TW201835109A - 具有增加之半衰期之治療蛋白質及其製備方法 - Google Patents

Abstract

本揭示案涉及將水溶性聚合物與治療蛋白質偶聯的材料及方法。

Description

具有增加之半衰期之治療蛋白質及其製備方法

本揭示案涉及將水溶性聚合物與治療蛋白質偶聯的材料及方法。

藉由在水溶性聚合物與治療蛋白質之間形成共價鍵來製備偶聯物可藉由多種化學方法執行。多肽藥物的聚乙二醇化可使多肽藥物在循環中得到保護並且改善其藥效及藥代動力學概況(Harris及Chess,Nat Rev Drug Discov.2003；2：214-21)。聚乙二醇化過程將乙二醇重複單元(聚乙二醇(PEG))與多肽藥物連接。PEG分子具有較大流體動力學體積(球狀蛋白質大小之5至10倍)，具有高度水溶性及水合能力、無毒、無免疫原性並且自體內快速清除。分子之聚乙二醇化可導致藥物對於酶促降解之抗性增加、活體內半衰期增加、給藥頻率降低、免疫原性減少、物理及熱穩定性增加、溶解性增加、液體穩定性增加，及聚集減少。首批聚乙二醇化藥物在二十世紀九十年代早期由FDA核准。自彼時起，FDA已核准若干種聚乙二醇化藥物用於經口、注射，及局部投與。

聚唾液酸(Polysialic acid；PSA)，亦稱為多聚唾液酸(colominic acid；CA)，為自然產生之多醣。其為具有α(2→8)酮苷鍵之N-乙醯神經胺酸之均聚物並且在其非還原末端含有鄰位二醇基團。其帶有負電荷並且為人體之天然成分。其可容易地自細菌大量地產生並且具有預先確定的物理特性(美國專利第5,846,951號)。因為細菌產生之PSA在化學及免疫學上與在人體內產生之PSA相同，所以細菌PSA為非免疫原性的，即使在與蛋白質偶合時亦如此。不同於一些 聚合物，PSA酸為可生物降解的。多聚唾液酸與過氧化氫酶及天冬醯胺酶之共價偶合已被證明可在存在蛋白分解酶或血漿的情況下增加酶穩定性。聚唾液酸化與未經修飾天冬醯胺酶之活體內比較研究揭示聚唾液酸化可增加酶之半衰期(Fernandes及Gregoriadis,Int J Pharm.2001；217：215-24)。

PEG衍生物與肽或蛋白質之偶合由Roberts等人評論(Adv Drug Deliv Rev 2002；54：459-76)。使水溶性聚合物與治療蛋白質偶合之一種途徑為經由蛋白質之碳水化合物部分使聚合物進行偶聯。蛋白質中之碳水化合物之鄰位羥基(OH)基團可容易地藉由過碘酸鈉(NaIO4)來氧化以形成活性醛基團(Rothfus及Smith,J Biol Chem 1963；238：1402-10；van Lenten及Ashwell,J Biol Chem 1971；246：1889-94)。隨後，聚合物可藉由使用含有例如活性醯肼基團之試劑而與碳水化合物之醛基團偶合(Wilchek M及Bayer EA,Methods Enzymol 1987；138：429-42)。最近的一種技術使用含有與醛反應以形成肟鍵之胺氧基的試劑(WO 96/40662、WO 2008/025856)。

描述水溶性聚合物與治療蛋白質偶聯之其他實例描述於以下專利案中：WO 06/071801，其教示使血管性血友病因子中之碳水化合物部分氧化，隨後使用醯肼化學與PEG偶合；美國公開案第2009/0076237號，其教示使rFVIII氧化，隨後使用醯肼化學與PEG以及其他水溶性聚合物(例如PSA、HES、右旋糖酐)偶合；WO 2008/025856，其教示使例如rFIX、FVIII及FVIIa之不同凝血因子氧化，隨後使用胺氧基化學藉由形成肟鍵而與例如PEG偶合；及美國專利第5,621,039號，其教示使FIX氧化，隨後使用醯肼化學與PEG偶合。

最近，描述一種經改良之方法，其包括使唾液酸經受溫和過碘酸鹽氧化以產生醛，繼而在存在催化量之苯胺的情況下與含有胺氧基之試劑反應(Dirksen A.及Dawson PE,Bioconjugate Chem.2008；19,2543-8；及Zeng Y等人，Nature Methods 2009；6：207-9)。苯胺催化作用極大地加速肟連接反應，使得可使 用非常低濃度之該試劑。親核催化劑之使用亦描述於Dirksen,A.等人，JAm Chem Soc.,128：15602-3(2006)；Dirksen,A.等人，Angew chem.Int Ed.,45：7581-4(2006)；Kohler,J.J.,ChemBioChem.,10：2147-50(2009)；Giuseppone,N.等人，J Am Chem Soc.,127：5528-39(2005)；及Thygesen,M.B.等人，J Org Chem.,75：1752-5(2010)。

雖然有上述技術及試劑，但是在此項技術中仍然需要以最少過程步驟及高效率來使水溶性聚合物與治療蛋白質偶聯，同時增加半衰期並且保持生物活性之材料及方法。

本揭示案提供用於使聚合物與蛋白質偶聯之材料及方法，其改良蛋白質之藥效及/或藥代動力學性質，同時使偶聯反應之產率最大化。

在本揭示案之一實施例中，提供製備治療蛋白質偶聯物之方法，其包括使治療蛋白質、或其生物學活性片段與硫醇還原劑及水溶性聚合物、或其功能衍生物在以下條件下接觸之步驟：(a)在治療蛋白質上產生經還原之半胱胺酸巰基，及(b)使得水溶性聚合物可與經還原之半胱胺酸巰基偶聯；該治療蛋白質具有具備不超過一個可接近的半胱胺酸巰基之胺基酸序列。

在另一實施例中，提供上述方法，其中治療蛋白質選自由以下組成之群：選自由以下組成之群之絲胺酸蛋白酶抑制因子(serpin)超家族之蛋白質：A1PI(α-1蛋白酶抑制因子)，或A1AT(α-1-抗胰蛋白酶)、ATR(α-1-抗胰蛋白酶相關蛋白質)、AACT或ACT(α-1-抗胰凝乳蛋白酶)、PI4(蛋白酶抑制因子4)、PCI或PROCI(蛋白質C抑制因子)、CBG(皮質類固醇結合球蛋白)、TBG(甲狀腺素結合球蛋白)、AGT(血管緊縮素原)、中心粒蛋白(centerin)、PZI(蛋白質Z依賴性蛋白酶抑制因子)、PI2(蛋白酶抑制因子2)、PAI2或PLANH2(纖溶酶原激活物抑制因子-2)、SCCA1(鱗狀細胞癌抗原1)、SCCA2(鱗狀細胞癌抗原2)、PI5(蛋白酶抑 制因子5)、PI6(蛋白酶抑制因子6)、梅根蛋白(megsin)、PI8(蛋白酶抑制因子8)、PI9(蛋白酶抑制因子9)、PI10(蛋白酶抑制因子10)、埃披蛋白(epipin)、湯古蛋白(yukopin)、PI13(蛋白酶抑制因子13)、PI8L1(蛋白酶抑制因子8樣1)、AT3或ATIII(抗凝血酶-III)、HC-II或HCF2(肝素輔因子II)、PAI1或PLANH1(纖溶酶原激活物抑制因子-1)、PN1(蛋白酶連接蛋白I)、PEDF(色素上皮細胞衍生因子)、PLI(胞漿素抑制因子)、C1IN或C1INH(血漿蛋白酶C1抑制因子)、CBP1(膠原結合蛋白1)、CBP2(膠原結合蛋白2)、PI12(蛋白酶抑制因子12)，及PI14(蛋白酶抑制因子14)；選自由以下組成之群之蛋白質：抗凝血酶III、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、人類血清白蛋白、醇脫氫酶、膽綠素還原酶、丁醯膽鹼酯酶、補體C5a、皮質醇結合蛋白、肌酸激酶、鐵蛋白、肝素輔因子、介白素2、蛋白質C抑制因子、組織因子；玻連蛋白；卵白蛋白、纖溶酶原激活物抑制因子、神經絲抑蛋白(neuroserpin)、C1-抑制因子、連接蛋白、α-2-抗纖溶酶、肝素輔因子II、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-微球蛋白；及選自由以下組成之群之凝血因子蛋白質：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、血管性血友病因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、因子XIII(FXIII)凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。在相關實施例中，治療蛋白質為A1PI。在另一相關實施例中，治療蛋白質為人類血清白蛋白。

在另一實施例中，提供上述方法，其中治療蛋白質為醣蛋白。在相關實施例中，治療蛋白質在活體內經醣化。在另一相關實施例中，治療蛋白質在活體外經醣化。

在另一實施例中，提供上述方法，其包括0.100與10.0克重之間數量之治療蛋白質。在各種實施方案中，治療蛋白質之數量在0.01與10.0克重之間、0.02與9.0克重之間、0.03與8.0克重之間、0.04與7.0克重之間、0.05與6.0克重之間、0.06與5.0克重之間、0.07與4.0克重之間、0.08與3.0克重之間、0.09與2.0 克重之間，及0.10與1.0克重之間。因此，在一實施例中，本揭示案之方法可適用於大規模生產治療蛋白質偶聯物。

在另一實施例中，提供上述方法，其中水溶性聚合物選自由以下組成之群：線性、分支或多臂水溶性聚合物。在另一實施例中，提供上述方法，其中水溶性聚合物具有3,000與150,000道爾頓(Da)之間之分子量。在各種實施方案中，水溶性聚合物具有5,000與125,000之間、6,000與120,000之間、7,000與115,000之間、8,000與110,000之間、9,000與100,000之間、10,000與80,000之間、15,000與75,000之間、20,000與60,000之間、30,000與50,000之間，及35,000與45,000Da之間之分子量。在一實施例中，水溶性聚合物為線性的並且具有10,000與50,000Da之間之分子量。在另一實施例中，水溶性聚合物為線性的並且具有20,000之分子量。

在另一實施例中，提供上述方法，其中水溶性聚合物選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖(pullulane)、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)，及其功能衍生物。

在另一實施例中，提供上述方法，其中水溶性聚合物經衍生以含有選自由以下組成之群之巰基特異性基團：馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸、鄰吡啶-二硫化物(OPSS)及碘乙醯胺。在一實施例中，水溶性聚合物為PEG並且巰基特異性基團為MAL。在另一實施例中，水溶性聚合物為PSA並且巰基特異性基團 為MAL。

在另一實施例中，在上述方法中，硫醇還原劑選自由以下組成之群：參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、硼氫化鈉(NaBH₄)、氰基硼氫化鈉(NaCNBH₃)、β-巰基乙醇(BME)、鹽酸半胱胺酸及半胱胺酸。在一實施例中，硫醇還原劑為TCEP。

在另一實施例中，提供上述方法，其中硫醇還原劑濃度相對於治療蛋白質濃度為1與100倍之間莫耳過量。在另一實施例中，硫基還原劑濃度相對於治療蛋白質濃度為1與10倍之間莫耳過量。在各種實施方案中，硫基還原劑濃度相對於治療蛋白質濃度為1與9、1與8、1與7、1與6、1與5、2與4，及3與4倍之間莫耳過量。

在另一實施例中，提供上述方法，其中治療蛋白質之胺基酸序列含有不超過一個半胱胺酸殘基。在另一實施例中，提供上述方法，其中可接近的半胱胺酸巰基存在於治療蛋白質之原生胺基酸序列中。在另一實施例中，提供上述方法，其中治療蛋白質之胺基酸序列經修飾以包含可接近的半胱胺酸巰基。在另一實施例中，提供上述方法，其中在治療蛋白質上產生經還原之半胱胺酸巰基之條件不使蛋白質中之其它半胱胺酸胺基酸之間之二硫鍵還原。在另一實施例中，在上述方法中，治療蛋白質僅包含一個包含經完全或部分氧化之可接近巰基的半胱胺酸殘基，該僅一個半胱胺酸殘基不涉及與治療蛋白質之胺基酸序列中之另一半胱胺酸殘基的二硫鍵。

在本揭示案之另一實施例中，提供上述方法，其進一步包括純化治療蛋白質偶聯物之步驟。在各種實施方案中，治療蛋白質偶聯物使用選自由以下組成之群之技術來純化：離子-交換層析、疏水性相互作用層析、體積排除層析及親和層析或其組合。

在另一實施例中，提供上述方法，其中治療蛋白質、水溶性聚合 物及硫醇還原劑在單一容器中一起孵育，其中經氧化之SH基團之還原與偶聯反應同時執行。在另一實施例中，硫醇還原劑在與治療蛋白質一起孵育之後並且在將治療蛋白質與水溶性聚合物一起孵育之前得以移除，其中經氧化之SH基團之還原與偶聯反應依序執行。

在本揭示案之另一實施例中，提供上述方法，其中治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少20%生物活性。在另一實施例中，治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少60%生物活性。在一實施例中，治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持10%至100%之間之生物活性。在各種實施例中，治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，或90%生物活性。

在本揭示案之另一實施例中，提供上述方法，其中治療蛋白質偶聯物之至少70%由單一水溶性聚合物構成。在另一實施例中，治療蛋白質偶聯物之10-100%由單一水溶性聚合物構成。在各種實施例中，治療蛋白質偶聯物之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%由單一水溶性聚合物構成。

在本揭示案之另一實施例中，提供上述方法，其中治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加之半衰期。在另一實施例中，治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加為至少1.5倍之半衰期。在一實施例中，治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加為至少1至10倍之半衰期。在各種實施例中，治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加為至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5倍之半衰期。

在本揭示案之另一實施例中，提供製備A1PI偶聯物之方法，其包括以下步驟：使A1PI與TCEP在可使A1PI上之巰基得以還原之條件下接觸，及 使經衍生以含有MAL基團之線性PEG與A1PI在使得水溶性聚合物與經還原之巰基偶聯之條件下接觸；該A1PI僅包含一個包含經完全或部分氧化之可接近巰基的半胱胺酸殘基，該僅一個半胱胺酸殘基不涉及與A1PI之胺基酸序列中之另一半胱胺酸殘基之二硫鍵；該TCEP濃度相對於A1PI濃度為3與4倍之間莫耳過量；其中A1PI偶聯物之至少70%由單一水溶性聚合物構成；該A1PI偶聯物相對於原生A1PI具有增加之半衰期；並且該A1PI偶聯物相對於原生A1PI保持至少60%生物活性。

第1圖顯示藉由用NaCNBH3還原以形成烷氧基胺鍵來使肟鍵穩定。

第2圖顯示在使用一級胺之經修飾加百利合成之兩步有機反應中合成含有兩個活性胺氧基之3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。

第3圖顯示以聚乙二醇化A1PI獲得之藥代動力學概況。

治療蛋白質之藥理學及免疫學性質可藉由化學修飾及與諸如本文所述之聚合物化合物進行偶聯來改良。本揭示案提供製備具有生物活性及相對於非偶聯治療蛋白質具有延長半衰期之治療偶聯物的材料及方法。所得偶聯物之性質通常在很大程度上視聚合物之結構及大小而定。因此，具有經界定及較窄大小分佈之聚合物通常在此項技術中為較佳的。如PEG之合成聚合物可容易地以較窄大小分佈來製造，同時PSA可以產生具有較窄大小分佈之最終PSA製劑的方式來純化。另外，具有經界定之聚合物鏈及較窄大小分佈之聚乙二醇化試劑已上市並且可以合理的價格購得。

製備治療蛋白質偶聯物之方法

如本文所述，本揭示案提供製備治療蛋白質偶聯物之方法。本揭 示案提供之方法之各種組成部分，例如，治療蛋白質、水溶性聚合物、還原劑及其類似物質，以及該等方法提供之各種條件，例如，反應時間及各種組成部分之濃度在下文得以描述。

在本揭示案之一實施例中，治療蛋白質與硫醇還原劑接觸以在治療蛋白質上產生經還原之半胱胺酸巰基。在另一實施例中，具有經還原之半胱胺酸巰基之治療蛋白質與水溶性聚合物接觸以產生治療蛋白質偶聯物。在各種實施例中，使水溶性聚合物與治療蛋白質進行偶聯之反應步驟個別地及「依序地」得以執行。舉例而言，諸如治療蛋白質、硫醇還原劑、及水溶性聚合物等之起始材料及試劑在個別反應步驟之間分開(亦即，治療蛋白質首先還原，繼而移除還原劑，然後與水溶性聚合物接觸)。在另一實施例中，根據本揭示案完成偶聯反應所必需之起始材料及試劑在單一容器中(「同時」)執行。

在本揭示案之各種實施例中，巰基-(SH)特異性試劑(例如，具有SH-特異性/相容性端基或連接物之水溶性聚合物)與存在於治療蛋白質上之SH基團偶聯。在各種實施例中，SH基團存在於治療蛋白質之半胱胺酸殘基上。在本揭示案提供之方法中，治療蛋白質包含多個(例如，一個以上)半胱胺酸殘基，但是此等半胱胺酸殘基中僅一個可接近並且因此可用於與水溶性聚合物進行偶聯。例如，治療蛋白質可在其自然產生之胺基酸序列中具有多個半胱胺酸殘基。然而，此治療蛋白質具有不超過一個如下所述之可接近半胱胺酸SH基團。根據本揭示案之各種實施例，此治療蛋白質在使得水溶性聚合物與可接近的巰基偶聯而不干擾存在於治療蛋白質中之二硫橋鍵的條件下位點特異性地與水溶性聚合物偶聯。

根據本揭示案之各種實施例並且如所下文進一步描述，治療蛋白質之胺基酸序列可自然地在半胱胺酸殘基上含有單一(亦即，一個)可接近的SH基團。或者，治療蛋白質之胺基酸序列可使用標準分子生物技術來修飾以在半 胱胺酸殘基上含有單一可接近的SH基團。當出現例如以下情況時，此修飾可為必要的：(i)治療蛋白質之天然(即，野生型)胺基酸序列不包含半胱胺酸殘基；(ii)治療蛋白質之胺基酸序列包含多個半胱胺酸殘基，但是其全部涉及二硫橋鍵或在其他方面不可接近(例如，埋藏於折疊蛋白質中)；(iii)治療蛋白質之胺基酸序列包含多個半胱胺酸殘基，且此等半胱胺酸殘基中一個以上為可接近的。在上述情形(ii)及(iii)中，本揭示案涵蓋使用標準分子生物技術來對經修飾之胺基酸序列進行工程化，從而產生具有單一可接近的SH基團之治療蛋白質。或者，本揭示案涵蓋使用標準化學技術來修飾治療蛋白質，從而產生具有單一可接近的SH基團之治療蛋白質。

舉例而言，本揭示案提供使用SH-特異性試劑(例如MAL-PEG)對治療蛋白質(例如，A1PI)進行聚乙二醇化之方法，其在存在溫和還原劑(例如TCEP)的情況下執行。此方法可以同時方法或替代地使用依序方式(首先還原，然後偶聯)來執行。SH-特異性試劑包括但不限於馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸、鄰吡啶-二硫化物(OPSS)及碘乙醯胺。

在本發明之各種實施例中，提供上述方法，其中任何水溶性聚合物與治療蛋白質偶聯。

在本發明之各種實施例中，提供上述方法，其中治療蛋白質含有一個可接近的自由SH基團，其不涉及二硫橋鍵。在各種實施例中，具有一個自由可接近的SH基團之治療蛋白質及肽藉由重組DNA技術方法(即，蛋白質之胺基酸序列經修飾以使得僅一個可接近的SH基團存在於蛋白質上)來製備。在本揭示案之各種實施例中，絲胺酸蛋白酶抑制因子諸如A1PI(α-1蛋白酶抑制因子)、或A1AT(α-1-抗胰蛋白酶)、ATR(α-1-抗胰蛋白酶相關蛋白質)、AACT或ACT(α-1-抗胰凝乳蛋白酶)、PI4(蛋白酶抑制因子4)、PCI或PROCI(蛋白質C抑制因子)、CBG(皮質類固醇結合球蛋白)、TBG(甲狀腺素結合球蛋白)、AGT(血管緊縮素 原)、中心粒蛋白、PZI(蛋白質Z-依賴性蛋白酶抑制因子)、PI2(蛋白酶抑制因子2)、PAI2或PLANH2(纖溶酶原激活物抑制因子-2)、SCCA1(鱗狀細胞癌抗原1)、SCCA2(鱗狀細胞癌抗原2)、PI5(蛋白酶抑制因子5)、PI6(蛋白酶抑制因子6)、梅根蛋白、PI8(蛋白酶抑制因子8)、PI9(蛋白酶抑制因子9)、PI10(蛋白酶抑制因子10)、埃披蛋白、湯古蛋白、PI13(蛋白酶抑制因子13)、PI8L1(蛋白酶抑制因子8樣1)、AT3或ATIII(抗凝血酶-III)、HC-II或HCF2(肝素輔因子II)、PAI1或PLANH1(纖溶酶原激活物抑制因子-1)、PN1(蛋白酶連接蛋白I)、PEDF(色素上皮細胞衍生因子)、PLI(胞漿素抑制因子)、C1IN或C1INH(血漿蛋白酶C1抑制因子)、CBP1(膠原結合蛋白1)、CBP2(膠原結合蛋白2)、PI12(蛋白酶抑制因子12)、及PI14(蛋白酶抑制因子14)及血液凝固蛋白質諸如因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、血管性血友病因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶預期可在所描述之方法中使用。

治療蛋白質

如本文所述，術語治療蛋白質係指表現出與治療蛋白質相關之生物活性之任何治療蛋白質分子。在本揭示案之一實施例中，治療蛋白質分子為全長蛋白質。在本揭示案之各種實施例中，治療蛋白質可自其天然來源產生及純化。或者，根據本揭示案，術語「重組治療蛋白質」包括經由重組DNA技術獲得之任何治療蛋白質。在某些實施例中，該術語包括如本文所述之蛋白質。

如本文所使用，「內源性治療蛋白質」包括來源於欲接受治療之哺乳動物的治療蛋白質。該術語亦包括自轉殖基因或存在於該哺乳動物中之任何其他外來DNA轉錄的治療蛋白質。如本文所使用，「外源性治療蛋白質」包括並非來源於欲接受治療之哺乳動物的凝血蛋白質。

如本文所使用，「血漿衍生治療蛋白質」或「血漿性」包括在自 具有參與凝血途徑之性質之哺乳動物獲得的血液中發現之所有形式蛋白質，例如凝血蛋白質。

如本文所揭示，添加水溶性聚合物為改良治療蛋白質之性質的一種途徑。在本揭示案之某些實施例中，多肽由以下治療蛋白質例示：酶、抗原、抗體、受體、凝血蛋白質、生長因子、激素、及配體。

在某些實施例中，治療蛋白質為絲胺酸蛋白酶抑制因子蛋白質家族之成員(例如，A1PI(α-1蛋白酶抑制因子)、或A1AT(α-1-抗胰蛋白酶)、ATR(α-1-抗胰蛋白酶相關蛋白質)、AACT或ACT(α-1-抗胰凝乳蛋白酶)、PI4(蛋白酶抑制因子4)、PCI或PROCI(蛋白質C抑制因子)、CBG(皮質類固醇結合球蛋白)、TBG(甲狀腺素結合球蛋白)、AGT(血管緊縮素原)、中心粒蛋白、PZI(蛋白質Z-依賴性蛋白酶抑制因子)、PI2(蛋白酶抑制因子2)、PAI2或PLANH2(纖溶酶原激活物抑制因子-2)、SCCA1(鱗狀細胞癌抗原1)、SCCA2(鱗狀細胞癌抗原2)、PI5(蛋白酶抑制因子5)、PI6(蛋白酶抑制因子6)、梅根蛋白、PI8(蛋白酶抑制因子8)、PI9(蛋白酶抑制因子9)、PI10(蛋白酶抑制因子10)、埃披蛋白、湯古蛋白、PI13(蛋白酶抑制因子13)、PI8L1(蛋白酶抑制因子8樣1)、AT3或ATIII(抗凝血酶-III)、HC-II或HCF2(肝素輔因子II)、PAI1或PLANH1(纖溶酶原激活物抑制因子-1)、PN1(蛋白酶連接蛋白I)、PEDF(色素上皮細胞衍生因子)、PLI(胞漿素抑制因子)、C1IN或C1INH(血漿蛋白酶C1抑制因子)、CBP1(膠原結合蛋白1)、CBP2(膠原結合蛋白2)、PI12(蛋白酶抑制因子12)，及PI14(蛋白酶抑制因子14))。絲胺酸蛋白酶抑制因子係折疊成保守結構並且使用獨特的自殺受質樣抑制機制之蛋白質超家族(300-500個胺基酸大小)(Silverman,G.A.等人，J.Biol.Chem.,276(36)：33293-33296(2001)；全部以引用方式併入)。

在某些實施例中，治療蛋白質為凝血因子蛋白質家族之成員(例如，因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、血管性血友病因子(VWF)、 因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶)。

在各種實施例中，治療蛋白質具有一個或一個以上半胱胺酸殘基。在一實施例中，其中治療蛋白質僅具有一個半胱胺酸殘基，該半胱胺酸殘基包含經完全或部分氧化之可接近巰基。半胱胺酸上之此巰基基團雖然不涉及與治療蛋白質之胺基酸序列中之另一半胱胺酸殘基的二硫鍵，但是其可在純化之後與「自由」半胱胺酸殘基或任何其他含硫化合物(例如，麩胱甘肽)結合。如本文揭示，治療蛋白質上之此半胱胺酸之還原增加例如將水溶性聚合物與半胱胺酸上之巰基偶合的效率。

在另一實施例中，治療蛋白質含有一個以上半胱胺酸，但是僅具有一個包含經完全或部分氧化之可接近巰基的半胱胺酸殘基(即，僅一個半胱胺酸殘基不涉及與治療蛋白質之胺基酸序列中之另一半胱胺酸殘基的二硫鍵或在其他方面例如歸因於蛋白質內或蛋白質之間之相互作用，諸如由於蛋白質折疊或形成二聚體而得以埋藏及其類似情況而變得不可接近)。

在各種實施例中，半胱胺酸殘基可被添加或自治療蛋白質之胺基酸序列移除，從而使得可根據本揭示案進行水溶性物質之偶聯。全部以引用方式併入之美國專利第5,766,897號描述在一般情況下「半胱胺酸-聚乙二醇化蛋白質」之產生。下文討論多肽變體、類似物及衍生物。

本文提供之治療蛋白質不應視為排他的。實際上，如自本文提供之本揭示案顯而易知，本揭示案之方法可適用於其中根據本揭示案需要連接水溶性聚合物的任何蛋白質。例如，治療蛋白質描述於US 2007/0026485中，其全部以引用方式併入本文。

A1PI

在一實施例中，根據本揭示案中提供之方法將A1PI與水溶性聚 合物偶聯。A1PI(α1-蛋白酶抑制因子或A1PI或阿爾法1-抗胰蛋白酶或α1-抗胰蛋白酶或A1AT)為存在於人類血漿中之394個胺基酸之52kD醣蛋白(Carrell,R.W.等人，Nature 298(5872)：329-34(1982)；UniProtKB/Swiss-Prot登錄號P01009)。人類α1-抗胰蛋白酶之結構及變化。藉由轉譯後修飾將一個碳水化合物鏈(N-聚糖)添加至三個ß-天冬醯胺殘基中之每一個(Brantly,Am.J.Respir.Cell.Mol.Boil.,27：652-654(2002))。A1PI藉由由三個非編碼內含子及四個編碼外顯子組成之人類染色體14q31-32,3上之12.2kb基因編碼。

兩個胺基酸Met358-Ser359為蛋白質之活性中心。A1PI主要在肝細胞中合成，但是A1PI之蛋白質生物合成，繼而釋放至血流中亦在單核吞噬細胞、腸細胞及肺之上皮細胞中發生(NN.,Am.J.Respir.Crit.Care Med.,168：818-900(2003),Travis,J.及Salvesen,G.S.,Annu.Rev.Biochem.,52：655-709(1983))。

A1PI可在整個身體組織中被偵測到，但是在肺中具有特定生理顯著性。由於肺與吸入空氣之較大接觸表面所引起之大量持久細胞防禦事件導致周圍肺泡組織中之高度活性蛋白酶之釋放增加。若蛋白酶與抑制因子之間之平衡由於遺傳引起之A1PI表達不足或有毒物質諸如香煙煙霧而發生偏移，則NE可能破壞肺泡細胞。此可導致形成危及生命之肺氣腫，一種慢性阻塞性肺病/COPD(Klebe,g.,Spektrum，第2版，351-366(2009))。

分別全部以引用方式併入之WO 2005/027821及美國專利第5,981,715號、第6,284,874號及第5,616,693號揭示純化A1PI之方法。美國專利第5,981,715號亦揭示A1PI替換或A1PI增強療法。A1PI缺乏係由很多等位基因變體顯示之常染色體隱性遺傳性病症並且在被指定為蛋白酶抑制因子(Pi)系統之等位基因排列中予以表徵。此等等位基因已基於在不同個體之血清中出現之α-1-PI水準來分組。正常個體具有α-1-PI之正常血清水準(正常個體被指定為具有PiMM 表型)。有缺陷的個體具有平均正常水準之35%以下之血清α-1-PI水準(此等個體被指定為具有PiZZ表型)。空(Null)個體在其血清中偵測不到A1PI蛋白質(此等個體被指定為具有Pi(null)(null)表型)。

A1PI缺乏由A1PI之較低血清(平均正常水準之35%以下)及肺水準來表徵。此等有缺陷的個體具有患上全腺泡型肺氣腫之高風險。此肺氣腫在呈現PiZZ、PiZ(null)及Pi(null)(null)表型之個體中佔主導地位。該病狀之症狀通常在患病個體之生命之三十多歲至四十多歲期間顯現。

與A1PI缺乏相關之肺氣腫由於下呼吸道中之用以抑制嗜中性白血球彈性蛋白酶之A1PI濃度不足，導致肺實質結締組織構架之破環而產生。患有A1PI缺乏之個體具有針對嗜中性白血球在其下呼吸道中釋放之嗜中性白血球彈性蛋白酶之極少保護。A1PI缺乏個體中之蛋白酶：蛋白酶抑制因子之此失衡導致肺實質及肺泡壁之慢性損害，並且最終導致破環。

患有嚴重A1PI缺乏之個體通常呈現小於50mg/dl之內源性血清A1PI水準，如藉由商業標準所確定。患有此等低血清A1PI水準之個體在生命期內具有大於80%之患上肺氣腫之風險。據估計在美國，至少40,000名患者或全部肺氣腫患者之2%由於編碼A1PI之基因之缺陷而患有此疾病。A1PI缺乏代表美國及歐洲白種人的一種最常見之致死性遺傳性病症。

患有A1PI缺乏之患者之療法涉及替換或增強血清中之A1PI水準。若A1PI之血清水準增加，此預期將導致肺中之較高濃度，由此矯正肺中之嗜中性白血球彈性蛋白酶：A1PI失衡並且防止或減緩肺組織之破環。正常及A1PI缺乏群體之研究已提示最小保護性血清A1PI水準為80mg/dl或11μM(約57mg/dl；使用純標準)。因此，A1PI缺乏患者中之大多數增強療法旨在提供A1PI之最小保護性血清水準，因為血清A1PI為肺泡A1PI之來源。

自從二十世紀八十年代中期以來，A1PI製劑已可用於治療用 途。主要用途為先天性A1PI缺乏之增強(替換)療法。人類A1PI在活體內之半衰期為4.38天，標準偏差為1.27天。每週60mg A1PI/kg體重之目前建議劑量可將A1PI之較低血清水準恢復至高於11μM或80mg/dl之保護性臨界水準的水準。

全部以引用方式併入之美國專利第4,496,689號揭示與A1PI共價連接之水溶性聚合物。其他公開案揭示水溶性聚合物與A1PI之單一半胱胺酸殘基之偶聯(Cantin,A.M.等人，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.,27：659-665(2002)；Tyagi,S.C.,J.Biol.Chem.,266：5279-5285(1991))。

FVII

在一實施例中，根據本揭示案中提供之方法將FVII與水溶性聚合物偶聯。FVII(亦稱為穩定因子或前轉化素)為在止血及凝血中起關鍵作用之維生素K依賴性絲胺酸蛋白酶醣蛋白(Eigenbrot,Curr Protein Pept Sci.2002；3：287-99)。

FVII在肝中合成並且以48kD之單鏈醣蛋白形式得以分泌。FVII與所有維生素K依賴性絲胺酸蛋白酶醣蛋白共有相似的蛋白質域結構，其由以下域組成：胺基末端γ-羧基麩胺酸(GL)域，其具有9-12個負責蛋白質與脂質膜之相互作用之殘基；羧基末端絲胺酸蛋白酶域(催化域)；及兩個表皮生長因子樣域，其含有介導與組織因子之相互作用的鈣離子結合位點。γ-麩胺醯基羧化酶催化分子之胺基末端部分中之Gla殘基的羧化。羧化酶之作用視還原形式之維生素K而定，該維生素K經氧化成環氧化物形式。維生素K環氧化物還原酶為將環氧化物形式之維生素K轉化回還原形式所需。

主要比例之FVII在血漿中以酶原形式循環，並且此形式之活化導致精胺酸152與異白胺酸153之間之肽鍵裂解。由此產生的活化FVIIa由經由單一二硫鍵(Cys 135至Cys 262)連接之NH2衍生輕鏈(20kD)及COOH末端衍生重鏈(30kD)組成。輕鏈含有膜結合Gla域，而重鏈含有催化域。

由基因及環境因子確定之FVII之血漿濃度為約0.5mg/mL(Pinotti 等人，Blood.2000；95：3423-8)。不同FVII基因型可導致平均FVII水準中之若干倍之差異。血漿FVII水準在健康女性之妊娠期間升高，亦隨著年齡而增加並且在女性及患有高三酸甘油脂血症之人中較高。FVII具有所有促凝血因子中最短之半衰期(3-6h)。FVIIa之平均血漿濃度在健康個體中為3.6ng/mL並且與其他凝血因子相比，FVIIa之循環半衰期相對較長(2.5h)。

遺傳性FVII缺乏為罕見常染色體隱性出血病症，在一般人群中之發病率估計為每500,000人中之1個病例(Acharya等人，J Thromb Haemost.2004；2248-56)。來自抑制因子之獲得性FVII缺乏亦非常罕見。亦已報道所發生之缺乏與諸如頭孢菌素、青黴素及口服抗凝血劑之藥物相聯繫的病例。此外，已報道獲得性FVII缺乏自發發生或與諸如骨髓瘤、敗血症、再生障礙性貧血之其他病狀一起、與介白素-2及抗胸腺細胞球蛋白療法一起發生。

參考FVII多核苷酸及多肽序列包括例如關於基因組序列之GenBank登錄號J02933、關於cDNA之M13232(Hagen等人PNAS 1986；83：2412-6)，及關於多肽序列之P08709(參考文獻全部併入本文)。FVII之各種多態性已得以描述，例如參見Sabater-Lleal等人(Hum Genet.2006；118：741-51)(參考文獻全部併入本文)。

因子IX

FIX為維生素K-依賴性血漿蛋白質，其藉由在存在鈣離子、磷脂及FVIIIa的情況下將FX轉化為其活性形式來參與凝血之內在途徑。FIX之主要催化能力為充當具有針對FX內之特定精胺酸-異白胺酸鍵之特異性的絲胺酸蛋白酶。FIX活化藉由FXIa發生，該FXIa導致活化肽自FIX切除以產生活化FIX分子，其包含由一或多個二硫鍵保持之兩個鏈。FIX中之缺陷引起隱性X-連鎖B型血友病。

A型及B型血友病為分別以FVIII及FIX多肽缺乏為特徵之遺傳疾 病。該等缺乏之潛在原因常常為皆位於X染色體上之FVIII及FIX基因中之突變的結果。血友病之傳統療法通常涉及靜脈內投與來自正常個體之彙集血漿或半純化凝血蛋白質。此等製劑可能被病原體或病毒諸如傳染性朊病毒、HIV、細小病毒、A型肝炎及C型肝炎所污染。因此，迫切需要不要求使用人類血清之治療劑。

FIX活性之降低水準與B型血友病之嚴重程度成正比例。B型血友病之當前治療由藉由血漿衍生或重組之FIX來替換缺失之蛋白質所組成(所謂FIX取代或替換治療或療法)。

FIX之多核苷酸及多肽序列可發現於例如UniProtKB/Swiss-Prot登錄號P00740、美國專利第6,531,298號中。

因子VIII

凝血因子VIII(FVIII)在血漿中以非常低濃度循環，並且與血管性血友病因子(VWF)非共價結合。止血期間，FVIII自VWF分離並且藉由在存在鈣及磷脂或細胞膜的情況下增強活化速率來充當活化因子IX(FIXa)介導之FX活化的輔因子。

FVIII以具有域結構A1-A2-B-A3-C1-C2之約270-330kD之單鏈前體形式加以合成。當自血漿純化時(例如，「血漿衍生」或「血漿性」)，FVIII由重鏈(A1-A2-B)及輕鏈(A3-C1-C2)組成。輕鏈之分子質量為80kD，而歸因於B域內之蛋白分解，重鏈在90-220kD範圍內。

FVIII亦作為在出血病症中用於治療用途之重組蛋白形式加以合成。已設計各種活體外檢測以確定重組FVIII(rFVIII)作為治療藥物之潛在功效。此等檢測模擬內源性FVIII之活體內效應。FVIII之活體外凝血酶治療引起其促凝血活性之快速增加及隨後降低，如活體外檢測所量測。此活化及鈍化與皆在重鏈及輕鏈中之特定有限的蛋白分解一致，其改變FVIII中之不同結合表位之可用性，例如使得FVIII可自VWF分離並且與磷脂表面結合或改變與某些單株抗體之 結合能力。

FVIII之缺乏或機能不良與最常見的出血病症，A型血友病相關。用於控制A型血友病之首選治療為以血漿衍生或rFVIII濃縮物進行之替換療法。FVIII水準低於1%之患有嚴重A型血友病之患者通常接受預防療法以便在各劑量之間保持FVIII高於1%。考慮到各種FVIII產物在循環中之平均半衰期，此結果可通常藉由每週給予FVIII兩至三次來達成。

參考多核苷酸及多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-ProtP00451(FA8_HUMAN)；Gitschier J等人，Characterization of the human Factor VIII gene,Nature,312(5992)：326-30(1984)；Vehar GH等人，Structure of human Factor VIII,Nature,312(5992)：337-42(1984)；Thompson AR.Structure and Function of the Factor VIII gene and protein,Semin Thromb Hemost,2003：29；11-29(2002)。

血管性血友病因子

血管性血友病因子(VWF)為以一系列大小在約500至20,000kD範圍內之多聚體形式在血漿中循環之醣蛋白。多聚體形式之VWF由藉由二硫鍵連接在一起之250kD多肽次單元組成。VWF介導最***小板附著至受損血管壁之內皮下層。僅僅較大多聚體表現出止血活性。據推測，內皮細胞分泌較大聚合物形式之VWF並且彼等具有低分子量形式之VWF(低分子量VWF)來自蛋白裂解。具有較大分子質量之多聚體被儲存於內皮細胞之Weibel-Pallade體中並且在受刺激後釋出。

VWF由內皮細胞及巨核細胞合成為基本上由重複域組成之前原VWF。在信號肽裂解後，前VWF經由其C-末端區域之二硫鍵發生二聚化。二聚體充當藉由自由端末端之間之二硫鍵控制之多聚化的原體。在組裝成多聚體後進行前肽序列之蛋白分解移除(Leyte等人，Biochem.J.274(1991),257-261)。

自VWF之選殖cDNA預測之初級轉譯產物為2813-殘基前體多肽(前原VWF)。前原VWF由22胺基酸信號肽及741胺基酸前肽組成，其中成熟VWF包含2050個胺基酸(Ruggeri Z.A.及Ware,J.,FASEB J.,308-316(1993)。

VWF中之缺陷引起血管性血友病(VWD)，其係以顯著性或高或低之出血表型為特徵。3型VWD為VWF完全缺失之最嚴重形式，而1型VWD涉及VWF之定量損失並且其表型可能非常輕微。2型VWD涉及VWF之定性缺陷並且可能與3型VWD一樣嚴重。2型VWD具有許多亞形式，一些形式與高分子量多聚體之損失或減少相關。2a型血管性血友病(VWD-2A)係以中間及較大多聚體二者之損失為特徵。VWD-2B係以最高分子量多聚體之損失為特徵。與VWF相關之其他疾病及病症在此項技術中為已知的。

前原VWF之多核苷酸及胺基酸序列可分別以GenBank登錄號NM_000552及NP_000543獲得。

根據本發明之其他凝血蛋白質描述於此項技術中，例如Mann KG,Thromb Haemost,1999；82：165-74。

A. 多肽

在一態樣中，本揭示案之起始材料為蛋白質或多肽。所涵蓋之治療蛋白質分子包括全長蛋白質、全長蛋白質之前體、全長蛋白質之生物活性次單元或片段，以及此等形式之治療蛋白質中任一者之生物活性衍生物及變體。因此，治療蛋白質包括以下彼等：(1)所具有之胺基酸序列在至少約25、約50、約100、約200、約300、約400或更多個胺基酸之區域上具有與本文所述之參考核酸或胺基酸序列所編碼之多肽大於約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%或更大胺基酸序列一致性；及/或(2)特異性結合至針對包含如本文所述之參考胺基酸序列的免疫原、其免疫原性片段，及/或其保守修飾變體所 產生之抗體，例如多株或單株抗體。

如本文所使用之「生物活性衍生物」、「生物活性片段」、「生物活性類似物」或「生物活性變體」包括具有與某一分子實質上相同功能及/或生物性質(諸如結合性質)及/或相同結構基礎(諸如肽骨架或基礎聚合物單元)的該分子之任何衍生物或片段或類似物或變體。

諸如「變體」或「衍生物」之「類似物」為與自然產生之分子在結構上實質上相似並且具有相同生物活性之化合物，儘管在某些情況下程度不同。

「衍生物」例如為一種類型之類似物並且係指與參考多肽共有相同或實質上相似結構的經修飾(例如，以化學方法)的多肽。

多肽變體例如為一種類型之類似物並且係指與參考多肽(即，「原生多肽」或「原生治療蛋白質」)共有實質上相似結構並且具有相同生物活性的多肽。變體與變體所衍生於之自然產生之多肽相比，基於涉及以下之一或多種突變而在其胺基酸序列之組成上有所不同：(i)在多肽之一或多個末端及/或自然產生之多肽序列之一或多個內部區域(例如，片段)中缺失一或多個胺基酸殘基，(ii)在多肽之一或多個末端(通常為「添加」或「融合」)及/或自然產生之多肽序列之一或多個內部區域(通常為「***」)中***或添加一或多個胺基酸、或(iii)在自然產生之多肽序列中將一或多個胺基酸由其他胺基酸取代。

變體多肽包括***變體，其中一或多個胺基酸殘基添加至本揭示案之治療蛋白質胺基酸序列。***可位於蛋白質之任一末端或兩個末端，且/或可定位於治療蛋白質胺基酸序列之內部區域中。在任一末端或兩個末端具有額外殘基的***變體包括例如融合蛋白質及包含胺基酸標簽或其他胺基酸標記之蛋白質。在一態樣中，治療蛋白質分子視情況含有N-末端Met，尤其當分子重組表達於細菌細胞諸如大腸桿菌中時。

在缺失變體中，如本文所述之治療蛋白質多肽中之一或多個胺基酸殘基被移除。缺失可在治療蛋白質多肽之一個或兩個末端，且/或藉由移除治療蛋白質胺基酸序列內之一或多個殘基來實現。因此，缺失變體包括治療蛋白質多肽序列之片段。

在取代變體中，治療蛋白質多肽之一或多個胺基酸殘基被移除並且以替代殘基來替換。在一態樣中，取代在性質上為保守的，並且此類型之保守取代在此項技術中為熟知的。或者，本揭示案包涵亦為非保守之取代。示範性保守取代描述於Lehninger,[Biochemistry,第2版；Worth Publishers,Inc.,New York(1975)，第71-77頁]中並且直接在下文闡明。

保守取代

或者，示範性保守取代直接在下文闡明。

保守取代II

如本文所述，在各種實施例中，治療蛋白質經修飾以引入或缺失半胱氨酸、醣化位點，或其他胺基酸，以便獲得相容側鏈用於定向水溶性聚合物連接。此修飾可使用在此項技術中已知的標準分子生物技術來實現並且可重組實現(例如，工程化胺基酸序列以缺失或***一或多個半胱氨酸)以使得經純化的修飾蛋白質包含所需序列。或者，此修飾可在產生及純化蛋白質之後在活體外實現。

B. 多核苷酸

編碼本揭示案之治療蛋白質的核酸包括(例如但不限於)基因、前mRNA、mRNA、cDNA、多態變體、等位基因、合成及自然產生之突變體。

編碼本揭示案之治療蛋白質的多核苷酸亦包括但不限於以下彼等：(1)在嚴格雜交條件下與編碼如本文所述之參考胺基酸序列，及其保守修飾變體的核酸特異性雜交；(2)所具有之核酸序列在至少約25、約50、約100、約150、約200、約250、約500、約1000、或更多個核苷酸(直至成熟蛋白質之1218個核苷酸之全長序列)之區域上具有與如本文所述之參考核酸序列大於約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或更高核苷酸序列一致性。示範性「嚴格雜交」條件包括在50%甲醯胺、5X SSC、20mMNa˙PO4，pH 6.8中在42℃下雜交；及在1X SSC中在55℃下清洗30分鐘。應理解可基於待雜交之序列之長度及GC核苷酸含量對此等示範性條件作出改變。此項技術中之公式標準適合於確定合適之雜交條件。參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)§§ 9.47-9.51。

C. 治療蛋白質之產生

「自然產生」之多核苷酸或多肽序列通常來自哺乳動物，包括但不限於靈長類動物，例如人類；齧齒動物，例如大鼠、小鼠、倉鼠；牛、豬、 馬、綿羊，或任何哺乳動物。本揭示案之核酸及蛋白質可為重組分子(例如，異源並且編碼野生型序列或其變體，或非自然產生)。在各種實施例中，自然產生之治療蛋白質係自由人類獲得之血液或血漿樣品純化。

治療蛋白質之產生包括在此項技術中已知用於執行以下步驟之任何方法：(i)藉由遺傳工程來產生重組DNA，(ii)藉由例如但不限於轉染、電穿孔或顯微注射將重組DNA引入原核或真核細胞中，(iii)培養該等轉型細胞，(iv)例如原構性或在誘導後表達治療蛋白質，及(v)例如自培養基或藉由收穫經轉型之細胞來分離該凝血蛋白質，以便獲得經純化的治療蛋白質。

在其他態樣中，治療蛋白質藉由在特徵為可產生藥理可接受的凝血蛋白質分子之合適原核或真核宿主系統中表達來產生。真核細胞的實例為哺乳動物細胞，諸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2。

多種載體經用於製備治療蛋白質並且選自真核及原核表達載體。用於原核表達之載體之實例包括質體，諸如但不限於pRSET、pET及pBAD，其中用於原核表達載體中之啟動子包括但不限於以下中之一或多種：lac、trc、trp、recA，或araBAD。用於真核表達之載體的實例包括：(i)用於在酵母中表達之載體諸如但不限於pAO、pPIC、pYES，或pMET，其使用啟動子諸如但不限於AOX1、GAP、GAL1，或AUG1；(ii)用於在昆蟲細胞中表達之載體諸如但不限於pMT、pAc5、pIB、pMIB，或pBAC，其使用啟動子諸如但不限於pH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64，或polh，及(iii)用於在哺乳動物細胞中表達之載體諸如但不限於pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3，或pBPV，及在一態樣中源自病毒系統之載體諸如但不限於牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒，或逆轉錄病毒，其使用啟動子諸如但不限於CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV，及β-肌動蛋白。

D. 投與

在一實施例中，本揭示案之偶聯治療蛋白質可藉由注射，諸如靜脈內、肌肉內或腹膜內注射來投與。

為了將包含本揭示案之偶聯治療蛋白質的組合物投與人類或測試動物，在一態樣中，組合物包含一或多種藥學上可接受的載體。術語「藥學」或「藥理可接受」係指分子實體及組合物為穩定的，可抑制蛋白質降解諸如聚集及裂解產物，並且另外如下所述在使用此項技術中熟知之途徑投與時不產生過敏，或其他不良反應。「藥學上可接受的載體」包括任何及所有臨床適用之溶劑、分散介質、塗料、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延緩劑及其類似試劑，包括以上揭示之彼等試劑。

如本文所使用，「有效量」包括適合於治療疾病或病症或減輕疾病或病症之症狀的劑量。在一實施例中，「有效量」包括適合於治療患有導致如本文所述之A1PI缺乏的常染色體隱性病症之哺乳動物之劑量。在一實施例中，「有效量」包括適合於治療患有如本文所述之出血病症之哺乳動物的劑量。如本文所使用，「有效量」亦包括適合於治療患有如本文所述之出血病症之哺乳動物的劑量。

組合物可經口、局部、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、***、直腸、或顱內注射投與。如本文所使用之術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射，或輸注技術。亦涵蓋藉由靜脈內、真皮內、肌肉內、***內、腹膜內、鞘內、眼球後、肺內注射及或手術植入於特定位點來投與。通常，組合物基本上無熱原，以及可能對接受者有害之其他雜質。

可以治療醫師選擇之劑量水準及模式來執行組合物之單次或多次投與。為了預防或治療疾病，合適劑量視如上所述之待治療之疾病之類型、疾病之嚴重程度及過程、投與藥物是出於預防還是治療目的、先前療法、患者之臨床史及對於藥物之反應，及主治醫師之裁量而定。

本揭示案亦涉及包含有效量之如本文定義之偶聯治療蛋白質的醫藥組合物。醫藥組合物可進一步包含藥學上可接受的載體、稀釋劑、鹽、緩衝劑，或賦形劑。醫藥組合物可用於治療以上定義之出血病症。本揭示案之醫藥組合物可為溶液或凍乾產物。醫藥組合物之溶液可經受任何適合的凍乾過程。

作為另一態樣，本揭示案包括套組，其包含以有助於本揭示案之組合物用於投與受試者之方式包裝之本揭示案之組合物。在一實施例中，此套組包含包裝於容器諸如密封瓶或器皿中的本文所述之化合物或組合物(例如，包含偶聯治療蛋白質之組合物)，該容器具有標簽貼附於其上或包含於包裝中以描述化合物或組合物於實施該方法中的用法。在一實施例中，套組含有：具有包含偶聯治療蛋白質之組合物的第一容器及具有用於第一容器中之組合物的生理可接受的重構溶液之第二容器。在一態樣中，化合物或組合物以單位劑型來包裝。套組可還包括適合於根據特定投與途徑來投與組合物之裝置。較佳地，套組含有描述治療蛋白質或肽組合物之用法的標簽。

水溶性聚合物

在本揭示案之一實施例中，治療蛋白質偶聯物分子結合至水溶性聚合物，其包括但不限於聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二醛酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)及其功能衍生物。

根據本揭示案之各種實施例，水溶性聚合物可藉由連接功能連接 物或特異性及所需要之端基化學來進行修飾或衍生以使得此水溶性聚合物衍生物能夠以位點特異性方式連接至治療蛋白質(具有至少一個與此端基化學相容的可接近位點)。例如，本揭示案涵蓋水溶性聚合物功能衍生物，諸如N-羥基琥珀醯亞胺酯-PEG(NHS-PEG)、PEG碳酸鹽、PEG醛、胺氧基-PEG、PEG醯肼(PEG-Hz)、PEG肼、PEG馬來醯亞胺(MAL-PEG)、PEG硫醇(PEG-SH)、胺基PEG(PEG-NH2)、羧基PEG(PEG-COOH)、羥基PEG(PEG-OH)、PEG環氧化物、經氧化PSA、胺氧基-PSA、PSA醯肼、PEG乙烯碸、PEG鄰吡啶-二硫化物(OPSS)、PEG碘乙醯胺、PEG苯并***、PSA-SH、MAL-PSA、PSA醯肼、PSA肼及PSA-NH2。

在本揭示案之一實施例中，水溶性聚合物具有350至150,000、500至100,000、1000至80,000、1500至60,000、2,000至45,000Da、3,000至35,000Da、及5,000至25,000Da之分子量範圍。在各種實施例中，水溶性聚合物為具有10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、或80,000Da之分子量的PEG或PSA。在一實施例中，水溶性聚合物為具有20,000Da之分子量的PEG或PSA。

在一實施例中，治療蛋白質衍生物保持原生治療蛋白質產物之全部功能活性，並且與原生治療蛋白質產物相比，提供活體內之延長半衰期。在本揭示案之另一實施例中，相對於原生治療蛋白質之活體內半衰期，構築體之半衰期減少或增加為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍。

在另一實施例中，相對於原生凝血蛋白質，治療蛋白質衍生物保持至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56,57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、或150百分比(%)生物活性。

在一實施例中，例如偶聯A1PI蛋白質及原生A1PI蛋白質之生物活性藉由嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制能力檢測來確定(Travis J,Johnson D(1981)：Method Enzymol 80,754-764)。

在一實施例中，衍生物及原生凝血蛋白質(例如，FVII)之生物活性藉由發色活性與凝血因子抗原值之比率(凝血因子：Chr：凝血因子：Ag)來確定。

A. 唾液酸及PSA

PSA由N-乙醯神經胺酸之聚合物(通常均聚物)組成。二級胺基通常承載乙醯基，但是其可替代地承載羥乙醯基。羥基上之可能取代基包括乙醯基、乳醯基、乙基、硫酸酯，及磷酸酯基團。

N-乙醯神經胺酸Neu5Ac

唾液酸(N-乙醯神經胺酸)之結構

PSA及經修飾PSA(mPSA)通常包含基本上由藉由2,8-或2,9-糖苷鍵或此等之組合(例如交替2,8-及2,9-鍵)連接之N-乙醯神經胺酸部分組成之線性聚合物。在尤佳之PSA及mPSA中，糖苷鍵為α-2,8。此類PSA及mPSA便利地自多聚唾液酸衍生，並且在本文中稱為「CA」及「mCA」。典型PSA及mPSA包含至少2個、較佳至少5個、更佳至少10個及最佳至少20個N-乙醯神經胺酸部分。因此，其可包含2至300個N-乙醯神經胺酸部分、較佳5至200個N-乙醯神經胺酸部分，或最佳10至100個N-乙醯神經胺酸部分。PSA及CA較佳基本上不含除N- 乙醯神經胺酸以外的糖部分。因此，PSA及CA較佳包含至少90%、更佳至少95%及最佳至少98%N-乙醯神經胺酸部分。

當PSA及CA包含除N-乙醯神經胺酸以外的部分(例如在mPSA及mCA中)時，此等部分較佳位於聚合物鏈之一個或兩個末端處。此類「其他」部分可例如為藉由氧化或還原自末端N-乙醯神經胺酸部分衍生之部分。

例如，WO 2001/087922描述非還原末端N-乙醯神經胺酸單元藉由與過碘酸鈉反應而轉化為醛基之此類mPSA及mCA。另外，WO 2005/016974描述還原末端N-乙醯神經胺酸單元經受還原以將還原末端N-乙醯神經胺酸單元處之環還原性打開，由此形成鄰位二醇基團，繼而藉由氧化以將鄰接的二醇基團轉化為醛基的此類mPSA及mCA。

可自在非還原末端含有單一醛基之氧化PSA製備不同PSA衍生物。胺氧基PSA之製備描述於下文實例5中，PSA馬來醯亞胺之製備描述於下文實例14中。含有末端胺基之PSA-NH2可藉由與NH4Cl之還原性胺化來製備並且含有末端巰基之PSA-SH藉由使PSA-NH2與2-亞胺基硫烷(特勞特試劑(Traut’s reagent))反應來製備，兩種程序描述於US 7,645,860B2中。PSA肼可根據US 7,875,708B2藉由使經氧化PSA與肼反應來製備。PSA醯肼可藉由使經氧化PSA與己二酸二醯肼反應來製備(WO 2011/012850A2)。

多聚唾液酸(N-乙醯神經胺酸之均聚物)之結構

多聚唾液酸(PSA之子類)為具有α(2→8)酮苷鍵之N-乙醯神經胺 酸(NANA)之均聚物，並且尤其由擁有K1抗原之大腸桿菌之特定菌株產生。多聚唾液酸具有許多生理功能。其為藥物及化妝品之重要原料。

聚唾液酸化與未經修飾天冬醯胺酶之活體內比較研究揭示聚唾液酸化可增加酶之半衰期(Fernandes及Gregoriadis,Biochimica Biophysica Acta 1341：26-34,1997)。

如本文所使用，「唾液酸部分」包括唾液酸單體或聚合物(「多醣」)，其可溶於水溶液或懸浮液中並且在以藥學有效量投與PSA-凝血蛋白質偶聯物後，對於哺乳動物幾乎沒有負面影響，諸如副作用。在一態樣中，聚合物表徵為具有1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、或500個唾液酸單元。在某些態樣中，將不同唾液酸單元在一個鏈中加以組合。

在本揭示案之一實施例中，多醣化合物之唾液酸部分具有高度親水性，並且在另一實施例中，整個化合物具有高度親水性。親水性主要由唾液酸單元之懸垂羧基、以及羥基來賦予。醣單元可含有其他官能基，諸如胺、羥基或硫酸酯基團，或其組合。此等基團可存在於自然產生之醣化合物上，或引入衍生多醣化合物中。

自然產生之聚合物PSA可獲得其顯示廣泛大小分佈(例如Sigma C-5762)及高多分散性(PD)之多分散製劑。因為多醣通常在帶有共純化內毒素之固有風險的細菌中產生，所以純化長唾液酸聚合物鏈可提高內毒素含量增加的可能性。亦可合成製備具有1-4個唾液酸單元之短PSA分子(Kang SH等人，Chem Commun.2000；227-8；Ress DK and Linhardt RJ,Current Organic Synthesis.2004；1：31-46)，由此將較高內毒素水準之風險減少到最低限度。然而，現在可製造亦不含內毒素之具有窄大小分佈及低多分散性的PSA製劑。在一態樣中，特定用於本揭示案之多醣化合物為由細菌產生之彼等者。此等自然產生之多醣中之 一些被稱為醣脂。在一實施例中，多醣化合物實質上不含末端半乳糖單元。

B. 聚乙二醇(PEG)及聚乙二醇化

在某些態樣中，治療蛋白質藉由多種化學方法中之任一者與水溶性聚合物偶聯(Roberts JM等人，Advan Drug Delivery Rev 2002；54：459-76)。例如，在一實施例中，治療蛋白質藉由使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯使PEG與蛋白質之自由胺基偶聯來得以修飾。在另一實施例中，例如PEG之水溶性聚合物使用馬來醯亞胺化學或在先前氧化之後使PEG醯肼或PEG胺與治療蛋白質之碳水化合物部分偶合而與自由SH基團偶合。

在一態樣中，偶聯藉由在形成穩定鍵下使水溶性聚合物與治療蛋白質直接偶合(或經由連接物系統偶合)來執行。另外，在本揭示案之某些態樣中使用可降解、可釋放或可水解之連接物系統(Tsubery等人，J Biol Chem 2004；279：38118-24/Greenwald等人，J Med Chem 1999；42：3657-67/Zhao等人，Bioconj Chem 2006；17：341-51/WO2006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2)。

在本揭示案之各種實施例中，治療蛋白質藉由使用含有諸如琥珀酸琥珀醯亞胺基酯、戊二酸琥珀醯亞胺基酯或丙酸琥珀醯亞胺基酯之活性N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)的聚乙二醇衍生物經由離胺酸殘基來得以修飾。此等衍生物在溫和條件下藉由形成穩定醯胺鍵而與治療蛋白質之離胺酸殘基反應。另外，離胺酸殘基可藉由在NaCNBH3存在下以PEG醛進行還原性胺化以形成二級胺鍵而得以修飾。碳水化合物殘基(主要為N-聚糖)可在先前氧化之後以胺氧基PEG或PEG醯肼修飾。蛋白質中之自由SH基團可與PEG馬來醯亞胺、PEG乙烯碸、PEG鄰吡啶-二硫化物及PEG碘乙醯胺反應。PEG化學之概述由Roberts等人給出(Adv Drug Deliv Rev 2002；54：459-76)。

在本揭示案之各種實施例中，PEG衍生物之鏈長為5,000Da。在 各種實施例中使用具有500至2,000Da、2,000至5,000Da、大於5,000直至10,000Da或大於10,000直至20,000Da、或大於20,000直至150,000Da之鏈長的其他PEG衍生物，包括線性及分支結構。在本揭示案之一實施例中，PEG衍生物之鏈長為20,000Da。

胺基之聚乙二醇化的替代方法為(不限於)藉由形成胺基甲酸酯鍵而與PEG碳酸酯進行化學偶聯，或藉由形成二級醯胺鍵之還原性胺化而與醛或酮反應。

在本揭示案之各種實施例中，治療蛋白質分子使用可購得之PEG衍生物來進行化學修飾。在替代態樣中，此等PEG衍生物具有線性或分支結構。下文列出含有NHS基團的PEG-衍生物之實例。

以下PEG衍生物為可自Nektar Therapeutics購得之彼等PEG衍生物之非限制實例(Huntsville,Ala.；參見www.nektar.com/PEG reagent catalog；Nektar Advanced PEGylation,price list 2005-2006)：

mPEG-丙酸琥珀醯亞胺基酯(mPEG-SPA)

mPEG-α-甲基丁酸琥珀醯亞胺基酯(mPEG-SMB)

mPEG-CM-HBA-NHS(CM=羧甲基；HBA=羥基丁酸)

分支PEG-衍生物(Nektar Therapeutics)之結構：

分支PEG N-羥基琥珀醯亞胺(mPEG2-NHS)

具有分支結構之此試劑由Kozlowski等人更詳細地描述(BioDrugs 2001；5：419-29)。

PEG衍生物之其他非限制實例可自NOF Corporation購得(日本東京；參見www.nof.co.jp/english：Catalogue 2005)

線性PEG-衍生物(NOF Corp.)之一般結構：

X=羧甲基

X=羧戊基

x=琥珀酸酯

x=戊二酸酯

分支PEG-衍生物(NOF Corp.)之結構：2,3-雙(甲基聚氧基伸乙基-氧基)-1-(1,5-二側氧基-5-琥珀醯亞胺基氧基，戊氧基)丙烷

2,3-雙(甲基聚氧基伸乙基-氧基)-1-(琥珀醯亞胺基羧基戊氧基)丙烷

此等丙烷衍生物顯示具有1,2取代模式之甘油骨架。在本揭示案中，亦涵蓋基於具有1,3取代之甘油結構的分支PEG衍生物或在US2003/0143596A1中描述之其他分支結構。

亦涵蓋如Tsubery等人(J Biol Chem 2004；279：38118-24)及Shechter等人(WO04089280A3)所描述之具有可降解物(例如，可水解連接物)之PEG衍生 物。

C. 羥烷基澱粉(HAS)及羥乙基澱粉(HES)

在本揭示案之各種實施例中，治療蛋白質分子使用羥烷基澱粉(HAS)或羥乙基澱粉(HES)或其衍生物來進行化學修飾。

HES為自然產生之支鏈澱粉(amylopectin)之衍生物並由體內之α-澱粉酶降解。HES為以多達95重量%之濃度存在於玉米澱粉中之碳水化合物聚合物支鏈澱粉之經取代的衍生物。HES表現出有利的生物性質並且用作血量替換劑以及在診所中用於血液稀釋療法中(Sommermeyer等人，1987,Krankenhauspharmazie,8(8),271-278；及Weidler等人，1991,Arzneim.-Forschung/Drug Res.,41,494-498)。

支鏈澱粉由葡萄糖部分組成，其中在主鏈中存在α-1,4-糖苷鍵並且在分支位點發現α-1,6-糖苷鍵。此分子之物理-化學性質主要由糖苷鍵之類型決定。由於鏈裂α-1,4-糖苷鍵，產生每匝約六個葡萄糖單體之螺旋狀結構。聚合物之物理化學以及生物化學性質可經由取代來進行修飾。羥乙基之引入可經由鹼性羥乙基化作用來達成。藉由修改反應條件，可利用未經取代的葡萄糖單體中之相應羥基關於羥乙基化作用的不同反應性。由於此事實，熟習此項技術者能夠在有限的範圍內影響取代模式。

HAS係指由至少一個羥烷基取代之澱粉衍生物。因此，術語羥烷基澱粉不限於末端碳水化合物部分包含羥烷基R1、R2、及/或R3之化合物，而且係指存在於末端碳水化合物部分及/或澱粉分子之其餘部分HAS'中之任何位置的至少一個羥基由羥烷基R1、R2或R3取代的化合物。

烷基可為可適當經取代的線性或分支烷基。較佳地，羥烷基含有1至10個碳原子，更佳1至6個碳原子，更佳1至4個碳原子，甚至更佳2-4個碳原子。因此，「羥烷基澱粉」較佳包括羥乙基澱粉、羥丙基澱粉及羥丁基澱粉，其中羥乙基澱粉及羥丙基澱粉尤佳。

包含兩個或兩個以上不同羥烷基之羥烷基澱粉亦包括於本揭示案中。包含於HAS中之至少一個羥烷基可含有兩個或兩個以上羥基。根據一實施例，包含於HAS中之至少一個羥烷基含有一個羥基。

術語HAS亦包括其中烷基經單或多取代之衍生物。在一實施例中，烷基經鹵素、尤其氟取代，或經芳基取代，限制條件為HAS保持可溶於水。此外，羥烷基之末端羥基可經酯化或醚化。HAS衍生物描述於全部以引用方式併入之WO/2004/024776中。

D. 連接方法

治療蛋白質可藉由熟習此項技術者己知之各種技術中之任一者與多醣化合物共價連接。

水溶性聚合物之偶合可藉由與蛋白質直接偶合或經由連接物分子來執行。化學連接物之一實例為含有碳水化合物選擇性醯肼及巰基反應性馬來醯亞胺基團之MBPH(4-[4-N-馬來醯亞胺基苯基]丁酸醯肼)(Chamow等人，J Biol Chem 1992；267：15916-22)。其他示範性及較佳連接物於下文描述。

在本揭示案之各種態樣中，唾液酸部分例如藉由在以引用的方式併入本文之美國專利第4,356,170號中描述之方法結合至治療蛋白質，例如，白蛋白、A1PI、FVIIa或絲胺酸蛋白酶抑制因子或凝血因子蛋白質家族之其他成員。

使PSA與多肽偶合之其他技術亦為己知的並且由本揭示案涵蓋。例如，美國公開案第2007/0282096號描述使例如PSA之胺或醯肼衍生物與蛋白質偶聯。另外，美國公開案第2007/0191597號描述含有用於與受質(例如，蛋 白質)之還原末端反應之醛基的PSA衍生物。此等參考文獻全部以引用方式併入。

另外，各種方法在美國專利第5,846,951號(全部以引用方式併入)之第7欄第15行至第8欄第5行予以揭示。示範性技術包括經由凝血蛋白質或多醣任一者上之羧基與凝血蛋白質或多醣之胺基之間之肽鍵的鍵合，或凝血蛋白質或多醣之羧基與治療蛋白質或多醣之羥基之間之酯鍵。治療蛋白質藉以與多醣化合物共價鍵結之另一鍵合係經由凝血蛋白質上之自由胺基與藉由過碘酸鹽氧化在多醣之非還原末端處形成之醛基之間反應的希夫鹼(Jennings HJ及Lugowski C,J Immunol.1981；127：1011-8；Fernandes AI and Gregoriadis G,Biochim Biophys Acta.1997；1341；26-34)。在一態樣中，所產生之希夫鹼藉由以NaCNBH3特異性還原以形成二級胺來穩定化。替代方法係藉由在先前氧化之後以NH4Cl還原性胺化來產生PSA中之末端自由胺基。雙官能試劑可用於連接兩個胺基或兩個羥基。例如，含有胺基之PSA藉由如BS3(雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯/Pierce，Rockford，IL)之試劑來與蛋白質之胺基偶合。另外，如磺基-EMCS(N-ε-馬來醯亞胺己醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯/Pierce)之異雙官能交聯試劑用於例如連接胺及硫醇基團。

在另一方法中，製備PSA醯肼並且將其在先前氧化及產生醛官能基之後與蛋白質之碳水化合物部分偶合。

如上所述，治療蛋白質之自由胺基與唾液酸殘基之1-羧基反應以形成肽鍵或在1-羧酸基團與凝血蛋白質上之羥基或其他合適活性基團之間形成酯鍵。或者，羧基與脫乙醯化5-胺基形成肽鍵，或治療蛋白質分子之醛基與唾液酸殘基之N-脫乙醯化5-胺基形成希夫鹼。

只要反應基團對於PEG及PSA而言為相同的，以上描述即可適用於PEG。

或者，水溶性聚合物以非共價方式與治療蛋白質締合。例如，在 一態樣中，水溶性聚合物與藥學活性化合物經由疏水性相互作用相連接。其他非共價締合包括靜電相互作用，其中帶相反電荷的離子彼此吸引。

在各種實施例中，治療蛋白質以化學計量之量(例如，1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：7、1：8、1：9，或1：10等)與水溶性聚合物連接或締合。在各種實施例中，1-6、7-12或13-20水溶性聚合物與治療蛋白質連接。在其他實施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個水溶性聚合物與治療蛋白質連接。在一實施例中，單一水溶性聚合物與治療蛋白質連接。在另一實施例中，單一水溶性聚合物經由半胱胺酸殘基與治療蛋白質連接。

此外，治療蛋白質，在經由一或多個碳水化合物部分與水溶性聚合物偶聯之前，可在活體內或活體外醣化。此等醣化位點可充當蛋白質與水溶性聚合物偶聯之靶標(美國專利申請案第20090028822號、美國專利申請案第2009/0093399號、美國專利申請案第2009/0081188號、美國專利申請案第2007/0254836號、美國專利申請案第2006/0111279號，及DeFrees S.等人，Glycobiology,2006,16,9,833-43)。

E. 胺氧基鍵

在一實施例中，在製備凝血蛋白質之偶聯物中採用使羥胺或羥胺衍生物與醛(例如，在藉由過碘酸鈉進行氧化之後的碳水化合物部分上)反應以形成肟基。例如，醣蛋白(例如，根據本揭示案之已經醣化或能夠醣化之治療蛋白質)首先以諸如過碘酸鈉(NaIO4)之氧化劑氧化(Rothfus JA及Smith EL.,J Biol Chem 1963,238,1402-10；及Van Lenten L and AshwellG.,J Biol Chem 1971,246,1889-94)。醣蛋白之過碘酸鹽氧化係基於描述於1928年之經典馬蘭潑拉德(Malaprade)反應，即以過碘酸鹽來氧化鄰位二醇以形成活性醛基(Malaprade L.,Analytical application,Bull Soc Chim France,1928,43,683-96)。此類氧化劑之其 他實例為四乙酸鉛(Pb(OAc)4)、乙酸錳(MnO(Ac)3)、乙酸鈷(Co(OAc)2)、乙酸鉈(TlOAc)、硫酸鈰(Ce(SO4)2)(US 4,367,309)或過釕酸鉀(KRuO4)(Marko等人，J Am Chem Soc 1997,119,12661-2)。「氧化劑」意謂能夠在生理反應條件下使碳水化合物中之鄰位二醇氧化，從而產生活性醛基的溫和氧化性化合物。

第二步驟為使含有胺氧基之聚合物與經氧化碳水化合物部分偶合以形成肟鍵。在本揭示案之各種實施例中，此步驟可在催化量之親核催化劑苯胺或苯胺衍生物存在下執行(Dirksen A及Dawson PE,Bioconjugate Chem.2008；Zeng Y等人，Nature Methods 2009；6：207-9)。苯胺催化作用極大地加速肟連接反應，使得可使用非常低濃度之該等試劑。在本揭示案之另一實施例中，肟鍵藉由用NaCNBH3還原以形成烷氧基胺鍵而得以穩定化(第1圖)。其他催化劑於下文描述。

在各種實施例中，使水溶性聚合物與治療蛋白質偶聯之反應步驟個別及依序地執行(即，起始材料(例如，治療蛋白質、水溶性聚合物等)、試劑(例如，氧化劑、苯胺等)及反應產物(例如，治療蛋白質上之經氧化碳水化合物，經活化胺氧基水溶性聚合物等)在個別反應步驟之間分開)。在另一實施例中，根據本揭示案用於完成偶聯反應所必需之起始材料及試劑(例如，治療蛋白質、水溶性聚合物、硫醇還原劑、氧化劑等)在單一容器中執行(亦即，「同時反應」)。在一實施例中，將原生治療蛋白質與胺氧基-聚合物試劑混合。隨後，添加氧化劑並且執行偶聯反應。

對於胺氧基技術之額外資訊可發現於分別全部併入之以下參考文獻中：EP1681303A1(羥烷基澱粉化促紅細胞生成素)；WO 2005/014024(藉由肟連接基團連接之聚合物與蛋白質之偶聯物)；WO96/40662(含有胺氧基之連接化合物及其在偶聯物中之應用)；WO 2008/025856(修飾蛋白質)；Peri F等人，Tetrahedron 1998,54,12269-78；Kubler-Kielb J及Pozsgay V.,J Org Chem 2005, 70,6887-90；Lees A等人，Vaccine 2006,24(6),716-29；及Heredia KL等人，Macromoecules 2007,40(14),4772-9。

在各種實施例中，根據本文所述之胺氧基技術與治療蛋白質(例如，A1PI、FVIIa或絲胺酸蛋白酶抑制因子或凝血因子蛋白質家族之其他成員)之經氧化碳水化合物部分連接之水溶性聚合物包括但不限於聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、硫酸皮膚素、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHE)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。

親核催化劑

在各種實施例中，水溶性聚合物與治療蛋白質之偶聯可藉由苯胺或苯胺衍生物催化。苯胺有力地催化醛及酮與胺之水性反應以形成穩定亞胺諸如腙及肟。下圖將未經催化之肟連接反應與苯胺催化之肟連接反應進行比較(Kohler JJ,ChemBioChem 2009；10：2147-50)：

雖然苯胺催化作用可加速肟連接反應，從而允許較短反應時間及使用較低濃度之胺氧基試劑，但是苯胺具有毒性，當例如將經偶聯之治療蛋白質用於形成製藥基礎時，必須考慮到此情況。例如，苯胺已被證明可誘導變性血紅素血症(Harrison,J.H..及Jollow,D.J.,Molecular Pharmacology,32(3)423-431,1987)。大鼠之長期飲食治療已被證明可誘導脾中之腫瘤(Goodman,DG.等人，J Natl Cancer Inst.,73(1)：265-73,1984)。活體外研究亦顯示苯胺具有誘導染色體突變之潛力並且具有潛在基因毒性活性(Bombhard E.M.及Herbold B,Critical Reviews in Toxicology 35,783-835,2005)。

在各種實施例中，提供苯胺衍生物作為替代肟連接催化劑。此類苯胺衍生物包括但不限於鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、磺胺 酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺，及對茴香胺。

在各種實施例中，間甲苯胺(m-toluidine)(亦稱為間甲苯胺(meta-toluidine)、間甲基苯胺、3-甲基苯胺，或3-胺基-1-甲苯)用於催化本文所述之偶聯反應。間甲苯胺及苯胺具有相似物理性質及基本上相同的pKa值(間甲苯胺：pKa 4.73，苯胺：pKa 4.63)。

本揭示案之親核催化劑可用於肟連接反應(例如，使用胺氧基鍵)或腙形成(例如，使用醯肼化學)。在本揭示案之各種實施例中，在偶聯反應中提供0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、或50mM之濃度的親核催化劑。在各種實施例中，提供1至10mM之間之親核催化劑。在本揭示案之各種實施例中，偶聯反應之pH值範圍為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0及7.5。在一實施例中，pH在5.5至6.5之間。

還原劑

在本發明之各種實施例中，溫和還原步驟係用以還原治療蛋白質之可接近的半胱胺酸殘基，從而使得具有巰基-特異性基團之水溶性聚合物可與治療蛋白質偶聯。如本文揭示，還原劑或「硫醇還原劑」包括但不限於參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、硼氫化鈉(NaBH4)、氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、β-巰基乙醇(BME)及鹽酸半胱胺酸。

在各種實施例中，馬來醯亞胺基團(MAL)用於與半胱胺酸之硫醇(SH)基團進行偶聯。此類型修飾之一個基本先決條件為可接近的半胱胺酸經還原。然而，因為半胱胺酸側鏈通常在氧化狀態下以二硫鍵形式存在，所以藉由合適還原劑還原在偶聯之前執行。

根據本揭示案，還原劑以最低可能濃度使用以便防止原生形式之蛋白質之可能活性損失或解折疊(Kim等人，Bioconjugate Chem.,19：786-791(2008))。在另一實施例中，將乙二胺四乙酸(EDTA)添加至還原進料。此舉有助於保持經還原之SH基團之再氧化速率較低(Yang等人，Protein eng.,16：761-770(2003))。

雖然DTT及BME為最普及之還原劑，但是如本文揭示，TCEP提供具有溶液中之極好穩定性的有效還原劑的優勢。TCEP可還原經氧化之SH基團而不還原二硫橋鍵。蛋白質之結構不受影響，因而此試劑可用於「同時」方法中(在一鍋反應中同時進行還原及偶聯反應)(Hermanson GT,Bioconjugate Techniques.第2版，Elsevier,New York 2008)。

在本揭示案之一實施例中，經固定之TCEP還原凝膠(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)預期可用於「依序」方法中。

在各種實施例中，還原劑與SH基團(例如，存在於治療蛋白質上)之比率在等莫耳直至100倍(亦即，1：100，或100倍莫耳過量)之範圍內。在各種實施例中，還原劑之量相對於治療蛋白質濃度為1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍莫耳過量。

偶聯蛋白質之純化

在各種實施例中，已與氧化劑一起孵育之蛋白質及/或根據本揭示案已與水溶性聚合物進行偶聯之治療蛋白質需要純化。諸多純化技術在此項技術中為已知的，並且包括但不限於諸如離子交換層析、疏水性相互作用層析、體積排除層析及親和層析之層析方法或其組合、過濾方法，及沈澱方法(Guide to Protein Purification,Meth.Enzymology第463卷(由Burgess RR及Deutscher MP編)，第2版，Academic Press 2009)。

示範性實施例

本揭示案提供以下示範性實施例：

A1. 一種製備治療蛋白質偶聯物之方法，其包括使治療蛋白質、或其生物學活性片段與硫醇還原劑及水溶性聚合物在以下條件下接觸之步驟：(a)在該治療蛋白質上產生經還原之半胱胺酸巰基，及(b)使得該水溶性聚合物可與該經還原之半胱胺酸巰基偶聯；該治療蛋白質具有具備不超過一個可接近的半胱胺酸巰基之胺基酸序列。

A2. 如段落A1之方法，其中該治療蛋白質之胺基酸序列含有不超過一個半胱胺酸殘基。

A3. 根據段落A1至A2中任一段落之方法，其包括0.100與10.0克重之間之數量的治療蛋白質。

A4. 根據段落A1至A3中任一段落之方法，其中該可接近的半胱胺酸巰基存在於該治療蛋白質之原生胺基酸序列中。

A5. 根據段落A1至A3中任一段落之方法，其中治療蛋白質之該胺基酸序列經修飾以包含該可接近的半胱胺酸巰基。

A6. 根據段落A1及A3至A5中任一段落之方法，其中在該治療蛋白質上產生經還原之半胱胺酸巰基之條件不使該蛋白質之其他半胱胺酸胺基酸之間之二硫鍵還原。

A7. 根據段落A1至A6中任一段落之方法，其中該等條件防止在該硫醇還原劑與水溶性聚合物之間形成加合物。

A8. 根據段落A1至A7中任一段落之方法，其中該治療蛋白質為絲胺酸蛋白酶抑制因子。

A9. 根據段落A1至A7中任一段落之方法，其中該治療蛋白質為 凝血蛋白質。

本揭示案亦提供以下示範性實施例：

B1. 一種製備治療蛋白質偶聯物之方法，其包括以下步驟：使治療蛋白質或其生物學活性片段與硫醇還原劑在可使該治療蛋白質上之巰基得以還原之條件下接觸，及使水溶性聚合物與該治療蛋白質在使得該水溶性聚合物可與該經還原之巰基進行偶聯之條件下接觸；該治療蛋白質包含至少一個半胱胺酸殘基，及該治療蛋白質僅包含一個包含經完全或部分氧化之可接近巰基的半胱胺酸殘基，該僅一個半胱胺酸殘基不涉及與該治療蛋白質之胺基酸序列中之另一半胱胺酸殘基的二硫鍵。

B2. 根據段落B1之方法，其中該硫醇還原劑濃度相對於該治療蛋白質濃度為1與100倍之間莫耳過量。在一實施例中，該硫基還原劑濃度相對於該治療蛋白質濃度為1與10倍之間莫耳過量。

B3. 根據先前段落B1至B2中任一段落之方法，其中該治療蛋白質偶聯物之至少70%由單一水溶性聚合物構成。在一實施例中，該治療蛋白質偶聯物之10-100%由單一水溶性聚合物構成。

B4. 根據先前段落B1至B3中任一段落之方法，其還包括純化該治療蛋白質偶聯物之步驟。

B5. 根據段落B4之方法，其中該治療蛋白質偶聯物使用選自由以下組成之群之技術來純化：離子-交換層析、疏水性相互作用層析、體積排除層析及親和層析或其組合。

B6. 根據先前段落B1至B5中任一段落之方法，其中該治療蛋白質、水溶性聚合物及硫醇還原劑在單一容器中一起孵育，其中該經氧化之SH基 團之還原與該偶聯反應同時執行。

B7. 根據段落B1至B5中任一段落之方法，其中該硫醇還原劑在與該治療蛋白質一起孵育之後並且在將該治療蛋白質與該水溶性聚合物一起孵育之前得以移除，其中該經氧化之SH基團之還原與該偶聯反應依序執行。

B8. 根據先前段落B1至B7中任一段落之方法，其中該僅一個半胱胺酸殘基存在於該治療蛋白質之原生胺基酸序列中。

B9. 根據段落B1至B7中任一段落之方法，其中該治療蛋白質之胺基酸序列經修飾以包含該僅一個半胱胺酸殘基。

B10. 根據先前段落B1至B9中任一段落之方法，其中該治療蛋白質為醣蛋白。

B11. 根據段落B10之方法，其中該治療蛋白質在活體內經醣化。

B12. 根據段落B10之方法，其中該治療蛋白質在活體外經醣化。

B13. 根據先前段落B1至B12中任一段落之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加之半衰期。

B14. 根據段落B13之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加為至少1.5倍之半衰期。在一實施例中，該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加為至少1至10倍之半衰期。

B15. 根據先前段落B1至B14中任一段落之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少20%生物活性。

B16. 根據段落B15之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少60%生物活性。在一實施例中，該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持10%至100%之間之生物活性。

B17. 根據先前段落B1至B16中任一段落之方法，其中該硫醇還原劑選自由以下組成之群：參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、 二硫赤蘚糖醇(DTE)、硼氫化鈉(NaBH4)、氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、β-巰基乙醇(BME)、鹽酸半胱胺酸及半胱胺酸。

B18. 根據段落B17之方法，其中該硫醇還原劑為TCEP。

B19. 根據先前段落B1至B18中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：線性、分支或多臂水溶性聚合物。

B20. 根據先前段落B1至B19中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物具有3,000與150,000道爾頓(Da)之間之分子量。

B21. 根據段落B20之方法，其中該水溶性聚合物為線性並且具有10,000與50,000Da之間之分子量。在一實施例中，該水溶性聚合物為線性並且具有20,000之分子量。

B22. 根據先前段落B1至B21中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)，及其功能衍生物。

B23. 根據段落B22之方法，其中該水溶性聚合物經衍生以含有選自由以下組成之群之巰基特異性基團：馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸、鄰吡啶-二硫化物(OPSS)及碘乙醯胺。

B24. 根據段落B23之方法，其中該水溶性聚合物為PEG並且該巰基-特異性基團為MAL。

B25. 根據段落B23之方法，其中該水溶性聚合物為PSA並且該巰基-特異性基團為MAL。

B26. 根據先前段落B1至B25中任一段落之方法，其中該治療蛋白質選自由以下組成之群：α-1蛋白酶抑制因子(A1PI)、抗凝血酶III、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、人類血清白蛋白、醇脫氫酶、膽綠素還原酶、丁醯膽鹼酯酶、補體C5a、皮質醇結合蛋白、肌酸激酶、凝血因子V(FV)、凝血因子VII(FVII)、鐵蛋白、肝素輔因子、介白素2、蛋白質C抑制因子、組織因子及玻連蛋白。

在一實施例中，該治療蛋白質選自由以下組成之群：卵白蛋白、纖溶酶原-激活物抑制因子、神經絲抑蛋白、C1-抑制因子、連接蛋白、α-2-抗纖溶酶、肝素輔因子II、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-微球蛋白、凝血因子VIII(FVIII)，及凝血因子XIII(XIII)。

在另一實施例中，該治療蛋白質為選自由以下組成之群之絲胺酸蛋白酶抑制因子超家族之蛋白質：A1PI(α-1蛋白酶抑制因子)、或A1AT(α-1-抗胰蛋白酶)、ATR(α-1-抗胰蛋白酶相關蛋白質)、AACT或ACT(α-1-抗胰凝乳蛋白酶)、PI4(蛋白酶抑制因子4)、PCI或PROCI(蛋白質C抑制因子)、CBG(皮質類固醇結合球蛋白)、TBG(甲狀腺素結合球蛋白)、AGT(血管緊縮素原)、中心粒蛋白、PZI(蛋白質Z-依賴性蛋白酶抑制因子)、PI2(蛋白酶抑制因子2)、PAI2或PLANH2(纖溶酶原激活物抑制因子-2)、SCCA1(鱗狀細胞癌抗原1)、SCCA2(鱗狀細胞癌抗原2)、PI5(蛋白酶抑制因子5)、PI6(蛋白酶抑制因子6)、梅根蛋白、PI8(蛋白酶抑制因子8)、PI9(蛋白酶抑制因子9)、PI10(蛋白酶抑制因子10)、埃披蛋白、湯古蛋白、PI13(蛋白酶抑制因子13)、PI8L1(蛋白酶抑制因子8樣1)、AT3或ATIII(抗凝血酶-III)、HC-II或HCF2(肝素輔因子II)、PAI1或PLANH1(纖溶酶原激活物抑制因子-1)、PN1(蛋白酶連接蛋白I)、PEDF(色素上皮細胞衍生因子)、PLI(胞漿素抑制因子)、C1IN或C1INH(血漿蛋白酶C1抑制因子)、CBP1(膠原結合 蛋白1)、CBP2(膠原結合蛋白2)、PI12(蛋白酶抑制因子12)，及PI14(蛋白酶抑制因子14)。

在另一實施例中，該治療蛋白質為選自由以下組成之群之凝血因子蛋白質：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、血管性血友病因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。

B27. 根據段落B26之方法，其中該治療蛋白質為A1PI。

B28. 一種藉由根據先前段落B1至B27中任一段落之方法產生之治療蛋白質偶聯物。

B29. 一種製備A1PI偶聯物之方法，其包括以下步驟：使該A1PI與TCEP在使得該A1PI上之巰基得以還原之條件下接觸，及使經衍生以含有MAL基團之線性PEG與該A1PI在使得該水溶性聚合物可與該經還原之巰基進行偶聯之條件下接觸；該A1PI僅包含一個包含經完全或部分氧化之可接近巰基的半胱胺酸殘基，該僅一個半胱胺酸殘基不涉及與該A1PI之胺基酸序列中之另一半胱胺酸殘基的二硫鍵；該TCEP濃度相對於該A1PI濃度為3與4倍之間莫耳過量；其中該A1PI偶聯物之至少70%由單一水溶性聚合物構成；該A1PI偶聯物相對於原生A1PI具有增加之半衰期；及該A1PI偶聯物相對於原生A1PI保持至少60%生物活性。

B30. 一種製備絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之方法，其包括使水溶性聚合物或其功能衍生物與絲胺酸蛋白酶抑制因子或其生物學活性片段在允許偶聯之條件下接觸；該水溶性聚合物或其功能衍生物選自由以下組成之群：聚唾液酸 (PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)、N-羥基琥珀醯亞胺酯-PEG(NHS-PEG)、PEG碳酸鹽、PEG醛、胺氧基-PEG、PEG醯肼(PEG-Hz)、PEG肼、PEG硫醇(PEG-SH)、胺基PEG(PEG-NH2)、羧基PEG(PEG-COOH)、羥基PEG(PEG-OH)、PEG環氧化物、經氧化PSA、胺氧基-PSA、PSA醯肼(PSA-Hz)、PSA肼、PEG乙烯碸、PEG鄰吡啶-二硫化物(OPSS)、PEG碘乙醯胺、PEG苯并***、PSA硫醇(PSA-SH)、MAL-PSA及胺基PSA(PSA-NH2)。

該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子保持至少60%生物活性。

B31. 根據段落B30之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之至少70%由至少一種水溶性聚合物構成。在一實施例中，該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之10-100%由至少一種水溶性聚合物構成。

B32. 根據段落B30至B31中任一段落之方法，其進一步包括純化該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之步驟。

B33. 根據段落B32之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物使用選自由以下組成之群之技術來純化：離子-交換層析、疏水性相互作用層析、體積排除層析及親和層析或其組合。

B34. 根據段落B30至B33中任一段落之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子為醣蛋白。

B35. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子在活體內經醣化。

B36. 根據段落B34之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子在活體外經醣化。

B37. 根據段落B30至B36中任一段落之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加之半衰期。

B38. 根據段落B37之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生絲胺酸蛋白酶抑制因子具有增加為至少1.5倍之半衰期。在一實施例中，該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生絲胺酸蛋白酶抑制因子具有增加為1與10倍之間之半衰期。

B39. 根據段落B30至B38中任一段落之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少20%生物活性。

B40. 根據段落B39之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生絲胺酸蛋白酶抑制因子保持至少60%生物活性。在一實施例中，該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生絲胺酸蛋白酶抑制因子保持10與100%之間生物活性。

B41. 根據段落B30至B40中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：線性、分支或多臂水溶性聚合物。

B42. 根據段落B30至B41中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物具有3,000與150,000道爾頓(Da)之間之分子量。

B43. 根據段落B42之方法，其中該水溶性聚合物為線性並且具有10,000與50,000Da之間之分子量。

B44. 根據段落B30至B43中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物功能衍生物為PEG-NHS。

B45. 根據段落B30至B43中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物功能衍生物為胺氧基-PEG並且該絲胺酸蛋白酶抑制因子經醣化。

B46. 根據段落B30至B43中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物功能衍生物為胺氧基-PSA並且該絲胺酸蛋白酶抑制因子經醣化。

B47. 根據段落B45至B46中任一段落之方法，其中在與水溶性聚合物功能衍生物接觸之前，該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子之碳水化合物部分藉由與包含選自由以下組成之群之氧化劑的緩衝液一起孵育來氧化：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及過釕酸鉀(KRuO4)；其中在該經氧化之碳水化合物部分與該水溶性聚合物功能衍生物上之活性胺氧基之間形成肟鍵。

B48. 根據段落B47之方法，其中該氧化劑為過碘酸鈉(NaIO4)。

B49. 根據段落B46之方法，其中該胺氧基-PSA藉由使經活化之胺氧基連接物與經氧化之PSA反應來製備；其中該胺氧基連接物選自由以下組成之群：a)下式之3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺連接物： b)下式之3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺連接物： 及c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺連接物：

其中該PSA藉由與氧化劑一起孵育來氧化以在該PSA之非還原末端形成末端醛基。

B50. 根據段落B47至B49中任一段落之方法，其中使該經氧化之碳水化合物部分與該經活化之水溶性聚合物功能衍生物接觸係在包含選自由以 下組成之群之親核催化劑的緩衝液中進行：苯胺、鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、磺胺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺、對茴香胺及其衍生物。

B51. 根據段落B47至B50中任一段落之方法，其還包括藉由在包含選自由以下組成之群之還原性化合物的緩衝液中孵育該治療蛋白質來使該肟鍵還原的步驟：氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)及抗壞血酸(維生素C)。

B51A. 根據段落B30至B51中任一段落之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子為A1PI。

B52. 一種藉由根據段落B30至B51及B51A中任一段落之方法製備之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物。

B53. 一種治療蛋白質偶聯物，其包含：(a)包含至少一個半胱胺酸殘基之治療蛋白質或其生物學活性片段，該治療蛋白質僅包含一個包含經完全或部分氧化之可接近巰基的半胱胺酸殘基，該僅一個半胱胺酸殘基不涉及與該治療蛋白質之胺基酸序列中之另一半胱胺酸殘基的二硫鍵；及(b)一種結合至該治療蛋白質之該巰基的水溶性聚合物或其功能衍生物。

B54. 根據段落B53之治療蛋白質偶聯物，其中該僅一個半胱胺酸殘基存在於該治療蛋白質之原生胺基酸序列中。

B55. 根據段落B53之治療蛋白質偶聯物，其中該治療蛋白質之胺基酸序列經修飾以包含該僅一個半胱胺酸殘基。

B56. 根據段落B53至B55中任一段落之治療蛋白質偶聯物，其中該治療蛋白質為醣蛋白。

B57. 根據段落B56之治療蛋白質偶聯物，其中該治療蛋白質在活體內經醣化。

B58. 根據段落B56之治療蛋白質偶聯物，其中該治療蛋白質在活體內經醣化。

B59. 根據段落B53至B58中任一段落之治療蛋白質偶聯物，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加為至少1.5倍之半衰期。在一實施例中，該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加為至少1與10倍之間之半衰期。

B60. 根據段落B53至B59中任一段落之治療蛋白質偶聯物，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少60%生物活性。在一實施例中，該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少10%與100%之生物活性。

B61. 根據段落B53至B60中任一段落之治療蛋白質偶聯物，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：線性、分支或多臂水溶性聚合物。

B62. 根據段落B53至B61中任一段落之治療蛋白質偶聯物，其中該水溶性聚合物具有3,000與150,000道爾頓(Da)之間之分子量。

B63. 根據段落B53至B62中任一段落之治療蛋白質偶聯物，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)，及其功能衍生物。

B64. 根據段落B53至B63中任一段落之治療蛋白質偶聯物，其中該水溶性聚合物經衍生以含有選自由以下組成之群之巰基-特異性基團：馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸、鄰吡啶-二硫化物(OPSS)及碘乙醯胺。

B65. 根據段落B64之治療蛋白質偶聯物，其中該水溶性聚合物為PEG並且該巰基-特異性基團為MAL。

B66. 根據段落B64之治療蛋白質偶聯物，其中該水溶性聚合物為PSA並且該巰基-特異性基團為MAL。

B67. 根據段落B53至B66中任一段落之治療蛋白質偶聯物，其中該治療蛋白質選自由以下組成之群：A1PIα-1蛋白酶抑制因子(A1PI)、抗凝血酶III、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、人類血清白蛋白、醇脫氫酶、膽綠素還原酶、丁醯膽鹼酯酶、補體C5a、皮質醇結合蛋白、肌酸激酶、凝血因子V(FV)、凝血因子VII(FVII)、鐵蛋白、肝素輔因子、介白素2、蛋白質C抑制因子、組織因子及玻連蛋白。

在一實施例中，該治療蛋白質選自由以下組成之群：卵白蛋白、纖溶酶原-激活物抑制因子、神經絲抑蛋白、C1-抑制因子、連接蛋白、α-2-抗纖溶酶、肝素輔因子II、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-微球蛋白、凝血因子VIII(FVIII)，及凝血因子XIII(XIII)。

在另一實施例中，該治療蛋白質為選自由以下組成之群之絲胺酸蛋白酶抑制因子超家族之蛋白質：A1PI(α-1蛋白酶抑制因子)，或AIAT(α-1-抗胰蛋白酶)、ATR(α-1-抗胰蛋白酶相關蛋白質)、AACT或ACT(α-1-抗胰凝乳蛋白酶)、PI4(蛋白酶抑制因子4)、PCI或PROCI(蛋白質C抑制因子)、CBG(皮質類固醇結合球蛋白)、TBG(甲狀腺素結合球蛋白)、AGT(血管緊縮素原)、中心粒蛋白、PZI(蛋白質Z-依賴性蛋白酶抑制因子)、PI2(蛋白酶抑制因子2)、PAI2或PLANH2(纖溶酶原激活物抑制因子-2)、SCCA1(鱗狀細胞癌抗原1)、SCCA2(鱗 狀細胞癌抗原2)、PI5(蛋白酶抑制因子5)、PI6(蛋白酶抑制因子6)、梅根蛋白、PI8(蛋白酶抑制因子8)、PI9(蛋白酶抑制因子9)、PI10(蛋白酶抑制因子10)、埃披蛋白、湯古蛋白、PI13(蛋白酶抑制因子13)、PI8L1(蛋白酶抑制因子8樣1)、AT3或ATIII(抗凝血酶-III)、HC-II或HCF2(肝素輔因子II)、PAI1或PLANH1(纖溶酶原激活物抑制因子-1)、PN1(蛋白酶連接蛋白D、PEDF(色素上皮細胞衍生因子)、PLI(胞漿素抑制因子)、C1IN或C1INH(血漿蛋白酶C1抑制因子)、CBP1(膠原結合蛋白1)、CBP2(膠原結合蛋白2)、PI12(蛋白酶抑制因子12)，及PI14(蛋白酶抑制因子14)。

在另一實施例中，該治療蛋白質為選自由以下組成之群之凝血因子蛋白質：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、血管性血友病因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。

B68. 根據段落B67之治療蛋白質偶聯物，其中該治療蛋白質為A1PI。

B69. 一種絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其包含：(a)絲胺酸蛋白酶抑制因子或其生物學活性片段；及(b)至少一種結合至該絲胺酸蛋白酶抑制因子或其生物學活性片段之水溶性聚合物或其功能衍生物，該水溶性聚合物或其功能衍生物選自由以下組成之群：聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、右旋糖酐、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮 醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)、N-羥基琥珀醯亞胺酯-PEG(NHS-PEG)、PEG碳酸鹽、PEG醛、胺氧基-PEG、PEG醯肼(PEG-Hz)、PEG肼、PEG硫醇(PEG-SH)、胺基PEG(PEG-NH2)、羧基PEG(PEG-COOH)、羥基PEG(PEG-OH)、PEG環氧化物、經氧化PSA、胺氧基-PSA、PSA醯肼(PSA-Hz)、PSA肼、PEG乙烯碸、PEG鄰吡啶-二硫化物(OPSS)、PEG碘乙醯胺、PEG苯并***、PSA硫醇(PSA-SH)、MAL-PSA及胺基PSA(PSA-NH2)；該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子保持至少60%生物活性。

B70. 根據段落B69之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子為醣蛋白。

B71. 根據段落B70之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子在活體內經醣化。

B72. 根據段落B70之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子在活體外經醣化。

B73. 根據段落B69至B72中任一段落之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生絲胺酸蛋白酶抑制因子具有增加為至少1.5倍之半衰期。在一實施例中，該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生絲胺酸蛋白酶抑制因子具有增加為至少1與10倍之間之半衰期。

B74. 根據段落B69至B73中任一段落之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：線性、分支或多臂水溶性聚合物。

B75. 根據段落B69至B74中任一段落之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物具有3,000與150,000道爾頓(Da)之間之分子量。

B76. 根據段落B75之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水 溶性聚合物為線性並且具有10,000與50,000Da之間之分子量。在一實施例中，該水溶性聚合物為線性並且具有20,000Da之分子量。

B77. 根據段落B69至B76中任一段落之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物功能衍生物為PEG-NHS。

B78. 根據段落B69至B76中任一段落之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物功能衍生物為胺氧基-PEG並且該絲胺酸蛋白酶抑制因子經醣化。

B79. 根據段落B69至B76中任一段落之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物功能衍生物為胺氧基-PSA並且該絲胺酸蛋白酶抑制因子經醣化。

B80. 根據段落B69至B79中任一段落之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子選自由以下組成之群：A1PI、抗凝血酶III、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、卵白蛋白、纖溶酶原-激活物抑制因子、神經絲抑蛋白、C1-抑制因子、連接蛋白、α-2-抗纖溶酶及肝素輔因子II。

B81. 一種治療疾病之方法，其包括以有效治療該疾病之量投與如申請專利範圍第53至68項中任一項之治療蛋白質偶聯物。

B82. 一種治療疾病之方法，其包括以有效治療該疾病之量投與根據段落B69至B80中任一段落之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物。

B83. 一種包含醫藥組合物的套組，該醫藥組合物包含i)根據段落B53至B68中任一段落之治療蛋白質偶聯物；及ii)藥學上可接受的賦形劑；該醫藥組合物包裝於具有標簽之容器中，該標簽描述該醫藥組合物在治療疾病之方法中之用法。

B84. 一種包含醫藥組合物的套組，該醫藥組合物包含i)根據段落B69至B80中任一段落之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物；及ii)藥學上可接受的賦 形劑；該醫藥組合物包裝於具有標簽之容器中，該標簽描述該醫藥組合物在治療疾病之方法中之用法。

B85. 根據段落B83至B84中任一段落之套組，其中該醫藥組合物以單位劑型包裝。

本揭示案亦提供以下示範性實施例：

C1. 一種製備治療蛋白質偶聯物之方法，其包括以下步驟：使包含單一可接近及可氧化巰基之治療蛋白質與硫醇還原劑在使該巰基得以還原之條件下接觸，及使水溶性聚合物與該治療蛋白質在使得該水溶性聚合物可與該經還原之巰基進行偶聯之條件下接觸。

C1A. 根據段落C1之方法，其中該治療蛋白質選自由以下組成之群：α-1蛋白酶抑制因子(A1PI)、抗凝血酶III、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、卵白蛋白、纖溶酶原-激活物抑制因子、神經絲抑蛋白、C1-抑制因子、連接蛋白、α-2-抗纖溶酶、肝素輔因子II、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-微球蛋白、白蛋白、醇脫氫酶、膽綠素還原酶、丁醯膽鹼酯酶、補體C5a、皮質醇結合蛋白、肌酸激酶、因子V(FV)、因子VII(FVII)、鐵蛋白、肝素輔因子、介白素2、蛋白質C抑制因子、組織因子及玻連蛋白或其生物活性片段、衍生物或變體。

C1B. 根據段落C1至C1A中任一段落之方法，其中該硫醇還原劑選自由以下組成之群：參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、DTE、硼氫化鈉(NaBH4)，及氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)。

C1C. 根據段落C1至C1B中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、 硫酸皮膚素、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)，及其功能衍生物。

C2. 根據段落C1B之方法，其中該硫醇還原劑為TCEP。

C2A. 根據段落C2之方法，其中該治療蛋白質、水溶性聚合物及硫醇還原劑在單一容器中一起孵育。

C3. 根據段落C1至C2中任一段落之方法，其中該硫醇還原劑濃度相對於該治療蛋白質濃度為1-100之間莫耳過量。

C4. 根據段落C1至C3中任一段落之方法，其中該硫醇還原劑濃度相對於該治療蛋白質濃度為3倍莫耳過量。

C5. 根據段落C1至C4中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：線性、分支或多臂水溶性聚合物。

C6. 根據段落C5之方法，其中該水溶性聚合物具有3,000與150,000Da之間之分子量。

C7. 根據段落C6之方法，其中該水溶性聚合物為線性並且具有20,000Da之分子量。

C8. 根據段落C1至C7中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物為PEG。

C9. 根據段落C1至C7中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物為PSA。

C10. 根據段落C1至C9中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物經選自由以下組成之群之巰基-特異性試劑衍生：馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸、 鄰吡啶-二硫化物(OPSS)及碘乙醯胺。

C11. 根據段落C8之方法，其中該巰基-特異性試劑為MAL。

C12. 根據段落C11之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為MAL-PEG。

C13. 根據段落C11之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為MAL-PSA。

C14. 根據段落C1至C13中任一段落之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少20%生物活性。

C15. 根據段落C14之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少60%生物活性。

C16. 根據段落C1至C15中任一段落之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加之半衰期。

C17. 根據段落C16之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加為至少2倍之半衰期。

C18. 根據段落C1至C17中任一段落之方法，其中該治療蛋白質偶聯物包含單一水溶性聚合物。

C19. 根據段落C18之方法，其中該治療蛋白質偶聯物之至少20%由單一水溶性聚合物構成。

C20. 根據段落C1至C19中任一段落之方法，其中該單一可接近及可氧化巰基為半胱胺酸殘基上之巰基。

C21. 根據段落C20之方法，其中該半胱胺酸殘基存在於該治療蛋白質之原生胺基酸序列中。

C22. 根據段落C21之方法，其中該治療蛋白質係自人類血漿純化。

C23. 根據段落C22之方法，其中該治療蛋白質為自然醣化之A1PI。

C24. 根據段落C21之方法，其中該治療蛋白質在宿主細胞中重組產生。

C25. 根據段落C24之方法，其中該宿主細胞選自由以下組成之群：酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞，及細菌細胞。

C26. 根據段落C25之方法，其中自然醣化之治療蛋白質由該哺乳動物細胞產生。

C27. 根據段落C26之方法，其中由該哺乳動物細胞產生自然醣化之A1PI。

C28 根據段落C25之方法，其中該治療蛋白質由該細菌細胞產生。

C29. 根據段落C28之方法，其中該治療蛋白質在自該細菌細胞純化之後，在活體外經醣化。

C30. 根據段落C29之方法，其中A1PI在自該細菌細胞純化之後，在活體外經醣化。

C31. 根據段落C20之方法，其中該治療蛋白質之原生胺基酸序列經修飾以在該半胱胺酸殘基上包含單一可接近及可氧化巰基。

C32. 根據段落C31之方法，其中在該治療蛋白質之原生胺基酸序列中，一或多個半胱胺酸殘基經***、缺失或取代。

C33. 根據段落C32之方法，其中該治療蛋白質在宿主細胞中重組產生。

C34. 根據段落C33之方法，其中該宿主細胞選自由以下組成之群：酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞，及細菌細胞。

C35. 根據段落C34之方法，其中由該哺乳動物細胞產生自然醣化之治療蛋白質。

C36. 根據段落C34之方法，其中該治療蛋白質由該細菌細胞產生。

C37. 根據段落C36之方法，其中該治療蛋白質在自該細菌細胞純化之後，在活體外經醣化。

C38. 根據段落C1至C37中任一段落之方法，其還包括純化該治療蛋白質偶聯物之步驟。

C39. 根據段落C38之方法，其中該治療蛋白質偶聯物使用選自由以下組成之群之技術純化：離子-交換層析、疏水性相互作用層析、體積排除層析及親和層析或其組合。

C40. 一種藉由根據段落C1至C39中任一段落之方法產生之治療蛋白質偶聯物。

本揭示案亦提供以下示範性實施例：

D1. 一種製備醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之方法，其包括使水溶性聚合物與醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子在允許偶聯之條件下接觸；該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子保持至少20%生物活性；及該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子具有增加之半衰期。

D1A. 根據段落D1之方法，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子選自由以下組成之群：A1PI(α-1蛋白酶抑制因子)、或A1AT(α-1-抗胰蛋白酶)、ATR(α-1-抗胰蛋白酶相關蛋白質)、AACT或ACT(α-1-抗胰凝乳蛋白酶)、PI4(蛋白酶抑制因子4)、PCI或PROCI(蛋白質C抑制因子)、CBG(皮質類固醇結合球蛋 白)、TBG(甲狀腺素結合球蛋白)、AGT(血管緊縮素原)、中心粒蛋白、PZI(蛋白質Z-依賴性蛋白酶抑制因子)、PI2(蛋白酶抑制因子2)、PAI2或PLANH2(纖溶酶原激活物抑制因子-2)、SCCA1(鱗狀細胞癌抗原1)、SCCA2(鱗狀細胞癌抗原2)、PI5(蛋白酶抑制因子5)、PI6(蛋白酶抑制因子6)、梅根蛋白、PI8(蛋白酶抑制因子8)、PI9(蛋白酶抑制因子9)、PI10(蛋白酶抑制因子10)、埃披蛋白、湯古蛋白、PI13(蛋白酶抑制因子13)、PI8L1(蛋白酶抑制因子8樣1)、AT3或ATIII(抗凝血酶-III)、HC-II或HCF2(肝素輔因子II)、PAI1或PLANH1(纖溶酶原激活物抑制因子-1)、PN1(蛋白酶連接蛋白I)、PEDF(色素上皮細胞衍生因子)、PLI(胞漿素抑制因子)、C1IN或C1INH(血漿蛋白酶C1抑制因子)、CBP1(膠原結合蛋白1)、CBP2(膠原結合蛋白2)、PI12(蛋白酶抑制因子12)，及PI14(蛋白酶抑制因子14)。

D1B. 根據段落D1至D1A中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)，及其功能衍生物。

D1C. 根據段落D1B之方法，其中該水溶性聚合物衍生物選自由以下組成之群：N-羥基琥珀醯亞胺酯-PEG(NHS-PEG)、PEG碳酸鹽、PEG醛、胺氧基-PEG、PEG醯肼(PEG-HZ)、PEG肼、PEG馬來醯亞胺(MAL-PEG)、PEG硫醇(PEG-SH)、胺基PEG(PEG-NH2)、羧基PEG(PEG-COOH)、羥基PEG(PEG-OH)、PEG環氧化物、經氧化PSA、胺氧基-PSA、PSA醯肼、PSA肼、 PEG乙烯碸、PEG鄰吡啶-二硫化物(OPSS)、PEG碘乙醯胺、PEG苯并***、PSA-SH、MAL-PSA，及PSA-NH2。

D1D. 根據段落D1至D2A中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物或其功能衍生物具有3,000與150,000Da之間之分子量。

D2. 根據段落D1之方法，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子保持至少60%生物活性。

D3. 根據段落D1至D2中任一段落之方法，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子具有增加為至少2倍之半衰期。

D4. 根據段落D1至D3中任一段落之方法，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物包含單一水溶性聚合物。

D5. 根據段落D4之方法，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之至少20%由單一水溶性聚合物構成。

D6. 根據段落D1至D5中任一段落之方法，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子包含單一可接近及可氧化巰基。

D7. 根據段落D6之方法，其中該單一可接近及可氧化巰基為半胱胺酸殘基上之巰基。

D8. 根據段落D7之方法，其還包括使該具有單一可接近及可氧化巰基之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子與硫醇還原劑在使該巰基得以還原之條件下接觸。

D9. 根據段落D8之方法，其中該硫醇還原劑選自由以下組成之群：參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、DTE、硼氫化鈉(NaBH4)，及氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)。

D10. 根據段落D9之方法，其中該硫醇還原劑為TCEP。

D11. 根據段落D8至D10中任一段落之方法，其中該治療蛋白質、水溶性聚合物及硫醇還原劑在單一容器中一起孵育。

D12. 根據段落D8至D11中任一段落之方法，其中該硫醇還原劑濃度相對於該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子濃度為1-100倍之間莫耳過量。

D13. 根據段落D8至D12中任一段落之方法，其中該硫醇還原劑濃度相對於該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子濃度為3倍莫耳過量。

D14. 根據段落D8至D13中任一段落之方法，其中該半胱胺酸殘基存在於該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子之原生胺基酸序列中。

D15. 根據段落D14之方法，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子自人類血漿純化。

D16. 根據段落D15之方法，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子為A1PI。

D17. 根據段落D14之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子在宿主細胞中重組產生。

D18. 根據段落D17之方法，其中該宿主細胞選自由以下組成之群：酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞，及細菌細胞。

D19. 根據段落D18之方法，其中由該哺乳動物細胞產生自然醣化之絲胺酸蛋白酶抑制因子。

D20. 根據段落D19之方法，其中該自然醣化之絲胺酸蛋白酶抑制因子為A1PI。

D21. 根據段落D18之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子由細菌細胞產生。

D22. 根據段落D21之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子在自該細菌細胞純化之後，在活體外經醣化。

D23. 根據段落D22之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子為A1PI。

D24. 根據段落D6至D23中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物經選自由以下組成之群之巰基-特異性試劑衍生：馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸、鄰吡啶-二硫化物(OPSS)及碘乙醯胺。

D25. 根據段落D24之方法，其中該巰基-特異性試劑為MAL。

D26. 根據段落D25之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為MAL-PEG。

D27. 根據段落D25之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為MAL-PSA。

D28. 根據段落D24之方法，其中該水溶性聚合物衍生物選自以下之群：線性、分支及多臂水溶性聚合物衍生物。

D29. 一種製備醣化A1PI偶聯物之方法，其包括：使包含單一可接近及可氧化巰基之醣化A1PI蛋白質與包含TCEP之溶液在使該巰基得以還原之條件下接觸，及使水溶性聚合物或其功能衍生物與該醣化A1PI在允許偶聯之條件下接觸；該醣化A1PI偶聯物相對於原生醣化A1PI保持至少20%生物活性；以及該醣化A1PI偶聯物相對於原生醣化A1PI具有增加之半衰期；及其中至少70%之該A1PI經單聚乙二醇化。

D30. 根據段落D29之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為MAL-PEG。

D31. 根據段落D29之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為MAL-PSA。

D32. 根據段落D29至D31中任一段落之方法，其中該治療蛋白 質、水溶性聚合物及硫醇還原劑在單一容器中一起孵育。

D33. 根據段落D1至D5中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物以選自由以下組成之群之離胺酸-特異性試劑衍生：N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)。

D34. 根據段落D33之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為PEG-NHS。

D35. 根據段落D33之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為PSA-NHS。

D36. 根據段落D1至D5中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物以胺氧基連接物來衍生。

D37. 根據段落D36之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為胺氧基-PEG。

D38. 根據段落D36之方法，其中該水溶性聚合物衍生物為胺氧基-PSA。

D39. 根據段落D36至D38中任一段落之方法，其中在與該水溶性聚合物或其功能衍生物接觸之前，該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子之碳水化合物部分藉由與包含選自由以下組成之群之氧化劑的緩衝液一起孵育來氧化：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及過釕酸鉀(KRuO4)；其中在該經氧化之碳水化合物部分與該胺氧基連接物衍生之水溶性聚合物上之活性胺氧基之間形成肟鍵，從而形成該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物。

D40. 根據段落D39之方法，其中該氧化劑為過碘酸鈉(NaIO4)。

D41. 根據段落D36至D40中任一段落之方法，其中該胺氧基連接物衍生之水溶性聚合物為胺氧基-PEG。

D42. 根據段落D36至D40中任一段落之方法，其中該胺氧基連接 物衍生之水溶性聚合物為胺氧基-PSA。

D43. 根據段落D42之方法，其中該胺氧基-PSA藉由使經活化之胺氧基連接物與經氧化之PSA反應來製備；其中該胺氧基連接物選自由以下組成之群：a)下式之3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺連接物： b)下式之3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺連接物： 及c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺連接物：

其中該PSA藉由與氧化劑一起孵育來氧化以在該PSA之非還原末端形成末端醛基。

D44. 根據段落D39至D43中任一段落之方法，其中使該經氧化之碳水化合物部分與該經活化之水溶性聚合物接觸係在包含選自由以下組成之群之親核催化劑的緩衝液中進行：苯胺、鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、磺胺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺、對茴香胺及其衍生物。

D45. 根據段落D39至D44中任一段落之方法，其還包括藉由在包含選自由以下組成之群之還原性化合物的緩衝液中孵育該治療蛋白質來使該肟鍵還原的步驟：氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)及抗壞血酸(維生素C)。

D46. 一種藉由根據段落D1至D45中任一段落之方法產生之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物。

D47. 一種醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其包含： a)醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子蛋白質；及b)至少一種水溶性聚合物，其結合至(a)中之該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子蛋白質，從而形成醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物；該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子保持至少60%生物活性；及該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子具有增加之半衰期。

D48. 根據段落D47之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子選自由以下組成之群：A1PI(α-1蛋白酶抑制因子)、或A1AT(α-1-抗胰蛋白酶)、ATR(α-1-抗胰蛋白酶相關蛋白質)、AACT或ACT(α-1-抗胰凝乳蛋白酶)、PI4(蛋白酶抑制因子4)、PCI或PROCI(蛋白質C抑制因子)、CBG(皮質類固醇結合球蛋白)、TBG(甲狀腺素結合球蛋白)、AGT(血管緊縮素原)、中心粒蛋白、PZI(蛋白質Z-依賴性蛋白酶抑制因子)、PI2(蛋白酶抑制因子2)、PAI2或PLANH2(纖溶酶原激活物抑制因子-2)、SCCA1(鱗狀細胞癌抗原1)、SCCA2(鱗狀細胞癌抗原2)、PI5(蛋白酶抑制因子5)、PI6(蛋白酶抑制因子6)、梅根蛋白、PI8(蛋白酶抑制因子8)、PI9(蛋白酶抑制因子9)、PI10(蛋白酶抑制因子10)、埃披蛋白、湯古蛋白、PI13(蛋白酶抑制因子13)、PI8L1(蛋白酶抑制因子8樣1)、AT3或ATIII(抗凝血酶-III)、HC-II或HCF2(肝素輔因子II)、PAI1或PLANH1(纖溶酶原激活物抑制因子-1)、PN1(蛋白酶連接蛋白I)、PEDF(色素上皮細胞衍生因子)、PLI(胞漿素抑制因子)、C1IN或C1INH(血漿蛋白酶C1抑制因子)、CBP1(膠原結合蛋白1)、CBP2(膠原結合蛋白2)、PI12(蛋白酶抑制因子12)、及PI14(蛋白酶抑制因子14)。

D49. 根據段落D48至D49中任一段落之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支 PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)，及其功能衍生物。

D50. 根據段落D49之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，該水溶性聚合物衍生物選自由以下組成之群：N-羥基琥珀醯亞胺酯-PEG(NHS-PEG)、PEG碳酸鹽、PEG醛、胺氧基-PEG、PEG醯肼(PEG-Hz)、PEG肼、PEG馬來醯亞胺(MAL-PEG)、PEG硫醇(PEG-SH)、胺基PEG(PEG-NH2)、羧基PEG(PEG-COOH)、羥基PEG(PEG-OH)、PEG環氧化物、經氧化PSA、胺氧基-PSA、PSA醯肼、PSA肼、PEG乙烯碸、PEG鄰吡啶-二硫化物(OPSS)、PEG碘乙醯胺、PEG苯并***、PSA-SH、MAL-PSA，及PSA-NH2。

D51. 根據段落D48至D50中任一段落之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物或其功能衍生物具有3,000與150,000Da之間之分子量。

D52. 根據段落D48至D51中任一段落之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物或其功能衍生物選自以下之群：線性、分支及多臂水溶性聚合物或其功能衍生物。

D53. 根據段落D49之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物經選自由以下組成之群之巰基-特異性試劑衍生：馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸、鄰吡啶-二硫化物(OPSS)及碘乙醯胺。

D54. 根據段落D53之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該巰基-特異性試劑為MAL。

D55. 根據段落D54之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物衍生物為MAL-PEG。

D56. 根據段落D54之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物衍生物為MAL-PSA。

D57. 根據段落D49之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物以選自由以下組成之群之離胺酸-特異性試劑衍生：N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)。

D58. 根據段落D57之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該離胺酸-特異性試劑為NHS。

D59. 根據段落D57之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物衍生物為PEG-NHS。

D60. 根據段落D57之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物衍生物為PSA-NHS。

D61. 根據段落D49之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物以胺氧基連接物來衍生。

D62. 根據段落D61之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物衍生物為胺氧基-PEG。

D63. 根據段落D61之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物衍生物為胺氧基-PSA。

D64. 根據段落D61至D63中任一段落之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該胺氧基連接物選自由以下組成之群：a)下式之3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺連接物： b)下式之3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺連接物： 及c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺連接物：

D65. 根據段落D46至D65中任一段落之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子為A1PI。

D66. 一種治療與絲胺酸蛋白酶抑制因子相關之疾病之方法，其包括以有效治療該疾病之量投與根據段落D46至D65中任一段落之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物。

D67. 根據段落D66之方法，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子為A1PI。

D68. 根據D67之方法，其中該水溶性聚合物為MAL-PEG。

D69. 根據段落D67至D68中任一段落之方法，其中該疾病為肺氣腫。

D70. 一種包含醫藥組合物的套組，該醫藥組合物包含i)根據段落D46至D65中任一段落之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物；及ii)藥學上可接受的賦形劑；該醫藥組合物包裝於具有標簽之容器中，該標簽描述該醫藥組合物在治療與該絲胺酸蛋白酶抑制因子相關之疾病之方法中之用法。

D71. 根據段落D70之套組，其中該醫藥組合物以單位劑型包裝。

D72. 一種套組，其包含：包含根據段落D46至D65中任一段落之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之第一容器，及包含用於第一容器中之該組合物的生理可接受的重構溶液之第二容器，其中該套組與標簽一起包裝，該標 簽描述該醫藥組合物在治療與該絲胺酸蛋白酶抑制因子相關之疾病之方法中之用法。

D73. 根據段落D72之套組，其中該醫藥組合物以單位劑型包裝。

本揭示案亦提供以下示範性實施例：

E1. 一種製備醣化治療蛋白質偶聯物之方法，其包括使水溶性聚合物與醣化治療蛋白質在允許偶聯之條件下接觸，該醣化治療蛋白質偶聯物相對於原生醣化治療蛋白質保持至少20%生物活性，並且該醣化治療蛋白質偶聯物相對於原生醣化治療蛋白質具有增加之半衰期。

E2. 根據段落E1之方法，其中該醣化治療蛋白質偶聯物相對於原生醣化治療蛋白質保持至少30%生物活性。

E2A. 根據段落E1之方法，其中該醣化治療蛋白質在純化之前，在活體內經醣化。

E3. 根據段落E1之方法，其中該醣化治療蛋白質在純化之後，在活體外經醣化。

E4. 根據段落E1至E3中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)，及其功能衍生物。

E5. 根據段落E1之方法，其中該偶聯在同時反應中發生。

E6. 根據段落E1至E5中任一段落之方法，其中該醣化治療蛋白質選自由以下組成之群：血漿-衍生α-1蛋白酶抑制因子(A1PI)、重組A1PI、抗凝血酶III、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、卵白蛋白、纖溶酶原-激活物抑制因子、神經絲抑蛋白、C1-抑制因子、連接蛋白、α-2-抗纖溶酶、肝素輔因子II、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-微球蛋白、白蛋白、醇脫氫酶、膽綠素還原酶、丁醯膽鹼酯酶、補體C5a、皮質醇結合蛋白、肌酸激酶、因子V、因子VII、鐵蛋白、肝素輔因子、介白素2、蛋白質C抑制因子、組織因子及玻連蛋白或其生物活性片段、衍生物或變體。

E7. 根據段落E1至E6中任一段落之方法，其中該醣化治療蛋白質偶聯物相對於原生醣化治療蛋白質保持至少40%生物活性。

E8. 根據段落E7之方法，其中該醣化治療蛋白質偶聯物相對於原生醣化治療蛋白質保持至少50%生物活性。

E9. 根據段落E8之方法，其中該醣化治療蛋白質偶聯物相對於原生醣化治療蛋白質保持至少60%生物活性。

E10. 根據段落E8之方法，其中該醣化治療蛋白質偶聯物相對於原生醣化治療蛋白質保持至少70%生物活性。

E11. 根據段落E8之方法，其中該醣化治療蛋白質偶聯物相對於原生醣化治療蛋白質保持至少80%生物活性。

E12. 根據段落E8之方法，其中該醣化治療蛋白質偶聯物相對於原生醣化治療蛋白質保持至少90%生物活性。

E12A. 根據段落E1至E12中任一段落之方法，其中該醣化治療蛋白質偶聯物之半衰期係為該原生醣化治療蛋白質之至少2倍高。

E12B. 根據段落E12A之方法，其中該醣化治療蛋白質偶聯物之半衰期係為該原生醣化治療蛋白質之8倍高。

E12C. 根據段落E1至E12B中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物選自以下之群：線性、分支或多臂水溶性聚合物。

E12D. 根據段落E1至E12B中任一段落之方法，其中該水溶性聚合物為PEG。

E12E. 根據段落E12D之方法，其中該PEG選自由以下組成之群：N-羥基琥珀醯亞胺酯-PEG(NHS-PEG)、PEG碳酸鹽、PEG醛、胺氧基-PEG、PEG醯肼(PEG-Hz)、PEG肼、PEG馬來醯亞胺(MAL-PEG)、PEG硫醇(PEG-SH)、胺基PEG(PEG-NH2)、羧基PEG(PEG-COOH)、羥基PEG(PEG-OH)及PEG環氧化物。

E13. 根據段落E12E之方法，其中該PEG在3,000與80,000Da之間。

E13A. 根據段落E4之方法，其中該水溶性聚合物為PSA。

E14. 根據段落E13A之方法，其中該PSA選自由以下組成之群：經氧化PSA、胺氧基-PSA、PSA醯肼、PSA-SH、MAL-PSA及PSA-NH2。

E15. 根據段落E14之方法，其中該PSA在3,000與80,000Da之間。

E15A. 根據段落E1至E15中任一段落之方法，其中該醣化治療蛋白質自人類血漿純化。

E16. 根據段落E1至E15中任一段落之方法，其中該醣化治療蛋白質在宿主細胞中重組產生。

E17. 根據段落E16之方法，其中該宿主細胞為動物細胞。

E18. 根據段落E17之方法，其中該動物細胞為哺乳動物細胞。

E19. 根據段落E18之方法，其中該哺乳動物細胞選自由以下組成之群：CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep，及HepG2。

E20. 根據段落E3之方法，其中該醣化治療蛋白質在細菌細胞中 重組產生。

E21. 根據段落E20之方法，其中該細菌細胞選自由以下組成之群：大腸桿菌。

E22. 根據段落E12之方法，其中該水溶性聚合物為NHS-PEG。

E23. 根據段落E12之方法，其中該水溶性聚合物為胺氧基-PEG。

E24. 根據段落E23之方法，其中在偶聯之前，該治療蛋白質之碳水化合物部分藉由以包含選自由以下組成之群之氧化劑的緩衝液孵育來氧化：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及過釕酸鉀(KRuO4)；並且其中在該經氧化之碳水化合物部分與該胺氧基-PEG上的活性胺氧基之間形成肟鍵，從而形成該治療蛋白質偶聯物。

E25. 根據段落E24之方法，其為同時反應。

E26. 根據段落E24或E25中任一段落之方法，其中該氧化劑為過碘酸鈉(NaIO4)。

E27. 根據段落E14之方法，其中該水溶性聚合物為胺氧基-PSA。

E28. 根據段落E27之方法，其中在偶聯之前，該治療蛋白質之碳水化合物部分藉由以包含選自由以下組成之群之氧化劑的緩衝液孵育來氧化：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及過釕酸鉀(KRuO4)；並且其中在該經氧化之碳水化合物部分與該胺氧基-PSA上的活性胺氧基之間形成肟鍵，從而形成該治療蛋白質偶聯物。

E29. 根據段落E28之方法，其為同時反應。

E30. 根據段落E28或E29中任一段落之方法，其中該氧化劑為過碘酸鈉(NaIO4)。

E30A. 根據段落E27之方法，其中該胺氧基-PSA藉由使經活化之胺氧基連接物與經氧化之PSA反應來製備；

其中該胺氧基連接物選自由以下組成之群：a)下式之3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺連接物： b)下式之3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺連接物： 及c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺連接物：

其中該PSA藉由與氧化劑一起孵育來氧化以在該PSA之非還原末端形成末端醛基。

E30B. 根據段落E30A之方法，其中該胺氧基連接物為3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。

E30C. 根據段落E28之方法，其中該氧化劑為NaIO4。

E31. 根據段落E24至E26或E28至E30C中任一段落之方法，其中該經氧化之碳水化合物部分與該經活化之水溶性聚合物之該接觸係在包含選自由以下組成之群之親核催化劑之緩衝液中進行：苯胺及苯胺衍生物。

E32. 根據段落E24至E26或E28至E31中任一段落之方法，其還包括藉由在包含選自由以下組成之群之還原性化合物的緩衝液中孵育該治療蛋白質來使該肟鍵還原的步驟：氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)及抗壞血酸(維生素C)。

E33. 根據段落E32之方法，其中該還原性化合物為氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)。

E34. 根據段落E12之方法，其中該水溶性聚合物為MAL-PEG。

E35. 根據E34之方法，其中該醣化治療蛋白質之巰基(-SH)部分藉由與包含選自由以下組成之群之還原劑的緩衝液一起孵育來還原：參[2-羧乙 基]膦鹽酸鹽(TCEP)、DTT、DTE、NaBH4，及NaCNBH3。

E36. 根據段落E35或E36中任一段落之方法，其中該還原劑為TCEP。

E37. 根據段落E36之方法，其為同時反應。

E38. 根據段落E36或E37中任一段落之方法，其中該TCEP濃度相對於該治療蛋白質濃度為1-100倍之間莫耳過量。

E38. 根據段落E37之方法，其中該醣化治療蛋白質為A1PI。

E39. 根據段落E38之方法，其中該醣化A1PI偶聯物經單聚乙二醇化。

E40. 根據段落E39之方法，其中至少20、30、40、50、60、70、80或90%之該A1PI經單聚乙二醇化。

E41. 一種製備醣化A1PI偶聯物之方法，其包括：使MAL-PEG與該醣化A1PI在允許偶聯之條件下接觸，該醣化A1PI偶聯物相對於原生醣化A1PI保持至少20%生物活性，並且該醣化A1PI偶聯物相對於原生醣化A1PI具有增加之半衰期，其中該醣化A1PI之半胱胺酸232處之該巰基(-SH)部分藉由與TCEP一起孵育來還原，並且其中至少20%之該A1PI經單聚乙二醇化。

E42. 根據段落E41之方法，其中至少30、40、50、60、70、80或90%之該A1PI經單聚乙二醇化。

E43. 根據段落E1至E42中任一段落之方法，其中該治療蛋白質偶聯物在偶聯之後經純化。

本揭示案亦提供以下示範性實施例：

F1. 一種藉由如申請專利範圍第E1至E46項中任一項之方法產生之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物。

F2. 一種醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其包含： (a)醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子；及(b)至少一種結合至(a)之該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子的水溶性聚合物，該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子保持至少20%生物活性，並且該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子具有增加之半衰期。

F2A. 根據段落F1之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其在純化之前在活體內經醣化。

F3. 根據段落F1之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其在純化之後在活體外經醣化。

F4. 根據段落F2之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物絲胺酸蛋白酶抑制因子選自由以下組成之群：A1PI(α-1蛋白酶抑制因子)、或A1AT(α-1-抗胰蛋白酶)、ATR(α-1-抗胰蛋白酶相關蛋白質)、AACT或ACT(α-1-抗胰凝乳蛋白酶)、PI4(蛋白酶抑制因子4)、PCI或PROCI(蛋白質C抑制因子)、CBG(皮質類固醇結合球蛋白)、TBG(甲狀腺素結合球蛋白)、AGT(血管緊縮素原)、中心粒蛋白、PZI(蛋白質Z-依賴性蛋白酶抑制因子)、PI2(蛋白酶抑制因子2)、PAI2或PLANH2(纖溶酶原激活物抑制因子-2)、SCCA1(鱗狀細胞癌抗原1)、SCCA2(鱗狀細胞癌抗原2)、PI5(蛋白酶抑制因子5)、PI6(蛋白酶抑制因子6)、梅根蛋白、PI8(蛋白酶抑制因子8)、PI9(蛋白酶抑制因子9)、PI10(蛋白酶抑制因子10)、埃披蛋白、湯古蛋白、PI13(蛋白酶抑制因子13)、PI8L1(蛋白酶抑制因子8樣1)、AT3或ATIII(抗凝血酶-III)、HC-II或HCF2(肝素輔因子II)、PAI1或PLANH1(纖溶酶原激活物抑制因子-1)、PN1(蛋白酶連接蛋白I)、PEDF(色素上皮細胞衍生因子)、PLI(胞漿素抑制因子)、C1IN或C1INH(血漿蛋白酶C1抑制因子)、CBP1(膠原結合蛋白1)、CBP2(膠原結合蛋白2)、PI12(蛋白酶抑制因子12)，及PI14(蛋白酶抑制因子14)或其生物活性片段、衍生物或變體。

F5. 根據段落F2之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、羥乙基澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)、2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨磷酸(MPC)，及其功能衍生物。

F8. 根據段落F5之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物為約20kDa。

F9. 根據段落F2之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子保持至少40%生物活性。

F10. 根據段落F9之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物相對於原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子保持至少50%生物活性。

F11. 根據段落F2之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之半衰期係為該原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子之至少1-100倍高。

F12. 根據段落F11之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之半衰期係為該原生醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子之3倍高。

F13. 根據段落F5之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物為PEG。

F14. 根據段落F13之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該PEG選自由以下組成之群：N-羥基琥珀醯亞胺酯-PEG(NHS-PEG)、胺氧基-PEG、馬來醯亞胺-PEG(MAL-PEG)、PEG碳酸鹽、PEG醛、胺氧基-PEG、PEG醯肼(PEG-Hz)、PEG肼、PEG硫醇(PEG-SH)、胺基PEG(PEG-NH2)、羧基PEG(PEG-COOH)、羥基PEG(PEG-OH)及PEG環氧化物。

F15. 根據段落F5之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物為PSA。

F16. 根據段落F15之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該PSA選自由以下組成之群：胺氧基-PSA。

F17. 根據段落F2之絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子自人類血漿純化。

F18. 根據段落F2之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子在宿主細胞中重組產生。

F19. 根據段落18之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該宿主細胞為動物細胞。

F20. 根據段落F19之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該動物細胞為哺乳動物細胞。

F24. 根據段落F14之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物為NHS-PEG。

F25. 根據段落F14之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物為胺氧基-PEG。

F26. 根據段落F25之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該 胺氧基-PEG經由該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子上之經氧化之碳水化合物部分來與該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子連接。

F27. 根據段落F16之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物為胺氧基-PSA。

F28. 根據段落F27之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該胺氧基-PSA藉由使經活化之胺氧基連接物與經氧化之PSA反應來製備；其中該胺氧基連接物選自由以下組成之群：a)下式之3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺連接物： b)下式之3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺連接物： 及c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺連接物：

其中該PSA藉由與氧化劑一起孵育來氧化以在該PSA之非還原末端形成末端醛基。

F29. 根據段落F14之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該水溶性聚合物為MAL-PEG。

F30. 根據段落F29之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該MAL-PEG經由該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子上之經還原之巰基(-SH)部分與該絲胺酸蛋白酶抑制因子連接。

F31. 根據段落F27之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子為A1PI。

F32. 根據段落F31之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中該 A1PI偶聯物經單聚乙二醇化。

F33. 根據段落F32之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中至少50%之該A1PI經單聚乙二醇化。

F34. 根據段落F32之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中至少60%之該A1PI經單聚乙二醇化。

F35. 根據段落F32之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物，其中至少70%之該A1PI經單聚乙二醇化。

本揭示案亦提供以下示範性實施例：

G1. 一種治療與絲胺酸蛋白酶抑制因子相關之疾病之方法，其包括以有效治療該疾病之量投與根據上述申請專利範圍中任一項之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物。

G2. 根據段落G1之方法，其中該絲胺酸蛋白酶抑制因子為A1PI。

G3. 根據段落G2之方法，其中該水溶性聚合物為MAL-PEG。

G4. 根據段落G3之方法，其中該疾病為肺氣腫。

本揭示案亦提供以下示範性實施例：

H1. 一種包含醫藥組合物的套組，該醫藥組合物包含i)根據上述申請專利範圍中任一項之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物；及ii)藥學上可接受的賦形劑；該醫藥組合物包裝於具有標簽之容器中，該標簽描述該醫藥組合物在治療與該絲胺酸蛋白酶抑制因子相關之疾病之方法中之用法。

H2. 根據段落H1之套組，其中該醫藥組合物以單位劑型包裝。

H3. 一種套組，其包含：包含根據上述申請專利範圍中任一項之醣化絲胺酸蛋白酶抑制因子偶聯物之第一容器，及包含用於第一容器中之該組合物的生理可接受的重構溶液之第二容器，其中該套組與標簽一起包裝，該標簽描述該醫藥組合物在治療與該絲胺酸蛋白酶抑制因子相關之疾病之方法中之 用法。

H4. 根據段落H3之套組，其中該醫藥組合物以單位劑型包裝。

以下實例不欲具有限制性，而僅例示本揭示案之特定實施例。

實例 實例1

同雙官能連接物NH2[OCH2CH2]2ONH2之製備

同雙官能連接物NH₂[OCH₂CH₂]₂ONH₂

含有兩個活性胺氧基之(3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺)根據Boturyn等人(Tetrahedron 1997；53：5485-92)在使用一級胺之經修飾加百利合成(Gabriel-Synthesis)之兩步有機反應中經合成(第2圖)。在第一步驟中，將一個分子之2,2-氯二***與兩個分子之橋-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺在二甲基甲醯胺(DMF)中反應。所需同雙官能產物藉由乙醇中之肼解作用自所得中間體製備。

實例2

同雙官能連接物NH2[OCH2CH2]4ONH2之製備

同雙官能連接物NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂

含有兩個活性胺氧基之(3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺)根據Boturyn等人(Tetrahedron 1997；53：5485-92)在使用一級胺之經修飾加百利合成之兩步有機反應中經合成(第2圖)。在第一步驟中，將一個分子之雙-(2-(2-氯乙氧基)-乙基)-醚與兩個分子之橋-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺在DMF中反應。所需同雙官能產物藉由乙醇中之肼解作用自所得中間體製備。

實例3

同雙官能連接物NH2[OCH2CH2]6ONH2之製備

同雙官能連接物NH₂[OCH₂CH₂]₆ONH₂

含有兩個活性胺氧基之(3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺)根據Boturyn等人(Tetrahedron 1997；53：5485-92)在使用一級胺之經修飾加百利合成之兩步有機反應中經合成。在第一步驟中，將一個分子之六乙二醇二氯化物與兩個分子之橋-N-羥基-3-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺在DMF中反應。所需同雙官能產物藉由乙醇中之肼解作用自所得中間體製備。

實例4

3-氧雜-戊烷-1,5二氧基胺之詳細合成

3-氧雜-戊烷-1,5二氧基胺根據Botyryn等人(Tetrahedron 1997；53：5485-92)如實例1中概述之兩步有機合成中經合成。

步驟1：

向橋-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺(59.0g；1.00當量)於700ml無水N,N-二甲基甲醯胺中之溶液添加無水K2CO3(45.51g；1.00當量)及2,2-二氯二***(15.84ml；0.41當量)。將反應混合物在50℃下攪拌22h。將混合物在減壓下蒸發至乾。將殘餘物懸浮於2L二氯甲烷中並且以飽和NaCl水溶液提取兩次(分別1L)。將二氯甲烷層經Na2SO4乾燥，然後在減壓下蒸發至乾並且在高真空中乾燥以給出64.5g呈白黃色固體形式之3-氧雜戊烷-1,5-二氧-橋-2',3'-二羧基二醯亞胺降冰片烯(中間體1)。

步驟2：

向中間體1(64.25g；1.00當量)於800ml無水乙醇中之溶液，添加31.0ml水合肼(4.26當量)。然後使反應混合物回流2小時。藉由在減壓下蒸發溶劑將混合物濃縮至起始體積之一半。將出現之沈澱物過濾掉。將剩餘乙醇層在 減壓下蒸發至乾。將含有粗產物3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺之殘餘物在真空中乾燥以獲得46.3g。將粗產物藉由管柱層析(矽膠60；以二氯甲烷/甲醇混合物進行等度溶離，9+1)進一步純化以獲得11.7g純最終產物3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。

實例5

胺氧基-PSA之製備

將自Serum Institute of India(Pune,India)獲得之1000mg經氧化PSA(MW=20kD)溶解於16ml 50mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.0中。然後將170mg 3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺加入反应混合物。在RT下振盪2小時之後，添加78.5mg氰基硼氫化鈉並且執行反應18小時隔夜。然後使用以再生纖維素製成之具有5kD截留量之膜(Millipore)使反應混合物經受超濾/滲濾程序(UF/DF)。

或者，可在沒有還原步驟的情況下製備胺氧基PSA。

將自Serum Institute of India(Pune,India)獲得之573mg經氧化PSA(MW=20kD)溶解於11,3ml 50mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.0(緩衝液A)中。然後將94mg 3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺加入反应混合物。然後在RT下振盪5h之後，使混合物經受使用Fractogel EMD DEAE 650-M層析凝膠(管柱尺寸：XK16/105)之弱陰離子交換層析步驟。將反應混合物以50ml緩衝液A稀釋並且以1cm/min流速加載至以緩衝液A預平衡之DEAE管柱上。然後將管柱以20CV緩衝液B(20mM HEPES，pH 6.0)清洗以便以2cm/min流速移除自由的3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺及氰化物。將胺氧基-PSA試劑以由67%緩衝液B及43%緩衝液C(20mM HEPES，1M NaCl，pH 7.5)組成之不連續梯度溶離。將溶離液使用由聚醚碸製成之5kD膜(50cm²，Millipore)藉由UF/DF來濃縮。最終滲濾步驟相對於緩衝液D(20mM HEPES，90mM NaCl，pH 7.4)執行。製備物藉由量測總PSA(間苯二酚檢測)及總胺氧基(TNBS檢測)以確定修飾度來加以分析表徵。此外，確定多分散性以及自由3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。

實例6

胺氧基-PSA試劑之凍乾

根據實例5製備胺氧基-PSA試劑。滲濾之後，將產物在-80℃下冷凍並且凍乾。凍乾之後，將試劑溶解於合適體積之水中並且用於經由碳水化合物修飾來製備PSA-蛋白質偶聯物。

實例7

A1PI以PEG馬來醯亞胺之聚乙二醇化(依序方法)

將25mg經純化之A1PI溶解於反應緩衝液(20mM Na2HPO4，5mM EDTA，pH 7.0)中以給出10mg/ml最終濃度。向此溶液添加等分試樣之TCEP(參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽/Thermo Scientific)儲備溶液(5mg TCEP/ml反應緩衝液)以獲得莫耳過量之3M TCEP。將混合物在室溫下在黑暗中孵育1小時。然後TCEP藉由凝膠過濾使用PD-10管柱(GE-Healthcare)來分離。隨後A1PI使用10莫耳過量之分支PEG馬來醯亞胺20kD(NOF Sunbright MA系列)來化學修飾。修飾反應在溫度T=+2-8℃下在黑暗中執行1小時，繼而使用L-半胱胺酸(最終濃度：10mM)執行中止步驟。添加L-半胱胺酸之後，反應混合物伴以輕微振盪在相同溫度下再孵育一小時。

經修飾之A1PI以平衡緩衝液(25mM Na2HPO4，pH 6.5)稀釋以將溶液電導率校正至<4.5mS/cm並且以5ml之管柱容積(CV)及ml/min之流速加載至預充填之HiTrap Q FF(GE-Healthcare)上。然後管柱以10CV平衡緩衝液(流速：2ml/min)平衡。最後，PEG-A1PI以線性梯度用溶離緩衝液(25mM Na2HPO4，1M NaCl，pH 6.5)溶離。

實例8

A1PI以PEG馬來醯亞胺之聚乙二醇化(同時方法)

將30mg經純化之A1PI溶解於反應緩衝液(20mM Na2HPO4，5 mM EDTA，pH 7.0)中以給出10mg/ml最終濃度。向此溶液添加等分試樣之TCEP儲備溶液(5mg TCEP/ml反應緩衝液)以獲得莫耳過量之4M TCEP。將混合物孵育10分鐘，然後藉由添加10莫耳過量之分支PEG馬來醯亞胺20kD(NOF Sunbright MA系列)來起始化學修飾。修飾反應在溫度T=+2-8℃下在黑暗中執行1小時，繼而使用L-半胱胺酸(最終濃度：10mM)執行中止步驟。添加L-半胱胺酸之後，反應混合物伴以輕微振盪在相同溫度下再孵育一小時。

經修飾之A1PI以平衡緩衝液(25mM Na2HPO4，pH 6.5)稀釋以將溶液電導率校正至<4.5mS/cm並且以5ml之管柱容積(CV)使用1ml/min之流速加載至預充填之HiTrap Q FF(GE-Healthcare)上。然後管柱以10CV平衡緩衝液(流速：2ml/min)平衡。最後，PEG-A1PI以線性梯度用溶離緩衝液(25mM Na2HPO4，1M NaCl，pH 6.5)溶離。

實例9

以PEG-A1PI ELISA監測之聚乙二醇化A1PI之藥代動力學研究

將APEG-A1PIELISA用於特定地量測來源於大鼠藥代動力學研究之血漿樣品中的聚乙二醇化A1PI之濃度。該檢測基本上遵循申請案US 12/342,405。簡言之，將兔抗-PEG IgG(Epitomics，#YG-02-04-12P)以碳酸鹽緩衝液，pH 9.5中之5μg/mL之濃度塗佈於Maxisorp F96板並且使用抗-人類A1PI-過氧化物酶製劑(結合位點，PP034)來偵測結合之聚乙二醇化A1PI。檢測顯示2至32ng/mL範圍內之A1PI-結合PEG的線性劑量-濃度關係。藉由使用Nag等人(Anal Biochem 1996；237：224-31)描述之比色法來量測，藉由以己知濃度之PEG來連續稀釋聚乙二醇化A1PI製劑來確立此檢測範圍。比色檢測用於使用硫氰鐵銨來估計聚乙二醇及聚乙烯乙醇酸化蛋白質，並且使用所獲得之校準曲線來推斷樣品信號。第3圖顯示所獲得之藥代動力學概況。

在沒有任何干擾的情況下，聚乙二醇化A1PI可藉由內源性非聚 乙二醇化大鼠A1PI，在投與之後之所有時間點，以投與之後48h獲取之最後樣品來特定地量測到。如預期，所量測之濃度隨著時間的推移而降低，在觀察週期期間在大鼠循環中未發生聚乙二醇化A1PI之大量去聚乙二醇化的跡象。因此，由於用於監測其濃度之特定檢測，在大鼠模型中獲得之PK概況展現大鼠循環中之聚乙二醇化A1PI的穩定性。

實例10

A1PI中之離胺酸殘基以PEG-NHS聚乙二醇化

A1PI以具有20kD分子量並且含有活性NHS酯(系統名稱：2,3-雙(甲基聚氧基伸乙基氧基)-1-(1,5-二側氧基-5-琥珀醯亞胺基氧基，戊氧基)丙烷)之聚乙二醇化試劑(SUNBRIGHT GL2-200GS/NOF，日本東京)來聚乙二醇化。將經純化之A1PI於50mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.5中之溶液調整至3.3mg/ml蛋白質濃度並且添加聚乙二醇化試劑(儲備溶液：50mg試劑/ml 2mM HCl)以給出10mg/ml最終濃度。聚乙二醇化反應伴以輕微攪拌在室溫下執行2小時。然後藉由添加甘胺酸(最終濃度10mM)1小時停止反應。隨後，將反應之pH值藉由添加2N HCl而調整至6.5並且將混合物加載至以25mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.5預平衡之陰離子交換層析樹脂(Q-Sepharose FF/GE-Healthcare)上。然後，管柱以20CV平衡緩衝液清洗以移除過量試劑並且聚乙二醇化A1PI以洗脫緩衝液(25mM磷酸鹽緩衝液，1MNaCl)使用1ml/min流速來溶離。

最後，溶離液使用具有由聚醚碸組成並且具有10kD之分子量截留量之膜的Vivaspin裝置(Sartorius,Göttingen,Gemany)藉由超濾/滲濾來濃縮。最終滲濾步驟相對於50mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.0來執行。

實例11

A1PI中之碳水化合物殘基之聚乙二醇化(依序方法)

向溶解於1.5ml 20mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.0中之2.0mg A1PI添 加過碘酸鈉水溶液(10mM)以給出100μM最終濃度。混合物在黑暗中在4℃下振盪1h並且在RT下藉由添加1M甘油溶液(最終濃度：10mM)來中止15min。然後，藉由以相同緩衝系統預平衡之PD-10管柱(GE healthcare)上的凝膠過濾來分離低分子量污染物。隨後，將線性胺氧基-PEG試劑(NOF SUNBRIGHT ME 200C/NOF，日本東京)添加至含有A1PI之溶離份並且將混合物在4下在pH 6.0下振盪18小時。最後，偶聯物藉由IEX在如上所述之條件下進一步純化。

實例12

A1PI中之碳水化合物殘基之聚乙二醇化(同時方法)

將10mg A1PI溶解於12ml組胺酸-緩衝液，pH 6.0(20mM L-組胺酸，150mM NaCl,5mM CaCl₂)中。然後添加過碘酸鈉水溶液(5mM)以給出120μM最終濃度。隨後，添加具有20kD之MW的線性PEG-胺氧基試劑(NOF SUNBRIGHT ME 200C/NOF，日本東京)以給出5倍莫耳過量之PEG試劑。將混合物伴以輕微攪拌在黑暗中在4℃下孵育18小時並且在室溫下藉由添加25μl 1M半胱胺酸水溶液來中止15min。最後，偶聯物藉由IEX在如上所述之條件下進一步純化。

實例13

A1PI中之碳水化合物殘基在親核催化劑存在下的聚乙二醇化

如上所述，A1PI經由碳水化合物殘基來聚乙二醇化。與胺氧基試劑之化學反應在使用10mM濃度之親核催化劑苯胺存在下執行(Zheng等人，Nature Methods 2009；6：207-9)。作為此催化劑之替代品，使用間甲苯胺(濃度：10mM)。該化學反應在室溫下執行2小時，而非在4℃下執行18小時。作為替代品，可使用間甲苯胺或如US 2012/0035344 A1所描述之其他親核催化劑。

實例14

PSA馬來醯亞胺之製備

將0.68g經氧化之PSA溶解於15.1ml 50mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.0中以給出43mg/ml最終濃度。然後添加含有馬來醯亞胺及醯肼基團之雙官能EMCH連接物的50mM溶液(Pierce/50mM磷酸鹽緩衝液中之16.7mg/ml)。pH值校正至pH 6.0並且溶液伴以輕微攪拌在黑暗中在室溫下孵育30分鐘。隨後，添加2.6ml之1M NaBH₃CN溶液(=50M過量)並且伴以輕微攪拌在黑暗中在R.T.下再執行孵育180分鐘。然後，溶液以50mM磷酸鹽緩衝液，pH 6以1：1稀釋以降低電導率(~7mS/cm)。然後，混合物以4ml/min流速施加至具有8ml床體積(單塊類型DEAE CIM/BIA分離)的預充填之IEX管柱以便純化PSA馬來醯亞胺連接物。然後，管柱使用40ml/min流速以32管柱體積之50mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.0清洗。然後，連接物以59% 50mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.0及41% 50mM磷酸鹽緩衝液/1M NaCl，pH 7.5之梯度溶離。最後，溶離液經受使用聚醚碸膜(類型BIOMAX 5/Millipore)之UF/DF。最終滲濾步驟相對於含有90mM NaCl之50mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.5來執行。

實例15

A1PI以PSA馬來醯亞胺之聚唾液酸化(依序方法)

A1PI藉由使用含有活性馬來醯亞胺基團之聚唾液酸化試劑來聚唾液酸化。此類型試劑之實例如上所述(經氧化之PSA與雙官能EMCH連接物(Pierce)反應，隨後藉由離子交換層析來純化)。

A1PI以使用10mg/ml蛋白質濃度及3M試劑過量的反應緩衝液(20mM Na2HPO4，5mM EDTA，pH 7.0)中之TCEP試劑(參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽/Thermo Scientific)來還原。將混合物在室溫下在黑暗中孵育1小時。然後TCEP藉由凝膠過濾使用PD-10管柱(GE-Healthcare)來分離。隨後，A1PI以使用10莫耳試劑過量之反應緩衝液中之PSA馬來醯亞胺來化學修飾。修飾反應在溫度4℃下在黑暗中執行1小時，繼而使用L-半胱胺酸(最終濃度：10mM)執行中止步驟。 添加L-半胱胺酸之後，反應混合物伴以輕微攪拌在相同溫度下再孵育一小時。最後，聚唾液酸化A1PI藉由Q-Sepharose FF上之IEX來純化。

實例16

A1PI以PSA馬來醯亞胺之聚唾液酸化(同時方法)

A1PI藉由使用含有活性馬來醯亞胺基團之聚唾液酸化試劑來聚唾液酸化。此類型試劑之實例如上所述(經氧化之PSA與雙官能EMCH連接物(Pierce)反應，隨後藉由離子交換層析來純化)。

將A1PI溶解於反應緩衝液(20mM Na2HPO4,5mM EDTA,pH 7.0)中以給出10mg/ml最終濃度。向此溶液添加等分試樣之TCEP(參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽/Thermo Scientific)儲備溶液(5mg TCEP/ml反應緩衝液)以獲得4倍莫耳過量。將混合物孵育10分鐘，然後藉由添加10莫耳過量之PSA馬來醯亞胺試劑(實例14)來起始化學修飾。

修飾反應在4℃下在黑暗中執行1小時。添加L-半胱胺酸之後，反應混合物伴以輕微攪拌在相同溫度下再孵育一小時。最後，聚唾液酸化A1PI藉由Q-Sepharose FF上之IEX來純化。

實例17

以PEG馬來醯亞胺修飾人類血清白蛋白(HSA)中之SH基團

將30mg經純化之HSA溶解於反應緩衝液(20mM Na2HPO4,5mM EDTA,pH 7.0)中以給出10mg/ml最終濃度。向此溶液添加等分試樣之TCEP儲備溶液(5mg TCEP/ml反應緩衝液)以產生4莫耳過量。將混合物孵育10分鐘。藉由添加10倍莫耳過量之含有末端馬來醯亞胺基團之分支PEG試劑(分子量20kD)來起始化學修飾。此類型試劑之實例為來自NOF(NOF Corp.，日本東京)之Sunbright ® MA系列。修飾反應在溫度T=+2-8℃下在黑暗中執行1小時，繼而使用L-半胱胺酸(最終濃度：10mM)執行中止步驟。添加L-半胱胺酸之後，反應混 合物伴以輕微振盪在相同溫度下再孵育一小時。然後，pH值藉由逐滴添加0.1M HCl而調整至6.8。

隨後，偶聯物藉由DEAE-Sepharose FF上之陰離子交換層析來純化。將反應混合物施加至層析管柱(體積：20ml)。然後，管柱以10管柱體積(CV)起始緩衝液(25mM乙酸鈉，pH 6.2)來清洗。PEG-HSA偶聯物以25mM乙酸鈉緩衝液，pH 4.5溶離並且量測280nm下之OD。將含有偶聯物之溶離份彙集並且經受使用10kD再生纖維素膜之UF/DF。

實例18

重組因子VIII(rFVIII)中之SH基團的修飾

含有自由及可接近巰基之重組FVIII(rFVIII)突變體根據US 7,632,921 B2藉由重組DNA技術製備並且用於經由自由SH基團來進行化學修飾。此突變體使用10倍莫耳過量之含有末端馬來醯亞胺基團的分支PEG試劑(20kD分子量)來進行化學修飾。此類型試劑之實例為來自NOF(NOF Corp.，日本東京)之Sunbright ® MA系列。反應在室溫下在5倍過量TCEP存在下執行1小時。然後，偶聯物藉由疏水性相互作用層析(HIC)純化。離子強度藉由添加含有8M乙酸銨(8M乙酸銨，50mM HEPES，5mM CaCl2，350mM NaCl，0.01%吐溫80，pH 6.9)之緩衝液以獲得2.5M乙酸銨之最終濃度來增加。然後，將反應混合物加載至充填有以平衡緩衝液(2.5M乙酸銨，50mM HEPES，5mM CaCl2，350mwNaCl，0.01%吐溫80，pH 6.9)平衡之苯基-Sepharose FF的層析管柱上。產物以洗脫緩衝液(50mM HEPES，5mM CaCl2，0.01%吐溫80，pH 7.4)溶離，並且溶離液藉由使用由再生纖維素製成之30kD膜的UF/DF來濃縮。

實例19

其他治療蛋白質之聚唾液酸化

如本文所述，在如間甲苯胺或鄰胺基苯甲酸之替代親核催化劑存 在下執行之聚唾液酸化反應可延伸至其他治療蛋白質。例如，在本揭示案之各種態樣中，使用PSA胺氧基或PEG胺氧基試劑之上述聚唾液酸化或如上所述之聚乙二醇化反應可重複用於諸如本文所述之彼等蛋白質的治療蛋白質。

實例20

使用分支PEG使治療蛋白質聚乙二醇化

本揭示案之治療蛋白質之聚乙二醇化可延伸至由醛及含有活性胺氧基之合適連接物製成的分支或線性聚乙二醇化試劑。

實例21

其他治療蛋白質之聚唾液酸化

如本文所述，在如間甲苯胺或鄰胺基苯甲酸之替代親核催化劑存在下執行之聚唾液酸化反應可延伸至其他治療蛋白質。例如，在本揭示案之各種態樣中，使用PSA胺氧基或PEG胺氧基試劑之上述聚唾液酸化或如上所述之聚乙二醇化反應可重複用於諸如本文所述之彼等蛋白質的治療蛋白質。聚唾液酸化反應在個別反應步驟中或替代地在如本文所述之同時反應中執行。

實例22

使用分支PEG使治療蛋白質聚乙二醇化

根據本文提供之實例，本揭示案之治療蛋白質之聚乙二醇化可延伸至由醛及含有活性胺氧基之合適連接物製成的分支或線性聚乙二醇化試劑。

實例23

使用分支PEG使治療蛋白質聚乙二醇化

本揭示案之治療蛋白質之聚乙二醇化可延伸至由醛及含有活性胺氧基之合適連接物製成的如上所述的分支或線性聚乙二醇化試劑。聚乙二醇化反應在個別反應步驟中或替代地在如本文所述之同時反應中執行。

實例24

白蛋白之聚唾液酸化[依序方法]

PSA馬來醯亞胺根據實例14製備並且用於使用依序方法來經由自由SH-基團使人類血清白蛋白(HSA)聚唾液酸化。HSA以使用10mg/ml蛋白質濃度及3M試劑過量的反應緩衝液(20mM Na₂HPO₄,5mM EDTA,pH 7.0)中之TCEP試劑(參[4-羧乙基]膦鹽酸鹽/Thermo Scientific)來還原。將混合物在室溫下在黑暗中孵育1小時。然後TCEP藉由凝膠過濾使用PD-10管柱(GE-Healthcare)來分離。隨後，HSA以使用10莫耳試劑過量之反應緩衝液中之PSA馬來醯亞胺來進行化學修飾。修飾反應在溫度4℃下在黑暗中執行1小時，繼而使用L-半胱胺酸(最終濃度：10mM)執行中止步驟。添加L-半胱胺酸之後，反應混合物伴以輕微攪拌在相同溫度下再孵育一小時。最後，聚唾液酸化HSA藉由Q-Sepharose FF上之IEX來純化。

實例25

白蛋白之聚唾液酸化(同時方法)

PSA馬來醯亞胺根據實例14加以製備並且用於使用同時方法經由自由SH-基團將人類血清白蛋白(HSA)聚唾液酸化。將HSA溶解於反應緩衝液(20mM Na₂HPO₄,5mM EDTA,pH 7.0)中以給出10mg/ml最終濃度。向此溶液添加等分試樣之TCEP(參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽/Thermo Scientific)儲備溶液(5mg TCEP/ml反應緩衝液)以獲得4倍莫耳過量。將混合物孵育10分鐘，然後藉由添加10倍莫耳過量之PSA馬來醯亞胺試劑(實例14)來起始化學修飾。修飾反應在4℃下在黑暗中執行1小時。添加L-半胱胺酸之後，反應混合物伴以輕微攪拌在相同溫度下再孵育一小時。最後，聚唾液酸化HSA藉由Q-Sepharose FF上之IEX來純化。

實例26

A1PI之聚乙二醇化

具有1ml反應緩衝液(20mM Na₂HPO₄，5mM EDTA，pH 7.0)中之2.6mg A1PI(純A1PI起始材料)的若干批料藉由使用不同莫耳過量之還原劑TCEP來處理。此等研究之目標為針對PEG-馬來醯亞胺與A1PI之反應來優化TCEP濃度。

一方面與還原同時並且另一方面在移除還原劑之後依序執行10倍莫耳PEG過量之聚乙二醇化反應。針對兩種變體來測試最佳莫耳TCEP過量。

最後，在室溫下以基於所用PEG試劑數量10倍莫耳過量之半胱胺酸來中止混合物一小時。

最佳還原劑過量之確定

在修飾批料中，除了莫耳過量之TCEP以外的所有因子保持不變。由於此技術之目標為使20kD-MAL-PEG選擇性結合至A1PI之僅半胱胺酸，因此對於HPLC分析唯一必須考慮的事項為單-PEG-A1PI與原生A1PI之比率。在適用條件下未觀察到聚-PEG-A1PI，此證實特異性偶合之假設。

兩種偶聯物之比較證明與同時方法相比，在依序還原/聚乙二醇化的情況下，偶聯進行得好的多。即使以3莫耳過量之TCEP，亦達成約79%單PEG A1PI之最大比率，而在同時過程中，以4莫耳過量之TCEP獲得約74%之最高單-PEG-A1PI比率。亦在依序變體中測試以0.4、2及4mM(=8、40、80倍莫耳過量)濃度之巰基乙醇之還原，在比較中亦包括具有最高聚乙二醇化轉換率(turnover)的濃度(2mM)。結果證明巰基乙醇可為依序方法之適用替代方案，但是不適合於同時偶聯過程，因為其與MAL-PEG反應不相容。

測試最佳莫耳PEG過量

對於同時及依序過程二者，測試PEG過量對於聚乙二醇化反應之影響。為此目的，在關於優化還原劑(TCEP)之相同反應條件下處理修飾批料。將同時過程調整至4倍莫耳TCEP過量並且依序過程調整至3倍莫耳TCEP過量，亦即先前確定之理想還原劑過量。除PEG過量以外的所有因子保持不變。相應批料之聚乙二醇化轉換率之分析藉由HPLC執行。

兩種聚乙二醇化變體之比較(表2)顯示即使3倍莫耳PEG過量亦在 依序過程中產生多達85%之最大聚乙二醇化轉換率。另一方面，在相同反應條件(3倍PEG過量)下執行之同時過程甚至未實現此聚乙二醇化轉換率之一半。此外，表2顯示太高的PEG過量可能由於原生A1PI之較高比率而導致阻礙聚乙二醇化反應。

在依序過程中，藉由在憑藉PD-10管柱移除TECP期間以填充有相應PEG過量之Falkon管來收集經還原之A1PI，亦達成較好的聚乙二醇化速率，這是因為經還原之A1PI能夠與PEG直接反應，產生更高的聚乙二醇化轉換率。

相比之下，PEG試劑僅在TCEP優化中已進行PD-10管柱程序之後添加，以致於即使在此短暫停留時間之後，小部分經還原之A1PI似乎再氧化並且PEG轉換率較小。

實例27

以聚乙二醇化A1PI抑制彈性蛋白酶

單聚乙二醇化A1PI經由藉由如實例8所描述與MAL-PEG20kD反應以便對SH-基團進行修飾來製備並且經受活體外活性測試。此測試確定作為A1PI功能活性度量的其抑制豬胰腺彈性蛋白酶之能力。簡言之，A1PI或A1PI衍生物之彈性蛋白酶抑制因子活性在兩步反應中確定。在第一步驟中，A1PI樣品與過量豬彈性蛋白酶一起孵育。此舉導致複合物形成及彈性蛋白酶失活。在第二步驟中，藉由添加彈性蛋白酶-特異性發色受質Suc(Ala)₃-pNA來量測剩餘彈性蛋白酶活性。pNA之釋放可在405nm下以光度法量測並且為殘餘彈性蛋白酶活性之直接度量。殘餘彈性蛋白酶活性在與A1PI濃度成間接比例的預定範圍內。檢測校準藉由使用相對於α1-抗胰蛋白酶之第一WHO標準(WHO 05/162；12.4mg功能活性A1PI/mL)進行校準之A1PI參考製劑來達成。結果以mg活性A1PI/ml來表示。另外，總蛋白質含量藉由Bradford檢測來量測並且計算比率活性/總蛋白質。

作為結果，與未經修飾之A1PI相比，單聚乙二醇化A1PI修飾變 體之活性確定為74%。

Claims (33)

1. 一種製備治療蛋白質偶聯物之方法，其包括以下步驟：使治療蛋白質、或其生物學活性片段與硫醇還原劑及水溶性聚合物、或其功能衍生物在以下條件下接觸：(a)在該治療蛋白質上產生經還原之半胱胺酸巰基(sulfhydryl)，及(b)使得該水溶性聚合物與該經還原之半胱胺酸巰基偶聯；該治療蛋白質具有具備不超過一個可接近的半胱胺酸巰基之胺基酸序列；其中該治療蛋白質選自由以下組成之群：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、血管性血友病因子(Von Willebrand Factor，VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、因子XIII(FXIII)及凝血酶(FII)。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該治療蛋白質為醣蛋白。
3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該治療蛋白質在活體內經醣化。
4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該治療蛋白質在活體外經醣化。
5. 如申請專利範圍第1項之方法，其包括0.100與10.0克重之間之量的治療蛋白質。
6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：線性、分支或多臂水溶性聚合物。
7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該水溶性聚合物具有3,000與150,000道爾頓(Da)之間之分子量。
8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該水溶性聚合物為線性並且具有10,000與50,000Da之間之分子量。
9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該水溶性聚合物為線性並且 具有20,000之分子量。
10. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該水溶性聚合物選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、羥烷基澱粉(HAS)、多醣、聚三葡萄糖(pullulan)、殼聚糖(chitosan)、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉(polyoxazoline)、聚丙烯醯基嗎啉(polyacryloylmorpholine)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈(polyphosphazene)、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲縮醛)(PHF)，及其功能衍生物。
11. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該水溶性聚合物經衍生以含有選自由以下組成之群之巰基特異性基團：馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸、鄰吡啶-二硫化物(OPSS)及碘乙醯胺(iodacetamides)。
12. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該水溶性聚合物為PEG並且該巰基特異性基團為MAL。
13. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該水溶性聚合物為PSA並且該巰基特異性基團為MAL。
14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該硫醇還原劑選自由以下組成之群：參[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(Tris[2-carboxyethyl]phosphine hydrochloride，TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(dithioerythritol，DTE)、硼氫化鈉(NaBH ₄)、氰基硼氫化鈉(NaCNBH ₃)、β-巰基乙醇(BME)、鹽酸半胱胺酸及半胱胺酸。
15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該硫醇還原劑為TCEP。
16. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該硫醇還原劑濃度相對於 該治療蛋白質濃度為1與100倍之間莫耳過量。
17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該硫醇還原劑濃度相對於該治療蛋白質濃度為1與10倍之間莫耳過量。
18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該治療蛋白質之胺基酸序列含有不超過一個半胱胺酸殘基。
19. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該可接近的半胱胺酸巰基存在於該治療蛋白質之原生胺基酸序列中。
20. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該治療蛋白質之胺基酸序列經修飾以包含該可接近的半胱胺酸巰基。
21. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該治療蛋白質上產生經還原之半胱胺酸巰基之該等條件不使該治療蛋白質中之其他半胱胺酸胺基酸之間之二硫鍵還原。
22. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該治療蛋白質僅包含一個包含經完全或部分氧化之可接近巰基的半胱胺酸殘基，該僅一個半胱胺酸殘基不涉及與該治療蛋白質之胺基酸序列中之另一半胱胺酸殘基的二硫鍵。
23. 如申請專利範圍第1項之方法，其還包括純化該治療蛋白質偶聯物之步驟。
24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該治療蛋白質偶聯物使用選自由以下組成之群之技術純化：離子交換層析、疏水性相互作用層析、體積排除層析及親和層析或其組合。
25. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該治療蛋白質、水溶性聚合物及硫醇還原劑在單一容器中一起孵育，其中該經氧化之SH基團之還原與該偶聯反應同時執行。
26. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該硫醇還原劑係在與該治療 蛋白質一起孵育之後並且在將該治療蛋白質與該水溶性聚合物一起孵育之前被移除，其中該經氧化之SH基團之還原與該偶聯反應依序執行。
27. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質保持至少20%生物活性。
28. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該治療蛋白質偶聯物之至少70%包含單一水溶性聚合物。
29. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加之半衰期。
30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該治療蛋白質偶聯物相對於原生治療蛋白質具有增加為至少1.5倍之半衰期。
31. 一種製備治療蛋白質偶聯物之方法，其包括以下步驟：使治療蛋白質、或其生物學活性片段與硫醇還原劑及水溶性聚合物、或其功能衍生物在以下條件下接觸：(a)在該治療蛋白質上產生經還原之半胱胺酸巰基，及(b)使得該水溶性聚合物與該經還原之半胱胺酸巰基偶聯；該治療蛋白質具有具備不超過一個可接近的半胱胺酸巰基之胺基酸序列；其中該水溶性聚合物不是聚唾液酸(PSA)；其中該治療蛋白質選自由以下組成之群：A1PI(α-1蛋白酶抑制因子)、A1AT(α-1-抗胰蛋白酶)、ATR(α-1-抗胰蛋白酶相關蛋白質)、AACT或ACT(α-1-抗胰凝乳蛋白酶)、PI4(蛋白酶抑制因子4)、PCI(蛋白質C抑制因子)、CBG(皮質類固醇結合球蛋白)、TBG(甲狀腺素結合球蛋白)、AGT(血管緊縮素原)、中心粒蛋白(centerin)、PZI(蛋白質Z-依賴性蛋白酶抑制因子)、PI2(蛋白酶抑制因子2)、SCCA1(鱗狀細胞癌抗原1)、SCCA2(鱗狀細胞癌抗原2)、PI5(蛋白酶抑制因子5)、PI6(蛋白酶抑制因子6)、梅根蛋白(megsin)、PI8(蛋白酶抑制因子8)、PI9(蛋白酶抑制因子9)、PI10(蛋白酶抑制因子10)、埃披蛋白(epipin)、湯古蛋白(yukopin)、 PI13(蛋白酶抑制因子13)、PI8L1(蛋白酶抑制因子8樣1)、AT3或ATIII(抗凝血酶-III)、PN1(蛋白酶連接蛋白I)、PEDF(色素上皮細胞衍生因子)、PLI(胞漿素抑制因子)、C1IN或C1 INH(血漿蛋白酶C1抑制因子)、CBP1(膠原結合蛋白1)、CBP2(膠原結合蛋白2)、PI12(蛋白酶抑制因子12)、PI14(蛋白酶抑制因子14)、人類血清白蛋白、醇脫氫酶、膽綠素還原酶、丁醯膽鹼酯酶、補體C5a、皮質醇結合蛋白、肌酸激酶、鐵蛋白、介白素2、TF(組織因子)、玻連蛋白(vitronectin)、卵白蛋白、纖溶酶原(plasminogen)激活物抑制因子、神經絲抑蛋白(neuroserpin)、連接蛋白、α-2-抗纖溶酶、輔因子II、α1-微球蛋白、蛋白質C、蛋白質S、tPA及ADAMTS13蛋白酶。
32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該治療蛋白質為纖溶酶原激活物抑制因子，其為PAI-1或PLANH1(纖溶酶原激活物抑制因子-I)或PAI2或PLANH2(纖溶酶原激活物抑制因子-2)。
33. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該治療蛋白質為肝素輔因子，其為HC-II或HCF2(肝素輔因子II)。