KR20200089699A

KR20200089699A - 비알콜성 지방간염의 항-huTNFR1 요법

Info

Publication number: KR20200089699A
Application number: KR1020207017059A
Authority: KR
Inventors: 헤이크 반텔; 클라우스 피젠마이어; 안드레아스 허만
Original assignee: 발리오팜 아게
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-07-27
Also published as: IL274770A; JP2021504379A; BR112020010632A2; EP3717068A1; SG11202003910VA; CN111787980A; JP7280259B2; US11028178B2; WO2019102023A1; TW201925234A; EA202091182A1; MX2020005445A; US20200299396A1; CA3081493A1; AU2018371232A1

Abstract

본 발명은, 비알콜성 지방간염(NASH) 및 이와 연관된 질환 증상의 치료에 사용하기 위한, 인간 종양 괴사 인자 1(huTNFR1)을 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다.

Description

비알콜성 지방간염의 항-huTNFR1 요법

본 발명은, 비알콜성 지방간염(NASH) 및 이와 연관된 질환 증상의 신규한 치료에 관한 것이다.

비-알콜성 지방간 질환(NAFLD)은 알콜 남용의 부재하에 발생하는 일련의 질환을 나타내고, 비-알콜성 지방간염(NASH)을 포함한다. NAFLD는 서구 국가에서 발생률의 증가를 나타내고, 간세포 암종의 발증에 결정적으로 기여한다.

양성 간 지방증으로부터 진행성 지방간염으로의 순서를 따라 한 가지 기본적 단계는, 아폽토시스로서 분류되는 간세포 세포사의 발생이다. 네크로톱시스는 프로그램된 대체 세포사 경로로서 부상되었고, NASH 환자의 간에서 활성화되는 것으로 밝혀졌다[참조: Gautheron et al. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology 2015, 1:264-266].

아파리시오-베르가라 등(Aparicio-Vergara et al.)[참조: Hepatology 2013, 57(2):566-576]은 간 지방증 또는 인슐린 저항성의 발증을 예방하는데 있어서 TNFR1 엑토도메인 탈락의 역할을 기재한다. TNFR1 탈락의 불능은 마우스의 비만, 인슐린 저항성 또는 간 지방증을 초래하지 않았다. 그러나, 비-탈락 돌연변이를 포함하는 마우스는 NASH로의 신속한 진행을 나타냈다. TNFR1 엑토도메인 탈락의 활성화는 NASH로의 진행을 약화시키는데 매우 중요한 것으로 밝혀졌다.

쿠베로 등(Cubero et al.)[참조: Cell Death and Differentiation 2013, 20:1580-1592]는 간세포 및 면역 세포의 TNFR1이 만성 간 질환의 작용 방식에서 상이한 역할을 갖는 것을 기재한다.

토미타 등(Tomita et al.)[참조: Gut 2006, 55:415-424]는 TNFa/TNFR 매개된 시그널링 경로의 증강이 NASH 동물 모델에서 간 섬유증의 병인에 결정적으로 관여할 수 있음을 기재한다.

야론 일란(Yaron Ilan)[참조: AASLD Liver Learning. Ilan Y. Nov 8 2014; 60709]은 지방간 질환을 치료하기 위한 항-TNF 기반 경구 면역요법을 개시한다. TNFα에 결합하는 항-TNF 융합 단백질(PRX-106)은 고지방 식이 마우스 모델에서 사용되었다.

TNFR1에 대한 항체는 리간드를 모방하는 반응을 유도함으로써 작용제 가능성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 반응은 시그널 전달이 다가 TNF 삼량체의 결합에 의한 수용체의 응집에 의해 개시되는 것을 시사한다.

게다가, TNFR1-선택적 억제는 TNFR1-특이적 항체로 달성될 수 있다. 예를 들면, 인간 TNFR1에 대한 선택성을 갖는, 모노클로날 뮤린 항체, H398 및 US5736138에 기재된 항체는 TNF-매개된 시그널 형질도입 및 세포독성의 강력한 억제를 나타냈다[참조: Moosmayer et al. 1995, Ther. Immunol. 2:31-40].

H398의 인간화 버전은 WO2008/113515A2에 기재되어 있다.

WO2012035141은 이펙터 기능을 매개하는 것이 결여되어 있는 항-huTNFR1을 개시한다.

일가 항-huTNFR1 항체는 WO2017174586 A1에 기재되어 있다.

제틀리츠 등(Zettlitz et al.)[참조: LandesBioscience 2010, November/Dezember:639-647]는 인간화 TNFR1-특이적 길항성 모노클로날 항체의 생성을 기재한다.

리츠터 등(Richter et al.)[참조: PLOS One 2013, 8(8):1-13]는, TNFR2를 그대로 두면서, TNF의 프로-염증 활성을 감소시키기 위해 TNFR1 시그널링의 선택적 억제를 위한 인간화 길항성 항-TNFR1 항체를 사용하는 것을 기재한다.

버거 등(Berger et al.)[참조: Protein Engineering, Design & Selection 2013, 26(10):581-587]은 TNF 작용의 선택적 길항제로서 항-TNFR1 scFv-HAS 융합 단백질을 기재한다. 피긴스 등(Feagins et al.)[참조: Eur J Gastroenterol Hepatol. 2015, 27(10):1154-1160]은 종양 괴사 인자 억제제(TNFi)로 치료한 환자가 비-알콜성 지방간 질환(NASH 또는 지방증)을 발증하는 것을 기재한다.

NASH를 치료하는 치료 가능성은, 지금까지 특정 약물을 이용할 수 없었기 때문에, 라이프 사이클 변경으로 제한 및 한정되어 있다. 따라서, NASH 및 이와 연관된 질환 활성의 효과적 치료를 제공할 필요가 있다.

본 발명의 목적은 NASH 및 각각의 질환 증상의 개선된 치료를 제공하는 것이다.

그 목적은 본 발명의 주제에 의해 해결된다.

본 발명은, NASH 및/또는 특히 NASH와 연관된 임의의 질환 증상, 그 중에서 간 지방증, NAFLD 질환 활성(NAS), 아폽토시스, 섬유증, 및 높은 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 및 인슐린 수준을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한, 인간 종양 괴사 인자 1(huTNFR1)을 특이적으로 인식하는 항체의 신규한 의학적 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명은 NASH 및 이와 연관된 질환 증상을 앓고 있는 환자의 신규한 의학적 치료를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 비알콜성 지방간염(NASH) 및 이와 연관된 질환 증상의 치료에 사용하기 위한, huTNFR1을 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다.

특정한 측면에 따르면, 항체는 단리된 항체이다.

특정한 측면에 따르면, 항체는 모노클로날 및/또는 재조합 항체이다.

특정한 측면에 따르면, 항체는 huTNFR1의 막-원위 CRD1 및/또는 CRD2의 서브도메인 A1 내의 에피토프를 특이적으로 인식하고, 바람직하게는 huTNFR1의 N-말단 영역 중의 아미노산 1 내지 115 또는 1 내지 70으로 표시되는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 구체적으로, huTNFR1의 서열은 서열번호 32로서 동정된다.

특정한 실시형태에 따르면, 항체는 단일특이적인, 이가의 전장(full-length) 항체, 또는 항원-결합 항체 단편이다.

또 다른 특정 실시형태에 따르면, 항체는, huTNFR1에 결합하는 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위만을 포함하는, huTNFR1의 일가 결합제이다. 구체적으로, 항체는 huTNFR1을 일가로 인식한다.

특정한 실시형태에 따르면, 항체는 Fab 분자, scFv 분자, 단일 가변 도메인, 디설파이드-안정화된 Fv(dsFv), 절반-IgG1 항체 및 Fv 도메인 또는 상기 중의 어느 하나의 기능적 활성 유도체로 이루어진 "일가 항체" 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 항체는 친수성 폴리머, 예컨대, PEG에 결합하고/하거나, 폴리펩타이드, 예컨대, 인간(또는 마우스) 혈청 알부민, 트랜스페린, 알부민-결합 도메인 또는 펩타이드, Ig-결합 도메인 또는 펩타이드, PEG-모방 펩타이드 확장, 항체 Fc 단편, 우선적 헤테로이량체화(호모이량체화와 비교하여)를 가능하게 하는 돌연변이를 갖는 항체 Fc 단편, 또는 상기 폴리펩타이드 중의 어느 하나의 기능적 변이체와 융합된다.

구체적으로, 항체는, 항체 Fc 단편과 융합되는 임의의 Fab, scFv, dsFv 또는 Fv 도메인이고, 여기서 Fc는 CH2 및 CH3 도메인의 헤테로이량체로 이루어지고, CH2 및/또는 CH3 도메인은, 호모이량체화와 비교하여 우선적 헤테로이량체화를 가능하게 하는 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는다. 구체적으로, Fc 중의 CH3 도메인의 하나 또는 둘 다를 변형시켜, 아미노산 구조를 변경하고, 예컨대, CH3/CH3 도메인의 헤테로이량체를 함유하는 Fc를 수득한다.

구체적으로, 항체 작제물은, 항체의 일가 결합 구조를 여전히 유지하면서, 추가의 항체 도메인의 존재 또는 부재하에, 항체 Fc 영역 또는 단편과 융합된 Fv 도메인을 포함한다. 구체적 예는 Fc 또는 변형된 Fc와 융합된 Fab 모이어티 또는 Fv 모이어티를 지칭한다.

바람직한 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 VH 도메인, CH2 및 CH3 도메인으로 이루어지고, 임의로 추가로 하나 이상의 링커를 포함하고; 경쇄는 VL 도메인, CH2 및 CH3 도메인으로 이루어지고, 임의로 추가로 하나 이상의 링커를 포함한다.

특정한 실시형태는 인간 IgG1 Fc를 포함하고, 여기서 CH2-CH3 도메인은 하나 이상의 "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 돌연변이, 예를 들면,

T366W인, 하나의 CH3 도메인 단량체 상에 존재하는, CH3 베타-시트의 표면을 변형시키는 "놉(knob)" 돌연변이; 및

T366S, L368A, Y407V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 다른 CH3 도메인 단량체 상에 존재하는, CH3 베타-시트의 표면을 변형시키는 "홀(hole)" 돌연변이를 통해 헤테로이량체를 형성한다.

구체적으로, 항체는, 이펙터 기능을 하향조절하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 특정한 측면에 따르면, Fc 영역은 이펙터 기능을 하향조절하도록 글리코조작된다.

특정한 실시형태에 따르면, 항체 작제물은, 이펙터 기능을 하향조절하도록 돌연변이되는, 적어도 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90% 서열 동일성 중의 어느 하나를 갖는 인간 IgG1 Fc의 기능적 변이체인 인간 또는 인공 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역은, E233P, L234V, L235A, ΔG236, A327G, A330S 및 P331S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 중쇄를 포함하고, 바람직하게는 A327G/A330S/P331S를 포함한다(카뱃 EU 인덱스 넘버링). 바람직하게는, 적어도 2개의 상기 돌연변이, 보다 바람직하게는 적어도 3개, 4개, 5개 또는 모든 6개 돌연변이가 Fc 서열로 조작된다. 서열번호 31은 인간 IgG1 Fc의 서열을 동정한다.

구체적으로, 항체는 PEG화, HES화 또는 PSA화되어 있다.

구체적으로, 항체는 분자량이 5,000 내지 150,000g/mol 범위인 PEG로 페길화되어 있다. 예시적 항체 작제물, 예컨대, Fab는 PEG 40,000으로 페길화되어 있다.

구체적으로, 항체는, 하나의 Fab 부분, 힌지 영역 및 하나의 Fc 부분만을 특징으로 하는 절반 항체 IgG1이고, 여기서 힌지 영역 및/또는 Fc 부분(특히 인간 IgG1 Fc)는 하나 이상의 돌연변이를 포함하여 중쇄 이량체화를 회피하고[참조: Gu et al. (2015) PLoS One 10(1):e0116419], 예를 들면,

- 힌지 영역 중의 돌연변이(서열번호 33): C226S, C229S(EU 넘버링), 및

- Fc 부분 중의 돌연변이: P395A, F405R, Y407R, K409D(EU 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

구체적으로, 항체는 Fv-Fc 융합 단백질이고, 여기서 Fv는 VH/VL 도메인 쌍으로 이루어지고, VH는 제1 힌지/링커 영역을 통해 제1 CH2-CH3 도메인 쇄와 융합되고, VL은 제2 힌지/링커 영역을 통해 제2 CH2-CH3 도메인 쇄와 융합된다. 바람직하게는, 제1 및 제2 CH2-CH3 도메인 쇄는, 예컨대, 제1 및 제2 CH2-CH3 도메인 쇄 사이의 우선적 헤테로이량체화를 가능하게 하여, 예를 들면, 상기 지시된 바와 같이 "놉-인투 홀" 돌연변이를 통해 Fc 헤테로이량체를 특징으로 하는 Fv-Fc 제제를 수득하기 위해 하나 이상의 점 돌연변이에서 서로 상이하다.

구체적으로, 항체는, 하나 이상의 추가(인공) 도메인간 디설파이드 결합을 특징으로 하는 디설파이드-안정화 Fv(dsFv)를 포함한다. 이러한 디설파이드 결합은, VH 및 VL 도메인을 브릿징하는 디설파이드 결합의 브릿지 교각으로서 사용될 수 있는 적합한 위치에서 하나 이상의 추가 시스테인 잔기를 VH 및 VL 도메인 중의 어느 하나에 도입함으로써 수득되고, 디설파이드 결합은 시스테인의 환원시에 수득된다. 특정한 예에 따르면, 디설파이드 결합은 VH 중의 하기 위치 및 VL 중의 상응하는 위치 중의 어느 하나에서 Fv에 도입될 수 있다: VH 중의 44C 및 VL 중의 100C, VH 중의 108C 및 VL 중의 55C, VH 중의 106C 및 VL 중의 56C, 또는 VH 중의 101C 및 VL 중의 46C.

구체적으로, 항체는

a) 상보성-결정 영역(CDR): VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및

b) CDR: VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL),

여기서,

i)

VH-CDR1은 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어짐;

VH-CDR2는 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어짐;

VH-CDR3은 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어짐;

VL-CDR1은 서열번호 4를 포함하거나 이로 이루어짐;

VL-CDR2는 서열번호 5를 포함하거나 이로 이루어짐;

VL-CDR3은 서열번호 6을 포함하거나 이로 이루어짐;

또는

ii)

VH-CDR1은 서열번호 23을 포함하거나 이로 이루어짐;

VH-CDR2는 서열번호 24를 포함하거나 이로 이루어짐;

VH-CDR3은 서열번호 25를 포함하거나 이로 이루어짐;

VL-CDR1은 서열번호 26을 포함하거나 이로 이루어짐;

VL-CDR2는 서열번호 27을 포함하거나 이로 이루어짐;

VL-CDR3은 서열번호 28을 포함하거나 이로 이루어짐;

넘버링은 카뱃 EU 인덱스에 따름,

또는 각각의 CDR 서열에서 0, 1 또는 2개(또는 최대 1개, 즉 0 또는 1개)의 점 돌연변이를 포함하고, huTNFR1을 특이적으로 인식하는, 상기 i) 또는 ii) 중 임의의 기능적 활성 변이체

를 포함한다.

구체적으로, 항체는 VH 및 VL

여기서,

VH-CDR1은 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지고;

VH-CDR2는 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지고;

VH-CDR3은 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지고;

VL-CDR1은 서열번호 4를 포함하거나 이로 이루어지고;

VL-CDR2는 서열번호 5를 포함하거나 이로 이루어지고;

VL-CDR3은 서열번호 6을 포함하거나 이로 이루어지고;

넘버링은 카뱃 EU 인덱스에 따름,

또는 CDR 서열의 어느 하나 이상, 또는 각각에서 최대 1개(즉, 0 또는 1개)의 점 돌연변이를 포함하고 huTNFR1을 특이적으로 인식하는, 이의 기능적 활성 변이체

를 포함한다.

구체적으로, VH 및 VL 서열은 VH- 및 VL-CDR 서열을 특징으로 하고,

여기서

i)

VH-CDR1은 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지고;

VH-CDR2는 서열번호 10을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 위치 5에서의 X는 S이고;

VH-CDR3은 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지고;

VL-CDR1은 서열번호 4를 포함하거나 이로 이루어지고;

VL-CDR2는 서열번호 5를 포함하거나 이로 이루어지고;

VL-CDR3은 서열번호 11을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 위치 3에서의 X는 G이거나,

ii)

VH-CDR1은 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지고;

VH-CDR3은 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지고;

VL-CDR1은 서열번호 4를 포함하거나 이로 이루어지고;

VL-CDR2는 서열번호 5를 포함하거나 이로 이루어지고;

VL-CDR3은 서열번호 11을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 위치 3에서의 X는 S이다.

구체적으로, 항체는 서열번호 7 또는 9를 포함하거나 이들로 이루어지는 VH 서열; 및 서열번호 8 또는 10을 포함하거나 이들로 이루어지는 VL 서열, 또는 하나 이상 또는 각각의 CDR 서열에서 최대 1개 점 돌연변이 및 VH 및 VL의 하나 이상 또는 각각의 프레임워크(FR) 서열 FR1 내지 4에서 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 이의 기능적 활성 변이체를 포함한다.

huTNFR1을 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 특정한 VH/VL 조합물은

a) 서열번호 7을 포함하거나 이로 이루어지는 VH 서열; 및 서열번호 8을 포함하거나 이로 이루어지는 VL 서열; 또는

b) 서열번호 9를 포함하거나 이로 이루어지는 VL 서열; 및 서열번호 10을 포함하거나 이로 이루어지는 VL 서열 중의 어느 하나이다.

구체적으로, 항체는 Fab를 포함하거나 이로 이루어지는 전장 또는 항원-결합 항체 단편이고, 이는

a) 서열번호 11을 포함하거나 이로 이루어지는 중쇄(HC) 서열; 및

b) 서열번호 12를 포함하거나 이로 이루어지는 경쇄(LC) 서열;

또는, 각각 HC 및 LC에 포함된 VH 및 VL 도메인의 하나 이상 또는 각각의 CDR 서열에서 최대 1개 점 돌연변이 및 VH 및 VL 도메인의 하나 이상 또는 각각의 FR 서열 FR1-4에서 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 이의 기능적 활성 변이체이다.

구체적으로, 항체는

a) 서열번호 18을 포함하거나 이로 이루어지는 HC 서열; 및

b) 서열번호 13을 포함하거나 이로 이루어지는 LC 서열;

또는, 각각 HC 및 LC에 포함된 VH 및 VL 도메인의 하나 이상 또는 각각의 CDR 서열에서 최대 1개 점 돌연변이 및 VH 및 VL 도메인의 하나 이상 또는 각각의 FR 서열 FR1-4에서 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 이의 기능적 활성 변이체를 포함한다.

서열번호 18로 동정된 HC 및 서열번호 13으로 동정된 LC를 포함하는 항체의 특정한 기능적 활성 변이체는,

a) 서열번호 19를 포함하거나 이로 이루어지는 VH, 또는 상기 VH 서열에 함유된 적어도 CDR 서열;

b) 4 내지 10개 아미노산, 예를 들면, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산으로 이루어진, 바람직하게는 다수의 글리신, 세린 또는 트레오닌의 임의의 조합으로 이루어진 링커 서열, 예를 들면, 서열번호 15로 이루어진 링커;

c) 서열번호 16을 포함하거나 이로 이루어지는 CH2 도메인; 및

d) 서열번호 20을 포함하거나 이로 이루어지는 CH3 도메인

으로 이루어진 HC; 및

a) 서열번호 14를 포함하거나 이로 이루어지는 VL, 또는 상기 VH 서열에 함유된 적어도 CDR 서열;

c) 서열번호 16을 포함하거나 이로 이루어지는 CH2 도메인; 및

d) 서열번호 17을 포함하거나 이로 이루어지는 CH3 도메인

으로 이루어진 LC를 포함한다.

구체적으로, 이러한 항원-결합 항체는,

a) HC 코딩 서열 서열번호 22; 및

b) LC 코딩 서열 서열번호 21,

또는 HC 및 LC 각각에 포함된 VH 및 VL 도메인의 CDR 서열의 하나 이상 또는 각각에서 최대 1개 점 돌연변이와 VH 및 VL 도메인의 FR 서열 FR1 내지 4의 하나 이상 또는 각각에서 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 이의 기능적 활성 변이체

를 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자에 의해 코딩된다.

특정한 실시형태에 따르면, 항체는 6개 CDR 서열의 하기 조합을 특징으로 하는 항원-결합 부위를 포함하고, 이는

서열번호 23: VH-CDR1;

서열번호 24: VH-CDR2;

서열번호 25: VH-CDR3;

서열번호 26: VL-CDR1;

서열번호 27: VL-CDR2; 및

서열번호 28: VL-CDR3,

또는 CDR 서열의 어느 하나 이상 또는 각각에서 최대 1개의 점 돌연변이를 포함하고 huTNFR1을 특이적으로 인식하는, 이의 기능적 활성 변이체

를 포함하거나 이들로 이루어진다.

구체적으로, 항체는,

VH 및 VL 도메인, 여기서,

a) VH는 서열번호 29를 포함하거나 이로 이루어지고;

b) VL은 서열번호 30을 포함하거나 이로 이루어짐;

또는 VH 및 VL 도메인의 CDR 서열의 어느 하나 이상 또는 각각에서 0, 1 또는 2개(또는 최대 1개)의 점 돌연변이와 VH 및 VL 도메인의 FR 서열 FR1 내지 4에서 어느 하나 이상 또는 각각에서 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 이의 기능적 활성 변이체

에 도입된 항원-결합 부위를 포함한다.

구체적으로, 항체는 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 VH 및 VL 도메인은 임의의 상보성 결정 영역(CDR) 서열에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는 모체 도메인의 친화성 성숙된 기능적 변이체이고, 여기서

a) 모체 VH 도메인은 CDR 서열: 서열번호 23, 서열번호 24, 및 서열번호 25를 특징으로 하고;

b) 모체 VL 도메인은 CDR 서열: 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 적어도 하나의 점 돌연변이는 서열번호 24 및/또는 서열번호 28 중의 어느 하나에 존재한다.

구체적으로, 임의의 예시적 항체(이는 본원에 제공된 서열을 특징으로 하는 항체들이다)는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 마찬가지로, 동일한 항원-결합 부위를 포함하고/하거나 동일한 표적 결합 특이성을 갖는 임의의 대체 항체를 사용할 수 있다. 특정한 대체 항체는 예시적 항체의 기능적 변이체인 것들이고, 여기서 임의의 예시적 항체는, huTNFR1 표적을 특이적으로 인식하는 기능을 갖는, 변이체를 생성하기 위한 "모체"로서 사용될 수 있다.

구체적으로, 항체는 본원에 제공된 서열을 특징으로 하는 모체 항체의 친화성 성숙 항체이고, 특히 여기서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR 서열은 모체 항체 중의 각각의 CDR과 비교하여 최대 1개 점 돌연변이를 포함하는 기능적 활성 CDR 변이체이다.

특정한 실시형태에서, 기능적 활성 변이체 항체는 각각의 CDR 서열에서 0, 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이, 바람직하게는 각각의 CDR 서열에서 0, 1 또는 2개의 점 돌연변이만을 포함하고, 여기서 점 돌연변이는 1개 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실 중의 어느 하나이다.

본원에 기재된 항체(모체 항체)의 임의의 기능적 활성 변이체는 구체적으로 huTNFR1 결합 특이성을 특징으로 한다. 기능적 활성 변이체는 하나 이상의 돌연변이 FR 서열을 포함할 수 있고, 이는 하나 이상, 예를 들면, 수개의 점 돌연변이, 예를 들면, 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 점 돌연변이를 포함하여, 모체 항체 중의 각각의 FR 서열과 비교하여 적어도 60% 서열 동일성, 또는 적어도 70% 서열 동일성, 또는 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 변이체 서열을 수득한다.

구체적으로, 항체는, 10^-8M 또는 5×10^-9 M의 K_D 및 10^-3 s^-1 미만의 K_off로 huTNFR1에 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함한다. 결합 친화성 및 결합 특성(회합 또는 해리)는, 이가 결합의 아비더티 효과를 실질적으로 제외하고서, 일가 결합을 결정하는 표준 시험으로 구체적으로 결정된다. 표준 시험은 생리학적 온도(약 37℃, 또는 37℃±1℃에서)에서 석영 결정 미량천칭(QCM)에 의한 측정에 기반한다. 이러한 친화성 측정은 Fab 포맷으로 특히 수행된다. 따라서, 항체가 Fab 분자 이외인 경우, 항원-결합 부위는 37℃에서 QCM에 의한 친화성 측정을 위해 각각의 Fab 분자에 특히 도입된다. 이는 친화성 측정을 간섭할 수 있는 아비더티 효과와 무관하게 일가 결합제의 친화성 측정 결과의 비교를 가능하게 한다. 특히 바람직한 QCM은 중등도 수용체 밀도에서 수행된다. 구체적으로, huTNFR1에 결합하는 항체 작제물의 친화성은 37℃ 및 50 내지 100Hz 범위의 중등도 수용체 밀도, 예를 들면, 50Hz, 또는 50Hz±10Hz, 또는 50Hz±5Hz에서 QCM에 의해 Fab 포맷에 대해 결정된다.

구체적으로, K_D는 4×10^-9 M 미만, 또는 3×10^-9 M 미만, 또는 2×10^-9 M 미만, 또는 10^-9 M 미만, 또는 심지어 10^-10 M 미만이다.

구체적으로, k_off는 10^-3 미만, 또는 5×10^-4 s^-1 미만, 또는 10^-4 s^-1 미만, 또는 10^-5 s^-1 미만이다.

구체적으로, 항원-결합 모이어티는 적어도 10⁵ M^-1s^-1의 k_on로 huTNFR1을 인식한다.

특정한 측면에 따르면, 질환 증상은 간 지방증, 염증성 간, 간 섬유증(또는 아폽토시스) 및 간세포 암종 중의 어느 하나이다. 구체적으로, 임의의 질환 증상의 발증 위험에 있거나 이미 앓고 있는 NASH 환자가 치료된다. NASH 또는 관련 질환 증상의 몇몇 지표는 NAFLD 질환 활성(NAS) 및 높은 ALT 및 인슐린 혈청 수준을 포함하고, 이는 본원에 기재된 치료에 의해 효과적으로 감소될 수 있다.

구체적으로, 환자는 또한 II형 진성 당뇨병, I형 진성 당뇨병, 전-당뇨병, 인슐린 저항성 또는 비만을 앓고 있고, 여기서 비만은 ≥30의 체질량 지수를 갖는 환자로서 정의된다.

구체적으로, 항체는 유효량으로 환자에게 투여된다. 구체적으로, 양은 TNFa/huTNFR1 시그널링을 길항시키는데 효과적이다. 항체는 길항성 항체이고, 이에 의해 세포-기반 검정으로 측정될 때, 실질적 TNFa/TNFR 매개된 시그널링 및 시그널 형질도입을 회피하는 것이 특히 바람직하다. 본원에 기재되고 본원에 제공된 항체 서열을 특징으로 하는 임의의 항체는 길항성 항체인 것으로 특히 이해된다.

특정한 측면에 따르면, 항체는, 바람직하게는 각각 Kym-1 세포에서 TNFR1-매개된 세포사의 억제를 위한 검정 또는 HeLa 세포 또는 HT1080 세포로부터 IL-6 또는 IL-8 방출의 억제를 위한 검정에 의해, 세포-기반 검정에서 결정된 바와 같이 TNF-huTNFR1 수용체 상호작용을 직접 억제한다. 구체적으로, Kym-1 세포에서 TNFR1-매개된 세포사의 억제를 위한 검정에서, IC₅₀ 값은 5.0×10^-9M 미만이다. 구체적으로, HeLa 세포로부터 IL-6 방출의 억제를 위한 검정에서, IC₅₀ 값은 4.0×10^-8M 미만이거나, HT1080 세포로부터 IL-8 방출의 억제를 위한 검정에서 IC₅₀ 값은 2.0×10^-8 M 미만이다.

특정한 실시형태에 따르면, 일가 상호작용에 의해 huTNFR1에 결합하고 TNF-모방 작용제 활성을 나타내는 위험이 저하된 항체가 사용된다. 특히 바람직한 것은, TNFR1에 결합하는 친화성이 높고, 오프 속도가 낮고, TNFR1-의존성 TNF 반응의 우수한 억제를 갖는 항체이다.

구체적으로, 본원에 기재된 항체는, 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 제제에서 제공된다. 항체의 길항 특성 때문에, 약제학적 제제는, 작용 활성에 기인하는 부작용을 피하면서, 높은 항체 농도를 포함할 수 있다.

구체적으로, 약제학적 제제는 바람직하게는 정맥내 또는 피하 투여에 의해 비경구 사용을 위해 제형화된다.

구체적으로, 본원에 기재된 항체는 면역원성이 낮고, 항-약물 항체(ADA) 등의 억제제의 형성 없이 반복적으로 사용할 수 있다.

놀랍게도, 본원에 기재된 항체, 특히 일가 항체는 ADA, 예를 들면, 면역글로불린 또는 면역요법제에 대한 항체를 발증하는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 종래 기술에서, ADA가 세포 표면 상에서 TNFR1에 결합하면 항체를 가교결합하고 이에 의해 TNFR1 시그널링을 잠재적으로 자극할 가능성이 있기 때문에, 이러한 ADA의 존재는 TNFR1에 대해 지시된 항체에 의한 추가 면역요법을 특히 제외한다. 그러나, 본원에 기재된 항체는, ADA의 존재하에서도, TNFR1 시그널링을 자극하지 않는다(또는 실질적으로 자극하지 않는다).

구체적으로, 본원에 기재된 약제학적 제제는, ADA, 예를 들면, 항-huTNFR1 항체 또는 임의의 IgG 구조에 대한 ADA를 발증한 환자에게 투여될 수 있다.

구체적으로, 유효량의 항체는

a) 지방증, 트리글리세라이드 함량, 염증, 및/또는 간 조직에서 아폽토시스;

b) 혈청 아미노트랜스퍼라제 수준;

c) 인슐린-저항성 및 임의로 글루코즈-내성을 개선시키기 위해; 및/또는

d) NAFLD 활성 스코어 중의 어느 하나 이상을 감소시키기 위해, NASH를 앓고 있는 환자에게 투여된다.

구체적으로, 항체는 0.05mg/kg 내지 20mg/kg, 바람직하게는 0.2mg/kg 내지 6mg/kg 범위의 용량으로 NASH를 앓고 있는 환자에게 투여된다. 인간에서 효과적인 양은 기재된 마우스 모델에서 치료학적 유효량(20mg/kg)으로부터 추정할 수 있다. HED(인간 등가 용량)은 약 1 내지 2mg/kg이다.

바람직한 항체 용량은, 예를 들면, 0.5 내지 1000mg, 바람직하게는 1 내지 400mg의 범위이다. 피하 투여되는 경우, 바람직한 투여량은 0.5 내지 400mg의 범위이다.

특정한 측면에 따르면, 항체는 전신 투여, 바람직하게는 정맥내 주입 또는 볼루스 주사에 의해 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다.

특정 실시형태에 따르면, 항체는 규칙적, 예를 들면, 매주 정맥내 또는 피하 주사로, 예를 들면, 0.5 내지 5mg/kg, 특히 약 2mg/kg의 용량으로 환자에게 반복적으로 투여된다. 투여된 약물의 빈도 및 용량은 질환 상태 및 치료에 대한 반응에 적응할 수 있다.

구체적으로, 항체는 식이 치료와 조합하여 NASH를 앓고 있는 환자에게 투여된다. 항체 치료는 구체적으로 NSAP/NSAID 등의 항-염증 약물, 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR) 작용제, 글루카곤-유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R) 작용제 또는 퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체(PPAR) 작용제를 사용한 요법과 조합할 수 있다.

달리 명기하지 않는 한, 위치는 카뱃의 EU 인덱스에 따라 본원에서 넘버링된다. 카뱃 넘버링 스킴의 설명은 문헌[참조: Kabat, EA, et al., 서열s of proteins of immunological interest (NIH publication no. 91-3242, 5^th edition (1991))]에서 발견할 수 있다.

도 1: B6-huTNFR1-k/i-마우스는, 과거 8주간의 항-TNFR1 또는 대조군 항체(Ab)에 의한 치료를 포함하여, 32주간 고지방식(HFD)를 제공받았다. 항-TNFR1-Ab로 치료한 HFD 마우스의 간 조직은, 대조군 항체로 치료한 마우스의 간 조직과 비교하여 간 조직에서 지방증(A), 트리글리세라이드 함량(B) 및 NAFLD 활성 스코어(C)의 현저한 감소를 나타냈다. *p<0.05; **p<0.01.
도 2: B6-huTNFR1-k/i-마우스는, 과거 8주간 항-TNFR1 또는 대조군 항체(Ab)에 의한 치료를 포함하여 32주간 고지방식(HFD)를 제공받았다. 항-TNFR1-Ab로 치료한 HFD 마우스의 간 조직은, 대조군 항체(B)로 치료한 마우스의 간 조직과 비교하여 현저한 시리우스 레드 염색에 의해 평가한 간 섬유증의 개선(A)을 나타냈다. *p<0.05.
도 3: B6-huTNFR1-k/i-마우스는 과거 4주간 항-TNFR1 또는 대조군 항체(Ab)에 의한 치료를 포함하여 20주간 고지방식(HFD)를 제공받았다. 대조군 항체와 비교하여, 항-TNFR1-항체 치료는 간 조직에서 카스파제-3 활성화의 현저한 감소를 가져왔다. *p<0.05.
도 4: B6-huTNFR1-k/i-마우스는, 과거 8주간 항-TNFR1 또는 대조군 항체(Ab)에 의한 치료를 포함하여 32주간 고지방식(HFD)를 제공받았다. 대조군 항체와 비교하여, 항-TNFR1-Ab에 의한 치료는 ALT 및 인슐린 혈청 수준의 현저한 개선을 가져왔다. * p<0.05
도 5: 서열
서열번호 1: VH-CDR1
서열번호 2: VH-CDR2
서열번호 3: VH-CDR3
서열번호 4: VL-CDR1
서열번호 5: VL-CDR2
서열번호 6: VL-CDR3
서열번호 7: IgG13.7/Fab13.7의 VH
서열번호 8: IgG13.7/Fab13.7의 VL
서열번호 9: ATROSAB/IZI06.1의 VH
서열번호 10: ATROSAB/IZI06.1의 VL
서열번호 11: (Fab13.7 중쇄[볼드체 = VH])
서열번호 12: (Fab13.7 경쇄[볼드체 = VL])
서열번호 13: VL1C(VL13.7-CH2-CH31; VL 및 CH1 함유 쇄):
서열번호 14: VL13.7
서열번호 15: 링커
서열번호 16: CH2
서열번호 17: CH31: CH31은 산재된 Ig 불변 도메인이고, 이는 CH3으로부터 기원하는 잔기를 주로 함유하고 또한 CH1으로부터의 잔기를 함유한다.;
서열번호 18: VHkC(VH13.7-CH2-CH3kappa; VH 및 CLk 함유 쇄):
서열번호 19: VH13.7
서열번호 20: CH3k
서열번호 21: VL1C(VL13.7-CH2-CH31; VL 및 CH1 함유 쇄):
서열번호 22: VHkC(VH13.7-CH2-CH3kappa; VH 및 CLk 함유 쇄):
서열번호 23: ATROSAB의 VH-CDR1
서열번호 24: ATROSAB의 VH-CDR2
서열번호 25: ATROSAB의 VH-CDR3
서열번호 26: ATROSAB의 VL-CDR1
서열번호 27: ATROSAB의 VL-CDR2
서열번호 28: ATROSAB의 VL-CDR3
서열번호 29: ATROSAB VH
서열번호 30: ATROSAB VL
서열번호 31: 인간 IgG1 Fc
서열번호 32: huTNFR1 서열:
서열번호 33: 힌지 영역
도 6: 아트로시맙(HC: 서열번호 18, LC: 서열번호 13)의 생화학적 특성화. (a) 아트로시맙의 분자 조성의 대표적 카툰(백색: Fc로부터 유래하는 불변 Ig 도메인; 밝은 회색: VH 및 CH1로부터 유래하는 서열; 어두운 회색: VL 및 CLκ로부터 유래하는 서열). 아트로시맙은 환원(R) 및 비-환원 조건(NR)하에 SEC (b) (TSKgel SuperSW mAb HR, 유속 0.5ml/min, 이동상 Na2HPO4/NaH2PO4) 및 SDS-PAGE (c) (NuPAGETM 4-12% Bis-TRIS Midi Gel)에 의해 특성화했다. M: 마커. (d) 아트로시맙의 열 안정성은 동적 광 산란 및 수득된 데이터 점의 시각적 해석에 의해 분석했다. 인간 혈장에서 인큐베이션후 아트로시맙의 안정성은 ELISA에서 인간 TNFR1에 대한 잔류 결합 활성의 검출에 의해 분석했다. 바는 3개의 개별 실험의 EC50 값을 나타낸다(평균±SD). 하나의 샘플은 4℃에서 PBS에서 인큐베이팅하고, 인간 혈장에서 희석 직후에 -20℃로 동결시킨 하나의 샘플은 대조군으로 사용했다.
도 7: 항원 결합 및 Fc 수용체 및 C1q 보체 단백질과의 상호작용. 인간 TNFR1-Fc에 대한 아트로시맙의 평형 결합은 ELISA((a) n=3, 평균±SD)에 의해 분석했다. Fab 13.7(동일한 VH 및 VL을 함유함) 및 ATROSAB(낮은 친화도의 이가 버전)을 대조군으로 사용했다. (b) 실시간 결합 동역학은, 데이터 분석을 위해 1:1 결합 알고리즘을 사용하여 128nM 내지 4nM(1:2 희석 단계)의 5개 농도에서 QCM에 의해 기록했다. (c) 고정된 아트로시맙 뿐만 아니라 2개 대조군 단백질 ATROSAB(침묵 Fc) 및 리툭시맙(야생형 Fc 부분)과 인간 FcγRI, IIb 및 III, 및 보체 단백질 C1q와의 상호작용은 ELISA(n=2, 평균±SD)에 의해 분석했다.
도 8: 아트로시맙의 길항성 생물활성 및 작용성 결여. 아트로시맙은 3개의 상이한 시험관내 검정에서 작용제 활성의 완전한 결여를 증명했다: (a) HeLa 세포로부터 IL 6 방출, (b) HT1080 세포로부터 IL-8 방출, 및 Kym 1 세포를 사용하여 세포사 유도 검정(c). (a) 및 (b)에서 한계 작용제 효과를 나타내는, 완전한 작용 성질 및 이가 IgG ATROSAB를 입증한 모체 Fab 13.7을 대조군 단백질로서 사용했다. 동일한 세트의 단백질은, 각각 IL-6 방출(d), IL-8 방출(e) 및 세포사 유도(f)에 의해 검출된 바와 같이, HeLa, HT1080 및 Kym-1 세포에서 세포 표면 상의 TNFR1의 활성화를 억제하는 가능성에 대해 분석했다. TNFR1은 0.1nM TNF(d 및 e) 또는 0.01nM TNF(f)를 사용하여 활성화했다. 모든 그래프는 3개 개별 실험의 평균을 나타내고, 오차 바는 SD를 나타낸다.
도 9: 항-인간 IgG 항체의 존재하에 아트로시맙의 작용성 결여. 일정한 농도(약 15.8nM)의 비-특이적 항체의 존재하에 아트로시맙에 의한 HT1080 세포의 표면 상에서 TNFR1의 활성화는 3개의 상이한 마우스 항-인간 IgG 혈청(a, b 및 c)을 사용하여 IL-8 방출 검정에서 분석했다. 마우스 항-인간 IgG 혈청 단독, 비자극된 세포 및 TNF(33nM)을 대조군으로 사용했다. 3개 개별 실험의 평균±SD가 제시되어 있다.
도 10: 아트로시맙의 약동학 분석. 아트로시맙의 순환 농도는 C57BL/6J 녹-인 마우스에서 400㎍ 단백질의 볼루스 주사후 마우스 혈청에서 검출했고, 이는 완전 뮤린 단백질 대신에 뮤린 경막 및 세포내 도메인에 연결된 인간 TNFR1의 세포외 도메인을 발현한다. 무손상 단백질은 ELISA에서 인간 TNFR1-Fc에 결합시에 결정되었다. 그래프는 5개 마우스의 평균±SD를 나타낸다.

본 발명을 기재하는 맥락(특히 하기 특허청구범위의 맥락)에서 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 지시어의 사용은, 본원에서 달리 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형을 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

용어 "포함하는", "갖는", "포함하는" 및 "함유하는"은, 달리 언급하지 않는 한, 개방형 용어(즉, "포함하지만, 이에 한정되지 않는")로 해석되어야 한다. 본 발명의 목적상, 용어 "~로 이루어진"은 용어 "~를 포함하는"의 바람직한 실시형태인 것으로 간주된다. 이하, 그룹이 적어도 특정 수의 실시형태를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이는 바람직하게는 이들 실시형태만으로 이루어진 그룹을 또한 포함하는 것을 의미한다.

용어 "항체"는, 링커 서열의 존재 또는 부재하에, 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로 이해되는, 항체 도메인으로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 것으로 본원에서 이해된다. 폴리펩타이드는, 루프 서열에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 적어도 2개 베타-쇄로 이루어진 베타-배럴 구조를 포함하는 경우, 항체 도메인으로 이해된다. 항체 도메인은 천연 구조이거나, 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형되어, 항원 결합 특성 또는 임의의 기타 특성, 예컨대, 안정성 또는 기능적 특성, 예컨대, Fc 수용체 및/또는 Fcgamma 수용체에 대한 결합을 변형시킬 수 있다.

본원에서 사용된 항체는 적어도 하나의 항원-결합 부위를 포함하고, 이는 huTNFR1 또는 huTNFR1의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 따라서, huTNFR1 수용체에 대한 항체의 결합은 항체당 하나의 huTNFR1-특이적 결합 부위만을 통해 일가로 할 수 있거나, 2개의 huTNFR1-특이적 결합 부위를 통해 이가로 할 수 있다. 특히, 항원-결합 부위는 1 또는 2개의 항체 도메인이다. 단독 또는 조합하여 임의의 가변 항체 도메인, 예컨대, VH 도메인 단독 또는 VH 및 VL 도메인의 조합을 사용하여 항원-결합 부위를 구축할 수 있다. 구체적으로, 항원-결합 부위는 CDR 서열의 조합에 의해 형성된다. CDR 서열의 이러한 조합은 또한 CDR 결합 부위, 예를 들면, 하나의 가변 도메인의 3개 CDR 서열에 의해 형성된 항원 결합 포켓, 예컨대, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 조합, 또는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 조합, 또는 2개 가변 도메인의 기타 6개 CDR 서열, 예컨대, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 조합으로서 이해된다. 또는, 수용체에 대한 천연 리간드 또는 인공 작제물로부터 유래하는 항원-결합 부위가 사용될 수 있다. 본원에서 언급되는 CDR 서열은 다음과 같이 지시된다:

VH 도메인의 CDR:

VH-CDR1 = CDRH1

VH-CDR2 = CDRH2

VH-CDR3 = CDRH3

VL 도메인의 CDR:

VL-CDR1 = CDRL1

VL-CDR2 = CDRL2

VL-CDR3 = CDRL3

구체적으로, 단일 가변 항체 도메인의 CDR 결합 부위는 항원-결합 부위, 예컨대, 가변 영역의 중쇄 및 경쇄의 도메인의 결합 부위(예컨대, dAb, Fd, VL, Vkappa, Vlambda, VH, VHH), 또는 가변 항체 도메인의 쌍의 결합 부위, 예컨대, VH/VL 쌍으로서 사용될 수 있다.

따라서, CDR 결합 부위를 포함하는 항체는 단일 가변 항체 도메인 또는 가변 결합 도메인의 쌍을 포함할 수 있고, 임의로 동일하거나 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 다른 가변 도메인, 예를 들면, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 포함할 수 있고, 여기서 하나의 항체-결합 부위만이 huTNFR1에 대해 지시되고, 적어도 하나의 또 다른 항원-결합 부위는 huTNFR1과 상이한 표적에 대해 지시된다. 임의로, 항체 작제물은 불변 항체 도메인, 또는 연결 서열 또는 힌지 영역을 갖거나 갖지 않는 가변 및/또는 불변 항체 도메인의 조합을 추가로 포함한다.

본원에 기재된 바와 같이, 특정의 항체 포맷, 예를 들면, 단일 항체 도메인, 예컨대, VH, VL 또는 VHH, 또는 가변 항체 도메인의 쌍, 예컨대, VL/VH 쌍을 포함하여, 연결 서열 또는 힌지 영역을 갖거나 갖지 않는 가변 및/또는 불변 항체 도메인의 조합을 포함하거나 이들로 이루어지는 항체, 또는 VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인을 포함하는 항체, 예컨대, 중쇄 항체, Fab, F(ab'), (Fab)₂, scFv, Fd, Fv, 또는 전장 항체, 예를 들면, IgG 유형(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체가 사용될 수 있다. 용어 "전장 항체"는, 적어도 대부분의 Fc 도메인, 및 천연-존재 항체 단량체에서 통상 발견되는 기타 도메인을 포함하는 임의의 항체 분자를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 이 문구는 특정 항체 분자가 항체 단편이 아님을 강조하기 위해 본원에서 사용된다.

예시적 일가, 단일특이적 결합제는 Fab, scFv, Fv, 도메인 항체, IgG 절반-항체, 또는 일가 IgG, 예컨대, 완전한 경쇄, 하나의 완전한 중쇄 및 추가의 Fc 쇄 결여 Fd(FD=VH-CH1)로 이루어진 1개-아암(arm) IgG이고, 이는 Fc 도메인의 호모이량체화를 회피하도록 놉-인투-홀 기술(또는 기타 비대칭 Fc 부분)에 따라 생성할 수 있다.

예시적 이가- 또는 다가 결합제는 임의의 면역글로불린 유형의 전장 항체, 또는 임의의 전장 항체의 항원-결합 항체 단편이고, 이는 적어도 2개의 항원-결합 부위, 예를 들면, 어느 하나 이상의 Fab, F(ab'), (Fab)₂, scFv 또는 Fv를 포함한다.

용어 "Fv"는, CDR 결합 부위를 도입한 가변 도메인, 예를 들면, VH, VL 또는 VH/VL의 영역으로서 본원에서 이해된다. 따라서, 용어 "Fv"는, 링커의 존재 또는 부재하에, 양 가변 도메인의 베타-시트 구조 사이의 상호작용에 의해 VL 도메인과 관련된 VH 도메인인 VH, VL 또는 VH/VL에 특히 적용된다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 구체적으로 항체 제제에서 단리된 형태의 항체를 포함하고, 이는 상이한 표적에 대해 지시된 다른 항체를 실질적으로 포함하지 않거나 항체 도메인의 상이한 구조적 정렬을 포함한다. 추가로, 단리된 항체는, 단리된 항체의 조합을 함유하는 조합 제제에 포함될 수 있고, 예컨대, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 상이한 특이성을 갖는다.

용어 "항체"는, 인간 종, 예컨대, 포유동물, 예컨대, 인간 또는 뮤린, 또는 조류, 예컨대, 암탉을 포함하는 동물 기원의 항체에 적용되고, 이 용어는 특히, 인간 항체에서와 같이, 동물 기원의 서열, 예를 들면, 인간 서열에 기반하는 재조합 항체를 포함한다. 인간 항체는 전형적으로 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 포함한다. 인간 항체는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 사용되고, 이는, 예를 들면, CDR에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열(예를 들면, 시험관내에서 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 라이브러리, 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 유전자이식 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.

그러나, 용어 "항체"는, 상이한 종의 기원의 서열, 예컨대, 뮤린 및 인간 기원의 서열을 갖는 키메라 항체, 또는 인간 기원 및 비-인간, 예를 들면, 설치류 기원의 아미노산 서열을 함유하는 인간화 항체에 추가로 적용된다.

용어 "항체"는 구체적으로 임의 부류 또는 아부류의 항체에 적용된다. 이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 주요 부류의 항체 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM에 할당될 수 있고, 이들중 일부는 아부류(이소형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다.

이 용어는 추가로 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 구체적으로 재조합 항체에 적용되고, 이 용어는, 상이한 기원의 유전자 또는 서열, 예를 들면, 뮤린, 키메라, 인간화 항체 또는 하이브리도마 유래 항체를 포함하는, 재조합 수단, 예컨대, 동물, 예를 들면, 인간을 포함하는 포유동물로부터 유래하는 항체에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 항체 및 항체 구조를 포함한다. 추가의 예는 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 또는 항체 또는 항체 도메인의 재조합, 조합 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 다른 DNA 서열에 대한 항체 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 지칭한다.

항체 도메인은 천연 구조이거나, 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형되어, 예를 들면, 항원 결합 특성 또는 임의의 기타 특성, 예컨대, 안정성 또는 기능적 특성, 예컨대, Fc 수용체 FcRn 및/또는 Fcgamma 수용체(FCGR)에 대한 결합을 변형시킬 수 있다.

특정 예는, 하나 이상의 인공 CDR 서열을 포함하는 적어도 하나의 항원-결합 부위에 의해 표적 huTNFR1을 특이적으로 인식하도록 조작되거나 비-천연 존재 항체 작제물을 생성하도록 조작된 인공 작제물인 비-천연 존재 항체를 지칭하고, 이는 임의의 천연-존재 면역글로불린 구조와 상이한 구조를 갖는다.

본원에 추가로 기재된 항체의 구체적 예는 비-천연 존재, 예를 들면, 또 다른 항체 또는 활성제와의 조합 제제로 제공된 바와 같고, 이 조합은 천연에 존재하지 않는다. 추가의 구체적 예는 천연-존재 항체의 인공 유도체 또는 변이체, 또는 천연-존재 항체, 또는 항체의 안정성을 개선하도록 조작되는 프레임워크-영역을 갖는 항체의 최적화 또는 친화성-성숙 변이체를 지칭한다. 이러한 최적화 또는 조작에 의해, 항체는 하나 이상의 합성 구조 또는 서열 또는 특성을 포함하고, 이는 항체의 문맥에서 천연에서 발견되지 않을 것이다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 항체의 유도체, 특히 기능적 활성 유도체를 또한 지칭하고, 본원에서 또한 항체의 기능적 변이체를 지칭하는 것으로 이해된다.

기능적 활성 유도체는 특히, 항체 자체의 일차 아미노산 서열을 변경시키지 않는 융합 또는 공유 화학적 변형에 의해 생성된다. 유도체는, 예를 들면, 순환 반감기의 연장, 안정성의 증가, 클리어런스의 감소 또는 면역원성의 변경을 포함하는 목적하는 특성을 가질 수 있다. 특정 항체 유도체는 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체 및/또는 융합 단백질의 임의의 조합으로서 이해되고, 여기서 항체의 임의의 도메인은 하나 이상의 다른 단백질, 예컨대, 다른 항체의 임의의 위치에서 융합될 수 있고, 예를 들면, 결합 구조는 CDR 루프, 수용체 폴리펩타이드, 게다가 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 독소 등을 포함한다. 항체의 유도체는 공유 결합, 정전기 상호작용, 디-설파이드 결합 등의 다양한 화학적 기술에 의해 다른 물질에 대한 회합 또는 결합에 의해 수득될 수 있다. 항체에 결합된 다른 물질은 지질, 탄수화물, 핵산, 유기 및 무기 분자 또는 이의 임의의 조합(예: PEG, 프로드러그 또는 약물)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는, 예를 들면, 항체-약물 접합체를 수득하기 위해 약물을 포함하는 유도체이다.

용어 유도체는 또한, 예를 들면, 글리코조작에 의해 생성된, 예를 들면, 특정한 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 단편, 변이체, 유사체 또는 동족체를 포함하고, 이는 기능성이고 기능성 변이체, 예를 들면, 특정 표적에 대한 결합으로 작용할 수 있다.

항체 서열과 관련하여 용어 "글리코조작된"은 글리코조작의 결과로서 변형된 면역원 특성, ADCC 및/또는 CDC를 갖는 글리코실화 변이체를 지칭한다. 모든 항체는 중쇄 불변 영역에서 보존된 위치에 탄수화물 구조를 함유하고, 각각의 이소형은 단백질 어셈블리, 분비 또는 기능적 활성에 가변적으로 영향을 미치는 N-연결된 탄수화물의 별개의 어레이를 보유한다. IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인에 Asn297에 보존된 N 연결된 글리코실화 부위를 갖는 글리코단백질이다. Asn297에 부착된 2개 복합 이중-안테나 올리고당은 CH2 도메인 사이에 매립되어, 폴리펩타이드 골격과의 광범위한 접촉을 형성하고, 이들의 존재는 항체가 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 등의 이펙터 기능을 매개하는데 필수적이다. 예를 들면, N297을, 예를 들면, A 또는 T299로 돌연변이시킴으로써 N297에서 N-글리칸의 제거는 전형적으로 ADCC가 감소된 비글리코실화 항체를 초래한다.

항체 글리코실화의 주요 차이는 세포주 사이에서 발생하고, 심지어 상이한 배양 조건하에 성장한 소정 세포주에 대해 약간의 차이가 보인다. 박테리아 세포에서의 발현은 전형적으로 비글리코실화 항체를 제공한다.

항체는 활성 Fc 모이어티를 결여할 수 있고, 따라서 구체적으로 CH2 및 CH3 도메인의 쇄를 결여하는 임의의 항체를 포함하는 FCGR 결합 부위를 갖지 않는 항체 도메인으로 구성되거나, 예를 들면, Fc 이펙터 기능을 감소시키는, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 폐지 또는 감소시키는 변형에 의해 Fc 이펙터 기능을 결여하는 항체 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 돌연변이유발, 예를 들면, FCGR 결합 부위에서의 돌연변이에 의해, 또는 항체의 ADCC 및/또는 CDC 활성을 간섭하고 따라서 Fc 이펙터 기능의 감소 또는 Fc 이펙터 기능의 결여를 달성하는 유도체 또는 물질(agent)에 의해 수행될 수 있고, 이는 전형적으로, ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정된 바와 같이, 비변형된(야생형) 항체의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 Fc 이펙터 기능을 지칭하는 것으로 이해된다.

예시적 항체는, 예컨대, FcRn에 대한 결합 부위를 유지하기 위해 Fc 단편 또는 Fc 단편의 적어도 일부를 포함하여, 생체내에서 실질적 반감기를 갖는 항체를 수득할 수 있다.

그러나, Fc는, 예를 들면, IgG1의 IgG2 아형으로의 스위치에 의해 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 변형에 의해, 예를 들면, E233P 및/또는 L234V 및/또는 L235A 및/또는 D265G 및/또는 A327Q 및/또는 A330A 및/또는 G236, 인간 IgG1 Fc에서 결실 및/또는 A327G 및/또는 A330S에 의해 가능한 ADCC 및/또는 CDC 활성의 감소를 수득하기 위해 변형시킬 수 있고, 여기서 넘버링은 카뱃[EU-인덱스]에 따른다.

추가의 예는, 예를 들면, K.O. 글리코실화 부위, 예컨대, N297Q에 의해 면역원성을 감소시키는 변형을 지칭하고, 이는 렉틴 수용체에 대한 손상된 결합을 제공한다.

용어 "항체"는 또한, 모체 CDR 서열의 기능적 활성 CDR 변이체를 갖는 항체 및 모체 항체의 기능적 활성 변이체 항체를 포함하는 항체의 변이체를 지칭한다. 예를 들면, 본원에 제공된 CDR 결합 서열 및/또는 중쇄 및 경쇄 서열을 특징으로 하는 이들 항체의 기능적 변이체는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 조작 및 사용될 수 있다.

구체적으로, 모체 항체의 항체 변이체는 본원에 제공된 임의의 예시적 항체 등의 모체 항체의 적어도 하나의 항체 서열을 조작함으로써 생성할 수 있고, 예를 들면, 항체 변이체는 중쇄 가변 영역의 적어도 3개 CDR 및 임의로 경쇄 가변 영역의 적어도 3개 CDR을 추가로 포함하고, 적어도 하나의 CDR 또는 FR 영역, 또는 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC)의 불변 영역 중의 적어도 하나의 점 돌연변이는, 표적 huTNFR1에 대한 특이적 결합에 의해 측정된 바와 같이, 여전히 기능적으로 활성적이다.

구체적으로, 항체 변이체는, 특히 특정한 항체 아미노산 서열 또는 영역으로 삽입체를 결실, 교환, 도입하거나, 예를 들면, 항체 안정성, 이펙터 기능 또는 반감기를 조작하기 위해 불변 도메인에서, 예를 들면, 당업계에서 이용가능한 친화성 성숙 기술에 의해 항원-결합 특성을 개선시키기 위해 가변 도메인에서 아미노산 서열을 화학적으로 유도체화하는, 예를 들면, 돌연변이유발 방법에 의해 수득된 돌연변이 항체 또는 항체 단편이다. 예를 들면, 랜덤화 기술에 의해 수득된 목적하는 위치에서 점 돌연변이를 포함하는 임의의 공지된 돌연변이유발 방법을 사용할 수 있다. 일부 경우에서, 위치는, 항체 서열을 랜덤화하기 위해 임의의 가능한 아미노산 또는 바람직한 아미노산의 선택을 사용하여 랜덤으로 선택된다. 용어 "돌연변이유발"은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 변경하기 위한 당업계에서 인식된 기술을 지칭한다. 바람직한 유형의 돌연변이유발은 오차 발생이 수운 PCR 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발, 또는 기타 부위 지시된 돌연변이유발을 포함한다.

점 돌연변이는 특히, 상이한 아미노산에 대해 아미노산의 하나 이상의 단일(불-연속) 또는 이중체의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입에서 비-조작된 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열의 발현을 야기하는 폴리뉴클레오타이드의 조작으로서 이해된다.

구체적으로, 기능적 활성 변이체 항체는 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드 서열 내의 뉴클레오타이드의 화학적 유도체화에 의해, 서열의 원위 말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에서, 예를 들면, CDR 서열에서 N-말단 및/또는 C-말단 1, 2, 3 또는 4개 아미노산 및/또는 중앙 1, 2, 3 또는 4개 아미노산(즉, CDR 서열의 중앙에서)에서 모체 항체 또는 모체 항체 서열의 변형에 의해 생성되고, 이러한 변형은 이러한 서열의 활성에 영향을 미치지 않고 특히 손상시키지 않는다. 선택된 표적 항원에 대해 특이성을 갖는 결합 부위의 경우에, 항체의 기능적 활성 변이체는, 이것이 변화되어, 예를 들면, 특정 에피토프에 대한 미세 특이성, 친화성, 아비더티, Kon 또는 Koff 등을 변화시킬 수 있더라도, 소정 결합 특이성을 여전히 갖거나 동일한 생물학적 활성을 실질적으로 가질 수 있다. 예를 들면, 친화성 성숙 항체는 기능적 활성 변이체 항체로서 구체적으로 이해된다. 따라서, 친화성 성숙 항체 중의 변형된 CDR 서열은 기능적 활성 CDR 변이체로서 이해된다.

친화성 성숙은 표적 항원에 대한 친화성이 증가된 항체가 생성되는 프로세스이다. 당업계에서 이용가능한 친화성 성숙 라이브러리를 제조 및/또는 사용하는 임의의 하나 이상의 방법을 사용하여, 본원에 개시된 본 발명의 다양한 실시형태에 따라 친화성 성숙 항체를 생성할 수 있다. 이러한 예시적 친화성 성숙 방법 및 용도, 예컨대, 랜덤 돌연변이유발, 박테리아 돌연변이체 균주 통과, 부위-지시된 돌연변이유발, 돌연변이 핫스팟 표적화, 변성 돌연변이유발, 항체 셔플링, 경쇄 셔플링, 중쇄 셔플링, CDR1 및/또는 CDR1 돌연변이유발, 및 본원에 개시된 발명의 다양한 실시형태에 따라 방법 및 용도를 실시하기 쉬운 친화성 성숙 라이브러리를 생성 및 사용하는 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Wark & Hudson, 2006, Advanced Drug Delivery Reviews 58: 657-670]에 개시된 것들을 포함한다.

아미노산 돌연변이유발을 포함하거나 면역글로불린 유전자 세그먼트에서 체세포 돌연변이의 결과로서 항체의 구조적 변화에 의해, 항원에 대한 결합 부위의 변이체가 생성되고 보다 큰 친화성을 위해 선택된다. 친화성 성숙 항체는 모체 항체보다 몇배 더 큰 친화성을 나타낼 수 있다. 단일 모체 항체는 친화성 성숙에 제공될 수 있다. 또는, 표적 항원에 대한 결합 친화성이 유사한 항체의 풀은, 친화성 성숙 단일 항체 또는 이러한 항체의 친화성 성숙 풀을 수득하기 위해 변경되는 모체 구조로서 간주될 수 있다.

본원에 기재된 항체의 바람직한 친화성 성숙 변이체는 결합 친화성이 적어도 2배 증가, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 50배 또는 바람직하게는 적어도 100배 증가를 나타낸다. 친화성 성숙은, 본원에 기재된 항체를 수득하기 위해 중간 결합 친화성을 갖는 항체와 함께, 모체 분자의 각 라이브러리를 사용하여 선택 캠페인 과정에서 사용될 수 있다. 또는, 친화성은 10^-10 M 미만 또는 심지어 10^-11 M 미만의 K_D에 상응하는 높은 값을 수득하기 위해 본원에 기재된 항체의 친화성 성숙에 의해 보다 증가시킬 수 있다.

특정 실시형태에서, 결합 친화성은 친화성 ELISA 검정에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 결합 친화성은 BIAcore, ForteBio 또는 MSD 검정에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 결합 친화성은 동역학적 방법에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 결합 친화성은 평형/용액 방법에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 결합 친화성은 표준 석영 결정 미량천칭(QCM) 측정에 의해, 특히 생리학적 조건(약 37℃, 밀도 약 50Hz)과 유사한 소정 조건에서 결정된다.

본원에 기재된 항체의 구체적 기능은 TNF-huTNFR1 상호작용의 억제제(또한 길항제로서 불리움)로서의 기능이다. 본원에서 이해되는 용어 "억제제"는

a) 시험관내 및/또는 생체내에서 TNFR1 시그널링을 조절(예를 들면, 감소 또는 제거)하는 능력 및/또는

b) 시험관내 및/또는 생체내에서 TNFR1-매개된 세포사를 억제하는 능력 및/또는

c) 시험관내 및/또는 생체내에서 염증 사이토킨을 방출하기 위해 TNF-매개된 세포 자극을 억제하는 능력,

d) 상이한 메카니즘에 의해 TNFR1 시그널링을 억제하는 능력을 갖는 물질이다.

특히, 본원에 사용된 항체는 세포 표면 상에서 TNFR1의 하나 이상의 분자에 대한 하나 이상의 분자 TNF의 결합을 간섭한다. 치료적 응용을 위해, 이론에 국한시키지 않고서, TNF-huTNFR1 상호작용 억제제는 TNF의 존재하에 huTNFR1 시그널링 또는 TNF의 존재하에 huTNFR1 매개된 세포사를 억제하는 능력, 또는 TNF의 존재하에 염증 사이토킨을 방출하기 위해 세포 자극을 억제하는 능력을 가질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시그널링" 및 "시그널링 형질도입"은 특이적 및 순차적인 일련의 분자를 통해 세포 표면 수용체에 의해 세포외 자극을 핵 중의 유전자로 전달하여 자극에 대한 특이적 세포 반응을 야기하는 생화학 프로세스를 나타낸다.

huTNFR1 상호작용의 억제는 세포-기반 분석에서 또는 생체내에서 용량-의존적 방식으로 생체외에서 측정할 때, TNFR1 시그널링 또는 시그널 형질도입의 효과의 하향조절을 유도할 수 있다. 본원에 기재된 항체의 기능적 활성은 특히, 생체외 세포-기반 검정에서 측정할 때, 생체내에서 TNF-huTNFR1 상호작용 또는 LTα-huTNFR1 상호작용을 억제하는 억제 기능을 특징으로 한다. 추가의 검정은, TNF-TNFR1 상호작용을 괴롭히는 TNFR1 수용체의 가교-결합과 연관된 실질적 부작용을 배제하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 검정은 각각 염증 사이토킨 IL-6 또는 IL-8을 생성하기 위해 자극 활성의 부재에 대한 HeLa 또는 HT1080 세포에서 항체 또는 변이체의 활성을 결정하는 것이다. 예시적 시험은 하기 실시예 섹션에서 기재되어 있다.

억제는 전형적으로 huTNFR1 상호작용 또는 활성의 효과를 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 최대 수준까지 감소시킨다. 본원에 기재된 항체를 생성 및 특성화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체 변이체는 huTNFR1 발현 세포를 사용한 하나 이상의 세포-기반 검정 또는 생체내 검정을 사용하여 소정 특성에 대해 생성 및 스크리닝된다. 이러한 검정을 위해, 항체는 전형적으로, 예를 들면, TNF의 존재 및 부재하에 세포가 결합되어 길항 및 작용 활성을 결정할 수 있도록 외인적으로 첨가된다. 이들 검정은 전형적으로 면역글로불린의 기능에 기초하고, 즉, 항체가 huTNFR1에 결합하고 일부 생화학적 사상, 예를 들면, 상기 세포에 대한 TNF 결합의 차단을 매개하는 능력, 예를 들면, 경쟁 결합 검정, TNF/수용체 결합 억제, TNF의 존재 또는 부재하에 사이토킨 발현의 감소, 또는 구체적으로 염증성 인터류킨, 예컨대, IL-6 또는 IL-8, 아폽토시스 등에 기초한다.

본원에 기재된 항체는 바람직하게는 TNF-길항 활성만을 갖고(특히, 검출가능한 작용 활성 부재), 따라서 바람직하지 않은 염증 반응, 아폽토시스 및 괴사, 또는 기관 장애를 야기할 수 있는 순환에서 증가된 TNF 수준에 의해 유발된 염증 반응을 감소시킨다. 바람직한 항체는, 각각 절반-최대 포화 농도의 TNF 또는 LTalpha를 사용하여, 바람직하게는 0.01 내지 0.1nM 범위의 TNF 및 LTalpha에서 세포-기반 검정으로 측정할 때, 100nM 미만, 바람직하게는 20nM 미만, 보다 바람직하게는 10nM 미만, 가장 바람직하게는 일자리 나노몰 범위 이하의 IC₅₀에 상응하는 길항 활성을 갖는다.

그러나, TNF를 사용하지 않고서, 동일한 세포-기반 검정에서 잠재적 TNF-모방 작용 활성을 측정할 수 있다. 본원에 기재된 항체는 바람직하게는, TNF의 부재하에 HeLa 또는 HT1080 세포의 인큐베이션이 무 또는 약간의 사이토킨의 유도, 예를 들면, 적어도 5nM 또는 대략 10nM의 항체 농도에서 0.5ng/ml 미만의 상승된 IL-6 또는 IL-8 수준을 야기하는 경우, 유의한 작용 활성을 갖지 않는다. 바람직하게는, 사이토킨이 없거나 약간 또는 음성 사이토킨만이 존재하고, 이는 10pg/10⁵ 세포 미만의 양에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 예에서, 사이토킨 발현 및 방출은 18시간 이내에 2.5pg/100.000 세포 미만이다. 바람직하게는, 작용 활성은 기저 수준 미만, 또는 필적하는 TNF 농도의 반응의 2% 미만, 바람직하게는 등가 또는 최대 TNF 반응의 1% 미만이다.

본원에 기재된 항체 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬한 후에 특정한 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의되고, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않는다. 당업계의 숙련가는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 일고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "항원"은 용어 "표적" 또는 "표적 항원"과 호환적이고, 항체 결합 부위에 의해 인식되는 전체 표적 분자 또는 이러한 분자의 단편을 지칭한다. 구체적으로, 면역학적으로 관련되는 항원, 예를 들면, 폴리펩타이드 또는 탄수화물 구조, 일반적으로 "에피토프", 예를 들면, B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프로서 지칭되는 항원의 구조는 이러한 결합 부위에 의해 인식될 수 있다. huTNFR1 항원은, 대부분의 인간 세포의 표면 상에서 단량체성 또는 다량체성 사이토킨 수용체로서 삼량체 TNF 또는 LTα에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 구조를 포함하는 항원이다.

본원에 사용된 용어 "huTNFR1"은, 대부분의 인간 세포에서 편재적으로 발현되는, CD120a TNFR1(p55/60, TNFRSF1A 종양 괴사 인자 수용체 상과, 멤버 1A[Homo sapiens(인간)], Gene ID: 7132) 수용체의 TNF이다. huTNFR1의 특정한 예시적 서열은 서열번호 32로서 제공된다.

본원에 사용된 용어 "에피토프"는 특히, 특정한 결합 파트너를 완전히 구성하거나 항체의 결합 부위에 대한 특정한 결합 파트너의 일부일 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 에피토프는 탄수화물, 펩타이드 구조, 지방산, 유기, 생화학 또는 무기 물질 또는 이들의 유도체 및 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 펩타이드 구조, 예컨대, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 포함되는 경우, 이는 통상 적어도 3개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 40개 아미노산 및 보다 바람직하게는 약 10 내지 20개 아미노산을 포함할 것이다. 에피토프는 선형 또는 형태적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 또는 탄수화물 쇄의 일차 서열의 단일 세그먼트로 구성된다. 선형 에피토프는 연속적 또는 중첩할 수 있다.

형태적 에피토프는, 폴리펩타이드를 폴딩하여 삼차 구조를 형성함으로써 함께 모은 아미노산 또는 탄수화물로 구성되고, 아미노산은 선형 서열에서 반드시 서로 인접할 필요는 없다. 구체적으로 및 폴리펩타이드 항원과 관련하여, 형태적 또는 불연속 에피토프는, 일차 서열에서 분리된, 그러나 폴리펩타이드가 천연 단백질/항원 내로 폴딩될 때에 분자의 표면 상에서 일관된 구조로 어셈블리되는, 2개 이상의 이산 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 한다.

본원에서, 용어 "에피토프"는 특히 huTNFR1에 포함된 에피토프를 지칭하고, 이는 huTNFR1의 CDR2의 막-원위 CDR1 및 서브도메인 A1에 도입된 에피토프이다.

핵산, 항체 또는 다른 화합물과 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된" 또는 "단리"는, "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록, 천연적으로 연관될 수 있는 환경으로부터 충분히 분리된 이러한 화합물을 지칭한다. "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과 인공 또는 합성 혼합물의 배제, 또는 기본 활성을 간섭하지 않고, 예를 들면, 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 반드시 의미하는 것은 아니다.

본원에 기재된 단리된 항체 등의 폴리펩타이드 또는 단백질과 관련하여, 용어 "단리된"은 구체적으로, 이러한 제조가 시험관내 또는 생체내에서 실시된 재조합 DNA 기술에 의한 것일 때, 이들이 제조되는 환경(예를 들면, 세포 배양물) 또는 천연 환경에서 발견되는 다른 화합물 등의 이들이 자연적으로 연관되는 물질을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 화합물을 지칭한다. 단리된 화합물은 희석제 또는 보조제와 함께 제형화될 수 있고, 여전히 실제적인 목적으로 단리된다-예를 들면, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 진단 또는 치료에 사용될 때에 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "재조합"은 "유전 공학에 의해 제조되는 또는 그의 결과"를 의미한다. 재조합 숙주는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 구체적으로 포함하거나, 재조합 핵산 서열을 함유하도록, 특히 숙주 외래의 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 유전자 조작되었다. 재조합 단백질은 숙주에서 각각의 재조합 핵산을 발현시킴으로써 생성된다.

본원에 추가로 기재된 항체는 재조합 항체일 수 있다. 이를 위해, 본원에 사용된 용어 "재조합 항체"는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 항체, 예컨대, (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마를 위해 유전자도입 또는 염색체도입된 동물(예: 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들면, 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리 또는 항체의 항원-결합 서열의 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 항체는, 예를 들면, 항체 성숙 동안 발생하는 재배열 및 돌연변이를 포함하도록 조작된 항체를 포함한다. 본 발명에 따르면, 당업자에게 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 문헌[참조: Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)]에 충분히 설명되어 있다.

본원에 기재된 항체는 바람직하게는, 숙주 세포를 사용하는 재조합 발현 시스템, 예를 들면, 이. 콜라이의 주변세포질 공간에서의 발현, 또는 효모 또는 포유동물, 예를 들면, CHO, HEK 또는 인간 생성 숙주 세포주 등의 진핵생물 발현 시스템에서 분비된 단백질의 발현에 의해 생성된 단백질로서 제공된다.

차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포는 항체 생산에 가장 일반적으로 사용되어 왔다. 적합한 글리코실화 패턴을 제공하는 것에 추가하여, 이들 세포는 유전적으로 안정하고 생산성이 높은 클론 세포주의 일관된 생성을 가능하게 한다. 이들은 무혈청 배지를 사용하여 단순한 생물반응기에서 고밀도로 배양할 수 있고, 안전하고 재현가능한 바이오프로세스의 개발을 가능하게 한다.

숙주 세포는 무혈청 조건하에서, 및 임의로 동물 기원의 임의의 단백질/펩타이드를 포함하지 않는 배지에서 확립, 적용 및 완전히 배양될 때에 가장 바람직하다.

본원에 사용된 "특이적" 결합, 인식 또는 표적화는 결합제, 예를 들면, 항체 또는 항체의 항원-결합 부위가 분자의 이종성 모집단에서 표적 항원 또는 각각의 에피토프에 대해 상당한 친화성을 나타내는 것을 의미한다. 따라서, 지정된 조건(예: 면역검정)하에, 결합제는 표적 항원에 특이적으로 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 분자에 상당량으로 결합하지 않는다. 특이적 결합은 결합이, 선택된 바와 같이, 표적 동일성, 높은, 중간 또는 낮은 결합 친화성 또는 아비더티의 측면에서 선택적임을 의미한다. 선택적 결합은 통상 결합 상수 또는 결합 역학이 적어도 10배 상이한(적어도 1 로그 차이로 이해됨) 경우에 달성되고, 바람직하게는 그 차이는, 또 다른 표적과 비교하여, 적어도 100배(적어도 2 로그 차이로 이해됨), 및 보다 바람직하게는 적어도 1000배(적어도 3 로그 차이로 이해됨)이다. 차동 결합은 면역검정, 바람직하게는 면역블롯팅, ELISA 또는 기타 면역학적 방법에 의해 결정될 수 있다. 특정 표적에 대한 항체 분자의 특이성은 경쟁 검정에 의해, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 선택적 결합은 당업계에 공지된 재조합 항체 최적화 방법에 의해 조작 또는 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 면역글로불린 쇄의 가변 영역의 특정 영역은, 경쇄 셔플링, 목적 돌연변이유발, CDR 융합, 및 선택된 CDR 및/또는 프레임워크 영역의 지시된 돌연변이유발을 포함하는 하나 이상의 최적화 전략에 제공할 수 있다.

용어 "동일한 특이성을 갖는", "동일한 결합 부위를 갖는" 또는 "동일한 에피토프에 결합하는"의 사용은 동등한 모노클로날 항체가 동일하거나 실질적으로 동일한, 즉 유사한 면역반응(결합) 특성을 나타내고, 사전-선택된 표적 결합 서열과의 결합을 위해 경쟁한다. 특정 표적에 대한 항체 분자의 상대 특이성은 경쟁 검정에 의해, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]에 기재된 바와 같이 상대적으로 결정될 수 있다.

본원에서 경쟁은 경쟁 ELISA 분석 또는 ForteBio 분석에 의해 결정될 때에 약 30% 초과의 상대 억제를 의미한다. 특정 맥락에서, 예를 들면, 경쟁 분석이 항원 결합의 의도된 기능으로 설계된 신규 항체를 선택하거나 스크리닝하기 위해 사용되는 경우, 경쟁의 적합한 수준의 기준으로서 상대 억제의 보다 높은 역치를 설정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 항체가 충분히 경쟁적인 것으로 간주되기 전에, 적어도 40% 상대 억제, 또는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 심지어 적어도 100% 상대 억제가 검출되는 경쟁 결합에 대한 기준을 설정할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "환자"는 인간 및 기타 포유동물 대상체를 지칭한다. 특히, 본원에 기재된 의료 용도 또는 각각의 치료 방법은 NASH 또는 NASH와 연관된 질환 증상의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 적용된다. 대상체는, 초기 단계 또는 말기 단계 질환을 포함하여 NASH의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 구체적으로 예방적 및/또는 치료적 치료를 제공받은 대상체를 포함한다. 따라서, 용어 "치료"는 예방적 및 치료적 치료 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다.

구체적으로, 용어 "요법"은 질환을 치유하거나 질환의 증상을 감소시키는 투여를 포함하는 치료적 조치를 지칭한다.

구체적으로, 용어 "예방"은 질환 발생 또는 질환의 재발 위험을 감소시키는 것을 의도하는 예방적 조치를 지칭한다.

화합물, 예를 들면, 본원에 기재된 항체의 용어 "유효량" 또는 충분량"의 어느 하나와 본원에서 호환적으로 사용된 용어 "치료학적 유효량"은, 대상체에게 투여되는 경우, 유익한 또는 목적하는 결과를 초래하는데 충분한 양 또는 활성이고, 따라서 유효량 또는 이의 동의어는 그것이 적용되는 상황에 의존한다.

유효량은 이러한 질환 또는 장애를 치료, 예방 또는 억제하기에 충분한 화합물의 양을 의미하는 것으로 의도된다. 질환과 관련하여, 본원에 기재된 항체의 치료학적 유효량은, TNF-TNFR1 상호작용의 억제로부터 유리한 질환 또는 증상을 치료, 조절, 약화, 역전 또는 영향을 주기 위해 구체적으로 사용된다.

이러한 유효량에 상응하는 화합물의 양은 주어진 약물 또는 화합물, 약제 제형, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 치료되는 대상체 또는 숙주의 속성 등의 다양한 인자에 의존하여 달라질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.

본원에 추가로 기재된 바와 같이, 환자를 치료하는 방법은 치료학적 유효량의 상기 정의된 huTNFR1-항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료학적 유효량은 전형적으로 0.5 내지 500mg, 바람직하게는 1 내지 400mg, 보다 더 바람직하게는 최대 300mg, 최대 200mg, 최대 100mg 또는 최대 10mg의 범위일 수 있지만, 보다 높은 용량이, 예를 들면, 비만 환자 또는 급성 질환 증상의 치료를 위해 지시될 수 있다.

본원에 기재된 바람직한 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 huTNFR1 항체, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 약제학적으로 허용되는 염, 보조제, 안정화제, 희석제 및 용매, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분을 포함한다.

한 가지 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 환자에게 투여된 유일한 치료학적 활성제이다. 또는, 본원에 기재된 항체는, TNF 길항제, 항-염증제, 사이토킨, 성장 인자 또는 다른 치료제를 포함하지만 이로써 한정되지 않는 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 투여된다. TNFR1-길항제 항체는 하나 이상의 다른 치료 요법, 바람직하게는 항-TNF 치료제, 예컨대, 항-TNF 항체와 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 본원에 기재된 항체는 바람직하게는 1차 치료로서 또는 항-TNF 치료제가 급성 또는 만성 치료의 어느 쪽이든 효율적이지 않은 2차 치료로서 투여된다. 특히 바람직한 의학적 용되는 만성 질환을 치료하기 위한 것이다.

또한, 본원에 기재된 치료학적 유효량의 항체를 사용한 대상체의 치료 또는 예방 섭생은 단일 투여로 구성되거나, 또는 일련의 적용을 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체는 적어도 1년에 1회, 적어도 반년에 1회 또는 적어도 1개월에 1회 투여될 수 있다. 그러나, 또 다른 실시형태에서, 항체는 주어진 치료를 위해 주당 약 1회 내지 약 매일 투여로 대상체에게 투여될 수 있다. 치료 기간의 길이는 질환의 중증도, 급성 또는 만성 질환, 환자의 연령, 항체 포맷의 농도 및 활성 등의 다양한 요인에 따라 달라진다. 또한, 치료 또는 예방에 사용된 유효 투여량은 특정 치료 또는 예방 섭생의 과정에 걸쳐 증가 또는 감소할 수 있음을 이해할 것이다. 투여량의 변화는 당업계에 공지된 표준 진단 검정에 의해 발생하고 명백해질 수 있다. 일부 경우에, 만성 투여가 요구될 수 있다.

"비알콜성 지방간염(NASH)"은, 알콜성 소비와 연관되지 않고 간세포의 지방 변화를 특징으로 하고 소엽내 염증 및 섬유증을 수반하는 간 질환이다. NASH는 일반적, 종종 "침묵" 간 질환이다. 이는 알콜성 간 질환과 유사하지만, 거의 또는 전혀 술을 마시지 않는 사람에서 발생한다. 3가지 주요 특징은 NASH를 특성화하고 이를 대사 기원의 다른 간 질환, 간에서 비정상적 지방 축적 또는 침착(간 지방증), 간 염증, 및 간 손상 또는 간 조직 손상(섬유증)과 구별한다.

NASH는 말기 간 질환, 간경변 및 간세포 암종으로 진행될 실질적 위험이 있는 잠재적으로 심각한 증상이다. 강경변이 발증하는 일부 환자는 간 부전의 위험이 있고, 결국 간 이식을 필요로 할 수 있다. NAFLD는 NAFLD 활성 스코어(NAS), 지방증(0 내지 3), 소엽 염증(0 내지 3) 및 간세포 벌룬(0 내지 2)에 대한 간 생검의 조직병리학적 스코어의 합계에 의해 NASH와 구별될 수 있다. <3의 NAS는 NAFLD에 상응하고, 3-4는 경계선 NASH에 상응하고, >5는 NASH에 상응한다. 생검은 또한 섬유증(0 내지 4)에 대해 채점된다.

본원에 사용된 바와 같이, NASH를 앓고 있는 환자는 NASH를 앓고 있거나 NASH로 진단되었거나 NASH의 발증에 유전적 경향이 있거나 대사 증후군, 비만, 당뇨병 또는 전-당뇨병을 앓고 있기 때문에 NASH의 발증에 취약한 환자이다. 또 다른 실시형태에서, NASH를 앓고 있는 환자는, 아직 NASH의 어떠한 신체 증상을 나타내지 않지만, NASH의 임상적 소견 특성(간에서 지방의 비정상적 축적, 간 염증 및 간 섬유증)을 나타내기 위해 시험되고 발견된 환자이다. 일부 경우에서, NASH를 앓고 있는 환자는 아직 진단이 이루어지지 않았지만 NASH의 증상을 나타낸다.

NASH의 치료는 NASH의 간경병으로의 진행을 지연시키거나 중단시킬 수 있다. 일부 치료 섭생은 신체 증상의 발병 또는 일련의 신체 증상 또는 임상 증상 또는 NASH와 연관된 발견을 지연시키는 것을 목표로 한다. 일부 실시형태에서, 치료는, 예를 들면, 체중 감소, 나약함 또는 피로 등의 NASH의 적어도 하나의 측정가능한 신체 증상의 개선을 초래한다. 다른 실시형태에서, 치료는 적어도 하나의 임상 파라미터의 개선 또는 NASH의 발견, 예를 들면, 비정상 간 지방 축적, 생검에 의해 결정된 간 섬유증, 간 염증, 간 효소(예: ALT)의 비정상 수준, 염증 사이토킨 또는 NAS 스코어의 비정상 수준을 초래한다. 다른 실시형태에서, 치료는, 육체적으로, 예를 들면, 측정가능한 증상 또는 일련의 증상(예: 피로, 체중 감소 또는 나약함)의 안정화에 의해 또는 임상적/생리학적으로, 예를 들면, 측정가능한 파라미터, 예를 들면, 간에서 비정상 지방 축적, 간 효소의 비정상 수준, 간 염증 마커의 비정상 수준, 간 생검의 비정상 발견, NAS 스코어의 안정화에 의해 NASH의 진행의 감소, 억제 또는 지연을 초래한다. 또 다른 실시형태에서, 치료는 또한, 질환 또는 장애 자체가 완전히 나타나기 전에, NASH의 원인 및/또는 효과 또는 임상적 징후, 또는 NASH의 결과로서 발증된 증상중 하나를 방지할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 NASH 환자에서 생존율 또는 생존 시간의 증가를 초래한다. 일부 실시형태에서, 치료는 간 이식을 필요로 하는 NASH 환자에 대한 가능성의 감소를 초래한다. 다른 실시형태에서, 치료는 NASH 환자가 간 이식을 받아야 할 필요성을 제거시킨다. 다른 실시형태에서, 이는 NASH 환자가 간경변을 발증할 가능성을 감소시킨다. 다른 실시형태에서, 이는 조직학에 의해 결정되는 바와 같이 간경변으로의 진행을 예방한다.

본원에 기재된 특정 실시형태는 "모노클로날" 항체(mAb)를 지칭한다. 모노클로날 항체는 항체 유전자를 모노클로날 숙주 세포 또는 각각의 세포주로 클로닝함으로써 생성된다. 모노클로날 항체는 배양에서, 세포주에 의해 항체 분자를 생성하는 임의의 방법을 사용하여, 예를 들면, 재조합 진핵생물(포유동물 또는 곤충) 또는 원핵생물(박테리아) 숙주 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하는 적합한 방법의 예는 쾨흘러 및 밀스테인의 하이브리도마 방법[참조: 1975, Nature 256:495-497] 및 인간 B-세포 하이브리도마 방법[참조: Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; and Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63]을 포함한다.

본원에 기재된 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 동정되거나 수득될 수 있다. 이러한 방법에서, 마우스 또는 햄스터 등의 기타 적절한 숙주 동물은, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화된다. 또는, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성한다.

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대, 방사선면역검정(RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정된다.

이어서, 모노클로날 항체는 표적 항원의 이의 특이적 결합에 대한 추가 시험 및, 예를 들면, 상이한 진단 또는 치료 목적을 위한 항체의 조작을 위해 하이브리도마 상청액으로부터 정제할 수 있다.

일부 경우에, huTNFR1-특이적 항체는 huTNFR1 항원에 대한 스크리닝을 통해 나타난다. 차별적으로 결합하는 클론을 단리할 가능성을 증가시키기 위해, 상이한 항원 또는 에피토프에 대해 공정적으로 스크리닝하여 다수 선택적 압력을 적용할 수 있다.

원하는 선택적 결합 특성을 갖는 항체를 동정하는 스크리닝 방법은 항체 서열 또는 이의 항원-결합 서열을 나타내는 라이브러리(예: 파지, 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포를 사용; 또는 핵산 정보를 각각의 (폴리)펩타이드로 변역하는 시험관내 디스플레이 시스템)를 사용한 디스플레이 기술에 의해 수행될 수 있다. 반응성은, 예를 들면, 표준 검정을 사용하여, 유세포분석법을 사용한 ELISA, 웨스턴 블롯팅 또는 표면 염색에 기초하여 평가할 수 있다.

단리된 항원(들)은, 예를 들면, 항체 라이브러리, 예를 들면, 파지-, 파지미드- 또는 효모-표시된 항체 라이브러리로부터 항체를 선택하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 기재된 특정 실시형태는 "약제학적 조성물"을 지칭하고, 이러한 조성물은, 특히 인공, 비-천연 존재 조성물을 수득하기 위해, 본원에 기재된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 본 발명에 따라 볼루스 주사 또는 주입 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여 수단을 용이하게 하기에 적합한 약제학적 담체는 당업계에 공지되어 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로, 본원에 기재된 항체 또는 관련 조성물 또는 조합과 생리학적으로 양립가능한 임의의 및 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 추가의 예는 멸균수, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.

한 가지 이러한 측면에서, 항체는 원하는 투여 경로에 적절한 하나 이상의 담체와 조합될 수 있고, 항체는, 예를 들면, 임의의 락토즈, 수크로즈, 전분, 알킨산의 셀룰로즈 에스테르, 스테아르산, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 아카시아, 젤라틴, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리딘, 폴리비닐 알콜과 혼합될 수 있고, 임의로 통상의 투여를 위해 추가로 정제화되거나 캡슐화될 수 있다. 또는, 항체는 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 카복시메틸 셀룰로즈, 콜로이드 용액, 에탄올, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 참기름, 트라가칸트 검 및/또는 다양한 완충액에 용해시킬 수 있다. 담체는 조절된 방출 물질 또는 시간 지연 물질, 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독 또는 왁스 또는 당업계에 공지된 기타 물질과 조합하여 포함할 수 있다.

추가의 약제학적으로 허용되는 담체는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES]에 기재되어 있다. 액체 제형은 용액, 에멀전 또는 현탁액일 수 있고, 현탁화제, 가용화제, 계면활성제, 보존제 및 킬레이트제 등의 부형제를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 항체 및 하나 이상의 약제학적 활성제가 제형화되는 약제학적 조성물이 고려된다. 본원에 기재된 항체의 안정한 제형은 원하는 순도를 갖는 상기 항체를 동결건조된 제형 및 수용액의 형태로 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다. 생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균성이다. 이는 멸균 여과 막 또는 다른 방법을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 본원에 개시된 항체 및 기타 치료학적 활성제는 또한 면역리포좀으로 제형화되고/되거나 마이크로캡슐에 포획될 수 있다.

본원에 기재된 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 경구, 피하, 정맥내, 비강내, 이내, 경피, 점막, 국소, 예를 들면, 겔, 고약, 로션, 크림, 복강내, 근육내, 폐내, 예를 들면, 흡입가능한 기술 또는 폐 전달 시스템을 사용하여, 질내, 비경구, 직장내 또는 안내를 포함하는 다양한 방법으로 수행될 수 있다.

비경구 투여에 사용된 예시적 제형은, 예를 들면, 멸균 용액, 에멀전 또는 현탁액 등의 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 것들을 포함한다.

한 가지 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는, 예를 들면, 단일요법을 변형 또는 예방하는 질환으로서 대상체에게 투여된 유일한 치료학적 활성제이다.

또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 추가의 활성 물질, 예를 들면, 혼합물 또는 키트 부분으로 조합되어, 치료 또는 예방, 예컨대, 질환 변형 또는 예방 병용 요법을 필요로 하는 대상체를 치료한다.

하나 이상의 다른 치료제 또는 예방제와의 조합은 표준 치료, 예를 들면, 염증 및/또는 다른 항체 기반 요법의 항생제, 스테로이드 및 비-스테로이드 억제제를 포함할 수 있다. 조합은 1차 질환의 치료에 사용되는 제제를 구체적으로 포함하고, 여기서 염증 프로세스는 2차 염증, 퇴행성 또는 악성 질환 증상을 야기할 수 있다. 1차 질환은, 예를 들면, NASH이고, 조합은, 예를 들면, NSAID 또는 기타 신규한 약물, 예컨대, FXR-작용제, GLP1R-작용제 또는 PPAR-작용제를 포함할 것이다.

병용 요법에서, 항체는 혼합물로서, 또는 하나 이상의 다른 치료 섭생과 함께, 예를 들면, 병행 요법 전, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다.

본원에 기재된 항체 또는 각각의 약제학적 제제의 생물학적 특성은 세포, 조직 및 전체 유기체 실험에서 생체외 특성화될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 약물은, 질환 또는 질환 모델에 대한 치료에 대한 약물 효능을 측정하기 위해 또는 약물의 약동학, 약력학, 독성 및 기타 특성을 측정하기 위해, 마우스, 랫트, 래빗, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이를 포함하지만 이로써 한정되지 않는 동물에서 종종 생체내에서 시험된다. 동물은 질환 모델로서 지칭될 수 있다. 치료제는 종종 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식 마우스 및 유전자도입 마우스(녹인 및 녹아웃 포함)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 마우스에서 시험된다. 이러한 실험은 수동 면역요법에 대한 적절한 반감기, 이펙터 기능, 억제제 활성 및/또는 면역 반응을 갖는 치료제 또는 예방제로서 사용될 항체의 가능성을 결정하기 위한 의미있는 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는 포유동물이 시험에 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간, 영장류와의 유전자 유사성으로 인해, 원숭이는 적합한 치료 모델일 수 있고, 따라서 대상 작용제 또는 조성물의 효능, 독성, 약동학, 약력학, 반감기 또는 기타 특성을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 인간의 시험은 궁극적으로 약물로서의 승인을 위해 요구되기 때문에, 물론 이러한 실험이 고려된다. 따라서, 본원에 기재된 항체 및 각각의 약제학적 조성물은 이의 치료적 또는 예방적 효능, 독성, 면역원성, 약동학 및/또는 다른 임상적 특성을 결정하기 위해 인간에서 시험될 수 있다.

따라서, 본 발명은 NASH 및 특히 NASH와 연관되는 질환 증상의 신규한 치료 방법을 제공한다. 마우스 모델에서 밝혀진 바와 같이, 항-TNFR1 항체가 NASH에서 간 지방증 및 조직학적 질환 활성을 현저히 개선시키는 것은 놀라운 것이다. TNFR1-억제는 간 지방증의 퍼센트 및 트리글리세라이드 함량의 현저한 감소를 초래했다. 또한, 지방증, 볼루잉 및 소엽 염증을 고려한 NAFLD 활성 스코어는 항-TNFR1 항체 치료에 의해 현저히 감소되었다. 선택적 TNFR1-억제가 NAFLD 마우스 모델에서 간 섬유증을 개선시키고 간 조직에서 섬유증의 감소에 의해 간 섬유증을 치료할 수 있는 것은 예상치 못한 것이었다. 항-TNFR1 항체 치료는 간 조직에서 아폽토시스를 감소시킬 수 있음이 추가로 밝혀졌다. 추가로, ALT 및 인슐린 혈청 수준의 현저한 감소가 달성되었다. 따라서, 항-TNFR1 항체를 사용한 치료는 NAFLD에서 염증 및 인슐린 저항성의 현저한 개선을 초래했다.

NASH 또는 지방증의 발증이 TNFi 요법의 부작용으로 보고되었기 때문에, 항-TNFR1 항체가 종래 기술의 관점에서 NASH에서 간 지방증 및 조직학적 질환 활성을 현저히 개선시키는 것은 특히 놀라운 것이었다. 피긴스 등(Feagins et al.)은 인플릭시맙, 아달리무맙 또는 에타네르셉트로 치료한 크론병, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염 환자가 TNFi 치료 동안 비정상 ALT 수준을 발증했고 간 생검에서 NAFLD(NASH 또는 지방증)을 나타냈음을 보고했다[참조: Eur J Gastroenterol Hepatol. 2015, 27(10):1154-1160]. 따라서, TNFR1의 선택적 억제가 NASH에 대해 효과적이라는 것은 매우 예상치 못한 것이었다.

본원에 기재된 예시적 항체는, 예를 들면, WO2012035141에 따라 생성된 전장 항체 및/또는 WO2008113515A2에 기재된 이의 모체 마우스 항체 H398, 상기 어느 하나의 친화성-성숙 기능적 활성 변이체 및/또는 항체 단편, 또는 일가 항-huTNFR1 결합제이고 상기 어느 하나의 항원-결합 부위를 포함하는 항체, 예컨대, WO2017174586 A1에 기재된 1가 항체이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이로 한정되지 않는다.

실시예

실시예 1: 실험 NAFLD를 갖는 마우스에서 간 지방증 및 조직학적 질환 활성의 개선

방법

B6-huTNFR1-k/i-마우스는 항-TNFR1(Atrosab) 또는 대조군 항체(Cetuximab, 항-EGFR 항체, Erbitux^®, ImClone Systems, Bristol-Myers Squibb und Merck KGaA) 치료(20mg/kg 체중, 2x/w)가 보충된 24주 동안 식수(Kohli R et al., Hepatology 2010)에서 60% kcal 지방+프럭토즈/사카로즈로 이루어진 고지방 식이(HFD)를 추가 8주간 제공받았다.

본원에 사용된 아트로사브 항체는, WO2012035141에 따라 생성되고 VH 및 VL 도메인의 조합이 도입된 항원-결합 부위를 포함하는 전장 항체이고, 이는 6개 CDR 서열:

서열번호 23: VH-CDR1

서열번호 24: VH-CDR2

서열번호 25: VH-CDR3

서열번호 26: VL-CDR1

서열번호 27: VL-CDR2

서열번호 28: VL-CDR3을 포함한다.

치료 종료시에, 차등적으로 치료된 마우스로부터 간 조직을 간 지방증, NAFLD 활성 스코어, 아폽토시스 및 섬유증에 대해 비교했다.

클레이너 등[참조: Kleiner et al., Hepatology 2005]에 따르는 NAFLD 활성 스코어(NAS) 및 지방증의 퍼센트는 병리학자에 의해 평가했다. 트리글리세라이드 활성은 효소 시험(Roche Diagnostics)을 사용하여 균질화 간 조직에서 측정했다. 아폽토시스는 활성화된 카스파제-3(세포 시그널링)에 대한 항체를 사용하여 면역조직화학에 의해 조사했다. 섬유증은 제조업자(Sigma Aldrich)의 프로토콜에 따라 시리우스 레드 염색에 의해 검출했고, 기재된 바와 같이 정량화했다[참조: Schindelin J et al., Nat Methods 2012].

혈청은 운동 UV 시험(Beckman Coulter)에 의해 ALT 수준에 대해 분석하고, 인슐린 수준은 제조업자의 지침에 따라 초민감성 마우스 인슐린 ELISA 키트(Crystal Chem.)을 사용하여 측정했다.

결과:

아트로사브-치료는 실험 NAFLD를 갖는 마우스에서 간 지방증 및 조직학적 질환 활성의 현저한 개선을 초래했다.

항-TNFR1 항체(아트로사브) 또는 대조군(세툭시맙) 항체로 치료한 HFD-마우스의 간 조직은 간 지방증의 퍼센트, 트리글리세라이드 함량 및 NAFLD 활성 스코어(NAS)에 의해 평가된 질환 활성에 대해 조직학적으로 분석했다. 대조군 항체로 치료한 마우스와 비교하여, TNFR1-억제는 트리글리세라이드 함량(p<0.01; 도 1B) 뿐만 아니라 간 지방증의 퍼센트(p<0.05; 도 1A)의 현저한 감소를 초래했다. 또한, 지방증, 볼루닝 및 소엽 염증을 고려하는 NAFLD 활성 스코어(NAS)는 대조군 마우스와 비교하여 아트로사브-치료 마우스에서 유의적으로(p<0.05) 감소되었다(도 1C).

실시예 2: 선택적 TNFR1-억제는 NAFLD 마우스 모델에서 간 섬유증의 개선과 연관된다.

선택적 TNFR1-억제가 간 지방증 및 NAS를 개선시킨다는 것을 입증한 후, 섬유증 감소에 대한 아트로사브의 효과를 분석했다. 간 섬유증의 개선은, 대조군 항체로 치료한 마우스와 비교하여, 항-TNFR1-항체로 치료한 마우스에서 시리우스 레드 염색에 의해 평가하여 입증했다(도 2A). 섬유성 부분의 정량화는 대조군 마우스와 비교하여 항-TNFR1-항체로 치료한 마우스의 간 조직에서 유의한(p<0.05) 섬유증 감소를 나타냈다(도 2B).

실시예 3: 항-TNFR1 항체로 치료한 NAFLD 마우스의 간 조직에서 아폽토시스 감소

초기 실험에서, 마우스는 항-TNFR1 또는 대조군 항체로 4주 치료를 포함하여 20주 동안 HFD를 제공받았다. 항-TNFR1 항체 치료는, 이미 4주 치료 기간 내에, 활성 카스파제-3의 면역조직화학 분석에 의해 평가된 아폽토시스를 감소시킬 수 있음이 입증되었다. 대조군 항체와 비교하여, 활성 카스파제-3의 유의한(p<0.05) 감소가 항-TNFR1 항체로 치료한 마우스의 간 조직에서 관찰될 수 있다(도 3).

실시예 4: 항-TNFR1 항체로 치료한 NAFLD 마우스의 혈청에서 ALT 및 인슐린 수준의 개선

항-TNFR1 항체로 치료한 마우스의 개선된 조직의 관찰(도 1 및 2)와 일치하게, 대조군 항체로 치료한 마우스와 비교하여, ALT(도 4A) 및 인슐린(도 4B) 혈청 수준의 유의한(p<0.05) 감소가 입증되었다. 따라서, 선택적 항-TNFR1 억제는 염증 및 인슐린 저항성의 유의한 개선을 초래했다.

실시예 5: 아트로시맙의 기재 - 생성 및 특성화

재료

아트로사브 항체는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득했다. 재조합 인간 TNFR1-Fc 융합 단백질은 WO2012035141에 기재된 바와 같이 생성했다. 아트로시맙(HC: 서열번호 18; LC: 서열번호 13)은, 카탈렌트(Catalent Pharma Solutions, Somerset, Ewing, NJ, US)에 의한 CHO 세포에서 렌티바이러스 형질도입 후에 생성하고 정제했다. 항-His-HRP(HIS-6 His-Probe-HRP, sc-8036)은 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구매했다. 항-인간 IgG A(Goat, polyclonal, 2010-01)는 SouthernBiotech 및 항-인간 IgG B(염소, 폴리클로날, MBS571163)로부터 입수하고, 항-인간 IgG B(염소, 폴리클로날, MBS571678)은 MyBioSource(San Diego, CA, USA)로부터 입수했다. 추가로, 항-인간 IgG(Fab 특이적, A 0293) 및 항-인간 IgG(Fc 특이적, A 0170)은 Sigma-Aldrich(Taufkirchen, Germany)로부터 구매했다.

단백질 생산

폴리에틸렌이민(선형, 25kDa, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)을 사용하여 일시적으로 형질감염된 HEK 293E 세포에서 WO2017174586A1에 기재된 바와 같이 참조 단백질 Fab 13.7을 생산하고, 제조업자(CaptureSelect^TM IgG-CH1 Affinity Matrix, 194320005, Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Germany)에 의해 권장된 바와 같이 단백질 친화성 크로마토그래피에 의해 엄격하게 정제했다.

단백질 특성화

아트로시맙의 순도 및 정확한 어셈블리는 환원제로서 베타-머캅토에탄올의 존재 및 부재하에 4㎍의 정제된 단백질을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석했다. 겔 내의 단백질은 쿠마시에-브릴리언트 블루를 사용하여 염색하고, 겔을 물로 탈-염색했다. 무손상 단백질은 Waters 2695 HPLC 및 Phenomenex Yarra SEC-2000 컬럼(300 × 7.8mm)을 사용하여 크기-배제 크로마토그래피에 의해 분석했다. 표준 단백질: 티로글로불린(669kDa), 아포페리틴(443kDa), 알콜 데하이드로게나제(150kDa), BSA(66 kDa), 탄산 탈수효소(29kDa), FLAG 펩타이드(1kDa).

열 안정성

아트로시맙의 용융/응집 온도(T_m)은 PBS 중의 100㎍의 정제된 단백질을 사용하여 동적 광 산란(ZetaSizer Nano ZS, Malvern, Herrenberg, Germany)에 의해 결정했다. 적용된 온도는 각각의 측정 전에 2분의 평형 시간으로 35℃에서 80℃까지 1℃ 간격으로 증가시켰다. T_m은 증가 시그널(kcps)의 시각적 해석에 의해 결정했다.

혈장 안정성

정제된 아트로시맙의 샘플을 인간 혈장에서 100nM의 농도로 희석시키고, 37℃에서 1, 3 및 7일 동안 인큐베이팅했다. 인간 TNFR1에 대한 잔류 결합능의 후속 분석은 PBS 중의 2% 탈지유(2% MPBS)에서 1 내지 3.16(10의 제곱근)의 단계에 의해 연속 희석 후에 ELISA로 수행했다. 대조군 샘플은 7일 동안 PBS에서 4℃에서 인큐베이팅하거나, 인간 혈장에서 희석 후에 직접 동결시켰다.

효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)

미세역가 플레이트를 100㎕의 TNFR1-Fc 융합 단백질(PBS 중의 1㎍/ml)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅했다. 잔류 결합 부위를 실온에서 2시간 동안 2% MPBS(PBS 중의 탈지유, 웰당 200㎕)로 차단하고, 이어서 PBS로 2회 세척했다. 2% MPBS에서 희석한 100㎕의 샘플을, 2% MPBS에서 100㎕의 HRP 접합된 검출 항체와 함께 최종 배양 단계 전에 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 결합된 단백질을 100㎕ TMB 기질 용액(1mg/ml 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘[TMB], 100mM Na-아세테이트 완충액 중의 0.006% H₂O₂, 실온에서 pH 6)로 검출하고, 50㎕ 1M H₂SO₄의 첨가에 의해 HRP-반응을 중지시키고, 450nm 파장에서의 흡광도는 무한 미세역가 플레이트 판독기(TECAN, Maennedorf, Switzerland)를 사용하여 측정했다. 각 인큐베이션 단계 사이 및 검출 전에, 플레이트를 PBST로 2회 및 PBS로 2회 세척했다.

석영 결정 미량천칭을 사용한 친화성 측정

단백질-단백질 상호작용에서 실시간 결합 역학은 석영 결정 미량천칭 측정(Cell-200 C-Fast, Attana, Stockholm, Sweden)에 의해 결정했다. 결합 파트너(TNFR1-Fc) 중의 하나는 화학적으로 LNB 카복실 센서 칩(3623-3103, Attana, Stockholm, Sweden) 상에 제조업자의 프로토콜에 따라 약 94ΔHz의 중간 밀도에서 고정시켰다. 결합 실험은 37℃에서 25㎕/min의 유속으로 pH 7.4에서 128nM 내지 4nM(1:2 희석 단계)의 PBST(PBS, 0.1% 트윈 20)으로 희석시킨 샘플(분석물)로 수행했다. 칩은 25㎕의 20mM 글리신(pH 2.0)으로 재생시켰다. 매 제3 측정마다, 데이터 분석 전에 결합 곡선으로부터 차감된 작동 완충액의 주사를 측정했다. 데이터는 Attana에 의해 제공된 소프트웨어를 사용하여 수집하고, Attache 사무실 평가 소프트웨어(Attana, Stockholm, Sweden) 및 TraceDrawe(ridgview 장치, Vange, Sweden)에 의해 분석했다.

인터류킨 방출 검정

웰당 2×10⁴ HeLa 또는 HT1080 세포를 96 웰 미세역가 플레이트에 파종하고, 밤새 100㎕ RPMI 1640+5% FCS에서 성장시켰다. 다음 날, 상청액을 교환하여 구성적으로 생성된 사이토킨을 제거했다. 세포는 37℃, 5% CO₂에서 RPMI 1640+5% FCS에서 샘플의 일련의 희석으로 인큐베이팅했다. 경쟁 실험의 경우에, 양 분석된 단백질 샘플을 개별적으로 제조하고(적정 또는 단일 농도로 희석), 후속적으로 플레이트에 첨가했다. 비-자극된 세포는 대조군으로 사용했다. 16 내지 20시간 후, 플레이트를 5분 동안 500g으로 원심분리하고, 세포 상청액을 ELISA에 의해 직접 분석하고, 이는 제조업자의 프로토콜에 따라 수행했다. 상청액을 RPMI 1640(FCS 없이)으로 희석하고, 항체를 시약 희석제(0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20mM TRIS, 150mM NaCl, pH 7.5)로 희석했다. 코팅된 미세역가 플레이트는 PBS 중의 1% BSA(소 혈청 알부민)을 사용하여 차단하고, 세척 및 검출 및 측정을 ELISA에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행했다. 세포 배양 상청액에서 IL-6 및 IL-8의 검출을 위한 샌드위치 ELISA 키트는 ImmunoTools(Friesoythe, Germany)로부터 구매했다.

세포독성/세포 생존력 검정

세포(웰당 1×10⁴)를 96-웰 미세역가 플레이트에 파종하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 인큐베이팅했다. 단백질을 RPMI 1640+10% FCS로 희석하고, 세포에 첨가했다. 세포독성 검정물은 상청액을 버리기 전에 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이팅하고, 50㎕ 결정 자색 용액을 웰에 첨가했다. 이어서, 플레이트를 20회 ddH₂O에서 세척하고, 건조시켰다. 염색 용액에 함유된 메탄올에 의해 고정된 살아있는 및 부착 세포로부터 생성되는 잔류 자색 염료를, 실온에서 10분 동안 진탕시키면서, 100㎕ 메탄올의 첨가에 의해 용해시켰다. 플레이트는 무한 미세역가 플레이트 판독기(Tecan, Maennedorf, Switzerland)를 사용하여 측정했다.

약동학

특정 마우스 유전자의 유전자좌에서 인간 TNFR-1의 세포외 도메인의 유전자를 보유하는 유전자도입 C57BL/6J 마우스(C57BL/6J-huTNFRSF1Aecdtm1UEG/izi, Dong et al., 2016)는 400㎍의 아트로시맙의 정맥내 주사를 제공받았다. 혈액 샘플은 3일 및 7일 뿐만 아니라 3분, 30분, 1시간, 2시간 및 6시간 후에 수집하고, 즉시 아이스 상에서 인큐베이팅했다. 혈청을 원심분리(13,000g, 4℃, 10분)에 의해 분리하고, -20℃에서 저장했다. 혈청 중의 잔류 단백질은 상기 기재된 바와 같이 결합 ELISA에 의해 검출했다. ELISA 시그널을 분석된 단백질의 새롭게 제조된 표준 결합 곡선으로부터 보간했다. 결정된 농도를 시간에 대해 플롯팅하고, 마이크로소프트 엑셀용 PKsolver 애드-인(add-in)을 사용하여 분석하면, 약동학 상수가 수득되었다.

실시예 5.1: 아트로시맙의 생화학적 특성화

아트로시맙으로 지정된 일가 종양 괴사 인자(TNF) 수용체(TNFR1)-특이적 길항제는 Fab 13.7의 가변 도메인을 헤테로이량체 Fc 모듈 Fc1k(1/카파)의 N-말단에 융합시킴으로써 생성했다. 이 프로세스는, 확장된 혈청 순환을 가능하게 하기 위해, 신생아 Fc 수용체와 상호작용하는 능력이 구비된, 증가된 크기의 Fab-유사 일가 분자를 생성했다(도 6a). 수득된 약물 후보 아트로시맙은 몇 라운드의 렌티바이러스 형질도입 후에 CHO 세포에서 생성하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및, 카탈렌트 파르마 솔루션스(Catalent Pharma Solutions)(Catalent Pharma Solutions, Somerset, Ewing, NJ, US)에 의한 연속 크기 배제 크로마토그래피로 정제했다.

아트로시맙은 81kDa의 보간된 분자량 및 3.5nm의 스트로크 반경 rs를 갖는 17.9분의 체류 시간에서 SEC의 단일 피크를 나타냈다(도 6b). 환원 조건하의 SDS-PAGE에서, 38kDa 및 43kDa의 2개 밴드가 검출되었고, 뿐만 아니라 비-환원 조건하에 70kDa의 1개 밴드가 검출되었다(도 6c). 이들 데이터는 72kDa의 계산된 분자 질량(35kDa 및 36kDa 쇄로 구성됨)에 양호하게 상응하고, 양 폴리펩타이드 쇄의 적절한 발현 및 기능성 헤테로이량체 단백질의 정확한 어셈블리를 나타낸다. 또한, 아트로시맙은 동적 광 산란(DLS, 도 6d)에 의해 측정할 때 64℃의 응집점(T_m)을 나타냈고, 이는 또한 DLS에 의해 분석된 무손상 IgG 분자의 것에 필적한다[참조: Martin et al., 2014, Brader et al., 2015]. 마지막으로, 인간 TNFR1-Fc에 대한 아트로시맙의 결합 활성은 최대 7일 동안 인간 혈장에서 인큐베이팅후에 변경 없이 잔류했고, 이는 양호한 혈장 안정성을 나타낸다(도 6e).

실시예 5.2: TNFR1, Fcγ 수용체 및 보체 단백질 C1q에 대한 아트로시맙의 결합

아트로시맙과 이의 표적 수용체 TNFR1의 상호작용은 평형 조건하에 ELISA에 의해 분석하고, 모체 Fab 13.7과 비교할 때, 결합 활성의 2배 감소를 나타내는 0.4nM의 EC₅₀ 값(도 7a)을 생성하고, 이가 IgG ATROSAB와 비교하여 4배 감소를 나타낸다. 더욱이, 아트로시맙은 약 94ΔHz의 중간 수용체 밀도로 고정화시킨 인간 TNFR1에 석영 결정 미량천칭을 사용한 실시간 결합 연구에서, 1:1 결합 알고리즘에 의해 분석할 때, 2.7nM의 외관상 K_D 값 및 k_on 3.7×10⁵M^-1s^-1 및 9.8×10^-4 s^-1로 결합했다(도 7b). 주목할만한 것은, 아트로시맙은 항체-매개된 이펙터 기능을 감소시키도록 변형되는 Fc 영역을 포함한다(Armour et al., 1999). 따라서, 아트로시맙은, ELISA에 의해 입증된 바와 같이, 보체 단백질 C1q 뿐만 아니라 인간 Fcγ 수용체 Ia, IIb 및 IIIa에 대한 결합의 거의 완전한 결여를 나타냈다(도 7c). 결합은, 상기 기재된 항-인간 TNFR1 IgG ATROSAB(Zettlitz et al., 2010)와 비교할 때, 유사한 정도(FcγRI 및 FcγRIII) 또는 보다 더 현저하게(FcγRIIb 및 C1q) 감소했고, 이는 Fcγ 수용체 및 C1q 결합과 관련하여 동일한 Fc 변형을 갖는다.

실시예 5.3: 아트로시맙은 시험관내에서 TNFR1 활성화를 억제하고, 임의의 작용제 활성을 결여한다.

아트로시맙은, Kym-1 세포를 사용한 세포사 유도 검정 뿐만 아니라, IL-6를 분석하는 HeLa 세포 및 IL-8을 위한 HT1080 세포를 사용하는 인터류킨(IL) 방출 실험에서 50pM 내지 500nM의 분석된 농도 범위에서 임의의 작용제 생물활성의 완전한 부재를 나타냈다(도 3a 내지 3c). 작용성의 동일한 결여는 모체 Fab 13.7의 경우에 검출되었다. 대조적으로, 이가 IgG ATROSAB는 1nM 내지 100nM의 농도에서 IL-6 및 IL-8의 한계 방출을 유도했고(도 8a 및 b), 이는 이전에 공개된 데이터를 확인했다(Richter et al., 2013). 대조적으로, ATROSAB의 한계 작용 활성은 Kym-1 세포사 유도 검정에서 검출할 수 없었다(도 8c).

추가로, 아트로시맙은, 각각 54.5nM 및 24.2nM의 EC₅₀ 값으로 HeLa IL-6 방출 검정 및 HT1080 IL-8 방출 검정에서 0.1nM TNF에 의해 유도된 TNFR1의 활성화를 억제시켰다(도 8d 및 e). 더욱이, Kym-1 세포에서 0.1nM TNF에 의해 유도된 세포사는 16.2nM의 IC₅₀ 값에서 아트로시맙에 의해 억제되었다(도 8f). 모체 Fab 13.7과 비교할 때, 이들 데이터는 생물활성에서 1.5배 내지 1.9배 감소를 나타낸다(표 1). 그러나, 이가 IgG ATROSAB의 생물활성과 비교하여, 아트로시맙은, 각각 IL-6 방출 검정, IL-8 방출 검정 및 세포사 유도 검정에서 측정할 때, TNF-매개된 TNFR1 활성화의 3.0배, 3.5배 및 4.0배 더 강력한 억제를 입증했다(표 1).

아트로시맙의 생물활성

	아트로시맙	Fab 13.7	ATROSAB
IC₅₀, IL-6 [nM]	54.5	37.1	164.7
IC₅₀, IL-8 [nM]	24.2	12.7	84.1
IC₅₀, 세포사 유도 [nM]	16.2	9.5	64.4

예를 들면, 항-약물 항체(ADA)에 의해 매개된 아트로시맙의 이차 가교결합의 잠재적 위험에 대처하기 위해, 아트로시맙의 작용제 가능성은 HT1080 세포를 사용하여 IL-8 방출 검정에서 3개의 상이한 마우스 항-인간 IgG 혈청의 존재하에 분석했다[참조: Richter et a. 2013]. 아트로시맙, Fab 13.7 및 ATROSAB에 대한 마우스 항-인간 IgG 혈청의 결합은 ELISA에 의해 입증했다(데이터는 제시하지 않음). 특히, 아트로시맙은 분석된 농도 범위(50pM 내지 500nM)에서 IL-8의 임의의 방출을 유도하지 않았고, 이는 또한 모체 Fab 13.7에 대해 관찰되었다(도 9a 내지 c). 대조적으로, 이가 IgG ATROSAB는, 도 8에서 관찰된 한계 방출과 비교할 때, IL-8의 증가된 방출을 명백하게 유도했고(도 9a 내지 c), 이는, ATROSAB와 비교할 때, 약물-특이적 항체의 존재하에서도 TNFR1의 임의의 활성화를 매개하는 아트로시맙의 명백히 감소된 경향을 나타낸다.

실시예 5.4: 아트로시맙의 약동학

마지막으로, 아트로시맙의 약동학 특성은, 인간 TNFR1의 세포외 도메인의 도입유전자를 갖는 C57BL/6J-huTNFRSF1A_ecd ^tm1UEG/izi (Dong et al., 2016) 마우스를 사용하여 400㎍ 단백질의 볼루스 주사후에 기록했다(도 10, 표 2). 아트로시맙은 2.2 ± 1.2시간의 초기 반감기 및 41.8 ± 18.1시간의 말기 반감기로 마우스 순환으로부터 제거되었고, 이는 5856.0　±　1369.9㎍/ml × h의 곡선하 면적을 초래한다.

아트로시맙의 약동학 분석

t_1/2α(h)	2.2±1.2
t_1/2β(h)	41.8±18.1
C₀(㎍/ml)	324.7±53.5
AUC 0-t(㎍/ml×h)	5856.0±1369.9
V_ss(㎍/(㎍/ml))	3.4±1.3
CL((㎍)/(㎍/ml)/h)	0.28±0.20

t_1/2α, 초기 반감기; t_1/2β, 말기 반감기; C₀, 보간된 초기 농도; AUC 0-t, 레이즈 검출된 시점까지의 곡선하 면적; V_ss, 분포 용적(정상 상태에서); CL, 클리어런스.

참조문헌

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Tyr Ser Gly His Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 30 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 31 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 32 <211> 455 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro 20 25 30 His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys 35 40 45 Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 50 55 60 Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu 85 90 95 Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val 100 105 110 Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 115 120 125 Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe 130 135 140 Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu 145 150 155 160 Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu 165 170 175 Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr 180 185 190 Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 195 200 205 Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu 210 215 220 Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys 225 230 235 240 Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu 245 250 255 Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser 260 265 270 Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val 275 280 285 Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys 290 295 300 Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly 305 310 315 320 Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn 325 330 335 Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp 340 345 350 Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro 355 360 365 Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu 370 375 380 Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln 385 390 395 400 Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala 405 410 415 Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly 420 425 430 Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro 435 440 445 Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg 450 455 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly

Claims

비알콜성 지방간염(NASH) 및 이와 연관된 질환 증상의 치료에 사용하기 위한, 인간 종양 괴사 인자 1(huTNFR1)을 특이적으로 인식하는 항체.
제1항에 있어서, huTNFR1의 막-원위(membrane-distal) CRD1 및/또는 CDR2의 서브도메인 A1 내의 에피토프를 특이적으로 인식하고, 바람직하게는 huTNFR1의 N-말단 영역의 아미노산 1 내지 115로 표시되는 에피토프를 특이적으로 인식하는, 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체인, 항체.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단일특이적인, 이가의 전장(full-length) 항체인, 항체.
제4항에 있어서, 이펙터 기능을 매개하는 것이 결여된 IgG1 Fc 도메인을 포함하고, 바람직하게는 E233P, L234V, L235A, ΔG236, A327G, A330S 및 P331S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게는 A327G/A330S/P331S를 포함하고, 여기서 넘버링은 카뱃 EU 인덱스에 따르는, 항체.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, huTNFR1을 일가로(monovalently) 인식하는, 항체.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
a) 상보성-결정 영역(CDR): VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
b) CDR: VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL),
여기서,
i)
VH-CDR1은 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어짐;
VH-CDR2는 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어짐;
VH-CDR3은 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어짐;
VL-CDR1은 서열번호 4를 포함하거나 이로 이루어짐;
VL-CDR2는 서열번호 5를 포함하거나 이로 이루어짐;
VL-CDR3은 서열번호 6을 포함하거나 이로 이루어짐;
또는
ii)
VH-CDR1은 서열번호 23을 포함하거나 이로 이루어짐;
VH-CDR2는 서열번호 24를 포함하거나 이로 이루어짐;
VH-CDR3은 서열번호 25를 포함하거나 이로 이루어짐;
VL-CDR1은 서열번호 26을 포함하거나 이로 이루어짐;
VL-CDR2는 서열번호 27을 포함하거나 이로 이루어짐;
VL-CDR3은 서열번호 28을 포함하거나 이로 이루어짐;
넘버링은 카뱃 EU 인덱스에 따름,
또는 각각의 CDR 서열에서 0, 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함하고, huTNFR1을 특이적으로 인식하는, 상기 i) 또는 ii) 중 임의의 기능적 활성 변이체
를 포함하는, 항체.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열번호 7 또는 9를 포함하거나 이로 이루어지는 VH 서열과 서열번호 8 또는 10을 포함하거나 이로 이루어지는 VL 서열, 또는 이의 기능적 활성 변이체를 포함하고, 여기서 기능적 활성 변이체가 각각의 CDR 서열에서 최대 1개의 점 돌연변이와 VH 및 VL의 프레임워크(FR) 서열 FR1 내지 4에서 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 것인, 항체.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 증상이 간 지방증, 염증성 간, 간 섬유증 및 간세포 암종 중 어느 것인, 항체.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 유효량의 항체가 TNFa/huTNFR1 시그널링을 길항시키기 위해 NASH를 앓고 있는 환자에게 투여되는, 항체.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 유효량의 항체가 하기 중의 어느 하나 이상을 감소시키기 위해, NASH를 앓고 있는 환자에게 투여되는, 항체:
a) 지방증, 트리글리세라이드 함량, 염증, 및 또는 간 조직에서 아폽토시스;
b) 혈청 아미노트랜스퍼라제 수준;
c) 인슐린-저항성 및 임의로 글루코즈-내성을 개선시키기 위해; 및/또는
d) NAFLD 활성 스코어.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 0.05mg/kg 내지 20mg/kg 범위의 용량으로 NASH를 앓고 있는 환자에게 투여되는, 항체.
제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 항-염증 약물을 사용한 치료; 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR) 작용제, 글루카곤-유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R) 작용제, 또는 퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체(PPAR) 작용제를 사용한 요법과 조합하여 NASH를 앓고 있는 환자에게 투여되는, 항체.
제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 II형 진성 당뇨병, I형 진성 당뇨병, 전-당뇨병, 인슐린 저항성 또는 비만을 앓고 있는 환자에게 투여되고, 비만이 적어도 30의 체질량 지수를 갖는 환자로서 정의되는, 항체.
제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 유효량의 항체를 포함하는 약제학적 제제가 사용되는, 항체.