TW202020145A - γδＴ細胞的製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種方法，其為從人工多能性幹細胞製造γ δ T細胞之方法，其中前述人工多能性幹細胞係源自α β T細胞以外之細胞。

Description

γ δ T細胞的製造方法

本發明係關於從人工多能性幹細胞製造γ δ T細胞之方法，從人工多能性幹細胞分化之γ δ T細胞及包含該細胞的細胞集團等。

近年，就對癌之治療法而言，免疫細胞治療受到矚目。免疫細胞治療意指將於患者之體外增殖及活性化的免疫細胞對患者投與，使該免疫細胞攻擊癌細胞的治療法。免疫細胞治療具有「與先前之外科治療、放射線治療、化學治療之三大療法相比幾乎無副作用」的優點。免疫細胞治療方面雖有各種治療法，其中，使用擔任自然免疫，對癌細胞具有細胞傷害活性之γ δ T細胞的治療，受到矚目。

γ δ T細胞治療方面，期望在實現該細胞治療中，用於效率良好地製造該細胞，安定供給之製造方法的開發時，已知有只選擇患者之血液中之γ δ T細胞的手法(將血液細胞於含有唑來膦酸及IL-2之培養基中培養的方法(專利文獻1))，然而，在本發明人等所知之範圍，從幹細胞製造γ δ T細胞之手法未被報導。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2006/006720號小冊子

本發明之課題，為提供從幹細胞製造γ δ T細胞之方法。又，本發明之課題，為提供從幹細胞分化之γ δ T細胞及包含該細胞的細胞集團。

本發明人等為解決上述課題而進行專心檢討的結果，發現藉由從α β T細胞以外之細胞誘導人工多能性幹細胞，再將該細胞誘導為T細胞，可效率良好地取得γ δ T細胞。又，藉由此種方式對所得到之γ δ T細胞導入嵌合抗原受體(CAR)基因，製作表現該CAR之γ δ T細胞時，顯示該γ δ T細胞對於導入前之γ δ T細胞難以識別及傷害的癌細胞，亦顯示高細胞傷害性。本發明人等基於此等見識，再度重複研究之結果，於是完成本發明。

亦即，本發明提供以下事項。

[1]一種方法，其為從人工多能性幹細胞製造γ δ T細胞之方法，其中前述人工多能性幹細胞係源自α β T細胞以外之細胞。

[2]如[1]記載之方法，其包含下列步驟：

(1)從α β T細胞以外之細胞建立人工多能性幹細胞的步驟；

(2)使步驟(1)所建立之人工多能性幹細胞分化為T細胞的步驟。

[3]如[1]或[2]記載之方法，其中前述α β T細胞以外之細胞為α β T細胞以外之單核細胞。

[4]如[1]至[3]中任一項記載之方法，其中前述α β T細胞以外之細胞為單核球。

[5]如[2]至[4]中任一項記載之方法，其包含在前述(1)及(2)任一步驟所得到之細胞中，導入可識別並結合腫瘤特異性抗原或腫瘤關連抗原之核酸的步驟，該核酸如下：

(i)編碼α TCR之核酸及編碼βTCR之核酸、

(ii)編碼γ TCR之核酸及編碼δTCR之核酸、及/或

(iii)編碼CAR之核酸。

[6]如[5]記載之方法，其中前述γ TCR為V γ 9TCR，且前述δ TCR為V δ 2TCR。

[7]如[1]至[6]中任一項記載之方法，其包含在前述(1)及(2)之任一步驟中所得到的細胞中，導入編碼包含IL-15及IL-15Rα之融合蛋白質之核酸的步驟。

[8]一種細胞，其為源自人工多能性幹細胞之γ δ T細胞，其中前述人工多能性幹細胞係源自α β T細胞以外之細胞。

[9]一種γ δ T細胞，其係依照[1]至[7]中任一項記載之方法製造者。

[10]如[8]或[9]記載之細胞，其中前述α β T細胞以外之細胞為α β T細胞以外之單核細胞。

[11]如[8]至[10]中任一項記載之細胞，其中前述α β T細胞以外之細胞為單核球。

[12]如[8]至[11]中任一項記載之細胞，其中前述γ δ T細胞係表現V γ 9TCR及V δ 2TCR。

[13]如[8]至[12]中任一項記載之細胞，其中前述γ δ T細胞係表現CAR。

[14]如[8]至[13]中任一項記載之細胞，其中前述γ δ T細胞係表現包含IL-15及IL-15R α之融合蛋白質。

[15]一種細胞集團，其為至少全部細胞之90%以上為γ δ T細胞的細胞集團，其中前述γ δ T細胞為從源自α β T細胞以外之細胞之人工多能性幹細胞所分化的細胞。

[16]一種醫藥，其中包含[8]至[14]中任一項記載之細胞或[15]記載之細胞集團。

[17]如[16]記載之醫藥，其係使用於腫瘤之預防或治療。

[18]一種細胞之殺傷劑，其包含[8]至[14]中任一項記載之細胞或[15]記載之細胞集團。

[19]如[8]至[14]中任一項記載之細胞或[15]記載之細胞集團，其係用於腫瘤之預防或治療。

[20]如[8]至[14]中任一項記載之細胞或[15]記載之細胞集團的使用，其係用於製造腫瘤之預防劑或治療劑。

[21]一種腫瘤之預防或治療方法，其包含投與[8]至[14]中任一項記載之細胞或[15]記載之細胞集團。

若依照本發明，可提供從人工多能性幹細胞製造γ δ T細胞之方法，從人工多能性幹細胞分化的γ δ T細胞及包含該細胞之細胞集團等。再者，在藉由上述方法所製造之γ δ T細胞中，表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞，可於試管中及活體中顯示CAR識別之抗原特異性高的細胞傷害活性。

第1圖展示使用抗體組(V δ 1 Myltenyi FITC、V δ 2 Myltenyi APC、γ δ TCR BD BV510、CD3 BioLegend APC/Cy7及α β TCR eBioscience FITC)，將所取得之細胞染色的結果。塗滿之峰表示非染色群之結果，空白之峰表示使用各抗原特異性抗體的染色結果。

第2圖展示使用抗體組(V δ 1 Myltenyi FITC、V δ 2 Myltenyi APC、γ δ TCR BD BV510、CD3 BioLegend APC/Cy7及α β TCR eBioscience FITC)，將所取得之細胞染色的流式細胞術之結果。

第3圖展示所取得的γ δ T細胞之細胞傷害活性的測定結果。縱軸表示細胞傷害活性(%)，橫軸表示對於標的細胞數之所混合的γ δ T細胞數之比例。

第4圖展示源自iPS細胞之γ δ T細胞(i γ δ T細胞)之細胞增殖的測定結果。縱軸表示細胞增殖率，橫軸表示從開始藉由抗CD3抗體(UCHT1)及抗CD30抗體刺激之日後的經過日數。

第5圖展示將V γ 9V δ 2TCR基因導入iPS細胞並使其分化而得的γ δ T細胞(i γ 9 δ 2T細胞)的細胞膜表面上之CD3及γ δ TCR分子的表現。

第6圖展示將V γ 9V δ 2TCR基因導入源自iPS細胞之造血前驅細胞(HPC)並使其分化而得的γ δ T細胞(iH γ 9 δ 2T細胞)的細胞膜表面上之CD3及γ δ TCR分子的表現。

第7圖展示使抗CD19-CAR基因表現之i γ δ T細胞(iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞)之細胞增殖的測定結果。縱軸表示細胞數，橫軸表示從開始藉由抗CD3抗體(UCHT1)及抗CD30抗體刺激之日後的經過日數。

第8圖展示使抗CD19-CAR基因表現之iH γ 9δ2T細胞(iHCD19CAR/IL-15 γ 9δ2T)之細胞增殖的測定結果。縱軸表示細胞數，橫軸表示從開始藉由抗CD3抗體(UCHT1)刺激之日後的經過日數。

第9圖展示使抗CD19-CAR基因表現之i γ δ T細胞(iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞)之細胞傷害活性的測定結果。縱軸表示標的細胞傷害率(%)，橫軸表示對於標的細胞數之所混合的iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞數之比例。

第10圖展示使抗CD19-CAR基因表現之iH γ 9 δ 2T細胞(iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞)之細胞傷害活性的測定結果。縱軸表示標的細胞傷害率(%)，橫軸表示對於標的細胞數之所混合的iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞數之比例。

第11圖展示藉由活體內投與使抗CD19-CAR基因表現之i γ δ T細胞(iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞)，對於以人類CD19陽性腫瘤致癌之小鼠之生存日數的效果。縱軸表示小鼠之生存率，橫軸表示從移植癌細胞之日後的經過日數。

第12圖展示藉由活體內投與使抗CD19-CAR基因表現之iH γ 9 δ 2T細胞(iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T)，對於表現螢光素酶之人類腫瘤移植小鼠的抗腫瘤效果。

在本說明書中，「基因之表現」可包含從該基因之特定核苷酸序列合成mRNA(亦稱為轉錄或mRNA之表現)及基於該mRNA之資料合成蛋白質(亦稱為轉譯或蛋白質之表現)兩者，然而若無特別聲明，「基因之表現」或僅是「表現」二字，意指蛋白質之表現。

在本說明書中，「陽性」意指蛋白質或mRNA以依照該領域中周知手法以可檢測量表現。蛋白質之檢測，可利用使用抗體之免疫學的檢定，例如，ELISA、免疫染色、流式細胞術而進行。又，在細胞內表現，在細胞表面不表現之蛋白質(例如轉錄因子或其次單元等)的情況，使該蛋白質與報導子蛋白質一起表現，藉由檢測該報導子蛋白質，可檢測為對象之蛋白質。mRNA之檢測，可利用例如，RT-PCR、微陣列、生物晶片及RNAseq等核酸擴增方法及/或核酸檢測方法而進行。

在本說明書中，「陰性」意指蛋白質或mRNA之表現量，藉由如上述之全部或任何周知手法，均未達檢測下限值。蛋白質或mRNA之表現之檢測下限值隨各手法而異。

在本說明書中，為陽性意指「有蛋白質或mRNA之表現」，陰性意指「無蛋白質或mRNA之表現」。因此，「表現之有無」之調整，意指將細胞調成檢測對象之蛋白質或mRNA之表現量為檢測下限值以上(陽性)之狀態及未達檢測下限值(陰性)之狀態的任一種狀態。

在本說明書中，「培養」意指使細胞於試管內環境中維持、增殖(成長)、且/或分化。「進行培養」意指在組織外或體外，例如，細胞培養盤、培養皿或燒瓶中使細胞維持、增殖(成長)、且/或分化。

在本說明書中，「使濃縮」意指使細胞之組成物等之組成物中特定構成成分的比例增加，「已濃縮」意指在用於說明細胞之組成物，例如，在細胞集團所使用的情況，特定構成成分之量，與濃縮前之細胞集團中的此種構成成分之比例相比有增加的細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型而濃縮，因此，標的細胞型之比例，與濃縮前之細胞集團內所存在之標的細胞的 比例相比為增加。細胞集團亦可藉由本技術領域周知之細胞選擇及篩選方法，針對標的細胞型進行濃縮。細胞集團亦可藉由本說明書中記載的特定之培養方法、篩選或選擇製程而濃縮。本發明之特定實施態樣中，藉由將標的細胞集團濃縮之方法，細胞集團對於標的細胞集團至少被濃縮10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。

在本說明書中，「擴大培養」意指目的為使期望之細胞集團增殖，使細胞數增加的培養。細胞數之增加，只要藉由使細胞之增殖造成的增數超過死滅造成的減數而達成者即可，未必需要細胞集團之全部細胞均增殖。細胞數之增加，與擴大培養之開始前相比，可為1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍、3000倍、5000倍、10000倍、100000倍、1000000倍以上。

在本說明書中，「刺激」意指某物質與各種受體等結合，將其下游之信號途徑活化。

在本說明書中，「細胞集團」意指相同種類或相異種類之2種以上細胞。「細胞集團」亦意指相同種類或相異種類之細胞的塊體(mass)。

1.從人工多能性幹細胞製造γ δ T細胞之方法

本發明提供從人工多能性幹細胞製造γ δ T細胞、及包含該γ δ T細胞之細胞集團的方法(以下簡稱為「本發明之製法」)。本發明之製法，包含使人工多能性幹細胞分化為T細胞之步驟。本發明之製法所用的人工多能性幹細胞，可為已建立之庫存的細胞，亦可為從α β T細胞以外之細胞建立的人工多能性幹細胞。因此，在本發明之一實施態樣中，本發明之製法包含(1)從α β T細胞以 外之細胞建立人工多能性幹細胞的步驟，及(2)使步驟(1)所建立之人工多能性幹細胞分化為T細胞的步驟。

在本發明中「T細胞受體(TCR)」意指由TCR鏈(α鏈、β鏈、γ鏈、δ鏈)之二聚體構成。「γ δ T細胞」意指表現CD3，且表現由TCR γ鏈(γ TCR)及TCRδ鏈(δ TCR)所構成之TCR(以下，有稱為「γ δ TCR」之情況)的細胞。「α β T細胞」意指表現CD3，且表現由TCR α鏈(α TCR)及TCR β鏈(β TCR)所構成之TCR(以下，有稱為「α β TCR」之情況)的細胞。幾乎所有α β T細胞均藉由α β TCR識別抗原肽-MHC[主要組織相容性基因複合體，在人類之情況為HLA：人類白血球型抗原]複合體(將其稱為MHC拘束性)。與此相對地，γ δ T細胞藉由γ δ TCR，在與MHC分子無關係下，識別細胞所表現之多樣分子。各TCR鏈由可變區域及恆定區域構成，可變區域中，存在3個互補性決定區域(CDR1、CDR2、CDR3)。TCR基因由基因組上多個之V(可變性)、D(多樣性)、J(接合性)及C(恆定性)之基因片段構成。T細胞之分化、成熟之過程中進行基因再構成，β鏈基因中，隨機選出D及J各1個以結合，繼而，V-DJ間進行基因再構成。其過程中，V-D間及D-J間隨機地發生鹼基之***或刪除，基因之多樣性變高。於TCR之mRNA前驅體中，與VDJ區域之共通區域，即C區域，發生RNA剪接，而以功能性TCR基因之形式表現。

就γ TCR而言，例如，可列舉V γ 1TCR、V γ 2TCR、V γ 3TCR、V γ 4TCR、V γ 5TCR、V γ 6TCR、V γ 7TCR、V γ 8TCR、V γ 9TCR，就δ TCR而言，可列舉V δ 1TCR、V δ 2TCR、V δ 3TCR、V δ 4TCR、V δ 5TCR、V δ 6TCR、V δ 7TCR、V δ 8TCR、V δ 9TCR。又，就具體之γ TCR與δ TCR之組合而言， 無限定，例如，可列舉V γ 3V δ 1TCR、V γ 4V δ 1TCR、V γ 9V δ 1TCR、V γ 9V δ 2TCR。

(1)建立人工多能性幹細胞之步驟

在本發明中「人工多能性幹細胞」(以下有稱為「iPS細胞」之情況)意指藉由在體細胞導入初期化因子而建立，具有多能性，即可分化成存在於活體之多種細胞，且兼具增殖能力的幹細胞，其至少包含本發明中所使用的可被誘導成造血前驅細胞之任何細胞。人工多能性幹細胞，以源自哺乳動物(例如：小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、狗、猴、猩猩、黑猩猩、人類)為較佳，以源自人類為更佳。

人工多能性幹細胞之建立方法，可藉由該領域中周知，對任意之體細胞導入初期化因子而建立。其中，初期化因子，例如，可例示Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-連環蛋白(beta-catenin)、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因產物，此等初期化因子可單獨使用，亦可組合而使用。就初期化因子之組合而言，可例示WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D,et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26：795-797、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,2：525-528、Eminli S,et al.(2008),Stem Cells.26：2467-2474、Huangfu D,et al.(2008),Nat.Biotechnol.26：1269-1275、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3,568-574、Zhao Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3：475-479、Marson A,(2008),Cell Stem Cell,3,132-135、Feng B,et al.(2009),Nat.Cell Biol.11：197-203、R.L.Judson et al.,(2009),Nat.Biotechnol.,27：459-461、Lyssiotis CA,et al.(2009),Proc Natl Acad Sci U S A.106：8912-8917、Kim JB,et al.(2009),Nature.461：649-643、Ichida JK,et al.(2009),Cell Stem Cell.5：491-503、Heng JC,et al.(2010),Cell Stem Cell.6：167-74、Han J,et al.(2010),Nature.463：1096-100、Mali P,et al.(2010),Stem Cells.28：713-720、Maekawa M,et al.(2011),Nature.474：225-9所記載之組合。

體細胞方面，非限定地，可包含胎兒(仔)之體細胞、新生兒(仔)之體細胞、及成熟之體細胞的任一種，又，亦可包含初代培養細胞、繼代細胞、及株化細胞之任一種。再者，前述之細胞可為健康之細胞，亦可為疾患性之細胞。具體而言，體細胞可例示例如(1)神經幹細胞、造血前驅細胞、間葉系幹細胞、齒髓幹細胞等組織幹細胞(體性幹細胞)、(2)組織前驅細胞、(3)血液細胞(例如：末梢血細胞、臍帶血細胞等)、單核細胞(例如：淋巴球(NK細胞、B細胞、α β T細胞以外之T細胞(例如：γ δ T細胞等)、單核球、樹狀細胞等))、顆粒球(例如：嗜酸性球、嗜中性球、嗜鹼性球)、巨核球)、上皮細胞、內皮細胞、肌肉細胞、纖維母細胞(例如：皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃黏膜細胞、腸細胞、脾細胞、胰細胞(例如：胰外分泌細胞等)、腦細胞、肺細胞、腎細胞及脂肪細胞等分化的細胞等。其中，以α β T細胞以外之單核細胞為較佳，更具體而言，以單核球或γ δ T細胞為較佳。

就將初期化因子導入體細胞之方法而言，在初期化因子為DNA之形態的情況，例如，可藉由磷酸鈣共沉澱法、PEG法、電穿孔法、顯微注射法、脂質體轉染法等而進行。例如，可使用細胞工學別冊8新細胞工學實驗規程，263-267(1995)(秀潤社發行)、病毒學(Virology)，52卷，456(1973)、日藥理誌(Folia Pharmacol.Jpn.)，第119卷(第6號)，345-351(2002)等記載之方法。在使用病毒載體之情況，將核酸導入適當之包裝細胞(例如Plat-E細胞)或互補細胞株(例如293細胞)，回收於培養上清中產生之病毒載體，依據各病毒載體藉由適當方法，可使該載體感染細胞而導入細胞中。例如，就載體而言，使用逆轉錄病毒載體的具體手段揭示於國際公開第2007/69666號、Cell,126,663-676(2006)及Cell,131,861-872(2007)等。尤其在使用逆轉錄病毒載體之情況，藉由使用為重組纖維連接蛋白(fibronectin)片段之CH-296(Takara Bio公司製)，可對各種細胞進行高效率的基因導入。

亦可將初期化因子以RNA之形態直接導入細胞中，於細胞內使該初期化因子表現。就RNA之導入方法而言，可使用周知之方法，例如，可適合使用脂質體轉染法或電穿孔法等。又，在初期化因子為蛋白質之形態的情況，例如，可藉由脂質體轉染、與細胞膜透過性肽(例如，源自HIV之TAT及聚精胺酸)之融合、顯微注射等手法等而導入細胞中。

就基礎培養基而言，例如，可列舉杜白可培養基(例如：IMDM)、伊格爾培養基(例如：DMEM、EMEM、BME、MEM、α MEM)、漢姆培養基(例如：F10培養基、F12培養基)、RPMI培養基(例：RPMI-1640培養基、RPMI-1630培養基)、MCDB培養基(例：MCDB104、107、131、151、153培養基)、費瑟爾培養基、199培養基、靈長類ES細胞用培養基(靈長類ES/iPS細胞用培養液， ReproCell公司)、小鼠ES細胞用培養基(TX-WES培養液，Thrombo X公司)、無血清培養基(mTeSR，Stemcell Technology公司)、ReproFF、StemSpan(註冊商標)SFEM、StemSpan(註冊商標)H3000、StemlineII、ESF-B培養基、ESF-C培養基、CSTI-7培養基、Neurobasal培養基(生命技術公司)、StemPro-34培養基、StemFit(註冊商標)(例如：StemFit AK03N、StemFit AK02N)等，然而不以此為限。再者，此等培養基亦可視需要混合等而使用，例如，可列舉DMEM/F12培養基等。

在基礎培養基中，可適宜添加10%至20%之血清(胎牛血清(FBS)、人類血清、馬血清)或血清代替物(KSR等)、胰島素、各種維生素、L-麩醯胺酸、非必需胺基酸等各種胺基酸、2-巰基乙醇、各種細胞激素(介白素類(IL-2、IL-7、IL-15等)、幹細胞因子(SCF(Stem cell factor))、激活素等)、各種荷爾蒙、各種增殖因子(白血病抑制因子(LIF)、鹼性纖維母細胞增殖因子(bFGF)、TGF-β等)、各種細胞外基質、各種細胞接著分子、青黴素/鏈黴素、嘌呤黴素等抗生素、酚紅等pH指示藥等。

培養以例如在1%至10%，較佳2%至5% CO₂之蒙氣下，於例如約37℃至42℃，較佳約37℃至39℃，進行約25至50日為較佳。

在本發明中，成為採取體細胞之來源的哺乳動物無特別限制，較佳為人類。從「不引起排斥反應」之觀點而言，同族細胞、HLA之類型相同或實質上相同的他族細胞、已調整HLA表現之有無及/或表現量的他族細胞等為較佳。就HLA而言，以在類型I及/或類型II所含的至少一部分次單元中，調整表現之有無及/或表現量為較佳。

(2)使人工多能性幹細胞分化為T細胞之步驟

就從人工多能性幹細胞成為T細胞之分化方法而言，只要可將人工多能性幹細胞分化為γ δ T細胞，無特別限制，在本發明之一實施態樣中，使人工多能性幹細胞分化成T細胞之步驟，可包含(2-1)使人工多能性幹細胞分化成造血前驅細胞之步驟，及(2-2)使該造血前驅細胞分化成CD3陽性T細胞之步驟。

(2-1)使人工多能性幹細胞分化成造血前驅細胞之步驟

在本發明中，「造血前驅細胞(Hematopoietic Progenitor Cell(s)(HPC))」意指CD34陽性細胞，較佳為CD34/CD43雙陽性(DP)細胞。在本發明中，造血前驅細胞與造血幹細胞並無區別，若無特別聲明，表示相同之細胞。

就從人工多能性幹細胞分化成造血前驅細胞之方法而言，只要可分化成造血前驅細胞，無特別限制，例如，可列舉如國際公開第2013/075222號、國際公開第2016/076415號及Liu S.et al.,Cytotherapy,17(2015)；344-358等所記載，於誘導培養基中將多能性幹細胞培養成造血前驅細胞之方法。

在本發明中，成為造血前驅細胞之誘導培養基，無特別限制，然而可使用動物細胞之培養所用的培養基作為基礎培養基而調製。在基礎培養基方面，可列舉與上述步驟(1)所用者相同者。培養基方面，可含有血清，或亦可以無血清使用。視需要，在基礎培養基中，例如，亦可包含維生素C類(例如：抗壞血酸)、白蛋白、胰島素、運鐵蛋白、硒化合物(例如：亞硒酸鈉)、脂肪酸、微量元素、2-巰基乙醇、硫代甘油(例如：α-單硫代甘油(MTG))、脂質、胺基酸、L-麩醯胺酸、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(例如：Glutamax(註冊商標))、非必需胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素(例如：青黴素、鏈黴素)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、細胞激素等。

在本發明中維生素C類，意指L-抗壞血酸及其衍生物，L-抗壞血酸衍生物意指在活體內藉由酵素反應形成維生素C者。就本發明所用的抗壞血酸之衍生物而言，可例示磷酸維生素C(例如：抗壞血酸-2-磷酸酯)、抗壞血酸葡萄糖苷、抗壞血酸乙酯、維生素C酯、四己基癸酸抗壞血酸酯、硬脂酸抗壞血酸酯及抗壞血酸-2磷酸-6-棕櫚酸。較佳為磷酸維生素C(例如：抗壞血酸-2-磷酸酯)，例如，可列舉磷酸-L-抗壞血酸鈉或磷酸-L-抗壞血酸鎂等磷酸-L-抗壞血酸鹽。

在使用維生素C類之情況，維生素C類以每4日、每3日、每2日、或每1日，另行添加(補充)為較佳，以每1日添加為更佳。在某實施態樣中，該維生素C類在培養液中，以相當於5ng/ml至500ng/ml之量(例如：相當於5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml之量)添加。在其他實施態樣中，該維生素C類於培養液中，以相當於5μg/ml至500μg/ml之量(例如：相當於5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml之量)添加。

步驟(2-1)中所用之培養基，亦可進一步添加自BMP4(骨形態生成蛋白質4)、VEGF(血管內皮生長因子)、SCF(幹細胞因子)、TPO(血小板生成素)、FLT-3L(Flt3配體)、bFGF(鹼性纖維母細胞生長因子)構成之群組選擇的至少1種細胞激素。更佳為添加BMP4、VEGF及bFGF之培養，進一步更佳為添加BMP4、VEGF、SCF及bFGF之培養。

在使用細胞激素之情況，就培養基中之濃度而言，例如，BMP4可為5ng/ml至500ng/ml，VEGF可為5ng/ml至500ng/ml，SCF可為5ng/ml至100ng/ml，TPO可為1ng/ml至100ng/ml，FLT-3L可為1ng/ml至100ng/ml，bFGF可為5ng/ml至500ng/ml。

又，前述培養基中，亦可添加TGF β阻礙劑。TGF β阻礙劑，意指對TGF β家族之信號傳達干擾的低分子阻礙劑，例如包含SB431542、SB202190(以上，R.K.Lindemann et al.,Mol.Cancer 2：20(2003))、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)等。例如，在TGF β阻礙劑為SB431542之情況，培養基中之濃度以0.5μM至100μM為較佳。

人工多能性幹細胞之培養，可為貼附培養或懸浮培養。在貼附培養之情況，可使用以細胞外基質成分塗覆之培養容器而進行，又，亦可與飼養細胞進行共培養。就飼養細胞而言，無特別限定，例如，可列舉纖維母細胞(小鼠胎仔纖維母細胞(MEF)、小鼠纖維母細胞(STO)等)。飼養細胞以藉由本身周知之方法，例如放射線(γ射線等)照射或抗癌劑(絲裂黴素C等)處理等不活化為較佳。就細胞外基質成分而言，可列舉基質膠(Matrigel)(Niwa A,et al.PLoS One.6(7)：e22261,2011)、明膠、膠原、彈性蛋白等纖維性蛋白質；透明質酸、軟骨素硫酸等葡糖胺聚糖或蛋白多糖；纖維連接蛋白(fibronectin)、玻璃體結合蛋白、層黏連蛋白等細胞接著性蛋白質等。

懸浮培養意指將細胞以對培養容器非貼附之狀態培養，無特別限定，可使用未進行以提高與細胞之貼附性為目的之人工處理(例如，藉由細胞外基質等之塗覆處理)的培養容器，或使用以人工方式進行抑制貼附之處理(例如，藉由聚羥基乙基甲基丙烯酸(poly-HEMA)或非離子性之界面活性多元醇(Pluronic F-127等)之塗覆處理)的培養容器來進行。在懸浮培養之時，以形成胚樣體(EB)進行培養為較佳。

在本發明中，造血前驅細胞亦可從培養多能性幹細胞所得到之網樣構造物(亦稱為ES-sac或iPS-sac)調製。其中、「網樣構造物」意指源自多能性幹細胞之立體囊狀(內部具有空間者)構造體，為由內皮細胞集團等所形成，內部包含造血前驅細胞之構造體。

培養溫度之條件，無特別限制，然而例如為約37℃至42℃，以約37℃至39℃為較佳。又，關於培養期間，若為本技術領域人士，可觀測造血前驅細胞之數目等而適宜決定。只要能得到造血前驅細胞，日數無特別限定，例如，為至少6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上，較佳為14日。培養期間長，在造血前驅細胞之製造上通常無問題，不過以例如35日以下為較佳，以21日以下為更佳。又，亦可於低氧條件培養，在本發明中之低氧條件，可例示15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%或彼等以下之氧濃度。

(2-2)使造血前驅細胞分化成CD3陽性T細胞之步驟

就從造血前驅細胞成為CD3陽性T細胞之分化方法而言，只要能將造血前驅細胞分化成CD3陽性T細胞，無特別限制，例如，可列舉在與如國際公開第2016/076415號或國際公開第2017/221975號等所記載之從造血前驅細胞誘導T細胞之方法同樣之培養條件下，培養造血前驅細胞的方法。

在本發明中，就成為CD3陽性T細胞之分化誘導培養基而言，無特別限制，可調製動物細胞之培養所用的培養基，作為基礎培養基。基礎培養基方面，可列舉與上述步驟(1)所用者相同者。培養基中可含有血清，或者亦可以無血清使用。視需要，在基礎培養基方面，例如，可包含維生素C類(例如：抗壞血酸)、白蛋白、胰島素、運鐵蛋白、硒化合物(例如：亞硒酸鈉)、脂肪酸、微量 元素、2-巰基乙醇、硫代甘油(例如：α-單硫代甘油(MTG))、脂質、胺基酸、L-麩醯胺酸、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(例如：Glutamax(註冊商標))、非必需胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素(例如：青黴素、鏈黴素)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、細胞激素等。

在於步驟(2-2)中使用維生素C類之情況，維生素C類可列舉與步驟(2-1)中所記載者相同者，可以同樣方式添加。在某實施態樣中，培養基中或培養液中的維生素C類之濃度，以5μg/ml至200μg/ml為較佳。在其他實施態樣中，該維生素C類於培養液中，以相當於5μg/ml至500μg/ml之量(例如：相當於5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml之量)添加。

在步驟(2-2)中，以使用p38阻礙劑及/或SDF-1(基質細胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor 1))為較佳。在本發明中「p38阻礙劑」意指阻礙p38蛋白質(p38MAP激酶)之功能的物質，例如，可列舉p38之化學阻礙劑、p38之顯性陰性(dominant negative)突變體或編碼其之核酸等，然而不以此等為限。

就本發明中所用的p38之化學阻礙劑而言，可例示SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基磺醯基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羥基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB239063(反-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]環己醇)及其衍生物、SB220025及其衍生物、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SClO-469、SCIO-323、VX-702、FR167653，然而不以此等為限。此等化合物可為市售，例如關於SB203580、SB202190、SC239063、SB220025及PD169316，可從Calbiochem公司；關於SClO-469及SCIO-323，可從Scios公司等購入。就 P38之化學阻礙劑而言，以SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基磺醯基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物為較佳。

本發明中所用的p38之顯性陰性突變體，可列舉使位於p38之DNA結合區域的180位之蘇胺酸點變異成丙胺酸的p38T180A，使人類及小鼠中之p38之182位的酪胺酸點變異成***酸的p38Y182F等。p38阻礙劑於培養基中含有約1μM至約50μM之範圍。就P38阻礙劑而言，在使用SB203580之情況，可以1μM至50μM、5μM至30μM、10μM至20μM之範圍含於培養基中。

本發明中所用之SDF-1，不僅為SDF-1 α或其成熟型，亦可為SDF-1 β、SDF-1 γ、SDF-1 δ、SDF-1 ε或SDF-1

等同功型或彼等之成熟型，又，亦可為此等之任何比例的混合物等。較佳為使用SDF-1 α。再者，SDF-1有時亦被稱為CXCL-12或PBSF。

在本發明中，SDF-1只要具有其作為趨化因子之活性，在其胺基酸序列中，1或數個胺基酸可經置換、刪除、附加及/或***(亦將此種胺基酸之置換、刪除、附加及/或***之SDF-1稱為「SDF-1變異體」)。又，同樣地，在SDF-1或SDF-1變異體中，糖鏈亦可經置換、刪除及/或附加。就上述SDF-1之變異體而言，例如，可列舉至少保持4個半胱胺酸殘基(在人類SDF-1 α之情況，為Cys30、Cys32、Cys55及Cys71)，且相對於天然體之胺基酸序列，具有90%以上之相同性者等，但不限於此胺基酸變異。SDF-1亦可為哺乳動物，例如，人類或例如猴、羊、牛、馬、豬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠等非人類哺乳動物者。例如，就人類之SDF-1 α而言，可使用以GenBank登錄編號：NP_954637被登 錄的蛋白質，就SDF-1 β而言，可使用以GenBank登錄編號：NP_000600被登錄的蛋白質。

SDF-1可使用市售者，亦可使用從天然精製者，或使用藉由肽合成或基因工學之手法而製造者。SDF-1，例如，以約10ng/ml至約100ng/ml之範圍含於培養基中。又，亦可使用具有SDF-1樣之活性的SDF-1代替物，代替SDF-1。就此種SDF-1代替物而言，可例示CXCR4促效劑，亦可將具有CXCR4促效劑活性之低分子化合物等添加於培養基中，代替SDF-1。

步驟(2-2)所用之培養基，可於培養液中添加自SCF、TPO(血小板生成素)、FLT-3L及IL-7所構成之群組選擇的細胞激素之至少1種，較佳為將其全部添加於培養液中。此等之濃度，例如，SCF為10ng/ml至100ng/ml，TPO為10ng/ml至200ng/ml，IL-7為1ng/ml至100ng/ml，FLT-3L為1ng/ml至100ng/ml。

在步驟(2-2)中，可將造血前驅細胞進行貼附培養或懸浮培養，在貼附培養之情況，可將培養容器塗覆而使用，又，亦可與飼養細胞等進行共培養。就共培養用之飼養細胞而言，可例示骨髓間質細胞株OP9細胞(可從理研BioResource Center取得)。該OP9細胞，較佳為恆常地表現DLL4或DLL1之OP9-DL4細胞或OP9-DL1細胞(例如，Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC.Cold Spring Harb Protoc.2009(2))。在本發明中，在使用OP9細胞作為飼養細胞之情況，可藉由將另行製備之DLL4或DLL1、或者DLL4或DLL1與Fc等之融合蛋白質適宜添加於培養基中而進行。在使用飼養細胞之情況，以將該飼養細胞適宜交換，進行培養為較佳。飼養細胞之交換，可藉由將培養中之對象細胞移至預先播種之飼養細胞上而進行。該交換可每5日、每4日、每3日、或每2日進行。 又，在將胚樣體進行懸浮培養，得到造血前驅細胞之情況，以將其解離為單細胞，進行貼附培養為較佳。雖可與飼養細胞進行共培養，然而較佳為在不使用飼養細胞下進行培養。

在貼附培養之情況，就作為塗覆培養容器之情況中的塗覆劑而言，例如，可列舉Matrigel(Niwa A,et al.PLos One,6(7)：e22261,2011))、膠原、明膠、層黏連蛋白、肝素硫酸蛋白多糖、RetroNectin(註冊商標)、DLL4或DLL1、或者DLL4或DLL1與抗體之Fc區域(以下，稱為Fc)等之融合蛋白質(例如：DLL4/Fc chimera)、巢蛋白、及/或此等之組合，其中以RetroNectin和DLL4與Fc等之融合蛋白質的組合為較佳。

在步驟(2-2)中，培養溫度條件無特別限定，例如，為約37℃至約42℃，以約37℃至約39℃為較佳。又，關於培養期間，若為本技術領域人士，可觀測γδT細胞之數目等，同時適宜決定。只要得到γδT細胞，日數無特別限定，例如，典型而言，為至少10日以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、或20日以上，較佳為21日。又，以90日以下為較佳，以42日以下為更佳。

藉由以上之步驟所得到的CD3陽性T細胞集團，可包含γ δ T細胞，然而步驟(2)可進一步包含以下之步驟(2-3)。

(2-3)使CD3陽性T細胞濃縮之步驟

就使CD3陽性T細胞濃縮之方法而言，只要能將γ δ T細胞濃縮，無特別限制，例如，可列舉以與如國際公開第2016/076415號及國際公開第2017/221975號等所記載之從CD4CD8雙陽性T細胞誘導CD8陽性T細胞之步驟相同的培養條件下，培養CD3陽性T細胞之方法。

在本發明中，就CD3陽性T細胞之濃縮所用的培養基而言，無特別限制，可調製培養動物細胞用的培養基，作為基礎培養基。基礎培養基方面，可列舉與上述步驟(1)所用者相同者。培養基方面，可含有血清，亦能以不含血清使用。基礎培養基中，視需要可包含，例如，維生素C類(例如：抗壞血酸)、白蛋白、胰島素、運鐵蛋白、硒化合物(例如：亞硒酸鈉)、脂肪酸、微量元素、2-巰基乙醇、硫代甘油(例如：α-單硫代甘油(MTG))、脂質、胺基酸、L-麩醯胺酸、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(例如：Glutamax(註冊商標))、非必需胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素(例如：青黴素、鏈黴素)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、細胞激素、荷爾蒙等。在本發明之一態樣中，可含有抗壞血酸等維生素C類、胰島素、運鐵蛋白、硒化合物(例如：亞硒酸鈉)及IL-7等細胞激素。

在步驟(2-3)中使用維生素C類之情況，維生素C類，可列舉與步驟(2-1)中所記載者相同者，可以同樣方式添加。在某實施態樣中，培養基中或培養液中的維生素C類之濃度，以5μg/ml至200μg/ml為較佳。在其他實施態樣中，該維生素C類於培養液中，以相當於5μg/ml至500μg/ml之量(例如：相當於5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml之量)添加。

在步驟(2-3)中使用荷爾蒙之情況，就荷爾蒙而言，可列舉副腎皮質荷爾蒙。副腎皮質荷爾蒙可例示糖質腎上腺皮質激素或其衍生物，醋酸可體松、氫可體松、醋酸氟氫可體松、潑尼松龍(prednisolone)、曲安奈德(triamcinolone)、甲基潑尼松龍、***(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、丙酸倍氯米 松(beclomethasone)。較佳為***。在副腎皮質荷爾蒙為***之情況，其在培養基中的濃度為1nM至100nM。

步驟(2-3)中，可於培養基中包含CD3/TCR複合體促效劑。CD3/TCR複合體促效劑，只要為能藉由與CD3/TCR複合體特異地結合，將信號從CD3/TCR複合體傳達至CD3陽性細胞內的分子，無特別限制。就CD3/TCR複合體促效劑而言，例如，可列舉CD3促效劑及/或TCR促效劑。就CD3促效劑而言，可列舉抗CD3促效劑抗體(亦簡稱為「抗CD3抗體」)或其結合片段，就TCR促效劑而言，可列舉自抗TCR促效劑抗體(亦簡稱為「抗TCR抗體」)或其結合片段、MHC/抗原肽複合體或其多聚體及MHC/超抗原複合體或其多聚體所構成之群組選擇的至少一個。在使用抗CD3抗體之情況，抗CD3抗體同時包含多株抗體及單株抗體，而較佳為單株抗體。又，該抗體雖可為屬於IgG、IgA、IgM、IgD或IgE之任一種免疫球蛋白類型者，然而較佳為IgG。就抗CD3抗體而言，例如可列舉從OKT3純系產生之抗體(OKT3)及從UCHT1純系產生之抗體(UCHT1)等，而以UCHT1為較佳。抗CD3抗體於培養基中的濃度，例如，為10ng/ml至1000ng/ml，較佳為50ng/ml至800ng/ml，更佳為250ng/ml至600ng/ml。上述CD3/TCR複合體促效劑，可使用市售者，亦可使用從天然精製者，或使用藉由肽合成、基因工程手法或化學合成法而製造者。OKT3及UCHT1，例如，可從ThermoFisher公司或GeneTex公司等購入。

在步驟(2-3)中使用細胞激素之情況，就細胞激素而言，可列舉IL-2及IL-7等。在細胞激素為IL-2之情況，其於培養基中之其濃度，為10U/ml至1000U/mL，在為IL-7之情況，其於培養基中之濃度，為1ng/ml至1000ng/mL。

在步驟(2-3)中，培養溫度條件無特別限定，例如，為約37℃至約42℃，以約37℃至約39℃為較佳。又，關於培養期間，若為本技術領域人士，可觀測γ δ T細胞之數目等，並適宜決定。只要得到γ δ T細胞，日數無特別限定，例如，為至少1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上，較佳為6日。又，以28日以下為較佳，以14日以下為更佳。

在藉由以上之步驟所得到的CD3陽性T細胞集團中，包含γ δ T細胞，雖可將其進一步濃縮，但步驟(2)可進一步包含以下之步驟(2-4)。

(2-4)將包含γ δ T細胞之CD3陽性T細胞擴大培養的步驟

就將包含γ δ T細胞之CD3陽性T細胞擴大培養的方法而言，只要能使γ δ T細胞增殖，無特別限制，例如，可列舉：在與如國際公開第2016/076415號及國際公開第2018/135646號等記載的將CD8 α+β+細胞傷害性T細胞擴大培養之步驟同樣之培養條件下，將包含γ δ T細胞之CD3陽性T細胞進行培養的方法。

在本發明中，就將包含γ δ T細胞之CD3陽性T細胞擴大培養所用的培養基而言，無特別限制，然而可製備培養動物細胞用的培養基，作為基礎培養基。就基礎培養基而言，可列舉與上述步驟(2-3)所用者相同者。培養基中可含有血清，亦能以不含血清之形式使用。在基礎培養基中，視需要亦可含有例如維生素C類(例如：抗壞血酸)、白蛋白、胰島素、運鐵蛋白、硒化合物(例如：亞硒酸鈉)、脂肪酸、微量元素、2-巰基乙醇、硫代甘油(例如：α-單硫代甘油(MTG))、脂質、胺基酸、L-麩醯胺酸、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(例如：Glutamax(註冊商標))、非必需胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素(例如：青黴素、鏈黴素)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、細胞激素、荷爾蒙等。 在本發明之一態樣中，亦可含有抗壞血酸等維生素C類、胰島素、運鐵蛋白、硒化合物(例如：亞硒酸鈉)及IL-7等細胞激素。

在步驟(2-4)中使用維生素C類之情況，維生素C類可列舉與步驟(2-1)所記載者相同者，並可以同樣方式添加。在某實施態樣中，培養基中或培養液中的維生素C類之濃度，以5μg/ml至200μg/ml為較佳。在其他實施態樣中，該維生素C類，於培養液中，以相當於5μg/ml至500μg/ml之量(例如：相當於5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml之量)添加。

步驟(2-4)中，於培養基中包含CD3/TCR複合體促效劑。CD3/TCR複合體促效劑，只要為能藉由與CD3/TCR複合體特異地結合，而從CD3/TCR複合體將信號傳達至CD3陽性細胞內之分子，將無特別限制。就CD3/TCR複合體促效劑而言，例如，可列舉CD3促效劑及/或TCR促效劑。就CD3促效劑而言，可列舉抗CD3促效劑抗體(亦簡稱為「抗CD3抗體」)或其結合片段，就TCR促效劑而言，可列舉自抗TCR促效劑抗體(亦簡稱為「抗TCR抗體」)或其結合片段、MHC/抗原肽複合體或其多聚體及MHC/超抗原複合體或其多聚體構成之群組選擇的至少一種。在使用抗CD3抗體之情況，抗CD3抗體同時包含多株抗體及單株抗體，較佳為單株抗體。又，該抗體只要屬於IgG、IgA、IgM、IgD或IgE之任一種免疫球蛋白類型者即可，較佳為IgG。就抗CD3抗體而言，可列舉例如從OKT3純系產生之抗體(OKT3)及從UCHT1純系產生之抗體(UCHT1)等，較佳為UCHT1。抗CD3抗體之培養基中的濃度，例如，為0.3ng/ml至10000ng/mL，較佳為50ng/ml至5000ng/ml，更佳為200ng/ml至4000ng/ml。上述CD3/TCR複合體促效劑，可使用市售者，亦可使用從天然精製者，或使用藉由 肽合成、基因工程手法或化學合成法而製造者。例如，OKT3及UCHT1可從ThermoFisher公司或GeneTex公司等購入。

步驟(2-4)中，以培養基中存在纖維連接蛋白(fibronectin)或其改變體為較佳。該纖維連接蛋白只要為能與CD3陽性細胞結合之分子，無特別限制。纖維連接蛋白之改變體，只要為能與CD3陽性細胞表面之VLA-5及VLA-4結合的分子，將無特別限制，例如，可列舉RetroNectin。纖維連接蛋白或其改變體，不論於培養基中以何種態樣存在皆可。例如，可於培養時含於培養基中，亦可於培養容器中被固相化，然而較佳為在培養容器中被固相化。

在培養基中含有纖維連接蛋白或其改變體之情況，培養基可與含有CD3/TCR複合體促效劑的培養基相同。又，亦可與不論有無血清、添加物等，但含有CD3/TCR複合體促效劑的培養基相同。在培養基中含有纖維連接蛋白或其改變體之情況，纖維連接蛋白或其改變體之濃度，就下限而言，為10ng/ml以上，較佳為100ng/ml以上，就上限而言，為10000μg/ml以下，較佳為1000μg/ml以下。

步驟(2-4)中，以培養基中存在CD30促效劑為較佳。該CD30促效劑只要為能藉由與CD30特異地結合，從CD30將信號傳達至細胞內的分子，將無特別限制。就CD30促效劑而言，例如，可列舉自抗CD30促效劑抗體(亦簡稱為「抗CD30抗體」)或其結合片段及CD30配體或其結合斷片所構成之群組選擇的至少一種。

步驟(2-4)中所用之CD30促效劑，只要與CD3/TCR複合體促效劑同樣地，於培養時能與CD30接觸而存在，不論其存在之態樣。例如，可培養時含於培養基中，亦可於培養容器中被固相化，然而較佳為含於培養基中。

在培養基中含有CD30促效劑之情況、培養基可與含有CD3/TCR複合體促效劑之培養基相同。又，可與不論是否有血清、添加物等，但含有CD3/TCR複合體促效劑之培養基相同。在培養基中含有CD30促效劑之情況，培養基中的CD30促效劑之濃度，本技術領域人士可依據CD30促效劑而適宜決定。例如，CD30促效劑為抗CD30促效劑抗體或其結合片段之情況，培養基中的抗CD30促效劑抗體或其結合片段之濃度，通常為1ng/ml至10000ng/ml，較佳為30ng/ml至300ng/ml。

又，在CD30促效劑於培養容器中被固相化之情況，培養容器可與CD3/TCR複合體促效劑被固相化之培養容器相同。又，將CD30促效劑在培養容器中固相化之方法，亦與CD3/TCR複合體促效劑之固相化方法相同。使CD30促效劑在培養容器中固相化時之CD30促效劑的溶液濃度，就下限而言，為0.1ng/ml以上，較佳為1ng/ml以上，就上限而言，為10000ng/ml以下，較佳為1000ng/ml以下。

在步驟(2-4)中使用細胞激素之情況，就細胞激素而言，可列舉IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21等，此等可只使用1種，或亦可使用複數種(較佳為所有種類)。在細胞激素為IL-2之情況，其於培養基中之濃度可為10U/ml至1000U/ml；在為IL-7之情況，其於培養基中之濃度，可為1ng/ml至1000ng/ml。又，IL-12於培養基中之濃度可為5ng/ml至500ng/ml，IL-15於培養基中之濃度可為1ng/ml至100ng/ml，IL-18於培養基中之濃度可為5ng/ml至500ng/ml，IL-21於培養基中之濃度可為2ng/ml至200ng/ml。

步驟(2-4)中可進一步於培養基中包含為細胞激素之TNF家族細胞激素。就TNF家族細胞激素而言，例如，可列舉TNF-α、TNF-β、淋巴毒素 α、Fas配體、TRAIL、TWEAK、TL1A、RANK配體、OX40配體、APRIL、AITRL、BAFF、4-1BBL及CD40配體等，而以TL1A為較佳。在使用TL1A之情況，其在培養基中之濃度可為5ng/ml至500ng/ml，而以10ng/ml至300ng/ml為較佳，以20ng/ml至200ng/ml為更佳。

又，步驟(2-4)中，可進一步在培養基中包含細胞凋亡阻礙劑。就細胞凋亡阻礙劑而言，可列舉蛋白酶阻礙劑，例如，可列舉胱天蛋白酶(caspase)阻礙劑。就胱天蛋白酶阻礙劑而言，以Pan Caspase FMK inhibitor Z-VAD(N-苄基氧基羰基-Val-Ala-Asp(O-Me)氟甲基酮)(以下，稱為「Z-VAD-FMK」)為較佳，就其於培養基中之濃度而言，可為1μM至1000μM，而以1μM至500μM為較佳，以1μM至200μM為更佳，1μM至50μM為特佳。

在本發明中，所得到之γ δ T細胞可單離而使用，亦可原樣(亦即，作為可含有其他細胞種之細胞集團)而使用。在單離之情況，可使用自γ TCR、δ TCR及CD3構成之群組選擇的至少一種分子作為指標而單離，該單離之方法，可使用本技術領域人士所周知的方法。例如，可列舉使用(視需要可與磁珠等結合)γ TCR、δ TCR及CD3之抗體，藉由流式細胞術，或藉由磁性細胞分離法而單離的方法；使用可將期望之抗原固定化的親和管柱等而精製的方法，然而不以此等為限。

又，在原樣使用之情況，可使用本技術領域人士所周知之方法，增加γ δ T細胞於細胞集團中所佔之比例。就增加細胞集團中γ δ T細胞所佔之比例的方法而言，可列舉Front.Immunol.,5：636(2014)、日本專利特表2017-537625、特表2003-529363等之方法，然而不以此為限。

又，本發明之製法中所用的細胞，具有編碼識別並結合抗原或該抗原-HLA複合體之外因性TCR及/或嵌合抗原受體(CAR)的核酸。因此，在本發明之一實施態樣中，可包含：(1)從α β T細胞以外之細胞建立人工多能性幹細胞之步驟，及(2)對步驟(1)所建立之人工多能性幹細胞分化為T細胞之步驟的任何時候所得到之細胞(例如，多能性幹細胞、造血前驅細胞等)，導入編碼前述TCR(亦即，(i)α TCR及β TCR、(ii)γ TCR及δ TCR)之核酸，及/或編碼(iii)前述CAR之核酸的步驟。其中，(i)編碼α TCR及β TCR之核酸，係導入使人工多能性幹細胞分化為T細胞之步驟的任一步驟中所得到之γ δ T細胞。在本說明書中，編碼TCR之核酸，意指包含編碼形成TCR之單方鏈的鹼基序列，及編碼另一方鏈之鹼基序列的核酸。又，編碼TCR之核酸，亦意指包含編碼形成TCR之單方鏈之鹼基序列的核酸，與包含編碼另一方鏈之鹼基序列之核酸的組合。亦即，在將編碼TCR((i)α TCR及β TCR)之核酸導入細胞的情況，可將包含編碼α TCR之鹼基序列及編碼β TCR之鹼基序列兩者的1個核酸導入，亦可將包含編碼α TCR之鹼基序列及包含編碼β TCR之鹼基序列的核酸個別導入。在個別導入之情況，可將此等核酸同時導人，亦可逐次導入。(ii)γ TCR及δ TCR之情況亦相同。

本發明中所用之TCR，不僅為TCR之α鏈及β鏈構成異二聚體(heterodimer)者(亦即，α β TCR)、或TCR之γ鏈及δ鏈構成異二聚體者(亦即，γ δ TCR)，亦構成均二聚體者。再者，亦可使用欠缺恆定區域之一部分或全部者，或將胺基酸序列重組者。其中，以γ δ TCR為較佳，尤其以V γ 9V δ 2TCR為特佳。

又，上述之TCR鏈之恆定區域，在其來源之細胞傷害性T細胞(CTL)純系之TCR鏈的恆定區域中，可施行設定之改變。就此改變而言，例如，可列舉藉由將CTL純系之TCR之恆定區域的特定胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基，使藉由TCR鏈間之二硫鍵所形成的二聚體表現效率亢進等，然而不以此等為限。

就上述TCR為標的之抗原而言，例如可列舉腫瘤抗原，然而不以其為限。腫瘤抗原可為腫瘤特異性抗原(TSA)，亦可為腫瘤關連抗原(TAA)。就該腫瘤抗原而言，具體言之，可列舉選自MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2等分化抗原；WT1、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15等腫瘤特異性多系列抗原；CEA等胎兒抗原；起因於p53、Ras、HER-2/neu等過剩表現之腫瘤基因或突變之腫瘤抑制基因；BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR等染色體易位的固有腫瘤抗原；及埃潑斯坦‧巴爾病毒抗原EBVA及人類乳突病毒(HPV)抗原E6及E7等病毒抗原所構成之群組的1種以上之抗原。就其他腫瘤抗原而言，可列舉TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-連環蛋白(catenin)、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合蛋白質\親環蛋白C關連蛋白質、TAAL6、TAG72、TLP及TPS，然而不以此等為限。

如下述之實施例所示，在一實施態樣中，藉由本發明之製法所得到之γ δ T細胞中，表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞方面，對表現CAR之標的抗原的細胞，顯示特異之細胞傷害活性及抗腫瘤活性(本說明書中亦簡稱為「細胞傷害活性」)。因此，從抗原特異之細胞傷害活性的觀點，本發明之製法所得到的γ δ T細胞，以表現CAR為較佳。細胞具有細胞傷害活性之確認，可藉由周知之方法評價，就較適合之方法而言，例如可藉由鉻釋放檢定等，測定對於表現CAR之標的抗原之細胞的細胞傷害活性的方法。

在本發明中「嵌合抗原受體(CAR)」意指包含抗原結合結構域、膜貫通結構域、及細胞內信號傳達結構域之融合蛋白質。CAR之抗原結合結構域，包含可使抗體之可變區域之輕鏈(VL)及重鏈(VH)經由連結子(例如：G及S構成之連結子(GS連結子)(例如，GGGS、GGGGS或將此等組合之連結子(例如：序列編號4或5等)等)等間隔物(spacer)以串聯方式結合的短鏈抗體(scFv)。表現CAR之γ δ T細胞，藉由scFV領域識別抗原後，將其識別信號通過細胞內信號傳達結構域，傳達至T細胞內。藉由在γ δ T細胞導入CAR，變得可對目的之抗原賦予特異性。又，由於CAR不依賴於HLA類型I或類型II，可直接識別抗原分子，對於HLA類型I或類型II基因之表現降低的細胞，亦能引起高免疫反應。就以前述CAR為標的之抗原而言，可列舉與以前述TCR為標的之上述抗原相同的抗原。

就CAR之膜貫通結構域而言，例如，可列舉自源自TCR之α鏈、β鏈或ζ鏈、CD28、CD3ε鏈、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB(CD137)及CD154所構成之群組選擇的1種以上蛋白質之膜貫通結構域等，然而不以此等為限。可 使用源自與抗原結合結構域連結之最初細胞內信號傳達結構域的分子之膜貫通結構域，例如，在源自與抗原結合結構域連結之最初細胞內信號傳達結構域的分子為CD28的情況，膜貫通結構域亦可源自CD28。或者，可使用人為設計之膜貫通結構域。

就CAR之細胞內信號傳達結構域而言，例如，可列舉自源自CD3 ζ鏈(TCR ζ鏈)、FcR γ鏈、FcR β鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈、CD3 ε鏈、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d所構成之群組選擇的1種以上蛋白質之細胞內結構域，然而不以此等為限。此等之中，以源自CD3ζ鏈之細胞內信號傳達結構域為較佳。又，細胞內信號傳達結構域中，可進一步包含共刺激分子之細胞內結構域，就該共刺激分子而言，例如，可列舉自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能關連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及CD83所構成之群組選擇的1種以上蛋白質之細胞內結構域。藉由選擇所結合之共刺激分子之種類或數目，可調控CAR之活性強度或持續時間(例如，Mol Ther.2009；17：1453-1464.)。

在CAR之抗原結合結構域與膜貫通結構域之間、或CAR之細胞內信號傳達結構域與膜貫通結構域之間，可組入間隔物，就該間隔物而言，通常可使用300胺基酸以下，較佳為10至100胺基酸，最佳為25至50胺基酸構成之肽。具體而言，可列舉包含源自IgG1之絞鍊區域、免疫球蛋白之CH2CH3區域及CD3之一部分的肽等，然而不以此等為限。

就具體之CAR而言，可列舉將scFV及CD3 ζ鏈經由間隔物結合的第1世代之CAR，為了增強對T細胞之活化能力，在第1世代之CAR之scFV與CD3 ζ鏈之間，組入源自CD28之膜貫通結構域及細胞內結構域的第2 世代之CAR，及在第2世代之CAR之CD28的細胞內結構域與CD3 ζ鏈之間，組入與CD28相異之共刺激分子(4-1BB或OX40)之細胞內結構域的第3世代之CAR，然而不以此等為限。

就本發明所用之CAR而言，更具體言之，可列舉包含下列者的嵌合抗原受體：作為抗原結合結構域的可識別CD19之scFv；作為膜貫通結構域的CD8之膜貫通結構域；作為細胞內信號傳達結構域的源自CD28之細胞內結構域、源自CD30之細胞內結構域、源自4-1BB之細胞內結構域、源自CD3 ζ鏈之細胞內結構域。細胞內信號傳達結構域所含的上述各細胞內結構域之順序無特別限制，例如，可依序包含源自CD28之細胞內結構域、源自CD30之細胞內結構域或源自4-1BB之細胞內結構域、源自CD3 ζ鏈之細胞內結構域。更具體而言，本發明之嵌合抗原受體，例如，係由在藉由序列編號1或2所表示之胺基酸序列、或序列編號1或2所表示之胺基酸中，1或2個以上(較佳為約1至100個，更佳為約1至50個，進一步更佳為約1至10個，特佳為1至數(2、3、4或5)個)胺基酸經置換、刪除、附加及/或***而成的胺基酸序列所構成。

又，就源自CD30之細胞內結構域而言，例如，可列舉在序列編號3所表示之胺基酸中，1或2個以上(較佳為約1至100個，更佳為約1至50個，進一步更佳為約1至10個，特佳為1至數(2、3、4或5)個)胺基酸經置換、刪除、附加及/或***而成的胺基酸序列等。如上述，在胺基酸經置換、刪除、附加及/或***之情況，其置換、刪除、附加及/或***之位置，只要能保持CD30之細胞內結構域之功能，將無特別限定。

上述之TCR及/或CAR(以下有時簡稱為「TCR等」)能特異地識別並結合抗原，可依照周知之方法確認，就較佳方法而言，可列舉例如Dextramer 檢定或ELISPOT檢定等。藉由進行ELISPOT檢定，可確認在細胞表面表現TCR等之T細胞，藉由該TCR等識別標的抗原，並將其信號傳達至細胞內。

再者，本發明人等發現表現上述CAR同時表現包含IL-15及IL-15Rα之融合蛋白質(以下有時簡稱為「IL-15/IL-15R α」)的細胞，與只表現CAR之細胞相比，細胞傷害活性上升。因此，從細胞傷害活性之觀點，藉由本發明之製法所得到之γ δ T細胞，以可表現IL-15/IL-15R α為較佳，以可進一步表現上述CAR為更佳。因此，為得到表現IL-15/IL-15R α之γ δ T細胞，本發明之製法可包含將編碼IL-15/IL-15R α之核酸導入上述1.之步驟(1)及(2)之任一步驟中所得到之細胞(例如，藉由步驟(2-2)所得到之CD3陽性T細胞、藉由步驟(2-3)濃縮之CD3陽性T細胞等)的步驟。

藉由IL-15之信號傳達系統，通常，在抗原提示細胞上表現之IL-15R α與IL-15結合，藉由將IL-15提示在由與CD8陽性CD4陰性細胞上之IL-15R β共通之γ鏈(γc)所構成的IL-15受體(轉呈現(trans-presentation))，可維持CD8陽性CD4陰性細胞的細胞傷害活性。因此，表現IL-15/IL-15R α之CD3陽性細胞，在該細胞為CD8陽性CD4陰性之情況，可經由IL-15受體將IL-15信號傳遞至本身之細胞內。或者，表現IL-15/IL-15R α之CD3陽性細胞，經由IL-15受體，可將IL-15信號傳遞至其他CD8陽性CD4陰性細胞內。如以上之說明，IL-15/IL-15R α由於能維持CD8陽性CD4陰性細胞之細胞傷害活性，可期待對於成為CAR標的之細胞的繼續性的細胞傷害效果。

IL-15/IL-15R α可為膜貫通型蛋白質，亦可為分泌型蛋白質。已知IL-15R α於自成熟型蛋白質之N末端至1-65胺基酸之IL-15結合結構域，為用於與IL-15結合的責任區域(Wei X.et al.,J.Immunol.,167：277-282,2001)。因 此，膜貫通型蛋白質只要為保持IL-15結合結構域，且保持IL-15R α之膜貫通結構域的蛋白質即可。另一方面，就分泌型蛋白質而言，只要為保持IL-15結合結構域，且IL-15R α之膜貫通結構域經缺失的蛋白質(例如，IL-15R α之1-65胺基酸殘基、1-85胺基酸殘基、或1-182胺基酸殘基所構成之蛋白質，或包含與該胺基酸序列85%以上相同之胺基酸序列的肽等)即可。

IL-15/IL-15R α可於IL-15與IL-15R α之間組入間隔物，就該間隔物而言，通常可使用300胺基酸以下，較佳為10至100胺基酸，最佳為20至50胺基酸構成之肽。具體而言，可列舉上述之GS連結子等，然而不以此等為限。

就IL-15/IL-15R α而言，若為融合IL-15及IL-15R α之蛋白質，無特別限制，具體而言，可列舉包含序列編號6之肽。或者，就IL-15/IL-15Rα而言，只要能與IL-15受體結合，將IL-15信號傳達至細胞內，即無限制，例如，可列舉包含與序列編號6所示之胺基酸序列具有約90%以上，較佳為約95%以上，更佳為約97%以上，特佳為約98%以上，最佳為約99%以上之同源性或相同性之胺基酸序列的肽。其中「同源性」或「相同性」意指在該技術領域中，使用周知之數學演算法，在使2個胺基酸序列對準之情況，於最佳對準(alignment)(該演算法，為了達到最佳之對準，以考慮在序列之一者或兩者中導入間隙(gap)為較佳)時，相對於所重疊之全部胺基酸殘基，相同胺基酸及類似胺基酸殘基(在相同性之情況，為相同胺基酸殘基)的比例(%)。「類似胺基酸」意指在物理化學性質上類似之胺基酸，例如，可列舉芳香族胺基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族胺基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性胺基酸(Gln、Asn)、鹼性胺基酸(Lys、Arg、His)、酸性胺基酸(Glu、Asp)、具有羥基之胺基酸(Ser、Thr)、側鏈小之胺基酸(Gly、 Ala、Ser、Thr、Met)等可分類為相同群組的胺基酸。可預測藉由此種類似胺基酸之置換，不至於對蛋白質之表現型造成變化(亦即，為保存性胺基酸置換)。保存性胺基酸置換之具體例，為該技術領域所周知，並記載於各種文獻中(例如，參照Bowie氏等，Science,247：1306-1310(1990))。本說明書中的胺基酸序列之同源性或相同性，可使用同源性計算演算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，依照以下之條件(期待值=10；允許間隙；基質=BLOSUM62；篩選=OFF)而計算。

本說明書中所用之「能結合(capable of binding)」的術語，意指「具有結合之能力(having an ability to bind)」，係指與1個或其以上之其他分子形成非共價鍵複合體的能力。用於決定結合能力之各種方法及檢定，為本技術領域所周知。結合通常為具有高親和性之結合，以KD值測定之親和性，較佳為未達1μM，更佳為未達100nM，進一步更佳為未達10nM，再進一步更佳為未達1nM，再更佳為未達100pM，再進一步更佳為未達10pM，再更佳為未達1pM。所謂「KD」或「KD值」之術語，相當於本技術領域中所周知之平衡解離常數。

上述之TCR等以編碼TCR等之核酸的形式導入細胞中。又，包含IL-15及IL-15Rα之融合蛋白質，亦以編碼該融合蛋白質之核酸的形式導入細胞中。該核酸可為DNA，亦可為RNA，或者亦可為DNA/RNA嵌合體，較佳為DNA。又，該核酸可為雙股，亦可為單股。在雙股之情況，可為雙股DNA、雙股RNA或DNA：RNA之雜交物。在核酸為RNA之情況，關於RNA之序列，將T以U代替。又，該核酸在試管中或細胞中，只要能表現多肽，亦可包含天然核苷酸、修飾核苷酸、核苷酸類似物、或此等之混合物。

上述之核酸可依照本身周知之方法構築。例如，基於周知之TCR或CAR之胺基酸序列或核酸序列，以化學方式合成DNA鏈，或藉由將合成之一部分重疊的寡DNA短鏈，利用PCR法或Gibson Assembly法進行接續，可構築編碼TCR或CAR之全長或一部分的DNA。編碼包含IL-15及IL-15Rα之融合蛋白質的核酸，亦能以同樣方式構築。

上述之核酸，可組入表現載體中。該載體可為組入標的細胞之基因組的載體，亦可為不組入該基因組之載體。在一實施態樣中，不組入基因組之載體，可於標的細胞之基因組的外側複製。載體亦可於標的細胞之基因組之外側，以複數個複製體存在。在本發明之其他實施態樣中，載體係組入標的細胞之基因組中。在較佳之實施態樣中，載體係組入標的細胞之基因組的預定位置。

就上述載體所使用的啟動子而言，例如，可使用EF1 α啟動子、CAG啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV(巨細胞病毒)啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(單純皰疹病毒胸苷激酶)啟動子、TCRV α基因啟動子、TCR V β基因啟動子等。其中，以EF1 α啟動子、CAG啟動子、MoMuLV LTR、CMV啟動子、SRα啟動子等為較佳。

上述之載體，除上述啟動子之外，亦可視需要，包含轉錄及轉譯調節序列、核糖體結合部位、增強子、複製起點、聚A附加信號、選擇標記基因等。就選擇標記基因而言，例如，可列舉二氫葉酸還原酵素基因、新黴素耐性基因、嘌呤黴素耐性基因等。

在本發明之一實施態樣中，可將包含編碼TCR之α鏈的核酸，及編碼β鏈之核酸的表現載體，導入標的細胞內，在標的細胞內或細胞表面構 成TCR之α鏈與β鏈的異二聚體。在此情況中，編碼TCR之α鏈的核酸，及編碼β鏈之核酸，可組入個別之表現載體，亦可組入1個表現載體。在組入1個表現載體之情況，此2種核酸，以經由能進行多順反子(polycistronic)表現之序列組入為較佳。藉由使用能進行多順反子表現之序列，可使在一種表現載體中組入的複數個基因更有效地表現。就可進行多順反子表現之序列而言，例如，可列舉2A序列(例如：源自***病毒(FMDV)之2A序列(F2A)、源自馬鼻炎A病毒(ERAV)之2A序列(E2A)、源自豬鐵士古病毒(Porcine teschovirus)(PTV-1)之2A序列(P2A)、源自明脈扁翅蛾病毒(Thosea asigna virus)(TaV)之2A序列(T2A序列)(PLoS ONE 3,e2532,2008、Stem Cells 25,1707,2007)、內部核糖體進入部位(IRES)(U.S.Patent No.4,937,190)等，然而從表現量均勻之觀點而言，以P2A序列及T2A序列為較佳。在使用包含編碼TCR之γ鏈的核酸，及編碼δ鏈之核酸之表現載體的情況，亦相同。

就上述之表現載體而言，在導入細胞中之情況，只要能於疾病之預防或治療充分期間表現TCR等，無特別限定，而可列舉病毒載體或質體載體等。就病毒載體而言，可列舉逆轉錄病毒載體(包含慢病毒載體或假性載體)、腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體、仙台病毒、游離型載體等。又，亦可使用轉位子表現系統(PiggyBac系統)。就質體載體而言，可列舉動物細胞表現質體(例如，pal-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。

將上述之核酸或載體導入細胞的方法無特別限定，可使用周知之方法。在導入核酸或質體載體之情況，可使用與上述1.(1)之步驟中記載之方法相同的方法。或者，亦可藉由基因組編集(例如，CRISPR系統、TALEN、ZFN等)，將上述之核酸導入細胞之基因組中。

又，上述之核酸亦可藉由RNA之形式直接導入細胞中，於細胞內表現TCR等而使用。就RNA之導入方法而言，可使用周知之方法，例如，可適合使用脂質體轉染法或電穿孔法等。

在上述之(1)及(2)之步驟中，導入上述之核酸的時機，只要於γ δ T細胞中導入之TCR等能表現即可，無特別限制，例如，可於iPS細胞、HPC(CD34⁺/CD43⁺)、ProT細胞(CD4^-/CD8^-)、CD3⁺/CD4⁺/CD8⁺T細胞、CD3⁺/CD4^-/CD8⁺T細胞、或其他細胞(例如：CD3^-/CD4⁺/CD8⁺細胞等)之階段導入。

在將上述之核酸導入細胞中的情況，從導入之TCR的表現上升、錯配TCR之出現的抑制、或非本身反應性之抑制的觀點而言，以藉由siRNA抑制該細胞原本表現之內在性TCR鏈的表現為較佳。在將前述之核酸適用於該方法的情況，為了避免siRNA對TCR之效果，以使編碼該TCR之核酸的鹼基序列，與對應於抑制內在性TCR鏈之表現的siRNA作用之RNA的鹼基序列為相異之序列(密碼子變換型序列)為較佳。此等方法記載於例如國際公開第2008/153029號。前述之鹼基序列，可對編碼從天然取得之TCR的核酸進行靜默變異之導入，或將人為設計之核酸以化學方式合成而製作。或者，為避免與內在性TCR鏈之錯配，可將編碼導入之TCR之核酸的恆定區域之一部分或全部，以源自人類以外之動物，例如小鼠之恆定區域置換。

2. γ δ T細胞或含有該γ δ T細胞之細胞集團

又，本發明提供一種細胞或細胞集團，其為γ δ T細胞、或包含該γ δ T細胞之細胞集團，該γ δ T細胞為從源自α β T細胞以外之細胞之人工多能性幹細胞所分化的細胞。上述細胞集團中所含的γ δ T細胞之比例(該細胞集團所含的γ δ T細胞數/該細胞集團所含的全細胞數)以90%以上(例如：90%以上、95% 以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%)為較佳。此種細胞集團，例如，可藉由本發明之製法而得到。該比例可藉由將表現γ TCR、δ TCR及CD3之細胞之比例，藉由流式細胞術測定而算出。因此，在一實施態樣中，本發明提供藉由本發明之製法所製造的γ δ T細胞及/或包含該γ δ T細胞之細胞集團。前述γ δ T細胞亦可包含上述1.記載之外因性的編碼TCR的核酸、編碼CAR之核酸以及/或編碼包含IL-15及IL-15R α之融合蛋白質的核酸。以下有時將其中述及之γ δ T細胞、或包含該γ δ T細胞之細胞集團，簡稱為「本發明之細胞等」。

3.包含本發明之細胞等的醫藥

本發明提供含有本發明之細胞等作為有效成分的醫藥(以下，有時稱為「本發明之醫藥」)。本發明之細胞等，由於對例如癌細胞、癌幹細胞、腫瘤細胞等顯示細胞傷害活性，包含本發明之細胞等的醫藥，可使用作為癌等腫瘤之預防或治療之用途，例如投與至哺乳動物(例如：小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、羊、猴、人類)，較佳投與至人類。因此，在本發明之一態樣中，提供腫瘤之預防或治療用之本發明之細胞等。又，提供一種腫瘤之預防或治療方法，其包含將本發明之細胞等，較佳為以包含該細胞等之醫藥的形式進行投與。

藉由本發明之醫藥或本發明之細胞等進行預防或治療之癌等之腫瘤，例如，“Daniel Baumhoer et al.,Am J.Clin Pathol,2008,129,899-906”等所記載，腫瘤方面，包含良性之腫瘤、惡性之腫瘤(亦稱為「癌」)、及可診斷或判定之良性或惡性的腫瘤。就腫瘤而言，具體言之，可列舉肝臟癌(例如：肝細胞癌)、卵巢癌(例如：卵巢透明細胞腺癌)、小兒癌、肺癌(例如：扁平上皮癌、肺小細胞癌)、睪丸癌(例如：非精原瘤胚細胞腫瘤)、軟部腫瘤(例如：脂肪肉瘤、 惡性纖維性組織球瘤)、子宮癌(例如：子宮頸部上皮內腫瘤、子宮頸部扁平上皮癌)、黑色素瘤、腎上腺腫瘤(例如：腎上腺之腺瘤)、神經性腫瘤(例如：神經鞘瘤)、胃癌(例如：胃之腺癌)、腎臟癌(例如：格拉維茨腫瘤)、乳癌(例如：浸潤性小葉性癌、黏液性癌)、甲狀腺癌(例如：髓樣癌)、喉頭癌(例如：扁平上皮癌)、膀胱癌(例如：浸潤性移行上皮癌)等，然而不以此等為限。

本發明之醫藥所含的細胞，在投與至對象前，亦可使用適當培養基及/或刺激分子進行培養及/或刺激。就刺激分子而言，可列舉細胞激素類、適當蛋白質、其他成分等，然而不以此等為限。就細胞激素類而言，可例示如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ等，而較佳可使用IL-2。就IL-2之培養基中的濃度而言，無特別限定，例如，較佳為0.01U/ml至1×10⁵U/ml，更佳為1U/ml至1×10⁴U/ml。又，就適當之蛋白質而言，可例示如CD3配體、CD28配體、抗IL-4抗體。又，此外，亦可添加凝集素等淋巴球刺激因子。再者，亦可於培養基中添加血清或血漿。此等於培養基中之添加量無特別限定，而可例示0體積%至20體積%，又，可依據培養階段，變更所使用的血清或血漿之量。例如，可將血清或血漿濃度依階段遞減而使用。就血清或血漿之來源而言，自身或非自身之任一者皆可，然而從安全性之觀點，以源自自身者為較佳。

本發明之醫藥，以非經口方式投與至對象而使用為較佳。就非經口之投與方法而言，可列舉靜脈內、動脈內、肌肉內、腹腔內、及皮下投與等之方法。投與量可依據對象之狀態、體重、年齡等而適宜選擇，然而通常就細胞數而言，針對體重60kg之對象，每1次通常為1×10⁶至1×10¹⁰個，較佳為1×10⁷至1×10⁹個，更佳為5×10⁷至5×10⁸個進行投與。又，可1次投與，亦可複數次投與。本發明之醫藥可形成適合非經口投與的周知之形式，例如，注射劑或注入劑。 本發明之醫藥亦可包含適宜的藥理學上可容許之賦形劑。本發明之醫藥為安定地維持細胞，亦可包含生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)、培養基等。就培養基而言，無特別限定，可列舉RPMI、AIM-V、X-VIVO10等培養基，然而不以此等為限。又，該醫藥中，亦可為安定化之目的而添加醫藥上可容許的載劑(例如：人類血清白蛋白)、保存劑等。

再者，本發明之細胞等，由於可殺傷表現上述之腫瘤抗原等標的抗原的細胞，可使用作為表現該抗原之細胞(例如：癌細胞、癌幹細胞、腫瘤細胞等)的殺傷劑。該殺傷劑，能以與前述醫藥同樣方法製作及使用。

又，本發明中，亦包含以含有本發明之細胞等所成之醫藥為基準，在腫瘤之預防劑或治療劑之製造中的本發明之細胞等之使用的實施態樣。腫瘤之預防劑或治療劑，可藉由本身周知之方法製造。例如，可與上述本發明之醫藥之調製方法同樣地，製造適合非經口投與的周知之形式，例如，注射劑或注入劑等。

藉由以下之實施例更具體地說明本發明，然而本發明之範圍不受彼等實施例之限定。

[實施例]

[實施例1]表現γδTCR之細胞之製造方法的檢討

就包含造血前驅細胞之細胞集團而言，使用由京都大學iPS細胞研究所供給之iPS細胞(Ff-I01s04株：來自健康人末梢血單核球)，依據周知之方法(例如，Cell Reports 2(2012)1722-1735或國際公開第2017/221975號所記載之方法)而分化的懸浮細胞集團。具體而言，在以超低貼附處理之6孔培養盤中將Ff-I01s04株以3 x 10⁵細胞/孔播種(Day0)，並於EB培養基(在StemPro34中添加10μg/ml 人類胰島素、5.5μg/ml人類運鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉、2mM L-麩醯胺酸、45mM α-單硫代甘油、及50μg/ml抗壞血酸2-磷酸酯)中添加10ng/ml BMP4、50ng/ml bFGF、15ng/ml VEGF、2μM SB431542，在低氧條件下(5% O₂)進行5日培養(Day5)。繼而，添加50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml FLT-3L，再進行5至9日培養(至Day14)，得到懸浮細胞集團。再者，於培養期間中，每2日或3日進行培養基交換。將包含HPC之上述懸浮細胞集團，使用以下之抗體組染色。

[表1]

將進行上述染色之細胞集團，提供藉由FACSAria之挑選。將所得到之細胞部分，依據周知之方法(例如，Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175或國際公開第2017/221975號所記載的方法)，分化為淋巴球系細胞。具體而言，將造血前驅細胞集團，以2000細胞/孔播種在塗覆重組h-DLL4/Fc嵌合體(SinoBiological)及Retronectin(Takara Bio)之48-孔-培養盤中，並於5% CO₂、37℃條件下培養。在培養期間中，每2日或3日進行培養基交換。再者，培養基方面，係使用添加15% FBS及2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100ng/ml鏈黴素、55μM 2-巰基乙醇、50μg/ml抗壞血酸-2-磷酸酯、10μg/ml 人類胰島素、5.5μg/ml人類運鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml FLT-3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580、30ng/ml SDF-1α之αMEM培養基。從培養開始第7日及第14日，於同樣塗覆之48-孔-培養盤中進行繼代培養。在培養開始第21日(Day35)回收所有細胞，藉由流式細胞儀(BD FACSAria^TM Fusion，BD Biosciences公司製)確認CD45(+)、CD3(+)部分存在。將所得到之細胞播種於24-孔-培養盤，並於5% CO₂、37℃條件下培養。就培養基而言，使用包含15% FBS及2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100ng/ml鏈黴素、50μg/ml抗壞血酸-2-磷酸酯、10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、5ng/mL亞硒酸鈉、500ng/mL抗CD3抗體(0KT3)、10nM***(富士製藥工業股份有限公司：10171-H02H)、100U/ml IL-2、10ng/mL IL-7之αMEM培養基。培養開始第27日(Day41)回收所有細胞，使用血球板計算細胞數後，使用以下之抗體組染色。

[表2]

染色之結果，顯示藉由源自iPS細胞(Ff-I01s04株)之造血前驅細胞，可調製表現γ δ TCR的細胞(γ δ TCR陽性細胞)(第1圖)。

再者，顯示由於該γ δ TCR陽性細胞包含V δ 1陽性γ δ T細胞、及V δ 2陽性γ δ T細胞，故可調製V δ 1型及V δ 2型之γ δ T細胞(第2圖)。

[實施例2]γ δ T細胞之細胞傷害活性的檢討

評價[實施例1]中所得到之源自iPS細胞(Ff-I01s04株)之γ δ T細胞的細胞傷害活性。以中皮瘤細胞株NCI-H226作為標的細胞，使DELFIA BATDA Reagent(Perkin Elmer)於37℃反應30分鐘。將反應液洗淨後，將包含V δ 1陽性γ δ T細胞、及V δ 2陽性γ δ T細胞之源自iPS細胞(Ff-I01s04株)之γ δ T細胞的細胞集團，相對於標的細胞以0.5、1、2、4、8、16倍之比例混合，評價2小時後之標的細胞死亡，同時評價源自iPS細胞(Ff-I01s04株)之γ δ T細胞的細胞傷害活性。

評價之結果，顯示源自iPS細胞(Ff-I01s04株)之γ δ T細胞，對於腫瘤細胞株NCI-H226具有細胞傷害活性(第3圖)。

(i γ δ T細胞之擴大培養及功能評價)

[實施例3]i γ δ T細胞之製造

除使用UCHT1(GeneTex公司製)作為抗CD3抗體以外，藉由與實施例1同樣之方法，製造源自iPS細胞(Ff-I01s04株)的γ δ T細胞(i γ δ T細胞)。

[實施例4]i γ δ T細胞之擴大培養

將[實施例3]中所得到之i γ δ T細胞，在含有15% FBS之α-MEM培養基中添加含有表3之細胞激素之添加劑的培養基中，以2,000,000細胞/mL懸浮，並播種於抗CD3抗體(UCHT1)及RetroNectin固相化的培養盤，於5% CO₂/37℃下培養3日。在培養第3日，從培養盤回收細胞，並使用NucleoCounter(註冊商標)NC-200(ChemoMetec)計測細胞數，同時將該細胞適量地懸浮在培養基中，該培養基係在含有15% FBS之α-MEM培養基中添加包含表4之細胞激素之添加劑而成；繼而添加在未固相化之G-Rex(註冊商標)6孔培養盤(WILSONWOLF) 中，於5% CO₂/37℃下培養。然後，在培養第5、6、7、8、9、10、11、14、17日之任何4至6次，將一部分細胞從培養盤回收，使用血球計數板計測細胞數。

抗CD3抗體及RetroNectin於培養盤之固相化，係依照以下之方法進行。將以需要之濃度溶解於PBS中的抗CD3抗體(UCHT1，最終濃度3000ng/mL)及RetroNectin(最終濃度150μg/mL)添加於培養盤後，在4℃下靜置一晚。用PBS洗淨後，付諸於試驗。

[表3]

[表4]

藉由抗CD3抗體(UCHT1)及抗CD30抗體之刺激，可見到i γ δ T細胞之細胞增殖(第4圖)。

[實施例5]源自iPS細胞之V γ 9V δ 2T細胞的製造

1. iPS細胞之準備

iPS細胞方面，與[實施例1]同樣地，使用由京都大學iPS細胞研究所(CiRA)所供給之Ff-I01s04株。iPS細胞培養係依據CiRA所發佈的規程「於無飼養細胞之人類iPS細胞之培養」進行。

2. iPS細胞分化成HPC

iPS細胞分化成造血前驅細胞(HPC)，係與[實施例1]同樣地依據周知之方法(WO2017/221975)進行。

3. V γ 9V δ 2基因

使用源自G115 γ δ T細胞純系之V γ 9V δ 2 T細胞受體(V γ 9V δ 2TCR G115)。就包含編碼V γ 9V δ 2TCR G115之基因的核酸而言，人工合成編碼多肽(序列編號7)的寡DNA，該多肽係從N末端依照表5之順序排列而設計者。

[表5]

4.搭載V γ 9V δ 2基因之逆轉錄病毒載體的製作

慢病毒載體方面，使用從pLVSIN-CMV Neo(Clontech公司)除去編碼新黴素耐性基因之序列，將CMV啟動子置換成人類泛素(ubiquitin)啟動子，即pLVSIN-Ub。將[實施例5]3.中合成之人工寡DNA組入pLVSIN-Ub逆轉錄病毒載體之多重選殖位點(multiple cloning site)。使用此質體與Clontech公司之Lenti-X^TM 293T細胞株及Lenti-X^TM Packaging Single Shots(VSV-G)，製作慢病毒載體。

5.源自iPS細胞之V γ 9V δ 2T細胞之製造

使[實施例5]4.所製作的搭載V γ 9V δ 2基因之逆轉錄病毒載體感染[實施例5]1.中所準備之iPS細胞及實施例[實施例5]2.中所製作的源自iPS細胞之造血前驅細胞(HPC)。使此等細胞與[實施例1]同樣地，依據周知之方法(WO2017/221975)分化成T細胞，製作源自iPS細胞之V γ 9V δ 2T細胞。就分化之步驟中所使用的抗CD3抗體而言，使用500ng/mL UCHT1(GeneTex公司製)。(以下，將從iPS細胞所製作的源自iPS細胞之V γ 9V δ 2T細胞稱為「i γ 9 δ 2T細胞」， 將從源自iPS細胞之HPC所製作的源自iPS細胞之V γ 9V δ 2T細胞稱為「iH γ 9 δ 2T細胞」。)關於所得到之i γ 9 δ 2T細胞及iH γ 9 δ 2T細胞，藉由流式細胞儀(BD FACSAria^TM Fusion，BD Biosciences公司製)測定在細胞膜表面上之CD3、γ δ TCR、V γ 9及V δ 2的表現(第5及6圖)。

[實施例6]源自iPS細胞之抗CD19-CAR/IL-15 γ δ T細胞的製造

1.抗CD19-CAR基因

就包含抗CD19-CAR基因之核酸而言，人工合成從N末端依表6之順序排列而設計之編碼多肽(序列編號2)的寡DNA。

[表6]

2.搭載抗CD19-CAR基因之逆轉錄病毒載體的製作

將[實施例6]1.中合成之人工寡DNA組入pMY逆轉錄病毒載體之多重選殖位點。使用逆轉錄病毒載體產生用之FRY-RD18細胞，製作病毒載體。

3. IL-15R α/IL-15基因

就包含IL-15R α/IL-15基因之核酸而言，人工合成從N末端依表7之順序排列而設計的編碼多肽(序列編號6)之寡DNA。

[表7]

4.搭載IL-15R α/IL-15基因之逆轉錄病毒載體的製作

將[實施例6]3.所合成之人工寡DNA組入pMY逆轉錄病毒載體之多重選殖位點。使用逆轉錄病毒載體產生用之FRY-RD18細胞，製作病毒載體。

5.源自iPS細胞之抗CD19-CAR/IL-15 γ δ T細胞的製造

使[實施例6]2.所製作的搭載抗CD19-CAR基因之逆轉錄病毒載體及[實施例6]4.所製作的搭載IL-15R α/IL-15基因之逆轉錄病毒載體感染[實施例4]中所得到之i γ δ T細胞及[實施例5]5.所製作之iH γ 9δ2T細胞，製作源自iPS細胞的抗CD19-CAR/IL-15 γ δ T細胞。(以下，將從i γ δ T細胞所製作的源自iPS細胞之抗CD19-CAR/IL-15 γ δ T細胞稱為「iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞」，將從iH γ 9 δ 2T細胞所製作的源自iPS細胞之抗CD19-CAR/IL-15 γ δ T細胞稱為「iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞」。)

[實施例7]源自iPS細胞之抗CD19-CAR/IL-15 γ δ T細胞的擴大培養

1. iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞之擴大培養

將[實施例6]所得到之iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞以與[實施例4]同樣之方法進行擴大培養。但是，使用分別添加包含表8之細胞激素的添加劑(代替包含表3之細胞激素的添加劑)，及包含表9之細胞激素的添加劑(代替包含表4之細胞激素之添加劑)的培養基。

[表8]

[表9]

藉由抗CD3抗體(UCHT1)及抗CD30抗體之刺激，可見到iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞之增殖(第7圖)。

2. iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞之擴大培養

將[實施例6]所得到之iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞以與[實施例7]1.同樣之方法進行擴大培養。但是，不添加抗人類CD30抗體(human CD30 Antibody)。

藉由抗CD3抗體(UCHT1)之刺激，可見到iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞之增殖(第8圖)。

[實施例8]源自iPS細胞之抗CD19-CAR/IL-15 γ δ T細胞之細胞傷害活性的檢討

評價[實施例7]所得到之iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞及iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞的細胞傷害活性。以CD19陽性Raji細胞及CD19陰性CCRF-CEN細胞作為標的細胞，將iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞或iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞以相對於標的細胞0.5、1、2、4、8、16倍之比例混合，評價2小時後之標的細胞死亡的比例，同時評價iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞及iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞之細胞傷害活性。

評價之結果，顯示iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞及iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞，對於CD19陽性Raji細胞具有細胞傷害活性，對於CD19陰性CCRF-CEN細胞則無(第9及10圖)。

[實施例9]藉由iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞之生存日數延長效果

針對NOD/Shi-scid,IL-2R γ KO(NOG)小鼠(實驗動物中央研究所，雌性，7-8週齡)，將5x10⁵個(細胞)之Nalm6細胞(ATCC)進行尾靜脈移植，製作Nalm6異種移植小鼠。在移植後第4日，將[實施例6]所製造之iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞(5x10⁶個(細胞))懸浮於0.1mL之HBSS-緩衝液的懸浮液或等量之HBSS-緩衝液(對照)進行尾靜脈投與後，確認生存日數。

經尾靜脈移植CD19陽性Nalm6癌細胞之小鼠，相對於對照投與群於3週以內全例死亡，而在iCD19CAR/IL-15 γ δ T細胞投與群，至少6週後為止全例均生存(第11圖)。

[實施例10]藉由iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞之活體中抗腫瘤效果

針對NOD/Shi-scid,IL-2R γ KO(NOG)小鼠(實驗動物中央研究所，雌性，7-8週齡)，經尾靜脈移植5x10⁵個(細胞)之螢光素酶表現Nalm6細胞(ATCC)，製作螢光素酶表現Nalm6異種移植小鼠。在移植後第4日，將[實施例6]所製造之iHCD19CAR/IL-15 γ 9δ2T細胞(5x10⁶個(細胞))懸浮於0.1mL之HBSS-緩衝液的懸浮液或等量之HBSS-緩衝液(對照)進行尾靜脈投與。在投與2週後，經尾靜脈投與螢光素，使用IVIS Imaging System(IVIS LUMINA II，CaliperLS公司製)測定、Nalm6細胞表現的螢光素酶之活性。

對照投與群中，可確認全身具有源自Nalm6細胞之發光，相對地，在iHCD19CAR/IL-15 γ 9 δ 2T細胞投與群中，幾乎未檢測到發光(第12圖)。

[產業上之可利用性]

依照本發明，可效率良好地取得γ δ T細胞，以此種方式所取得之細胞，對腫瘤等疾病之預防或治療有用。

本申請案係以在日本國所申請之特願2018-133727(申請日：2018年7月13日)及特願2019-117891(申請日：2019年6月25日)作為基礎，藉由其中述及之事項，將彼等之內容全部包含於本說明書中。

<110> 國立大學法人京都大學 日商武田藥品工業股份有限公司

<120> 製造γ δ T細胞的方法

<130> 092929

<150> JP 2018-133727

<151> 2018-07-13

<150> JP 2019-117891

<151> 2019-06-25

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 965

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19-CAR(CD8-CD28-CD30-CD3z)

<400> 1

<210> 2

<211> 544

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19-CAR(CD8-CD28-4-1BB-CD3z)

<220>

<221> 信號

<222> (1)..(22)

<223> 免疫球蛋白重鏈的導引序列

<220>

<221> 肽

<222> (23)..(126)

<223> 抗-CD19抗體輕鏈的可變區

<220>

<221> 肽

<222> (127)..(141)

<223> 肽連結子

<220>

<221> 肽

<222> (142)..(261)

<223> 抗-CD19抗體重鏈的可變區

<220>

<221> 肽

<222> (262)..(344)

<223> CD8-衍生序列

<220>

<221> 肽

<222> (345)..(385)

<223> CD28的細胞內功能域區

<220>

<221> 肽

<222> (386)..(432)

<223> 4-1BB的細胞內功能域區

<220>

<221> 肽

<222> (433)..(544)

<223> CD3 ζ的細胞內功能域區

<400> 2

<210> 3

<211> 87

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連結子

<400> 4

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連結子

<400> 5

<210> 6

<211> 400

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> 信號

<222> (1)..(23)

<223> 人類IL-2導引序列

<220>

<221> 肽

<222> (24)..(137)

<223> 人類IL-15

<220>

<221> 肽

<222> (138)..(161)

<223> 肽連結子

<220>

<221> 肽

<222> (162)..(400)

<223> 人類IL-15Ra

<400> 6

<210> 7

<211> 629

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> V γ 9 V δ 2 TCR

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(315)

<223> T細胞受體γ

<220>

<221> 信號

<222> (316)..(337)

<223> P2A

<220>

<221> 肽

<222> (338)..(629)

<223> T細胞受體δ

<400> 7

Claims (21)

1. 一種方法，其為從人工多能性幹細胞製造γ δ T細胞之方法，其中該人工多能性幹細胞係源自α β T細胞以外之細胞。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其包含下列步驟：

   (1)從α β T細胞以外之細胞建立人工多能性幹細胞的步驟；

   (2)使步驟(1)所建立之人工多能性幹細胞分化為T細胞的步驟。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該α β T細胞以外之細胞為α β T細胞以外之單核細胞。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其中該α β T細胞以外之細胞為單核球。
5. 如申請專利範圍第2至4項中任一項所述之方法，其包含在前述(1)及(2)任一步驟所得到之細胞中，導入可識別並結合腫瘤特異性抗原或腫瘤關連抗原之核酸的步驟，該核酸如下：

   (i)編碼α TCR之核酸及編碼β TCR之核酸、

   (ii)編碼γ TCR之核酸及編碼δ TCR之核酸、及/或

   (iii)編碼CAR之核酸。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該γ TCR為V γ 9TCR，且該δ TCR為V δ 2TCR。
7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之方法，其中包含在該(1)及(2)之任一步驟中所得到的細胞中，導入編碼包含IL-15及IL-15R α之融合蛋白質之核酸的步驟。
8. 一種細胞，其為源自人工多能性幹細胞之γ δ T細胞，其中該人工多能性幹細胞係源自α β T細胞以外之細胞。
9. 一種γ δ T細胞，其係依照如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之方法製造者。
10. 如申請專利範圍第8或9項所述之細胞，其中該α β T細胞以外之細胞為α β T細胞以外之單核細胞。
11. 如申請專利範圍第8至10項中任一項所述之細胞，其中該α β T細胞以外之細胞為單核球。
12. 如申請專利範圍第8至11項中任一項所述之細胞，其中該γ δ T細胞表現V γ 9TCR及V δ 2TCR。
13. 如申請專利範圍第8至12項中任一項所述之細胞，其中該γ δ T細胞表現CAR。
14. 如申請專利範圍第8至13項中任一項所述之細胞，其中該γ δ T細胞表現包含IL-15及IL-15R α之融合蛋白質。
15. 一種細胞集團，其為至少全部細胞之90%以上為γ δ T細胞的細胞集團，其中該γ δ T細胞為從源自α β T細胞以外之細胞之人工多能性幹細胞分化的細胞。
16. 一種醫藥，其包含如申請專利範圍第8至14項中任一項所述之細胞或如申請專利範圍第15項所述之細胞集團。
17. 如申請專利範圍第16項所述之醫藥，其係使用於腫瘤之預防或治療。
18. 一種細胞之殺傷劑，其包含如申請專利範圍第8至14項中任一項所述之細胞或如申請專利範圍第15項所述之細胞集團。
19. 如申請專利範圍第8至14項中任一項所述之細胞或如申請專利範圍第15項所述之細胞集團，其係使用於腫瘤之預防或治療。
20. 一種申請專利範圍第8至14項中任一項所述之細胞或如申請專利範圍第15項所述之細胞集團的用途，係用於製造腫瘤之預防劑或治療劑。
21. 一種腫瘤之預防或治療方法，其包含投與如申請專利範圍第8至14項中任一項所述之細胞或如申請專利範圍第15項所述之細胞集團。

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