TW201904998A - 不對稱異二聚fc-scfv融合抗globo h及抗cd3雙特異性抗體及其於癌症治療上之用途 - Google Patents

不對稱異二聚fc-scfv融合抗globo h及抗cd3雙特異性抗體及其於癌症治療上之用途

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Abstract

本發明提供一種雙特異性抗Globo H抗體，其包括特異性地結合至Globo H之抗Globo H抗體；及一種T細胞靶向域，其融合至該抗Globo H抗體之重鏈之CH3域，其中該T細胞靶向域特異性地結合至T細胞上之抗原；且其中該抗Globo H抗體包含在效應子結合位點處之突變，使得該雙特異性抗Globo H抗體具有削減的效應子功能。該T細胞靶向域為來自抗CD3抗體之ScFv或Fab。

Description

不對稱異二聚FC-SCFV融合抗GLOBO　H及抗CD3雙特異性抗體及其於癌症治療上之用途
本發明係關於抗體工程改造，特定言之關於用於癌症治療之不對稱異二聚雙特異性抗體。
Globo H為一種在各種上皮癌細胞之表面上過度表現之六醣(Fuc-α1→2Gal-β1→3Gal-NAc-β1→3Gal-α1→4Gal-β1→4Glcβ1-)，該等上皮癌細胞包括乳癌細胞、結腸癌細胞、卵巢癌細胞、胰臟癌細胞、肺癌細胞及***癌細胞。因此，Globo H為有前景的診斷/治療目標。
雖然抗Globo H之抗體為有用的，但是仍然需要抗Globo H抗體之經改良治療劑。
本發明係關於含有T細胞靶向(例如，抗CD3)域之雙特異性抗Globo H抗體及其於癌症治療中之用途。本發明之一個態樣係關於雙特異性抗Globo H抗體。根據本發明之一個實施例的雙特異性抗Globo H抗體包括：抗Globo H抗體，其特異性地結合至Globo H；及T細胞靶向域，其融合至該抗Globo H抗體之重鏈之CH3域，其中該T細胞靶向域特異性地結合至T細胞上之抗原；且其中該抗Globo H抗體包含在效應子結合位點處之突變，使得該雙特異性抗Globo H抗體具有削減的效應子功能。
根據本發明之一些實施例，雙特異性抗Globo H抗體可具有T細胞靶向域，該T細胞靶向域可為ScFv或Fab，其可源於抗CD3抗體。
根據本發明之一些實施例，該在效應子結合位點處之突變可包括L234A及L235A突變或L235A及G237A突變。
雙特異性抗Globo H抗體亦可包括具有杵臼結構的不對稱異二聚重鏈，其由CH3域中之突變產生。此等突變可包括用於杵臂之S354C及T366W，及用於臼臂之Y349C、T366S、L368A及Y407V。
本發明之其他態樣將因為以下描述變得顯而易見。
本發明之實施例係關於抗Globo H之雙特異性不對稱抗體及此等抗體在治療癌症中之用途。不對稱抗體含有不相同之兩個重鏈。重鏈中的一者當作杵臂，而另一個重鏈當作可容納杵的臼臂。杵及臼結構可在重鏈之第三不變區CH3中經工程改造(例如，藉由定點突變誘發)。杵及臼之互補性有助於不對稱抗體形成。(A.M. Merchant等人，「An efficient route to human bispecific IgG 」, Nat. Biotechnol., 1998, 16:677-81; doi: 10.1038/nbt0798-677)。
本發明之不對稱異二聚雙特異性抗體含有特異性地結合至Globo H之變異域。另外，此等抗體各自含有靶向T細胞上之抗原的抗體(例如，抗CD3)之ScFv或Fab片段。因此，本發明之抗體為雙特異性抗體，亦即一個域特異性地結合Glob H而另一個域特異性地結合T細胞抗原(例如，CD3)。藉由具有特異性地靶向T細胞之結合域(例如，ScFv或Fab片段)，此等抗體具有T細胞募集能力，以促進T細胞介導之細胞毒性。由於此等抗體特異性地結合至Globo H，吾人可確保T細胞介導之細胞毒性係針對表現Globo H抗原之細胞，諸如上皮來源之癌症。
此外，為確保T細胞細胞毒性特異性地針對表現Globo H之細胞，此等抗體中之效應子功能也許需要被壓制或降低。儘管抗體效應子功能(諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC))在免疫療法中為期望的，但此等效應子功能對於本發明之雙特異性抗體為非所期望的。
根據本發明之實施例，本發明之雙特異性抗體含有針對T細胞之結合域(圖1中之ScFv optF1)，而抗體變異域特異性地結合至表現Globo H之細胞(例如，癌細胞)。同一分子上之兩個特異性結合域確保將T細胞被帶到表現Globo H之靶細胞。若本發明之雙特異性抗體上之Fc部分之效應子功能完好，則不僅NK細胞(經由NK細胞上之FcR)可結合至抗體之Fc部分之效應子功能位點(位於鉸鏈及CH2域中)，同時T細胞上之CD3也會結合至抗體之抗CD3域(例如，ScFv或Fab)。當此發生時，NK細胞可能介導針對T細胞之細胞毒性。這將適得其反。另外，由Fc部分之效應子功能所導致的ADCC或CDC細胞毒性與本發明之雙特異性抗體所導致的細胞毒性相比是較不具專一性的。
先前技術中已揭示用於降低效應子功能的若干方法，包括聚糖修飾、使用不與效應子細胞上之受體良好相互作用的IgG2或IgG4子型，或在雙特異性抗體之效應子相互作用位點(亦即，下鉸鏈或CH2域)中之突變。
根據本發明之實施例，抗體可經修飾以透過在效應子結合位點處之定點突變誘發來降低或削減ADCC及CDC效應子功能。在一個實例中，杵臂和/或臼臂之CH2域中之位置234及235處之胺基酸殘基自白胺酸變為丙胺酸。在另一實例中，杵臂和/或臼臂之CH2域中之位置235及237處之胺基酸殘基自白胺酸及甘胺酸變為丙胺酸。
藉由突變的效應子結合位點，此等抗體將不大可能募集效應子細胞(例如，NK細胞)，且因此這樣一個雙特異性抗體就其自身而言將不(或幾乎不可能)觸發ADCC或CDC反應。替代地，T細胞接合及活化仰賴於本發明抗體與靶細胞之表面上所表現之抗原的結合，由此增加靶向療法之功效且減少非所需副作用。
根據本發明之實施例，不對稱異二聚Fc-ScFv融合抗Globo H x 抗CD3雙特異性抗體(亦即，其Fc域連接至抗CD3 scFv或Fab或F(ab')2之抗Globo H抗體)可透過抗Globo H抗體重鏈之分子工程改造而產生。為產生不對稱二聚體，重鏈之CH3域可經突變以產生杵結構或臼結構。杵及臼結構之互補性將有助於異二聚抗體形成。用於產生此等杵及臼結構之方法為此項技術中已知的。
根據本發明之實施例，為增強Fc異二聚化，位置354及366處之杵臂CH3域之胺基酸殘基可分別自絲胺酸及蘇胺酸變為半胱胺酸及色胺酸，且位置349、366、368及407處之臼臂CH3域之胺基酸殘基可分別自酪胺酸、蘇胺酸、白胺酸及酪胺酸變為半胱胺酸、絲胺酸、丙胺酸及纈胺酸。(A.M. Merchant等人., 「An efficient route to human bispecific IgG 」, Nat. Biotechnol., 1998, 16:677-81; doi: 10.1038/nbt0798-677)。儘管此實例說明異二聚抗體之杵-臼方法，亦可在不背離本發明之範疇下使用此項技術中已知之其他方法。(參見例如A. Tustian等人，「Development of purification processes for fully human bispecific antibodies based upon modification of protein A binding avidity 」, MAbs, 2016年5月-6月; 8(4): 828-838; doi: 10.1080/19420862.2016. 1160192。)
另外，T細胞靶向域(例如，ScFv或Fab片段)可融合至C端處之重鏈之杵臂或臼臂。此等融合蛋白質可使用此項技術中已知之分子選殖技術(諸如PCR)而容易地產生。T細胞靶向域可源於特異性地結合至T細胞之抗原(或表面標記物)(如CD3)之抗體。根據本發明之實施例，T細胞靶向域可為源於抗CD3抗體之ScFv或Fab片段。
此外，在杵臂及臼臂CH2域處負責效應子結合的胺基酸殘基可經改變以消除或減少效應子結合，由此最小化或預防ADCC或CDC。舉例而言，位置234及235處之殘基可自白胺酸變為丙胺酸，或位置235及237處之胺基酸殘基可自白胺酸及甘胺酸變為丙胺酸，以削減ADCC、CDC及非特異性效應子細胞功能。
藉由CH2及CH3域工程改造之組合，本發明之抗Globo H x 抗CD3雙特異性抗體(BsAb)可有效地接合及活化T細胞以誘導免疫細胞以表現Globo H之靶細胞依賴性方式產生細胞介素，以及穿孔蛋白及顆粒酶。因此，藉由不對稱異二聚抗Globo H x 抗CD3 BsAb將T細胞接合至目標腫瘤的治療性安全區間將顯著地增加。
圖1展示說明與習知杵-臼異二聚抗體相比，本發明之異二聚雙特異性抗體的示意圖。如圖1中所展示，根據本發明之實施例，為增強Fc異二聚化，位置354及366處之杵臂CH3域之胺基酸殘基可分別自絲胺酸及蘇胺酸變為半胱胺酸及色胺酸，且位置349、366、368及407處之臼臂CH3域之胺基酸殘基分別自酪胺酸、蘇胺酸、白胺酸及酪胺酸變為半胱胺酸、絲胺酸、丙胺酸及纈胺酸。
本發明之實施例為雙特異性抗體，其包括含有兩個不同抗原結合域之不對稱抗體(異二聚抗體)，該兩個不同抗原結合域中之一者特異性地靶向T細胞，諸如展示於圖1中之ScFv optF1 (源於抗CD3抗體)。
本發明之實施例可為呈不對稱異二聚Fc-ScFv (AHFS)或不對稱異二聚Fc-Fab (AHFF)融合抗體形式之形式的雙特異性抗體。根據本發明之實施例，ScFv或Fab片段可與抗體之杵臂和/或臼臂融合。在圖1中，KT指示T細胞靶向域被繫栓至杵臂，而HT指示T細胞靶向域被繫栓至臼臂。根據本發明之一些實施例，雙特異性抗體可在杵臂及臼臂二者上具有T細胞靶向域(亦即KT+HT)。
本發明之抗體可藉由各種表現構築體(載體)獲得。可將表現載體轉染至用於抗體表現之任何適合細胞中，諸如CHO細胞、293細胞等。用於表現及純化抗體的方法為此項技術中已知的。
本發明之實施例將藉由以下特定實例來說明。熟習此項技術者應瞭解，此等實例僅用於說明且其他修改及變化在不脫離本發明之範疇的情況下係可能的。各種分子生物學技術、載體、表現系統、蛋白質純化、抗體-抗原結合分析等在此項技術中已熟知且將不詳細重複。實例 抗 Globo H 單株抗體之製備
本發明之雙特異性抗體可自抗Globo H之單株抗體開始產生。根據本發明之實施例，產生單株抗體之通用方法包括獲得產生抗Globo H之單株抗體的融合瘤。
產生單株抗體之方法為此項技術中已知的且在此將不再贅述。簡言之，藉由適當的佐劑，用抗原(Globo H)免疫小鼠。接著，收集經免疫小鼠之脾細胞且與骨髓瘤細胞融合。可使用任何已知方法(諸如ELISA)來鑑別陽性純系結合Globo H之能力。
根據本發明之實施例，抗體之序列經測定且用作產生杵結構及臼結構之突變以及降低或壓制效應子功能之突變的依據。簡言之，例如使用TRIzol®試劑來分離融合瘤之總RNA。接著，例如使用第一股cDNA合成套組(Superscript III)及寡聚(dT)20 引子或Ig-3'恆定區引子，由總RNA合成cDNA。接著自cDNA選殖免疫球蛋白基因之重鏈及輕鏈序列。選殖可使用PCR，使用合適引子，例如Ig-5'引子集(Novagen)。PCR產物可使用CloneJetTM PCR選殖套組(Ferments)直接地被選殖至適合載體(例如，pJET1.2載體)中。pJET1.2載體含有致死性***基因，且僅在所需基因被植入此致死性區域中時，在選擇條件下方可存活。這有助於重組群落之選擇。最後，針對所需純系篩選重組群落，分離且定序彼等純系之DNA。可在國際免疫遺傳學資訊系統(international ImMunoGeneTics information system) (IGMT)網站上分析免疫球蛋白(IG)核苷酸序列。對CDR序列之分析可基於Kabat方法或類似方法。
一旦獲得單株抗體(mAb)，小鼠mAb可被人源化或被製成完全人類抗體。用於產生人類化抗體及人類抗體之程序為此項技術中已知的。另外，抗體可藉由定點突變誘發進一步被最佳化。舉例而言，可執行丙胺酸掃描以在CDR中鑑別對於抗體-抗原結合而言為關鍵或非關鍵的胺基酸殘基。結合之進一步最佳化可藉由篩選CDR序列和/或構架區中之突變體來執行。藉由執行此等實驗，吾等鑑別出可以高結合性特異性地結合至Globo H的若干抗Globo H抗體。
根據本發明之實施例，抗Globo H抗體可包含：重鏈變異域，其具有由HCDR1 (GYISSDQILN，SEQ ID NO: 1)、HCDR2 (RIYPVTGVTQYXHKFVG，SEQ ID NO: 2，其中X為任何胺基酸)及HCDR3 (GETFDS，SEQ ID NO: 3)組成之三個互補區；及輕鏈變異域，其具有由LCDR1 (KSNQNLLX'SGNRRYZLV，SEQ ID NO: 4，其中X'為F、Y或W，且Z為C、G、S或T)、LCDR2 (WASDRSF，SEQ ID NO: 5)及LCDR3 (QQHLDIPYT，SEQ ID NO: 6)組成之三個互補區。CH2 及 CH3 域之突變誘發
抗Globo H單株抗體序列用作供使用此項技術中已知之技術(諸如使用PCR)定點突變誘發的依據。可用定序分析確認所需突變體純系。
如上文所提及，本發明之雙特異性抗體較佳為不對稱二聚體。較佳地，此等不對稱二聚體係基於杵-臼方法。舉例而言，為產生臼臂，重鏈CH2及CH3域之核苷酸序列可經突變以包括L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變。替代地，重鏈CH2及CH3域之核苷酸序列可經突變以包括L235A、G237A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變。
圖2展示具有L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變之例示性臼臂之核苷酸序列，而圖3展示具有L235A、G237A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變之例示性臼臂之核苷酸序列。此等突變體含有在CH3域中之杵-臼突變(殘基349、366、368及407)以及在CH2域中之效應子結合位點突變(殘基234、235及237)的突變。應注意此等僅為舉例。熟習此項技術者將瞭解，亦可在不背離本發明之範疇下使用此項技術中已知之類似突變。
舉例而言，額外突變體可包括以下。為產生杵臂，重鏈CH2及CH3域之核苷酸序列可經突變以包括L234A、L235A、S354C及T366W突變。替代地，重鏈CH2及CH3域之核苷酸序列可經突變以包括L235A、G237A、S354C及T366W突變。
圖4展示具有L234A、L235A、S354C及T366W突變之例示性杵臂之核苷酸序列，而圖5展示具有L235A、G237A、S354C及T366W突變之例示性杵臂之核苷酸序列。
熟習此項技術者將瞭解，CH2及CH3中之突變可經調換，亦即混合及匹配。舉例而言，圖6展示具有L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變之例示性臼臂之胺基酸序列，而圖7展示具有L234A、L235A、S354C及T366W突變之例示性杵臂之胺基酸序列。替代地，圖8展示具有L235A、G237A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變之例示性臼臂之胺基酸序列，而圖9展示具有L235A、G237A、S354C及T366W突變之例示性杵臂之胺基酸序列。雙特異性抗 Globo H x 抗 CD3 抗體之產生
本發明之雙特異性抗體各自含有一個T細胞靶向域。T細胞靶向域例如可靶向CD3。舉例而言，為製備本發明之雙特異性抗體，抗CD3 ScFv (或Fab)可融合至抗Globo H抗體之C端。可在抗CD3 ScFv與抗Globo H抗體之CH3域之間使用連接子。任何適合連接子可與本發明之實施例一起使用，諸如短肽連接子(例如，Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser；SEQ ID NO: 7)。
圖10展示連接子之一個實例之核苷酸序列，且圖11展示抗CD3 (OKTF1)之ScFv之核苷酸序列，而圖12及圖13分別展示對應胺基酸序列。
此等抗體之產生僅需要常規分子生物技術。作為一實例，(1)杵臂及臼臂在MfeI及BamHI分解下，藉由將經PCR擴增之合成杵臂基因(S354C及T366W)及臼臂基因(Y349C、T366S、L368A及Y407V)次選殖至表現抗Globo H抗體的載體中而產生。
(2)與抗CD3 ScFv融合之杵臂或臼臂是藉由合成杵臂連接子或臼臂連接子基因片段與連接子抗CD3 ScFv基因片段之組裝PCR產生，且在MfeI及BamHI分解之後，將經組裝DNA次選殖至表現抗Globo H抗體的載體中。
(3)CH2域之突變是例如藉由合成基因片段與234A及235A突變或235A及237A突變之組裝PCR產生，且在NheI及MfeI分解之後，將經組裝DNA次選殖至表現抗Globo H抗體的載體中。抗體表現及純化
關於抗體產生，不同純系可在任何適合細胞(諸如CHO或F293細胞)中表現。作為一實例，F293細胞(Life technologies)經表現抗Globo H mAb之載體轉染且培養7天。使用蛋白A親和力管柱(GE)，可自培養基純化抗Globo H抗體。使用此項技術中已知之程序或根據製造商之說明書，可用Bio-Rad蛋白質分析套組測定蛋白質濃度且用12% SDS-PAGE進行分析。
本發明之各種抗體可藉由此項技術中已知之技術(諸如SDS-PAGE及HPLC)分析。舉例而言，可藉由使用4-12%非還原及還原SDS-PAGE凝膠，隨後藉由考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue)染色來分析雙特異性抗體樣本溶液。結合親和力
本發明抗體之結合親和力可利用此項技術中已知之任何適合方法(諸如Biacore)評定。
簡言之，製備抗Globo H之流動溶液以進行結合動力學研究。將配位體Globo H固定在CM5晶片上：首先，在固定緩衝液(10 mM乙酸鈉，pH 4.5)中，將配位體(Globo H-胺)稀釋至6 μg/mL。一般在25℃下使用5 μL/min之流速進行固定。在胺偶合套組中提供用於固定之試劑。活化：EDC/NHS，7分鐘。固定：流動時間720秒。失活：1.0 M乙醇胺pH 8.5，7分鐘。此過程將在感測器晶片CM5上產生約200 RU之結合反應。
接著，如下進行單循環動力學分析：Biacore單循環動力學(single-cycle kinetics，SCK)方法具有用以獲得動力學資料之軟體。選擇操作：方法。參數設定如下：資料收集速率：1 Hz；偵測模式：雙重；溫度：25℃；濃度單位：nM；緩衝液A：HBS-EP+緩衝液。選擇開始(Start up)且將複本之數目改成3。選擇開始循環(Startup cycle)且參數設定如下：類型：低樣本消耗；接觸時間：150秒；解離時間：420秒；流速：50 μL/min；流動路徑：兩個。選擇樣本循環(Sample cycle)且參數設定如下：類型：單循環動力學；濃度/循環：5；接觸時間：150秒；解離時間：420秒；流速：50 μl/min；流動路徑：兩個。選擇再生(Regeneration)且參數設定如下：再生溶液：10 mM甘胺酸pH 2.0/1.5 (v/v=1)；接觸時間：45秒；流速：30 μL/min；流動路徑：兩個。選擇樣本之複本(Copy)且參數設定如上。製備樣本：將分析物抗體在操作緩衝液中稀釋至200 nM。自200 nM樣本製備濃度系列：將200 μL之200 nM溶液與200 μL之操作緩衝液混合以獲得100 nM溶液。繼續連續稀釋以獲得以下：200、100、50、25及12.5 nM。製備樣本且根據支架位置(Rack Position)定位。根據製備操作方案(Prepare Run Protocol)，確保一切正確，且點擊開始(Start)以開始實驗。使用由Biacore T100評估軟體2.0提供之預定模型(1:1結合)進行親和力結合曲線擬合。抗體介導之 ADCC 分析：
此項技術中已知之用於抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)的任何方案可與本發明之實施例一起使用。舉例而言，將效應子細胞(例如，人類PBMC細胞)與BsAb以10:1 E/T比率(效應子與靶標比率)在過度表現Globo H之人類乳癌細胞株HCC1428-GFP上一起培育72小時。PBS用作BsAb之陰性對照。細胞存活率是藉由細胞之GFP面積(μm2 )量測且用Developer Toolbox 1.9.2透過IN Cell分析器6000 (GE)分析。實驗使用來自健康志願者之PBMC細胞。實驗性方案如下。
將HCC1428-GFP細胞在適合培養基中在37℃下於5% CO2 之潮濕培育箱氛圍中預培養。繼代培養所有細胞株至少三個繼代，將細胞接種在96孔黑色平底培養盤(對於所有細胞株，10,000細胞/100微升/孔)中且使其在37℃下於5% CO2 之潮濕氛圍中附著隔夜。
製備具有抗CD3雙特異性抗體之AHFS 抗Globo H之溶液且在細胞接種之後24 h將其稀釋為合適工作濃度。將AHFS抗Globo H x 抗CD3溶液之等分試樣添加至細胞培養物，以獲得20 nM及100 nM且培育細胞72小時。將PBMC或T細胞用作效應子細胞，與靶細胞呈10:1之比率。在0小時及72小時檢驗細胞之綠色螢光。藉由細胞之GFP面積(μm2 )量測細胞存活率。
圖14展示使用PBMC作為效應子細胞的此實驗之結果。結果展示，AHFS抗Globo H x 抗CD3雙特異性抗體在PBMC存在下有效地殺死表現Globo H之乳癌細胞株HCC1428。如所預期，野生型(亦即，不具有壓制效應子功能之突變) AHFS能夠在具有或不具有抗CD3融合之情況下殺死癌細胞，但具有抗CD3之AHFS更為有效。此等野生型抗體保留ADCC及CDC功能。
相反，效應子位點突變體(不具有效應子功能)無法在不具有抗CD3域之情況下殺死癌細胞，從而指示ADCC及CDC功能已受損。另一方面，具有抗CD3域之抗體甚至能夠在ADCC或CDC功能不存在之情況下殺死癌細胞。亦即，藉由mut234-235或mut235-237，具有經繫栓抗CD3之抗體(K+HT及KT+H)在殺死癌細胞方面有效，但不具有經繫栓抗CD3之彼等(K+H)無效。
展示於圖14中之結果清楚地展示，本發明之AHFS可經工程改造以具有最小或無效應子功能，由此避免非所需ADCC或CDC功能。然而，在具有T細胞靶向域之情況下，此等抗體具有藉由T細胞特異性細胞毒性殺死癌細胞的能力。本發明之實施例清楚地證實，抗Globo H之雙特異性抗體可經工程改造成不具有非特異性ADCC或CDC細胞毒性且仍保留T細胞特異性細胞毒性。
圖15展示使用T細胞作為效應子細胞的類似實驗之結果。結果展示，AHFS抗Globo H x 抗CD3雙特異性抗體有效地殺死表現Globo H之乳癌細胞HCC1428。相反，在T細胞靶向域不存在之情況下，野生型(亦即，不具有壓制效應子功能之突變)及效應子位點突變體(mut234-235或mut235-237) AHFS不能夠接合及活化T細胞；因此，其不能夠殺死癌細胞。
展示於圖15中之結果清楚地展示，本發明之AHFS抗Globo H x 抗CD3雙特異性抗體可以特異性方式接合及活化T細胞，由此避免非特異性ADCC。抗體介導之 CDC 分析
此項技術中已知之用於補體依賴性細胞毒性(CDC)的任何方案可與本發明之實施例一起使用。舉例而言，將補體(40%之健康人類血清NHS (v:v))與本發明之雙特異性抗體(BsAb)在過度表現Globo H之人類乳癌細胞株HCC1428-GFP上一起培育12小時。PBS用作BsAb之陰性對照。詳細的細胞培養條件如上文所概述。細胞存活率是藉由細胞之GFP面積(μm2 )量測且用Developer Toolbox 1.9.2透過IN Cell分析器6000 (GE)分析。實驗使用來自健康志願者之健康人類血清NHS。
圖16展示來自此實驗之結果。野生型抗體(不具有效應子結合位點處之突變)能夠支援補體依賴性細胞毒性(CDC)。相反，效應子位點突變體(mut234/235及mut235/237)(在其效應子結合位點處具有壓制效應子功能之突變)不能夠支援CDC，無論T細胞靶向域是否存在。此等結果指示，本發明之抗體(其在其效應子結合位點處具有突變)將不具有非特異性CDC。T 細胞介導之細胞毒性
以上結果展示，具有受損效應子功能之本發明抗體將不會支援非特異性細胞毒性(無論ADCC或CDC)。此等抗體反而支援特異性T細胞細胞毒性。T細胞介導之細胞毒性誘導各種細胞介素以及穿孔蛋白及顆粒酶產生，其有助於細胞毒性。為確認T細胞介導之細胞毒性，吾人可分析此等因子之產生。
將效應子細胞(人類T細胞)與BsAb以10:1 E/T比率在過度表現Globo H之人類乳癌細胞株HCC1428-GFP上一起培育72小時。PBS用作BsAb之陰性對照。細胞存活率是藉由細胞之GFP面積(μm2 )量測且用Developer Toolbox 1.9.2透過IN Cell分析器6000 (GE)分析。實驗使用來自健康志願者之T細胞。細胞介素分析
將效應子細胞(人類PBMC細胞或T細胞)與BsAb以10:1 E/T比率在過度表現Globo H之人類乳癌細胞株HCC1428-GFP上一起培育24、48及72小時。收集上清液且以800 rpm離心5 min。藉由Milliplex MAP人類CD8+ T細胞磁珠板，6-叢培養盤量測上清液之六種細胞介素(IFNγ、顆粒酶A、顆粒酶B、TNF-α、IL-2及穿孔蛋白)。
圖17展示具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體不能夠在與Globo H抗原之結合不存在的情況下誘導非特異性T細胞活化及IL-2產生，而野生型(不具有效應子結合位點處之突變)可誘導IL-2產生。
圖18展示具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體不能夠在與Globo H抗原之結合不存在的情況下誘導非特異性T細胞活化及TNF-α產生，而野生型(不具有效應子結合位點處之突變)可誘導TNF-α產生。
圖19展示具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體不能夠在與Globo H抗原之結合不存在的情況下誘導非特異性T細胞活化及INF-γ產生，而野生型(不具有效應子結合位點處之突變)可誘導INF-γ產生。
圖20展示具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體不能夠在與Globo H抗原之結合不存在的情況下誘導非特異性T細胞活化及穿孔蛋白產生，而野生型(不具有效應子結合位點處之突變)可誘導穿孔蛋白產生。
圖21展示具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體不能夠在與Globo H抗原之結合不存在的情況下誘導非特異性T細胞活化及顆粒酶A產生，而野生型(不具有效應子結合位點處之突變)可誘導顆粒酶A產生。
圖22展示具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體不能夠在與Globo H抗原之結合不存在的情況下誘導非特異性T細胞活化及顆粒酶B產生，而野生型(不具有效應子結合位點處之突變)可誘導顆粒酶B產生。
圖23展示在結合至腫瘤細胞上之Globo H抗原之後，具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體能夠接合及活化T細胞且誘導IL-2產生。在Globo H抗原存在下由本發明抗體誘導之特異性T細胞細胞毒性及IL-2產生幾乎與由野生型(不具有效應子結合位點處之突變)誘導之彼等一樣有效。此等結果指示，由本發明抗體誘導之細胞毒性為腫瘤靶細胞依賴型。
圖24展示在結合至腫瘤細胞上之Globo H抗原之後，具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體能夠接合及活化T細胞且誘導TNF-α產生。在Globo H抗原存在下由本發明抗體誘導之特異性T細胞細胞毒性及TNF-α產生幾乎與由野生型(不具有效應子結合位點處之突變)誘導之彼等一樣有效。此等結果指示，由本發明抗體誘導之細胞毒性為腫瘤靶細胞依賴型。
圖25展示在結合至腫瘤細胞上之Globo H抗原之後，具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體能夠接合及活化T細胞且誘導INF-γ產生。在Globo H抗原存在下由本發明抗體誘導之特異性T細胞細胞毒性及INF-γ產生幾乎與由野生型(不具有效應子結合位點處之突變)誘導之彼等一樣有效。此等結果指示，由本發明抗體誘導之細胞毒性為腫瘤靶細胞依賴型。
圖26展示在結合至腫瘤細胞上之Globo H抗原之後，具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體能夠接合及活化T細胞且誘導穿孔蛋白產生。在Globo H抗原存在下由本發明抗體誘導之特異性T細胞細胞毒性及穿孔蛋白產生幾乎與由野生型(不具有效應子結合位點處之突變)誘導之彼等一樣有效。此等結果指示，由本發明抗體誘導之細胞毒性為腫瘤靶細胞依賴型。
圖27展示在結合至腫瘤細胞上之Globo H抗原之後，具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體能夠接合及活化T細胞且誘導顆粒酶A產生。在Globo H抗原存在下由本發明抗體誘導之特異性T細胞細胞毒性及顆粒酶A產生幾乎與由野生型(不具有效應子結合位點處之突變)誘導之彼等一樣有效。此等結果指示，由本發明抗體誘導之細胞毒性為腫瘤靶細胞依賴型。
圖28展示在結合至腫瘤細胞上之Globo H抗原之後，具有效應子結合位點處之突變的本發明抗體能夠接合及活化T細胞且誘導顆粒酶B產生。在Globo H抗原存在下由本發明抗體誘導之特異性T細胞細胞毒性及顆粒酶B產生幾乎與由野生型(不具有效應子結合位點處之突變)誘導之彼等一樣。此等結果指示，由本發明抗體誘導之細胞毒性為腫瘤靶細胞依賴型。
總之，以上結果清楚地展示，具有其效應子結合位點處之突變的本發明之實施例(抗Globo H x 抗CD3雙特異性抗體)將不誘導非特異性ADCC或CDC。替代地，本發明之實施例可僅在Globo H抗原存在下誘導特異性T細胞活化(在結合至T細胞上CD3之後)，使得產生有助於T細胞活化及腫瘤細胞殺滅之細胞介素及因子(例如，IL-2、TNF-α、INF-γ、穿孔蛋白、顆粒酶A及顆粒酶B)。因此，當用於患者時，本發明抗體將具有降低之副作用且將需要較少抗體以獲得治療效果。
本發明之一些實施例係關於用於治療與Globo H之表現相關聯之癌症的方法。此等癌症包括上皮源之癌症，諸如乳癌、***癌、肺癌等。根據本發明之實施例，一種用於治療與Globo H之過度表現相關聯之癌症的方法包含向有需要之個體投與有效量之如上文所描述之雙特異性抗Globo H抗體。個體可為人類或動物。
儘管本發明之實施例已用有限數目之實例加以說明，熟習此項技術者仍應瞭解，其他修改及變化在不脫離本發明之範疇的情況下係可能的。因此，本發明之保護範疇應僅受所附申請專利範圍限制。
圖1展示說明根據本發明之實施例的含有ScFv抗CD3融合之不對稱二聚雙特異性抗Globo H抗體之實例的示意圖。
圖2展示根據本發明之實施例的抗Globo H抗體之臼臂之核苷酸序列，該臼臂具有L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變。
圖3展示根據本發明之一個實施例的抗Globo H抗體之臼臂之核苷酸序列，該臼臂具有L235A、G237A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變。
圖4展示根據本發明之一個實施例的抗Globo H抗體之杵臂之核苷酸序列，該杵臂具有L234A、L235A、S354C及T366W突變。
圖5展示根據本發明之一個實施例的抗Globo H抗體之杵臂之核苷酸序列，該杵臂具有L235A、G237A、S354C及T366W突變。
圖6展示根據本發明之一個實施例的抗Globo H抗體之臼臂之胺基酸序列，該臼臂具有L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變。
圖7展示根據本發明之一個實施例的抗Globo H抗體之杵臂之胺基酸序列，該杵臂具有L234A、L235A、S354C及T366W突變。
圖8展示根據本發明之一個實施例的抗Globo H抗體之臼臂之胺基酸序列，該臼臂具有L235A、G237A、Y349C、T366S、L368A及Y407V突變。
圖9展示根據本發明之一個實施例的抗Globo H抗體之杵臂之胺基酸序列，該杵臂具有L235A、G237A、S354C及T366W突變。
圖10展示根據本發明之一個實施例的連接子之核苷酸序列。
圖11展示根據本發明之一個實施例的抗CD3 ScFv之核苷酸序列。
圖12展示根據本發明之一個實施例的連接子之胺基酸序列。
圖13展示根據本發明之一個實施例的抗CD3 ScFv之胺基酸序列。
圖14展示根據本發明之實施例，抗Globo H x 抗CD3雙特異性抗體在人類週邊血液單核球細胞存在下，有效地殺死表現Globo H之乳癌細胞株HCC1428。
圖15展示根據本發明之實施例，抗Globo H x 抗CD3雙特異性抗體在人類T細胞存在下，有效地殺死表現Globo H之乳癌細胞株HCC1428。
圖16展示根據本發明之實施例，CH2域中之L234A及L235A或L235A及G237A之Fc突變完全抑制抗體介導之補體依賴性細胞毒性(CDC)。
圖17展示根據本發明之一個實施例，在L234A及L235A或L235A及G237A突變體中，藉由Fc-抗CD3 ScFv融合域誘導之非特異性T細胞活化及IL-2產生被完全削減。
圖18展示根據本發明之一個實施例，在L234A及L235A或L235A及G237A突變體中，藉由Fc-抗CD3 ScFv融合域誘導之非特異性T細胞活化及TNF-α產生被完全削減。
圖19展示根據本發明之一個實施例，在L234A及L235A或L235A及G237A突變體中，藉由Fc-抗CD3 ScFv融合域誘導之非特異性T細胞活化及IFN-γ產生被完全削減。
圖20展示根據本發明之一個實施例，在L234A及L235A或L235A及G237A突變體中，藉由Fc-抗CD3 ScFv融合域誘導之非特異性T細胞活化及穿孔蛋白產生被完全削減。
圖21展示根據本發明之一個實施例，在L234A及L235A或L235A及G237A突變體中，藉由Fc-抗CD3 ScFv融合域誘導之非特異性T細胞活化及顆粒酶A產生被完全削減。
圖22展示根據本發明之一個實施例，在L234A及L235A或L235A及G237A突變體中，藉由Fc-抗CD3 ScFv融合域誘導之非特異性T細胞活化及顆粒酶B產生被完全削減。
圖23展示根據本發明之一個實施例，AHFS (不對稱異二聚SC-FV融合)抗Globo H x 抗CD3 BsAb以腫瘤靶細胞依賴性方式有效地活化T細胞並誘導IL-2產生。
圖24展示根據本發明之一個實施例，AHFS抗Globo H x 抗CD3 BsAb以腫瘤靶細胞依賴性方式有效地活化T細胞並誘導TNF-α產生。
圖25展示根據本發明之一個實施例，AHFS抗Globo H x 抗CD3 BsAb以腫瘤靶細胞依賴性方式有效地活化T細胞並誘導IFN-γ產生。
圖26展示根據本發明之一個實施例，AHFS抗Globo H x 抗CD3 BsAb以腫瘤靶細胞依賴性方式有效地活化T細胞並誘導穿孔蛋白產生。
圖27展示根據本發明之一個實施例，AHFS抗Globo H x 抗CD3 BsAb以腫瘤靶細胞依賴性方式有效地活化T細胞並誘導顆粒酶A產生。
圖28展示根據本發明之一個實施例，AHFS抗Globo H x 抗CD3 BsAb以腫瘤靶細胞依賴性方式有效地活化T細胞並誘導顆粒酶B產生。

Claims (11)

  1. 一種雙特異性抗Globo H抗體，其包含： 抗Globo H抗體，其特異性地結合至Globo H；及 T細胞靶向域，其融合至該抗Globo H抗體之重鏈之CH3域， 其中該T細胞靶向域特異性地結合至T細胞上之抗原；及 其中該抗Globo H抗體包含在效應子結合位點處之突變，使得該雙特異性抗Globo H抗體具有削減的效應子功能。
  2. 如請求項1之雙特異性抗Globo H抗體，其中該T細胞靶向域為ScFv或Fab。
  3. 如請求項2之雙特異性抗Globo H抗體，其中該ScFv或Fab源於抗CD3抗體。
  4. 如請求項1之雙特異性抗Globo H抗體，其中在該效應子結合位點處之該等突變包含L234A及L235A突變。
  5. 如請求項1之雙特異性抗Globo H抗體，其中在該效應子結合位點處之該等突變包含L235A及G237A突變。
  6. 如請求項1至5中任一項之雙特異性抗Globo H抗體，其進一步包含第一重鏈之CH3域中之杵結構及第二重鏈之CH3域中之臼結構。
  7. 如請求項6之雙特異性抗Globo H抗體，其中該杵結構是由S354C及T366W突變形成，且該臼結構是由Y349C、T366S、L368A及Y407V突變形成。
  8. 如請求項6之雙特異性抗Globo H抗體，其中該抗Globo H抗體可包含：重鏈變異域，其具有由HCDR1 (GYISSDQILN，SEQ ID NO: 1)、HCDR2 (RIYPVTGVTQYXHKFVG，SEQ ID NO: 2，其中X為任何胺基酸)及HCDR3 (GETFDS，SEQ ID NO: 3)組成之三個互補區；及輕鏈變異域，其具有由LCDR1 (KSNQNLLX'SGNRRYZLV，SEQ ID NO: 4，其中X'為F、Y或W，且Z為C、G、S或T)、LCDR2 (WASDRSF，SEQ ID NO: 5)及LCDR3 (QQHLDIPYT，SEQ ID NO: 6)組成之三個互補區。
  9. 一種用於治療與Globo H之過度表現相關聯之癌症的醫藥組合物，其包含有效量之如請求項1至8中任一項之雙特異性抗Globo H抗體。
  10. 如請求項9之醫藥組合物，其中該癌症為上皮源之癌症。
  11. 如請求項9之醫藥組合物，其中該癌症為乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、胃癌、胰臟癌、肺癌或***癌。
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