TW202012710A - 牙科植體或補體件之表面處理的方法，及具有奈米多孔表面的牙科植體或補體件 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種將由鈦或鈦合金製造的牙科植體或補體件進行表面處理的方法，其可得到防止細菌黏附的能力顯著之植體或補體件的外表面，且提供較佳的美感修整。此方法的步驟包含對植體或補體件外表面提供表面粗度，及對該植體或補體件施加陽極氧化處理，將該粗面平滑化且在該植體或補體件外表面上產生奈米孔。本發明亦關於一種由鈦或鈦合金製造的牙科植體或補體件，其包含粗且具有奈米孔的外表面。

Description

牙科植體或補體件之表面處理的方法，及具有奈米多孔表面的牙科植體或補體件
本發明關於一種將牙科植體或補體件進行表面處理的方法，且特定而言為一種包含在該牙科植體或補體件上形成表面粗度，繼而將該牙科植體或補體件進行陽極氧化以將該粗面平滑化，在此粗面上形成奈米孔，及對該表面提供特定顏色的方法。本發明亦關於一種粗外表面有奈米孔的牙科植體或補體件。
通常由鈦製造的牙科植體可將一顆或以上的假牙部分或完全固定於無牙上頜或頜骨。其由於鈦之骨整合能力而為可行的，換言之，與骨頭建立直接且緊密的交互作用。此外，鈦自發形成氧化物表面層，其功能為防止植體腐蝕及受力時之機械性劣化。
在牙科植入學領域中，牙科植體之表面處理在先行技藝為已知的，而對植體表面提供有利於將植體整合到骨組織中的較佳性質，因此提高植入成功率。然而儘管此技術有所進展，植體植入仍會因不同的原因而失敗。
先行技藝已知牙科植體固定為複雜的過程，因為其涉及3種組織型態：上皮組織、軟結締組織、及骨頭。文獻中已揭述，跨上皮層裝置中有4種可預見的失敗模式。第一種為植體附近軟組織凹陷而產生囊或真空。第二種為尚發育不全的結締組織穿透植體孔而在過程中產生提升力，稱為「過移(permigration)」。此軟組織不安定破壞植體附進的保護性封口，而在植體與軟組織之間的區域中留下病原可能進入的通路。其他兩種失敗模式為感染及創傷過程。因此關於在軟組織與植體之間的界面中產生儘可能緊密的封口之需求，作為對抗感染的最初屏障及作為植體與跨上皮層補體件長期成功的重要因素，有明確的共識。事實上，牙科植體植入失敗的最常見原因為微生物在植體與假牙之間的區域中繁殖。此失敗原因比其他突出，因為較為常見且有重要的臨床意義。
因此，現在越來越注意維持軟牙齦組織，及在軟組織與植體及假牙的表面之間得到緊密的生理封口，因為其對植入短中期成功至為重要。牙齦纖維母細胞為牙周組織的主要成分，且負責維持結締組織的結構整體性，及在植體的跨黏膜部分緊密封閉軟組織。
細菌在植體、假牙、與軟牙齦組織間區域中累積會造成形成生物膜(換言之，在許多人身上為厚層的細菌有序累積)，其耐抗生素治療且產生發炎病症，如植體周圍黏膜炎及植體周圍炎。植體周圍炎特徵為植體附近的支撐骨損失。其估計置入骨頭中的植體有6.6至36.6%發生植體周圍炎。
如果無法防止細菌累積，則因此發生任何感染均需要移除植體及受影響的組織，繼而清理及治癒該區域才可嵌入新 植體。這些手術涉及額外的費用及病人不適，且會導致嚴重的健康問題。
因此重點為在植體的跨黏膜及跨上皮層區域中，發展減少黏附細菌數的植體表面，因此將形成溶菌斑且後來軟組織發炎的風險最小化。
為了嚐試降低植體中的細菌的溶菌斑發生，現已在口腔中測試許多種特徵及表面處理不同的材料。某些這些處理含有金屬離子，如Ag+、Cu2+、Ni2+、Cr3+、Zn2+、Fe3+等，其一旦被釋放到植體附近的區域中則具有抗菌效果。然而對於長期植入用補體件，此型表面由於這些金屬在血液中累積而有問題。在這些情形，這些金屬離子的抗菌作用通常限於最初植入時間及為了手術的滅菌。為了讓這些金屬離子長時間作用，現有在氧化物層中「設陷」(trapping)離子的策略，使得其僅在這些保護層降解時釋放。其已出現在產生磨潤現象的植體或補體，如人工膝蓋或髖關節。
另一方面，現在已有基於表面材質的抗菌效果之處理。已知微米粗度提高會促進在植體及補體件表面上形成細菌生物膜。另一方面已證明，經由包括奈米管或奈米孔進行奈米程度的修改對於抑制細菌黏附非常有效。完成這些奈米結構(尤其是製造更有序的結構)的技術使其難以轉移到複雜的幾何體，如一般的植體製造。此外，這些處理通常具有暗沉的表面修整，其對於所欲用途不太具美感。
為了讓跨上皮層補體件具有利於後續補體重建的美感，現已製造硬塗層，如藉氮化鈦電漿氣相沈積方法(PVD)產生。然而，其抗菌效果有限，主要由於粗度低及表面硬化限制離子釋放。
因此具有同時滿足這些三種要求的抗菌表面為必要的：其抗菌活性不基於將金屬離子釋放到人體中(可能在器官中累積)；其美感適於補體重建；及其為最初細菌黏附的抑制劑，而防止會危害植入之微生物生物膜及細菌的溶菌斑之形成。
本發明之一目的為一種由鈦或鈦合金製造的牙科植體或補體件之表面處理的方法，其可得到防止細菌黏附的能力顯著之植體或補體件的外表面。此方法的步驟包含對植體或補體件外表面提供表面粗度，及對該植體或補體件施加陽極氧化處理，將該粗度平滑化且在此植體或補體件外表面上產生奈米孔。換言之，本發明提議經由將事先使用其他方法變粗糙的表面進行陽極氧化，而組合使用表面材質之光滑修改條件與奈米孔。
本發明之另一目的為一種由鈦或鈦合金製造的牙科植體或補體件，其包含具有奈米孔的粗外表面。
本發明提供一種對細菌黏附之抗性較大的牙科植體或補體件。此外，本發明改良植體或補體件的植入美感特徵，因為得到的表面色調可使植體或補體件有較佳的美感修整。此外，本發明之植體或補體件提供不釋放金屬離子的優點。另一方面，該本發明之植體或補體件可較佳地固定軟組織(纖維母細胞黏附)。最後，本發明之方法避免使用氟化合物，其為習知方法在鈦中得到奈米管/奈米孔之基礎，且在處理上為高毒性/風險。
本發明之細節可在附圖中得知，其不意圖限制本發明之範圍： - 第1圖顯示根據依既存表面而施加的陽極氧化電壓之目視外觀：在切削方法後，在氮化物附加處理後，及在削減酸處理後。
- 第2圖顯示依挑選的陽極氧化電壓對經氮化物附加處理的樣品之孔徑(奈米)分布長條圖[A)75伏特，B)100伏特，C)125伏特，D)140伏特，E)170伏特]。
- 第3圖顯示依挑選的陽極氧化電壓對經削減酸處理的樣品之孔徑(奈米)分布長條圖[A)75伏特，B)100伏特，C)125伏特]。
- 第4圖顯示掃描電子顯微鏡影像，其提供施加相同的奈米材質化處理前後，微米及奈米程度的表面地形外觀[A)切削後表面，B)切削及100伏特陽極氧化後表面，C)削減酸處理後表面，D)削減酸處理及100伏特陽極氧化後表面，E)氮化物附加處理後表面，F)氮化物附加處理及100伏特陽極氧化後表面]。
- 第5圖顯示在靜態條件使用血鏈球菌(SS)與金黃色葡萄球菌(SA)菌株的細菌黏附實驗結果[A)切削後表面，B)切削及100伏特陽極氧化後表面，C)削減酸處理後表面，D)削減酸處理及100伏特陽極氧化後表面，E)氮化物附加處理後表面，F)氮化物附加處理及100伏特陽極氧化後表面]。
- 第6圖顯示在動態條件且於人造或天然唾液中調節，使用血鏈球菌(SS)、變種鏈球菌(SM)、與牙周致病菌(AA)菌株的細菌黏附實驗結果[A)切削後表面，B)切削及100伏特陽極氧化後表面，C)削減酸處理後表面，D)削減酸處理及100伏特陽極氧化後表面]。
- 第7圖顯示使用全基因學技術，在體內細菌黏附後24小時實行的DNA提取實驗結果，其以圖表顯示在不同表面上發現的 6種最多細菌的結果[A)氮化物附加處理後表面，B)氮化物附加處理及100伏特陽極氧化後表面]。
- 第8圖顯示使用全基因學技術，在體內細菌黏附後24小時實行的DNA提取實驗結果，其以圖表顯示在不同表面上發現的25種關於植體周圍炎之最致病細菌的結果[A)氮化物附加處理後表面，B)氮化物附加處理及100伏特陽極氧化後表面]。
- 第9圖顯示基於牙齦之初纖維母細胞黏附實驗於下列表面上的結果，其係按表面拉伸及表面佔據率計：A)切削後表面，B)切削及100伏特陽極氧化後表面，C)削減酸處理後表面，D)削減酸處理及100伏特陽極氧化後表面。
- 第10圖顯示代表纖維母細胞佔據以下之逆分散電子(retro-dispersed electrons)的掃描電子顯微鏡影像：A)切削後表面，B)切削及100伏特陽極氧化後表面，C)削減酸處理後表面，D)削減酸處理及100伏特陽極氧化後表面。
- 第11圖顯示基於牙齦之初纖維母細胞分化實驗結果，其係按第I型膠原蛋白原及纖維接合素合成計[A)切削後表面，B)切削及100伏特陽極氧化後表面，C)削減酸處理後表面，D)削減酸處理及100伏特陽極氧化後表面]。
本發明之一目的為一種將由鈦或鈦合金製造的牙科植體或補體件進行表面處理的方法。此方法包含對植體或補體件外表面提供表面粗度的步驟，及對該植體或補體件施加陽極氧化處理，將該粗度平滑化且在該植體或補體件外表面上產生奈米孔的後續步驟。應了解，奈米孔為許多直徑分散在平均直徑約為小於或等於300奈米內的洞，其中該洞之深度實質上等於或等同直徑且隨機分布而覆蓋全部表面。
在本發明方法之一些具體實施例中，對植體或補體件提供表面粗度的步驟包含經由切削該植體或補體件而製造表面粗度。在其他具體實施例中，此表面粗度係經由對該植體或補體件進行機械處理而製造。在其他具體實施例中，此表面粗度係經由對該植體或補體件進行化學處理，經由沈積方法，或經由對該植體或補體件進行熱處理而產生。在其他具體實施例中，對植體或補體件提供表面粗度的步驟包含經由對該植體或補體件進行電化學處理而產生表面粗度。
在本發明方法之一些具體實施例中，對植體或補體件施加陽極氧化處理的步驟可包含將該植體或補體件浸泡於至少一種電解質之電化學浴中，及使此浴接受電壓。其可使用如磷酸(H3PO4)、硫酸(H2SO4)、氫氟酸(HF)、草酸(C2H2O4)之電解質、或其組合。例如該電化學浴可包含1%至50%之間的磷酸(H3PO4)。在另一實例中，該電化學浴可包含1%至3%之間的草酸(C2H2O4)。該電壓可為25至200伏特，較佳為75至170伏特，且甚至更佳為80至120伏特。該電壓可較佳為施加至少1秒及少於10分鐘。
在一些具體實施例中，對植體或補體件施加陽極氧化處理的步驟係在-25至100℃之範圍的溫度進行。例如在特定具體實施例中，對植體或補體件施加陽極氧化處理的步驟可在室溫進行。
本發明之另一目的為提供一種由鈦或鈦合金製造的牙科植體或補體件，其包含具有奈米孔的粗外表面。應了解，奈米孔為許多直徑分散在平均直徑約為小於或等於300奈米內的洞，其中該洞之深度實質上等於或等同直徑且隨機分布而覆蓋全 部表面。在一些具體實施例中，該粗外表面包含直徑及深度在10至300奈米之間的隨機分布圓孔。
以下揭述對本發明之方法實行的測試及生成產物。
1.測試說明 1.1 表面的美感及地形評估
在不同的既存表面上產生本發明之表面奈米材質，以評估美感及功效。詳言之，其選擇3型基材：切削後未經任何修改之基材，換言之，在使用車床形成植體之後保持原樣的表面；本質相同但施加附加處理之基材，以對表面提供較硬的修整(氮化物)；及本質相同但已依照工業標準施加削減表面處理(酸蝕)而提供粗度之基材。為了提供奈米材質，以不同的電壓對該3種基材施加不同的陽極氧化處理。在光學顯微鏡下觀察得到的不同表面之美感外觀，其中在顯微鏡下得到的影像示於第1圖。在諮詢許多假牙專家之後，對牙齦區域最有利的色調為在附加處理(在100伏特、140伏特、或170伏特)之後或在削減處理(在100伏特)之後具有奈米材質之樣品所製造者。特定而言，經附加處理繼而在100伏特進行奈米材質化的表面之效果最突出，因為其產生非常類似牙齦天然色調之偏粉紅色反射。附加處理之奈米材質的孔徑分布長條圖(示於第2圖)顯示隨陽極氧化電壓增加，孔徑分散亦增加，其平均為約60奈米(75伏特)、70奈米(100伏特)、100奈米(125伏特與140伏特)、及210奈米(170伏特)。削減處理之奈米材質的情形(第3圖)亦同，雖然平均稍低：75伏特為55奈米，100伏特為65奈米，及125伏特為70奈米。
對於孔度為直徑約100奈米的美感結果及較大均勻性，將經由在100伏特進行陽極氧化而經奈米材質化處理的表面 用於以下實驗。第4圖顯示使用增大20,000倍之掃描電子顯微鏡得到這些表面相對其前身(切削、削減或附加處理)的地形外觀。在全部的情形均可見到，在奈米材質化處理之後可見到既存表面處理的地形特徵為被附加奈米孔。在附加處理的情形之效果突出，因為奈米材質化產生更均勻且有規律孔隙度分布的表面。
1.2 細菌黏附定量
此系列測試之目的為比較具有多孔性奈米材質的表面(本發明之標的)、與通常用於跨上皮層補體件的參考表面之能力。
在最初階段以靜態條件使用一般感染過程(金黃色葡萄球菌)及與口腔較相關(血鏈球菌)的2種重要菌株實行體外實驗。相較於無奈米材質的對照，在全部的情形奈米材質均造成兩種菌株之黏附在統計上顯著減少。
然後經由以人造及天然唾液(得自健康病人)調節且使用代表性口腔菌株(上述的血鏈球菌、變種鏈球菌、與牙周致病菌)之動態細菌黏附模型，對口內表面之實際功能實行更複雜及更具代表性的實驗。在此情形，僅比較切削表面與經削減處理表面(有或無奈米材質化處理)。值得一題的是，不似靜態測試，無關研究的細菌菌株，僅有對事先經削減處理修改表面(且不對切削表面)之奈米材質化處理得到系統性結果及顯著較少的細菌黏附，及將平均值按人造或天然唾液調整。
次一步驟為體內評估有或無奈米材質的表面之黏附力，在此情形對表面事先施加附加處理。因此將圓盤布置在對6位病人特製之牙套的經修改及未修改表面上，在嘴中經24小時之後，使用全基因學技術測量存在之細菌量。最初選擇嘴中6種 最多細菌而分析資料(第7圖，其中結果A及B分別對應無及有奈米材質的表面)。然後選擇口腔中25種關於感染過程最致病細菌(第8圖，其中結果A及B分別對應無及有奈米材質的表面)。在兩種情形，結果均為在奈米材質存在下，細菌黏附在統計上顯著減少。
1.3 牙齦纖維母細胞黏附之評估
一旦測定有奈米材質的表面之細菌黏附排斥增加，則可測定此排斥是否普及到任何細胞，尤其是牙齦區域之關注細胞：牙齦纖維母細胞。因此，對僅經切削的圓盤及對因削減處理而有粗面的圓盤實行黏附及細胞擴張實驗，其中該兩型均具有有及無奈米材質的表面。一方面評估細胞圓度(及反向擴張)，其顯示已黏附的細胞黏附良好且有作用，另一方面評估被細胞覆蓋之總面積量，其顯示各型表面由於此特定型式的細胞黏附所造成的親和力。示於第9圖的結果(其中A對應無奈米材質的切削表面，B對應有奈米材質的切削表面，C對應有削減處理粗面且無奈米材質的表面，及D對應有削減處理粗面且有奈米材質的表面)顯示，具有奈米材質的事先處理表面(D)可使纖維母細胞擴張較大，尤其是當細胞被暴露於表面超過60分鐘的時間時。在表面塗覆的情形，有奈米材質的事先處理表面(D)在暴露90分鐘下，被分化大之細胞佔據的表面百分比較大，雖然過去所有經某型表面處理(B、C、及D)的表面之結果均非常類似。第10圖中的電子顯微鏡影像支持這些結果。
1.4 牙齦纖維母細胞基質合成之評估
除了按功能性布置的細胞較多(換言之，其跨越表面完全拉伸)，測量被細胞釋放的蛋白質的指定測試提供將再生可 能性(換言之，除了所研究的不同表面的那些之外，另外製造額外細胞基質的可能性)定量的手段。第11圖(其中A對應無奈米材質的切削表面，B對應有奈米材質的切削表面，C對應有削減處理粗面且無奈米材質的表面，及D對應有削減處理粗面且有奈米材質的表面)顯示經由將第1型膠原蛋白原及纖維接合素合成之定量化的細胞分化結果。在膠原蛋白原合成的情形，當將表面以奈米材質處理時(B及D)未觀察到顯著增加。無關奈米材質，僅有削減前處理的較粗表面(C及D)得到在統計上顯著較佳結果。至於纖維接合素合成，唯有在將表面進行前處理之後以奈米材質處理(D)得到顯著較佳結果。
結論為，牙齦纖維母細胞之黏附及細胞分化結果顯示黏附抑制為針對細菌而非來自牙齦組織之真核細胞。極為相反地，對表面前處理增加奈米材質可抑制來自口腔的致病性要素之細菌黏附，經由有較多細胞形成健康組織而提升再生可能性。
2.實驗 2.1 表面製備
至於實驗，基於第4級商用純鈦(通常用於製造牙科植體)，製備直徑為12.7毫米且厚2毫米之圓盤，另及直徑為6毫米且厚1毫米之圓盤。切削表面對應零件切削(車床)後的表面狀態。對此對照表面實行兩型表面處理作為模型。一方面實行削減處理，包括將切削作業片浸泡在90℃之濃縮H2SO4/HCl酸浴中經過20分鐘，然後在室溫於15%之HNO3中經過20分鐘。另一方面實行附加處理，包括電漿氣相沈積(PVD)一層1至2微米之氮化鈦。奈米材質化係將該圓盤浸泡於25%之H3PO4浴中經過1分鐘，且施加在20至170伏特之間的可變陽極氧化電壓 而實行。在削減處理之後及在附加處理之後對切削表面進行這些處理。在製備各表面後，立即將該圓盤以A型無塵室條件清潔，然後在個別容器中經由照射β射線滅菌而在測試前儲存。
2.2 顯微術之表面定性評估
光學顯微術：在附有數位相機Leica DFC300FX型且放大10倍之Leica DMLB(Leica Microsystems,Wetzlar，德國)光學顯微鏡下，分析作業片美感修整之定性觀察。
電子顯微術：使用掃描電子顯微鏡(SEM，Quanta
200FEG,FEI Eindhoven，荷蘭)，以第二電子模式測定微米及奈米影像，其加速電壓為30仟伏及光束大小為5埃，放大1000至40000倍之間。
2.3 孔徑測定
各型樣品基於在10個不同區域放大30000倍的掃描電子顯微鏡影像(參見以上)進行平均孔洞直徑評估。然後使用ImageJ軟體，應用亮度/對比過濾器將奈米孔與其他影像隔開，而處理影像。然後應用計數演算法而可測定基本幾何縱橫比，如各孔的直徑。一旦擷取資料，則使用Origin軟體(v7.0654651)按施加的處理而計算孔徑分布長條圖。
2.4 體外微生物測試
細菌菌株：靜態測試係以金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC29213及血鏈球菌ATCC10556(S.sanguinis)菌株實行。動態測試係以變種鏈球菌ATCC25175(S.mutans)、血鏈球菌ATCC10556(S.sanguinis)、及牙周致病菌ATCC43718(A.actinomycetemcomitans)菌株實行。
實驗條件：將細菌在無添加之BHI洋菜平板上預先培養，變種鏈球菌、血鏈球菌、與金黃色葡萄球菌為在5%之CO2中經過48小時，及牙周致病菌為以厭氧條件在37℃經過72小時。然後將變種鏈球菌、血鏈球菌、與金黃色葡萄球菌於100毫升之BHI中培養24小時，或者將牙周致病菌在37℃於200毫升之BHI中培養48小時。所示的平均細菌生長時間及體積對應進行此實驗的最適存活率及生長條件，且是在分析數次不同的時間之後選擇。懸浮液中的細菌濃度為108隻細菌/毫升，由Neubauer相機測定。將細菌懸浮在無蛋白質且pH值為6.8之人造唾液(Jean-Yves Gal,2001)中而接觸基材。靜態黏附係在37℃實行60分鐘。用於動態黏附之實驗裝置為具有可同時分析9個樣品之9個埠的Robbins相機，且為速度為2毫升/分鐘的層流條件及在生理溫度。在最初黏附測試之前進行研究，以測定Robbins裝置的何者位置不影響最終黏附結果。動態黏附實驗係不間斷實行60分鐘，一旦完成即將黏附及存活率定量。在此情形，對全部基材(有及無奈米材質的切削表面、及原本就有削減處理粗面之有及無奈米材質的表面)同時進行全部實驗。最終黏附分析係使用具有LIVE/DEAD BacLightTM存活率套件之螢光顯微術實行。動態實驗被分為2組：第一組，考量材料的直接回應，在此情形將樣品直接置於未先調節之Robbins裝置中；第二組，考量材料經先行調節的回應，在此情形將樣品以得自年輕健康的男女志願者(包括吸菸者及不吸菸者)之天然唾液(Sánchez MC,2011)調節60分鐘。全部實驗均以獨立物品進行3次。研究各基材的表面上6個不同位置之存活率及黏附。
統計分析：使用變異數分析(ANOVA)及司徒頓T檢定(Student’s T-test)實行統計研究，以驗證是否接受不同群體的平均值一致之虛無假設。在對獨立樣品進行ANOVA或司徒頓T檢定時，若為顯著性低(小於0.05)，則拒絕群組平均值相同之假設。在變異數分析(ANOVA)中使用非計劃對比或事後對比，來驗證何組中有差異，其係在對預期何組差異最大尚無概念時使用。鑑於群組間差異必須相當大才能測得，此分析被視為相當保守，故其可能有群組間差異細微而在事後檢定無法測得的狀況。現已使用多重比較技術，其欲基於配對差異確定群組間差異。此分析已使用「塔基純正顯著差異」(HSD Tukey)檢定及Games-Howell檢定，其為當組數高時可將各組比較其他的技術。各組大小為各表面處理在螢光顯微術下取得及分析的影像數：每個測試樣本6個區域及對全部實驗均實行3次，計18張圖/組。全部群組的大小均相同。全部計算均使用SPSS v12(芝加哥，伊利諾州，美國)統計程式。
2.5 體內微生物測試
將具有不同研究表面之圓盤置於經特別設計以保持之且對6位24至45歲間的健康病人之上頜特製的聚碳酸酯牙套中。將作業表面朝向牙齒上方的嘴部區域。將2片圓盤置於各側，位置配合欲測試的2個表面交錯：無及經奈米材質處理。牙套在嘴中連續磨損24小時且僅在進食及清潔牙齒時移除。然後將該圓盤從牙套移除，以足夠的水清洗以排除任何未黏附殘跡，及將其在-80℃儲存直到分析。
16S核糖體之全基因分析及定序
全基因研究通常經由16S核糖體RNA(16S rRNA)基因之分析實行，其含有約1500對鹼基對(bp)且含有9個可變區穿插保留區。16S rRNA基因之可變區經常用於系譜分類，如性別或多種微生物族群中的物種。此全基因學析協定係基於16S rRNA基因的可變區V3及V4之定序及分析。為了產生完整的16S rRNA之全基因分析策略，此協定結合MiSeq(Illumina)定序系統，且使用特定IT套裝軟體及生物計算工具進行一級及二級分析。此協定包括5個不同階段：
1.隔離微生物DNA。使用指定的DNA隔離套件，其可從全部型式的生物膜樣品以高品質隔離DNA，從接受測試的圓盤表面得到微生物DNA。然後使用分光光度法及螢光分析將DNA樣品定量。
2.目標序列之聚合酶鏈反應(PCR)放大。V3及V4區中第一對的序列製造約~460bp之獨特擴增子。為了與Illumina索引及後續配結子相容，將指定配結子的序列隨同這些引子加入。
3.基因庫之製備。一旦將經選擇V3及V4區放大，則將Illumina序列配結子及雙索引條碼加入目標擴增子。此協定可在同一序列中將至多96個基因庫接合在一起。
4.MiSeq定序。使用MiSeq試劑及鹼基對讀值300bp，將V3及V4區中的全部讀值定序。考量96個經索引樣品，MiSeq產生大約>2千萬個讀值且可對每個樣品產生>100,000個讀值。
5.生物計算分析。一旦產生序列，則使用可用的資料庫對分類分級依照全基因流實行二級分析。如此可依照性別或物種將細菌分級。
2.6 纖維母細胞測試
如Anitua E、Tejero R、Zalduendo MM、Orive G.之Plasma Rich in growth factors promotes bone tissue regeneration by stimulating proliferation,migration,and autocrin secretion in primary human osteoblasts，J Periodontol 2013；84：1180-90所揭述，培養人類牙齦纖維母細胞之初細胞。簡言之，將牙齦纖維母細胞儲存在Eagle crop modifying Dulbecco培養基(DMEM)/F12(Gibco-Invitrogen,Grand Island，紐約州，美國)中，並補充麩醯胺酸2mM、正大黴素50微克/毫升(Sigma)、及15%之胎牛血清(FBS)(Biochrom AG,Leonorenstr，柏林，德國)。將該作物在加濕大氣中以37℃及5%之CO2培養。實驗係選擇第四至第六階段之間的細胞。對各型表面及實驗重複3次。
細胞黏附及擴張
將細胞在培養基中以20000個細胞/平方公分之密度栽種30、60、及90分鐘。在這些時間結束時將培養基丟棄，且將各井以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)血清沖洗。經由以5仟伏之電子加速電壓拍攝的電子顯微鏡影像，來測量表面上的細胞層高度。樣品被事先在戊二醛中以3重量百分比定著12-15小時，之後以PBS(pH=7.4)清洗3x10分鐘。然後將樣品施加濃度漸升乙醇溶液(30、50、70、90、及100體積百分比)而脫水。樣品在各濃度中經過60分鐘。使用ImageJ軟體分析不同表面中細胞覆蓋的面積之百分比。細胞擴張係以其圓度之倒數進行計算。
從額外細胞基質釋放的蛋白質
將表面不同之圓盤置於聚苯乙烯細胞培養板上。將細胞在其上以半高及以6000個細胞/平方公分之密度培養。在培養7天之後，使用ELISA套件(Takara，滋賀縣，日本)測定纖維接合素及第1型膠原蛋白原合成。

Claims (23)

  1. 一種由鈦或鈦合金製造的牙科植體或補體件之表面處理的方法，其特徵為包含以下步驟：- 對植體或補體件之外表面提供表面粗度；及- 對該植體或補體件施加陽極氧化處理，將該粗度平滑化，且在該植體或補體件之此外表面上產生直徑及深度小於或等於300奈米之奈米孔。
  2. 如請求項1之方法，其中對該植體或補體件提供表面粗度的步驟包含經由切削該植體或補體件而產生表面粗度。
  3. 如請求項1之方法，其中對該植體或補體件提供表面粗度的步驟包含經由對該植體或補體件進行機械處理而產生表面粗度。
  4. 如請求項1之方法，其中對該植體或補體件提供表面粗度的步驟包含經由對該植體或補體件進行化學處理而產生表面粗度。
  5. 如請求項1之方法，其中對該植體或補體件提供表面粗度的步驟包含經由沈積方法產生表面粗度。
  6. 如請求項1之方法，其中對該植體或補體件提供表面粗度的步驟包含經由對該植體或補體件進行熱處理而產生表面粗度。
  7. 如請求項1之方法，其中對該植體或補體件提供表面粗度的步驟包含經由對該植體或補體件進行電化學處理而產生表面粗度。
  8. 如請求項1之方法，其中對該植體或補體件施加陽極氧化處理的步驟包含將該植體或補體件浸泡於至少一種電解質之電化學浴中，並使此浴接受電壓。
  9. 如請求項8之方法，其中該至少一種電解質包含氫氟酸(HF)。
  10. 如請求項8之方法，其中該至少一種電解質包含硫酸(H 2SO 4)。
  11. 如請求項8之方法，其中該至少一種電解質包含磷酸(H 3PO 4)。
  12. 如請求項11之方法，其中該電化學浴包含1%至50%之間的磷酸(H 3PO 4)。
  13. 如請求項8之方法，其中該至少一種電解質包含草酸(C 2H 2O 4)。
  14. 如請求項13之方法，其中該電解質包含1%至3%之間的草酸(C 2H 2O 4)。
  15. 如請求項8之方法，其中該電壓為25至200伏特之值。
  16. 如請求項15之方法，其中該電壓為75至170伏特之值。
  17. 如請求項16之方法，其中該電壓為80至120伏特之值。
  18. 如請求項8之方法，其中該電壓係施加至少1秒。
  19. 如請求項8之方法，其中該電壓係施加少於10分鐘。
  20. 如請求項8之方法，其中對該植體或補體件施加陽極氧化處理的步驟係在-25至100℃的溫度進行。
  21. 如請求項8之方法，其中對該植體或補體件施加陽極氧化處理的步驟係在室溫進行。
  22. 一種牙科植體或補體件，其係由鈦或鈦合金所製造，其特徵為其包含具有直徑及深度小於或等於300奈米之奈米孔的粗外表面。
  23. 如請求項22之牙科植體或補體件，其中此粗外表面包含直徑及深度在10至300奈米之間的隨機分布之圓孔。
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