TW201927335A - 防止雙硫鍵於細胞培養收集物中還原之方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露係有關一種防止重組宿主細胞中所表現多肽中之雙硫鍵還原之方法，其包括在發酵後，添加磷酸鹽至重組宿主細胞之收集溶液中，其中多肽中之雙硫鍵保持未還原。

Description

防止雙硫鍵於細胞培養收集物中還原之方法
本揭露係有關一種防止重組宿主細胞中所表現多肽中之雙硫鍵還原之方法，其包括在發酵後，添加磷酸鹽至重組宿主細胞之收集溶液中，其中多肽中之雙硫鍵保持未還原。
生物醫藥工業使用細胞培養物生產各種不同醫療性蛋白質。可利用多種不同細胞型態(包括原核生物與真核生物)來表現重組醫療性蛋白質。該生物醫藥工業極度依賴哺乳動物細胞，因為其等有能力生產適當折疊及轉譯後修飾之蛋白質。醫療性蛋白質之製造通常從在生物反應器中培養細胞開始。要追蹤各種不同營養素與製程參數來確保最佳細胞生長及蛋白質製造。醫療性蛋白質通常為分泌性，因此在收集蛋白質時，第一個步驟即需排除細胞。在生物反應器中及在排除細胞期間，細胞可被溶解，釋出之組份可能改變或降解重組蛋白質。例如：收集物中之酵素及其他組份可能還原雙硫鍵。由於完整雙硫鍵對維持蛋白質結構與功能很重要，因此防止雙硫物還原之方法受到極大重視。
本實施例提供一種防止重組宿主細胞中所表現多肽中之雙硫鍵還原之方法，其包括在發酵後，添加磷酸鹽至重組宿主細胞之收集溶液中，其中多肽中之雙硫鍵保持未還原。
習此相關技藝者咸了解，下文所說明圖示僅供例示說明之目的。該等圖示並無意以任何方式限制本文教示或申請專利範圍。
圖1顯示使用計畫1收集物(表現IgG2之CHOK1-SV細胞)與改變磷酸鈉濃度(pH7.0)之雙硫物還原分析法。
圖2：使用計畫2收集物(表現IgG1之CHO-M細胞)與改變磷酸鈉濃度(pH7.0)之雙硫物還原分析法。
圖3(A)顯示加至TFPI收集物中以防止抗體還原之各種不同磷酸鹽濃度。
圖3(B)顯示重覆實驗3(A)，其顯現加至TFPI收集物中以防止抗體還原之各種不同磷酸鹽濃度之相同結果。
本揭露提供一種方法，其係有關防止多肽之雙硫鍵還原。
定義 定義
適當時，所採用之單數名詞亦將包括複數，反之亦然。若下文所示任何定義與任何其他文獻(包括本文以引用方式併入之任何文獻)中之名詞用法牴觸時，為了闡釋本說明書及其相關申請專利範圍，將一律以下文所示定義為主，除非另有詳細說明之相反定義(例如：首次使用該術語之原始文獻)。「或」意指「與/或」，除非另有其他說明。本文中「一」之用法意指「一或多個」，除非另有其他說明或「一或多個」之用法顯著不洽當時。「包含」、「涵括」、「含有」、「包括(include、includrs、與including)」係可交換使用，並且沒有限制。例如：術語「包括」應意指「包括(但不限)」。
本文所採用術語「TFPI」係指TFPI之任何變體、同型、及/或物種同源物，其係呈細胞天然表現之型式且存在於胞漿中。
本文所採用術語「TFPI」係指活化型TFPI，本文所採用「抗體」係指完整抗體與其任何抗原結合片段(亦即「抗原結合性部份」)或其單鏈。該術語包括全長免疫球蛋白分子(例如：IgG抗體)，其係天然發生 或由正常免疫球蛋白基因片段重組過程形成、或為免疫球蛋白分子之免疫活性部份，如：保留專一結合活性之抗體片段。不論其結構，抗體片段會與被全長抗體辨識之相同抗原結合。例如：抗-TFPI單株抗體片段會與TFPI之抗原決定基結合。抗體之抗原結合性功能可由全長抗體之片段執行。抗體之「抗原結合性部份」術語所涵括之結合性片段實例包括(i)Fab片段，係由VL、VH、CL與CH1功能域組成之單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包含兩個Fab片段，利用在鉸鏈區之雙硫橋鍵連結之二價片段；(iii)Fd片段，係由VH與CH1功能域組成；(iv)Fv片段，係由抗體之單臂之VL與VH功能域組成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其係由VH功能域組成；(vi)單離之互補決定區(CDR)；(vii)迷你抗體、二價抗體、三價抗體、四價抗體、與κ抗體(參見例如：Ill等人，Protein Eng 1997；10：949-57)；(viii)駱駝IgG；與(ix)IgNAR。此外，雖然Fv片段之兩個功能域(VL與VH)係由分開的基因編碼，但其等可以採用重組法，利用可以將其等製成單一蛋白質鏈之合成連接子接合，使其中VL與VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如：Bird等人(1988)Science 242：423-426；與Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此等單鏈抗體亦計畫包括在抗體之術語「抗原結合性部份」內。此等抗體片段係採用彼等習此相關技藝者常用之方法得到，依完整抗體之相同方式分析該片段之用途。
此外，抗體擬似物計畫包括抗原結合片段。本文所採用術語「抗體擬似物」或「擬似物」意指具有類似抗體結合性之蛋白質，但其係較小型之替代抗體或非抗體蛋白質。此等抗體擬似物可以包含在主幹中。術語「主幹」係指供工程處理新產物賦與訂製功能與特性之多肽平台。
本文所採用術語「抗-TFPI抗體」係指專一性結合其抗原決定基與其肝素相關複合物之抗體。當於活體內結合TFPI之抗原決定基時，本文所揭示抗-TFPI抗體可加強凝血級聯反應之一或多個態樣。
本文所採用術語「抑制結合」與「阻斷結合」(例如：提及抑制/阻斷TFPI受質與TFPI之結合時)可以交換使用並同時包括部份及完全抑制或阻斷蛋白質與其受質之結合，如：抑制或阻斷至少約10%、約20%、 約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或約100%。本文所採用「約」意指所示數值+/- 10%。
TFPI受質與TFPI之結合性提及術語抑制及/或阻斷時，抑制與阻斷亦包括當TFPI與抗-TFPI抗體接觸時相較於TFPI不與抗-TFPI抗體接觸時，TFPI與生理性受質之結合親和性之任何可檢測之下降程度，例如：使TFPI與其受質之交互作用受阻斷至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或約100%。
本文所採用術語「單株抗體」或「單株抗體組成物」係指單一分子組成物之抗體分子製劑。單株抗體組成物對特定抗原決定基展現單一結合專一性與親和性。因此，術語「人類單株抗體」係指具有衍生自人類胚原免疫球蛋白序列之變區與恆定區且展現單一結合專一性之抗體。人類抗體可包括不由人類胚原免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如：於活體外之隨機或定點誘變法引進之突變或於活體內之突變)。
本文所採用「單離抗體」係意指該抗體實質不含其他生物分子(包括具有不同抗原專一性之抗體)(例如：會與TFPI結合之單離抗體實質上不含會與TFPI以外之抗原結合之抗體)。有些實施例中，單離抗體之純度為至少約75%、約80%、約90%、約95%、約97%、約99%、約99.9%、或約100%乾重比。有些實施例中，可採用如：管柱層析法、聚丙烯醯胺凝膠電泳法、或HPLC分析等方法測定純度。然而，會與人類TFPI之抗原決定基、同型或變體結合之單離抗體會與其他相關抗原(例如：來自其他物種(例如：TFPI物種同源物)具有交叉反應性。此外，單離抗體可為實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。本文所採用「專一結合性」係指抗體與預定抗原之結合性。通常，具有「專一結合性」之抗體與抗原之親和性為至少約10-5M(？)，且其與該抗原之結合親和性比其與不相關抗原(例如：BSA、酪蛋白)之結合親和性高出例如：至少2倍。片語「辨識抗原之抗體」與「抗原之專一性抗體」可在本文中與術語「與抗原專一性結合之抗體」交換使用。本文所採用術語「最小 結合性」係指抗體不會結合特定抗原及/或與特定抗原之親和性低。通常，與抗原具有最小結合性之抗體與該抗原結合之親和性低於約102M-1且其與預定抗原結合之親和性不會高於其與不相關抗原結合之親和性
本文所採用術語對抗體(如：IgG抗體)之「高親和性」，係指結合親和性為至少約10-7M，至少一項實施例為至少約10-8M，有些實施例為至少約109M-1、1010M-1、1011M-1或更高，例如：高達1013M-1或更高。然而「高親和性」結合性可以隨其他抗體同型變化。例如：對IgM同型之「高親和性」結合性係指至少約107M-1之結合親和性。
本文所採用「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如：IgM或IgG1)。
「互補決定區」或「CDR」係指抗體分子重鏈可變區或輕鏈可變區內之三個高變區其中一個區，形成與結合抗原之三級結構互補之N-末端抗原結合性表面。從重鏈或輕鏈之N-末端開始，此等互補決定區分別稱為「CDR1」、「CDR2」、與「CDR3」[Wu TT,Kabat EA,Bilofsky H,Proc Natl Acad Sci U S A.1975 Dec；72(12)：5107與Wu TT,Kabat EA,J Exp Med.1970 Aug 1；132(2)：211]。CDR涉及抗原-抗體結合，CDR3包含針對抗原-抗體結合之獨特區。因此抗原結合性位點可包括六個CDR，包含來自每一個重鏈與輕鏈V區之CDR區。術語「抗原決定基」係指與抗體專一性結合或交互反應之抗原部位或區域，在有些實施例中，抗原係與抗體物理性接觸。反之，術語「互補位」係指抗體上與抗原專一性結合之部位或區域。具有競爭結合性特徵之抗原決定基若與對應抗體之結合性相互獨佔時(亦即一種抗體之結合同時排擠另一種抗體之結合)，則稱該等抗原決定基重疊。若抗原可以同時接納對應抗體之結合時，則稱彼等抗原決定基分開(獨立)。
本文所採用術語「競爭抗體」係指與本文所說明針對TFPI之抗體結合在約相同、實質上相同或基本上相同、或甚至相同之抗原決定基上之抗體。「競爭抗體」包括具有重疊抗原決定基專一性之抗體。競爭抗體因此可以與本文所說明抗體有效地競爭結合TFPI。有些實施例中，競爭抗體可與本文所說明抗體結合在相同抗原決定基。或者另一個觀 點，競爭抗體具有與本文所說明抗體相同之抗原決定基專一性。
本文所採用「保留性取代」係指多肽之修飾涉及以一或多個胺基酸取代具有類似生化性質之胺基酸，因此不會造成多肽之生物或生化功能喪失。「保留性胺基酸取代」係指其中胺基酸殘基被具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已於相關技藝中定義。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如：離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈之胺基酸(例如：天冬胺酸、麩胺酸)、無電荷極性側鏈之胺基酸(例如：甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈之胺基酸(例如：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈之胺基酸(例如：蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、與芳香系側鏈之胺基酸(例如：酪胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。本揭露之抗體可具有一或多個保留性胺基酸取代且仍保有抗原結合活性。
核酸與多肽之術語「實質上同源性」係指兩個核酸或兩個多肽、或其指定序列，當在最佳排比且比對下，在適當核苷酸或胺基酸嵌插或缺失下，一致之核苷酸或胺基酸為至少約80%。通常為至少約85%，有些實施例為90%、91%、92%、93%、94%、或95%，至少一項實施例為至少約96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、或99.5%之核苷酸或胺基酸，或者，當核酸之節段在選擇性雜交條件下可與股之補體雜交時，則具有實質上同源性。亦包括與本文所示特定核酸序列及胺基酸序列具有實質上同源性之核酸序列與多肽序列。兩個序列之間之同一性百分比為序列共有之相同位置數量之函數(亦即同源性%=相同位置#/總位置# x 100)，必需引進所考量之空位數、各空位之長度，以供兩個序列達最佳排比。可採用數學演算法，如(但不限於)：VectorNTITM之AlignXTM模組(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)進行序列比對及決定兩個序列之間之同一性百分比。採用AlignXTM時，多重排比之內設參數為：空位開放罰分：10；空位延伸罰分：0.05；空位分離罰分範圍：8；推遲排比之同一性%：40。
兩個序列之間之同一性百分比為序列共有之相同位置數量之函數(亦即同源性%=相同位置#/總位置# x 100)，必需引進所考量之空位 數、各空位之長度，以供兩個序列達最佳排比。可採用數學演算法，如(但不限於)：VectorNTITM之AlignXTM模組(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)進行序列比對及決定兩個序列之間之同一性百分比。採用AlignXTM時，多重排比之內設參數為：空位開放罰分：10；空位延伸罰分：0.05；空位分離罰分範圍：8；推遲排比之同一性%：40。(進一步詳情可參見http：//www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEACommunities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html)。
另一種測定查詢序列(本揭露之序列)與主序列之最佳完整匹配之方法亦稱為整體序列排比，可採用CLUSTALW電腦程式測定(Thompson等人，Nucleic Acids Research,1994,2(22)：4673-4680)，其係依據Higgins等人之演算法(Computer Applications in the Biosciences(CABIOS),1992,8(2)：189-191)。在序列排比中，查詢序列與主序列均為DNA序列。該整體序列排比之結果係以同一性百分比表示。可用於DNA序列之CLUSTALW排比，經由配對排比計算同一性百分比之參數為：矩陣=IUB，k-元組(k-tuple)=1，頂部對角線數=5，空位罰分=3，空位開放罰分=10，空位延伸罰分=0.1，多重排比時，可採用下列CLUSTALW參數：空位開放罰分=10，空位延伸罰分=0.05；空位分離罰分範圍=8；推遲排比之同一性%=40。
核酸可以出現在完整細胞中、溶胞液中、或呈部分純化或實質純化型。當核酸從通常在自然環境與其相聯之其他細胞組份中純化出來時，則為「單離」或「達成實質上純」。為了單離核酸，可採用如下列之標準技術：鹼/SDS處理、CsCl密度分離法(CsCl banding)、管柱層析法。
本文所採用術語「約」係指所提供單位值+/- 10%。
本文所採用術語「實質上」係指具有所需特徵或性質之總程度或約略程度之定量條件。習此生物相關技藝者咸了解，生物與化學現象即使有，也很少達成或避免絕對結果，因為許多變數會影響生物與化學組成物及材料之試驗、製造與儲存，且因為生物與化學組成物及材 料之試驗、製造與儲存所使用之儀器與設備會有固有誤差。因此本文所採用術語「實質上」係涵括許多生物與化學現象中固有之缺乏完整可能性。
實例1-材料
細胞培養液係採用標準製造程序製造。簡言之，取表現抗體之CHO細胞於振盪瓶中培養，直到達到足以接種2L或5L玻璃攪拌槽生物反應器之細胞數量。接種後，控制溶氧量、pH、溫度、與攪動速率，並每天取樣分析以確保準確性。接種後2天，開始連續添加濃縮之營養素進料，依需要添加葡萄糖溶液，以提供充份營養素。接種後14天，收集細胞培養液。所有試劑均來自Sigma Aldrich，除非另有說明。MabSelect Sure樹脂得自GE Healthcare Life Sciences。
實例2-製備澄清收集物
為了產生澄清收集物，依序使用PDK5深層過濾器(Pall)與無菌0.2uM濾器(Pall)，從所收集之細胞培養液中排除細胞。
實例3-小規模還原分析法
取收集之細胞培養液置入填充氮氣之手套袋(Atmosbag,Sigma)中。將40mL收集物倒至冰上之50mL錐形管中，冷卻20min。收集物隨後於冰上進行音波處理(Sonic Dismembrator Model 100,Fisher Scientific)，在功率3下60秒。此設定造成約99%細胞溶解。錐形管緊閉密封，從袋中取出，於4000 x g下離心15分鐘。隨後將管子送回袋中，再使用氮氣吹掃。溶胞上清液使用0.45um無菌濾器(Milipore)過濾，移至96深孔分析盤中。取溶胞上清液於室溫下，在沒有曝露到氧氣下培養。在每一個時間點，使用17.4uL 250mM NEM淬滅200uL樣本之反應，以封阻所有游離硫醇。取淬滅反應之樣本存放在4C下，直到純化及/或分析為止。為了測試抑制劑，在開始培養時，取3M磷酸鈉(pH 7.0)儲備母液加至溶胞上清液中，達成濃度範圍0至190mM。取樣本，在添加抑制劑後0、24、與48小時淬滅反應。
實例4-批次蛋白質A純化法
採用MabSelect Sure親和性樹脂純化所收集細胞培養液中之抗體。平衡緩衝液為50mM Tris、50mM NaCl(pH 7.0)。洗滌緩衝液為50mM乙酸鈉、1M NaCl(pH 5.2)。溶離緩衝液為50mM乙酸鈉(pH 3.7)，及中和緩衝液為1M Tris(pH 8.0)。在96孔過濾盤中，取20uL樹脂漿液(50% v/v含於平衡緩衝液中)與170uL已淬滅反應之收集細胞培養液組合。分析盤培養30min後，在下方使用96孔盤，離心收集流出液，棄置不要。所有離心步驟均在4000 x g下進行10分鐘。使用120uL洗滌緩衝液洗滌樹脂，離心後，使用120uL平衡緩衝液洗滌，及再度離心。經過兩個洗滌步驟後，添加50uL溶離緩衝液至過濾盤中，培養3min。在透明96孔盤中準備28uL中和緩衝液，用於收集溶出液。上下抽吸混合抗體溶液後，存放在-70C下，直到分析為止。
實例5-毛細管分析法
採用Caliper LabChip GX II取得毛細管電泳測定值。依據製造商之指示製備樣本。採用LabChip GX軟體取得凝膠狀數位影像。
結果與討論
由所收集細胞培養液在無氧環境下完全溶解細胞，進行還原試驗。此舉可達到最大釋放細胞內還原性組份、最小氧氣干擾、及防止雙硫物被氧氣再度氧化。此舉可以使還原抑制劑在「最壞情況下」或最可能還原條件下測試。藉由從溶胞液中純化抗體，並採用非還原性毛細管電泳法，依據分子大小分離蛋白質，並可檢測鏈內雙硫鍵***，即可隨時間監測抗體雙硫物還原。
為了測試磷酸鹽在防止雙硫物還原上之效力，使用各種不同濃度之磷酸鈉(pH 7)，加至計畫1(表現IgG2之CHOK1-SV細胞)與計畫2(表現IgG1之CHO-M)之厭氧性溶胞培養收集物中，其結果示於圖1與圖2。持續6、24、與48小時防止還原之磷酸鹽最小濃度綜合說明於表1。計畫2需要更高濃度之磷酸鹽才可防止還原。理論上，此點 可能歸因於IgG1分子比IgG2分子容易還原，或這兩種細胞株中還原酵素之表現程度不同。此分析法測定在最高還原條件下(所有細胞內還原組份均釋出而且沒有添加氧氣)之抑制劑濃度。較低濃度可能足以在更實際之澄清收集物條件下防止還原。較高濃度之磷酸鹽亦有效。
磷酸鹽為一種有效之手段，因為其價廉、無毒、且已常用於蛋白質A層析法期間之純化過程中。在常用為緩衝液，不視其為酵素抑制劑下，反而達成意外效益與實施例。
相當奇蹟且意外地發現，藉由添加磷酸鈉至收集之細胞培養液(HCCF)中，即可防止抗體雙硫物還原。當添加緩衝液來控制某些雙硫物還原實驗之pH時(因為氮氣會驅除CO2)，意外地發現本發明。原本無意使用磷酸鹽(即使其適用為pH 7之緩衝液)，因為已知其會抑制有些酵素反應。低濃度(40mM)不會防止還原，而高濃度(150mM)則完全防止還原(見圖3(A))。使用同一批TFPI收集物，在多個時間點重覆實驗(見圖3(B))。理論上可以藉由抑制收集物中造成還原之酵素而達成效果。
實驗A：
添加磷酸鈉之濃縮溶液至TFPI收集物中，達到磷酸鹽濃度0、40mM與150mM(見表2)。然後讓收集物維持在氮氣下(防止氧氣抑制)24小時。經過氮氣維持後，純化抗體，並採用毛細管電泳法分析雙硫物還原度。
磷酸鹽溶液可為磷酸鈉、磷酸鉀等等。亦可添加無水磷酸鹽。可以添加磷酸鹽至細胞培養基中、收集前之細胞培養液、或已收集之細胞培養液中。應適用於哺乳動物細胞、細菌、酵素等等所生產之蛋白質。不僅抗體，應適用於任何具有雙硫鍵之蛋白質。相較於先前技藝在防止還原上之作法(添加金屬、添加麩胱甘肽、空氣/O2吹掃法等等)上，磷酸鹽為一大躍進，因為其價廉、無毒、有效，而且已用於抗體製造過程中(磷酸鹽緩衝液常用於ProA層析法中)。由於其早已用於製程中，因此吾等已知磷酸鹽不會傷害抗體。
添加金屬來防止還原可能會負面影響抗體穩定性，因為其會誘發蛋白質沉澱(Li,Osborne等人2012)、氧化(Li,Nguyen等人1995；Masaraw等人2009)、及/或裂解(Rustandi與Wang 2001,Yan與Boyd 2011)。使用空氣或氧氣吹掃收集物可能增加蛋白質變性及/或聚集在空氣-液體界面上(Wiesbauer等人2013；Rudik等人2012)。由於磷酸鹽無毒性(不同於金屬)，因此不會危及患者安全性，且不需要清除試驗。此外，不需要特殊設備，此點與需要特殊收集槽之吹掃法相反。
雖然本實施例已參考明確實施例及實例說明，但應了解可以在不偏離附錄之申請專利範圍之精神與範圍下進行各種不同修飾與變化及改用等效物替代。因此本說明書與實例係舉例說明，並沒有限制的意義。此外，本文所提及所有文件、書、專利申請案與專利案之揭示內容均以引用之方式完整併入本文中。

Claims (16)

  1. 一種防止重組宿主細胞中所表現多肽中之雙硫鍵還原之方法，其包括在發酵後，添加磷酸鹽至重組宿主細胞之收集溶液中，其中多肽中之雙硫鍵保持未還原。
  2. 如請求項1之方法，其中該多肽包含抗體。
  3. 如請求項1之方法，其中該多肽包含該抗體之生物功能片段。
  4. 如請求項1之方法，其中該宿主細胞包含真核生物細胞。
  5. 如請求項4之方法，其中該真核生物細胞包含哺乳動物細胞。
  6. 如請求項5之方法，其中該哺乳動物細胞包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
  7. 如請求項1之方法，其中添加磷酸鹽至收集溶液中，使最終溶液在10-1000毫莫耳濃度範圍內。
  8. 如請求項1之方法，其中添加磷酸鹽至收集溶液中，使最終溶液在10-300毫莫耳濃度範圍內。
  9. 如請求項1之方法，其中該磷酸鹽包含選自由磷酸鈣、磷酸鈉、與磷酸鉀所組成群中之磷酸鹽。
  10. 如請求項2之方法，其進一步包含IgG抗體。
  11. 如請求項10之方法，其中IgG抗體包含IgG2。
  12. 如請求項10之方法，其中IgG抗體包含IgG1。
  13. 如請求項10之方法，其中IgG抗體包含IgG4。
  14. 如請求項1至3之方法，其進一步包括從已收集之細胞培養液(harvested cell culture fluid,HCCF)中回收多肽。
  15. 如請求項1至3之方法，其進一步包括從已收集之細胞培養液(HCCF)中純化多肽。
  16. 如請求項1之方法，其中該磷酸鹽為：(a)呈五水合物型或呈無水物型；(b)添加濃度為10-1000毫莫耳濃度之間；(c)添加濃度為10-300毫莫耳濃度之間；(d)添加濃度為10-100毫莫耳濃度之間；或 (e)添加濃度為該收集前或已收集之培養液中磷酸鹽濃度之至少約2倍。
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