TW202012629A - 嵌合載體 - Google Patents

Abstract

本發明揭示活的非人類單股反鏈病毒目(Mononegavirales )嵌合載體，其可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質。另外，本發明揭示根據本發明實施例之包含該等載體之組合物、用於在宿主中引發免疫反應之方法及套組以及製備該等載體之方法。

Description

嵌合載體

人類病原體係重要的健康問題。儘管進行持續研究，但仍需要改良之預防並治療病原體感染、尤其來自諸如人類呼吸道融合病毒(human respiratory syncytial virus , 「RSV」)等病毒之方法。

本發明之一實施例提供活的非人類單股反鏈病毒目(Mononegavirales )嵌合載體，其可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質。

本發明之另一實施例提供包含本發明之載體及醫藥上可接受之載劑之組合物。

本發明之另一實施例提供引發對至少一種人類病原體之免疫反應之方法，其包含向人類投與本發明之非人類單股反鏈病毒目載體或本發明之組合物。

本發明之另一實施例提供製備可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體之方法，其包含(a) 在非人類單股反鏈病毒目載體中***編碼來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之非天然基因。

本發明之另一實施例提供引發免疫反應之套組，該套組包含(a) 本發明之組合物，及(b) 至少一個用於容納該組合物之容器。

意外地，如本文所論述之鼠類肺炎病毒(murine pneumonia virus , MPV)基因體係用於提供針對非MPV病毒之宿主保護之理想載體，其具有優於其他載體類型之若干優點。

MPV基因體之一個優點在於其相對較小(＜15 kb)，且可藉由反相遺傳學容易地操縱。具體而言，可藉由標準重組DNA方法將變化引入至病毒基因體之經選殖cDNA中，且可在經轉染之組織培養細胞中回收所得經修飾之病毒。特定而言，可將一或多種表現一或多種異源抗原(例如來自異源病原體之保護性抗原)之超數基因引入至MPV基因體中。

MPV基因體之另一意外優點在於MPV基因體中之非天然***序列在活體外及活體內複製期間相對穩定。舉例而言，***RSV F蛋白之MPV載體極穩定，且儘管繼續進行研究，但本發明者尚未觀察到F蛋白序列自MPV基因體之缺失。此係意外的，此乃因一些載體類型中之***序列通常可在幾次(或若干次)複製之後缺失。此外，載體中之***序列通常在複製期間累積點突變，此會使其表現沈默；然而，此在MPV基因體中僅散發性地發生。

此外，MPV生物學之若干特徵使其可安全地用作載體(尤其在人類中)。舉例而言，MPV係在呼吸黏膜之表淺性上皮細胞中複製之親肺炎病毒，且因此不是高度侵襲性或全身性病毒。另外，MPV係細胞質RNA病毒，且不會整合至宿主基因體中或以其他方式擾亂宿主基因體。感染係急性的，沒有已知之長期感染。此外，此類型之病毒(非節段負鏈RNA病毒)在病毒基因體之間具有極低之重組發生率(Spann等人，J. Virol ., 77: 11201-11211 (2003) (以全文引用的方式併入本文中))。

另外，MPV有可能因宿主範圍限制而在人類中自然減毒，如同其在非人類靈長類動物中一般。齧齒類動物係MPV之天然宿主，且該病毒在非人類靈長類動物中高度減毒，且因此由於宿主範圍限制而推測在人類中高度減毒。認為副黏液病毒或肺炎病毒因宿主範圍限制之減毒係多基因性且穩定的，如由3型牛副流行性感冒病毒在非人類靈長類動物及人類中之宿主範圍限制所說明(Skiadopoulos等人，J. Virol ., 77:1141-1148 (2003) (以全文引用的方式併入本文中))。

此外，沒有人類感染MPV之證據，且人類缺乏針對此病毒之獲得性免疫(Brock等人，J. Virol. , 86: 5829-5843 (2012) (以全文引用的方式併入本文中))。儘管MPV與RSV之蛋白質之間具有10%-60%胺基酸序列一致性(後者係與MPV最密切相關之人類病原體)，但RSV特異性免疫不會交叉中和MPV或交叉保護免受MPV影響(在小鼠模型中測試)。因此，預期在人類中使用本發明之實施例之基於MPV之載體不應經受現有免疫性、尤其針對RSV之免疫性之限制。

另一優點在於，MPV在呼吸黏膜中複製且誘導呼吸道中之局部性免疫以及全身性免疫。因此，MPV載體預示著尤其有效針對呼吸病原體。

相關申請案之交叉參考

本專利申請案主張2018年4月23日提出申請之共同待決美國臨時專利申請案第62/661,320號之權益，該美國臨時專利申請案係以全文引用的方式併入本文中。 關於由聯邦政府發起之研究及開發之聲明

本發明係在政府支持下由國立衛生研究院(National Institutes of Health)之國家過敏及傳染病研究所(National Institute Allergy and Infectious Diseases)以項目號1ZIA000372-33作出。政府具有本發明之某些權利。 以電子方式提交之材料以引用方式併入

本文以全文引用的方式併入電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表，該序列表與本文同時提交且鑑別如下：一個於2019年4月18日創建之153,440個位元組之ASCII (文本)檔案，其命名為「742180_ST25.txt」。

本發明之一實施例提供活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體，其可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質。載體

如本文所使用，「嵌合」載體係包含非天然遺傳資訊之載體。舉例而言，包含來自人類病原體之遺傳資訊或材料之非人類單股反鏈病毒目載體(例如包含來自人類病原體之遺傳資訊或材料之齧齒類動物載體或包含來自RSV之遺傳資訊之MPV載體)。

如本文所使用，「非人類單股反鏈病毒目載體」係其天然宿主不為人類之單股反鏈病毒目之病毒。

當提供給人類時，將本文所闡述之載體減毒。減毒載體能夠在活體內複製，但在人類宿主中具有較低毒力或無毒力。載體減毒可係由於可降低載體之複製及/或毒力之多種因素中之任一者所致，包括(但不限於)感染非天然宿主(宿主範圍限制)、存在一或多種胺基酸及/或核苷酸取代、異源基因之添加或去除載體基因之一部分或全部。舉例而言，MPV載體部分地係由於宿主範圍限制而在人類中減毒。非人類 單股反鏈病毒目 載體

本發明之非人類單股反鏈病毒目載體可來自單股反鏈病毒目之任一成員，只要病毒之天然宿主係非人類動物即可。在一實施例中，病毒之天然宿主係非人類動物。較佳地，病毒之天然宿主係非人類哺乳動物。較佳地，病毒之天然宿主係在囓齒目(Rodentia)中。較佳地，病毒之天然宿主係在鼠科(Muridae)中。較佳地，病毒之天然宿主係在鼠亞科(Murinae)中。較佳地，病毒之天然宿主係小鼠。

若出現以下情形，則病毒係單股反鏈病毒目之成員：其基因體係線性、通常非節段、單鏈、非感染性之負極性RNA，其在受感染細胞及病毒粒子二者中緊密地包裹在核殼體中；具有反向互補之3’及5’末端；不與蛋白質共價連接；其基因體具有特徵性基因次序3’-UTR-核心蛋白基因-包膜蛋白基因-RNA依賴性RNA聚合酶基因-5’-UTR (3’-N-P-M-G-L-5’)；其自位於基因體3’端之單一啟動子經由極性依序轉錄自其基因體產生5-10種不同之mRNA；mRNA經5’封端且經多腺苷酸化；其藉由合成基因體之完全正義拷貝(稱為反基因體)進行複製；其形成感染性螺旋核殼體作為用於合成mRNA、反基因體及基因體之模板；其編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp, L)；及/或其通常產生包膜病毒粒子。

非人類單股反鏈病毒目載體可來自以下各科：肺泡病毒科(Pneumoviridae )、玻那病毒科(Bornaviridae )、絲狀病毒科(Filoviridae )、副黏病毒科(Paramyxovirdae )、彈狀病毒科(Rhabdoviridae )及目前未分配至科之彼等。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係來自肺泡病毒科。來自肺泡病毒科之非人類單股反鏈病毒目載體可包括來自間質肺炎病毒屬(Metapneumovirus )之彼等，例如禽類間質肺炎病毒(Avian metapneumovirus )物種。禽類間質肺炎病毒物種包括禽類間質肺炎病毒(「AMPV」)。

來自肺泡病毒科之非人類單股反鏈病毒目載體亦可包括來自正肺炎病毒屬(Orthopneumovirus )之彼等，例如牛正肺炎病毒(Bovine orthopneumovirus )及鼠類正肺炎病毒(Murine orthopneumovirus )物種。牛正肺炎病毒物種包括牛呼吸道融合病毒(「BRSV」)。鼠類正肺炎病毒物種包括鼠類肺炎病毒(「MPV」，先前稱為小鼠肺炎病毒(PVM))。較佳地，本發明之實施例之非人類載體係MPV。

來自玻那病毒科之非人類單股反鏈病毒目載體可包括來自玻那病毒屬(Bornavirus)之彼等，例如以下物種：毒蛇類1玻那病毒(Elapid 1 bonavirus)、哺乳動物1玻那病毒(Mammalian 1 bonavirus)、哺乳動物2玻那病毒(Mammalian 2 bonavirus)、雀形目1玻那病毒(Passeriform 1 bonavirus)、雀形目2玻那病毒(Passeriform 2 bonavirus)、鸚形目1玻那病毒(Psittaciform 1 bornavirus)、鸚形目2玻那病毒(Psittaciform 2 bornavirus)及水鳥1玻那病毒(Waterbird 1 bornavirus)。

來自絲狀病毒科之非人類單股反鏈病毒目載體可包括來自奎瓦病毒屬(Cuevairus )之庫瓦病毒(Lloviu cuevavirus )物種。

來自副黏液病毒科(Paramyxoviridae)之非人類單股反鏈病毒目載體可包括來自禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)之彼等，例如禽腮腺炎病毒(Avian Avulavirus) 1 -禽腮腺炎病毒13；來自亨尼巴病毒屬(Henipavirus)之彼等，例如雪松亨尼巴病毒(Cedar henipavirus)、加納蝙蝠亨尼巴病毒(Ghanaian bat henipavirus)、亨德拉亨尼巴病毒(Hendra henipavirus)、墨江亨尼巴病毒(Mojiang henipavirus)及尼帕亨尼巴病毒(Nipah heniparus) (例如尼帕病毒(Nipah virus))物種；來自麻疹病毒屬(Morbillivirus)之彼等；來自腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)之彼等，例如阿基莫塔腮腺炎病毒1 (Achimoto rubulavirus 1)、阿基莫塔腮腺炎病毒2、蝙蝠腮腺炎病毒(Bat mumps rubulavirus)、犬腮腺炎病毒(Canine rubulavirus)、馬普埃拉腮腺炎病毒(Mapuera rubulavirus)、湄南利腮腺炎病毒(Menangly rubulavirus)、豬腮腺炎病毒(Porcine rubulavirus)、猿腮腺炎病毒(Simian rubulavirus)、蘇須賀腮腺炎病毒(Sosuga rubulavirus)、提維特腮腺炎病毒(Teviot rubulavirus)、刁曼腮腺炎病毒(Tioman rubulavirus)、圖胡庫腮腺炎病毒1 (Tuhoko rubulavirus 1)、圖胡庫腮腺炎病毒2、圖胡庫腮腺炎病毒3及副流行性感冒5 (parainfluenza 5)物種。

來自彈狀病毒科之非人類單股反鏈病毒目載體可包括來自流行熱病毒屬(Ephemerovirus )之彼等，例如牛發熱流行熱病毒(Bovine fever ephemerovirus )；來自哈帕病毒屬(Hapavirus )之彼等；來自累範特病毒屬(Ledantevirus )之彼等；及來自麗沙病毒屬(Lyssavirus )之彼等，例如歐洲蝙蝠1麗沙病毒(European bat 1 lyssavirus )、歐洲蝙蝠2麗沙病毒、拉各斯蝙蝠麗沙病毒(Lagos bat lyssavirus )、狂犬病麗沙病毒(Rabies lyssavirus )、希莫尼蝙蝠麗沙病毒(Shimoni bat lyssavirus )及西高加索蝙蝠麗沙病毒(West Caucasian bat lyssavirus )。

另外，本發明之載體可來自熟習此項技術者目前未知之單股反鏈病毒目之病毒(即，天然但尚未發現之彼等或尚未經由天然或人工製程產生之彼等)。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係副黏液病毒仙台病毒(Sendai virus )，且人類病原體不是伊波拉病毒(Ebola virus )或呼吸道融合病毒。在一實施例中，人類病原體係伊波拉病毒或呼吸道融合病毒，且非人類單股反鏈病毒目載體不是副黏液病毒仙台病毒。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係副黏液病毒副流行性感冒病毒5 (paramyxovirus parainfluenza virus 5 )，且人類病原體不是RSV、流行性感冒或狂犬病。在一實施例中，人類病原體係RSV、流行性感冒或狂犬病，且非人類單股反鏈病毒目載體不是副黏液病毒副流行性感冒病毒5。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係棒狀病毒(rhabdovirus )水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus ，「VSV」)，且人類病原體不是伊波拉病毒或馬爾堡病毒(Marburg virus )。在一實施例中，人類病原體係伊波拉病毒或馬爾堡病毒，且非人類單股反鏈病毒目載體不是副黏液病毒棒狀病毒水泡性口炎病毒。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus )，且人類病原體不是流行性感冒病毒。在一實施例中，人類病原體係流行性感冒病毒，且非人類單股反鏈病毒目載體不是新城雞瘟病毒。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係來自肺泡病毒科。較佳地，非人類單股反鏈病毒目載體係來自鼠類正肺炎病毒屬(Murine orthopneumovirus )。較佳地，非人類單股反鏈病毒目載體係MPV。

較佳地，非人類單股反鏈病毒目載體係感染呼吸道之載體。較佳地，非人類單股反鏈病毒目載體係來自肺泡病毒科且感染呼吸道。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係源自野生型MPV (基因庫登錄號AY729016)。在一實施例中，可將突變引入反向遺傳系統之MPV編碼序列中以產生用於選殖之獨特限制酶位點(參見Krempl等人，J. Virol. , 81(17): 9490-501 (2007) (以全文引用的方式併入本文中))。在一實施例中，限制酶位點可分別在基因體核苷酸位置4509及8461處包括Age I及BstB I。在一實施例中，可藉由密碼子對最佳化來部分地修飾L聚合酶ORF，目標係增加L蛋白質之表現。

在一實施例中，MPV載體具有與ACGCGAAAAAATGCATAACAAAACTATCAACCTGAAAAAAGTT (SEQ ID NO: 1)具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之基因體啟動子。

在一實施例中，MPV載體具有與TTGATATCTCACAGGTTGTAAACATAGTTCTTTTATAATTATTGTTAGTTAAACTATTGTGTTTGACTTCCTTTGGGTATTTTTTTCCCGT (SEQ ID NO: 2)具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之反基因體啟動子。

在一實施例中，SH與G基因之間的基因間隔區及M2與L基因之間的基因間隔區可如上文所指示藉由引入獨特之限制酶位點(例如Age I及BstB I)來修飾以產生反向遺傳系統，且顯示該等區域之經修飾序列，如下表1中所示。 表1. MPV轉錄信號

在一實施例中，MPV載體具有與以下序列具有至少95% (即，96%、97%、98%、99%或100%)一致性之轉錄信號：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30及/或SEQ ID NO: 31。

在一實施例中，MPV載體包含編碼(以3’至5’基因次序列示)以下各項之核苷酸序列：非結構性蛋白質1 (「NS1」)、非結構性蛋白質2 (「NS2」)、核蛋白質(「N蛋白」)、磷蛋白質(「P蛋白」)、基質蛋白質(「M蛋白」)、小疏水蛋白質(「SH蛋白」)、吸附蛋白(G蛋白)、融合蛋白(F蛋白)、M2-1及M2-2蛋白質以及聚合酶蛋白質(「L蛋白」)。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 32具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之NS1序列(例如基因庫登錄號AY729016)。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 33具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質NS1。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 34具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之NS2序列(例如基因庫登錄號AY729016)。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 35具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質NS2。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 36具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之N序列。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 37具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質N。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 38具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之P序列。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 39具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質P。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 40具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之M序列。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 41具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質M。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 42具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之SH序列。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 43具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質SH。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 44具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之G序列。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 45具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質G。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 46具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之F序列。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 47具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之F蛋白。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 48具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之M2-1序列。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 49具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質M2-1。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 50具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之M2-2序列。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 51具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質M2-2。

在一實施例中，MPV載體具有與SEQ ID NO: 52具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之密碼子對最佳化L序列。

在一實施例中，MPV載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 53具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之蛋白質L。

在一些實施例中，「Kozak」序列(GCCGCCACC (SEQ ID NO: 63))位於AUG起始密碼子之上游。該「Kozak」序列可為轉譯起始提供有效環境。熟習此項技術者已知其他序列且可用於增加轉譯效率。人類病原體

本發明之載體可表現來自任一人類病原體之蛋白質。如本文所使用，「人類病原體」係可引起人類感染之病原體。人類病原體可包括病毒、細菌、原生動物、普裡昂蛋白(prion)及真菌。

病原體細菌包括來自以下物種之彼等：伊斯若放線菌(Actinomyces israelii)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis)、百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)、疏螺旋體屬(Borrelia)、布氏桿菌屬(Brucella)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、披衣菌屬(Chlamydia)、鸚鵡熱披衣菌(Chlamydophila psittaci)、梭菌屬(Clostridium)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、埃利希氏體屬(Ehrlichia)、腸球菌屬(Enterococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、土倫病弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)、奈瑟菌屬(Neisseria)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、星形土壤絲菌(Nocardia asteroides)、落磯山熱立克次體(Rickettsia rickettsii)、沙門桿菌屬(Salmonella)、志賀桿菌屬(Shigella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)及鼠疫耶爾辛氏菌(Yersinia pestis)。

病原性真菌包括來自以下物種之彼等：念珠菌屬(Candida)、麴菌屬(Aspergillus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、肺囊蟲屬(Pneumocystis)及葡萄穗黴屬(Stachybotrys)。

病原性原生動物包括引起以下疾病之彼等：瘧疾(由瘧原蟲屬(Plasmodium )引起)、變形蟲症(amoebiasis)、梨形鞭毛蟲症(giardiasis)、弓形蟲症(toxoplasmosis)、隱孢子蟲症(cryptosporidiosis)、滴蟲病(trichomoniasis)、查加斯病(Chagas disease)、利什曼體病(leishmaniasis)、非洲錐蟲病(African trypanosomiasis)、變形蟲性痢疾(amoebic dysentery)、棘狀變形蟲性角膜炎(acanthamoeba keratitis)及原發性變形蟲性腦膜腦炎(納格勒變形蟲病(naegleriasis))。

病原性普里昂蛋白包括引起以下疾病之彼等：庫-賈二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、醫源性庫-賈二氏病、變異庫-賈二氏病、家族性庫-賈二氏病、散發性庫-賈二氏病、傑茨曼-斯脫司勒-史茵克症候群(Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome)、致死性家族性失眠症、庫魯病(Kuru)、家族性海綿狀腦病及多系統萎縮。

病原性病毒包括來自以下科(或目)之彼等：副黏液病毒科，其包括人類副流行性感冒病毒血清型1、2及3 (HPIV1、2、3)及麻疹病毒；亨尼巴病毒科(Henipaviridae )，其包括亨德拉病毒(Hendra virus )及尼帕病毒(Nipah virus )；正黏液病毒科(Orthomyxoviridae )，其包括禽類流行性感冒A病毒；冠狀病毒科(Coronaviridae )，其包括嚴重急性呼吸症候群(SARS)、冠狀病毒及中東呼吸症候群(MERS)冠狀病毒；絲狀病毒科，其包括伊波拉病毒及馬爾堡病毒；沙粒病毒科(Arenaviridae )，其包括拉薩病毒(Lassa Virus )；布尼亞病毒目(Bunyavirales ) (先前稱為布尼亞病毒科(Bunyaviridae ))，其包括克裡米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus )、裂谷熱病毒及漢坦病毒(Hantavirus )；黃病毒科(Flaviviridae )及披膜病毒科(Togaviridae )，其包括西尼羅病毒(West Nile virus )、登革熱病毒(Dengue virus )、茲卡病毒(Zika virus )及屈公病病毒(Chikungunya virus )；及肺泡病毒科，其包括人類呼吸道融合病毒(RSV)及人類間質肺炎病毒。

較佳地，人類病原體係病毒。較佳地，人類病原體係肺泡病毒科病毒。

較佳地，人類病原體係RSV。RSV係包膜單鏈負義RNA病毒。RSV具有10個編碼11種蛋白質之基因。融合F (「F蛋白」)及附著G (「G蛋白」)表面醣蛋白係兩種病毒中和抗原，且係主要之保護性抗原。RSV F係I型跨膜包膜醣蛋白，其在進入時調介病毒粒子包膜與宿主細胞膜之融合。來自人類病原體之蛋白質

由經本發明之載體感染的細胞表現之來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質包括可以使宿主產生對人類病原體之免疫反應之任一蛋白質。

在一實施例中，該蛋白質係副黏液病毒科之融合(F)及血球凝集素(H)或血球凝集素-神經胺酸酶(HN)蛋白質，如由人類副流行性感冒病毒血清型1、2及3 (HPIV1、2、3)及麻疹病毒所例示。

在一實施例中，該蛋白質係亨尼巴病毒科之融合(F)及附著(G)蛋白質，如由亨德拉病毒及尼帕病毒所例示。

在一實施例中，該蛋白質係正黏液病毒科之血球凝集素(HA)及神經胺酸酶(NA)蛋白質，如由高度病原性禽類流行性感冒A病毒所例示。

在一實施例中，該蛋白質係冠狀病毒科成員之刺突(S)蛋白質，如由嚴重急性呼吸症候群(SARS)、冠狀病毒及中東呼吸症候群(MERS)冠狀病毒所例示。

在一實施例中，該蛋白質係絲狀病毒科成員之GP蛋白，如由伊波拉病毒及馬爾堡病毒所例示。

在一實施例中，該蛋白質係沙粒病毒科之GP1及GP2蛋白(表現為前體GPC)，如由拉薩病毒所例示。

在一實施例中，該蛋白質係布尼亞病毒目(先前稱為布尼亞病毒科)成員之Gn (GP1)及Gc (GP2)蛋白，如由克裡米亞-剛果出血熱病毒、裂谷熱病毒及漢坦病毒所例示。

在一實施例中，該蛋白質係黃病毒科及披膜病毒科成員之E醣蛋白物質，如由西尼羅病毒、登革熱病毒、茲卡病毒及屈公病病毒所例示。

較佳地，該蛋白質係肺泡病毒科之融合蛋白(F)或醣蛋白(G)，如由呼吸道融合病毒(RSV)及間質肺炎病毒(MPV)所例示。肺泡病毒科之融合蛋白 (F)

存在兩種野生型之此蛋白質(A及B或A1及B2)及其許多天然變體。此外，核苷酸序列之開放閱讀框可藉由密碼子最佳化而經修飾以增強蛋白質之表現。另外，核苷酸序列可經修飾以含有兩個與野生型中所存在之彼等一致之HEK胺基酸分配(66E及101P，參見SEQ ID NO: 54)。此外，序列可具有突變、缺失及***，只要其不會顯著地影響所表現之蛋白質引發期望免疫反應之能力即可。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體具有與SEQ ID NO: 54具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之F蛋白(來自RSV A2)之序列。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 55具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之F蛋白(來自RSV A2)。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體具有與SEQ ID NO: 56具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之F蛋白(來自RSV A2)之序列。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 57具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之F蛋白(來自RSV A2)。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體具有與SEQ ID NO: 58具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之F蛋白(來自RSV B1)之序列。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體可以使細胞產生與SEQ ID NO: 59具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之F蛋白(來自RSV B1)。

較佳地，RSV F蛋白以其融合前形式維持，與其融合形式相比，融合前形式可以使免疫反應增加。RSV F蛋白可藉由引入在其球狀頭部中導致二硫鍵形成或空腔填充突變之突變從而以融合前形式穩定。經穩定之RSV F蛋白較不可能解摺疊(當其與宿主細胞接觸時尤其合意) (參見McLellan等人，Science , 340: 1113-1117 (2013)；McLellan等人，Science , 342: 592-598 (2013)；及Joyce等人，Nature Structural and Molecular Biology , doi:10.1038/nsmb.3267 (2016)；其各自係以全文引用的方式併入本文中)。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係MPV載體，且可以使細胞表現F蛋白(肺泡病毒科)。編碼F蛋白之序列可在MPV載體基因體中之任一適宜位置，從而使得F蛋白得以表現，且前提係其不破壞載體基因。舉例而言，可如圖1中所圖解說明***編碼F蛋白之序列。編碼F蛋白之序列之兩側應為載體基因起始及基因終止序列。在開放閱讀框之任一側上可存在幾個或多達200個核苷酸。較佳地，在編碼F蛋白之序列開始前面存在約10-20個核苷酸以使加載核糖體，藉此使得蛋白質有效表現。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係MPV載體且可以使細胞表現F蛋白(肺泡病毒科)，且包含與SEQ ID NO: 60 (rMPV-F1)具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之序列。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係MPV載體且可以使細胞表現F蛋白(肺泡病毒科)，且包含與SEQ ID NO: 61 (rMPV-F3)具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之序列。

在一實施例中，非人類單股反鏈病毒目載體係MPV載體，且可以使細胞表現F蛋白(肺泡病毒科)，且包含與SEQ ID NO: 62 (rMPV-F4)具有至少85% (即，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之序列。

在一實施例中，表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之細胞係人類細胞。載體組合物

本發明之一實施例提供組合物，其包含本發明實施例之載體及醫藥上可接受之載劑。

該組合物可適於投與有需要之個體。在一實施例中，載體組合物適於投與哺乳動物。在一實施例中，載體實質上不含內毒素或外毒素。內毒素可包括熱原，例如脂多醣(「LPS」)分子。載體亦可實質上不含可引起發熱或其他副作用之無活性蛋白質片段。在實施例中，組合物含有少於約1%、少於約0.1%、少於約0.01%、少於約0.001%或少於約0.0001%之內毒素、外毒素及/或無活性蛋白質片段。在一些實施例中，載體組合物之熱原含量低於工業用水、自來水或蒸餾水。可使用業內已知之方法純化其他載體組合物組分，該等方法例如離子交換層析、超濾或蒸餾。在其他實施例中，可在投與患者之前使熱原不活化或破壞。用於載體組合物之原材料(例如水、緩衝劑、鹽及其他化學物質)亦可經篩選及去熱原。載體組合物中之所有材料均可係無菌的，且可測試每批載體組合物之無菌性。

在實施例中，載體組合物包含少於約50%、少於約20%、少於約10%或少於約5% (以乾重計)之污染性蛋白質。在實施例中，多醣莢膜蛋白質係在實質上不存在其他生物大分子下存在，該等大分子係例如其他蛋白質(具體而言可實質上掩蓋、減少、攪亂或改變組分蛋白質之特性之其他蛋白質，無論就作為經純化製劑而言或其在標的重構混合物中之功能而言)。在一些實施例中，相對於經純化亞單位之量，包含經純化亞單位蛋白質之載體組合物含有少於約5%、少於約2%、少於約1%、少於約0.5%、少於約0.2%、少於約0.1%之來自其中表現該等亞單位蛋白質之宿主細胞之蛋白質。

在一些實施例中，載體對宿主具有低毒性或無毒性。在某些實施例中，載體組合物包含濃度小於接種疫苗動物之LD₅₀ 量測值之成分。LD₅₀ 量測值可在小鼠或其他實驗模型系統中獲得，且外推至人類及其他動物。用於估計化合物在人類及其他動物中之LD₅₀ 之方法為業內所熟知。載體組合物可在其內含有任何組分，可在大鼠中具有以下LD₅₀ 值：大於約100 g/kg、大於約50 g/kg、大於約20 g/kg、大於約10 g/kg、大於約5 g/kg、大於約2 g/kg、大於約1 g/kg、大於約500 mg/kg、大於約200 mg/kg、大於約100 mg/kg、大於約50 mg/kg、大於約20 mg/kg或大於約10 mg/kg。

適於引入載體之組合物根據投與途徑而變化。諸如氣溶膠溶液(例如其可「霧化」)及滴劑溶液二者等適於鼻內投與之組合物均可包括糖、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、鹽緩衝劑及防腐劑。

在一實施例中，包含本發明實施例之載體之組合物包含單醣及/或二醣。在另一實施例中，包含本發明實施例之載體之組合物包含葡萄糖、蔗糖及/或果糖作為糖。

在一實施例中，包含本發明實施例之載體之組合物包含醫藥上可接受之緩衝劑，其足以將一實施例之組合物之pH調整且維持在約4.0至約8.0、較佳地約5.5至約7.0範圍內。適宜緩衝劑可包括檸檬酸鹽、磷酸鹽及甘胺酸。

載體在單獨或與其他適宜組分組合時可製成欲經由吸入投與之氣溶膠調配物。可將氣溶膠調配物置入加壓可接受之推進劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮及諸如此類。可將氣溶膠調配物遞送至鼻道中或遞送至口中。

適於非經腸投與(例如藉由關節內(在關節中)、靜脈內、肌內、真皮內、腹膜內、鼻內及皮下途徑)之組合物包括水性及非水性、等滲無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使得調配物與預期接受者之血液等滲之溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。組合物可於單位劑量或多劑量密封容器(例如安瓿及小瓶)中呈送。

注射用溶液及懸浮液可自無菌粉末、顆粒及錠劑製備。適於經口投與之組合物可由以下各項組成：(a) 液體溶液，例如懸浮於稀釋劑(例如水、鹽水或PEG 400)中之有效量之多醣莢膜；(b) 膠囊、小藥囊或錠劑，其各自含有預定量之作為液體、固體、顆粒或明膠之活性成分；(c) 於適當液體中之懸浮液；及(d) 適宜乳液。錠劑形式可包括以下各項中之一或多者：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸鈣、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、黃蓍膠、微晶纖維素、***樹膠、明膠、膠體二氧化矽、交聯羧甲基纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸及其他賦形劑、著色劑、填充劑、黏合劑、稀釋劑、緩衝劑、潤濕劑、防腐劑、矯味劑、染料、崩解劑及醫藥上相容之載劑。菱形錠劑形式可包含於矯味劑(通常蔗糖及***樹膠或黃蓍膠)中之載體，以及軟錠劑，其包含於惰性基質(例如除載體以外亦含有業內已知之載劑之明膠及甘油或蔗糖及***樹膠乳液、凝膠及諸如此類)中之載體。可將載體組合物囊封於(例如)脂質體中，或於提供載體之緩慢釋放之組合物中。載體投與

根據本發明實施例之載體可藉由投與個體來遞送，其通常藉由全身投與(例如鼻內、靜脈內、腹膜內、肌內、真皮內、皮下、真皮下、經皮、顱內、經黏膜、經肛門、經***、經口、經頰途徑或其可吸入)或其可藉由局部施加來投與。在一實施例中，投與途徑為鼻內(例如經鼻噴霧劑或滴劑)。在一實施例中，投與途徑為肌內。在其他實施例中，投與途徑為皮下。在其他實施例中，投與途徑為經黏膜。在某些實施例中，投與途徑為經皮或真皮內。用於引發免疫反應之方法

本發明之一實施例提供用於引發對至少一種人類病原體之免疫反應之方法，其包含向人類投與本發明之實施例之非人類單股反鏈病毒目載體或包含該本發明之實施例之非人類單股反鏈病毒目載體之組合物。

本發明之一實施例提供用於引發對至少一種人類病原體之免疫反應之方法，其包含向人類投與本發明之實施例之非人類單股反鏈病毒目載體或包含該本發明之實施例之非人類單股反鏈病毒目載體之組合物，其中在投與時，該人類未患有肺泡病毒科病毒感染。在此一情形中，向人類投與本發明實施例之載體或包含本發明實施例之載體之組合物以誘導免疫反應，該免疫反應可幫助使免於人類肺泡病毒科病毒之確立，例如藉由使免於感染(即，患病之第一且必要的步驟)。因此，在一些態樣中，該方法抑制未感染人類中人類肺泡病毒科之感染。在另一態樣中，該方法可降低已感染人類之感染之持續時間。

在某些實施例中，載體或含有本發明載體之組合物賦予保護性免疫，從而可以使接種疫苗之個體由於其暴露於載體而展現症狀或後遺症之延遲發作，或降低症狀或後遺症之嚴重程度。在特定實施例中，已接種疫苗之個體可在與人類肺泡病毒科接觸後不會展示症狀或後遺症、不會受人類肺泡病毒科感染或該兩種情形均有。保護性免疫通常藉由以下機制中之一或多者來達成：黏膜免疫、體液免疫或細胞免疫。黏膜免疫主要係由於呼吸道、胃腸道及泌尿生殖道之黏膜表面上分泌型IgA (sIGA)抗體而引起。sIGA抗體係在由抗原處理細胞B及T淋巴球介導之一系列事件後產生，該等事件使得身體之黏膜襯裡組織上之B淋巴球產生sIGA。體液性免疫通常係由血清中之IgG抗體及IgM抗體而引起。細胞免疫可經由細胞毒性T淋巴球或經由涉及樹突細胞、巨噬細胞及T淋巴球之遲髮型過敏以及涉及T細胞而不需要抗體之其他機制來達成。特定而言，細胞免疫可由T_H1 或T_H17 細胞介導。劑量

本發明實施例之載體或包含本發明實施例之載體之組合物之劑量係有效量，其以單一劑量或在多個劑量內誘導如上文所闡述之預防性反應。較佳地，劑量經選擇以使不利副作用最小化。此一量將端視於所採用之具體載體而變化。在一些實施例中，劑量包含約10^8.0 個感染單位(PFU)之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之劑量包含約10^7.0 個感染單位(PFU)之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^6.0 個感染單位之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^5.0 個感染單位(PFU)之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^4.0 個感染單位(PFU)之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^3.0 個感染單位(PFU)之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^2.0 個感染單位(PFU)之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10個或甚至更少之感染單位(PFU)之載體顆粒。

在一些實施例中，劑量包含約10^8.0 個感染單位(50%組織培養感染單位，TCID₅₀ )之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之劑量包含約10^7.0 個感染單位(TCID₅₀ )之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^6.0 個感染單位之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^5.0 個感染單位(TCID₅₀ )之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^4.0 個感染單位(TCID₅₀ )之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^3.0 個感染單位(TCID₅₀ )之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10^2.0 個感染單位(TCID₅₀ )之載體顆粒。在一些實施例中，組合物之單一劑量包含約10個或甚至更少之感染單位(TCID₅₀ )之載體顆粒。

欲遞送之載體之適當量將取決於個體之年齡、體重及健康狀況(例如免疫受損狀態)。當存在時，通常佐劑將以每劑量1-250 µg (例如50-150 µg、75-125 µg或100 µg)之量存在。

在實施例中，投與一個劑量之本發明實施例之載體或包含本發明實施例之載體之組合物以達成上文所闡述之結果。在其他實施例中，在最初疫苗接種後，個體接受一或多次追加疫苗接種達總計兩次、三次、四次或五次疫苗接種。可(例如)在最初疫苗接種後約1個月、2個月、4個月、6個月或12個月投與追加疫苗接種，使得一個疫苗接種方案涉及在0個月、0.5-2個月、4-8個月及12個月投與。可有利地投與分開劑量之疫苗，其可藉由相同或不同途徑投與。

在一些實施例中，本發明實施例之載體或包含本發明任一實施例之載體之組合物將以劑量遞增方式投與，從而使得載體之連續投與含有較先前投與更高濃度之載體。在實施例中，載體將以使得載體之連續投與含有較先前投與更低濃度之載體之方式投與。

在一個實施例中，有效量係在至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或甚至100%之接受者中提供感染(如由疫苗病毒之脫落所定義)之量。

在一個實施例中，有效量係在至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或甚至100%之接受者中提供感染(如由對載體之血清抗體效價增加≥4倍所定義)之量。

在一個實施例中，有效量係在至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或甚至100%之接受者中提供感染(如由對所表現外源抗原之血清抗體效價增加≥4倍所定義)之量。載體組合物之製備及儲存

本文所闡述之載體及組合物可使用多種技術來產生。本發明之一實施例提供用於製備可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體之方法，其包含在非人類單股反鏈病毒目載體中***編碼來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之非天然基因。在一實施例中，編碼來自至少一種人類病原體之非天然蛋白質之基因係位於非人類單股反鏈病毒目載體基因起始之下游。在一實施例中，編碼來自至少一種人類病原體之非天然蛋白質之基因係位於載體基因終止之上游。如本文所使用，「載體基因起始之下游」意指編碼來自至少一種人類病原體之蛋白質之基因所***之位置係在非人類單股反鏈病毒目載體基因起始之下游，從而使得基因起始容許病毒聚合酶L蛋白轉錄該基因。如本文所使用，「非人類單股反鏈病毒目載體基因終止之上游」意指編碼來自至少一種人類病原體之蛋白質之基因所***之位置係在非人類單股反鏈病毒目載體基因終止之上游，從而使得基因終止容許非人類單股反鏈病毒目載體聚合酶蛋白質在適當位置停止該基因之轉錄。

在實施例中，用於製造載體之方法可包含將一或多種蛋白質或其免疫原性片段或變體與載劑及/或佐劑混合。套組及組分

本發明之一實施例提供用於引發免疫反應之套組。該套組可包含本發明實施例之組合物及至少一個用於容納該組合物之容器。該套組視情況但較佳地含有使用該套組以將本發明實施例之組合物投與人類個體之說明書。該套組視情況含有投與組合物所需之組件(例如注射器、針、霧化器、噴霧器或滴管)。

本文所闡述之本發明標的物之實施例可有益地單獨或與一或多個其他實施例組合。在不限制前述說明之情形下，下文提供編號為(1)-(25)之本揭示內容之某些非限制性實施例。如熟習此項技術者在閱讀本揭示內容後將顯而易見，每一個別編號之實施例可與先前或之後個別編號之實施例中之任一者一起使用或組合。此意欲為實施例之所有此等組合提供支持，且不限於下文所明確提供之實施例之組合：

(1) 一種活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體，其可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質。

(2) 如實施例(1)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體之天然宿主係非人類動物。

(3) 如實施例(1)或(2)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體之天然宿主係來自囓齒目。

(4) 如實施例(1)至(3)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體係鼠類肺炎病毒(MPV)。

(5) 如實施例(1)至(4)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係細菌或病毒。

(6) 如實施例(1)至(5)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係病毒。

(7) 如實施例(1)至(6)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係人類肺泡病毒科病毒。

(8) 如實施例(1)至(7)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係正肺炎病毒。

(9) 如實施例(1)至(8)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種病原體係人類呼吸道融合病毒(RSV)。

(10) 如實施例(1)至(9)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種蛋白質係RSV F蛋白。

(11) 如實施例(1)至(10)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體包含與SEQ ID NO. 56具有至少90%序列一致性之序列。

(12) 如實施例(1)至(10)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體包含與SEQ ID NO. 58具有至少90%序列一致性之序列。

(13) 如實施例(1)至(9)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種蛋白質係RSV G蛋白。

(14) 如實施例(1)至(13)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 60具有至少90%序列一致性之序列。

(15) 如實施例(1)至(13)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 61具有至少90%序列一致性之序列。

(16) 如實施例(1)至(13)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 62具有至少90%序列一致性之序列。

(17) 一種組合物，其包含如實施例(1)至(16)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體及醫藥上可接受之載劑。

(18) 如實施例(17)之組合物，其中該組合物經調配用於鼻內投與。

(19) 一種引發對至少一種人類病原體之免疫反應之方法，其包含向人類投與如實施例(1)至(16)中任一實施例之非人類單股反鏈病毒目載體或如實施例(17)或(18)之組合物。

(20) 如實施例(19)之方法，其中在投與時，該人類未患有人類肺泡病毒科病毒感染。

(21) 如實施例(19)或(20)之方法，其中在投與時，該人類未患有人類呼吸道融合病毒(RSV)感染。

(22) 如實施例(19)至(21)中任一實施例之方法，其中該非人類單股反鏈病毒目載體係鼠類肺炎病毒(MPV)。

(23) 一種製備可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體之方法，其包含： (a) 在非人類單股反鏈病毒目載體中***編碼來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之非天然基因。

(24) 一種用於引發免疫反應之套組，該套組包含： (a) 如實施例(17)或(18)之組合物；及 (b) 至少一個用於容納該組合物之容器。

(25) 一種活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體，其可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質。

(26) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體之天然宿主係非人類動物。

(27) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體之天然宿主係來自囓齒目。

(28) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體係鼠類肺炎病毒(MPV)。

(29) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係細菌或病毒。

(30) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係病毒。

(31) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係人類肺泡病毒科病毒。

(32) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係正肺炎病毒。

(33) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種病原體係人類呼吸道融合病毒(RSV)。

(34) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種蛋白質係RSV F蛋白。

(35) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體包含與SEQ ID NO. 56具有至少90%序列一致性之序列。

(36) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體包含與SEQ ID NO. 58具有至少90%序列一致性之序列。

(37) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種蛋白質係RSV G蛋白。

(38) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 60具有至少90%序列一致性之序列。

(39) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 61具有至少90%序列一致性之序列。

(40) 如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 62具有至少90%序列一致性之序列。

(41) 一種組合物，其包含如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體及醫藥上可接受之載劑。

(42) 如實施例(41)之組合物，其中該組合物經調配用於鼻內投與。

(43) 一種引發對至少一種人類病原體之免疫反應之方法，其包含向人類投與如實施例(25)之非人類單股反鏈病毒目載體。

(44) 如實施例(43)之方法，其中在投與時，該人類未患有人類肺泡病毒科病毒感染。

(45) 如實施例(43)之方法，其中在投與時，該人類未患有人類呼吸道融合病毒(RSV)感染。

(46) 如實施例(43)之方法，其中該非人類單股反鏈病毒目載體係鼠類肺炎病毒(MPV)。

(47) 一種製備可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體之方法，其包含： (a) 在非人類單股反鏈病毒目載體中***編碼來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之非天然基因。

(48) 一種用於引發免疫反應之套組，該套組包含： (a) 如實施例(42)之組合物；及 (b) 至少一個用於容納該組合物之容器。

以下實例進一步說明本發明，但當然不應解釋為以任何方式限制本發明之範圍。 實例 實例1

此實例展現可如何製備本發明實施例之載體。

使用如由Kremp等人(「Identification of a novel virulence factor in recombinant pneumonia virus of mice,」J. Virol. , (81): 9490-9501 (2007) (以全文引用的方式併入本文中)所闡述之反相遺傳學系統構築rMPV-RSV-F載體。用於表現RSV F之rMPV載體骨架係源自在pBluescript質體載體(「pBS」)中選殖之MPV (先前稱為PVM)毒株15，該pBluescript質體載體含有兩個引入之在親代毒株15中不存在之限制位點(Age I及BstB I)且亦含有經部分修飾之L ORF。L ORF之下游67%經密碼子對最佳化(「CPO」)以含有使與在人類中有效表現相關之密碼子對含量增加之同義變化，同時保留整體密碼子使用及所編碼之胺基酸序列二者。來自毒株A2之RSV F ORF經密碼子最佳化用於人類密碼子使用(Genscript, Piscataway, NJ)以獲得更多之蛋白質表現。RSV F亦攜帶66E及101P之先前所闡述之兩種HEK胺基酸分配，其使所編碼之F蛋白胺基酸序列與wt毒株A2及臨床分離株之早期傳代之F蛋白胺基酸序列一致。

設計三種MPV載體構築體，其中將RSV F***序列置於第一基因位置中NS1基因之上游(rMPV-F1)、置於第三基因位置中介於NS2與N基因之間(rMPV-F3)或置於第四基因位置中介於N與P基因之間(rMPV-F4) (參見圖1)。RSV F***序列之位置使得RSV F ORF兩側為MPV基因起始(GS)及基因終止(GE)轉錄信號，從而使得能夠將RSV F轉錄為單獨之mRNA。將Kozak共有序列GCCGCCACC (SEQ ID NO: 63)置於RSV F AUG起始密碼子之上游以提供如所闡述之針對轉譯起始之有效背景。將RSV F***序列商業(Genscript)合成為長基因體節段，該等長基因體節段經設計用於使用如所指示之質體(pBS)序列中前導區上游之Xma I限制位點及下游Kpn I位點(rMPV-F1及rMPV-F3)或Kpn I及Bmt I位點(rMPV-F4)***至rMPV反基因體質體中(參見圖1)。最終構築體rMPV-F1含有1768個額外核苷酸，其位置緊接在MPV基因體之核苷酸位置67之後(NS1上游)，rMPV-F3含有1775個額外核苷酸，其位置緊接在MPV基因體之核苷酸位置981之後(介於NS2與N之間)，且rMPV-F4含有1771個額外核苷酸，其位置緊接在MPV基因體之核苷酸位置2276之後(介於N與P之間)。

自組成型地表現T7 RNA聚合酶之BHK BSR-T7/5細胞中之cDNA回收rMPV載體(關於例示性方法，參見Krempl等人，上文文獻)。利用MPV反基因體質體及表現MPV N、P、M2-1及L蛋白之支持質體轉染細胞。24小時後，將細胞刮下，渦旋，且使細胞懸浮液與Vero細胞單層共培養大約兩週以產生P1病毒儲備液。已證實P1病毒儲備液不含任何在回收期間引入之偶然突變。具體而言，分離病毒RNA且使用未選殖之重疊RT-PCR片段實施完整病毒基因體之Sanger序列分析。缺少反轉錄酶之對照RT-PCR反應未產生擴增產物，此證實PCR產物係自病毒RNA擴增而非自用於病毒拯救時所用cDNA之擴增。藉由噬斑分析及免疫染色測定病毒儲備液之效價。 實例2

此實例展現本發明實施例之載體之活體外穩定性。

此研究中使用Vero、人類肺上皮及幼小倉鼠腎細胞。將Vero細胞(非洲綠猴腎細胞，CCL-81, ATCC, Manassas, VA)維持在補充有4 mM L-麩醯胺酸(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)及10%胎牛血清(「FBS」) (Hyclone, Logan, UT)之OPTIPRO^TM 培養基中。將人類肺上皮A549 (CCL-185; ATCC, Manassas, VA)細胞維持在補充有4 mM L-麩醯胺酸之F-12K培養基(ATCC)中。BHK BSR T7/5細胞係維持在補充有3% FBS之Glasgow’s MEM培養基(ThermoFisher Scientific)中之BHK-21 (幼小倉鼠腎21)細胞。對於每隔一次傳代在培養基中納入建那黴素(Geneticin) (ThermoFisher Scientific)以確保選擇表現T7 RNA聚合酶之細胞。

使用重組(r) wt RSV毒株A2作為對照。除非另有註明，否則所有活體外組織培養實驗均係在37℃下進行。藉由以0.1之感染複數(「MOI」)感染在Vero細胞上繁殖rMPV及rMPV-RSV-F載體。在感染後兩週收穫病毒儲備液，此時細胞病變效應會將單層破壞。如所闡述在0.8%甲基纖維素覆蓋下藉由Vero細胞上之噬斑分析來測定rMPV效價。藉由利用針對蔗糖梯度純化之MPV產生的兔超免疫血清、之後利用辣根過氧化物酶標記之山羊抗兔IgG二級抗體(KPL, Gaithersburg, MD)進行免疫染色來使噬斑可視化。藉由與過氧化酶受質(KPL)一起培育來檢測所結合之二級抗體。每一樣品係以一式兩份進行測試且報告平均值。

為評估在活體外複製後RSV F蛋白之表現穩定性，藉由雙重染色噬斑分析來分析每一rMPV-RSV-F構築體之四個獨立病毒回收率以確定RSV F表現之穩定性。如先前Brock等人(「Evaluation of pneumonia virus of mice as a possible human pathogen,」J. Virol., 86: 5829-5843 (2012) (以全文引用的方式併入本文中))所闡述建立噬斑分析，且在感染後第四天使用80%甲醇來固定細胞。為鑑別MPV蛋白，以1: 5,000使用上文所闡述之兔抗rMPV多株一級抗體且藉由山羊抗兔680 LT抗體(Li-Cor; Lincoln, NE)進行檢測。利用各自為1: 200之三種RSV F特異性小鼠單株抗體(1129、1243及1269)之混合物探測RSV F，之後利用山羊抗小鼠800 CW二級抗體(Li-Cor)探測。兩種二級抗體均係使用1:800稀釋度。在Odyssey紅外成像儀(Li-Cor)上掃描平板，且分析影像以確定共表現RSV F及rMPV抗原之PFU之百分比。對於MPV及RSV F抗原，對噬斑影像分別進行假染色以呈現紅色及綠色。在將兩個通道合併時，共表現RSV F之rMPV噬斑將呈現黃色，而RSV F表現喪失之彼等將呈現紅色。如圖2中可見，由於噬斑係紅色，故rMPV -空載體不具有RSV F表現。相比之下，當將通道合併時，rMPV-F1、rMPV-F3及rMPV-F4係黃色。

圖3顯示rMPV-RSV-F載體在人類A549肺上皮細胞中之多循環生長動力學。圖4顯示rMPV-RSV-F載體在Vero細胞中之多循環生長動力學。 實例3

此實例展現本發明實施例之載體之活體內穩定性。

為評估RSV F蛋白在活體內複製後之表現穩定性，藉由噬斑分析、之後如上文所闡述之固定及雙重染色噬斑分析對來自下文所闡述之恒河猴研究之鼻咽拭子及氣管灌洗樣品進行分析。

為評估多循環複制動力學，利用每一病毒以0.1 PFU/細胞之MOI接種於T25燒瓶中之Vero細胞及A549細胞之複製單層培養物且在32℃下培育。使病毒接種物吸附三小時，之後將單層洗滌兩次且補充新鮮培養基。對於A549在第1天至第6天以及第8天及第10天且對於Vero細胞在第1天至第6天及第8天，將每種病毒及每種細胞類型之兩個細胞單層刮入上清液中，渦旋，藉由離心澄清並冷凍。藉由Vero細胞上之噬斑分析測定病毒效價。

接下來，評估RSV F及MPV載體蛋白質之表現。利用rMPV-RSV-F載體、空載體、wt rMPV、wt RSV以每細胞10 PFU之MOI感染於12孔平板中之Vero細胞單層或模擬感染。在感染後96小時，獲取受感染細胞之影像，且製備細胞溶解物以藉由西方墨點法檢查病毒蛋白質表現。利用1× PBS將細胞洗滌兩次且利用200 µL含有1× NUPAGE^TM LDS樣品緩衝液(ThermoFisher Scientific)、1× COMPLETE^TM ULTRA蛋白酶抑制劑(Roche, Basel, Switzerland)及無蛋白酶水之細胞溶解緩衝液溶解。經由QIAshredder旋轉管柱(Qiagen, Valencia, CA)旋轉每一溶解物並在乾冰上急凍。將90 µL每一溶解物與10 µL 10×還原劑(ThermoFisher Scientific)合併，且在70℃下變性並還原10 min。每一泳道加載25 µL，之後進行SDS-PAGE及西方墨點。利用針對蔗糖梯度純化之MPV病毒粒子產生的超免疫血清檢測rMPV G、rMPV N及rMPV P蛋白。利用針對表現MPV F蛋白之重組牛痘病毒產生的兔多株抗血清檢測MPV F蛋白。利用針對分別源自相應蛋白質之合成肽TNFDRSDLET (SEQ ID NO: 64)及SDSEESGDEA (SEQ ID NO: 65)所個別產生的兔超免疫血清檢測NS1及NS2。利用如Liang等人(「Chimeric bovine/human parainfluenza virus type 3 expressing respiratory syncytial virus (RSV) F protein: effect of insert position on expression, replication, immunogenicity, stability, and protection against RSV infection,」J. Virol. (88): 4237-4250 (2014) (以全文引用的方式併入本文中))所闡述之單株抗體探測RSV F。使用小鼠單株抗微管蛋白抗體(ThermoFisher Scientific，目錄號A-11126)檢測作為加載對照之微管蛋白。利用與紅外染料(Li-Cor)偶聯之相應物種特異性二級抗體檢測一級抗體。在Odyssey紅外成像系統上掃描膜。獲得條帶信號值，且使用IMAGESTUDIO^TM Lite，5.2.5版(Li-Cor)進行背景校正。

如圖5中可見，經wt RSV、rMPV-F1、rMPV-F3及rMPV-F4感染之細胞顯示明顯的病毒感染跡象。經模擬感染及rMPV-空感染之細胞未顯示任何感染跡象。

圖6顯示西方墨點，具體而言，可看到rMPV-F1、rMPV-F3及rMPV-F4 (泳道1、2及3)均含有RSV F蛋白(而rMPV-空[泳道4]及wt MPV [泳道5]則不含)。圖7繪示受感染細胞中之RSV F蛋白表現之程度。如圖7中可見，rMPV-F1、rMPV-F3、rMPV-F4及wt rRSV均表現高含量之RSV F蛋白。圖8繪示受感染細胞中之rMPV G、rMPV N、rMPV P、rMPV F、rMPV NS1及rMPV NS2表現之程度。如圖8中可見，受感染細胞表現每一所測試之蛋白質，其中之一些係位於F蛋白***之下游。該等結果指示穩定***。 實例4

此實例展現本發明實施例之載體有效使MPV在恒河獼猴中減毒。

NIH國家過敏及傳染病研究所動物照護及使用委員會批准本文中所闡述之非人類靈長類動物實驗，其係根據來自Guide for the Care and Use of Laboratory Animals , The National Academies Press, Washington, D.C. (2011)之推薦來實施。測試八隻年輕成年恒河獼猴(恒河獼猴(Macaca mulatta ))以藉由單獨的PRNT₆₀ 分析確認其針對RSV及MPV二者為血清陰性。經由組合之鼻內及氣管內途徑，每一部位利用1.0 mL含有於L-15培養基(ThermoFisher Scientific)中稀釋之10⁶ PFU之rMPV-F1或rMPV-F3之接種物接種兩組獼猴(每組四隻)。在單獨研究中，將與用於rMPV載體之彼等相同的同類群組之四隻恒河獼猴接種7.0 log₁₀ PFU/部位之重組wt RSV毒株A2。所有四隻動物經預篩選均對RSV為血清陰性。每天進行臨床觀察。在第0天-第10天、第12天、第14天、第21天及第28天收集鼻咽(「NP」)拭子。在感染後第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天、第14天、第21天及第28天收集氣管灌洗(「TL」)樣品。藉由如上文所闡述之噬斑分析來分析NP及TL樣品以量化病毒脫落。為評價免疫原性，在免疫後第0天、第14天、第21天及第28天收集血清，且藉由PRNT₆₀ 分析RSV中和抗體及MPV中和抗體。

如下實施PRNT₆₀ (60%噬斑減少中和測試)。藉由在Vero細胞上分別使用RSV-GFP及MPV-GFP實施PRNT₆₀ 分析來分析血清樣品之RSV中和抗體及MPV中和抗體效價。在同一實驗中並行分析來自所有12隻經rMPV-F1、rMPV-F3或wt RSV免疫之動物之血清的RSV中和抗體含量。在使用之前，將血清樣品在56℃下培育30分鐘以使血清補體不活化。然後將血清之連續稀釋液與等體積之經稀釋RSV-GFP或MPV-GFP混合並在37℃下培育30 min。在10%天竺鼠補體(Lonza, Walkersville, MD)存在下實施RSV中和分析。MPV中和分析中不包括補體，此乃因其使病毒不活化。在感染後第6天，藉由在Typhoon成像儀(GE Healthcare, Piscataway, NJ)上進行掃描獲得RSV-GFP及MPV-GFP噬斑之影像，且計算PRNT₆₀ 。每一樣品係以一式兩份進行測試且將平均值報告為Log₂ PRNT₆₀ 。 表2. 來自利用所指示之rMPV-RSV F載體或利用wt RSV接種之恒河獼猴上呼吸道之鼻咽拭子樣品之病毒效價

第10天後之時間點不具有可檢測到之病毒且未示出。檢測下限為0.7 log₁₀ PFU/mL。不具有任何可檢測到之病毒之樣品表示為「---」。「脫落天數」指示在檢測到病毒之第一天至最後一天所跨越之時間段，包括其間之負天數(若存在)。 表3. 來自利用所指示之rMPV-RSV F載體或利用wt RSV接種之恒河獼猴下呼吸道之氣管灌洗樣品之病毒效價

第8天後之時間點不具有可檢測到之病毒且未示出。不具有任何可檢測到之病毒之樣品表示為「---」。檢測下限為0.7 log₁₀ PFU/mL。「脫落天數」指示在檢測到病毒之第一天至最後一天所跨越之時間段，包括其間之負天數(若存在)。 表4. 自利用rMPV載體接種之恒河獼猴上呼吸道及下呼吸道收集之樣品中表現RSV F之噬斑形成單位(PFU)之百分比

藉由Vero細胞上之螢光雙重染色噬斑分析來分析在鼻內免疫後之指示日所收集之鼻咽拭子及氣管灌洗樣品以測定在活體內病毒複製期間共表現RSV F及MPV抗原之病毒PFU之百分比。該等百分比值係自每種樣品大約個100噬斑來測定。不具有任何可檢測到之病毒之樣品表示為「---」。未收集樣品之日指定為「nc」。 表5. 來自經rMPV-RSV-F載體或經wt RSV免疫之恒河獼猴的血清樣品之RSV 60%噬斑減少中和效價(PRNT₆₀ )

RSV PRNT₆₀ 分析之檢測下限為3.3 (log₂ 60%效價)。log₂ PRNT₆₀ 值≥ 5.3之RSV血清樣品視為陽性。 表6. 來自經rMPV-RSV F載體免疫之恒河獼猴的血清樣品之MPV 60%噬斑減少中和效價(PRNT₆₀ )

(PRNT₆₀ )分析之檢測下限為3.3 (log₂ 60%效價)。log₂ PRNT₆₀ 值≥ 5.3之MPV血清樣品視為陽性。

如表2-6中可見，兩種病毒(rMPV-F1及rMPV-F3)均在上呼吸道及下呼吸道中以低水準複製，維持穩定之RSV F表現，且以與由以高5至25倍效價複製之wt RSV所誘導之彼等類似之高含量誘導RSV中和血清抗體。此研究展現rMPV為RSV F蛋白之表現提供高度減毒但具有免疫原性之載體，其在未受RSV影響及經歷RSV之群體中具有潛在應用。

本文中所引用之所有參考文獻(包括出版物、專利申請案及專利)均係以引用的方式併入本文中，其併入程度如同將每一參考文獻個別且特定指示以引用方式併入本文中且其全文列示於本文中一般。

除非本文另有指示或上下文明顯矛盾，否則在闡述本發明之上下文(尤其在以下申請專利範圍之上下文)中術語「一(a及an)」及「該」及「至少一種」及類似指示物之使用均應解釋為涵蓋單數及複數二者。除非本文另有指示或上下文明顯矛盾，否則緊接著一或多個物項之列表使用之術語「至少一者」(例如，「A及B中之至少一者」)應解釋為意指選自所列示物項中之一個物項(A或B)或所列示物項中之兩者或更多者之任一組合(A及B)。除非另有註明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應解釋為開放式術語(即，意指「包括(但不限於)」)。除非本文另有指示，否則本文中所列舉之值之範圍僅意欲作為個別提及此範圍內之每一單獨值之速記方法，且每一單獨值係如同在本文中個別列舉一般併入本說明書中除非本文另有指示或上下文另外明顯矛盾，否則本文所闡述之所有方法均可以任何適宜順序來實施。除非另外主張，否則本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「例如(such as)」)均意欲僅更佳地闡釋本發明且不應對本發明之範圍構成限制。本說明書中之任何語言均不應解釋為指示任何未主張要素對於本發明實踐係必需的。

本文中闡述本發明之較佳實施例，包括本發明者已知用於實施本發明之最佳模式。熟習此項技術者在閱讀上述說明後可明瞭彼等較佳實施例之變化形式。本發明者期望熟習此項技術者適當採用此等變化形式，且本發明者期望本發明可以不同於本文所特定闡述之方式實踐。因此，本發明包括適用法律所容許之本文隨附申請專利範圍中所陳述標的物之所有修改形式及等效形式。此外，除非本文另有指示或上下文另外明顯矛盾，否則在其所有可能之變化形式中，上述要素之任一組合均涵蓋於本發明內。

圖1繪示顯示rMPV反基因體之圖，該等rMPV反基因體在第一(F1)、第三(F3)或第四(F4)基因位置中含有作為超數基因增添之RSV F基因。MPV基因顯示為未填充之矩形，且RSV F基因顯示為陰影矩形。MPV基因起始(「GS」)及基因終止(「GE」)轉錄信號分別由未填充及填充之條形指示，其在每一基因兩側，包括超數RSV F基因。在RSV F ORF兩側之核苷酸序列示於每一基因圖下，其中鑑別以下特徵：RSV F ORF (由陰影框表示)、GS及GE轉錄信號(以粗體顯示)、基因間隔區(「IG」)及位於RSV F ORF上游以促進有效轉譯之「Kozak」序列(以雙下劃線顯示，SEQ ID NO: 63)。

圖2繪示雙重染色噬斑分析之結果，其圖解說明rMPV載體表現RSV F之穩定性。簡言之，將Vero細胞與P1病毒儲備液之連續稀釋液一起接種，且在0.8%甲基纖維素覆蓋下培育四天。將單層固定且使用特異性抗體、隨後相應之紅外染料偶聯二級抗體探測RSV F及MPV抗原。RSV F及MPV抗原分別呈綠色及紅色，且在合併時呈黃色。選擇一個代表來自四個獨立實驗之結果之影像。在標記為「MPV抗原」之上排平板中，灰度指示紅色。在標記為「RSV F」之中排平板中，灰度指示綠色。在標記為「合併」之底排平板中，在行「rMPV-F1」、「rMPV-F4」及「rMPV-F3」下之平板中，灰度指示黃色。在標記為「合併」之底排平板中，在行「rMPV-空」下之平板中，灰度指示紅色。

圖3繪示rMPV-RSV-F載體在人類A549肺上皮細胞中之多循環生長動力學。利用rMPV-F1 (具有三角形之虛線)、rMPV-F3 (具有空心圓圈之點線)、rMPV-F4 (具有×之實線)或rMPV-空(具有實心黑色圓圈之實線)以0.1個噬斑形成單位(「PFU」，感染性病毒顆粒數量之量度)/細胞之感染複數(「MOI」)感染A549細胞之複製培養物。以24小時間隔藉由刮擦及渦旋收穫兩個培養物/病毒/細胞系，且製備澄清上清液並進行急凍。隨後藉由噬斑分析以一式兩份測定病毒效價。感染後天數係在x軸上，且log₁₀ PFU/ml係在y軸上。數據顯示為平均值及平均值之標準誤差，但在許多情形下誤差槓被給出小的誤差邊際之符號遮擋。檢測限為0.7 log₁₀ PFU/mL (點線)。

圖4繪示rMPV-RSV-F載體在Vero細胞中之多循環生長動力學。利用rMPV-F1 (具有三角形之虛線)、rMPV-F3 (具有空心圓圈之點線)、rMPV-F4 (具有×之實線)或rMPV-空(具有實心黑色圓圈之實線)以0.1 PFU/細胞之MOI感染Vero細胞之複製培養物。以24小時間隔藉由刮擦及渦旋收穫兩個培養物/病毒/細胞系，且製備澄清上清液並進行急凍。隨後藉由噬斑分析以一式兩份測定病毒效價。感染後天數係在x軸上，且log₁₀ PFU/ml係在y軸上。數據顯示為平均值及平均值之標準誤差，但在許多情形下誤差槓被給出小的誤差邊際之符號遮擋。檢測限為0.7 log₁₀ PFU/mL (點線)。

圖5繪示利用rMPV-RSV-F載體感染Vero細胞後之細胞病變效應。利用所指示之rMPV-RSV-F載體、空載體或wt rRSV以10 PFU/細胞之MOI感染Vero細胞單層或模擬感染Vero細胞單層。將培養物在32℃下培育96小時，且在200×放大率下進行光顯微照相術。所示影像代表兩個獨立實驗。經模擬感染及rMPV-空感染之細胞未顯示任何感染跡象，而經wt RSV、rMPV-F1、rMPV-F3及rMPV-F4感染之細胞顯示明顯的病毒感染跡象。

圖6繪示用於評估RSV F蛋白及rMPV蛋白在受感染細胞中之表現之西方墨點(Western blot)之結果。使用來自圖5中所示實驗之受感染細胞，在接種後96小時(「hpi」)製備細胞溶解物。對變性且經還原之溶解物進行西方墨點分析。如圖6中可見，rMPV-F1、rMPV-F3及rMPV-F4 (泳道1、2及3)均含有RSV F蛋白(而rMPV-空[泳道4]及wt rMPV [泳道5]則不含)。

圖7繪示受感染細胞中之RSV F蛋白表現之程度。利用小鼠單株抗體檢測RSV F蛋白。蛋白質條帶之量化圖係來自圖6中所示之西方墨點分析，且代表三個獨立實驗。相對RSV F蛋白表現係在y軸上，且將載體列示在x軸上。顯示標準誤差。如圖7中可見，rMPV-F1、rMPV-F3、rMPV-F4及wt rRSV均表現高含量之RSV F蛋白。

圖8繪示受感染細胞中之rMPV G、rMPV N、rMPV P、F、rMPV NS1及rMPV NS2蛋白表現之程度。利用針對蔗糖梯度純化之rMPV病毒粒子產生的超免疫血清檢測MPV G、MPV N及MPV P蛋白。利用針對僅表現MPV F蛋白之重組牛痘病毒產生的兔多株抗血清檢測MPV F蛋白。利用各自針對源自各別蛋白質之合成肽產生的個別兔超免疫血清檢測MPV NS1及MPV NS2蛋白。將微管蛋白作為加載對照進行探測且用於正規化每一樣品。蛋白質條帶之量化圖係來自圖5中所示之相同實驗，且代表三個獨立實驗。每一蛋白質之相對表現係在y軸上，且將載體列示在x軸上。顯示標準誤差。星號指示統計顯著性(p值小於0.05)。如圖8中可見，受感染細胞表現每一所測試之蛋白質。

Claims (48)

1. 一種活的非人類單股反鏈病毒目(Mononegavirales )嵌合載體，其可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質。
2. 如請求項1之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體之天然宿主係非人類動物。
3. 如請求項1或2之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體之天然宿主係來自囓齒目(Rodentia )。
4. 如請求項1至3中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體係鼠類肺炎病毒(murine pneumonia virus , MPV)。
5. 如請求項1至4中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係細菌或病毒。
6. 如請求項1至5中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係病毒。
7. 如請求項1至6中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係人類肺泡病毒科(Pneumoviridae )病毒。
8. 如請求項1至7中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係正肺炎病毒(Orthopneumovirus )。
9. 如請求項1至8中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種病原體係人類呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus , RSV)。
10. 如請求項1至9中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種蛋白質係RSV F蛋白。
11. 如請求項1至10中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體包含與SEQ ID NO. 56具有至少90%序列一致性之序列。
12. 如請求項1至10中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體包含與SEQ ID NO. 58具有至少90%序列一致性之序列。
13. 如請求項1至9中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種蛋白質係RSV G蛋白。
14. 如請求項1至13中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 60具有至少90%序列一致性之序列。
15. 如請求項1至13中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 61具有至少90%序列一致性之序列。
16. 如請求項1至13中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 62具有至少90%序列一致性之序列。
17. 一種組合物，其包含如請求項1至16中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體及醫藥上可接受之載劑。
18. 如請求項17之組合物，其中該組合物經調配用於鼻內投與。
19. 一種如請求項1至16中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體或如請求項17或18之組合物之用途，其用於製造用於引發對至少一種人類病原體之免疫反應的藥劑。
20. 如請求項19之用途，其中該藥劑用於在未患有人類肺泡病毒科病毒感染之人類中引發對至少一種人類病原體之免疫反應。
21. 如請求項19或20之用途，其中該藥劑用於在未患有人類呼吸道融合病毒(RSV)感染之人類中引發對至少一種人類病原體之免疫反應。
22. 如請求項19至21中任一項之用途，其中該非人類單股反鏈病毒目載體係鼠類肺炎病毒(MPV)。
23. 一種製備可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體之方法，其包含： (a) 在非人類單股反鏈病毒目載體中***編碼來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之非天然基因。
24. 一種用於引發免疫反應之套組，該套組包含： (a) 如請求項17或18之組合物；及 (b) 至少一個用於容納該組合物之容器。
25. 一種活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體，其可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質。
26. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體之天然宿主係非人類動物。
27. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體之天然宿主係來自囓齒目。
28. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體係鼠類肺炎病毒(MPV)。
29. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係細菌或病毒。
30. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係病毒。
31. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係人類肺泡病毒科病毒。
32. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種人類病原體係正肺炎病毒。
33. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種病原體係人類呼吸道融合病毒(RSV)。
34. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種蛋白質係RSV F蛋白。
35. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體包含與SEQ ID NO. 56具有至少90%序列一致性之序列。
36. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該非人類單股反鏈病毒目載體包含與SEQ ID NO. 58具有至少90%序列一致性之序列。
37. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其中該至少一種蛋白質係RSV G蛋白。
38. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 60具有至少90%序列一致性之序列。
39. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 61具有至少90%序列一致性之序列。
40. 如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體，其包含與SEQ ID NO: 62具有至少90%序列一致性之序列。
41. 一種組合物，其包含如請求項25之非人類單股反鏈病毒目載體及醫藥上可接受之載劑。
42. 如請求項41之組合物，其中該組合物經調配用於鼻內投與。
43. 一種如請求項25至40中任一項之非人類單股反鏈病毒目載體或如請求項41或42之組合物之用途，其用於製造用於引發對至少一種人類病原體之免疫反應之藥劑。
44. 如請求項43之用途，其中該藥劑用於在未患有人類肺泡病毒科病毒感染之人類中引發對至少一種人類病原體之免疫反應。
45. 如請求項43之用途，其中該藥劑用於在未患有人類呼吸道融合病毒(RSV)感染之人類中引發對至少一種人類病原體之免疫反應。
46. 如請求項43之用途，其中該非人類單股反鏈病毒目載體係鼠類肺炎病毒(MPV)。
47. 一種製備可以使細胞表現來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之活的非人類單股反鏈病毒目嵌合載體之方法，其包含： (a) 在非人類單股反鏈病毒目載體中***編碼來自至少一種人類病原體之至少一種蛋白質之非天然基因。
48. 一種用於引發免疫反應之套組，該套組包含： (a) 如請求項42之組合物；及 (b) 至少一個用於容納該組合物之容器。

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