TW201925234A - 抗huTNFR1治療非酒精性脂肪性肝炎 - Google Patents

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Abstract

一種特異性識別人類腫瘤壞死因子1 (human tumor necrosis factor 1，huTNFR1)之抗體，用於治療非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)及與其關聯之疾病。

Description

抗huTNFR1治療非酒精性脂肪性肝炎
本發明關於非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的新治療和與其關聯的疾病狀況。
非酒精性脂肪肝疾病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)代表在沒有酒精濫用的情況下發生的一系列疾病，並且包括非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis， NASH)。NAFLD在西方國家的發病率越來越高，並且對肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)的發展有著關鍵作用。
從良性肝脂肪變性到進行性脂肪性肝炎的順序之一個基本步驟係發生肝細胞之細胞死亡，歸類為細胞凋亡(apoptosis)。壞死性凋亡(necroptosis)已成為一種替代的計畫性細胞死亡途徑，並且發現其在NASH患者的肝臟中被活化（Gautheron等人，Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology 2015, 1:264-266）。
Aparicio-Vergara等人(Hepatology 2013, 57(2):566-576)描述TNFR1胞外域脫落(ectodomain shedding)在預防肝脂肪變性(hepatic steatosis)或胰島素抗性(insulin resistance)發展中的作用。TNFR1無法脫落不會造成小鼠肥胖、胰島素抗性、或肝脂肪變性。然而，包含非脫落突變(non-shedding mutation)的小鼠顯示朝向NASH快速進展。據發現TNFR1胞外域脫落之活化對於減弱向NASH的進展是關鍵的。
Cubero等人(Cell Death and Differentiation 2013, 20:1580-1592)描述肝細胞及免疫細胞中的TNFR1在慢性肝病的作用模式中具有不同的作用。
Tomita等人(Gut 2006, 55:415-424)描述TNFa/TNFR介導的傳訊(signaling)途徑之增強可在NASH動物模型中嚴重涉及肝纖維化的發病機理。
Yaron Ilan (AASLD Liver Learning.Ilan Y. Nov 8 2014; 60709)揭示用於治療脂肪肝疾病之基於抗TNF的口服免疫療法。將結合TNFα之抗TNF融合蛋白(PRX-106)用於高脂飲食小鼠模型。
藉由誘導模擬配體的反應，發現TNFR1的抗體具有促效潛力(agonistic potential)。該反應表明藉由多價TNF三聚體的結合使受體聚集引發訊息傳導(signal transduction)。
然而，TNFR1特異性抗體可實現TNFR1選擇性抑制。例如，單株鼠類抗體H398及US5736138中描述的抗體對人類TNFR1具有選擇性，顯示出對TNF介導的訊息傳導及細胞毒性有效抑制(Moosmayer等人1995, Ther.Immunol.2:31-40）。
WO2008/113515A2描述人源化版的H398。
WO2012035141揭示抗huTNFR1抗體，其缺乏介導效應物功能(effector function)。
單價(monovalent)抗huTNFR1抗體描述於WO2017174586 A1中。
Zettlitz等人（LandesBioscience 2010, 11月/12月：639-647）描述人源化TNFR1特異性拮抗性單株抗體的產生。
Richter等人(PLOS One 2013, 8(8):1-13)描述使用人源化拮抗性抗TNFR1抗體選擇性抑制TNFR1傳訊以降低TNF的發炎前驅因子活性(pro-inflammatory activity)，同時保持TNFR2不受影響。
Berger等人(Protein Engineering, Design & Selection 2013, 26(10):581-587)描述抗TNFR1 scFv-HAS融合蛋白作為TNF作用的選擇性拮抗劑。Feagins等人(Eur J Gastroenterol Hepatol.2015, 27(10):1154-1160)描述用腫瘤壞死因子抑制劑(TNFi)治療的患者發展為非酒精性脂肪肝疾病（NASH或脂肪變性）。
治療NASH的治療可能性是有限的，並且僅限於生活方式的改變，因為到目前為止還沒有具體的藥物。因此需要提供NASH的有效治療及與之關聯的疾病活動。
本發明的目的係提供NASH及個別疾病病況的改善治療。
該目的藉由本發明的主題來解決。
本發明提供特異性識別人類腫瘤壞死因子1 (huTNFR1)的抗體之新醫學用途，用於治療患有NASH及/或特別是與NASH關聯的任何疾病病況的患者，其中包括肝的脂肪變性、NAFLD疾病活動(NAS)、細胞凋亡、纖維化、以及高丙胺酸轉胺酶(alanine transaminase，ALT)及胰島素水平。因此，本發明為患有NASH的患者及與其關聯的疾病病況提供了新的醫學治療。
具體地，本發明提供了特異性識別huTNFR1的抗體，用於治療非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及與其關聯的疾病病況。
根據具體態樣，抗體係分離的抗體。
根據具體態樣，抗體係單株及/或重組抗體。
根據具體態樣，抗體特異性識別膜（－huTNFR1的遠端CRD1及/或CRD2之亞結構域A1）內之表位(epitope)，較佳地特異性識別huTNFR1的N端區域中由胺基酸1至115、或1至70所表示之表位。具體地，huTNFR1的序列經鑑定為SEQ ID NO：32。
根據具體實施例，抗體是單特異性、二價(bivalent)全長抗體，或抗原結合(antigen-binding)的抗體片段。
根據另一具體實施例，抗體是huTNFR1的單價結合劑(binder)，其僅包含一個具有結合huTNFR1之特異性的抗原結合位點(antigen binding site)。具體地，抗體單價地識別huTNFR1。
根據具體實施例，抗體係選自由下列所組成之「單價抗體」群組：Fab分子、scFv分子、單一可變結構域、雙硫鍵穩定之Fv (disulfide-stabilized Fv，dsFv)、半IgG1抗體、及Fv結構域、或任何前述者之功能活性衍生物；較佳地其中抗體建構體(construct)與諸如PEG之親水性聚合物偶聯、及/或與多肽（諸如人類（或小鼠）血清白蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白結合結構域或肽、Ig結合結構域或肽、PEG模擬多肽延伸、抗體Fc片段、攜帶突變之抗體Fc片段）融合以允許較佳之異源二聚合(heterodimerization)（勝於同源二聚合(homodimerization)）、或與任何前述多肽之功能性變異體融合。
具體地，抗體係Fab、scFv、dsFv、或Fv結構域中之任一者，其與抗體Fc片段融合，其中Fc由CH2及CH3結構域的異二聚體(heterodimer)組成，其中CH2及/或CH3結構域攜帶一或多個點突變，該等點突變允許優先異源二聚合而非同源二聚合。具體地，修飾Fc中之一個或兩個CH3結構域以改變胺基酸結構，諸如以獲得含有CH3/CH3結構域的異二聚體之Fc。
具體地，抗體建構體包含與抗體Fc區或片段融合之Fv結構域，具有或不具有其他抗體結構域，但保持抗體的單價結合結構。具體實例意指與Fc或經修飾Fc融合的Fab部分或Fv部分。
較佳的抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈由VH結構域、CH2及CH3結構域組成，可選地進一步包括一或多個連接子(linkers)；而輕鏈由VL結構域、CH2及CH3結構域組成，可選地進一步包括一或多個連接子。
具體實施例包含人類IgG1 Fc，其中CH2-CH3結構域透過一或多個「鈕入孔(knobs-into-holes)」突變形成異二聚體，例如，
修飾CH3β褶板(beta-sheet)表面之「鈕(knob)」突變，存在於一個CH3結構域單體上，該單體係T366W；以及
修飾CH3β褶板表面的「孔」突變，存在於另一個CH3結構域單體上，該單體係選自由下列所組成之群組：T366S、L368A、Y407V。
具體地，抗體包含Fc區，該Fc區包含一或多個突變以下調效應物功能。根據具體態樣，Fc區經醣工程化(glycoengineered)以下調效應物功能。
根據具體實施例，抗體建構體包含人類或人工IgG1 Fc區，該人類或人工IgG1 Fc區係人類IgG1 Fc之功能性變異體，具有60%、70%、80%、85%、或90%序列一致性(sequence identity)中之至少一者，其經突變以下調效應物功能。較佳地，Fc區包含重鏈，該重鏈具有至少一個選自由下列所組成之群組的突變：E233P、L234V、L235A、　G236、A327G、A330S、及P331S，較佳地包含A327G/A330S/P331S（Kabat EU指數編號）。較佳地，將六個突變中之至少兩個該突變，更佳地至少三個、四個、五個、或所有突變工程化至Fc序列中。SEQ ID NO：31識別人類IgG1 Fc的序列。
具體地，抗體係PEG化的(PEGylated)、HES化的(HESylated)、或PSA化的(PSAylated)。
具體地，用分子量範圍在5,000至150,000 g/mol之間的PEG將抗體聚乙二醇化(pegylated)。用PEG 40,000將例示性抗體建構體（諸如Fab）聚乙二醇化。
具體地，抗體係半抗體IgG1，其特徵在於僅一個Fab部分、絞鏈區、及一個Fc部分，其中絞鏈區及/或Fc部分（尤其是人類IgG1 Fc）包含一或多個突變以避免重鏈二聚化（Gu等人(2015) PLoS One 10(1):e0116419），例如，選自由下列所組成之群組：
－絞鏈區中的突變(SEQ ID NO：33)：C226S、C229S（EU編號），以及
－Fc部分的突變：P395A、F405R、Y407R、K409D（EU編號）。
具體地，抗體係Fv-Fc融合蛋白，其中Fv由VH/VL結構域對組成，並且其中VH經由第一絞鏈區/連接子區與第一CH2-CH3結構域鏈融合，而VL係經由第二絞鏈區/連接子區與第二CH2-CH3結構域鏈融合。較佳地，第一及第二CH2-CH3結構域鏈在一或多個點突變方面彼此不同，諸如例如透過如上所述之「鈕入孔」突變，允許第一及第二CH2-CH3結構域鏈之間的優先異源二聚合，從而獲得Fv-Fc製備物，其特徵在於Fc異二聚體。
具體地，抗體包含雙硫鍵穩定(disulfide-stabilized)之Fv (dsFv)，其特徵在於一或多個另外的（人工）域間雙硫鍵。藉由在合適的位置將一或多個另外的半胱胺酸殘基導入VH及VL結構域中之任一者來獲得此等雙硫鍵，可使用該等合適的位置作為橋接VH及VL結構域之雙硫鍵橋接端(bridge pier)，一旦還原(reducing)半胱胺酸即獲得雙硫鍵。根據具體實例，可將雙硫鍵在任何下列VH中的位置及VL中的對應位置導入Fv：VH中的44C及VL中的100C、VH中的108C及VL中的55C、VH中的106C及VL中的56C、或VH中的101C及VL中的46C。
具體地，抗體包含：
a)重鏈可變結構域(VH)，該重鏈可變結構域(VH)包含互補決定區(complementarity-determining region，CDR)：VH-CDR1、VH-CDR2、及VH-CDR3；以及
b)輕鏈可變結構域(VL)，該輕鏈可變結構域(VL)包含CDRs：VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，
其中
i)
VH-CDR1包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1組成；
VH-CDR2包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成；
VH-CDR3包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3組成；
VL-CDR1包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4組成；
VL-CDR2包含SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5組成；
VL-CDR3包含SEQ ID NO：6或由SEQ ID NO：6組成；
或
ii)
VH-CDR1包含SEQ ID NO：23或由SEQ ID NO：23組成；
VH-CDR2包含SEQ ID NO：24或由SEQ ID NO：24組成；
VH-CDR3包含SEQ ID NO：25或由SEQ ID NO：25組成；
VL-CDR1包含SEQ ID NO：26或由SEQ ID NO：26組成；
VL-CDR2包含SEQ ID NO：27或由SEQ ID NO：27組成；
VL-CDR3包含SEQ ID NO：28或由SEQ ID NO：28組成；
其中編號係根據Kabat EU指數；
或上述i)或ii)中任一項之功能活性變異體，其在CDR序列之各者中包含0、1、或2（或至多1，亦即，0或1）個點突變，並且該功能活性變異體特異性識別huTNFR1。
具體地，抗體包含VH及VL，
其中
VH-CDR1包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1組成；
VH-CDR2包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成；
VH-CDR3包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3組成；
VL-CDR1包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4組成；
VL-CDR2包含SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5組成；以及
VL-CDR3包含SEQ ID NO：6或由SEQ ID NO：6組成；
其中編號係根據Kabat EU指數；
或其功能活性變異體，該功能活性變異體在CDR序列之任何一或多者中、或在各者中，包含至多1（亦即，0或1）個點突變，並且該功能活性變異體特異性識別huTNFR1。
具體地，VH及VL序列的特徵在於VH-及VL-CDR序列，其中
i)
VH-CDR1包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1組成；
VH-CDR2包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10組成，其中位置5的X係S；
VH-CDR3包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3組成；
VL-CDR1包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4組成；
VL-CDR2包含SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5組成；以及
VL-CDR3包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11組成，其中位置3的X係G。
或ii)
VH-CDR1包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1組成；
VH-CDR2包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10組成，其中位置5的X係S；
VH-CDR3包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3組成；
VL-CDR1包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4組成；
VL-CDR2包含SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5組成；以及
VL-CDR3包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11組成；其中位置3的X係S。
具體地，抗體包含VH序列、及VL序列、或其功能活性變異體；該VH序列包含SEQ ID NO：7或9、或由SEQ ID NO：7或9組成，該VL序列包含SEQ ID NO：8或10、或由SEQ ID NO：8或10組成，該功能活性變異體在CDR序列之任何一或多者中、或各者中包含至多1個點突變，並且在VH及VL之框架(FR)序列FR1至FR4之任何一或多者中、或各者中具有至少60%的序列一致性。
包含能夠特異性識別huTNFR1並與huTNFR1結合的抗原結合位點(antigen-binding site)之特定的VH/VL組合係下列之任一者：
a)包含SEQ ID NO：7或由SEQ ID NO：7組成之VH序列；及包含SEQ ID NO：8或由SEQ ID NO：8組成之VL序列；或
b)包含SEQ ID NO：9或由SEQ ID No：9組成之VH 序列；及包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10組成之VL序列。
具體地，抗體係包含Fab或由Fab組成的之全長或抗原結合抗體片段，其包含：
a)重鏈(HC)序列，該重鏈(HC)序列包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11組成；以及
b)輕鏈(LC)序列，該輕鏈(LC)序列包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12組成；
或其功能活性變異體，該功能活性變異體在分別包含在HC及LC中的VH及VL結構域的CDR序列之任何一或多者中、或各者中包含至多1個點突變，並且在VH及VL結構域之FR序列FR1至FR4之任何一或多者中、或各者中具有至少60%的序列一致性。
具體地，抗體包含：
a) HC序列，其包含SEQ ID NO：18或由SEQ ID NO：18組成；以及
b) LC序列，其包含SEQ ID NO：13或由SEQ ID NO：13組成；
或其功能活性變異體，該功能活性變異體在分別包含在HC及LC中的VH及VL結構域的CDR序列之任何一或多者中、或各者中包含至多1個點突變，並且在VH及VL結構域之FR序列FR1至FR4之任何一或多者中、或各者中具有至少60%的序列一致性。
SEQ ID No：18鑑定之HC及由SEQ ID NO：13鑑定之LC的抗體之特異性功能活性變異體包含：
HC，由下列者組成：
a)包含SEQ ID NO：19或由SEQ ID NO：19組成之VH，或至少含在該VH序列中之CDR序列；
b)連接子序列，由4至10個胺基酸（例如，4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸）組成，較佳地由許多甘胺酸(glycine)、絲胺酸(serine)、或蘇胺酸(threonine)以任何組合組成，諸如例如由SEQ ID NO：15組成之連接子；
c) CH2結構域，其包含SEQ ID NO：16或由SEQ ID NO：16組成；以及
d) CH3結構域，其包含SEQ ID NO：20或由SEQ ID NO：20組成；
以及
LC，由下列者組成：
a)包含SEQ ID NO：14或由SEQ ID NO：14組成之VL，或至少含在該VH 序列中之CDR序列；
b)連接子序列，由4至10個胺基酸（例如，4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸）組成，較佳地由許多甘胺酸(glycine)、絲胺酸(serine)、或蘇胺酸(threonine)以任何組合組成，諸如例如由SEQ ID NO：15組成之連接子；
c) CH2結構域，其包含SEQ ID NO：16或由SEQ ID NO：16組成；以及
d) CH3結構域，其包含SEQ ID NO：17或由SEQ ID NO：17組成。
具體地，此類抗原結合抗體由一或多種核酸分子編碼，該等核酸分子包含：
a) HC編碼序列SEQ ID NO：22；以及
b) LC編碼序列SEQ ID NO：21；
或其功能活性變異體，該功能活性變異體在分別包含在HC及LC中的VH及VL結構域的CDR序列之任何一或多者中、或各者中包含至多1個點突變，並且在VH及VL結構域之FR序列FR1至FR4之任何一或多者中、或各者中具有至少60%的序列一致性。
根據具體實施例，抗體包含抗原結合位點，其特徵在於下列六個CDR序列之組合，該抗體包含下列者或由下列者組成：
SEQ ID NO：23；VH-CDR1；
SEQ ID NO：24；VH-CDR2；
SEQ ID NO：25；VH-CDR3；
SEQ ID NO：26；VL-CDR1；
SEQ ID NO：27；VL-CDR2；以及
SEQ ID NO：28；VL-CDR3；
或其功能活性變異體，該功能活性變異體在CDR序列之任何一或多者中、或在各者中，包含至多1個點突變，並且該功能活性變異體特異性識別huTNFR1。
具體地，抗體包含併入VH及VL結構域之抗原結合位點，其中
a) VH包含SEQ ID NO：29或由SEQ ID NO：29組成；以及
b) VL包含SEQ ID NO：30或由SEQ ID NO：30組成；
或其功能活性變異體，該功能活性變異體在VH及VL結構域的CDR序列之任何一或多者中、或各者中包含0、1、或2（或至多1）個點突變，並且在VH及VL結構域之FR序列FR1至FR4之任何一或多者中、或各者中具有至少60%的序列一致性。
具體地，抗體包含VH及VL結構域，其中VH及VL結構域中之至少一者係親代結構域之親和力成熟的功能性變異體，該親代結構域在任何互補決定區(CDR)序列中包含至少一個點突變，其中，
a)親代VH結構域的特徵在於CDR序列：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、及SEQ ID NO：25；以及
b)親代VL結構域的特徵在於CDR序列：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、及SEQ ID NO：28。
具體地，該至少一個點突變係在SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：28之任一者中。
具體地，根據本發明可使用任何例示性抗體（其是由本文提供的序列所表徵化的那些抗體）。同樣地，可使用包含相同抗原結合位點及/或具有相同標靶結合特異性(target binding specificity)之任何替代性抗體。特定的替代性抗體係那些為例示性抗體之功能性變異體者，其中任何例示性抗體可以用作為「親代」以產生變異體，該變異體具有特異性識別huTNFR1標靶之功能。
具體地，抗體係親代抗體之親和力成熟的抗體，其特徵在於本文提供的序列，特別是其中CDR序列之1、2、3、4、5、或6個係功能活性CDR變異體，該功能活性CDR變異體相較於親代抗體中個別的CDR，包含至多1個點突變。
在具體實施例中，功能活性變異體抗體在CDR序列中之各者僅包含0、1、2、或3個點突變，較佳地在CDR序列中之各者僅包含0、1、或2個點突變，其中點突變係一個胺基酸之任何取代、***、或刪除。
本文所述之抗體（親代抗體）的任何功能活性變異體的特徵在於huTNFR1結合特異性。功能活性變異體可包含一或多個突變FR序列，該序列包括一或多個（例如，數個點突變）例如至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個點突變，以獲得相較於親代抗體中個別的FR具有至少60%序列一致性、或至少70%序列一致性、或至少80%序列一致性、或至少90%序列一致性之變異體序列。
具體地，抗體包含結合huTNFR1的抗原結合部分(antigen-binding moiety)，其KD 小於10-8 M或5×10-9 M，並且koff 小於10-3 s-1 。結合的親和力及結合特徵（締合及解離）在用於判定單價結合之標準測試中特異性地判定，基本上排除二價結合之結合力效應(avidity effect)。標準測試係在生理溫度（約37℃，或在37℃ +/- 1℃）下基於藉由石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)的測量。這種親和力測量尤其是以Fab格式進行。因此，如果抗體係除Fab分子以外的任何抗體，則特別將抗原結合位點導入個別Fab分子中，用於藉由QCM在37℃下進行親和力測量。此確保單價結合劑的親和力測量結果的可比性，而不管可能干擾親和力測量之結合力效應。特佳的QCM係在中等受體密度下進行。具體地，藉由QCM在37℃下判定Fab形式的抗體建構體與huTNFR1結合的親和力，而且中等受體密度在50至100 Hz的範圍內，例如在約50 Hz、或在50 Hz +/- 10 Hz、或在50 Hz +/- 5 Hz。
具體而言，KD 小於4x10-9 M、或小於3x10-9 M、或小於2x10-9 M、或小於10-9 M、或甚至小於10-10 M。
具體地，koff 小於10-3 、或小於5x10-4 s-1 、或小於10-4 s-1 ,、或小於10-5 s-1 。
具體地，抗原結合部分識別具有至少105 M-1 s-1 之kon 的huTNFR1。
根據具體態樣，疾病病況係肝脂肪變性、肝臟發炎、肝纖維化（或細胞凋亡）、及肝細胞癌中之任一者。具體地，治療有發展任何疾病病況風險或已經患有任何疾病病況的NASH患者。NASH或相關疾病病況的若干指標包括NAFLD疾病活動(NAFLD disease activity，NAS)及高ALT和胰島素血清(insulin serum)水平，該等指標可藉由本文所述的治療有效地降低。
具體地，患者亦患有第II型糖尿病、第I型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性、或肥胖，其中肥胖係經定義為具有≧30之身體質量指數的患者。
具體地，將抗體以有效量施用於患者。具體地，該量有效地拮抗TNFa/huTNFR1傳訊。特佳地，抗體是拮抗性抗體，從而避免基於細胞(cell-based)的分析中所測量之實質性TNFa/TNFR介導的傳訊及訊息傳導。本文所述的並且藉由本文所提供的抗體序列表徵之任何抗體特別理解為拮抗性抗體。
根據具體態樣，抗體直接抑制TNF-huTNFR1受體交互作用，如在基於細胞的分析中所判定的，較佳地藉由用於抑制Kym-1細胞中TNFR1介導的細胞死亡之分析，或分別藉由用於抑制IL-6或IL-8從HeLa細胞或HT1080細胞釋放之分析。具體地，在用於抑制Kym-1細胞中TNFR1介導的細胞死亡的分析中，IC50 值小於5.0 x 10-9 。具體地，在用於抑制IL-6從HeLa細胞釋放的分析中，IC50 值小於4.0 x 10-8 M，或在抑制IL-8從HT1080細胞釋放的分析中，IC50 值小於2.0 x 10-8 M。
根據具體實施例，使用抗體，其藉由單價交互作用結合至huTNFR1且具有降低展現出TNF-模擬促效活性的風險。特佳地係具有結合至TNFR1的高親和力、及低解離速率(low off rate)之抗體，其提供對TNFR1依賴性TNF反應的優異抑制。
具體地，以包含抗體及醫藥上可接受之載劑(carrier)及/或賦形劑(excipient)之藥物製劑提供本文所述之抗體。由於抗體的拮抗性質，藥物製劑可包含高抗體濃度，同時避免由促效活性引起的副作用。
具體地，配製藥物製劑以用於腸胃外使用，較佳地藉由靜脈內或皮下投藥。
具體地，本文所述之抗體具有低免疫原性(immunogenicity)、並且可重複使用而不形成抑制劑，諸如抗藥物抗體(anti-drug antibodies，ADA)。
令人驚訝地發現，本文所述之抗體，尤其是單價抗體，可用於治療發生ADA的患者，例如，已開發出針對免疫球蛋白或抗體免疫治療劑(immunotherapeutics)的抗體。在現有技術中，此等ADA的存在將特別排除用針對TNFR1的抗體之進一步免疫治療劑，因為ADA具有在細胞表面上結合TNFR1時交聯抗體的潛力，從而潛在地促效TNFR1傳訊。然而，即使在ADA的存在下，本文所述之抗體也不會（或基本上不會）促效TNFR1傳訊。
具體地，本文所述之藥物製劑可施用於已經發生ADA的患者，例如，針對抗huTNFR1抗體或任何IgG結構之ADA。
具體地，將有效量之抗體施用於患有NASH的患者，以減少下列任何一或多者：
a)肝組織中的脂肪變性、三酸甘油酯含量、炎症、及/或細胞凋亡；
b)血清胺基轉移酶水平；
c)胰島素抗性並且可選地改善葡萄糖耐受性；及/或
d) NAFLD活性分數。
具體地，將抗體以0.05 mg/kg至20 mg/kg、較佳地0.2 mg/kg至6 mg/kg之劑量範圍施用於患有NASH的患者。可從所述小鼠模型中之治療有效劑量(20 mg/kg)推斷出對人類有效的量。HED（人體等效劑量(human equivalent dose)）係~1至2 mg/kg。
較佳的抗體劑量係，例如， 範圍在0.5至1000mg、較佳地1至400 mg。如果皮下施用，則較佳的劑量範圍係0.5至400mg。
根據具體態樣，藉由全身投藥(systemic administration)、較佳地藉由靜脈內輸注或單次快速注射，將抗體以治療有效量施用於患者。
根據具體實施例，將抗體以例如0.5至5 mg/kg、特別是約2mg/kg的劑量用規律的（例如每週一次）靜脈注射或皮下注射重複施用於患者。施用藥物的頻率及劑量可適應疾病狀態及對治療的反應。
具體地，將抗體與飲食治療組合施用於患有NASH的患者。抗體治療可特異性地與諸如NSAP/NSAID之消炎藥組合，或使用法尼醇X受體(farnesoid X receptor，(FXR))促效劑(agonist)、類升糖素肽-1受體(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP1R)促效劑、或過氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)促效劑之療法。
除非另有所指，否則該等位置在本文中係根據Kabat的EU指數編號。Kabat編號方案的解釋可在Kabat, EA,等人 ，Sequences of proteins of immunological interest（NIH publication no.91-3242，第五版(1991)）中找到。
在描述本發明的上下文中（尤其是在下列申請專利範圍的上下文中）使用用語「一(a/an)」及「該(the)」以及類似的參照物應解釋為涵蓋單數及複數兩者，除非本文另有指明或與上下文明顯矛盾。
除非另有註明，否則用語「包含(comprising)」、「具有(having)」、「包括(including)」、及「含有(containing)」應解釋為開放式用語(open-ended term)（即，意味著「包括但不限於(including, but not limited to)」）。出於本發明之目的，用語「由......組成(consisting of)」認為是用語「包含(comprising of)」的較佳實施例。如果在下文中將群組定義為包含至少一定數量之實施例，則此意味著亦涵蓋較佳地僅由此等實施例所組成之群組。
用語「抗體」在本文中被理解為涵蓋由抗體結構域組成或包含抗體結構域之多肽或蛋白質，該抗體結構域被理解為免疫球蛋白的重鏈及/或輕鏈之恆定及/或可變結構域，具有或不具有連接子序列。如果包含β-桶狀結構(beta-barrel structure)，則多肽被理解為抗體結構域，該β-桶狀結構由藉由環序列(loop sequence)連接之抗體結構域結構的至少兩個β-鏈(beta-strand)組成。抗體結構域可係天然結構或藉由誘變(mutagenesis)或衍生化(derivatization)修飾，例如，修飾抗原結合性質或任何其他性質，諸如穩定性或功能性，諸如與Fc受體FcRn及/或Fcγ受體的結合。
如本文中所使用之抗體包含至少一個抗原結合位點，其特異性識別huTNFR1或huTNFR1之表位。因此，抗體與huTNFR1受體的結合可單價地透過每個抗體僅一個huTNFR1特異性結合位點，或二價地透過兩個huTNFR1特異性結合位點結合。具體地，抗原結合位點具有一或兩個抗體結構域。可採用單獨或組合的任何可變抗體結構域（諸如單獨的VH結構域、或VH及VL結構域的組合）來建構抗原結合位點。具體地，藉由CDR序列的組合形成抗原結合位點。CDR序列的此等組合亦被理解為CDR結合位點，例如由一個可變結構域的三個CDR序列形成的抗原結合囊袋(antigen binding pocket)，諸如CDRH1、CDRH2、及CDRH3的組合，或CDRL1、CDRL2、及CDRL3的組合，抑或兩個可變結構域的六個CDR序列，諸如CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、及CDRL3的組合。替代地，可採用衍生自受體的天然配體之抗原結合位點、或人工建構體。本文提及之CDR序列指定如下：
VH結構域之CDR：
VH-CDR1 = CDRH1
VH-CDR2 = CDRH2
VH-CDR3 = CDRH3
VL結構域之CDR：
VL-CDR1 = CDRL1
VL-CDR2 = CDRL2
VL-CDR3 = CDRL3
具體地，單一可變抗體結構域之CDR結合位點可以使用作為抗原結合位點，諸如可變區的重鏈及輕鏈之結構域的結合位點（例如dAb、Fd、VL、Vκ(Vkappa)、Vλ(Vlambda)、VH、VHH），或可變抗體結構域對之結合位點，諸如VH/VL對。
因此，包含CDR結合位點的抗體可包含單一可變抗體結構域或一對可變結合結構域，並且可選地進一步包含具有相同或不同抗原結合特異性之其他可變結構域，例如雙特異性或多特異性抗體，其中僅一個抗原結合位點係針對huTNFR1，並且至少另一個抗原結合位點係針對不同於huTNFR1之標靶。可選地，抗體建構體進一步包含恆定抗體結構域，或具有或不具有連接序列(linking sequence)或絞鏈區之可變及/或恆定抗體結構域的組合。
可使用如本文所述之特異性抗體格式，例如， 包含單一可變抗體結構域或由單一可變抗體結構域組成之抗體（諸如VH、VL、或VHH）、或具有或不具有連接序列或絞鏈區之可變及/或恆定抗體結構域的組合，包括成對的可變抗體結構域（諸如VL/VH對）；包含VL/VH結構域對及恆定抗體結構域或由VL/VH結構域對及恆定抗體結構域組成之抗體（諸如重鏈抗體：Fab、F（ab'）、(Fab)2 、scFv、Fd、Fv；或全長抗體，例如， IgG型（例如 ，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亞型）、IgA1、IgA2、IgD、IgE、或IgM抗體）。用語「全長抗體(full length antibody)」可用以意指包含至少大部分Fc結構域及天然存在的抗體單體中常見的其他結構域之任何抗體分子。此短語在本文中係用於強調特定抗體分子不是抗體片段。
例示性單價、單特異性結合劑係Fab、scFv、Fv、結構域抗體、IgG半抗體、或單價IgG，諸如由完整的輕鏈、一條完整的重鏈、及缺少Fd (Fd = VH-CH1)之額外的Fc鏈組成之單臂IgG，可根據鈕入孔技術（或其他不對稱Fc部分）生產，以避免Fc結構域的同源二聚合。
例示性雙價或多價結合劑係任何免疫球蛋白類型之全長抗體，或任何全長抗體之抗原結合抗體片段，其包含，例如 ，任何一或多個Fab、F(ab’)、(Fab)2 、scFv、或Fv之至少兩個抗原結合位點。
用語「Fv」在本文中被理解為可變結構域之區域，結合例如VH、VL、或VH/VL之CDR結合位點。因此，用語「Fv」特別適用於VH、VL或VH/VL之任一者，係藉由兩個可變結構域的β褶板結構之間的交互作用與VL結構域相關聯之VH結構域，具有或不具有連接子。
如本文中所使用之用語「抗體」應具體包括抗體製劑中分離形式的抗體，其基本上不含針對不同靶抗原的其他抗體或包含抗體結構域的不同結構排列。又，分離的抗體可包含在組合製劑中，該組合製劑含有分離的抗體之組合，例如， 與至少一種其他抗體（諸如具有不同特異性的單株抗體或抗體片段）之組合。
用語「抗體」應適用於動物來源的抗體，包括人類物種，諸如哺乳動物，諸如人或鼠；或禽類，諸如母雞，該用語應特別包括基於動物來源序列之重組抗體，例如， 在人類抗體中之人類序列。人類抗體一般包含衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。如本文所述較佳地使用人類抗體，其可包括非由人類生殖系(human germline)免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基（例如 ，藉由體外 隨機或定點誘變(site-specific mutagenesis)或藉由體內 體細胞突變(somatic mutation)導入的突變），例如在CDR中。人類抗體包括從人類免疫球蛋白庫或從一或多種人類免疫球蛋白轉基因動物中分離的抗體。
然而，用語「抗體」進一步適用於具有不同物種來源序列之嵌合型抗體，諸如鼠類來源及人類來源序列；或人源化抗體，其含有人類來源及非人類來源（例如，囓齒類來源）之胺基酸序列。
用語「抗體」具體地適用於任何類別或亞類(subclass)之抗體。根據其等之重鏈恆定結構域的胺基酸序列，可將抗體指定為主要類別(major class)之抗體IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，並且其中一些可進一步分為亞類（同型(isotype)），例如 ，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。
該用語進一步適用於單株或多株抗體，具體是重組抗體，該用語包括藉由重組方法製備、表現、製造、或分離之所有抗體及抗體結構，諸如源自動物之抗體，例如， 哺乳動物，包括人類，其包含來自不同來源之基因或序列，例如 ，鼠類、嵌合型人源化抗體、或融合瘤衍生的抗體。進一步實例意指從轉化以表現抗體的宿主細胞中分離的抗體，或從重組、組合抗體庫或抗體結構域中分離之抗體，或藉由涉及抗體基因序列剪接成其他DNA序列之任何其他方法製備、表現、創造、或分離之抗體。
抗體結構域可係天然結構或藉由誘變(mutagenesis)或衍生化(derivatization)修飾，例如， 修飾抗原結合性質或任何其他性質，諸如穩定性或功能性，諸如與Fc受體FcRn及/或Fcγ受體(FCGR)的結合。
具體實例意指非天然存在的(non-naturally occurring)抗體，該抗體係經工程化以藉由至少一個抗原結合位點特異性識別標靶huTNFR1之人工建構體，該抗原結合位點包含一或多個人工CDR序列、或經工程化以產生非天然存在的抗體建構體，該抗體建構體具有不同於任何天然存在的免疫球蛋白結構之結構。
如本文進一步描述之抗體的具體實例係非天然存在的，例如，如在與另一種抗體或活性劑的組合製備中所提供的，該組合在自然界中不存在。具體的其他實例意指天然存在的抗體之人工衍生物或變異體、或天然存在的抗體之優化的或親和力成熟的變異體、或具有框架區(framework-region)的抗體，該框架區經工程化以改善抗體的穩定性。藉由此等優化(optimizing)或工程化(engineering)，抗體包含一或多種合成結構或序列或特徵，該等合成結構或序列或特徵不會在自然界的抗體情況(context)中被發現。
應當理解，如本文中所使用之用語「抗體」亦應指抗體之衍生物，特別是功能活性衍生物，在本文中亦稱為抗體之功能性變異體。
功能活性衍生物特別是藉由融合或共價化學修飾產生，不會改變抗體本身之一級胺基酸序列。衍生物可例如 具有所需的性質，包括例如延長循環半衰期、增加穩定性、降低廓清率、或改變免疫原性(immunogenicity)。 特異性抗體衍生物被理解為一或多種抗體結構域或抗體及/或融合蛋白之任何組合，其中抗體之任何結構域可在一或多種其他蛋白質的任何位置融合，諸如其他抗體，例如， 包含CDR環、受體多肽之結合結構，以及配體(ligands)、支架蛋白(scaffold protein)、酶、毒素、及類似者。抗體的衍生物可藉由各種化學技術與其他物質締合(association)或結合而獲得，例如共價偶聯(covalent coupling)、靜電交互作用，雙硫鍵結合等。結合至抗體的其他物質可係脂質、碳水化合物、核酸、有機及無機分子、或其任何組合（例如， PEG、前驅藥、或藥物）。在具體實施例中，抗體係包含藥物的衍生物，例如， 以獲得抗體-藥物結合物(antibody-drug conjugate)。
用語衍生物亦包括抗體的片段、變異體、類似物、或同源物，例如， 具有特定的醣苷化(glycosylation)模式，例如， 藉由醣工程化(glycoengineering)產生，其係功能性的並且可用作為功能性變異體，例如， 結合至特定標靶。
關於抗體序列之用語「經醣工程改造」應指由於醣工程化而具有修飾的免疫原性性質之醣苷化變異體，ADCC及/或CDC。所有抗體在重鏈恆定區中的保守位置含有碳水化合物結構，各同型具有不同的N-鍵聯碳水化合物結構陣列，其可變地影響蛋白質組裝、分泌、或功能活性。IgG1型抗體係醣蛋白，其在各CH2結構域之Asn297處具有保守的N鍵聯醣苷化位點。與Asn297連接的兩個複合雙觸角寡糖埋在CH2結構域之間，與多肽主鏈(backbone)形成廣泛的接觸，並且其等之存在對於抗體介導效應子功能諸如抗體依賴性細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)是必需的。在N297處除去N-聚醣，例如， 透過使N297突變為例如， A或T299，一般會得到具有降低的ADCC之無醣苷化(aglycosylated)抗體。
抗體醣苷化的主要差異發生在細胞株(cell line)之間，且甚至對於在不同培養條件下生長的給定細胞株也觀察到微小差異。細菌細胞中的表現一般提供無醣苷化抗體(aglycosylated antibody)。
抗體可缺乏活性Fc部分，因此，由不具有FCGR結合位點之抗體結構域組成、具體地包括缺乏CH2及CH3結構域鏈之任何抗體，或者包含缺乏Fc效應物功能之抗體結構域，例如， 藉由修飾來降低Fc效應物功能，特別是消除(abrogate)或降低ADCC及/或CDC活性。此等修飾可藉由誘變實現，例如， FCGR結合位點中之突變或藉由衍生物或試劑干擾抗體之ADCC及/或CDC活性，從而實現Fc效應物功能的降低或Fc效應物功能的缺乏，其中一般理解為意指藉由ADCC及/或CDC活性測量，小於10%之未經修飾（野生型）抗體的Fc效應子功能，較佳地小於5%。
例示性抗體可包含Fc片段或至少部分Fc片段，諸如用以維持與FcRn的結合位點，從而獲得具有體內 實質半衰期的抗體。
然而，可修飾Fc以獲得可能的ADCC及/或CDC活性降低，例如， 藉由IgG1轉換成IgG2亞型(subtype)、或藉由修飾降低與Fc受體的結合，例如， 藉由人類IgG1 Fc中之E233P、及/或L234V、及/或L235A、及/或D265G、及/或A327Q、及/或A330A、及/或G236，及/或A327G、及/或A330S，其中編號係根據Kabat [EU指數]。
進一步實例意指修飾以降低免疫原性，例如， 藉由K.O.醣苷化位點，諸如N297Q，其提供與凝集素受體之受損結合(impaired binding)。
應理解，用語「抗體」亦指抗體之變異體，該變異體包括具有親代CDR序列之功能活性CDR變異體之抗體，以及親代抗體之功能活性變異體抗體。例如，那些特徵在於CDR結合序列及/或本文所提供之重鏈及輕鏈序列的抗體之功能性變異體，可經工程化並如本文進一步所述來使用。
具體地，親代抗體的抗體變異體可藉由工程化親代抗體的抗體序列中之至少一者來產生，諸如本文所提供之任何例示性抗體，例如 ，其中抗體變異體包含至少3個重鏈可變區之CDR以及可任選地進一步至少3個輕鏈可變區之CDR，在至少一個CDR中或在FR區中、或在重鏈(HC)或輕鏈(LC)的恆定區中具有至少一個點突變仍然具有功能活性，藉由與標靶huTNFR1的特異性結合來測量。
具體地，抗體變異體是突變抗體或抗體片段，例如， 藉由誘變方法獲得，特別是在特定抗體胺基酸序列或區域中將***劑(insert)刪除、交換、導入，或化學性地衍生胺基酸序列，例如， 在恆定結構域中工程化抗體穩定性、效應物功能、或半衰期，或在可變結構域中改善抗原結合性質，例如， 藉由所屬技術領域中可得之親和力成熟技術。可採用任何已知的誘變方法，包括在所需位置之點突變，例如， 藉由隨機化技術獲得。在一些情況下，隨機選擇位置，例如， 用任何可能的胺基酸或選擇較佳的胺基酸來隨機化抗體序列。用語「誘變(mutagenesis)」意指用於改變多核苷酸或多肽序列之任何所屬技術領域公認的技術。較佳的誘變類型包括易錯(error prone) PCR誘變、飽和誘變、或其他定點(site directed)誘變。
點突變特別理解為多核苷酸的工程化，該工程化造成胺基酸序列的表現，該表現與非工程化胺基酸序列在不同胺基酸的一或多個單一的（非連續的）或雙重胺基酸之取代或交換、刪除或***不同。
具體地，藉由親代抗體或親代抗體序列之修飾產生功能活性變異體抗體，該修飾係藉由一或多個胺基酸的***、刪除、或取代；或在下列者中一或多個胺基酸殘基的化學衍生(chemical derivatisation)：胺基酸序列、或核苷酸序列內之核苷酸、或序列遠端之任一者或兩者，例如， 在CDR序列N端及/或C端1、2、3、或4個胺基酸，及/或中間的1、2、3、或4個胺基酸（亦即， 在CDR序列的中間）；並且該修飾不影響（特別是不損害）此序列的活性。在結合位點對選定的標靶抗原具有特異性的情況下，抗體的功能活性變異體仍具有預定的結合特異性或基本上相同的生物活性，儘管這係可改變的，例如 ，改變對特異性表位、親和力、結合力、Kon或Koff速率等之精細特異性(fine specificity)。例如，親和力成熟的抗體被特別理解為功能活性變異體抗體。因此，親和力成熟的抗體中經修飾的CDR序列被理解為功能活性CDR變異體。
親和力成熟係產生對標靶抗原具有增加的親和力之抗體的過程。可採用所屬技術領域中可得之任何一或多種製備及/或使用親和力成熟庫之方法，以便根據本文所揭示的本發明之各種實施例產生親和力成熟的抗體。例示性之此等親和力成熟方法及用途，諸如隨機誘變(random mutagenesis)、細菌誘變菌株傳代(bacterial mutator strains passaging)、定點誘變(site-directed mutagenesis)、突變熱點靶向(mutational hotspots targeting)、簡約誘變(parsimonious mutagenesis)、抗體混排(shuffling)、輕鏈混排、重鏈混排、CDR1及/或CDR1誘變，以及產生並使用適合於實施根據本文所揭示之本發明的各種實施例之方法及用途（包括例如於Wark & Hudson, 2006, Advanced Drug Delivery Reviews 58: 657– 670中所揭示者）的親和力成熟庫之方法。
隨著抗體的結構變化，包括胺基酸誘變或免疫球蛋白基因區段中體細胞突變的結果，產生抗原結合位點的變異體，並經選擇以具有更大的親和力。親和力成熟的抗體可展現出比親代抗體大數個對數倍(several logfold)之親和力。單親抗體可進行親和力成熟。替代地，具有與標靶抗原類似的結合親和力之抗體庫可被認為是改變的親代結構，以獲得親和力成熟的單一抗體或此等抗體之親和力成熟的庫(pool)。
本文所述抗體之較佳的親和力成熟變異體展現出結合親和力增加至少2倍，較佳地至少5倍、較佳地至少10倍、較佳地至少50倍、或較佳地至少100倍之增加。親和力成熟可在選擇活動的過程中採用，該選擇活動採用個別的親代分子庫，或者使用具有中等結合親和力之抗體，以獲得本文所述之抗體。替代地，藉由本文所述抗體之親和力成熟可甚至更增加親和力，以獲得對應於小於10-10 M、或甚至小於10-11 M之KD 的高值。
在某些實施例中，藉由親和力ELISA分析判定結合親和力。在某些實施例中，藉由BIAcore、ForteBio或MSD分析判定結合親和力。在某些實施例中，藉由動力學方法判定結合親和力。在某些實施例中，藉由平衡/溶液方法判定結合親和力。在某些實施例中，藉由標準石英晶體微量天平(quartz crystal microbalance，QCM)測量判定結合親和力，特別是在預定條件下，其類似於生理條件（約37℃，密度約50 Hz）。
本文所述抗體之具體功能係作為TNF-huTNFR1交互作用之抑制劑（亦稱為拮抗劑）的功能。如本文所理解，用語「抑制劑」係有能力進行下列者之物質：
a)在體外 及/或體內 調節（例如 ，減少或消除）TNFR1傳訊，及/或
b)在體外 及/或體內 抑制TNFR1介導的細胞死亡，及/或
c)抑制TNF介導的細胞刺激，以在體外 及/或體內 釋放發炎性細胞激素，
d)藉由不同的機制抑制TNFR1傳訊。
具體地，本文所使用之抗體干擾一或多種分子TNF與細胞表面上的一或多種TNFR1分子的結合。對於治療性應用，不受理論束縛，TNF-huTNFR1交互作用抑制劑可在TNF存在下有能力抑制huTNFR1傳訊，或在TNF存在下抑制huTNFR1介導之細胞死亡，或在TNF存在下抑制細胞刺激以釋放發炎性細胞激素。
如本文中所使用，用語「傳訊」及「訊息傳導」表示涉及經由細胞表面受體、通過特定及連續的一系列分子將細胞外刺激傳遞(transmission)到細胞核中的基因造成對刺激之特異性細胞反應的生物化學過程。
huTNFR1交互作用之抑制會造成TNFR1傳訊或訊息傳導作用的下調，如在基於細胞的分析中以劑量依賴性方式離體 或體內 測量。本文所述之抗體的功能活性具體特徵在於抑制功能，其抑制體內 TNF-huTNFR1交互作用或LTα-huTNFR1交互作用，如在基於離體細胞(ex vivo cell-based)分析中所判定的。可採用進一步的分析來排除與交聯TNFR1受體關聯之實質性副作用，該TNFR1受體將促效TNF-TNFR1交互作用。合適的分析係判定抗體或變異體對HeLa或HT1080細胞的活性，因為缺乏刺激活性以分別產生發炎性細胞激素IL-6或IL-8。在下列實例章節部分中描述例示性測試。
抑制一般導致huTNFR1交互作用或活性的作用降低至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或最大水平。產生且表徵本文所述抗體之方法係所屬技術領域中所熟知的。在較佳實施例中，使用一或多種採用表現huTNFR1的細胞之基於細胞的分析或體內 分析，產生抗體變異體並篩選預定性質。對於此等分析，一般外源性地添加抗體，使得細胞可被結合，例如，在存在及不存在TNF的情況下判定拮抗活性及促效活性。這些分析一般基於免疫球蛋白的功能；亦即，抗體與huTNFR1結合且介導一些生化事件的能力，例如阻斷TNF與所述細胞的結合，例如，在競爭性結合分析中，TNF/受體結合抑制、存在或不存在TNF時細胞激素表現減少，特別是發炎性介白素，諸如IL-6或IL-8、細胞凋亡、及類似者。
本文所述之抗體較佳地僅具有TNF拮抗活性（特別是沒有可檢測的促效活性），因此減少由循環中TNF水平升高引起的發炎性反應，其會導致非所欲之發炎性反應、細胞凋亡、及壞死(necrosis)、或器官衰竭(organ failure)。較佳的抗體具有對應於IC50 小於100 nM、較佳地小於20 nM、更較佳地小於10 nM，最佳地在個位數(single digit)奈莫耳(nanomolar)範圍或更小之拮抗活性，如在基於細胞的分析中採用TNF或LTα在半數最大飽和濃度(half-maximal saturation concentration)下測量的，較佳地分別在0.01至0.1 nM TNF及LTα範圍內。
可在相同之基於細胞的分析中測量潛在的TNF模擬促效活性，但不採用TNF。如果在不存在TNF的情況下培養HeLa或HT1080細胞導致細胞激素沒有或僅有邊際誘導，例如，在抗體之至少5 nM或約10 nM的濃度下，IL-6或IL-8水平升高小於0.5 ng/ml，則本文所述之抗體較佳地不具有顯著的促效活性。較佳地，沒有或僅邊際或陰性細胞激素產生，其可藉由小於10 pg/105 個細胞的量來判定。在較佳的實例中，細胞激素表現及釋放在18小時內係小於2.5 pg/100.00個細胞。較佳地，促效活性因此低於基礎水平，或小於2%之可比較的TNF濃度之反應，較佳地小於1%之等效(equivalent )或最大TNF反應。
關於本文所述之抗體序列，「百分比(%)胺基酸序列一致性」定義為在排比序列及導入間隔之後（如果需要的話），候選序列中與特定多肽序列中胺基酸殘基相同之胺基酸殘基百分比，以實現最大的百分比序列一致性，而不考慮作為序列一致性一部分之任何保守取代。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於測量排比(alignment)之適當參數，包括在所排比之序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。
如本文所使用之用語「抗原」與用語「標靶」或「標靶抗原」係可互換的，應意指整個標靶分子或由抗體結合位點識別之此等分子的片段。具體地，抗原的亞結構（例如，多肽或碳水化合物結構），通常稱為「表位」，例如，B細胞表位或T細胞表位，其係免疫學相關的，可藉由此等結合位點識別。huTNFR1抗原係包含受體結構的抗原，其能夠特異性結合三聚體TNF或LTα作為大多數人類細胞表面上之單體(monomeric))細胞激素受體或多聚體(multimeric)細胞激素受體。
如本文中所使用之用語「huTNFR1」應意指TNF之CD120a TNFR1（p55/60，TNFRSF1A腫瘤壞死因子受體超家族，成員1A [智人(Homo sapiens)]，基因ID：7132）受體，普遍表現在大多數人類細胞上。提供huTNFR1之具體例示性序列為SEQ ID NO：32。
如本文中所使用之用語「表位」應特別意指可完全構成特異性結合夥伴或係抗體結合位點之特異性結合夥伴之一部分的分子結構。表位可由下列任一者組成：碳水化合物；肽結構；脂肪酸；有機、生物化學、或無機物質；或其衍生物；及其任何組合。如果表位包含在肽結構中，諸如肽、多肽、或蛋白質，通常會包括至少3個胺基酸、較佳地5至40個胺基酸、以及更佳地約10至20個胺基酸之間。表位可係線性表位或構型表位(conformational epitope)。線性表位係由多肽或碳水化合物鏈的一級序列之單一區段組成。線性表位可係連續的或重疊的。
構型表位係由藉由將多肽折疊以形成三級結構而聚集在一起之胺基酸或碳水化合物組成，並且胺基酸不一定在線性序列中彼此相鄰。具體地，就多肽抗原而言，構型或不連續表位的特徵在於存在二或更多個離散的胺基酸殘基，在一級序列中分開，但當多肽折疊成天然蛋白質/抗原時，在分子表面上組裝成一致的結構。
在本文中用語「表位(epitope)」應特別意指huTNFR1中包含的表位，該表位係併入膜（－huTNFR1的遠端CRD1及CDR2之亞結構域A1）中之表位。
如本文中所使用關於核酸、抗體、或其他化合物之用語「分離的(isolated)」或「分離(isolation)」應意指此等化合物已經與其天然相關的環境充分分離，以便以「基本上純的(substantially pure)」形式存在。「分離的」不一定意味著將人造或合成混合物排除於其他化合物或材料，或者存在不干擾基本活性之雜質，並且該雜質可能例如由於不完全純化而存在。
關於多肽或蛋白質，例如本文中所述之分離的抗體，用語「分離的」應具體意指不含或基本上不含與化合物天然關聯之物質的化合物，例如在化合物之天然環境中或製備（例如，細胞培養）化合物之環境中發現的其他化合物，當此等製備係藉由體外 或體內 實施的重組DNA技術時。分離的化合物可與稀釋劑或佐劑(adjuvant)一起配製，並且又為了實際目的而分離-例如，當用於診斷或治療時，多肽或多核苷酸可與醫藥上可接受之載劑或賦形劑混合。
如本文中所使用之用語「重組」應意指「由基因工程製備或基因工程之結果」。重組宿主具體地包含表現載體(expression vector)或選殖載體(cloning vector)，或者已經過基因工程化以含有重組核酸序列，特別是採用宿主外來(foreign)之核苷酸序列。藉由在宿主中表現個別的重組核酸來產生重組蛋白。
在本文中進一步描述之抗體可係重組抗體。為此，用語「重組抗體」，如本文中所使用，包括藉由重組方法製備、表現、製造、或分離之抗體，諸如(a)從動物（例如，小鼠）分離之抗體，其係人類免疫球蛋白基因之轉基因或轉染色體(transchromosomal)、或由其製備之雜融合瘤，(b)從宿主細胞中分離之抗體經轉化(transformed)以表現抗體，例如來自轉染瘤(transfectoma)，(c)從重組、組合人類抗體庫或抗體的抗原結合序列庫中分離之抗體，以及(d)藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接(splicing))至其他DNA序列的任何其他方法製備、表現、製造、或分離之抗體。此等重組抗體包含經工程化以包括重排及突變之抗體，該等重排及突變例如在抗體成熟期間發生。根據本發明，可採用所屬技術領域中習知之分子生物學、微生物學、及重組DNA技術。此等技術在文獻中充分說明。參見，例如，Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)。
本文所述之抗體較佳地提供作為重組蛋白，該重組蛋白藉由採用宿主細胞之重組表現系統產生，例如，藉由在大腸桿菌(E. coli )的周質空間(periplasmic space)中表現、或藉由在真核表現系統諸如酵母或哺乳動物中表現為分泌蛋白，例如，藉由CHO、HEK、或人類生產宿主細胞株(cell line)。
中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞最常用於抗體生產。除了提供合適的醣苷化模式外，這些細胞還可一致地產生遺傳穩定、高生產的純系細胞株(clonal cell line)。其等可使用無血清培養基在簡單的生物反應器中培養至高密度，並允許開發安全且可重複的生物過程。
當在無血清條件下建立、適應、及完全培養時，宿主細胞係最佳的，並且可選的在不含任何動物來源的蛋白質/肽的培養基中。
如本文中所使用之「特異性」結合、識別、或靶向意指結合物（例如，抗體或抗體之抗原結合位點）對標靶抗原或異質分子群中的個別表位展現出明顯的親和力。因此，在指定條件下（例如，免疫分析），結合劑特異性結合至標靶抗原，並且不以顯著的量與樣本中存在的其他分子結合。特異性結合意指在所選擇的標靶識別(target identity)、高、中、或低結合親和力或結合力方面，結合係選擇性的。相較於另一標靶，如果結合常數或結合動力學至少相差10倍（理解為至少1個對數差異），通常可實現選擇性結合，較佳的差異係至少100倍（理解為至少2個對數差異），以及更佳的至少1000倍（理解為至少3個對數差異）。可藉由免疫分析法、較佳地免疫墨點法(immunoblotting)、ELISA、或其他免疫學方法判定微差結合(differential binding)。抗體分子對特定標靶的特異性可藉由競爭分析來判定，例如，如Harlow等人於ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988中所述。可藉所屬技術領域中已知的重組抗體優化方法工程化或改進選擇性結合。例如，可使本文所述之免疫球蛋白鏈之可變區的某些區域經歷一或多種優化策略，包括輕鏈混排(shuffling)、目的地誘變(destinational mutagenesis)、CDR合併(amalgamation)、及所選CDR及/或框架區之定向誘變。
使用用語「具有相同的特異性」、「具有相同的結合位點」、或「結合相同的表位」表示等效單株抗體展現出相同或基本相同的（亦即類似的）免疫反應（結合）特徵，並競相結合至預選擇(pre-selected)之標靶結合序列。抗體分子對特定標靶的相對特異性可藉由競爭分析來判定，例如，如Harlow等人於ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988）中所述。
在本文中競爭意指藉由競爭ELISA分析或藉由ForteBio分析判定比約30%更大的相對抑制(relative inhibition)。可能需要將較高的相對抑制閾值設定為特定情況下適當競爭水平的標準，例如，其中競爭分析係用以選擇或篩選經設計之具有預期抗原結合功能之新抗體。因此，例如，在認為抗體具足夠競爭性之前可設定競爭性結合的標準，其中檢測到至少40%之相對抑制，或至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或甚至至少100%。
如本文所用之用語「患者」應指人類及其他哺乳動物受試者。具體地，本文所述之醫學用途或相應的治療方法適用於需要預防或治療NASH或與NASH關聯的疾病病況之受試者。受試者可係面臨NASH風險或患有NASH的患者，包括早期或晚期疾病。用語「患者」具體包括接受預防性及/或治療性治療之受試者。因此，用語「治療」意味著包括預防性及治療性治療兩者。
具體地，用語「治療」意指治療性措施(therapeutic measures)，其意圖涵蓋治癒疾病或減輕疾病症狀之投藥。
具體地，用語「預防(prophylaxis)」意指預防性措施，旨在減少疾病發生風險或疾病復發。
用語「治療有效量(therapeutically effective amount)」，在本文中可與化合物之任何用語「有效量(effective amount)」或「足夠量(sufficient amount)」互換使用，例如，本文所述之抗體係足以在向受試者施用有益或所需結果（包括臨床結果）時之量或活性，並且因此，其有效量或同義詞取決於其所應用之情況。
有效量旨在表示足以治療、預防、或抑制此等疾病或病症之化合物的量。在疾病的情況下，如本文所述之抗體的治療有效量具體地用於治療、調節、減弱、逆轉、或影響受益於TNF-TNFR1交互作用抑制之疾病或病症。
對應於此等有效量之化合物的量將隨各種因子而變化，諸如給定的藥物或化合物、藥物製劑、給藥途徑、疾病或病症之類型、受試者之身份或待治療之宿主、及類似者，但仍然可由所屬技術領域中具有通常知識者常規地判定。
如本文進一步所述，治療患者之方法包含向有其需要之患者施予治療有效量之上文所定義的huTNFR1抗體之步驟。治療有效量一般範圍在0.5至500 mg、較佳地1至400 mg、甚至更佳的至多300 mg、至多200 mg、至多100 mg、或至多10 mg，但可表示更高的劑量，例如，用於治療肥胖患者或急性疾病病況。
本文所述之較佳醫藥組成物包含治療有效量之huTNFR1抗體及可任選地一或多種選自由下列所組成之群組的額外組分(additional component)：醫藥上可接受之載劑、醫藥上可接受之鹽、助劑(auxiliary agent)、安定劑、稀釋劑、及溶劑、或其任何組合。
在一個實施例中，本文所述之抗體係施用於患者之唯一治療活性劑。替代地，本文所述之抗體與一或多種其他治療劑組合施用，該等其他治療劑包括但不限於TNF拮抗劑、消炎劑、細胞激素、生長因子、或其他治療劑。TNFR1拮抗性抗體可與一或多種其他治療方案同時或連續施用，較佳的與抗TNF治療劑，諸如抗TNF抗體一起施用。本文所述之抗體較佳地施用於患者作為一線治療、或作為無論急性或慢性治療中抗TNF治療劑無效時之二線治療。特別較佳地的醫學用途係用於治療慢性疾病。
再者，具治療有效量之本文所述抗體的受試者之治療或預防方案可由單一投藥組成，或替代地包含一系列應用。例如，抗體可每年至少施用一次，至少半年一次、或至少每月一次。然而，在另一個實施例中，對於給定的治療，可將抗體每週約一次施用於受試者至約每日施用。治療期的長短取決於多種因素，諸如疾病的嚴重程度（不論急性或慢性疾病）、患者的年齡、抗體形式(format)之濃度及活性。亦應理解用於治療或預防之有效劑量可在特定治療或預防方案的過程中增加或減少。藉由所屬技術領域中已知的標準診斷分析可得到劑量的變化並且變得顯而易見。在某些情況下，可能需要慢性投藥。
「非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis, NASH)」係一種肝臟疾病，與飲酒無關，其特徵在於肝細胞的脂肪變化，伴有小葉內炎症及纖維化。NASH係常見的，通常係「沉默的」肝臟疾病。其類似於酒精性肝病，但發生在少喝酒或不喝酒的人身上。NASH的三個主要特徵是將其與代謝來源之其他肝臟疾病區分開來：肝臟中異常的脂肪堆積或沉積（肝的脂肪變性）、肝臟炎症、及肝臟損傷或肝臟組織損傷（纖維化）。
NASH係一種潛在的嚴重病況，具有進展為末期肝病、肝硬化、及肝細胞癌之巨大風險。一些發展為肝硬化的患者有肝功能衰竭(liver failure)的風險，並且最終可能需要肝臟移植。可藉由NAFLD活性分數(NAFLD Activity Score，NAS)將NAFLD與NASH區分，其為脂肪變性肝活體組織切片（0至3）、小葉炎症（0至2）、及肝細胞腫脹（0至2）之組織病理學分數的總和。NAS ＜3對應於NAFLD，NAS為3至4對應於臨界NASH，NAS ＞ 5對應於NASH。亦將活體組織切片對纖維化評分（0至4）。
如本文中所使用，患有NASH的患者係具有NASH的患者、或已經被診斷具有NASH的患者、或遺傳上傾向於發展NASH的患者、或因為患有代謝症候群、肥胖、糖尿病、或糖尿病前期(pre-diabetes)而易患NASH的人。在又其他實施例中，患有NASH的患者係經過測試並且發現顯示NASH特徵之臨床發現（肝臟中脂肪異常堆積、肝臟炎症、及肝纖維化）的患者，儘管他或她可能還沒有表現出NASH的任何身體症狀。在某些情況下，患有NASH的患者即使尚未進行診斷，也會出現NASH症狀。
NASH的治療可造成NASH進展緩慢或停止進展成肝硬化。一些治療方案旨在延遲與NASH相關之身體症狀或身體症狀組(set)或臨床表現或發現的發作。在一些實施例中，治療得到至少一種可測量之NASH身體症狀（諸如，例如體重減輕、虛弱或疲勞）的改善。在其他實施例中，治療得到至少一種NASH的臨床參數或發現之改善，諸如，例如異常的肝臟脂肪堆積(liver fat accumulation)、藉由活體組織切片(biopsy)判定之肝纖維化、肝臟炎症(liver inflammation)、肝臟酵素（例如，ALT）之異常水平、發炎性細胞激素或NAS分數之異常水平。在其他實施例中，治療導致NASH的進展降低、抑制、或減緩，該等降低、抑制、或減緩物理性地藉由，例如，穩定可測量的症狀或症狀組（諸如疲勞、體重減輕、或虛弱）；或臨床/生理學上地藉由，例如，穩定下列可測量的參數：諸如肝臟中的異常脂肪堆積、肝酶的異常水平、肝臟發炎性標記的異常水平、肝臟活體組織切片中的異常發現、NAS分數或兩者。在另一個實施例中，治療亦可在疾病或病症完全表現出來之前得以避免NASH之起因及/或作用或臨床表現、或由NASH所引起的其中一種症狀。在一些實施例中，治療得以使具有NASH的患者之存活率或存活時間增加。在一些實施例中，治療得以使具有NASH的患者需要肝臟移植的可能性降低。在其他實施例中，治療得以使NASH患者排除進行肝臟移植的需要。在其他實施例中，其得以使具有NASH的患者發生肝硬化的機會減少。在其他實施例中，其藉由組織學(histology)判定得以預防進展為肝硬化。
本文所述之具體實施例意指「單株(monoclonal)」抗體(mAb)。藉由將抗體基因選殖到單株宿主細胞或相應的細胞株中來產生單株抗體。可使用藉由培養細胞株產生抗體分子的任何方法產生單株抗體，例如，培養重組真核（哺乳動物或昆蟲）或原核（細菌）宿主細胞。製備單株抗體的合適方法的實例包括Köhler＆Milstein (1975, Nature 256:495-497)的融合瘤方法及人類B細胞融合瘤方法（Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001；及Brodeur等人，1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63）。
可採用融合瘤方法鑑別或獲得本文所述之抗體。在此等方法中，使小鼠或其它合適的宿主動物（諸如倉鼠）免疫，以引發產生或能夠產生特異性結合至用於免疫的蛋白質之抗體的淋巴細胞。替代地，可在體外 免疫淋巴細胞。然後使用合適的融合劑（諸如聚乙二醇）將淋巴細胞(lymphocytes)與骨髓瘤細胞(myeloma cell)融合，以形成融合瘤細胞。
分析在融合瘤細胞生長的培養基中用於產生針對抗原的單株抗體。較佳地，藉由免疫沉澱法(immunoprecipitation)或藉由體外 結合分析法（諸如放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)或酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)），判定由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性。
然後可從融合瘤上清液中純化單株抗體以進一步測試其標靶抗原之特異性結合，以及抗體的工程化，例如，用於不同的診斷或治療目的。
在某些情況下，huTNFR1特異性抗體藉由針對huTNFR1抗原的篩選而出現。為了增加分離差異結合克隆(binding clones)的可能性，可以藉由對不同抗原或表位進行逐步篩選來應用多種選擇壓力。
可藉由下列者來完成用於鑑別具有所欲選擇性結合性質的抗體之篩選方法：藉由使用顯示抗體序列或其抗原結合序列之庫（例如，使用噬菌體、細菌、酵母、或哺乳動物細胞）之顯示技術；或藉由將核酸資訊翻譯成各自的（多）肽）之體外 顯示系統。可基於ELISA、西方墨點法(Western blotting)、或用流動式細胞測量術(flow cytometry)表面染色來評估反應性，例如，使用標準分析。
分離的（多個）抗原可係例如用於從抗體庫中選擇抗體，例如，噬菌體(phage)、噬菌體質體(phagemid)、或酵母(yeast)展示的(displayed)抗體庫。
本文所述之具體實施例意指「藥物組成物(pharmaceutical composition)」，此等組成物可包含如本文所述之抗體及醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑，特別是獲得人造非天然存在的組成物。這些醫藥組成物可根據本發明以單次快速注射或輸注或藉由連續輸注施用。適合於促進此等投藥方式之藥物載劑係所屬技術領域中眾所周知的。
醫藥上可接受之載劑通常包括與本文所述之抗體或相關組成物或組合在生理學上相容之任何及所有合適的溶劑、分散介質(dispersion media)、包衣、抗菌劑(antibacterial agent)及抗真菌劑(antifungal agent)、等滲劑(isotonic agent)及吸收延遲劑(absorption delaying agent)、及類似者。醫藥上可接受之載體的進一步實例包括無菌水、鹽水、磷酸鹽緩衝液、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似者、以及其任何組合。
在一個此等態樣，抗體可與適合於所需投藥途徑之一或多種載劑組合，抗體可例如與任何下列者混合：乳糖、蔗糖、澱粉、烷酸(alkanoic acid)之纖維素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、***膠(acacia)、明膠、海藻酸鈉(sodium alginate)、聚乙烯吡咯啶(polyvinylpyrrolidine)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)，並且可任選地進一步壓片(tableted)或膜封(encapsulated)以用於習知之投藥。替代地，可將抗體溶解於鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纖維素膠體溶液(carboxymethyl cellulose colloidal solution)、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黃蓍膠(tragacanth gum)、及/或各種緩衝液中。載劑可包括受控的釋放材料(release material)或延時材料(time delay material)，諸如單獨或與蠟一起的單硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate)或二硬脂酸甘油酯(glyceryl distearate)、或所屬技術領域中熟知的其他材料。
另外的醫藥上可接受之載劑係所屬技術領域中已知的，並且描述於例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES。液體製劑可係溶液、乳液、或懸浮液，並且可包括賦形劑，諸如懸浮劑、增溶劑、界面活性劑、防腐劑、及螯合劑(chelating agent)。
考慮醫藥組成物，其中配製了本文所述之抗體及一或多種治療活性劑。藉由將具有所需純度之該抗體與可選的醫藥上可接受之載劑、賦形劑、或安定劑以冷凍乾燥製劑(lyophilized formulation)或水溶液的形式混合，製備本文所述抗體之穩定製劑用於儲存。用於體內 投藥的製劑係無菌的。這可藉由無菌過濾膜或其他方法過濾而輕易完成。本文揭示之抗體及其他治療活性劑亦可配製成免疫微脂體(immunoliposome)，及/或包埋(entrapped)在微膠囊中。
包含本文所述抗體之醫藥組成物的投藥可以多種方式進行，包括口服、皮下(subcutaneously)、靜脈內(intravenously)、鼻內、經耳內(intraotically)、經皮(transdermally)、經黏膜(mucosal)、外用(topically)，例如凝膠、軟膏(salve)、乳液(lotion)、乳霜(cream)等，腹膜內(intraperitoneally)、肌肉內、肺內(intrapulmonary)，例如採用可吸入技術或肺部輸送系統、***、腸胃外(parenterally)、直腸(rectally)、或眼內(intraocularly)。
用於腸胃外投藥之例示性製劑包括適合於皮下、肌肉內、或靜脈內注射者，例如，無菌溶液、乳液、或懸浮液。
在一個實施例中，本文所述之抗體係施用於受試者的唯一治療活性劑，例如，作為疾病改善或預防單療法(monotherapy)。
在另一個實施例中，將本文所述之抗體與其他活性物質組合，例如，在混合物或套件(kit of parts)中，用於治療需要治療或預防的受試者，諸如疾病改善或預防組合療法(combination therapy)。
與一或多種其他治療劑或預防劑之組合可包括標準治療，例如，抗生素、類固醇及非類固醇之炎症抑制劑， 及/或其他基於抗體的療法。組合可具體包含用於治療原發性(primary)疾病之藥劑(agent)，其中發炎性過程會導致續發性(secondary)發炎、退化性(degenerative)、或惡性(malignant)疾病病況。原發性疾病係例如NASH，而組合會例如包括NSAID或其他新藥諸如FXR促效劑、GLP1R促效劑、或PPAR促效劑。
在聯合治療中，抗體可作為混合物施用，或者伴隨一或多種其他治療方案一起施用，例如，在伴隨治療之前、同時、或之後。
本文所述之抗體或相應藥物製劑的生物學性質可在細胞、組織、及整個生物體實驗中離體 表徵。如所屬技術領域中所知，藥物通常係在動物體內 進行測試，包括但不限於小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、豬、及猴子，以測量對疾病或疾病模型之治療的藥物療效，或測量藥物之藥物動力學、藥效學、毒性、及其他性質。動物可稱為疾病模型。治療劑通常係在小鼠中進行測試，包括但不限於裸鼠(nude mice)、SCID小鼠、異種移植(xenograft)小鼠、及轉基因(transgenic)小鼠（包括植入(knockins)及剔除(knockouts)）。此等實驗可以提供有意義的數據，用於判定抗體用作治療劑或預防劑的潛力，其具有適當的半衰期、效應物功能、抑制劑活性、及/或被動免疫療法(passive immunotherapy)之免疫反應。任何生物，較佳係哺乳動物，可用於測試。例如，由於彼等與人類之遺傳相似性，靈長類(primates)、猴子可係合適的治療模型，且因此可用以測試受試藥劑(subject agent)或組成物之療效、毒性、藥物動力學、藥效學、半衰期、或其他性質。人體中之測試最終需要核准為藥物，並因此當然要考慮這些實驗。因此，可在人體中測試本文所述之抗體及各個醫藥組成物，以判定其等之治療或預防療效、毒性、免疫原性、藥物動力學、及/或其他臨床性質。
因此，本發明提供了治療NASH的新方法，並且特別是與NASH相關之那些疾病病況。令人驚訝的是，如在小鼠模型中所示，抗TNFR1抗體顯著改善NASH中之肝脂肪變性及組織學疾病活性。TNFR1抑制得以使肝脂肪變性的百分比以及三酸甘油酯含量顯著降低。此外，抗TNFR1抗體治療顯著降低了考量脂肪變性、細胞腫脹(ballooning)、及小葉炎症(lobular inflammation)之NAFLD活性分數。出乎意料的是，選擇性TNFR1抑制在NAFLD小鼠模型中改善了肝纖維化，甚至能夠藉由減少肝組織中的纖維化來治療肝纖維化。進一步顯示抗TNFR1抗體治療能夠減少肝組織中的細胞凋亡。此外，實現了ALT及胰島素血清水平的顯著降低。因此，用抗TNFR1抗體治療得到NAFLD中炎症及胰島素抗性的顯著改善。
特別令人驚訝的是，鑑於現有技術，抗TNFR1抗體顯著改善NASH中肝脂肪變性及組織學疾病活性，因為據報導NASH或脂肪變性的發展係TNFi療法的副作用。Feagins等人報導了使用英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、或依那西普(etanercept)治療之克隆氏症(Crohn’s disease)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis)、及僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)患者，在TNFi治療期間出現異常ALT水平，並在肝生檢(biopsies)中顯示NAFLD（NASH或脂肪變性）(Eur J Gastroenterol Hepatol. 2015, 27(10):1154-1160)。因此非常出乎意料的是，選擇性抑制TNFR1對NASH係有效的。
本文所述之例示性抗體是係例如，根據WO2012035141產生之全長抗體，及/或如WO2008113515A2中所述之其親代小鼠抗體H398、任何前述的親和力成熟之功能活性變異體及/或抗體片段，或那些單價抗huTNFR1結合劑及包含任何前述抗原結合位點之抗體，諸如於WO2017174586A1中所述之單價抗體。
藉由下列實例進一步說明本發明，但不限於此。

實例

實例 1 ：用實驗性 NAFLD 改善小鼠的肝脂肪變性及組織學疾病活性
方法：
B6-huTNFR1-k/i-小鼠在飲用水中接受由60% kcal脂肪+果糖/蔗糖組成的高脂肪飲食(high fat diet，HFD)（Kohli R等人，Hepatology 2010）達24週，補充以抗TNFR1 (Atrosab)或對照抗體（西妥昔單抗(Cetuximab)，一種抗EGFR抗體，Erbitux® , ImClone Systems, Bristol-Myers Squibb und Merck KGaA）治療（20 mg/kg體重，2x/w）達另外8週。
本文中所使用之Atrosab抗體是根據WO2012035141產生的全長抗體並且包含併入VH及VL結構域組合中之抗原結合位點，該抗體包含六個CDR序列，該序列為：
SEQ ID NO：23；VH-CDR1
SEQ ID NO：24；VH-CDR2
SEQ ID NO：25；VH-CDR3
SEQ ID NO：26；VL-CDR1
SEQ ID NO：27；VL-CDR2
SEQ ID NO：28；VL-CDR3.
在治療結束時，比較來自差異治療之小鼠的肝組織其肝脂肪變性、NAFLD活性分數、細胞凋亡、及纖維化。
根據Kleiner等人(Hepatology 2005)的方法，由病理學家評估脂肪變性的百分比以及NAFLD活性分數(NAFLD activity score, NAS)。藉由使用酶試驗(Roche Diagnostics)在均質化的肝組織中測定三酸甘油酯含量。使用針對活化的凋亡蛋白酶-3（細胞傳訊）之抗體藉由免疫組織化學研究細胞凋亡。根據製造商(Sigma Aldrich)的方案藉由天狼星紅染色檢測纖維化，並如所述(Schindelin J et al., Nat Methods 2012)定量。
藉由動力學UV測試(Beckman Coulter)分析血清的ALT水平，並且使用超靈敏(ultra-sensitive)小鼠胰島素ELISA套組(Crystal Chem.)根據製造商的說明書測量胰島素水平。
結果：
Atrosab治療得到用實驗性NAFLD顯著改善小鼠的肝脂肪變性及組織學疾病活性。
用抗TNFR1抗體(Atrosab)或對照（西妥昔單抗）抗體治療的HFD小鼠之肝組織以組織學分析肝脂肪變性百分比，藉由NAFLD活性分數(NAS)評估三酸甘油酯含量及疾病活性。相較於用對照抗體治療的小鼠，TNFR1抑制得到肝脂肪變性百分比（p＜0.05；圖1A）以及三酸甘油酯含量（p＜0.01；圖1B）顯著降低。此外，相較於對照小鼠，在Atrosab治療中考量脂肪變性、細胞腫脹、及小葉炎症之NAFLD活性分數(NAS)顯著(p＜0.05)降低（圖1C）。

實例 2 ：選擇性 TNFR1 抑制與 NAFLD 小鼠模型中肝纖維化的改善有關
已經證實選擇性TNFR1抑制改善肝脂肪變性及NAS，分析了Atrosab對纖維化降低之影響。相較於用對照抗體治療的小鼠，藉由天狼星紅染色評估證實了用抗TNFR1抗體治療的小鼠之肝纖維化的改善（圖2A）。相較於對照小鼠，纖維化區域的定量顯示了用抗TNFR1抗體治療的小鼠之肝組織中纖維化顯著(p＜0.05)減少（圖2B）。

實例 3 ：用抗 TNFR1 抗體治療的 NAFLD 小鼠之肝組織中細胞凋亡減少
在初始實驗中，小鼠接受HFD達20週，包括用抗TNFR1或對照抗體治療4週。藉由活性凋亡蛋白酶-3之免疫組織化學分析評估，已證實抗TNFR1抗體治療能夠在4周治療期內減少細胞凋亡。相較於對照抗體，在用抗TNFR1抗體治療的小鼠之肝組織中觀察到活性凋亡蛋白酶-3的顯著(p＜0.05)降低（圖3）。

實例 4 ：用抗 TNFR1 抗體治療的 NAFLD 小鼠血清中 ALT 及胰島素水平的改善
符合用抗TNFR1抗體治療的小鼠之改善的組織學觀察結果（圖1及2），相較於用對照抗體治療的小鼠，證實了用抗TNFR1抗體治療的小鼠中ALT（圖4A）及胰島素（圖4B）血清水平顯著(p＜0.05)降低。因此，選擇性抗TNFR1抑制得到炎症及胰島素抗性的顯著改善。

實例 5 ： Atrosimab 之描述 - 生產及表徵
材料
如實例1中所述獲得Atrosab抗體。如WO2012035141中所述產生重組人類TNFR1-Fc融合蛋白。在Catalent (Catalent Pharma Solutions, Somerset, Ewing, NJ, US)的CHO細胞中進行慢病毒轉導(lentiviral transduction)後，產生Atrosimab (HC: SEQ ID NO：18；LC:SEQ ID NO：13)並純化。抗His-HRP (HIS-6 His-Probe-HRP, sc-8036)購自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)。抗人類IgG A（山羊，多株，2010-01）獲自SouthernBiotech，及抗人類IgG B（山羊，多株，MBS571163）以及抗人類IgG B（山羊，多株，MBS571678）獲自MyBioSource, (San Diego, CA, USA)。此外，抗人類IgG（Fab特異性，A 0293）及抗人類IgG（Fc特異性，A 0170）購自Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany)。
蛋白質生產
使用聚乙烯亞胺（線性，25 kDa, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany）在瞬時轉染的HEK 293E細胞中，如WO2017174586A1中所述生產參考蛋白質(reference protein) Fab 13.7，並且嚴格按照製造商(CaptureSelect™ IgG-CH1 Affinity Matrix, 194320005, Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Germany)的建議藉由蛋白質親和性層析法(protein affinity chromatography)純化。
蛋白質表徵
在存在及不存在β-巰基乙醇作為還原劑的情況下，使用4 μg純化蛋白質藉由SDS-PAGE來分析Atrosimab的純度及正確組裝。使用考馬斯亮藍(Coomassie-Brilliant Blue)將凝膠中的蛋白質染色，並用水將凝膠脫色(de-stained)。使用Waters 2695 HPLC及Phenomenex Yarra SEC-2000管柱(300 x 7.8 mm)，藉由粒徑篩析層析法(size-exclusion chromatography)分析完整蛋白質。標準蛋白：甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin) (669 kDa)、脫鐵鐵蛋白(Apoferritin) (443 kDa)、醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase) (150 kDa)、BSA (66k Da)、碳酸酐酶(Carbonic anhydrase) (29 kDa)、FLAG肽(1 kDa)。
熱穩定性
使用100 μg PBS中的純化蛋白質，藉由動態光散射(ZetaSizer Nano ZS, Malvern, Herrenberg, Germany)判定Atrosimab的熔化/聚集溫度(Tm )。在每次測量之前，所施加的溫度以1℃的間隔從35℃增加至80℃，平衡時間為2分鐘。藉由增加信號(kcps)的目視判讀來判定Tm 。
血漿穩定性
將純化的Atrosimab樣本在人類血漿中稀釋至100 nM的濃度，並在37 ℃下培養1、3、及7天。在PBS中的2 %脫脂乳(2 % MPBS)以1至3.16（10的平方根）個步驟連續稀釋後，藉由ELISA對人類TNFR1的剩餘結合能力(remaining binding capacity)進行後續分析。將對照樣本在4℃下於PBS中培養7天或在人類血漿中稀釋後直接冷凍。
酵素結合免疫吸附分析法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)
用100 μl之TNFR1-Fc融合蛋白（1 µg/ml於PBS中）包覆微量滴定板(microtiterplate)，並在4℃培養過夜。在室溫下用2 % MPBS（PBS中的脫脂乳，每孔200 μl）封閉殘餘結合位點2小時，隨後用PBS洗滌兩次。將100 μl稀釋於2% MPBS中之樣本在最後一個培養步驟之前，於室溫下用100 μl在2 % MPBS中的HRP共軛檢測抗體培養1小時。用100 μl TMB受質溶液(substrate solution)（1 mg/ml 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺[3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, TMB]，0.006 % H2 O2 於100 mM乙酸鈉緩衝液，室溫下pH 6）檢測結合的蛋白質，藉由添加50 μl 1M H2 SO4 終止HRP反應，並使用Infinite微量滴定板讀取器(TECAN, Maennedorf, Switzerland)測量450 nm波長處之吸收。在各培養步驟之間及檢測之前，將板用PBST洗滌兩次並用PBS洗滌兩次。
使用石英晶體微量天平 (Quartz Crystal Microbalance) 之親和力測量
藉由石英晶體微量天平測量(Cell-200 C-Fast, Attana, Stockholm, Sweden)測定蛋白質-蛋白質之交互作用中的即時(real-time)結合動力學。根據製造商的方案，將一種結合夥伴(binding partner) (TNFR1-Fc)化學固定在LNB羧基感測器晶片(3623-3103, Attana, Stockholm, Sweden)上，中等密度為~ 94 ΔHz。用在pH 7.4下以128 nM與4 nM（1：2稀釋步驟）之間稀釋於PBST (PBS, 0.1 % Tween 20)中的樣品（分析物）在37℃下以25 μl/min的流速進行結合實驗。用25 μl、20 mM之甘胺酸(pH 2.0)使晶片再生。每隔三次測量，即測量注射之流動緩衝液，該流動緩衝液在數據分析之前從結合曲線中減去。使用Attana提供之軟體收集數據，並藉由Attaché Office Evaluation軟體(Attana, Stockholm, Sweden)及TraceDrawe (ridgview instruments, Vange, Sweden)進行分析。
介白素釋放分析
將每孔2 × 104 個HeLa或HT1080細胞接種到96孔微量滴定板中，並在100 μl RPMI 1640 + 5 % FCS中生長過夜。第二天，更換上清液以移除組成型(constitutively)產生之細胞激素。將細胞與稀釋系列之樣本一起在RPMI 1640 + 5 % FCS中於37 ℃、5 % CO2 下培養。在競爭實驗的情況下，個別製備兩種分析的蛋白質樣本（滴定或稀釋至單一濃度），並隨後加至板中。非刺激的細胞作為對照。16至20小時後，將板以500 g離心5分鐘，並藉由ELISA直接分析細胞上清液，其係根據製造商的方案進行。將上清液稀釋於RPMI 1640（不含FCS）中，並將抗體稀釋於試劑稀釋液(Reagent Diluent)（0.1 % BSA、0.05 % Tween 20、20 mM TRIS、150 mM NaCl，pH7.5）中。使用PBS中的1 % BSA（牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)）封閉包覆的微量滴定板並洗滌，以及進行如上所述用於ELISA之檢測及測量。用於檢測細胞培養上清液中IL-6及IL-8之夾心ELISA套組係購自ImmunoTools　(Friesoythe, Germany)。
細胞毒性 / 細胞存活性分析
將細胞（每孔1 × 104 ）接種到96孔微量滴定板中並在37 °C及5 % CO2 下培養過夜。將蛋白質在RPMI 1640 + 10％FCS中稀釋並加至細胞中。將細胞毒性檢測物(cytotoxicity assays)在37 °C、5 % CO2 下培養24小時，然後摒棄上清液並向孔中添加50 μl結晶紫色溶液。隨後，將板在ddH2 O中洗滌20次並乾燥。藉由在染色溶液中含有的甲醇固定之活細胞及黏附細胞(adherent cell)產生的剩餘紫色染料，藉由在室溫下添加100 μl甲醇並振盪10分鐘使其溶解。使用Infinite微量滴定板讀取器(Tecan, Maennedorf, Switzerland)測量板。
藥物動力學
在特定小鼠基因的基因座(locus)處攜帶人類TNFR-1的細胞外結構域基因之轉基因C57BL/6J小鼠（C57BL/6J-huTNFRSF1Aecdtm1UEG/izi，Dong等人，2016）接受靜脈內注射400 μg Atrosimab。在3 min、30 min、1 h，2 h、及6 h、以及3天、及7天後，收集血液樣本並立即在冰上培養。藉由離心（13.000 g，4 °C，10分鐘）分離血清並儲存在-20 ℃下。如上所述藉由結合ELISA檢測血清中的剩餘蛋白質。從新鮮製備之分析蛋白質的標準結合曲線內插ELISA訊息。將所判定之濃度對時間作圖，並使用用於Microsoft Excel之PKsolver插件(add-in)分析，獲得藥物動力學常數。

實例 5.1 ： Atrosimab 之生物化學表徵
藉由將Fab 13.7之可變結構域與異二聚化Fc模組Fc1k (1/κ)之N端融合，產生單價腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)受體1 (TNFR1)特異性拮抗劑，指稱為Atrosimab。此過程得到增大尺寸之類Fab (Fab-like)單價分子，其具有與新生兒Fc受體交互作用的能力，以便賦能延長血清循環（圖6a）。所得藥物候選物Atrosimab在幾輪慢病毒轉導後於CHO細胞中產生，藉由Catalent Pharma Solutions (Catalent Pharma Solutions, Somerset, Ewing, NJ, US)之蛋白質A親和性層析法(protein affinity chromatography)及連續粒徑排阻層析法(size exclusion chromatography, SEC)純化。
Atrosimab在SEC中具有單峰，保留時間(retention time)為17.9分鐘，內插分子量(interpolated molecular weight)為81 kDa，斯托克斯半徑(stokes radius) rS 為3.5 nm（圖6b）。在SDS-PAGE中，檢測到還原條件下38 kDa及43 kDa之兩條帶，以及非還原條件下70 kDa之一條帶（圖6c）。這些數據與經計算之72 kDa的分子量（由35 kDa及36 kDa鏈組成）良好地對應，指明兩條多肽鏈之正確表現及功能性異二聚體蛋白質之正確組裝。此外，如由動態光散射(dynamic light scattering)（DLS，圖6d）所判定，顯示Atrosimab的聚集點(Tm )為64 ℃，其係與亦由DLS分析之完整IgG分子相當（Martin等人，2014；Brader等人，2015）。最後，在人類血漿中培養至多7天後，Atrosimab與人類TNFR1-Fc的結合活性保持不變，表示良好的血漿穩定性（圖6e）。

實例 5.2 ： A Atrosimab 與 TNFR1 、 Fcγ 受體、及補體蛋白 C1q 之結合
在平衡條件下藉由ELISA分析Atrosimab與其標靶受體TNFR1的交互作用，得到EC50 值為0.4 nM（圖7a），表示相較於親代Fab 13.7，結合活性降低兩倍，而相較於二價IgG ATROSAB，降低了四倍。再者，在即時結合研究中使用石英晶體微量天平，以1：1結合演算法分析結合至人類TNFR1（固定在~94 Δhz的中等受體密度）之Atrosimab，其視解離常數(apparent KD )值為2.7 nM，而kon 為3.7 × 105 M-1 s-1 、及koff 為9.8 × 10-4 s-1 （圖7b）。值得注意的是，Atrosimab包含Fc區，該Fc區經修飾以減少抗體介導之效應子功能（Armor等人，1999）。因此，如ELISA所證實，Atrosimab顯示了幾乎完全缺乏與人類Fcγ受體Ia、IIb、及IIIa、以及補體蛋白C1q的結合（圖7c）。相較於先前所述的抗人類TNFR1 IgG ATROSAB（Zettlitz等人，2010），結合降低至相似程度（FcγRI及FcγRIII）、或甚至更顯著（FcγRIIb及C1q），關於Fcγ受體及C1q的結合，其攜帶相同的Fc修飾。

實例 5.3 ： Atrosimab 在體外抑制 TNFR1 活化並且缺乏任何促效活性
Atrosimab在介白素(IL)釋放實驗中顯示在50 pM與500 nM之間的分析濃度範圍內完全沒有任何促效生物活性，使用HeLa細胞分析IL-6及HT1080細胞之IL-8，以及在細胞死亡誘導分析中使用Kym-1細胞（圖3a至c）。在親代Fab 13.7的情況下檢測到相同的缺乏促效作用。相反地，二價IgG ATROSAB在1 nM與100 nM之間的濃度誘導了IL-6及IL-8的邊際釋放(marginal release)（圖8a及b），此證實了先前發表的數據（Richter等人，2013）。相反地，在Kym-1細胞死亡誘導分析中無法檢測到ATROSAB的邊際促效活性（圖8c）。
此外，Atrosimab抑制了在HeLa IL-6釋放分析及HT1080 IL-8釋放分析中由0.1nM TNF誘導的TNFR1活化，EC50 值分別為54.5 nM及24.2 nM（圖8d及e）。再者，Atrosimab抑制了Kym-1細胞中由0.1 nM TNF誘導的細胞死亡，IC50 值為16.2 nM（圖8f）。當與親代Fab 13.7比較時，這些數據表示生物活性降低1.5倍至1.9倍（表1）。然而，相較於二價IgG ATROSAB的生物活性，如在IL‑6釋放分析、IL-8釋放分析、及細胞死亡誘導分析中所判定的，證實了Atrosimab對TNF介導的TNFR1活化更能有效抑制，分別係3.0倍、3.5倍、及4.0倍（表1）。
表 1Atrosimab之生物活性
解決由例如抗藥物抗體(anti-drug antibodies, ADA)介導之Atrosimab二次交聯(secondary crosslinking)的潛在風險，使用HT1080細胞在IL-8釋放檢測中在三種不同的小鼠抗人類IgG血清存在下分析Atrosimab的促效潛力（Richter等人，2013）。藉由ELISA證實小鼠抗人類IgG血清與Atrosimab、Fab 13.7、及ATROSAB之結合（數據未顯示）。值得注意的是，Atrosimab在分析的濃度範圍（50 pM至500 nM）內並未誘導任何IL-8的釋放，此亦在親代Fab 13.7中觀察到（圖9a至c）。相反地，當與圖8中觀察到的邊際釋放相較時，二價IgG ATROSAB誘導了明顯增加的IL-8釋放（圖9a至c），表示相較於ATROSAB，即使在藥物特異性抗體存在下，Atrosimab明顯降低了介導任何TNFR1活化的傾向。
實例 5.4 ： Atrosimab 之藥物動力學
最後，使用C57BL/6J-huTNFRSF1Aecd tm1UEG /izi （Dong等人，2016）小鼠單次快速注射400 μg蛋白質後，記錄Atrosimab之藥物動力學性質，該小鼠攜帶人類TNFR1細胞外結構域之轉基因(transgene)（圖10，表2）。從小鼠循環中消除了Atrosimab，初始半衰期(initial half-life)為2.2 ± 1.2小時，終點半衰期(terminal half-life)為41.8 ± 18.1小時，得到曲線下面積為5856.0 ± 1369.9 μg/ml × h。

表 2Atrosimab之藥物動力學分析

t1/2 α，初始半衰期(initial half-life)；t1/2 β，終點半衰期(terminal half-life)；C0 ，內插初始濃度(interpolated initial concentration)；AUC 0-t，曲線下面積直到最後檢測到的時間點；Vss ，分布體積（在穩定狀態下）；CL，廓清率(clearance)。
SEQ ID NO：1；VH-CDR1
DFYIN

SEQ ID NO：2；VH-CDR2
EIXPXXGXAXYNXKFKA
其中
位置3的X係Y或V中之任一者；
位置5的X係Y、T、S或G中之任一者；
位置6的X係S或Q中之任一者；
位置8的X係H或E中之任一者；
位置10的X係Y或K中之任一者；
位置13的X係E或D中之任一者。

SEQ ID NO：3；VH-CDR3
WDFLDY

SEQ ID NO：4；VL-CDR1
RSSQSLLHSNGNTYLH

SEQ ID NO：5；VL-CDR2
TVSNRFS

SEQ ID NO：6；VL-CDR3
SQXTHVPYT
其中，位置3的X係S或G中之任一者

SEQ ID NO：7；IgG13.7/ Fab13.7之VH
HVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDFYINWVRQAPGQGLEWIGEIVPSQGEAKYNDKFKARVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDFLDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：8；IgG13.7/ Fab13.7之VL
DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLLHSNGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHVPYTFGGGTKVEIKRTVAA

SEQ ID NO：9；ATROSAB/ IZI06.1之VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDFYINWVRQAPGQGLEWIGEIYPYSGHAYYNEKFKARVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDFLDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：10；ATROSAB/ IZI06.1之VL
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGGGTKVEIKR

SEQ ID NO：11；（Fab13.7重鏈[粗體 = VH])
HVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDFYINWVRQAPGQGLEWIGEIVPSQGEAKYNDKFKARVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDFLDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

SEQ ID NO：12；(Fab13.7輕鏈[粗體 = VL])
DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLLHSNGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHVPYTFGGGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO：13； VL1C （ VL13.7-CH2-CH31 ；含有 VL 及 CH1 的鏈）：
DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLLHSNGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHVPYTFGGGTKVEIKGTGGGSGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPSDIAVEWESGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYSCSVMHEALHNHYTQKSVEPKSC

VL1C詳細說明：

SEQ ID NO：14；VL13.7
DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLLHSNGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHVPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：15；連接子
GTGGGSG

SEQ ID NO：16；CH2
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK

SEQ ID NO：17；CH31 GQPREPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPSDIAVEWESGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYSCSVMHEALHNHYTQKSVEPKSC

SEQ ID NO：18； VHkC （ VH13.7-CH2-CH3κ ；含有 VH 及 CLk 的鏈 ）：
HVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDFYINWVRQAPGQGLEWIGEIVPSQGEAKYNDKFKARVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDFLDYWGQGTTVTVSSGTGGGSGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLVNNFYPRDIAVEWEVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYSCSVMHEALHNHYTQKSFNRGEC

VHkC詳細說明：

SEQ ID NO：19；VH13.7
HVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDFYINWVRQAPGQGLEWIGEIVPSQGEAKYNDKFKARVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDFLDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：15；連接子
GTGGGSG

SEQ ID NO：16；CH2
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK

SEQ ID NO：20；CH3k
GQPREPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLVNNFYPRDIAVEWEVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYSCSVMHEALHNHYTQKSFNRGEC

SEQ ID NO：21； VL1C （ VL13.7-CH2-CH31 ；含有 VL 及 CH1 的鏈）：
gatgtgcagatgacccagagccccagcagcctgtctgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcggagcagccagagcctgctgcacagcaacggcaacacctacctgcattggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaccgtgtccaacagattcagcggcgtgccctctagattctccggctctggcagcggcaccgacttcaccctgaccatctctagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgcagccagtccacccacgtgccgtatacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaaaggtaccggcggaggatctggccctagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagtttaattggtacgtggacggcgtggaagtgcataacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctcgggaaccctccgtgtttcctctggcccctagcagcaagagcacctctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactacttccccagcgacattgccgtggaatgggagtctggcgccctgaccagcggagtgcatacctttccagcagtgctccagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgacagtgcccagctctagcctgggcacccagacctactcttgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaaaagcgtggaacccaagagctgc

SEQ ID NO：22； VHkC （ VH13.7-CH2-CH3κ ；含有 VH 及 CLk 的鏈 ）：
cacgtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtgaagaaacccggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacaccttcaccgacttctacatcaactgggtgcgccaggctccaggacagggcctggaatggatcggcgagatcgtgcctagccagggcgaggccaagtacaacgacaagttcaaggccagagtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggaactgagcagcctgcggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccagatgggacttcctggactactggggccagggcaccaccgtgacagtctcgagcggtaccggcggaggatctggccctagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctcgggaacccagcgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtctggcacagccagcgtcgtgtgcctcgtgaacaacttctaccccagagacattgccgtggaatgggaggtggacaacgccctccagagcggcaacagccaggaaagcgtgaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaaacataaggtgtacagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccttcaaccggggcgagtgc

SEQ ID NO：23
DFYIN

SEQ ID NO：24
EIYPYSGHAYYNEKFKA

SEQ ID NO：25
WDFLDY

SEQ ID NO：26
RSSQSLLHSNGNTYLH

SEQ ID NO：27
TVSNRFS

SEQ ID NO：28
SQSTHVPYT

SEQ ID NO：29；
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDFYINWVRQAPGQGLEWIGEIYPYSGHAYYNEKFKARVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDFLDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：30；
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGGGTKVEIKR

SEQ ID NO：31：人類IgG1 Fc：
tcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO：32：huTNFR1序列：
MGLSTVPDLLLPLVLLELLVGIYPSGVIGLVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLPQIENVKGTEDSGTTVLLPLVIFFGLCLLSLLFIGLMYRYQRWKSKLYSIVCGKSTPEKEGELEGTTTKPLAPNPSFSPTPGFTPTLGFSPVPSSTFTSSSTYTPGDCPNFAAPRREVAPPYQGADPILATALASDPIPNPLQKWEDSAHKPQSLDTDDPATLYAVVENVPPLRWKEFVRRLGLSDHEIDRLELQNGRCLREAQYSMLATWRRRTPRREATLELLGRVLRDMDLLGCLEDIEEALCGPAALPPAPSLLR

SEQ ID NO：33；IgG1：絞鏈區
DKTHTCPPCPAPELLGG
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無
圖1：B6-huTNFR1-k/i-小鼠接受高脂肪飲食(high fat diet，HFD)達32週，包括在過去8週內用抗TNFR1或對照抗體(Ab)治療。相較於用對照抗體(control antibody)治療的小鼠之肝組織，用抗TNFR1-Ab治療的HFD小鼠肝組織顯示肝組織中脂肪變性(A)、三酸甘油酯含量(B)、及NAFLD活性分數(C)顯著降低。*p＜0.05；**p＜0.01。
圖2：B6-huTNFR1-k/i-小鼠接受高脂肪飲食(high fat diet，HFD)達32週，包括在過去8週內用抗TNFR1或對照抗體(Ab)治療。用抗TNFR1-Ab治療的HFD小鼠之肝組織顯示藉由天狼星紅染色(Sirius Red staining)評估肝纖維化的改善(A)，其相較於來自用對照抗體治療之小鼠的肝組織係顯著的(B)。*p＜0.05。
圖3：B6-huTNFR1-k/i-小鼠接受高脂肪飲食(high fat diet，HFD) 20週，包括在過去4週內用抗TNFR1或對照抗體(Ab)治療。相較於對照抗體，抗TNFR1-抗體治療導致肝組織中凋亡蛋白酶-3 (caspase-3)活化的顯著降低。*p＜0.05。
圖4：B6-huTNFR1-k/i-小鼠接受高脂肪飲食(high fat diet，HFD)達32週，包括在過去8週內用抗TNFR1或對照抗體(Ab)治療。相較於對照抗體，用抗TNFR1-Ab治療導致ALT及胰島素血清水平的顯著改善。* p＜0.05
圖5：Atrosimab（HC： SEQ ID NO：18，LC： SEQ ID NO：13）之生物化學表徵。(a)Atrosimab分子組成之代表性圖(representative cartoon)（白色：源自Fc的恆定Ig結構域；亮灰色：VH及源自CH1的序列：深灰色：VL及源自CLκ的序列）。Atrosimab的特徵在於：SEC (b) TSKgel SuperSW mAb HR，流速0.5 ml/min，移動相Na2HPO4/NaH2PO4及SDS-PAGE (c) NuPAGETM 4-12%Bis-TRIS Midi Gel於還原(R)及非還原條件(NR)下。M：標記。(d)藉由動態光散射(dynamic light scattering)及獲得的數據點之目視判讀來分析Atrosimab的熱穩定性。藉由檢測ELISA中對人類TNFR1的殘餘結合活性來分析在人類血漿中培養後之Atrosimab的穩定性(e)。條狀代表三個個別實驗的EC50值（平均值±SD）。一個樣本在PBS中於4℃下培養，而一個樣本在人類血漿中稀釋後直接冷凍至-20 ℃作為對照。
圖6：抗原結合及與Fc受體和C1q互補蛋白之相互作用。藉由ELISA分析Atrosimab與人類TNFR1-Fc的平衡結合（(a) n = 3，平均值±SD）。Fab 13.7（含有相同的VH及VL）及ATROSAB（低親和力之二價形式(bivalent version)）作為對照。(b)使用1：1結合演算法，藉由QCM在128 nM與4 nM（1：2稀釋步驟）之間的五個濃度記錄實時結合動力學，用於數據分析。(c)藉由ELISA分析固定化Atrosimab以及兩種對照蛋白ATROSAB（沉默Fc）及利妥昔單抗(Rituximab)（野生型Fc部分）與人類FcγRI、IIb、及III還有補體蛋白C1q之交互作用（n = 2，平均值±SD）。
圖7：Atrosimab之拮抗生物活性及缺乏促效作用。在三種不同的體外分析中證實了Atrosimab完全缺乏促效活性：(a)從HeLa細胞釋放IL6，(b)從HT1080細胞釋放IL-8，及在細胞死亡誘導(cell death induction)分析中使用Kym 1細胞(c)。證實了完全促效性質之親代Fab 13.7以及在(a)及(b)中顯示出輕微促效作用之二價IgG ATROSAB作為對照蛋白。分別藉由IL-6釋放(d)、IL-8釋放(e)、及細胞死亡誘導(f)，分析了相同組的蛋白質抑制HeLa、HT1080、及Kym-1細胞中細胞表面上TNFR1活化的可能性。使用0.1 nM TNF（d及e）或0.01 nM TNF (f)活化TNFR1。所有圖表代表三個個別實驗的平均值，誤差條表示SD。
圖8：在抗人類IgG抗體存在下缺乏Atrosimab之促效作用。在使用三種不同的小鼠抗人類IgG血清的IL-8釋放分析中（a、b、及c），藉由Atrosimab在恆定濃度（約15.8 nM）的藥物特異性抗體存在下活化HT1080細胞表面上之TNFR1。單獨的小鼠抗人類IgG血清、未受刺激的細胞、及TNF (33nM)作為對照。所示者係三次個別實驗的平均值±SD。
圖9：Atrosimab的藥物動力學分析。在C57BL/6J嵌入(knock-in)小鼠中單次快速注射(bolus injection) 400 μg蛋白質後，在小鼠血清中判定Atrosimab的循環濃度，其表現與鼠跨膜(murine transmembrane)及細胞內結構域連接之人類TNFR1的細胞外結構域而不是完全鼠蛋白。在ELISA中與人類TNFR1-Fc結合後判定完整蛋白。該圖顯示五隻小鼠的平均值±SD。














































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































Claims (15)

  1. 一種特異性識別人類腫瘤壞死因子1 (human tumor necrosis factor 1，huTNFR1)之抗體，用於治療非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)及與其關聯之疾病。
  2. 如請求項1所述之抗體，其特異性識別膜（－huTNFR1的遠端CRD1及/或CRD2之亞結構域A1）內之表位，較佳地特異性識別huTNFR1的N端區域中由胺基酸1至115所表示之表位。
  3. 如請求項1或2所述之抗體，其係單株抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之抗體，其係單特異性、二價全長抗體。
  5. 如請求項4所述之抗體，其中該抗體包含IgG1 Fc結構域，該IgG1 Fc結構域缺乏介導效應物功能，該抗體較佳地包含至少一種選自由下列所組成之群組的突變：E233P、L234V、L235A、G236、A327G、A330S、和P331S，較佳地包含A327G/A330S/P331S，其中編號係根據Kabat EU指數。
  6. 如請求項1至3中任一項所述之抗體，其中單價識別該huTNFR1。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之抗體，其包含： a)重鏈可變結構域(VH)，該重鏈可變結構域(VH)包含互補決定區(complementarity-determining region，CDR)：VH-CDR1、VH-CDR2、及VH-CDR3；以及 b)輕鏈可變結構域(VL)，該輕鏈可變結構域(VL)包含CDRs：VH-CDR1、VH-CDR2、及VH-CDR3， 其中 i) VH-CDR1包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1組成； VH-CDR2包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成； VH-CDR3包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3組成； VL-CDR1包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4組成； VL-CDR2包含SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5組成； VL-CDR3包含SEQ ID NO：6或由SEQ ID NO：6組成； 或 ii) VH-CDR1包含SEQ ID NO：23或由SEQ ID NO：23組成； VH-CDR2包含SEQ ID NO：24或由SEQ ID NO：24組成； VH-CDR3包含SEQ ID NO：25或由SEQ ID NO：25組成； VL-CDR1包含SEQ ID NO：26或由SEQ ID NO：26組成； VL-CDR2包含SEQ ID NO：27或由SEQ ID NO：27組成； VL-CDR3包含SEQ ID NO：28或由SEQ ID NO：28組成； 其中編號係根據Kabat EU指數； 或上述i)或ii)中任一項之功能活性變異體，該功能活性變異體在CDR序列之各者中包含0、1、或2個點突變，並且該功能活性變異體特異性識別huTNFR1。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之抗體，其包含VH序列、及VL序列、或其功能活性變異體；該VH序列包含SEQ ID NO：7或9、或由SEQ ID NO：7或9組成，該VL序列包含SEQ ID NO：8或10、或由SEQ ID NO：8或10組成，或該功能活性變異體在CDR序列之各者中包含至多1個點突變，並且在VH及VL之框架(FR)序列FR1至FR4中具有至少60％的序列一致性。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之抗體，其中該疾病病況係肝脂肪變性(hepatic steatosis)、肝臟發炎(inflamed liver)、肝纖維化(liver fibrosis)、及肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)中之任一者。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之抗體，其中將有效量之該抗體施用於患有NASH的患者，以拮抗TNFa/huTNFR1傳訊。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之抗體，其中將有效量之該抗體施用於患有NASH的患者，以減少下列之任何一或多者： a)肝組織中的脂肪變性、三酸甘油酯含量、炎症、及/或細胞凋亡； b)血清胺基轉移酶水平； c)胰島素抗性並且可選地改善葡萄糖耐受性；及/或 d) NAFLD活性分數。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之抗體，其中將該抗體以0.05 mg/kg至20 mg/kg之劑量範圍施用於患有NASH的患者。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之抗體，其中將該抗體施用於患有NASH的患者，與用消炎藥之治療、或使用類法尼醇(Farnesoid) X受體(FXR)促效劑、類升糖素肽-1受體(GLP1R)促效劑、或過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)促效劑的治療一起組合。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之抗體，其中將該抗體施用於亦患有第II型糖尿病、第I型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性、或肥胖的患者，其中肥胖係經定義為具有至少30之身體質量指數的患者。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體，其中使用包含有效量之該抗體的藥物製劑。
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