3A)之調節劑。許多PDE3A調節劑也直接結合PDE3B蛋白質，及PDE3A調節劑可被使用來誘導SLFN12與PDE3B間之複合。環狀核苷酸磷酸二酯酶催化第二信使分子-環狀腺苷一磷酸(cAMP)及環狀鳥苷一磷酸(cGMP)-的水解，及其於許多生理程序為重要。

本揭示提供基於在包含癌細胞的對象生物樣本中之AIP及/或TRRAP的表達，用以鑑定患有可能對PDE3調節劑治療有反應的患有惡性病之對象之方法；該癌細胞相對於參考，也表達增加程度的PDE3A及SLFN12或PDE3B及SLFN12。

PDE3A調節劑之實例包括DNMDP(6-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫嗒嗪-3(2H)-酮)

及其醫藥上可接受之鹽，或WO2019/025562之化合物，諸如(6S)-5-[4’-氟-2-(三氟甲基)聯苯-4-基]-6-甲基-3,6-二氫-2H-1,3,4-

二嗪-2-酮；5-{4-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-3-(三氟甲基)苯基}-3,6-二氫-2H-1,3,4-

二嗪-2-酮；(6S)-5-[4-(2-胺基吡啶-4-基)-3-(三氟甲基)苯基]-6-甲基-3,6-二氫-2H-1,3,4-

二嗪-2-酮；及(6S)-6-甲基-5-{3-(三氟甲基)-4-[3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯基}-3,6-二氫-2H-1,3,4-

二嗪-2-酮或其醫藥上可接受之鹽。

須瞭解前文描述的調節劑為業界已知。該等結構式係提供用於闡明目的。結構式與已知藥物間之任何不一致性，將依有利於已知藥物解決。PDE3調節劑可呈醫藥上可接受之鹽形式。

PDE3調節劑可能具有全身性活性及/或局部活性。為了此目的，其可以合宜方式投予，例如，經由口服、腸道外、肺、鼻、舌下、舌、頰、直腸、***、皮膚、經皮、結膜、耳途徑，或作為植體或支架投予。用於此等投予途徑，依據本揭示之化合物可以合宜的投予型投予。

用於經口投予，可將依據本揭示之化合物調配成，快速地及/或以修正方式遞送本揭示之化合物的業界已知劑型，例如，錠劑(未包衣錠或包衣錠，例如具有腸衣或受控釋放的包衣，其為延遲溶解或為不可溶)、口服崩散錠、膜劑/糯米膠囊、膜劑/凍乾劑、膠囊(例如，硬或軟明膠膠囊)、糖衣錠、粒劑、丸粒劑、粉劑、乳液劑、懸浮劑、噴霧劑、或溶液。可將依據本揭示之化合物以結晶及/或非晶及/或溶解形式併入劑型。

腸道外投予可規避吸收步驟(例如，靜脈、動脈內、心內、脊椎內或腰內)或涵括吸收作用(例如，肌肉、皮下、皮內、經皮或腹膜內)而予執行。適合腸道外投予的投藥型其中包括呈溶液、懸浮劑、乳液劑、凍乾劑、或無菌粉劑形式的注射製劑及輸注製劑。

適合用於其它投予途徑的實例為吸入用醫藥型(例如，粉末吸入劑、霧化劑)、鼻用滴劑、鼻用溶液劑、鼻用噴劑；經舌、舌下、或經頰投予用之錠劑/膜劑/糯米膠囊/膠囊；栓劑；眼用滴劑、眼用軟膏劑、眼用浴劑、眼用***劑、耳用滴劑、耳用噴劑、耳用粉劑、耳用清洗劑、耳用塞劑；***膠囊、水性懸浮液(擦劑、振盪合劑)、親脂性懸浮劑、乳液劑、軟膏劑、乳膏劑、經皮治療系統(例如，貼片)、乳劑、糊劑、泡沫劑、撒粉劑、植體或支架。

診斷

本揭示之特徵在於用於癌症特徵化之診斷分析試驗。可測定於對象樣本中之AIP及/或TRRAP之程度，特別連結PDE3A及/或PDE3B之程度，及SLFN12之程度，及使用作為對於以PDE3調節劑處理具反應性的癌症指標。AIP、TRRAP、PDE3A、PDE3B、或SLFN12多核苷酸之程度可藉標準方法測定，諸如定量PCR、北方墨點、微陣列、質譜術、及原位雜交。標準方法可被使用來測定衍生自腫瘤的AIP、TRRAP、PDE3A、PDE3B、或SLFN12多肽之程度。此等方法包括免疫分析試驗、ELISA、使用結合AIP、TRRAP、PDE3A、PDE3B、或SLFN12的抗體之西方墨點法、及放射性免疫分析試驗。PDE3A、SLFN12、AIP及/或TRRAP；或PDE3B、SLFN12、AIP及/或TRRAP多核苷酸或多肽的程度升高，被視為對於使用PDE3調節劑處理具反應性的疾病、病症、或病況(例如，癌症)的陽性指標。

生物樣本之類型

將對象的惡性病對調節以誘導複合物形成處理的反應性加以特徵化中，測量於生物樣本的不同類型中之AIP、TRRAP、PDE3A、PDE3B、及/或SLFN12表達之程度。於一個具體例中，生物樣本為腫瘤樣本。

於大部分具體例中，於得自對於以PDE3調節劑處理具反應性的對象之樣本中，PDE3A及SLFN12、或PDE3B及SLFN12的表達為比於非反應性對象中之表達程度更高。於某些實務操作中，PDE3A、PDE3B、及SLFN12的表達，於患有惡性病對象中，比於參考條件下(例如，健康對照)獨立地更高至少約2、5、10、20、或30倍。於若干具體例中，藉由計算癌細胞中之生物標記(例如，AIP、TRRAP、PDE3A、PDE3B、SLFN12)的表達，相對於存在於非反應性癌細胞中之程度、或存在於健康對照細胞中之程度的差異，而判定倍數的改變。此外，本揭示係部分植基於先決要件發現當細胞也表達AIP時，出現PDE3A-SLFN12或PDE3B-SLFN12複合物形成(及因而出現細胞凋亡)。也發現TRRAP為對DNMDP之敏感度所需。因此，除了增高的PDE3A及SLFN12生物標記之外，對複合物形成具反應性的細胞，相較於參考，可表達AIP及/或TRRAP的表達之無變化或損失、極少變化或損失、或增加。舉例言之，相較於參考，反應性細胞可具有多於50%或多於60%或多於70%或多於80%或多於90%或多於100%之AIP及/或TRRAP的表達。於某些具體例中，若每細胞基因體的生物標記之套數係小於1或小於2^-1或小於2^-2或小於2^-3或小於2^-4或小於2^-5，則該細胞可被視為不表達AIP及/或TRRAP。反之，若每細胞基因體的生物標記之套數係大於1或大於2^-1或大於2^-2或大於2^-3或大於2^-4或大於2^-5，則該細胞可被視為表達AIP及/或TRRAP。於某些具體例中，參考為於全部細胞株中之指定生物標記(例如，PDE3A、PDE3B、SLFN12、AIP、TRRAP)的平均表達程度，其數據係顯示於第5圖。於各種實務操作中，若表達係大於於全部細胞株中該生物標記的平均表達程度 (其數據係顯示於第5圖)，則AIP及/或TRRAP被視為於細胞中被表達(亦即，針對AIP及TRRAP的參考可以是於全部細胞株中該生物標記的平均表達程度，其數據係顯示於第5圖)。於若干具體例中，表達係大於健康對照細胞(亦即，用於PDE3A、PDE3B、及/或SLFN12之參考可以是健康對照細胞)，則PDE3A、PDE3B、及/或SLFN12被視為於細胞中具有增加的表達。於若干具體例中，若表達係大於第5圖的癌細胞的平均表達程度，則PDE3A、PDE3B、及/或SLFN12被視為於細胞中具有增加的表達。

處理方法的選擇

如於本文中報告，於選擇處理方法過程中或於處理方法期間，患有惡性病之對象可被測試AIP及/或TRRAP的表達。於若干具體例中，患者被特徵化為具有：

(i)AIP及/或TRRAP表達(例如，如藉癌細胞中之平均表達程度判定，諸如於第5圖顯示)，

(ii)相對於參考(例如，健康細胞，測定自得自健康樣本族群的平均表達程度之值，如藉癌細胞中之平均表達程度判定，諸如於第5圖顯示)，PDE3A或PDE3B的表達為增加，及

(iii)相對於參考(例如，健康細胞，測定自得自健康樣本族群的平均表達程度之值，測定自癌細胞中之平均表達程度之值，例如從於第5圖測量的細胞測定)，SLFN12的表達為增加；

係經鑑定為對複合物形成及PDE3調節劑處理具反應性。舉例言之，該等患者被特徵化為具有：

(i)AIP及TRRAP表達(例如，如藉癌細胞中之平均表達程度判定，諸如於第5圖顯示)，

(ii)相對於參考(例如，健康細胞，測定自得自健康樣本族群的平均表達程度之值，測定自癌細胞中之平均表達程度之值，諸如於第5圖顯示)，PDE3A或PDE3B的表達為增加，及

可經鑑定為對複合物形成及PDE3調節劑處理具反應性。於某些實務操作中，患者被特徵化為具有：

(ii)相對於參考(例如，健康細胞，測定自得自健康樣本族群的平均表達程度之值，測定自癌細胞中之平均表達程度之值，諸如於第5圖顯示)，PDE3A的表達為增加，及

係經鑑定為對複合物形成及PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)處理具有反應性。該等患者被特徵化為具有：

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加；

可經鑑定為對複合物形成及PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)處理具有反應性。於各種實務操作中，患者被特徵化為具有：

(i)AIP及/或TRRAP表達，

(ii)相對於參考，PDE3B的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加；

係經鑑定為對複合物形成及PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)處理具有反應性。於若干具體例中，患者被特徵化為具有：

(ii)相對於參考(例如，測定自得自健康樣本族群的平均表達程度之值，如藉癌細胞中之平均表達程度判定，諸如於第5圖顯示)，PDE3B的表達為增加，及

(iii)相對於參考(例如，測定自得自健康樣本族群的平均表達程度之值，如藉癌細胞中之平均表達程度判定，諸如於第5圖顯示)，SLFN12的表達為增加；

係經鑑定為對複合物形成及PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)處理具有反應性。

於某些具體例中，用於前述處理方法之選擇，參考為全部細胞株中之平均表達程度，其數據係顯示於第5圖。

於某些具體例中，本揭示提供一種鑑定患有對使用PDE3調節劑處理具反應性的癌症之對象，該PDE3調節劑特別為WO2019/025562(該案全文揭示爰引於此並併入本發明之揭示)之化合物，及特別係有關於式(I)化合物，諸如第49頁第35行至第75頁第11行之化合物。於各種實務操作中，PDE3調節劑可選自於(6S)-5-[4’-氟-2-(三氟甲基)聯苯-4-基]-6-甲基-3,6-二氫-2H-1,3,4-

二嗪-2-酮或其鹽，

該方法包含測定於樣本中：

(a)AIP及TRRAP表達，

(b)相對於參考(例如，存在於對於健康/對照細胞的程度，或癌細胞株之平均表達程度，諸如於第5圖例示)，PDE3A或PDE3B的表達為增加，及

(c)相對於參考(例如，存在於對於健康/對照細胞的程度，或癌細胞株之平均表達程度，諸如於第5圖例示)，SLFN12的表達為增加；

藉此鑑定該對象為患有對於使用PDE3調節劑處理具反應性的癌症。

於某些具體例中，以上方法可使用來鑑定對象為患有對包含本文所述PDE3調節劑的處理較不可能具反應性的癌症，該方法包含：

-a)測定於得自該對象的樣本中之AIP及/或TRRAP表達、PDE3A或 PDE3B表達、及SLFN12表達，及

-b)當AIP及/或TRRAP為不存在時，鑑定該對象為對包含PDE3調節劑的處理較不可能具反應性。

本揭示也係有關於AIP的用途，其係用於活體外將癌症患者或得自傾向於對本文所述PDE3調節劑的處理有反應的癌症患者的樣本加以分層。

諸如抗體，其係與AIP結合或交互作用而用於活體外將癌症患者或得自傾向於對本文所述PDE3調節劑處理有反應的癌症患者的樣本加以分層的捕獲試劑之用途係預期涵蓋於本揭示之範圍內。

與TRRAP結合或交互作用而用於活體外將癌症患者或得自傾向於對本文所述PDE3調節劑處理有反應的癌症患者的樣本加以分層的捕獲試劑之用途也係預期涵蓋於本揭示之範圍內。

與SLFN12結合或交互作用而用於活體外將癌症患者或得自傾向於對本文所述PDE3調節劑處理有反應的癌症患者的樣本加以分層的捕獲試劑之用途也係預期涵蓋於本揭示之範圍內。

用於藉由AIP、TRRAP的表達及PDE3A或PDE3B及SLFN12的表達增加，予以特徵化的對象的癌症處理之本文所述的PDE3調節劑處理的用途，也係預期涵蓋於本揭示之範圍內。

鑑定為對複合物形成具反應性(例如，為藉PDE3調節而化學誘導)的細胞可以是與過度增生性疾病、病症、或病況相關的過度增生細胞。此種鑑定可被使用在各種過度增生性疾病、病症、或病況(諸如骨髓增生性病症或癌症)的治療及/或預防。於特定具體例中，細胞可以是癌細胞。於若干實務操作中，該細胞可以是選自下列癌症的癌細胞：膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、膠質母細胞瘤、腎癌、白血病(例如，急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、肝癌(例如，肝細胞癌、肝內膽管癌、血管肉瘤、血管瘤、肝母細胞瘤)、肺癌(例如，非小細胞肺癌、小細胞肺癌、間皮瘤)、黑色素瘤、卵巢癌、胰癌、***癌、多發性骨髓瘤、肉瘤(例如，骨肉瘤、軟組織肉瘤)、甲狀腺癌、泌尿道癌、子宮癌。於某些實務操作中，該細胞可以是造血性癌細胞，諸如急性淋巴母細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性單核細胞性白血病、何杰金氏淋巴瘤、或非何杰金氏淋巴瘤細胞。被視為落入於本揭示之範圍內的其它過度增生性疾病、病症、或病況包括骨髓增生性疾病，諸如原發性血小板增生症。

套組

本揭示提供用來特徵化對象對複合物形成具反應性及PDE3調節劑處理的反應性之套組。

於某些具體例中，套組可包括含有有效量的PDE3調節劑(例如，PDE3A調節劑、PDE3B調節劑)之呈單位劑型之治療性組成物。

於某些實務操作中，本揭示之診斷套組提供用於測量AIP、TRRAP、PDE3A、PDE3B、SLFN12、及其組合之表達的一個或多個試劑。此等試劑包括一個或多個捕獲分子(例如，辨識選自於AIP、TRRAP、PDE3A、PDE3B、或SLFN12之多肽的抗體)。於若干具體例中，套組包含測量AIP之表達的試劑、測量PDE3A之表達的試劑、及測量SLFN12之表達的試劑。於若干具體例中，套組包含測量AIP之表達的試劑、測量PDE3B之表達的試劑、及測量SLFN12之表達的試劑。於若干具體例中，套組包含測量TRRAP之表達的試劑、測量PDE3A之表達的試劑、及測量SLFN12之表達的試劑。於若干具體例中，套組包含測量TRRAP之表達的試劑、測量PDE3B之表達的試劑、及測量SLFN12之表達的試劑。於若干具體例中，套組包含測量AIP之表達的試劑、測量TRRAP之表達的試劑、測量PDE3A之表達的試劑、及測量SLFN12之表達的試劑。於若干具體例中，套組包含測量AIP之表達的試劑、測量TRRAP之表達的試劑、測量PDE3B之表達的試劑、及測量SLFN12之表達的試劑。於若干具體例中，套組包含測量AIP之表達的試劑、測量TRRAP之表達的試劑、測量PDE3A之表達的試劑、測量PDE3B之表達的試劑、及測量SLFN12之表達的試劑。

於若干具體例中，套組包含本文所述PDE3調節劑，連同用於測量AIP、TRRAP、PDE3A或PDE3B、及SLFN12之表達的試劑。

套組可包含含有治療性組成物或診斷性組成物的無菌容器--此等容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、囊、泡罩包裝、或業界已知之其它合宜容器。於某些實務操作中，容器可由塑膠、玻璃、多層紙、金屬箔、或適合用於盛裝藥物的其它材料製成。若屬期望，套組進一步包括測量生物標記(例如，PDE3A、PDE3B、SLFN12、TRRA、AIP)表達的指示，及/或將PDE3調節劑投予患有惡性病(例如，經選擇為對PDE3A調節劑處理具反應性的惡性病)對象的指示。於特定具體例中，該等指示包括下列中之至少一者：治療劑說明；惡性病或其症狀之治療或預防的用藥方案及投藥；注意事項；警語；適應症；禁忌症；用藥過量資訊；副作用；動物藥理學；臨床研究；及/或參考文獻。指示可直接印在容器(當存在有容器時)上，或作為貼到容器上的標籤，或作為於容器內或連同容器一起供應的分開單張、小冊子、卡片、或摺疊印刷品。

除非另行指示，否則本揭示之實務上採用分子生物學習知技術(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、及免疫學等熟諳技藝人士眾所周知的習知技術。此等技術可應用至本揭示的多核苷酸及多肽之生產，及因而可視為製作與實施本揭示。針對特定具體例特別有用的技術將討論於下列章節中。

提出下列實施例，以對熟諳技藝人士提供以如何製作與運用本揭示之分析試驗、篩檢、及療法的完整揭示與描述，而非意圖限制發明人所視之其揭示範圍。

實施例

下列實施例例示說明本詳細說明部分的特定態樣。該等實施例不應被解譯為限制性，原因在於該等實施例提供該等具體例的特定瞭解與實務及其各個面向。

實施例1：對PDE3A調節之敏感度的剖繪

為了測量回應於6-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫嗒嗪-3(2H)-酮(DNMDP)處理之癌細胞死亡，細胞係以每孔為下列細胞密度而接種在384w分析試驗孔板中：500個細胞之HeLa(DMEM)、A2058(DMEM)、HMCB(EMEM)、IGR37(DMEM)、NCIH1734(RPMI)；750個細胞之CAL51(DMEM)、COIO741(RPMI)、DKMG(RPMI)、GB1 (EMEM)、HEL(RPMI)、HEL9217(RPMI)、JHUEM1(DMEM+F12)、L3.3(RPMI)及TE4(RPMI)、HCC15(RPMI)、UACC257(RPMI)；1000個細胞之HUT78(IMEM)、NCIH1563(RPMI)、NCIH2122(RPMI)、NCIH2172(RPMI)、RVH421(RPMI)及SKMEL3(McCoy’s 5A)；1500個細胞之C32(EMEM)、HS578T(DMEM)及JHOM1(DMEM+F12)。細胞於37℃培育隔夜，及然後使用HP D300數位分配器以DNMDP劑量稀釋系列處理。於72小時後，各個孔內的細胞存活係藉Cell Titer Glo(Promega G755B及G756B)測量。存活百分比值係使用得自未處理組的值測定，AUC值係藉4-參數擬合而計算求出。DNMDP係購自Life Chemicals(F1638-0042)，及曲喹辛(trequinsin)係購自Sigma-Aldrich(T2057)。

每孔1400個細胞係播種於96孔板，於已使用500xg離心5分鐘以去除顆粒的培養基內。次日，紅螢光DNA染色染料Incucyte Nuclite Rapid Red，及綠螢光細胞凋亡染料Incucyte Caspase-3/7 Green Apoptosis Reagent(Essen Biosciences)以2微升FBS分別地添加至1：1000及1：1500終濃度。兩小時後，添加[2μM DNMDP+0.2% DMSO]或0.2% DMSO。因為甚至敏感細胞偶爾也在24小時以前***，故始於24小時追蹤細胞，但在24小時前凋亡的細胞也算在內。至於藥品廓清研究，培養基於72小時時自經DNMDP處理的細胞移出，細胞經以培養基清洗，及於無DNMDP之存在下繼續培育。細胞之追蹤始於72小時。利用Incucyte S3機器(Essen Biosciences)，每1小時拍攝影像直到96小時，及其後每2小時拍攝影像。紀錄三個頻道：相位對比、紅螢光(DNA)、及綠螢光(細胞凋亡)。用於細胞追蹤，分析疊置全部三個頻道的影片。為了避免因培養基成分歷時耗盡所致之效應，在DMSO對照細胞開始顯現***減慢或細胞凋亡增加之前，細胞被追蹤到最後一個小時(136h針對HeLa，194h針對SKMEL3，160h針對GB1，130h針對TE4，130h針對A2058，144h針對DKMG，106h針對HS578T，186h針對H2172，220h針對C32)。

測試黑色素瘤細胞株對DNMDP的敏感度，及鑑定此等細胞的生物標記。生物標記表達閾值係針對陽性預測值與敏感度加以優化。受試的49個黑色素瘤細胞株中，7個PDE3A及SLFN12表達程度升高，及一個相關蛋白質PDE3B表達程度升高。第1圖比較跨越數以百計的癌細胞株，對PDE3A與SLFN12的每千個鹼基轉錄物每百萬映射讀取(RKPM)的讀值，及鑑定生物標記陽性細胞株。表1闡明在第1圖中之生物標記陽性細胞株中，針對7個黑色素瘤細胞株的生物標記表達及DNMDP反應。第八敏感黑色素瘤細胞株RVH421的相關蛋白質PDE3B表達程度升高。於表1中，生物標記mRNA濃度表達為log₂(RPKM+1)，及曲線下方面積(AUC)係基於0至4的標度計算。敏感度數據的先前分析界定SLFN12/PDE3A組合生物標記之陽性預測值(PPV)為約50%，但優化的生物標記閾值導致62%之PPV，具有小於2.8的AUC界定為敏感，等於0至4的標度上的1.6之AUC。

此等8個黑色素瘤細胞株全部皆對DNMDP敏感，但一者除外。第2A圖闡明對投予DNMDP的此等8個細胞株，Cell Titer-Glo分析試驗測量的劑量反應，而第2B及2C圖闡明得自多個疾病適應症，全部受試PDE3A/SLFN12生物標記陽性細胞株的反應(RVH421為PDE3B/SLFN12生物標記陽性)。如可見於第2A圖，C32及RVH421只有部分敏感，及UACC257細胞為完全不敏感。進一步實驗已將UACC257不敏感度連結到其缺乏AIP表達(參照，例如，實施例3)。此外，可知敏感度並非為二元；反而劑量反應曲線顯示連續的抑制梯度。基於最大存活率值，受試細胞株可被分成強力敏感細胞株(13個細胞株具有<25%最大存活，第 2B圖)，部分敏感細胞株(7個細胞株具有25-75%最大存活，第2C圖)，及不敏感細胞株(2個細胞株具有100%最大存活，第2C圖)。

實施例2：CRISPR基因剔除

PDE3A CRISPR KO細胞(sgRNA#2)係根據de Waal et al,2016(2)(該案全文揭示爰引於此並併入本發明之揭示)產生。針對PDE3B及AIP的CRISPR標靶位點係使用CHOPCHOP CRISPR Design Tool(chopchop.cbu.uib.no)鑑定。為了sgRNA的選殖，前置寡核苷酸與反置寡核苷酸經煉合、磷酸化、及接合至經BsmBI消化的lentiCRISPRv2載體。載有各個導引構築體的慢病毒(lentivirus)係如前述包裝，及使用來感染標靶細胞。已經轉導的標靶細胞使用1μg/ml普羅黴素(puromycin)選擇，及於使用前，繼代培養7日。

第3A圖闡明於已有SLFN12的CRISPR基因剔除之細胞，於DNMDP存在下的存活。第3B圖闡明於已有PDE3A(有與無PDE3B之異位表達)的CRISPR基因剔除之細胞，於DNMDP存在下的存活。如所見，SLFN12基因剔除消除了對PDE3調節劑之全部測量得的敏感度。此外，PDE3B可支援於無PDE3A表達存在下的DNMDP敏感度，及PDE3B之異位表達又復可支援PDE3A基因剔除HeLa細胞中之DNMDP敏感度。第3A圖及第3B圖中之存活係使用72h Cell Titer-Glo分析試驗測量，及CRISPR係使用sg4，SLNF12 CRISPR指南RNA #4進行。

於全基因體關聯CRISPR篩檢中，基因被鑑定為用於HeLa細胞中殺死癌細胞為重要的。Brunello CRISPR庫被使用於DNMDP抗性篩檢。慢病毒感染係重複進行，針對各個重複物，使用足量HeLa細胞以達成每個庫成員>1000感染細胞(80000sgRNAs，>8×10⁷細胞總數)，及於低複合感染(MOI)，以達成每個細胞單一sgRNA的轉導。兩個重複物的感染效率分別為24%及31%，對應於約0.3之MOI，表示約85%感染細胞經預測為具有單一sgRNA整合。於感染時，HeLa細胞再懸浮於培養基內，及與Brunello庫病毒於8μg/ml聚凝胺(polybrene)之存在下混合(庫慢病毒係由在Broad Institute的基因微擾平台(Genetic Perturbation Platform)提供)，以每孔3x10⁶細胞接種於12孔培養皿，及於30℃於931xg離心2小時。離心感染後2小時，含病毒之培養基經移出，及添加新鮮培養基用於培育隔夜。感染後當天，細胞經胰蛋白酶處理，及以50%融合滙集入T225燒瓶(每個燒瓶1.6x10⁷細胞)，及普羅黴素被添加至1μg/ml以選擇感染細胞。同時，在線(in-line)感染效率分析試驗係藉比較普羅黴素選擇後的細胞計數與無選擇的細胞計數進行。普羅黴素選擇的四日之後，感染細胞經收集，以25%(每個燒瓶8x10⁶細胞)融合於T225燒瓶內繼代培養，又經三日，以使得CRISPR KO完成。細胞係在感染後8日收集，8x10⁷細胞各自劃分入DMSO對照臂(每個T225燒瓶接種8x10⁶細胞)、或25nM DNMDP處理臂(每個T225燒瓶接種2x10⁷細胞)。歷經其次14日，每3日至4日細胞以25%融合繼代培養。針對DMSO臂，每個繼代培養維持8x10⁷細胞，而全部存活細胞係用於DNMDP臂繼代培養。經化合物處理14日後，收獲細胞，以冷PBS洗滌，及以2x10⁷細胞(DMSO臂)或以下部分急速冷凍用於基因體DNA分離。基因體DNA係使用Nucleospin Blood XL套組(DMSO樣本，4製備以涵蓋8×10⁷細胞，Machere-Nagel 740950.50)或QIAamp DNA Blood迷你套組(經DNMDP處理樣本，Qiagen 51104)分離。 sgRNA標籤的PCR擴增及滙集庫定序係如Sanson等人「用於以多模態的CRISPR-Cas9基因篩檢之優化庫」(Sanson,et al.“Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities”)Nat Commun 9(1)：5416(“Sanson”)(該案全文揭示爰引於此並併入本發明之揭示)中之描述進行。

CRISPR篩檢資料分析大半係如Sanson中之描述進行。簡言之，定序讀取的反摺積，針對各個sgRNA在各個重複物處理條件下的讀取計數。針對每個條件各個指南的log2標準化讀取係使用公式log2(指南/總數*1000000+1)計算，及跨二重複物求取平均。25nM DNMDP之值減DMSO值，產生針對各個sgRNA的對數-倍數-變化，然後跨靶定於相同基因的全部sgRNA求取平均，以產生基因層面平均-對數-倍數-變化分數。為了統計上評估DNMDP處理相對於DMSO的基因層面富集度，基於平均-對數-倍數-變化將sgRNA排序，且針對各個sgRNA相對於排序的p值，係藉運用無置換的超幾何分布加以測定，相當於單邊費雪確切試驗。針對靶定於相同基因的各個sgRNA，負log10p值之平均經計算以產生各個基因的平均負log10p值。使用針對全部基因(每個基因有3至8個sgRNA)的平均log2-倍數-變化及平均負log10p值，產生火山圖，以將25nM DNMDP處理的陽性選擇後之基因富集度加以視覺化。

於25nM DNMDP之存在下，AIP、SLFNI2、及PDE3A基因剔除，造成細胞存活的最大增加。第4圖闡明，比較篩檢的-log(p值)(各自係與HeLa細胞作比較)，比較基因CRISPR指南表示型態的對數倍數變化(LFC)之CRISPR篩檢結果。於DNMDP之存在下，gRNA最佳支援存活對AIP具有特異性。如所預期，SLFN12及PDE3A基因剔除也強力支援於DNMDP之存在下的細胞存活，在AIP之後，分別地排序第二及第三。組織腖乙醯轉移酶複合物蛋白，轉形/轉錄域相關蛋白(TRRAP)之基因剔除也呈現為顯著，但為遠較弱的表現型。

CRISPR篩檢允許鑑定芳基烴受體交互作用蛋白為對細胞存活率具有強力效應。AIP為輔伴侶蛋白，其調節芳基烴受體及其它蛋白質的穩定性及亞細胞定位，如描述於Trivellin,G.and M.Korbonits,J Endocrinol 210(2011)：137-55(該案全文揭示爰引於此並併入本發明之揭示)。受試的癌細胞株中，只有單一癌細胞株UACC257為生物標記陽性，但DNMDP抗性黑色素瘤細胞株缺乏AIP表達。此點可見於第5圖，於其中x軸係藉log2套數作圖，及y軸係藉基因表達作圖。如可見，UACC257不表達AIP，但其餘細胞株表達AIP。

又復，AIP基因剔除消弭HeLa細胞對DNMDP的反應，係使用獨立gRNA加以驗證，如亦於第6A圖。當自黑色素瘤細胞株A2058的AIP基因剔除時，也觀察得相似結果(第6B圖)。此外，此等細胞株中之AIP基因剔除，導致PDE3A蛋白質表達的減少(第6C圖)。

實施例3：AIP基因剔除及複合物形成

因PDE3A蛋白質表達的減少可能影響DNMDP誘導PDE3A-SLFN12複合物形成，故也測量AIP基因剔除對此複合物形成的影響。因針對SLFN12蛋白並無良好抗體，故在親代或AIP基因剔除HeLa細胞中，發明人異位表達V5加標籤的SLFN12；免疫沈澱內生性PDE3A；及評比是否能在免疫沈澱中檢測得V5-SLFN12。細胞被接種於10公分培養皿，及於50-90%融合收集。用於在生物標記陽性細胞中及在AIP KO細胞中的PDE3A免疫墨點，細胞係以如同存活分析試驗中之相似密度，播種於15公分板，具有5000之容器比例因數，例如，每孔500細胞被按比例放大成每10公分板10⁶細胞，或每15公分板2.5x10⁶細胞，及然後在收集前培養72小時。於改質RIPA緩衝液(150mM NaCl，10%甘油，50mM Tris-Cl pH 8.0，50mM MgCl₂，1% NP-40)補充不含EDTA的蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich 4693159001)及PhosSTOP磷酸酶抑制劑(Sigma-Aldrich 4906837001)中，細胞丸粒於4℃溶解20分鐘。溶解物係於4℃於13,000rpm×10min離心澄清，及使用BCA蛋白質分析試驗(Thermo Fisher Scientific 23225)定量。已澄清的溶解物在4-12% Bis-Tris PAGE凝膠再度溶解，移至硝基纖維素膜(Thermo Fisher Scientific IB23001)，及使用對抗PDE3A(Bethyl 302-740A，1：2000)、V5(Life Technologies R96205於1：5,000)、AIP(Thermo Fisher Scientific MA3-16515於1：2000)、Vinculin(Sigma-Aldrich V9264於1：5,000)、GAPDH(Cell Signaling Technology 2118於1：2000)的初級抗體及得自LiCOR Biosciences(92632210及926068021，各自係於1：10,000)的二級抗體作免疫墨點。墨點經洗滌及使用LiCOR Odyssey紅外線成像儀成像，及螢光信號係藉LiCOR製造商供應的Image Studio軟體定量。

基因體DNA係使用QIAamp DNA迷你套組(Qiagen 51304)而自細胞分離，及SLFN12基因體區係使用Q5高保真2X母混合物(Q5 High-Fidelity 2X Master Mix)(New England Biolabs M0492)及引子SLFN12_2_F或SLFN12_428_F及SLFN12_858_R，藉PCR擴增。PCR 產物係使用QIAquick PCR純化套組(QIAquick PCR Purification Kit)(Qiagen 28104)純化，及送去使用針對用於PCR的前置或反置引子定序。定序讀取係使用Benchling排齊工具與參考序列排齊。

AIP基因剔除完全消除回應於DNMDP的PDE3A-SLFN12複合物形成(第7圖)，確證了DNMDP誘導複合物形成上游的AIP功能。第6C圖顯示PDE3A蛋白質濃度的部分減低，無法完全解釋AIP基因剔除對PDE3A-SLFN12複合物形成的效應。舉例言之，A549細胞，其當SLFN12之異位表達時，表達了足量內生性PDE3A以支援對複合物誘導活性化合物的部分敏感度，其表達比AIP基因剔除細胞相似的程度或甚至更少的PDE3A。

因未悖離本揭示之範圍及精髓在前述主旨中可做出各種變化，故預期涵蓋於前文實施方式中之，或界定於隨附之申請專利範圍中之全部主旨，被解譯為描述與闡明本揭示。鑑於前文教示，本揭示之許多修改及變化為可能。據此，本詳細說明部分意圖涵蓋落入於隨附之申請專利範圍的範疇以內的全部此等替代、修改及變化。

<110> 美商博得學院股份有限公司

<120> PDE3調節劑反應性癌症之鑑定

<130> 167741.019404/TW

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<150> 62/901,090

<151> 2019-09-16

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<151> 2018-11-01

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims

一種鑑定患有對PDE3A-SLFN12複合物形成或PDE3B-SLFN12複合物形成具有反應性的過度增生性疾病、病症、或病況的對象之方法，其包含從該對象獲得該過度增生性疾病、病症、或病況的一個或多個細胞及檢測：

(i)芳基烴受體交互作用蛋白(AIP)多肽或多核苷酸及/或轉形/轉錄域相關蛋白(TRRAP)多肽或多核苷酸在該細胞的表達，

(ii)相對於參考，磷酸二酯酶3A(PDE3A)多肽或多核苷酸及/或磷酸二酯酶3B(PDE3B)多肽或多核苷酸在該細胞的表達，及

(iii)相對於參考，許拉芬家族成員12(SLFN12)多肽或多核苷酸在該細胞的表達；

其中該過度增生性疾病、病症、或病況係被特徵化為對該複合物形成具有反應性若：

(i)AIP及/或TRRAP係在該細胞表達，

(ii)相對於參考，PDE3A及/或PDE3B的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該方法包含檢測：

(ii)相對於參考，PDE3A多肽或多核苷酸在該細胞的表達，及

該疾病、病症、或病況係被選擇為對PDE3A-SLFN12複合物形成具有反應性若：

(i)AIP及/或TRRAP係在該細胞表達，

(ii)相對於參考，PDE3A的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該方法包含檢測：

(ii)PDE3B多肽或多核苷酸的表達，及

該疾病、病症、或病況係被選擇為對PDE3B-SLFN12複合物形成具有反應性若：

(i)AIP及/或TRRAP係在該細胞表達，

(ii)相對於參考，PDE3B的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其包含檢測AIP及TRRAP在該細胞的表達，其中該過度增生性疾病、病症、或病況係被特徵化為對該複合物形成具有反應性若：

(i)AIP及TRRAP係被表達，

(ii)相對於參考，PDE3A及/或PDE3B的表達為增加，及

(iii)相對於參考，SLFN12的表達為增加。
一種殺死經選擇為對PDE3A-SLFN12複合物形成或PDE3B-SLFN12複合物形成具有反應性的細胞或減低其存活之方法，其包含使得該細胞與PDE3調節劑接觸，其中，該細胞係被選擇為對該PDE3調節劑具有反應性當該細胞：

(i)表達AIP及/或TRRAP多肽或多核苷酸，

(ii)相對於參考，具有PDE3A及/或PDE3B多肽或多核苷酸的表達增加，及

(iii)相對於參考，具有SLFN12多肽或多核苷酸的表達增加。
如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該細胞係被選擇為對該PDE3調節劑具有反應性當該細胞：

(i)表達AIP及TRRAP多肽或多核苷酸，

(ii)相對於參考，具有PDE3A及/或PDE3B多肽或多核苷酸的表達增加，及

(iii)相對於參考，具有SLFN12多肽或多核苷酸的表達增加。
如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該細胞係被選擇為對該PDE3調節劑具有反應性當該細胞：

(i)表達AIP及TRRAP多肽或多核苷酸，

(ii)相對於參考，具有PDE3A多肽或多核苷酸的表達增加，及

(iii)相對於參考，具有SLFN12多肽或多核苷酸的表達增加。
如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該細胞係被選擇為對該PDE3調節劑具有反應性當該細胞：

(i)表達AIP及TRRAP多肽或多核苷酸，

(ii)相對於參考，具有PDE3B多肽或多核苷酸的表達增加，及

(iii)相對於參考，具有SLFN12多肽或多核苷酸的表達增加。
一種於對象治療或預防過度增生性疾病、病症、或病況之方法，其包含對該對象投予PDE3調節劑，其中該對象係經以如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之方法鑑定為患有對PDE3調節劑具有反應性的過度增生性疾病、病症、或病況。
如申請專利範圍第5至9項中任一項所述之方法，其中該PDE3調節劑為6-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫嗒嗪- 3(2H)-酮(DNMDP)。
如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之方法，其中該AIP多核苷酸或TRRAP多核苷酸的表達係藉選自於由下列所組成之組群中之方法檢測：定量PCR、北方墨點、微陣列、質譜術、免疫墨點、免疫組織化學、ELISA、及原位雜交。
如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之方法，其中該SLFN12多核苷酸的表達程度的增加係藉選自於由下列所組成之組群中之方法檢測：定量PCR、北方墨點、微陣列、質譜術、免疫墨點、免疫組織化學、ELISA、及原位雜交。
如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之方法，其中該PDE3A及/或PDE3B多核苷酸的表達程度的增加係藉選自於由下列所組成之組群中之方法檢測：定量PCR、北方墨點、微陣列、質譜術、免疫墨點、免疫組織化學、ELISA、及原位雜交。
如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之方法，其中該過度增生性疾病、病症、或病況為骨髓過度增生性疾病。
如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之方法，其中該細胞為癌細胞。
如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該癌細胞為黑色素瘤、子宮內膜癌、肺癌、造血性癌/淋巴性癌、卵巢癌、子宮頸癌、軟組織肉瘤、泌尿道癌、胰癌、甲狀腺癌、腎癌、膠質細胞瘤、膠質母細胞瘤、或乳癌的癌細胞。
如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該癌細胞為黑色素瘤、膠質細胞瘤、膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、急性骨髓性白血病、或肺癌的癌細胞。
如申請專利範圍第5至17項中任一項所述之方法，其中該PDE3調節劑係經口投予。
如申請專利範圍第5至17項中任一項所述之方法，其中該PDE3調節劑係經由靜脈注射投予。
如申請專利範圍第1至19項中任一項所述之方法，其中該癌細胞係收集自組織樣本、血液樣本、或血漿樣本。
一種鑑定患有對PDE3A-SLFN12複合物形成或PDE3B-SLFN12複合物形成具有反應性的癌症的對象之套組，該套組包含結合AIP多肽的第一捕獲試劑及/或結合TRRAP多肽的第二捕獲試劑。
如申請專利範圍第21項所述之套組，其中該套組包含結合PDE3A多肽的第三捕獲試劑及/或結合PDE3B多肽的第四捕獲試劑及結合SLFN12多肽的第五捕獲試劑。
如申請專利範圍第21項所述之套組，其中該套組包含結合PDE3A多肽的第三捕獲試劑或結合PDE3B多肽的第四捕獲試劑及結合SLFN12多肽的第五捕獲試劑。
如申請專利範圍第21項所述之套組，其中該套組進一步包含結合SLFN12多肽的第三捕獲試劑。