TW201915023A - Ｉｌ－６ｒ抗體、其抗原結合片段及醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

本公開涉及IL-6R抗體、其抗原結合片段及醫藥用途。進一步地，本公開涉及包含該IL-6R抗體CDR區的羊駝源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，以及包含IL-6R抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為藥物的用途。特別地，本公開涉及一種人源化的IL-6R抗體在製備用於治療IL-6相關的疾病或病症的藥物中的用途。

Description

IL-6R抗體、其抗原結合片段及醫藥用途
本公開涉及IL-6R抗體以及其抗原結合片段，進一步地，本公開還涉及包含該IL-6R抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，本公開還涉及包含該IL-6R抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為IL-6R或IL-6相關疾病診斷劑和治療藥物的用途。
白介素6(IL-6)是一種多效性炎症細胞因子，能調節細胞生長和分化，在介導炎症反應及免疫應答中發揮重要作用。白介素6和其受體(IL-6R)的產生與許多疾病的發病機理相關，如多發性骨髓瘤、自身免疫性疾病和***癌症。
IL-6R是最早被發現的造血細胞因子受體超家族的成員，又被稱為CD126，包括IL-6R α及IL-6R β即IL-6家族成員共有信號轉導蛋白gp130。IL-6只有與IL-6R α結合形成IL-6/IL-6R α複合物後才能與gp130結合形成高親和力複合物(免疫學雜誌，2006,25(5)：475-479)。
IL-6R α主要表達在肝細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及 某些淋巴細胞表面；gp130表達於所有細胞表面(Rheumatology(Oxford,England)，2010,49(1)：15-24)。另外還存在一種可溶形式的IL-6R(即sIL-6R)。sIL-6R在體液中運輸，因此增加了對IL-6起反應的細胞的種類。例如，內皮細胞、滑膜細胞表達gp130，卻不表達IL-6R。只有在sIL-6R存在時，才能對IL-6起反應(Rheumatology(Oxford,England)，2010,49(1)：15-24)。另外，還存在一種由gp130胞外區組成的可溶性片段(sgp130)，它能與IL-6及sIL-6R複合物發生結合，具有拮抗IL-6生物學活性的作用。
已有研究表明，IL-6R在多種疾病中均有異常高表達，比如多發性骨髓瘤、肝癌以及幾乎所有的髓系白血病等等(Journal of Experimental Hematology 2001：9(2)184-187)。作為一種免疫治療靶點，全球首個IL-6R單抗Tocilizumab(托珠單抗)已於2009年上市。第二個IL-6R單抗Sarilumab也於2017年1月率先在加拿大上市。IL-6R抗原很早就已公開，目前已有WO1996011020A1、WO2009052454、WO2016089886、WO2005061000、US8753634、US20100215664、US7582298、US5795965、US8034344、WO2016062766和CN101454345B等專利報道了IL-6R的抗體。大多數專利均關於IL-6R抗體的適應症和應用，如肝癌、中樞神經系統(CNS)炎症、慢性類風濕性關節炎及血管炎等等。
但是，上述藥物在IL-6介導的疾病治療等方面仍有可改進的空間。因此，有必要繼續開發具有高選擇性、藥效 良好、副作用低的抗體，為治療IL-6R相關疾病提供更多和更優的抗IL-6R治療方案。
本公開提供與IL-6R的胞外區的胺基酸序列或三維結構結合的單株抗體或其抗原結合片段。此外，本公開獲得與該單株抗體或其抗體片段競爭的高活性和高穩定性的抗人IL-6R抗體。
此外，本公開將提供了一種生產方法，其生產根據本公開的抗體的純株、編碼該抗體的DNA、包含該DNA的載體、藉由轉化該載體而獲得的轉化體；本公開還提供了一種使用該純株或轉化體來生產抗體或其抗體片段的方法；以及本公開還提供了一種診斷劑或治療劑，其包含作為活性成分的根據本公開的抗體或其抗體片段。
一方面，本公開提供一種單株抗體或其抗原結合片段。根據本公開的單株抗體或其抗原結合片段包含：CDR1、CDR2和CDR3。其中，該CDR1的序列選自：SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：15的變體序列；在具體的實施方式中，相較於SEQ ID NO：15所示序列而言，該SEQ ID NO：15的變體序列存在1、2或3個胺基酸差異；在具體的實施方式中，該SEQ ID NO：15的變體序列是藉由親和力成熟(antibody affinity maturation)實驗所獲得的。該CDR2的序列選自：SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：16的變體序列；在具體的實施方式中，相較於SEQ ID NO：16所示序列而言，該SEQ ID NO：16的變體序列存在1、2或3個胺基酸差異；在具體的實施方式中，該SEQ ID NO：16的 變體序列是藉由親和力成熟實驗所獲得的。該CDR3的序列選自：SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：17的變體序列；在具體的實施方式中，相較於SEQ ID NO：17所示序列而言，該SEQ ID NO：17的變體序列存在1、2或3個胺基酸差異；在具體的實施方式中，該SEQ ID NO：17的變體序列是藉由親和力成熟實驗所獲得的。該單株抗體或其抗原結合片段識別並結合人IL-6R。
在一些實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段中，該CDR1序列如SEQ ID NO：15所示；該CDR2序列如SEQ ID NO：16所示；和該CDR3序列如SEQ ID NO：17所示。
在一些實施方式中，該單株抗體是重組抗體。
在一些實施方式中，該單株抗體選自：羊駝源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中，該人源化抗體的可變區上的FR區序列來源於人種系重鏈或其突變序列。
在一些實施方式中該單株抗體含有SEQ ID NO：14所示的VHH或其變體；該變體是在SEQ ID NO：14所示的VHH序列上具有1至15個胺基酸變異；更具體地，該VHH的變體是在SEQ ID NO：14所示的VHH的FR區位置上具有1至15個胺基酸變異；更具體地，該VHH的變體在SEQ ID NO：14所示的VHH序列上包含選自以下的變異：A14P、E23A、Q44G、V78L、K86R、N96A、A97F、Q116L、或其組合。
在一些實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段進一步 包括人抗體Fc區；較佳包含SEQ ID NO：19所示的人抗體Fc區序列。
在一些實施方式中，該抗原結合片段選自：單域抗體、和包含該CDR1至CDR3的肽。
在一些實施方式中，根據本公開的單株抗體或其抗原結合片段，與上述限定的單株抗體或其抗原結合片段競爭對IL-6R的結合，並阻斷IL-6與IL-6R的結合。
另一方面，本公開提供一種醫藥組成物，其含有治療有效量的上述單株抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
另一方面，本公開提供一種核酸分子，其編碼上述單株抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中，該核酸分子編碼上述CDR區。在一些實施方式中，該核酸分子包含與SEQ ID NO：13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或、至少100%同源性的多核苷酸。
另一方面，本公開提供一種重組載體，其包含根據上述的核酸分子。
另一方面，本公開提供一種宿主細胞，其轉化有上述重組載體；該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳為哺乳動物細胞或酵母細胞。該哺乳動物細胞較佳為HEK293E細胞、CHO細胞、NS0細胞。該哺乳動物細胞不發育成個體。
另一方面，本公開提供一種用於生產上述單株抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括以下步驟：．培養上述宿主細胞；．在培養物中形成並積累上述單株抗體或其抗原結合片段；以及．從培養物中回收該單株抗體或其抗原結合片段。
另一方面，本公開提供一種用於檢測或測定人IL-6R的方法，該方法包括步驟：使用上述單株抗體或其抗原結合片段檢測樣本中的IL-6R。
另一方面，本公開提供一種用於檢測或測定人IL-6R的試劑，該試劑包含上述單株抗體或其抗原結合片段。
另一方面，本公開提供一種治療與人IL-6R相關的疾病的方法，該方法包括：向受試者施用上述單株抗體或其抗原結合片段，或向受試者施用包含上述的醫藥組成物，或上述的核酸分子，以治療與人IL-6R相關的疾病。
另一方面，本公開提供上述單株抗體或其抗原結合片段在製備治療與IL-6相關的疾病的治療劑中的用途；本公開還提供上述醫藥組成物在製備治療與IL-6相關的疾病的治療劑中的用途；本公開還提供上述核酸分子在製備治療與IL-6相關的疾病的治療劑中的用途。
此外，本公開包括用於治療與IL-6R陽性細胞相關的疾病的藥劑，該藥劑包含本公開的單株抗體或其抗體片段作為活性成分。
本公開的抗體、抗原結合片段和組合物可以用於預防 和治療與IL-6R、IL-6相關的和/或與IL-6/IL-6R複合體(視需要地在與gp130的進一步複合體中)相關的、和/或與其中涉及IL-6和/或IL-6/IL-6R複合體(視需要地在與gp130的進一步複合體中)的信號傳導途徑和/或生物學功能和反應相關的疾病和病症，並且特別用於預防和治療與IL-6R、IL-6相關的和/或與IL-6/IL-6R複合體(視需要地在與gp130的進一步複合體中)相關的、和/或與其中涉及IL-6R、IL-6和/或IL-6/IL-6R複合體(視需要地在與gp130的進一步複合體中)的信號傳導途徑和/或生物學功能和反應相關的疾病和病症，該疾病和病症的特徵在於由IL-6R或由其中涉及IL-6R的途徑介導的過量的和/或不需要的信號傳導。基於本公開公開的內容，該與IL-6R、IL-6相關的和/或與IL-6/IL-6R複合體相關的、和/或與其中涉及IL-6和/或IL-6/IL-6R複合體的信號傳導途徑和/或生物學功能和反應相關的疾病和病症的實例，對於熟練的技術人員將是清楚的。該疾病和病症在本文通常還稱為“IL-6相關的病症”或“IL-6R相關的疾病”。
另一方面，本公開提供上述單株抗體或其抗原結合片段、上述醫藥組成物、如上所述的核酸分子、或其組合；在製備用於預防或治療包括下述疾病和病症的藥物中的用途：膿毒症(Starnes等，1999)和各種形式的癌症，諸如多發性骨髓瘤病(MM)、腎細胞癌(RCC)、漿細胞白血病(Klein等，1991)、淋巴瘤、B-淋巴組織增生病症(BLPD)和***癌。由過量的IL-6生產或信號傳導引起的其它疾 病的非限制性實例包括骨吸收(骨質疏鬆症)(Roodman等，1992；Jilka等，1992)、惡病質(Strassman等，1992)、銀屑病、腎小球系膜增生性腎小球腎炎、卡波西肉瘤、艾滋病相關的淋巴瘤(Emilie等，1994)；炎性病和病症，諸如類風濕性關節炎、全身發作的青少年特發性關節炎、高丙球蛋白血症(Grau等，1990)；侷限性迴腸炎、潰瘍性大腸炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、多發性硬化病、Castleman’s病、IgM γ-球蛋白病、心臟黏液瘤、哮喘(特別是變應性哮喘)、炎性貧血、以及自體免疫性胰島素-依賴型糖尿病(Campbell等，1991)。
此外，本公開涉及用於免疫檢測或測定IL-6R的方法；用於免疫檢測或測定IL-6R的試劑、用於免疫檢測或測定表達IL-6R的細胞的方法；和用於診斷與IL-6相關的疾病的診斷劑，其包含本公開的特異性識別人IL-6R並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體或抗體片段作為活性成分。
在本公開中，用於檢測或測定IL-6R的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。
免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。
上述與IL-6相關的疾病可以藉由用本公開的單株抗體 或抗體片段檢測或測定表達的IL-6來診斷。
為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。
在本公開中，對用於檢測或測定IL-6R的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達IL-6R的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液(全血、血漿、血清)、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
根據所需的診斷方法，含有本公開的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與該標記對應的受質等。
第1A至1C圖為1764及其人源化抗體阻斷IL-6和IL-6R結合的實驗。
第2A至2B圖為1764及其人源化抗體阻斷gp130與IL-6/IL-6R結合的實驗。
第3圖為1764與U266B1細胞結合實驗。
第4圖為1764抗體抑制IL-6誘導的TF-1增殖檢測實驗。
一.術語
為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
常規的免疫球蛋白是四聚體，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，組合分子量約150kDa。在駱駝科(Camelidae)成員中，相當比例的血清抗體是同源二聚體IgG，分子量約80kD(Hamers-Casterman等人.1993Nature,363,446-448)。這些重鏈免疫球蛋白(Ig)包含三個結構域，其可變區被稱為VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)。重組VHH(約12至14kD)構成完整的抗原結合結構域並顯示出廣闊的抗原結合譜。擴大它們的高變區，並表現出獨特的特性，如三至四個(與一般抗體VL相互作用的)疏水框架殘基被更多親水性胺基酸取代。為了穩定擴大的CDR，除了一般的二硫鍵以外，在單峰駱駝CDR1和CDR3之間，在美洲駝的CDR2和CDR3之間，VHH可具有額外的二硫鍵(Harmsen和De Haard 2007Appl Microbiol Biotechnol.,77,13-22；Muyldermans 2001J Biotechnol.,74,277-302)。擴大的CDR3環可以採取凸面構象，而一般的互補位被限制在凹的或者平面結構(Muyldermans 2001J Biotechnol.,74,277-302)。這些特徵允許VHH識別對 於一般抗體而言免疫原性較差的獨特表位(Lafaye等人.2009 Mol Immuno.,46,695-704；Wernery 2001 J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.,48,561-568)。儘管VHH被定義為單價抗體，默認排除任何親合力效果，被測量表示為體外IC50的生物活性可類似於一般的二價抗體分子(Thys等人.2010Antiviral Res.,87：257-264)。
術語“單株抗體”是指由一群基本同源的抗體獲得的抗體，即包含在該群體中的各個抗體是相同的(除了可能以少量存在的可能的天然突變以外)。單株抗體針對單個抗原位點具有高度特異性。此外，與一般的多株抗體製劑(其通常包括針對抗原上不同決定簇(表位)的不同抗體)不同的是，每個單株抗體只針對抗原上的單個決定簇或表位。
在某些實施方式中，本公開可涉及嵌合的駱駝科動物/人抗體，特別是其中VH和/或VL結構域完全是駱駝科動物序列(例如大羊駝或阿爾帕卡羊駝)，而抗體的其餘部分完全是人序列的嵌合抗體。在本公開的一些較佳實施方式中，還包括“人源化”或“種系化”的駱駝科抗體以及駱駝科/人嵌合抗體，其中VH和/或VL結構域相對於藉由主動免疫獲得的駱駝科VH和/或VL結構域來說在框架區包含一個或多個胺基酸替換。用人種系VH或VL結構域中的對應殘基來取代起始駱駝科VH或VL結構域中的不匹配胺基酸殘基，這樣的“人源化”過程提高了與人種系VH或VL結構域的序列一致性百分比。
本公開包括天然、重組的VHH或VH。
“重組”涉及採用遺傳工程的方法(選殖、擴增)來生產該VHH或VH。
根據本公開的VHH能夠是單體的形式或者同源多聚體的形式，如同源二聚體或同源三聚體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恒定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)各由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公開所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR1-3)。
本公開的抗體包括羊駝源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳人源化抗體。
術語“羊駝源抗體”為根據本領域知識和技能製備的針對人IL-6R來源於羊駝的單株抗體。製備時，用IL-6R抗原注射實驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤，或者建立免疫文庫，藉由噬菌體展示技術分離具有所需功能的抗體。在本公開一個具體的實施 方式中，該羊駝源IL-6R抗體或其抗原結合片段，可進一步包含羊駝的重鏈Fc區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將羊駝源性抗體的可變區與人抗體的恒定區(或Fc區)融合而成的抗體，可以減輕羊駝源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌羊駝源性特異性單抗的融合瘤或抗體文庫，然後將羊駝抗體可變區基因與人恒定區基因(或Fc區基因)連接成嵌合基因後***表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本公開一個具體的實施方式中，該IL-6R嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恒定區(或Fc區)，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區(或Fc區)，或者包含胺基酸突變(如YTE突變或回復突變)的IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區(或Fc區)變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，是指將羊駝的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量羊駝蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)中獲得，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性 下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，採用基於1764序列漸進式向人源突變模式，逐漸替換1764的FR區羊駝來源殘基為人源殘基，以保持活性。
術語“VHH”涉及來自駱駝科(駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝等)重鏈抗體的可變抗原結合結構域(參見Nguyen等人.2000EMBO J.，19，921-930；Muyldermans 2001J Biotechnol.，74，277-302以及綜述Vanlandschoot等人.2011 Antiviral Res.92，389-407)。
通常奈米抗體可以定義為具有下述(通用)結構的胺基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分別是指構架區(Frame)1-4，並且其中CDR1-CDR3分別是指互補決定區1-3。
本文中使用的術語“抗體構架區”或“抗體框架區”，是指可變結構域VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。
術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，IL-6R)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來實現抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結 合片段的實例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VHH結構域組成；(vi)分離的互補決定區(CDR)；或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合；(viii)VHH與Fc形成的融合蛋白；(ix)VHH與抗體重鏈恒定區形成的融合蛋白。
此外，“抗原結合片段”還包括含有VHH中三個CDR的可結合IL-6R的其他抗原結合形式。
本公開還進一步延伸至這樣的抗原結合多肽，其中VHH結構域的高變環或CDR來自於駱駝科，但相對於駱駝科動物編碼的序列來說，其中至少一個該(駱駝科動物來源的)高變環或CDR被改造成包含一個或多個胺基酸替換、添加或缺失。這些變化包括高變環/CDR的“人源化”。以這種方式改造的駱駝科動物來源之HV/CDR仍可以表現出與由駱駝科動物編碼的HV/CDR之胺基酸序列“基本一致” 的胺基酸序列。在這種情況下，“基本一致”可允許與駱駝科動物編碼的HV/CDR含有不超過一個，或不超過兩個，或不超過三個胺基酸序列不匹配。
本公開的抗體可以是任何同種型。用於人類治療用途的抗體類型通常為IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型。通常是IgG型，在這種情況下，它們可以屬IgG1、IgG2a和IgG2b、IgG3或IgG4四個亞類中的任何一種。在這些亞類中，允許在Fc部分進行一個或多個胺基酸的替換、***或缺失，或進行其它結構修飾，從而例如提高或降低Fc依賴的功能。
本公開的雙抗體可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別人IL-6R並與胞外區(胺基酸序列或其三維結構)結合的單株抗體的VHH的編碼cDNA，構建編碼VHH的DNA，以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少，將該DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。
包含CDR的肽是藉由包含VHH的CDR中的一個或多個區域而構成的。包含多個CDR的肽可以被直接相連或經由適合的肽接頭相連。
本公開的包含CDR的肽可以藉由以下步驟來生產：構建本公開的特異性識別人IL-6R並與胞外區(胺基酸序列或其三維結構)結合的單株抗體的VHH的CDR的編碼DNA；將該DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中；然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達該 肽。也可以藉由化學合成方法例(如Fmoc方法或tBoc方法)來生產該包含CDR的肽。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，IL-6R分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris編(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10-7M，例如大約小於10-8M、10-9M或10-10M或更小的親和力(KD)結合。
術語"KD"或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本公開的抗體以小於大約10-7M，例如小於大約10-8M、10-9M或10-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合IL-6R，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。
當術語“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭，其藉由以下測定法來測定：待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫學功能片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原(例如IL-6R抗原或其片段)的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原 結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見，例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接標記的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常該測定法涉及，使用能與帶有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白結合的純化抗原(該抗原在固態表面或細胞表面)。在待測抗原結合蛋白存在下，測量結合於固態表面或細胞的標記的量，來測量競爭性抑制。通常，待測抗原結合蛋白是過量存在的。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑒定的抗原結合蛋白包括：與參考抗原結合蛋白相同的表位發生結合的抗原結合蛋白；以及，與充分接近參考抗原結合蛋白結合的表位所鄰近的表位發生結合的抗原結合蛋白，該兩個表位在空間上互相妨礙結合的發生。在本文實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制(例如降低)至少40-45%、45-50 %、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下，結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。
本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
術語“載體”是指能夠運輸與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方式中，載體是“質體”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方式中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人IL-6R或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結 合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括微生物(例如細菌)、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括但不限於CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)HEK細胞(非限制性實施例HEK293E細胞)和NS0細胞等。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人IL-6R特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一 般技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍(如-70℃)或者凍乾。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種抗體或其片段的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據 多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方式(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecar Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副 作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性(homology)”是指兩個多核苷酸序列之間之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，術語“轉化體”和“轉化細胞”包括親代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移或繼代的數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中 微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質體序列等。一般參見Mlis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1至3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述的化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
二.實施例與測試例
以下結合實施例用於進一步描述本公開，但這些實施例並非限制本公開的範圍。
本公開實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。
實施例
實施例1：抗原、相關蛋白及抗體等試劑製備
編碼分別帶Fc、His、BP15(用於細胞內定點生物素化)標簽的人源白細胞介素6受體(hIL-6R.Fc、hIL-6R.His、hIL-6R.BP15)，帶有Flag.His標簽的食蟹猴IL-6R(cIL-6R.FH)以及帶有Fc或His標簽的人源IL-6(IL-6.Fc，IL-6.his)，帶有Fc標簽的gp130序列經分子選殖構建入哺乳動物細胞瞬轉表達載體中。
所有抗原和相關蛋白胺基酸序列如下：
hIL-6R.His(SEQ ID NO：1)
hIL-6R.BP15(SEQ ID NO：2)
hIL-6R.Fc(SEQ ID NO：3)
cIL-6R.FH(cIL-6R.FlagHis SEQ ID NO：4)
IL-6.Fc(SEQ ID NO：5)
IL-6.his(SEQ ID NO：6)
gp130.Fc(SEQ ID NO：7)
陽性抗體部分為：Roche/Chugai的抗IL-6R人源化單抗tocilizumab(序列來源於WO1996011020A1)；Ablynx的抗IL-6R單域抗體20A11與Fc融合蛋白；Regeneron的Salilumab(序列來源於CN101454345B)。胺基酸序列如下：Tocilizumab(Toci)
Tocilizumab重鏈：(SEQ ID NO：8)
Tocilizumab輕鏈：(SEQ ID NO：9)
20A11-Fc融合蛋白(20A11，其中VHH序列來源於vobarilizumab)(SEQ ID NO：10)
Sarilumab(Sari)
重鏈(SEQ ID NO：11)
輕鏈(SEQ ID NO：12)
採用PEI瞬轉HEK293E細胞(即293E細胞)進行蛋白表達後，根據不同標簽或融合蛋白選擇不同純化方式如下：
1.鎳管柱純化(分離含His標簽的蛋白)：將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質。用含有PBS緩衝液平衡鎳柱，沖洗2-5倍管柱體積；將上清樣品以一定流速上Ni Sepharose excel管柱(GE Healthcare,Cat# 17-3712-01)。用PBS緩衝液沖洗管柱，至A280讀數降至基線，再後用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液；最後用含有300mM咪唑 的PBS溶液沖提目的蛋白，並收集沖提峰。
2.色譜排阻純化：SEC管柱(superdex75)預先用PBS平衡，樣品上樣後(上樣體積不能大於3%柱體積)用PBS作為流動相沖提，收集各沖提峰，經過SDS-PAGE鑒定目的蛋白所在組分。
3.Flag親和層析(分離含Flag的蛋白)：利用0.5×PBS平衡flag親和填料，沖洗2-5倍管柱體積。待純化樣品與填料室溫共孵育2小時。用5個管柱體積的0.5×PBS沖洗填料，再用含有100μg/ml 3×Flag多肽的TBS緩衝液沖提目的蛋白，並收集，經過SDS-PAGE鑒定目的蛋白。
4.嵌合抗體的親和層析(分離含Fc的蛋白)：將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，重組抗體表達上清用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.0沖提目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0中和。沖提樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，去聚體的峰收集好後分裝備用。
實施例2：羊駝免疫、噬菌體展示文庫構建及篩選
採用IL-6R.Fc或IL-6R.His作為免疫原，與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑或PBS混勻後注射羊駝，前後免疫6次。在免疫前，以及第4、5、6次免疫之後取外周血用於效價測定，最終提取脾臟細胞。
分離的淋巴細胞經過抽提RNA，反轉錄成cDNA。建庫 採用兩次PCR：第一次PCR中，將3條正向引子設在FR1區，3條反向引子設在CH2區，正向和反向引子分別等比混合進行PCR，瓊脂糖凝膠回收小片段；第二次PCR中，正反向引子都加入sfiI酶切位點及保護鹼基，正向引子除sfiI酶切位點及保護鹼基外其餘序列與第一次PCR正向引子相同，反向引子設在FR4區。第二次PCR產物經過膠回收，酶切，連接到噬菌粒載體中，電轉化SS320感受態。最後得到一個庫容為1.74E9的噬菌體展示文庫。
文庫建成後，經過輔助噬菌體的包裝，形成噬菌體；進一步進行淘篩及ELISA鑒定，得到需要的純株。經液相和固相兩種方式淘篩：液相方式採用生物素化的IL-6R.BP15抗原在液相中與噬菌體顆粒結合後用鏈黴親和素磁珠捕獲；固相方式採用ELISA板包被IL-6R.Fc，結合噬菌體顆粒的方式進行。經過兩輪淘洗之後，挑取單株包裝噬菌體，進行ELISA檢測結合活性及IL-6和gp130阻斷活性。ELISA過程如下：
IL-6R結合ELISA：包被鏈黴親和素2ng/μl，100μl/孔，4℃過夜；2% MPBSCaMg封閉。37℃ 1小時。清洗平板後，孵育1ng/μl IL-6R.BP15。37℃ 1小時。清洗平板後，加入50μl 2% MPBSCaMg和50μl噬菌體上清。37℃孵育1小時。清洗平板後，加入1：5000稀釋的抗-M13 HRP 100μl。37℃孵育1小時。清洗平板後，加入100μl TMB顯色。加入100μl 1M H2SO4終止反應。測量OD450。
IL-6阻斷ELISA：包被IL-6.Fc 2ng/μl，100μl/孔，4 ℃過夜。2% MPBSCaMg(2% milk,0.90mM CaCl2,0.49mM MgCl2，1×PBS)封閉平板，37℃孵育1小時。洗平板，加入100μl 1ng/μl IL-6R.his，37℃孵育1小時。洗平板，加入50μl噬菌體上清+50μl 2% MPBSCaMg封閉液。37℃孵育1小時。洗平板，加入100μl 1：5000稀釋的抗-M13 HRP(GE healthcare,Cat# 27-9421-01)，37℃孵育1小時。洗平板，加入100μl TMB顯色。加入100μl 1M H2SO4終止反應。測量OD450。
gp130阻斷ELISA：包被gp130 2ng/μl，100μl/孔，4℃過夜。2% MPBSCaMg封閉平板，37℃孵育1小時。洗平板，加入100μl 1ng/μl IL-6R.his+1ng/μl IL-6.His，37℃孵育1小時。洗平板，加入50μl噬菌體上清和50μl 2% MPBSCaMg封閉液。37℃孵育1小時。洗平板，加入100μl 1：5000稀釋的抗-M13 HRP，37℃孵育1小時。洗平板，加入100μl TMB顯色。加入100μl 1M H2SO4終止反應。測量OD450。
對於每個純株，在IL-6R結合結果為陽性情況下，OD450(IL-6R結合ELISA)/OD450(IL-6阻斷ELISA)(IL-6R/IL-6)值大於等於4的純株，以及OD450(IL-6阻斷ELISA)/OD450(IL-6阻斷ELISA)(IL-6/gp130)值大於等於3的純株，進行測序。
序列經過分析，去除冗餘序列得到一系列純株。
實施例3：Fc融合蛋白構建及活性鑒定
為了進一步藉由分子水平，細胞水平鑒定所挑選純株，我們將所挑選的純株與Fc融合構建到哺乳動物瞬轉表達載體上，進行293E細胞瞬轉表達。經過親和純化，得到VHH-hFc融合蛋白。純化後的融合蛋白進行如下一系列的測試。
IL-6R阻斷實驗(測試例1)，阻斷gp130結合實驗(測試例2)，U266B1細胞結合活性(測試例3)，阻斷IL-6刺激的TF-1增殖樣品測試(測試例4)。最終篩選出各方面屬性最優的IL-6R單域抗體1764，其核苷酸序列如下： (SEQ ID NO：13)； 所編碼胺基酸序列如下： (SEQ ID NO：14)；其中，下底線表示該單域抗體1764的CDR1-3，序列分別為：CDR1：INVMG(SEQ ID NO：15)； CDR2：AIISGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：16)；CDR3：ILTYNDYDLGSDY(SEQ ID NO：17)；上述單域抗體VHH與下述Fc片段融合形成融合蛋白：編碼人Fc片段的核苷酸序列： (SEQ ID NO：18)；人Fc片段： (SEQ ID NO：19)。
實施例4：1764人源化
為了避免治療用抗體存在的抗藥反應，本公開將羊駝源分子1764進行人源化改造，以降低其免疫源性。人源化採用基於1764序列漸進式向人源突變模式，逐漸替換1764FR區羊駝源胺基酸殘基為人源胺基酸殘基。設計序列如下。
註：如A14P表示1764第14位胺基酸殘基A突變為P， 此表格中胺基酸殘基的位置編號為其在SEQ ID NO：14所示序列中的自然位置順序編號。
>1764-mu1(SEQ ID NO：20)
>1764-mu2(SEQ ID NO：21)
>1764-mu3(SEQ ID NO：22)
>1764-mu4(SEQ ID NO：23)
>1764-mu5(SEQ ID NO：24)
>1764-mu6(SEQ ID NO：25)
>1764-mu7(SEQ ID NO：26)
>1764-mu8(SEQ ID NO：27)
>1764-mu9(SEQ ID NO：28)
設計的9個純株與Fc(胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示)融合，構建到哺乳動物瞬轉表達載體上，進行293E細胞瞬轉表達。經過親和純化，得到VHH-hFc融合蛋白。
純化後的IL-6R抗體融合蛋白(含Fc片段，以下也稱IL-6R抗體)進行如下一系列的測試。
測試例1：IL-6R抗體的IL-6R阻斷實驗
阻斷IL-6與IL-6R的結合，能夠阻止IL-6R/IL-6複合物的形成，從而阻斷複合物與細胞膜上gp130的結合，最終阻斷下游信號的傳導。在體外採用ELISA的方式，測試 所有表達純化後的抗體是否具有阻斷IL-6結合IL-6R的能力。檢測過程如下：包被100μl IL-6.Fc 2ng/μl，4℃過夜。2%脫脂乳封閉，37℃ 1小時。洗平板，加入100μl梯度稀釋的待測樣品與IL-6R.BP15 1ng/μl。37℃孵育1小時。洗平板，加入1：4000稀釋的HRP-鏈黴親和素(Jackson,016-030-084)。洗平板後，加入100μl TMB室溫顯色5min，加入100μl 1M H2SO4終止。讀取OD450值。結果如第1A至1C圖所示。
測試例2：IL-6R抗體的gp130結合阻斷檢測
配體IL-6與受體IL-6R結合後的複合體可以與GP130結合，待測抗體藉由與IL-6R的結合阻斷形成IL-6/IL-6R/gp130複合體，檢測IL-6R.BP15上的生物素標簽，可以判斷抗體是否對形成三聚體有阻斷作用。
濃度為1μg/ml(PBS稀釋)的gp130 4℃包板過夜，倒掉包被液，用5%脫脂乳的PBS溶液，37℃封閉2-3h。封閉完成後，用洗滌緩衝液PBST(0.1%吐溫-20的PBS溶液)洗板3遍。
IL-6.his和IL-6R.BP15的濃度為0.06μg/ml，1% BSA的PBS溶液進行稀釋，IL-6R抗體上限濃度為50μg/ml用稀釋液按1：3稀釋。稀釋液為1% BSA的PBS溶液，用稀釋液按1：3稀釋。37℃孵育1h.。孵育完成後，用洗滌緩衝液PBST(0.1%的吐溫-20的PBS溶液)洗板3遍。
二抗HRP鏈黴親和素(Jackson,016-030-084)稀釋比 例為1：2000，37℃孵育1h，用洗滌緩衝液PBST(0.1%的吐溫-20的PBS溶液)洗板4遍，TMB顯色，讀取OD450值。結果如第2A和2B圖所示。
測試例3：IL-6R抗體的U266B1細胞結合活性
為檢測IL-6R抗體與表達IL-6R的細胞的結合能力，利用IL-6R抗體對表達IL-6R的U266B1細胞進行結合活性檢測。收集U266B1(ATCC® TIB-196TM)細胞，400g，4℃離心5min；加入含有終濃度10%FBS的預冷的DPBS，400g，4℃離心5min，重複兩次；將細胞分配至96孔板，10E5/孔；每孔加入50μl樣品，孵育45-60分鐘，4℃；每孔加入含有終濃度10%FBS的預冷的DPBS 250μl，400g,4℃離心5min；重複兩次；加入50μl 1：200稀釋的二抗Alexa Fluor@488羊抗人IgG(H+L)(Lifetechologies,A11013)，4℃避光孵育45分鐘；每孔加入含有終濃度10%FBS的預冷的DPBS 250μl，400g,4℃離心5min；重複兩次；每孔加入100μl預冷的DPBS重新懸浮細胞；上機檢測(BD，FACSverse)；採用flowjo分析檢測結果，結果如第3圖所示。
測試例4：IL-6R抗體阻斷IL-6刺激的TF-1增殖樣品測試
IL-6藉由與膜型IL-6R結合後可以啟動下游信號，誘導TF-1細胞增殖，IL-6R抗體可以阻斷IL-6與IL-6R的結 合，從而抑制TF-1細胞的增殖。
TF-1細胞培養：TF-1白血病細胞(ATCC，CRL-2003)細胞培養於10%FBS的RPMI1640(2ng/mL rhGM-CSF)(GE,Catalog No.SH30809.01)，放置於37℃，5% CO2培養箱中，細胞密度不超過1E6個/ml。
IL-6刺激的TF-1增殖抑制實驗步驟：取對數生長期的細胞用PBS洗三遍800rpm離心3min，用RPMI1640(FBS 2%，重組人IL-6 5ng/ml)調整細胞密度20000個/孔/180μl，並加入20μl梯度稀釋的待測抗體到96孔培養3天後(梯度稀釋起始抗體濃度為490nM，10倍梯度稀釋至4.9×10-7nM)，取100μl細胞懸液與100μl細胞滴度(Promega,Catalog No.G7573)混勻後進行檢測。結果如表2所示。
測試例5：IL-6R抗體抑制IL-6誘導的鐵調素表達
鐵調素的高表達是炎症性貧血的主要發病原因，而IL-6藉由與IL-6R結合後激活下游信號通路會上調鐵調素的表達水平，因此IL-6R抗體阻斷IL-6與IL-6R結合，可以抑制IL-6誘導鐵調素表達。實驗設計如下：第一組：空白對照：第二組：陽性對照，加入IL-6； 第三組：加入1764-mu3和IL-6；第四組：加入Tocilizumab和IL-6；Hep3B細胞(中科院，TCHu106)培養在含10% FBS的EME培養基中(Gibco，11095098)，在37℃，5% CO2培養箱中培養，每2~3天繼代培養。取對數期生長的Hep3B細胞鋪在6孔板中，每孔二十萬個細胞，在37℃，5% CO2培養箱中培養。第二天待細胞鋪板率達到80%~90%時，第3組、4組每孔分別加入終濃度為5nM的IL-6R抗體1764-mu3和Tocilizumab。在37℃，5% CO2培養箱中孵育30min後，除空白對照外，每孔分別加入終濃度為10ng/mlIL-6蛋白。細胞繼續培養24h後，收集細胞，提取總RNA，反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行螢光定量PCR檢測鐵調素的mRNA水平，以微球蛋白mRNA表達水平作為內參，結果如表3和圖4所示。
測試例6：抗體BIAcore親合力(KD)測定
按照人抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-39，GE)說明書中的方法將人抗捕獲抗體共價偶聯於Biacore儀器(Biacore T200，GE)的生物傳感芯片CM5(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲一定量的待測抗體，然後於芯片表面流 經一系列濃度梯度下的抗原(hIL-6R.his和cIL-6R.FH)，利用Biacore儀器(Biacore T200，GE)實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。
在每個循環解離完成後，用人抗捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物芯片洗淨再生。實驗中用到的胺基偶聯試劑盒購自GE公司(Cat.# BR-1000-50，GE)，緩衝液為HBS-EP+10×緩衝溶液(Cat.# BR-1006-69，GE)用D.I.水稀釋至1×(pH 7.4)。
實驗得到的數據用BIAevaluation 4.1版，GE軟件以(1：1)Langmuir模型進行擬合，得出親和力數值，結果如表4所示。
測試例7.大鼠藥物代謝動力學實驗
利用大鼠進行抗體融合蛋白的藥物代謝動力學實驗測試。大鼠給藥方案：
SD大鼠12隻(西普爾-必凱實驗動物有限公司)，雌雄各半，每組6隻，平均分成2組；靜脈注射給藥，給藥組於給藥前及給藥後15min、8h、1天、2天、4天、7天、10天、14天、21天和28天採集全血0.2ml，不加抗凝劑。取血後在4℃放置30min，1000g離心15min，取上清(血清)置於EP管中，於-80℃保存。目標物濃度採用ELISA方法測定，採用Winnolin軟體計算受試藥物的藥物動力學參數。檢測結果如表6所示。
1764-mu3和1764-mu4為單鏈抗體，半衰期分別為7.7天和6.2天。
測試例8. 加速穩定性測試
為觀察抗體的穩定性，對部分抗體進行加速實驗。1mg/ml抗體融合蛋白，在40℃放置3天後，觀察是否沉澱，並進行SEC檢測。檢測結果如表7所示。
雖然為了清楚的理解，已經借助於圖式和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本公開 的範圍。所有圖式中的數值單位與橫坐標上標明的單位相同。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉由引用完整地清楚結合。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司
<120> IL-6R抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
<130> 2017
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-6R.His
<400> 1
<210> 2
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-6R.BP15
<400> 2
<210> 3
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-6R.Fc
<400> 3
<210> 4
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cIL-6R.FH
<400> 4
<210> 5
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6.Fc
<400> 5
<210> 6
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6.his
<400> 6
<210> 7
<211> 829
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gp130.Fc
<400> 7
<400> 8
<210> 8
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 托珠單抗重鏈
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 托珠單抗(Toci)輕鏈
<400> 9
<210> 10
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20A11-Fc融合蛋白(20A11)
<400> 10
<210> 11
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sarilumab(Sari)重鏈
<400> 11
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sarilumab(Sari)輕鏈
<400> 12
<210> 13
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764 VHH編碼核酸
<400> 13
<210> 14
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764 VHH
<400> 14
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764 CDR1
<400> 15
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764 CDR2
<400> 16
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764 CDR3
<400> 17
<210> 18
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Fc片段
<400> 18
<210> 19
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Fc片段
<400> 19
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764-mu1
<400> 20
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764-mu2
<400> 21
<210> 22
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764-mu3
<400> 22
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764-mu4
<400> 23
<210> 24
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764-mu5
<400> 24
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764-mu6
<400> 25
<210> 26
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764-mu7
<400> 26
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764-mu8
<400> 27
<210> 28
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1764-mu9
<400> 28

Claims (25)

  1. 一種單株抗體或其抗原結合片段，該單株抗體或其抗原結合片段包含：CDR1、CDR2和CDR3，其中，該CDR1的序列選自SEQ ID NO：15所示序列或與SEQ ID NO：15相比存在3、2或1個胺基酸差異的變體序列；該CDR2的序列選自SEQ ID NO：16所示序列或與SEQ ID NO：16相比存在3、2或1個胺基酸差異的變體序列；該CDR3的序列選自SEQ ID NO：17所示序列或與SEQ ID NO：17相比存在1、2或3個胺基酸差異的變體序列；該單株抗體或其抗原結合片段結合人IL-6R。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該CDR1序列如SEQ ID NO：15所示；該CDR2序列如SEQ ID NO：16所示；和該CDR3序列如SEQ ID NO：17所示。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該單株抗體是重組抗體。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該單株抗體選自羊駝源抗體、嵌合抗體和人源化抗體。
  5. 申請專利範圍第3項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該單株抗體含有SEQ ID NO：14所示的VHH。
  6. 如申請專利範圍第4項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體含有SEQ ID NO：14所示的VHH變體。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中：該VHH變體是在SEQ ID NO：14所示的VHH的FR區上具有1至15個胺基酸的人源化突變。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該突變是在SEQ ID NO：14所示的VHH上選自A14P，E23A，Q44G，V78L，K86R，N96A，A97F，Q116L或其組合的胺基酸突變。
  9. 如申請專利範圍第7項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該變體的胺基酸序列如SEQ ID NO：20-28所示。
  10. 如申請專利範圍第1至9項任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體進一步包含人抗體Fc區。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體包含SEQ ID NO：19所示的人抗體Fc區。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該抗原結合片段是單域抗體或包含三個該CDR的肽。
  13. 一種經分離的單株抗體或其抗原結合片段，其與申請專利範圍第1至12項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段競爭結合IL-6R，並阻斷IL-6與IL-6R的結合。
  14. 一種醫藥組成物，其含有：治療有效量的如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
  15. 一種核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至13項中任一項的單株抗體或其抗原結合片段。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的核酸分子，其包含：與SEQ ID NO：13所示的核酸分子具有至少80%同源性的多核苷酸。
  17. 一種重組載體，其包含申請專利範圍第15或16項所述的核酸分子。
  18. 一種宿主細胞，其轉化有申請專利範圍第17項所述的重組載體，該宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞是真核細胞。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞是哺乳動物細胞或酵母細胞。
  21. 一種用於生產申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括步 驟：．培養申請專利範圍第18項所述的宿主細胞；．在培養物中形成並積累申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段；以及．從該培養物中回收該單株抗體或其抗原結合片段。
  22. 一種用於檢測或測定人IL-6R的方法，該方法包括步驟：用申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段接觸樣本。
  23. 一種用於檢測或測定人IL-6R的試劑，其包含：申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段。
  24. 一種申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，或申請專利範圍第14項所述的醫藥組成物，或申請專利範圍第15或16項所述的核酸分子的用途，其用在製備治療或預防與人IL-6相關的疾病的藥物。
  25. 一種申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第14項所述的醫藥組成物、申請專利範圍第15或16項所述的核酸分子、或其組合的用途，其用在製備用於預防或治療選自下列一種或多種疾病的藥物：膿毒症、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、漿細胞白血病、淋巴瘤、B-淋巴組織增生、***癌、骨質疏鬆症、惡病質、銀屑病、腎小球系膜增生 性腎小球腎炎、卡波西肉瘤、艾滋病相關的淋巴瘤、類風濕性關節炎、全身發作的青少年特發性關節炎、高丙球蛋白血症、侷限性迴腸炎、潰瘍性大腸炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化病、Castleman病、IgM γ-球蛋白病、心臟黏液瘤、哮喘、自體免疫性胰島素-依賴型糖尿病、炎性貧血。
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