相關申請案之交叉引用 不適用 關於聯邦獎助研究與開發之聲明 不適用 序列表之引用 依照37 C.F.R.1.821(c)，在此一起提交2017年10月5日創建且大小為278千位元組的命名為SEQUENCE LISTING USP62411120_ST25之符合ASCII之文本文件形式的序列表。前述文件之內容以全文引用的方式併入本文中。 本發明顯示，兩種抗原之融合物在免疫反應中產生出人意料之協同作用。 此外，本發明亦經由
hemB
(完全缺失，由此減小反突變成侵襲性表型之可能(Tuchscherr, 2011))使葡萄球菌之SCV表型穩定，使其能夠用作疫苗遞送系統。HemB編碼HemB蛋白質/單體，其組合以產生膽色素原合成酶或胺基乙醯丙酸酯脫水酶[EC 4.2.1.24]。此外，藉由使本發明之抗原，即基因SACOL0720失活實現進一步減毒，先前已顯示該抗原在陽離子肽抗性(Falord, 2012；Kawada-Matsuo, 2011；Meehl, 2007)及在活體內IMI期間(Allard, 2013)對於金黃色葡萄球菌極為重要。因此，表現本發明之構築體的該減毒雙重突變株可用於針對IMI之免疫接種及保護。
通用定義
呈現的標題及其他標識符，例如(a)、(b)、(i)、(ii)等，僅為了方便閱讀本說明書及申請專利範圍。在本說明書或申請專利範圍中使用標題或其他標識符未必需要按字母或數字次序或者步驟或要素呈現之次序進行步驟或要素。 在本說明書中，廣泛地利用多個術語。為了提供對本說明書及申請專利範圍(包括給出之此類術語之範疇)的清楚且一致之理解，提供以下定義。 當在申請專利範圍及/或說明書中與術語「包含」一詞結合使用時，使用詞語「
一個 ( 種 )
(
a / an
)」可意謂「一個(種)」，但其亦與「一或多個(種)」、「至少一個(種)」及「一個(種)或多於一個(種)」之含義相符。 在本申請案全文中，術語「
約
」用於指示值包括用於測定該值之裝置或方法之誤差的標準差。一般而言，術語「約」意圖指示至多10%之可能變化。因此，一個值之1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%及10%之變化包括在術語「約」內。除非另外指明，否則在一個範圍之前使用術語「約」適用於該範圍之兩端。 如本說明書及申請專利範圍中所使用，詞語「
包含
(
comprising
)」(及包含之任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有(having)」(及具有之任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括之任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及含有之任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」為包容性或開放性的且不排除其他未列出之要素或方法步驟。 如本文所使用，術語「
由 …… 組成
(
consists of
)」或「
由 …… 組成
(
consisting of
)」意謂僅包括在特別要求之實施例或請求項中具體陳述之要素、步驟或成分。
多肽、核酸及遞送系統
如本文所使用，術語「疫苗」係指能夠在宿主體內誘導/引發免疫反應且允許治療及/或預防感染及/或疾病的任何化合物/試劑(「疫苗組分」)或其組合。因此，此類試劑之非限制性實例包括蛋白質、多肽、蛋白質/多肽片段、免疫原、抗原、肽抗原決定基、抗原決定基，蛋白質、肽或抗原決定基以及分開添加或以相鄰序列形式(諸如在核酸疫苗中)添加的核酸、基因或基因部分(編碼所關注多肽或蛋白質或其片段)之混合物，及類似物。 在本發明之一態樣中，提供一種式I之融合構築體： X-A-連接子-B-Z (式(I))， 其中A與B相同或不同且各自獨立地為本發明之抗原多肽(亦即，其天然多肽、片段或變異體)。 在一具體實施例中，A及/或B係
( a )
包含以下之多肽：如圖24中所描繪之序列(SEQ ID NO:5及121至131)中之任一個中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如圖22D中所描繪之序列(SEQ ID NO:29及82至92)中之任一個中所述的SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如圖23I-J中所描繪之序列(SEQ ID NO:11及109至120)中之任一個中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611 (SEQ ID NO:189)、如圖25D中所描繪之序列(SEQ ID NO:152至164)中之任一個中所述的SACOL1867多肽、如圖21G-V中所述之SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944 (SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、如圖21H上之VI中所述的SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)。在一具體實施例中，以上多肽(a)係如以上所定義多肽之分泌或細胞外片段。可以使用例如軟體TMpred™(ExPASy) http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html、http://www.psort.org/ psortb/index.html http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html 及/或SignlP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預測跨膜結構域。TMpred™及
SignalIP 4.1
預測SACOL0720之細胞外結構域為：AA 310至508；SACOL0442為AA 36至203。Enzim預測出跨膜結構域SACOL1867(1-40)，因此細胞外結構域為：AA 41至239，而http://www.psort.org/psortb/index.html預測SACOL1867係細胞外蛋白質。由於以上提及之跨膜及/或信號肽結構域係推定的，故本發明涵蓋本文呈現之抗原(例如SACOL1867)具有或不具有信號肽及/或跨膜結構域之情形且涵蓋相應細胞外片段。在一個實施例中，以上提及之多肽係通常在細菌(例如金黃色葡萄球菌)之表面分泌或表現的多肽。 本發明所涵蓋的本文中所列金黃色葡萄球菌基因及其編碼之抗原多肽之Genbank寄存編號描繪於下表I中：
表 I
：本文所描述的IMI相關金黃色葡萄球菌基因及編碼多肽之GenBank寄存編號
由比對某些上文所列之多肽得到的共同序列呈現於圖21至25中。在該等共同序列之具體實施例中，共同序列(例如圖21至25中之共同序列)中之每個X定義為任何胺基酸，或當在比對中呈現之一或多種直系同源物中不存在該位置時不存在。在該等共同序列之具體實施例中，共同序列中之每個X定義為構成該比對中呈現之直系同源物中對應位置中的胺基酸中之任一個之保守或半保守取代的任何胺基酸，或當在該比對中呈現之一或多種直系同源物中不存在該位置時不存在。在圖21至25中，保守取代係以符號「:」指示，且半保守取代係以符號「.」指示。在另一個實施例中，每個X係指與該比對中呈現之直系同源物中對應位置中的胺基酸殘基中之任一個屬於相同種類的任何胺基酸，或當在該比對中呈現之一或多種直系同源物中不存在該位置時不存在。在另一個實施例中，每個X係指在該比對中呈現之直系同源物中之對應位置中的任何胺基酸，或當在該比對中呈現之一或多種直系同源物中不存在該位置時不存在。在一具體實施例中，A及/或B係滿足該等共同序列中之任一個或其片段的多肽。 保守胺基酸突變可以包括胺基酸之添加、缺失或取代；保守胺基酸取代在本文中定義為一個胺基酸殘基經具有類似化學特性(例如大小、電荷或極性)之另一胺基酸殘基取代。此類保守胺基酸取代可以為鹼性、中性、疏水性或酸性胺基酸經同一組之另一胺基酸取代(參見例如下表II)。術語「鹼性胺基酸」意謂側鏈pK值大於7之親水性胺基酸，其在生理pH下通常帶正電。鹼性胺基酸包括組胺酸(His或H)、精胺酸(Arg或R)及離胺酸(Lys或K)。術語「中性胺基酸」(又稱「極性胺基酸」)意謂側鏈在生理pH下不帶電，但在具有的至少一個鍵中兩個原子共同共有之電子對更靠近該等原子之一的親水性胺基酸。極性胺基酸包括絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、半胱胺酸(Cys或C)、酪胺酸(Tyr或Y)、天冬醯胺(Asn或N)及麩醯胺酸(GIn或Q)。術語「疏水性胺基酸」(又稱「非極性胺基酸」)意圖包括根據Eisenberg標準化共有疏水性標度(normalized consensus hydrophobicity scale)(1984)，展現大於零之疏水性的胺基酸。疏水性胺基酸包括脯胺酸(Pro或P)、異白胺酸(He或I)、***酸(Phe或F)、纈胺酸(VaI或V)、白胺酸(Leu或L)、色胺酸(Trp或W)、甲硫胺酸(Met或M)、丙胺酸(Ala或A)及甘胺酸(GIy或G)。「酸性胺基酸」係指具有pK值小於7之側鏈的親水性胺基酸，其在生理pH下通常帶負電。酸性胺基酸包括麩胺酸(GIu或E)及天冬胺酸(Asp或D)。 半保守胺基酸係一個殘基經具有類似空間構形但不共有化學特性之另一殘基置換。半保守取代之實例將包括半胱胺酸經丙胺酸或白胺酸取代；絲胺酸經天冬醯胺取代；纈胺酸經蘇胺酸取代；或脯胺酸經丙胺酸取代。 下表II指示胺基酸所屬各胺基酸種類。
胺基酸或核苷酸序列之間之相似性及一致性可以藉由比較比對序列中之每個位置測定。用於比較相似性及/或一致性之序列的最佳比對可以使用多種算法，例如使用此項技術中熟知之多序列比對程式/軟體，諸如ClustalW™、SAGA™、UGENE™或T-coffee™進行。多序列比對之實例描述於以下實例中且描繪於圖21A至25中。
基因操縱子
在另一個實施例中，A及/或B係
( b )
由來自與編碼如上文所定義之(a)之多肽的基因相同之操縱子之基因編碼的多肽。舉例而言，SACOL0718係來自與SACOL0720相同之操縱子的基因。
片段
在另一個實施例中，A及/或B係
( c )
包括含如上文所定義的(a)或(b)之至少13個連續胺基酸之免疫原性片段的多肽。 蛋白質/多肽之免疫原性片段定義為蛋白質/多肽中能夠在宿主體內誘導/引發免疫反應之部分。在一個實施例中，免疫原性片段能夠引發與該蛋白質/多肽種類相同但未必量相同之免疫反應。蛋白質/多肽之免疫原性片段較佳包含該蛋白質/多肽之一或多個抗原決定基。蛋白質/多肽之抗原決定基定義為該蛋白質/多肽中能夠引發特異性抗體及/或帶有能夠特異性結合該抗原決定基之受體之免疫細胞(例如T細胞或B細胞)的至少約4或5個胺基酸長度之片段。存在兩種不同類型的抗原決定基：線性抗原決定基及構形抗原決定基。線性抗原決定基包含一段連續胺基酸。構形抗原決定基通常係由在適當位置摺疊且一起形成適當摺疊之蛋白質中之抗原決定基的若干段連續胺基酸形成。如本文所使用，免疫原性片段係指該等抗原決定基類型中之一種或兩種。在單獨使用免疫原性片段(亦即，不與較大多肽構築體融合(例如與其他抗原片段融合))之一個實施例中，蛋白質/多肽之免疫原性片段包含至少16個胺基酸殘基。在另一實施例中，免疫原性片段包含天然蛋白質/多肽之至少16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160個連續胺基酸。在一具體實施例中，該片段具有該天然蛋白質/多肽之至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46 ,47、48、49、50或50或更多個連續胺基酸。在至少一個免疫原性片段形成較大多肽構築體之一部分(例如與其他抗原多肽、片段或其變異體融合)的一個實施例中，該免疫原性片段包含該多肽之至少13個連續胺基酸殘基。不受此限制，本發明所涵蓋之片段包括含以下中之至少13個連續胺基酸之免疫原性片段：如圖21中所示之SACOL029(及SACOL029直系同源物(例如圖24中所描繪)中之相應片段)；如圖21中所示之SACOL0442(及SACOL0442直系同源物(例如圖22中所描繪)中之相應片段)；如圖21中所示之SACOL0720(及SACOL0720直系同源物(例如圖23中所描繪)中之相應片段)；及如圖21中所示之SACOL1867(及SACOL1867直系同源物(例如圖25中所描繪)中之相應片段)。在另一個實施例中，本發明所涵蓋之片段包括含本發明之抗原蛋白質/多肽(如以上所定義之多肽(a))之至少一個抗原決定基的免疫原性片段。在另一個實施例中，本發明所涵蓋之片段包括含至少一個如圖21至25中之任一個中所描繪之抗原蛋白質/多肽中之任一種中描繪(加陰影)的抗原決定基之免疫原性片段。不受此限制，一個序列中之抗原決定基可以用軟體，諸如BCPred™、AAP™、FBCPred™及ABCPred™預測。 在一個實施例中，以上提及之免疫原性片段包含在至少兩種不同的金黃色葡萄球菌菌株中保守(亦即，一致)之序列。在其他實施例中，以上提及之免疫原性片段包含在至少3、4、5、6、7、8、9或10種不同金黃色葡萄球菌菌株中保守(亦即，一致)之序列。在另一個實施例中，以上提及之金黃色葡萄球菌菌株係COL、RF122、NCTC 8325、JH1、JH9、Newman、Mu3、Mu50、USA300-FPR3757、N315、MW2或MSSA476。在一個實施例中，以上提及之金黃色葡萄球菌菌株與牛乳腺炎有關(例如RF122)。
變異體
在另一個實施例中，以上提及之多肽或與該多肽大體上一致之多肽係在至少兩種不同金黃色葡萄球菌菌株中表現。如本文所使用，大體上一致係指多肽之胺基酸序列具有至少60%一致性，在實施例中具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在其他實施例中，多肽之胺基酸序列與其所比較之其他多肽具有至少60%、65%、70%,71%、72%、73%、74%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。 在另一個實施例中，A及/或B係
( d )
包含與如以上所定義的(a)至(c)中之任一個之多肽的序列總體至少60%一致之胺基酸序列的多肽。在其他實施例中，該胺基酸與(a)(例如在其全長內)至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在其他實施例中，該胺基酸與(a)至少60%、65%、70%,71%、72%、73%、74%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。舉例而言，圖21至25之比對中呈現的抗原直系同源物與其所比較之抗原或片段不一致，但存在一定一致性。該等圖中呈現之共同序列體現此類一致性百分比。 在另一個實施例中，A及/或B係
( e )
包括含(a)至(d)中任一個之至少13個連續胺基酸之免疫原性變異體的多肽。蛋白質/多肽之免疫原性變異體定義為蛋白質/多肽中能夠在宿主體內誘導/引發免疫反應之部分。一般技術者應瞭解，具有非天然存在之修飾(例如免疫原性變異體)且能夠誘導對未修飾試劑具有特異性之免疫反應(例如能夠誘導產生能夠識別該未修飾之試劑的抗體)的試劑(蛋白質/多肽、其片段)亦在術語「疫苗組分」之範圍內。舉例而言，本發明之疫苗組分可以經修飾以增強其活性、穩定性及/或生物利用率，及/或減小其毒性。可以例如藉由用包含酸性側鏈之另一胺基酸替代包含酸性側鏈之胺基酸、用另一大體積胺基酸替代大體積胺基酸、用包含鹼性側鏈之另一胺基酸替代包含鹼性側鏈之胺基酸及類似方式進行保守胺基酸取代。熟習此項技術者完全能夠產生蛋白質/多肽之變異體。此係例如經由篩選肽文庫或藉由肽改變程式進行。根據本發明之免疫原性變異體具有與該蛋白質種類基本上相同但量未必相同之免疫原性特性。本發明之蛋白質/多肽之免疫原性變異體可以例如包含融合蛋白及/或嵌合蛋白。舉例而言，預測作為外毒素、腸毒素或超抗原的本文中所鑑別之蛋白質(例如SACOL0442)的生物功能可以潛在地干擾哺乳動物免疫系統及抗體產生，及/或在宿主中顯示某種毒性。儘管在免疫接種期間，將SACOL0442多肽與例如SACOL0720組合使用時未觀察到此類干擾，但其可用於改變用於疫苗接種之蛋白質或多肽，由此降低外毒素之生物活性。為此目的，可用化學試劑(例如甲醛)使外毒素失活。亦可使用分子生物學技術使外毒素活性所涉及之推定區域缺失或突變，同時不喪失免疫原性(Chang等人, 2008)。另一實例係將基於胺基酸之組分與核酸(例如分開添加或以相鄰序列形式添加的基因或基因部分)碳水化合物，諸如在微生物多醣膠囊或生物膜中所發現的碳水化合物偶聯或混合。變異體之其他實例包括在N或C末端包含或在抗原序列內***可用於純化(例如親和純化)或用作間隔子或連接子之寡肽的本文所描述之抗原或其片段。可用於親和純化之寡肽之實例包括聚組胺酸標籤(例如包括或不包括RGS標籤的6至10個組胺酸殘基(例如HHHHHH、RGSHHHHHH或RGSHHHHHGS)。該his標籤之後亦可為適合於促進使用內肽酶移除聚組胺酸標籤之胺基酸序列。如式(I)中所述之「X」及/或「Z」區段亦可以包含此類可用於純化之寡肽及/或適合於促進移除此類可用於純化之寡肽的序列。 在具體實施例中，免疫原性片段包含多肽(a)之至少一個抗原決定基。不受此限制，在某些實施例中，免疫原性片段包含如圖21至25中呈現之序列中所描繪(加陰影)的多肽(a)之至少一個抗原決定基。在其他具體實施例中，變異體係如圖21至25中所揭示。
連接子
在融合蛋白結構域之間***連接子可以藉由增大結構域之間的距離，緩解構築體不同區段(例如抗原片段)之間之潛在排斥力，使蛋白質摺疊改善及/或恢復來增加生物活性。可以使用不同的多肽連接子序列且已知其具有獨特的特性，諸如可撓性、剛性或可裂解連接子。本發明涵蓋使用任何此類連接子，包括例如Chen等人, Adv Drug Deliv Rev. (2013), 65(10):1357-69中所列連接子中之任一種。本文中之實例提供有關所用特定連接子之說明(亦即，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)、ERKYK(SEQ ID NO:61)或/及EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62))，亦即富含維持兩個連接之結構域之間的距離且改善其摺疊的小親水性胺基酸之可撓性連接子結構。 在另一個具體實施例中，Fc包含CH2結構域、CH3結構域及鉸鏈區。在另一個具體實施例中，Fc係選自由以下組成之群之免疫球蛋白的恆定結構域：IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3及IgG-4。在另一個具體實施例中，Fc係免疫球蛋白IgG-1之恆定結構域。 可以在融合物之相鄰抗原之間包括連接子(例如，在包含兩個抗原之融合物中有1個連接子、在包含三個抗原之融合物中有2個連接子、在包含四個抗原之融合物中有三個連接子等)。在使用較大蛋白質結構域之融合物中，連接子可能較大且可包含片段可結晶區域(Fc)。 在一具體實施例中，連接子係含至少一個胺基酸之胺基酸序列或不存在。在一具體實施例中，連接子包含至少三個(至少4、5、6、7、8、9或10個)選自由以下組成之群之胺基酸：甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸、天冬胺酸、麩胺酸及離胺酸。在一具體實施例中，連接子係(EAAAK)n(SEQ ID NO:63)；(GGGGS)n(SEQ ID NO:67)；或(XPXPXP)n(SEQ ID NO:69)，其中x係任何胺基酸；其中n係1至5中之任一個，更具體言之為1、2、3、4或5；EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)；EAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:64)；GGGGS(SEQ ID NO:67)；GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:68)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)；XPXPXP(SEQ ID NO:69)，其中x係任何胺基酸；XPXPXPXPXPXP(SEQ ID NO:70)，其中x係任何胺基酸；ERKYK(SEQ ID NO:61)；ERKYKERKYK(SEQ ID NO:65)；ERKYKERKYKERKYK (SEQ ID NO:66)。在一更具體之實施例中，連接子係GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)、ERKYK(SEQ ID NO:61)或EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)。
構築體之 N 及 C 末端
X及Z各自獨立地不存在或為含至少一個胺基酸之胺基酸序列。不受此限制，其可為由選殖策略產生之一或多個胺基酸、用於便利構築體純化之胺基酸(例如聚組胺酸)、適合於促進使用內肽酶移除純化標籤之胺基酸。在融合構築體包含三個或三個以上抗原多肽之具體實施例中，X及/或Z中之任一個亦可包括另一抗原(抗原C、抗原D等)之序列及視情況至少一個其他連接子之序列。X及/或Z包含一或多個其他抗原且視情況包含連接子之此等具體實例可以更特定地例如以式(II)或(III)說明，如在融合物包含至少3個抗原時，遵循X'-C-連接子
1
-A-連接子
2
-B-Z'(II)；或在融合物包含至少4個抗原時，遵循X'-C-連接子
1
-A-連接子
2
-B-連接子
3
-D-Z'(III)。在式(II)及(III)中，X'、Z'、連接子
1
、連接子
2
及帶有連接子
3
之情形係相同或不同的且獨立地如本文所定義之式(I)中之X、Z及連接子所定義。 因此，在具體實施例中，融合構築體包含2、 3、4或更多個抗原多肽(及具有其他連接子之情形)。在一更具體之實施例中且不受此限制，融合構築體可以為SACOL0029_SACOL0442；SACOL0029_ SACOL0720；SACOL0029_SACOL1867；SACOL0029_ SACOL0720_SACOL1867；SACOL0029_SACOL1867_SACOL0442；SACOL0029_SACOL0720_SACOL0442；SACOL0442_SACOL0029_ SACOL0720；SACOL0442_SACOL0029_SACOL1867；SACOL0442_SACOL1867_SACOL0720；SACOL0720_SACOL0442_ SACOL1867；或SACOL0029_SACOL1867_SACOL0720_ SACOL0442，或抗原多肽呈任何其他次序的前述構築體中之任一種。
組合
本發明之構築體可以作為本發明之組合物(例如疫苗)之唯一免疫原性組分使用，或與一或多種其他融合構築體、免疫原性多肽、其片段或變異體及/或減毒活細菌(例如金黃色葡萄球菌)(表現或不表現融合構築體及/或多肽、其片段或變異體)組合使用。 該一或多種融合構築體可為包括如上文所定義之另一融合構築體的任何免疫原性融合構築體(參見例如實例14)。 用於本發明之組合物中的一或多個免疫原性多肽、其片段或變異體可為造成如本文所定義的本發明之組合物之免疫原性之任何多肽、片段或變異體。不受此限制，此類多肽、片段或變異體包括(a)包含以下之多肽：如圖24中所描繪之序列(SEQ ID NO:5及121至131)中之任一個中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如圖22D中所描繪之序列(SEQ ID NO:29及82至92)中之任一個中所述的SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如圖23I-K中所描繪之序列(SEQ ID NO:11及109至120)中之任一個中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611 (SEQ ID NO:189)、如圖25D中所描繪之序列(SEQ ID NO:152至164)中之任一個中所述的SACOL1867多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；(b)由來自與編碼(a)之多肽之基因相同的操縱子之基因編碼的多肽；(c)包括含(a)或(b)之至少13個連續胺基酸之免疫原性片段的多肽；(d)包含與(a)至(c)中任一個之多肽的序列總體至少60%一致之胺基酸序列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一個之至少13個連續胺基酸之免疫原性變異體的多肽，如上文所定義。不受此限制，任何此類多肽、片段或變異體均涵蓋實例1至14及21至26中所例示的組合物(例如疫苗#1至#8)中所包的多肽、片段或變異體。
減毒活細菌
用於本發明之組合物中的減毒活細菌(例如金黃色葡萄球菌)可以獨立於本發明之融合構築體及/或多肽、其片段變異體，或作為(亦即，可以表現)此類本發明之融合構築體及/或多肽、其片段或變異體之容器。 不受此限制，如本文中所說明，在本發明之組合情形中有用的減毒活細菌包括具有至少一個引起毒力(例如∆720)或促成宿主健康(例如代謝基因)之基因突變或缺失的葡萄球菌(例如金黃色葡萄球菌)。不受此限制，此類基因可為Novick 2003、Novick 2008或Maresso及Schneewind 2008中所鑑別之基因中之任一個。 在另一實施例中，可以藉由具有穩定的SCV表型使減毒活細菌進一步減毒。如本文所使用，術語「SCV表型」係指具有引起生長減慢、毒力因子表現改變及內化至宿主細胞中之能力的功能異常之氧化代謝的細菌。如本文所使用，術語«穩定SCV表型»用於表示保持SCV表型，亦即無法產生侵襲性反突變體(亦即，反突變成正常生長表型)之SCV菌株。此類穩定SCV金黃色葡萄球菌可以藉由使下表III中所列基因中之任一個突變或缺失(例如∆
hemB
)來產生。不受限制，本發明涵蓋使用實例15至25中所例示的穩定SCV金黃色葡萄球菌。如本文所使用，突變包括一或多個核苷酸之取代、缺失及/或***，以防止由本發明之基因編碼之多肽的表現或防止功能性多肽之表現。在一個較佳實施例中，突變防止多肽之表現。在另一個具體實施例中，在相同金黃色葡萄球菌之減毒活菌株或滅活菌株中之兩個突變係缺失或***。預期在本發明基因之一的任何位置具有防止多肽表現之突變的金黃色葡萄球菌突變菌株可以用作根據本發明之減毒活疫苗。減毒活疫苗，亦即包含呈減毒存活形式之根據本發明之細菌的疫苗，相較於滅活疫苗之優勢在於，其最佳地模擬天然感染方式。此外，其複製能力允許以較低細菌量進行疫苗接種；其數量將自動增加，直至其達到免疫系統之觸發量。自該時刻起，免疫系統將被觸發且最終將除去細菌。然而，使用減毒活細菌之微小不足之處可在於，固有地存留一定程度的毒力。此未必為實際不足之處，只要毒力程度係可接受的，亦即只要該疫苗至少減少細菌感染(例如IMI)症狀即可。當然，減毒活疫苗殘留的毒力越低，則在疫苗接種期間/之後，疫苗接種對體重增加之影響越小。 表III：與SCV表型有關之金黃色葡萄球菌基因的Genbank寄存編號(Kahl, 2014)
核酸
本發明之核酸較佳包含可操作地連接至基因表現所需之調控元件，諸如啟動子、起始密碼子、終止密碼子、強化子及聚腺苷酸化信號的編碼一或多種上述蛋白質/多肽(或其片段)之核苷酸序列。較佳選擇的調控元件在欲投與其之物種中係可操作的。在具體實施例中，核酸係如圖21至25中所描繪。 在本發明之內容內有向哺乳動物活體內投與本發明之核酸(例如核酸疫苗、DNA或RNA疫苗)以使得在該哺乳動物中表現一或多種所關注之蛋白質/多肽(或其片段)。
遞送系統
本發明疫苗之核酸可以為「裸」DNA或可以可操作地併入載體中。可以使用此項技術中熟知之方法，諸如直接注射DNA、受體介導之DNA吸收、病毒介導之轉染或非病毒轉染及基於脂質之轉染在活體內將核酸遞送至細胞中，所有該等方法皆可涉及使用載體。已使用直接注射在活體內將裸DNA引入至細胞中(參見例如，Acsadi等人(1991) Nature
332
:815-818；Wolff等人(1990)
Science 247
:1465-1468)。可以使用用於在活體內將DNA注射至細胞中的遞送裝置(例如「基因槍」)。此類裝置可以為可商購的(例如購自BioRad)。亦可藉由使裸DNA與偶合至細胞表面受體之配體的陽離子，諸如聚離胺酸形成複合物，將該DNA引入細胞中(參見例如，Wu, G.及Wu, C. H. (1988)
J. Biol. Chem
.
263
: 14621；Wilson等人(1992)
J. Biol. Chem
.
267
: 963-967；及美國專利第5,166,320號)。DNA-配體複合物與受體之結合可以促進受體介導之內吞作用引起的DNA吸收。DNA-配體複合物連接至破壞內體之腺病毒衣殼，由此釋放細胞質中之物質，可以用於避免該複合物經細胞內溶酶體降解(參見例如，Curiel等人 (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88
: 8850；Cristiano等人(1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90
:2122-2126)。 有用遞送載體包括可生物降解微膠囊、免疫刺激性複合物(ISCOM)或脂質體，及經遺傳工程改造之減毒活載體，諸如細胞、病毒或細菌。 脂質體載體係單層或多層囊泡，具有由親脂性物質形成之膜部分及內部含水部分。含水部分在本發明中用於容納欲遞送至靶細胞中之聚核苷酸材料。脂質體形成材料較佳一般具有陽離子基團，諸如四級銨基團；及一或多個親脂性基團，諸如具有約6至約30個碳原子之飽和或不飽和烷基。一組適合材料描述於歐洲專利公開案第0187702號中且亦論述於Wolff等人之美國專利第6,228,844號中，其相關揭示內容以引用的方式併入。許多其他適合之脂質體形成陽離子脂質化合物描述於文獻中。參見例如，L. Stamatatos等人, Biochemistry 27:3917 3925 (1988)；及H. Eibl等人, Biophysical Chemistry 10:261 271 (1979)。或者，可以利用微球體，諸如聚丙交酯-共乙交酯可生物降解微球體。如此項技術中所知，核酸構築體係用脂質體或微球體封裝或以其他方式形成複合物以將核酸遞送至組織。 較佳病毒載體包括噬菌體、疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰質炎病毒、牛痘病毒、缺陷性反轉錄病毒、腺相關病毒(AAV)及禽痘。轉型帶有外源DNA構築體之病毒載體的方法在此項技術中亦有充分描述。參見以上Sambrook及Russell。 如上所指出，可以藉由轉染或轉型將核酸(例如DNA或RNA)併入宿主，諸如活體外或離體宿主細胞(例如免疫細胞，諸如樹突狀細胞)，或如上所指出的減毒微生物宿主(例如減毒金黃色葡萄球菌、SCV等，參見例如實例25至26)中，且可以將表現所關注多肽(例如多個抗原或其對應片段之融合物及/或單一抗原或其片段)的經轉染或經轉型之細胞或微生物投與個體。在投與後，細胞將在個體中表現所關注蛋白質或多肽(或其變異體或片段)，該蛋白質或多肽繼而將誘導針對該蛋白質、多肽或其片段的免疫反應。 使用減毒活細菌免疫接種及/或遞送本發明之特定構築體或抗原混合物代表一種改善免疫反應的值得關注之方法(Griffiths及Khader, 2014)。模擬天然感染之減毒活生物體以一種有效的方式刺激免疫系統，引發廣泛且穩定之免疫反應，由此產生血清及黏膜抗體，以及協同作用以防止疾病的效應及記憶T細胞(Detmer及Glenting, 2006；Kollaritsch等人, 2000；Pasetti等人, 2011)。如此項技術中所知，適合減毒活細菌載體之實例包括金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門桿菌(
Salmonella typhimurium
)、傷寒沙門氏菌(
Salmonella typhi )
、志賀桿菌屬(
Shigella
)、芽孢桿菌屬(
Bacillus
)、乳桿菌屬(
Lactobacillus
)、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)、大腸桿菌(
Escherichia coli
)、霍亂弧菌(
Vibrio cholerae
)、彎曲桿菌屬(
Campylobacter
)或任何其他適合的細菌載體。轉型帶有外源DNA構築體之活細菌載體的方法在此項技術中有充分描述。參見例如，Joseph Sambrook及David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)。本發明涵蓋使用包含減毒活細菌(例如表現本發明之構築體之∆hemB∆720金黃色葡萄球菌)作為唯一免疫原性組分或其與各自表現本發明之另一多肽、片段或變異體(例如SACOL0442、SACOL0720或其片段或變異體)之其他減毒活細菌之組合的組合物。
組合物
本文所描述的多肽、核酸及遞送系統(例如包含核酸或載體之宿主細胞)可以調配成組合物。如本文所使用，術語「醫藥學上可接受」係指疫苗組分(例如賦形劑、載劑、佐劑)及組合物係生理上可耐受的且當投與個體時通常不會產生過敏性或類似不良反應，諸如反胃、眩暈及類似不良反應。較佳地，如本文所使用，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或洲政府之監管機構批准或在美國藥典或其他公認之藥典中列出適用於動物及人類。術語「賦形劑」係指可以與本發明之疫苗組分一起投與的稀釋劑、載劑或媒劑。可採用無菌水或生理食鹽水溶液以及右旋糖水溶液及甘油溶液作為載劑，特別是對於可注射溶液而言。 在一個實施例中，本發明之藥劑係與佐劑或免疫刺激劑組合投與。可以改善各組分之功效以產生免疫反應的適合佐劑或免疫刺激劑包括(但不限於)油(例如礦物油、乳化油，諸如MONTANIDE™或EMULSIGEN™-D)、金屬鹽(例如礬、氫氧化鋁或磷酸鋁)、陽離子肽(Bowdish等人, 2005；Hancock等人, 2000)，諸如吲哚力西丁(吲哚力西丁)、由母牛之免疫細胞產生之陽離子肽(Falla等人, 1996))、天然及人造微生物組分(例如細菌脂醣、弗氏佐劑(Freund's adjuvants)、胞壁醯二肽(MDP)、環狀二鳥苷-5'-單磷酸(c-di-GMP))、病原體相關分子模式(PAMPS)(諸如表面多醣、脂多醣、聚糖、肽聚糖或微生物DNA(例如CpG))、植物組分(諸如皂苷(例如Quil-A™))，及/或一或多種具有載劑作用之物質(例如膨潤土、乳膠粒子、脂質體、ISCOM™、DNA及聚磷腈(PCPP)共聚物)。亦可免疫接種含有經由TLR信號傳導以刺激促炎性細胞介素的抗原加配體之合成奈米粒子(諸如由可生物降解合成聚合物，如聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)製造之奈米粒子)(Kasturi等人, 2011)。 本發明之疫苗組分可以醫藥組合物形式投與。醫藥組合物可以單位劑型投與。可以採用任何適當的投與途徑，例如非經腸、皮下、肌肉內、***內、顱內、眶內、眼、室內、囊內、關節內、脊柱內、腦池內、腹膜內、鼻內、氣霧劑或經口投與。具體投藥途徑之實例包括非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、***內；口(例如吸入)；經皮(表面)；經黏膜及直腸投與。 可以採用習知醫藥實踐提供適合調配物或組合物以在存在或不存在佐劑情況下將此類疫苗組分投與個體。此項技術中熟知的用於製備醫藥組合物及調配物之方法見於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (第20版) A. R. Gennaro A R.編, 2000, Lippincott: Philadelphia中。用於非經腸投與之調配物可例如含有賦形劑、無菌水或生理食鹽水、聚伸烷基二醇(諸如聚乙二醇)、miglyol、植物來源之油或氫化萘。可使用生物可相容、可生物降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物控制化合物之釋放。其他可能用於本發明化合物之非經腸遞送系統包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物粒子、滲透泵、可植入輸注系統及脂質體。用於吸入或***內注射之調配物可以含有賦形劑，例如乳糖，或可以為含有例如聚氧化乙烯-9-月桂基醚、miglyol、甘膽酸酯及去氧膽酸酯之水溶液，或可以為油性溶液(例如石蠟油)以鼻滴劑形式或以凝膠形式投與。 治療性調配物可以呈液體溶液或懸浮液形式；對於經口投與，調配物可以呈錠劑或膠囊形式；且對於鼻內調配物，呈粉末、鼻滴劑或氣霧劑形式。用於非經腸、皮內、***內或皮下施用之溶液或懸浮液可以包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、生理食鹽水溶液、不揮發性油(例如石蠟油)、聚乙二醇、甘油、丙二醇、miglyol或其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；還原劑，諸如二硫蘇糖醇；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及用於調整張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼，諸如鹽酸或氫氧化鈉調節pH值。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成的安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。 適合於注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內或***內投與，適合載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor™ ELTM(BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。 口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載劑。其可以封裝於明膠膠囊中或壓縮成錠劑或飼料形式。出於經口投與疫苗之目的，活性組分可併有賦形劑且以錠劑、糖衣錠或膠囊或以飼料形式使用。可包括醫藥學上相容之黏合劑及/或佐劑物質作為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠及類似物可含有以下成分或具有類似性質之化合物中之任一種：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、Primogel™或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或sterotes；助流劑，諸如膠狀二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑。 對於藉由吸入投藥，疫苗組分係以氣霧劑噴霧形式自含有適合推進劑(例如氣體，諸如二氧化碳)之加壓容器，或噴霧器遞送。 亦可藉由經黏膜或經皮方式全身性投藥。對於經黏膜或經皮投藥，在調配物中使用適於滲透障壁之滲透劑。此類滲透劑一般為此項技術中已知的，且對於經黏膜投藥，包括例如清潔劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投藥可經由使用經鼻噴霧或栓劑實現。對於經皮投藥，如此項技術中一般所知，將活性化合物調配成軟膏、油膏、凝膠或乳膏形式。 亦可使用脂質體懸浮液(包括靶向特定細胞類型之脂質體)作為醫藥學上可接受之載劑。 醫藥組合物亦可含有防腐劑、增溶劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、氣味劑、用於改變滲透壓之鹽、緩衝劑、包覆劑或抗氧化劑。其亦可含有其他有治療價值的試劑。 靜脈內、肌肉內、皮下、***內或經口投與係較佳之使用形式。以有效量投與本發明之組分的劑量取決於特定活性成分之性質、宿主及個體之要求以及施用模式。
微生物靶
本發明之多肽、核酸及遞送系統可以用作針對葡萄球菌感染，包括引起***內感染(IMI)之葡萄球菌感染的抗微生物劑。在一個較佳實施例中，葡萄球菌感染係由金黃色葡萄球菌引起。
免疫接種多肽、核酸、載體、細胞、組合物及遞送系統之方法
本發明之方法、用途、醫藥組合物及套組涵蓋被動及主動免疫接種。 被動免疫接種係注射先前針對病原體(或本文所描述之抗原)產生的抗體或抗血清，以便保護或治癒感染或將來感染之接受體動物。保護作用在數週過程內衰退，在此期間用多肽、核酸或遞送系統(例如如上文所描述)主動免疫接種將有時間產生持續保護性反應。用於被動免疫接種之血清可以藉由使用如本文中所描述之多肽、核酸或遞送系統免疫接種供體動物來產生。該含有針對抗原之抗體的血清可以直接使用或在適當條件下儲存。其可以用於對抗急性感染(例如IMI)或作為預防(Tuchscherr等人, 2008)。在被動免疫接種中使用抗體或血清可以與其他藥劑，諸如抗生素組合以增加當前正在進展之感染的治癒率或增加對抗即將發生之感染的保護。 主動免疫接種係向個體投與如本文中所描述之多肽、核酸或遞送系統。 根據本發明之教示鑑別的組分具有預防及/或治療價值，諸如其可以用於產生免疫反應以預防及/或對抗疾病或病狀，且更特定言之，與微生物感染有關之疾病或病狀。 如本文所使用，術語「預防(prevent/preventing/prevention)」或「治療(treat/treating/treatment)」是指在個體中引發所需生物反應，亦即，預防及治療作用。根據本發明，治療作用包含在投與本發明之多肽、核酸或遞送系統(本發明之藥劑/組合物)後微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀之嚴重程度、強度及/或持續時間相較於在治療之前其在個體中之嚴重程度、強度及/或持續時間或相較於具有該感染或其任何症狀的未經處理之對照個體中之嚴重程度、強度及/或持續時間降低/減少中的一或多種。根據本發明，預防作用可以包含當與未經處理之對照個體(亦即，有經歷微生物(例如細菌)感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀之風險的無症狀個體)中之發作時間或其嚴重程度、強度及/或持續時間相比較時，在將來時間有經歷微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀之風險的無症狀個體中該微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀之發作延遲；或在本發明之藥劑/組合物投與後發生的微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀之嚴重程度、強度及/或持續時間降低/減少；及/或當與具有此類預先存在之微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀的未經處理之對照個體中微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀之進展相比較時，在投與本發明之藥劑/組合物後個體中任何預先存在之微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀的進展減少/減輕。如本文所使用，在治療性治療中，本發明之藥劑/組合物係在微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀發作之後投與。如本文所使用，在預防性治療中，本發明之藥劑/組合物係在微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀發作之前或在其發作之後但在其進展之前投與。 如本文所使用，「減少」或「減輕」微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症狀係指症狀相較於對照個體(未用本發明之藥劑/組合物治療之個體)減輕至少10%，在一個實施例中減輕至少20%，在另一實施例中減輕至少30%，在另一實施例中減輕至少40%，在另一實施例中減輕至少50%，在另一實施例中減輕至少60%，在另一實施例中減輕至少70%，在另一實施例中減輕至少80%，在另一實施例中減輕至少90%，在另一實施例中減輕100%(完全抑制)。 如本文關於葡萄球菌感染使用之術語「症狀」係指任何葡萄球菌感染症狀，諸如疼痛、炎症、發熱、嘔吐、腹瀉、疲勞、肌肉疼痛、食慾不振、脫水、低血壓、蜂窩組織炎、膿皰、癤子及燙傷樣皮膚症候群。更確切地說，就葡萄球菌IMI而言，葡萄球菌IMI症狀係指例如目測乳汁異常(例如水樣外觀、片狀、結塊、異味、存在血液)、***發紅、***腫脹、***壓痛、直腸溫度升高(＞39.0℃)、食慾不振、瘤胃活動性降低及疲勞。乳汁體細胞計數(SCC)增加係另一種葡萄球菌IMI。乳汁體細胞包括白血球，諸如白細胞或嗜中性球，以及上皮細胞。一般認為SCC ＞200,000個/mL可表示葡萄球菌IMI症狀或指示葡萄球菌IMI。
劑量
疫苗組分引起免疫反應之毒性或功效可以藉由細胞培養或實驗動物之標準程序測定。可量測有毒作用與免疫刺激作用之間之劑量比率。展現較大比率之組分較佳。儘管可以使用展現有毒副作用之組分，但應當小心地設計遞送系統以便使可能的細胞損傷減到最少並由此減小副作用。 自細胞培養分析法及實驗室動物研究獲得的資料可用於調配用於大型動物及人類的劑量範圍。此類組分之劑量較佳處於包括具有很小毒性或無毒性之投與濃度之範圍內。劑量可取決於所用劑型及所用投藥途徑而在此範圍內變化。 可以向個體投與任何適合量的醫藥組合物。劑量將取決於許多因素。通常，在單次劑量內所包含的活性成分之量將為有效地預防或治療IMI，且不誘導顯著毒性的量。熟練技術人員應瞭解，某些因素可能影響在個體中有效地產生免疫反應所需的劑量。另外，本發明之抗原(例如融合構築體)之治療有效量可能需要一系列劑量。一般而言，可考慮每劑約0.01 mg至500 mg量的包括融合構築體之抗原。在一具體實施例中，可考慮每劑約0.1 mg至1 mg量的包括融合構築體之抗原。一般而言，一劑、兩劑或三劑疫苗可以促進最佳免疫之發展。兩次劑量之間的時間可以短至三或四週，但使初始劑量(第一劑)與加強劑量(第二劑)間隔五、六、七、八、九或十週，隨後用加強注射刺激免疫系統可能為較佳的。後續加強注射(強化注射(recall shot))亦可最佳提供可持續之免疫。該強化注射可以例如每半年(6個月)、每年、每兩年、每三年或每五年進行。 「樣品」或「生物樣品」係指自活體分離之任何固體或液體樣品。在一個特定實施例中，其係指自哺乳動物分離之任何固體(例如組織樣品)或液體樣品，諸如乳汁、活檢材料(例如固體組織樣品)、血液(例如血漿、血清或全血)、唾液、滑液、尿液、羊膜液及腦脊髓液。此類樣品在分析感染原之表現量之前可以例如為新鮮的、經固定(例如福爾馬林、醇或丙酮固定)、經石蠟包埋或經冷凍。
患者
如本文所使用，術語「個體」或「患者」係指作為治療、觀察或實驗之對象的動物，較佳為哺乳動物，諸如(但不限於)人類、母牛(例如雌牛犢、經產母牛、初產母牛、小牛)、山羊、綿羊、母羊、驢、馬、豬、雞、貓、狗等。在一具體實施例中，其係母牛(例如有經歷葡萄球菌(例如IMI)感染之風險)。 如本文所使用，術語「在將來時間有經歷葡萄球菌感染(例如葡萄球菌感染(例如IMI)或其任何症狀之風險的個體」係指用於產奶或產肉之哺乳動物(例如母牛(例如雌牛犢、經產母牛、初產母牛、小牛)、山羊、綿羊)。 在一個實施例中，以上提及之哺乳動物係母牛。
偵測方法
量測所選蛋白質/多肽之量/含量的方法之實例包括(但不限於)：西方墨點法(Western blot)、免疫墨點法、酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫沈澱法、表面電漿子共振法、化學發光、螢光偏光、磷光、免疫組織化學分析、基質輔助雷射脫附/電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜法、顯微細胞測量術(microcytometry)、微陣列、顯微鏡檢查、流式細胞測量術，及基於蛋白質之特性，包括(但不限於)DNA結合、配體結合、與其他蛋白質搭配物之相互作用或酶活性的分析法。 在一個實施例中，使用特異性針對多肽/蛋白質的抗體在本發明之方法內偵測多肽/蛋白質之量。如本文所使用，術語「抗體」涵蓋單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需生物活性或特異性即可。「抗體片段」包含全長抗體之一部分，一般為其抗原結合區或可變區。抗體與靶多肽之間之相互作用係藉由輻射量測、色度或螢光方式偵測。可以藉由添加偶合至可偵測標籤，諸如酶、螢光團或發色團之二次抗體偵測抗原-抗體複合物。 用於製備抗體之方法係此項技術中熟知的。可以藉由用所關注多肽/蛋白質或其片段作為免疫原對適合個體(例如兔、山羊、小鼠或其他哺乳動物)免疫接種來製備多株抗體。多肽/蛋白質「片段」、「部分」或「區段」係具有上述多肽中之至少約5、7、10、14、15、20、21個或更多個胺基酸的胺基酸殘基鏈段。可以藉由標準技術，諸如使用固定之外吐小體標記物多肽或其片段的酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)，隨時間監測經免疫接種之個體中的抗體力價。在免疫接種之後的適當時間，例如當抗體力價最高時，可以自動物，通常小鼠獲得產抗體細胞，且可以使用產抗體細胞，藉由標準技術，諸如最初由Kohler及Milstein(1975)Nature 256: 495-497描述的融合瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor等人(1983)Immunol. Today 4: 72)、EBV-融合瘤技術(Cole等人(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld及Sell編(Alan R.Liss, Inc., New York, NY), 第77-96頁)或三源融合瘤技術製備單株抗體。用於產生融合瘤之技術係熟知的(一般參見Coligan等人編(1994) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY)。 或者，為了製備單株抗體分泌性融合瘤，可以藉由用多肽或其片段篩選重組組合免疫球蛋白文庫(例如抗體噬菌體展示文庫)，由此分離出結合該多肽之免疫球蛋白文庫成員來鑑別並分離單株抗體。用於產生及篩選噬菌體展示文庫之套組係可商購的(例如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System™，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAP™噬菌體展示套組，目錄號240612)。 另外，針對一或多種本文所描述之多肽/蛋白質的抗體亦可自商業來源獲得。 本發明亦涵蓋使用對多肽/蛋白質具有特異性之固定抗體且其係一般熟習此項技術者熟知的。抗體可固定至多種固體支撐物上，諸如磁性或層析基質粒子、分析位置(諸如微量滴定孔)之表面、固體基質材料(諸如塑膠、耐綸、紙)片及類似物。可以藉由在固體支撐物上以陣列方式塗佈該抗體或複數種抗體來製備分析條帶。此條帶接著可浸漬於測試樣品中，且接著藉由洗滌及偵測步驟快速處理，產生可量測信號，諸如彩色點。 複數種(2種或2種以上)多肽/蛋白質之分析可以用一份測試樣品分別或同時進行。若干多肽/蛋白質可以組合於一項測試中以高效處理多份樣品。 多肽/蛋白質之分析亦可以多種物理形式進行。舉例而言，可使用微量滴定板或自動化以便利大量測試樣品之處理。或者，可以開發單一樣品形式以便利以及時方式即時治療及診斷。特別有用的物理形式包含具有複數個不連續、可定址位置用於偵測複數種不同分析物之表面。此類形式包括蛋白質微陣列或「蛋白質晶片」(參見例如，Ng及Ilag, J.Cell Mol. Med. 6: 329-340, 2002)及毛細管裝置。 在一個實施例中，以上提及之表現量係藉由量測自該一或多個基因轉錄之mRNA的表現量測定。 測定核酸(mRNA)含量之方法係此項技術中已知的，且包括例如聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉錄酶-PCR(RT-PCR)、SAGE、定量PCR(q-PCR)、南方墨點法(Southern blot)、北方墨點法(Northern blot)、序列分析、微陣列分析、報導基因偵測或其他DNA/RNA雜交平台。對於RNA表現，較佳方法包括(但不限於)：提取細胞mRNA及使用與編碼一或多種本發明之蛋白質/多肽之編碼核酸之全部或一部分的轉錄物雜交之經標記探針進行北方墨點法；使用特異性引子、聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR(q-PCR)及逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增由一或多種編碼本發明之蛋白質/多肽之核酸表現的mRNA，隨後藉由多種方式中之任一種定量偵測產物；自生物樣品提取總RNA，接著標記並用於探測排列在多種表面中之任一種上的編碼本發明之蛋白質/多肽編碼核酸之全部或一部分的cDNA或寡核苷酸。
套組
本發明亦涵蓋包含本發明之組分的套組。舉例而言，該套組可以包含一或多種組分。該等組分可以包裝於適合投與之容器及裝置中。該套組可以進一步包含有關使用該套組之說明書。 本發明亦提供一種用於治療及/或預防葡萄球菌IMI之套組或包裝，其包含可用於向有需要之個體投與一或多種本發明之構築體、多肽、核酸、載體、宿主、組合物或其中至少兩種之組合的試劑。此類套組可以進一步包含例如有關預防及/或治療葡萄球菌IMI之說明書、容器、可用於執行該等方法之試劑。必要時，該套組進一步包括用於降低測試中之背景干擾的試劑、用於增加信號之試劑、用於組合及內插標記物值以產生對所關注臨床結果之預測的軟體及算法、用於進行測試之設備、校準曲線及圖表、標準化曲線及圖表，及類似物。
用於 進行本發明之模式
本發明藉由以下非限制性實例進一步詳細說明。
實例 1 ： 有關包括 SACOL0029 、 SACOL0442 、 SACOL0720 、 SACOL1867 、 SACOL1912 及 SACOL2385 之 疫苗 ( 疫苗 # 1 ) 之 材料及方法 製備抗原 .
選擇在金黃色葡萄球菌牛***內感染期間大量表現之六種抗原納入第一種牛疫苗(疫苗#1)中。該等抗原係：SACOL0029(GenBank寄存編號:YP_184940.1)(SEQ ID NO: 5)、SACOL0442 (YP_185332.1)(SEQ ID NO:29)、SACOL0720(YP_185601.1)(SEQ ID NO: 11)、SACOL1867(GenBank寄存編號：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、SACOL1912(GenBank寄存編號：YP_186737.1)(SEQ ID NO:43)及SACOL2385(GenBank寄存編號：YP_187189.1)(SEQ ID NO:50)。由GenScript,Inc.(Piscataway, NJ)對His標記的SACOL0029、SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385之重組蛋白質進行工程改造及製造。根據製造商之推薦，使用來自Qiagen Inc.(Mississauga, ON, Canada)之QIA表現技術(pQE30質體)工程改造及製造His標記的SACOL0442及SACOL0720之重組蛋白質。有關his標記之抗原序列，參見圖21 I至VI。實例2至5及圖1至4係關於該疫苗#1。
對奶牛免疫接種 .
將十九頭處於泌乳中期的健康經產荷斯坦母牛(Holstein cow)圈養於加拿大農業與農產品部奶牛及豬研究與開發中心(Dairy and Swine Research and Development Centre of Agriculture and Agri-Food Canada；Sherbrooke, QC)的II級生物安全畜棚中。將母牛隨機分成2組：一組(10頭母牛)接受生理食鹽水(安慰劑組)；另一組(9頭母牛)接受疫苗#1(疫苗接種組)。該疫苗係由六種抗原(SACOL0029、SACOL0720、SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385)各300 μg組合Emulsigen™-D(MVP Technologies, Omaha, NE)、CpG ODN 2007(TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:194)，一種病原體相關分子模式(PAMP)，VIDO, Saskatoon, SW)及陽離子肽吲哚力西丁(ILPWKWPWWPWRR(SEQ ID NO:195)，用於誘導母牛之免疫反應(Chemprep Inc., Miami, FL)構成。間隔10週在頸部中經皮下進行兩次免疫接種。未觀察到不良副作用。在第一次免疫接種之前(免疫前血清)並且接著每兩週取得尾靜脈血液及牛奶樣品以偵測總IgG、IgG1及IgG2。在第一次免疫接種之前及第一次免疫接種之後14週(亦即，在第二次免疫接種之後4週)自頸靜脈取得較大體積之血液(150 mL)進行外週血液單核細胞(PBMC)分離並分析細胞免疫反應。
藉由 ELISA 偵測總 IgG 、 IgG1 及 IgG2 .
如先前所描述且稍加修改(Ster等人,
Vet. Immunol. Immunopathol.
(2010), 136: 311-318)，偵測針對血清及牛奶中之每一抗原的總IgG、IgG1及IgG2。用測試抗原(5 µg/mL在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中稀釋，Sigma Aldrich, Oakville, ON)塗佈Nunc MaxiSorp™ 96孔盤(Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)並在37℃下培育隔夜。接著，在37℃下，用含有0.5%明膠之PBS(BD，Franklin Lakes, NJ)使該等盤飽和，保持1小時。將一百微升在含有0.5%明膠及0.1% Tween™ 20之PBS中的血清之兩倍連續稀釋液裝載至盤中並在37℃下培育1小時。用含有0.1% Tween™ 20之PBS洗滌該等盤三次。將一百微升辣根過氧化酶(HRP)偶聯之二次抗體添加至該盤中。使用的二次抗體係分別在含有0.5%明膠及0.1% Tween™ 20之PBS中以1/50,000、1/20,000及1/20,000稀釋的山羊抗牛IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)、綿羊抗牛IgG1(AbD Serotec, Raleigh, NC)或綿羊抗牛IgG2(AbD Serotec)。在37℃下培育1小時隨後洗滌3次之後，根據製造商之推薦，用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)試劑(KPL Inc., Gaithersburg, MD)偵測過氧化酶活性。 使用相同程序且略加修改，偵測牛奶中之總IgG、IgG1及IgG2。將牛奶樣品稀釋於含有0.5%明膠之PBS中。將綿羊抗牛IgG2係以1/10,000稀釋於含有0.5%明膠及0.1% Tween™ 20之PBS中。
評價細胞免疫反應
. 如先前所描述(Loiselle等人,
J . Dairy . Sci .
(2009), 92:1900-1912)，自頸靜脈血液分離出PBMC並用二乙酸羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFDA-SE；Molecular Probes Inc., Eugene, OR)標記。在CFDA-SE標記程序結束時，使該等PBMC懸浮於含有5% FBS及1X抗生素/抗黴菌素(A5955, Sigma Chemical Aldrich)之RPMI培養基中。用最終濃度為1 µg/mL之有絲***原伴刀豆球蛋白A(ConA；陽性對照；Sigma Aldrich)，或各抗原(每孔5 µg)刺激該等PBMC(5×10
6
個細胞/孔)並在37℃下培育7天。在無任何有絲***原下培育該等PBMC作為陰性對照。刺激係一式兩份進行(Ster等人, 2010)。 在與不同有絲***原一起培育之後，評價CD4+及CD8+細胞之增殖情況。以300×g離心細胞5分鐘，使其懸浮於含有0.5% BSA之PBS中。接著添加與Alexa Fluor™ 647偶合之小鼠抗牛CD8(以1/20稀釋，AbD serotec)及與rPE偶合之小鼠抗牛CD4(以1/20稀釋，AbD serotec)。在冰上培育20分鐘之後，用含有0.5% BSA之PBS洗滌細胞三次。接著使細胞懸浮於含0.5%甲醛之PBS中。在BD FACS Canto II流式細胞儀上，使用BD FACS Diva軟體藉由流式細胞測量術測定增殖群之百分比。
奶牛中之實驗性金黃色葡萄球菌 IMI
. 在使用細菌培養物進行實驗性IMI之前，確定細菌培養物之吸光度(A600 nm)與CFU之間的關係。在激發當天，將含一定體積金黃色葡萄球菌隔夜培養物之米勒辛頓培養液(Mueller Hinton broth，MHB；BD)轉移至200 mL新鮮MHB中以獲得0.1之A600 nm，且隨後使其在35℃下生長，直至A600 nm在指數生長期達到對應於10
8
CFU/mL之值。用於該實驗性感染之菌株(CLJ08-3)已預先在共同發明者之實驗室中表徵(Allard等人,
Vet. Microbiol.
(2013) 162: 761- 770)。對於***內輸注，常規地在無菌PBS(Sigma Aldrich)中稀釋細菌以在3 mL中達到約50 CFU。在本實驗中，將接種物塗鋪於TSA上並發現其在3 mL中含有63 cfu。 在實驗性IMI之前，進行體細胞計數(SCC)測定及無菌乳區牛奶樣品之細菌分析以確保所有母牛均無IMI。根據先前所描述之程序(Petitclerc等人,
J . Dairy . Sci .
(2007), 90: 2778-2787)且略加修改，在晚間擠奶之後，在每頭母牛四個乳區中之三個(隨機選擇)中進行乳區之實驗性細菌輸注。簡言之，在接種之前，用浸泡於70%乙醇中之紗布擦洗乳頭。使乳頭空氣乾燥，隨後將3 mL細菌懸浮液(含有63 CFU)經***內輸注至四個乳區中的三個中。在輸注之後，立即充分按摩所有乳區並將乳頭浸入基於碘伏之乳頭消毒劑中。在整個程序中穿戴拋棄式分指手套並在進行至下一動物之前消毒。輸注金黃色葡萄球菌的所有乳區變得感染且所有母牛在輸注金黃色葡萄球菌之後前幾天期間的某一時間顯示乳腺炎的臨床症狀(炎症及/或較差牛奶外觀)。
評價在實驗性感染之後金黃色葡萄球菌活菌計數
. 實驗性感染之後的前3週期間一週三次並且接著在其餘2週一週兩次在早晨擠奶之前取得無菌牛奶樣品。在丟棄前奶且用70%乙醇對乳頭消毒之後，對於每一個別乳區，將10 mL牛奶樣品無菌收集於50 mL無菌小瓶中。連續稀釋牛奶樣品且將100 μL各稀釋液塗鋪於胰蛋白酶大豆瓊脂(Becton Dickinson)及甘露糖醇鹽瓊脂盤(Becton Dickinson)上以測定CFU並鑑別金黃色葡萄球菌。接著在35℃下培育盤24小時，隨後對菌落計數。使用顯示菌落數在30個與300個之間的稀釋液計算細菌濃度。每一稀釋液係一式兩份塗鋪。
評價體細胞計數 .
以與無菌牛奶樣品相同之頻率，在早晨擠奶時使用個別乳區擠奶單元收集牛奶並稱重以測定乳區牛奶產量。亦自各乳區擠奶單元獲得非無菌50 mL樣品以藉由商業實驗室(Valacta Inc., Ste-Anne-de-Bellevue, QC, Canada)測定SCC。每頭母牛上之擠奶單元在其使用之間用基於碘之殺菌劑清潔劑(K.O.Dyne®, GEA Farm Technologies, Westmoreland, NY)充分洗滌並消毒。接觸牛奶之所有其他材料均用70%乙醇消毒。
統計分析
. 使用SAS(SAS Institute Inc., Cary, NC)之MIXED程序作為重複量測方式進行實驗性感染資料之統計分析。為分析SCC及CFU，在分析之前對資料進行log10轉換。使用GraphPad Prism™ v6.05進行抗體力價及CFU與SCC之間相關性的統計分析。
倫理學聲明 .
所有動物實驗均得到加拿大農業與農產品部地方機構動物護理委員會(Agriculture and Agri-Food Canada local institutional animal care committee)的批准並根據加拿大動物護理委員會(Canadian Council on Animal Care)之指導原則進行。
實例 2 ： 在疫苗接種之後的血清總 IgG1 力價 - 疫苗 # 1
如實例1(
製備 抗原及對奶牛免疫接種
)中所描述，製備有關SACOL0029(Genbank寄存編號：YP_184940.1)(SEQ ID NO: 5)、SACOL0442(SEQ ID NO:29)、SACOL0720(SEQ ID NO: 11)、SACOL1867(Genbank寄存編號：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、SACOL1912(Genbank寄存編號：YP_186737.1)(SEQ ID NO:43)及SACOL2385(Genbank寄存編號：YP_187189.1)(SEQ ID NO:50)之重組His標記之抗原並投與健康母牛。有九頭奶牛接受疫苗且10頭母牛接受生理食鹽水(安慰劑)。如實例1(
藉由 ELISA 偵測總 IgG 、 IgG1 及 IgG2
)中所描述，偵測總血清IgG、IgG1及IgG2力價。 正如預期，且如圖1B-C中所示，相較於安慰劑組，在疫苗接種組中免疫接種誘導抗原特異性血清IgG1及IgG2之產生增加。有趣的是，對於SACOL0442，IgG2/IgG1比率係1(參見圖1D)，指示針對該抗原的平衡Th1/Th2免疫反應。對於抗原SACOL0029、SACOL0720、SACOL1912及SACOL2385，IgG2/IgG1比率明顯低於SACOL0442之比率，指示該等抗原主要經由Th2路徑誘導IgG1抗體反應。
實例 3 ： 在疫苗接種之後的抗原依賴性血液
CD4+
及
CD8+
細胞增殖
-
疫苗
#1 對於各抗原，在第二次免疫接種(即將實驗性感染之前)之後四週，如實例1(
評價細胞免疫反應
)中所描述，評價來自經疫苗接種之母牛(9)及安慰劑母牛(10)之血液CD4+及CD8+細胞的抗原依賴性增殖情況。有關CD4+細胞之結果顯示於圖2中，其中每個符號表示在與陽性對照(ConA)或各抗原一起培育一週之後每頭母牛中增殖之CD4+細胞的百分含量。空心圓(○)表示經疫苗接種之母牛之資料，黑色正方形(■)表示安慰劑母牛之資料。水平線表示中值：虛線表示經疫苗接種之母牛之中值，而連續線表示安慰劑母牛之中值。 符號*顯示針對抗原SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及SACOL1912，疫苗接種組與安慰劑組之間之統計差異(*，P＜0.05)。 此外，對於除抗原SACOL0720之外的所有抗原，經疫苗接種之母牛及安慰劑母牛的CD8+細胞增殖類似，對於抗原SACOL0720，在經疫苗接種之母牛中觀察到較高CD8+細胞增殖(資料未顯示)。CD8+細胞之誘導看來對於感染之消退亦很重要(Riollet等人, 2001；Burton及Erskine, 2003)。疫苗能夠刺激細胞(CD8+)及體液(CD4+)兩種免疫反應。利用不同抗原之疫苗#1引起平衡的免疫反應。
實例 4 ： 如藉由跟蹤體細胞計數 ( SCC ) 之變化評價的 疫苗之保護作用 - 疫苗 # 1
如實例1(
奶牛中之實驗性金黃色葡萄球菌 IMI
、
在實驗性感染之後評價金黃色葡萄球菌活菌計數
、
評價體細胞計數
及
統計分析
)中所描述，對奶牛進行實驗性金黃色葡萄球菌感染並加以評價。在第二次免疫接種之後四週及4天，在晚間擠奶時，將63 CFU之金黃色葡萄球菌輸注至經疫苗接種母牛(9)及安慰劑母牛(10)之4個乳區中之3個中(第1天，圖3中之箭頭)。在早晨擠奶時取得無菌牛奶樣品並由Valacta(Ste-Anne-de-Bellevue, QC)測定SCC。結果顯示於圖3中，其中空心圓(○)及虛線表示經疫苗接種母牛之資料，而黑色正方形(■)及連續線表示安慰劑母牛之資料。每個空心圓表示經疫苗接種母牛之所有經感染乳區(27個)的平均SCC，而每個正方形表示安慰劑母牛所有經感染乳區(30個乳區)之平均SCC。 在激發期間，發現經疫苗接種母牛之牛奶中的SCC明顯低於安慰劑母牛(***；P＜0.001)，指示在經疫苗接種母牛中炎症較少及對感染之較佳控制。
實例 5 ： 金黃色葡萄球菌 ( CFU ) 之 SCC 或活菌計數相對於針對特異性抗原之血清或牛奶 IgG 力價之間的相關性 - 疫苗 # 1
如圖4A-B中所示，SCC與激發期之金黃色葡萄球菌CFU呈正相關(圖4A，r=0.82，P＜0.0001)且與在感染之前量測的針對SACOL0442之血清IgG1力價呈負相關(圖4B，r=-0.49，P＜0.05)。因此，疫苗接種使此由激發誘導之炎症標準減小。利用在第10天收集之樣品進行類似分析。觀察到與先前所獲得相同之相關性，但在此特定時間點，SCC及金黃色葡萄球菌CFU亦與針對SACOL0029之牛奶IgG2力價相關(圖4C，分別為r=-0.48，P＜0.05及r=-0.58，P＜0.05)。該等結果顯示，在針對感染之免疫反應中涉及超過一種抗原。
實例 6 ： 有關包括 SACOL0442 、 SACOL0720 以 及 SACOL1867 與 SACOL0029 之 融合物之疫苗的材料及方法 - 疫苗 # 2 製備抗原
. 選擇在金黃色葡萄球菌牛***內感染期間大量表現之四種抗原納入疫苗#2中。該等抗原係由以下編碼之多肽：SACOL0029(Genbank寄存編號：YP_184940.1)(SEQ ID NO: 5)、SACOL1867(Genbank寄存編號：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、SACOL0442(SEQ ID NO:29)及SACOL0720(SEQ ID NO: 11)。包括呈融合物形式的SACOL0029及SACOL1867抗原。由GenScript, Inc.(Piscataway, NJ)對His標記之SACOL0720及SACOL0029-1867之重組蛋白質進行工程改造及製造。根據製造商之推薦，使用來自Qiagen Inc.(Mississauga, ON, Canada)之QIA表現技術(pQE30質體)工程改造及製造His標記的SACOL0442之重組蛋白質。(有關SACOL0720、SACOL0442及SACOL0029-1867 his標記序列，參見圖21D-E及I，以及第II、III及VII項)。另外，亦藉由使用該QIA表現載體，藉由自金黃色葡萄球菌ATCC 25904選殖
clfA
基因製造表面蛋白質ClfA(SEQ ID NO:184)。該後一重組蛋白並非疫苗組合物之一部分，但用於ELISA分析中以測定針對其他金黃色葡萄球菌蛋白質，諸如ClfA之血清IgG力價。 該疫苗係由3種抗原(如實例1中所定義之SACOL0442及SACOL0720，及融合物SACOL0029-1867)各300 μg及Emulsigen™ -D(MVP Technologies, Omaha, NE)、CpG ODN 2007(亦即，T
CG
T
CG
TTGT
CG
TTTTGT
CG
TT(SEQ ID NO:194)(IDT, Coralville, IA))及吲哚力西丁(ILPWKWPWWPWRR(SEQ ID NO:195, GenScript, Piscataway, NJ, Chemprep Inc., Miami, FL)構成(疫苗#2)。
對奶牛免疫接種 .
將十一頭處於泌乳中期的健康經產荷斯坦母牛圈養於加拿大農業與農產品部奶牛及豬研究與開發中心(Sherbrooke, QC)的II級生物安全畜棚中。母牛接受疫苗#2(經疫苗接種組)。間隔10週在頸部中經皮下進行兩次免疫接種。未觀察到不良副作用。在第一次免疫接種之前(免疫前血清)，並且接著每週取得尾靜脈血液及牛奶樣品以偵測總IgG。
藉由 ELISA 偵測總 IgG .
如先前所描述且稍加修改(Ster等人,
Vet. Immunol. Immunopathol.
(2010), 136: 311-318)，偵測針對血清中之每一抗原的總IgG。用測試抗原(5 µg/mL在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中稀釋，Sigma Aldrich, Oakville, ON)塗佈Nunc MaxiSorp™ 96孔盤(Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)並在37℃下培育隔夜。接著，在37℃下，用含有0.5%明膠之PBS(BD，Franklin Lakes, NJ)使該等盤飽和，保持1小時。將一百微升在含有0.5%明膠及0.1% Tween™ 20之PBS中的血清之兩倍連續稀釋液裝載至盤中並在37℃下培育1小時。用含有0.1% Tween™20之PBS洗滌該等盤三次。將一百微升辣根過氧化酶(HRP)偶聯之二次抗體添加至該盤中。使用的二次抗體係在含有0.5%明膠及0.1% Tween™20之PBS中1/1000,000稀釋的山羊抗牛IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)。在37℃下培育1小時隨後洗滌3次之後，根據製造商之推薦，用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)試劑(KPL Inc., Gaithersburg, MD)偵測過氧化酶活性。
實例 7 ： 抗原融合物誘導高抗體力價 - 疫苗 # 2
圖5顯示經疫苗接種之母牛針對該疫苗(包括融合抗原SACOL0029及SACOL1867(在圖5上標為SACOL0029-1867)各抗原之血清總IgG力價。每個空心圓表示在第二次免疫接種之後四週每頭母牛之力價(在即將實驗性感染之前)，而每個黑色菱形表示免疫前力價。水平線表示中值：實線表示免疫前血清，點線表示在免疫接種之後四週取得的樣品。經疫苗接種之母牛的力價高於免疫前血清之力價(**，P＜0.01；對於測試的其他抗原，***，P＜0.001)。 因此，圖5顯示，由包括融合肽在內之三種獨立抗原構成的疫苗在母牛中誘導較強免疫反應。另外，圖5意外地顯示，融合抗原SACOL0029及SACOL1867(融合物SACOL0029-SACOL1867)引起的抗體力價高於由各單獨抗原引起之抗體力價(比較圖1A與圖5)且該等融合抗原使疫苗具有另外的益處。 更確切地說，當在疫苗中個別地投與時，免疫母牛針對SACOL0029及SACOL1867之力價分別達到3200及51200(圖1A)，而當該等抗原係以融合物形式投與時，免疫母牛之力價分別達到12800及409600(圖5)，顯示該融合物在免疫反應中產生出人意料之協同作用。
實例 8 ： 有關包含 SACOL0029 、 SACOL1867 以 及 SACOL1867 與 SACOL0029 之 融合物之疫苗的材料及方法 - 疫苗 # 3 製備抗原 .
選擇由在金黃色葡萄球菌牛***內感染期間大量表現之兩個基因得到的三種抗原納入疫苗中。該等抗原係：SACOL0029(Genbank寄存編號：YP_184940.1)(SEQ ID NO: 5)、SACOL1867Genbank寄存編號：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)及SACOL1867與SACOL0029之間之融合物(Genbank寄存編號：YP_184940.1)(SEQ ID NO: 5)。由GenScript, Inc.(Piscataway, NJ)對His標記之SACOL0029、SACOL1867及SACOL0029-1867之重組蛋白質進行工程改造及製造。(有關SACOL0029、SACOL1867及SACOL0029-1867之his標記序列，參見圖21A、F及I，第I、IV及VII項)。
對小鼠免疫接種
. 在小鼠中評價由SACOL0029、SACOL1867基因及SACOL0029與SACOL1867之融合物編碼的重組金黃色葡萄球菌蛋白質之免疫原性特性。四組小鼠接受呈單價形式(SACOL0029或SACOL1867)或呈多價形式(融合物SACOL0029-1867或SACOL0029與SACOL1867之組合)的精確等莫耳量之蛋白質，並比較。 簡言之，使用ExPASy™生物信息學資源門戶(http://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)計算對應於整個融合物或該融合物之SACOL0029或SACOL1867部分的各胺基酸序列之理論分子量。 向一組小鼠投與五微克融合物。根據理論分子量，測定5 µg之SACOL0029-1867融合物的相應莫耳量係168.55 pmol。向其他兩組小鼠分別投與1.15 µg及3.69 µg量的SACOL0029及SACOL1867以便分別提供168.55 pmol各抗原。最後一組小鼠接受兩種個別抗原(各168.55 pmol)之組合。 為製備免疫接種劑量，個別地混合SACOL0029、SACOL1867及SACOL0029-1867融合多肽並使其懸浮於PBS中以在100 µl體積中獲得最終等莫耳量之各抗原。將二十隻CD-1雌性小鼠隨機分成4組：A組(5隻小鼠)接受5 µg SACOL0029-1867融合蛋白(
融合物
)；B組(5隻小鼠)接受1.15 µg SACOL0029及3.69 µg SACOL1867(
組合
)；C組(5隻小鼠)接受1.15 µg SACOL0029(
0029
)；且D組接受3.69 µg SACOL1867(
1867
)。在頸部以間隔兩週方式兩次皮下注射對CD-1小鼠進行免疫接種。在整個實驗性免疫接種期間未觀察到不良副作用。在即將第一次初始注射之前(免疫前血清)及增強免疫接種之後十天(免疫血清)取得血液樣品。使血液等分試樣在室溫下凝結，保持一小時，在4℃下以10,000 g離心10分鐘。收集血清並保持在-20℃，以待後續分析。
藉由 ELISA 偵測總 IgG
. 如先前所描述且稍加修改(Ster等人,
Vet . Immunol . Immunopathol .
(2010), 136: 311-318)，偵測針對SACOL0029及SACOL1867重組蛋白質之血清總IgG。用75 µl各測試抗原(6.67 µg/mL在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中稀釋，Sigma Aldrich, Oakville, ON)塗佈Nunc MaxiSorp™96孔盤(Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)並在室溫下培育隔夜。接著在37℃下，用含有5%脫脂奶粉之PBS使該等盤飽和，保持1小時。將一百微升在含有3%牛奶及0.025% Tween™ 20之PBS中的血清之四倍連續稀釋液裝載至盤中並在37℃下培育1小時。用含有0.05% Tween™ 20之PBS洗滌該等盤三次。接著將一百微升辣根過氧化酶(HRP)偶聯之二次抗體添加至該盤中。所用二次抗體係在含有3%牛奶及0.025% Tween™20之PBS中1/5000稀釋的商購山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)。在37℃下培育1小時隨後洗滌3次之後，根據製造商之推薦，藉由添加一百微升3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)試劑(KPL Inc., Gaithersburg, MD)偵測過氧化酶活性。
統計分析
抗體力價及相關性之統計分析係使用GraphPad Prism™ v6.05進行。
實例 9 ： 相較於單價抗原或抗原組合 ， 抗原融合物誘導明顯較高之抗體力價 - 疫苗 # 3
圖6顯示融合多肽(亦即，SACOL0029-1867融合蛋白)中所包括之抗原(SACOL1867)可以誘導針對特異性抗原(SACOL1867)的較強特異性抗體免疫反應，且更重要的是，該反應可以顯著高於利用該抗原之單價形式(單獨投與之SACOL1867)或作為融合物之一部分的個別多肽之多價組合(SACOL1867加SACOL0029之組合)獲得的反應。因此，除產生針對多個多肽靶之免疫反應的優勢外，此類融合抗原亦提供大幅提高針對該等靶之抗體力價的額外益處。
實例 10 ： 有關包括 SACOL0720 片段及 / 或 SACOL442 片段之疫苗的材料及方法 - 疫苗 # 4 至 6 製備抗原
. 基於B細胞抗原決定基之存在，選擇長度為15至50個胺基酸且源自於序列SACOL0442及/或SACOL0720之肽及胺基酸片段。亦設計出肽抗原決定基之融合物，其中用胺基酸連接子(例如EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)，或ERKYK(SEQ ID NO:61)，或KDYERKYKKHIVS(SEQ ID NO:196))接合各種抗原決定基。肽及胺基酸片段係由Biomatik, Inc.(Cambridge, ON)合成。在收到後，將凍乾之肽及胺基酸片段以5 mg/mL濃度懸浮於無菌水中並在-80℃儲存待用。
對小鼠免疫接種
. 使用肽及胺基酸片段作為抗原對小鼠免疫接種。對於製備免疫接種劑量，除非另外說明，否則將各肽及胺基酸片段或其組合混合並懸浮於含有20% EMULSIGEN®-D水包油乳液佐劑之PBS中，以獲得每劑100 µg多肽之最終劑量。將CD-1雌性小鼠隨機分成具有3至4隻動物的不同組別。以間隔兩週方式兩次皮下注射小鼠頸部進行免疫接種。在整個實驗期間未觀察到不良副作用。在即將第一次初始注射之前(免疫前血清)及增強免疫接種之後十天(免疫血清)取得血液樣品。使血液等分試樣在室溫下凝結，保持1小時，並且接著在4℃下以10,000 g離心10分鐘。收集血清並保持在-20℃，以待後續分析。
藉由 ELISA 偵測總 IgG
. 如先前所描述及稍加修改(Ster等人,
Vet . Immunol . Immunopathol .
(2010), 136: 311-318)，偵測針對用於免疫接種小鼠之抗原中所發現之特定胺基酸序列的血清總IgG。用100 µl在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(Sigma Aldrich, Oakville, ON)中稀釋的最終濃度為5 µg/mL之各靶胺基酸序列塗佈Nunc MaxiSorp™96孔盤(Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)並在室溫下培育隔夜。接著在37℃下，用含有5%脫脂奶粉之PBS使該等盤飽和，保持1小時。將一百微升在含有1%牛奶及0.025% Tween™ 20之PBS中的血清之四倍或兩倍連續稀釋液裝載至盤中並在37℃下培育1小時。接著用含有0.05% Tween™ 20之PBS洗滌該等盤三次。接著將一百微升辣根過氧化酶(horseradish peroxidase；HRP)偶聯之二次抗體添加至該盤中。所用二次抗體係在含有1%牛奶及0.025% Tween™ 20之PBS中1/5000稀釋的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)。在37℃下培育1小時隨後用PBS Tween™ 20洗滌3次且最後用PBS洗滌一次之後，根據製造商之推薦，用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)試劑(KPL Inc., Gaithersburg, MD)偵測過氧化酶活性。
統計分析
. 抗體力價及光學密度之統計分析係使用GraphPad Prism™v6.05進行。
實例 11 ： 針對包括由序列 SACOL0442 及 SACOL0720 編碼之抗原決定基的肽之融合物的免疫反應 - 疫苗 # 4
使用由SACOL0442及SACOL0720編碼之肽抗原決定基之融合物對小鼠接種疫苗(n=4)。肽融合物之序列係
KDGGKYTLESHKELQ EAAAKEAAAK KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND
(SEQ ID NO: 3)(疫苗#4)，其中連接子呈斜體且不同抗原決定基係以粗體字符標識。抗原決定基係由SACOL0442編碼之KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)、由SACOL0720編碼之KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO: 23)及亦由SACOL0720編碼之DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO: 24)。在ELISA分析中，自動物收集之血清中的IgG抗體能夠結合包含來自SACOL0442(亦即KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1))及/或SACOL0720(亦即，QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)；KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)、DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO: 24))之B細胞抗原決定基的胺基酸片段且抗體力價為1/6400或更高。用於免疫接種之肽之融合物及在ELISA分析中用作抗體靶之胺基酸片段或多肽顯示於下表III中。在該表中，抗原決定基係呈粗體且連接子序列係呈斜體。 表III-多肽疫苗及抗體反應靶
在ELISA分析中，由來自疫苗接種以上融合抗原之小鼠之IgG結合以上顯示之所有抗體靶。 由此證實，可以使用由SACOL0442及SACOL0720編碼之肽抗原決定基之融合物免疫接種哺乳動物並引起免疫反應。獲得的免疫反應包括產生識別SACOL0442或SACOL0720、由SACOL0442或SACOL0720編碼之胺基酸片段或變異體的抗體。
實例 12 ： 在免疫接種中用作抗原之多個抗原決定基之融合物顯著增強針對單一抗原決定基之免疫反應 - 疫苗 # 4
使用由SACOL0442及SACOL0720編碼之肽抗原決定基之融合物對小鼠接種疫苗(n=4)。肽融合物之序列係
KDGGKYTLESHK ELQ EAAAKEAAAK KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND
(SEQ ID NO: 3)，其中連接子呈斜體且不同抗原決定基以粗體字符標識。抗原決定基係由SACOL0442編碼之KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)、由SACOL0720編碼之KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO: 23)及亦由SACOL0720編碼之DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO: 24)。用由SACOL0442編碼之單一肽抗原決定基KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)對另一組小鼠(n=4)免疫接種。 自動物收集血清並測試針對由SACOL0442編碼之胺基酸片段(GEHLPKGNIVINT
KDGGKYTLESHKELQ
KDRENVKINTAD)(SEQ ID NO: 2)的IgG抗體之存在，該胺基酸片段含有肽抗原決定基KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)。 如
圖 7
上所示，相較於當僅使用肽抗原決定基KDGGKYTLESHK ELQ(SEQ ID NO: 1)作為抗原進行免疫接種時獲得的抗體含量，用三個肽抗原決定基(一個由SACOL0442編碼及兩個由SACOL0720編碼)之融合物免疫接種顯著增加針對由SACOL0442編碼之胺基酸片段(GEHLPKGNIVINT
KDGGKYTLESHKELQ
KDRENVKINTAD)(SEQ ID NO: 2)之抗體產生，該胺基酸片段含有肽抗原決定基KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)。
實例 13 ： 針對 SACOL0720 變異體編碼之 50 個 胺基酸之多肽片段的免疫反應 - 疫苗 # 5
用由序列SACOL0720編碼的含有B細胞抗原決定基(粗體字符)，更具體言之，含有抗原決定基KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)、DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO: 24)及QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)的50個胺基酸之肽片段(
KDINKIYFMTDVDLGGP TFVLND
KDYERKYKKHIVS
QFGFDLKHKKDALA
(SEQ ID NO: 27))(疫苗#5)對一組小鼠(n=3)進行疫苗接種。
KDINKIYFMTDVDL GGPTFVLND
KDYERKYKKHIVS
QFGFDLKHKKDALA
(SEQ ID NO: 27)之總體序列與SACOL0720之天然序列在連接抗原決定基DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO: 24)與QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)之區域中有四個胺基酸之差異。因此，可以認為疫苗#5係SACOL0720之變異體片段或藉由連接子ERKYK(SEQ ID NO:61)隔開的來自SACOL0720之抗原決定基之融合物。 測試血清中針對由SACOL0720(SEQ ID NO:25)(亦即，圖21D中第II項顯示之聚組胺酸形式)編碼的天然蛋白質之片段之IgG抗體的存在。在ELISA分析中，用對應於胺基酸之變異序列(或融合物SACOL0720-720)之肽片段疫苗接種之小鼠均產生識別原始胺基酸序列中之抗原決定基的抗體，且力價為1/6400或更高。 由此證實，包含由序列SACOL0720編碼之抗原決定基的胺基酸片段可以在哺乳動物中引起免疫反應。此亦進一步證實，天然序列變異體能夠刺激針對含有B細胞抗原決定基之原始片段序列的免疫系統。
實例 14 ： 針對融合物組合 ( 肽融合物 0442 - 0720 及多肽融合物 0029 - 1867 ) 之 免疫反應 - 疫苗 # 6
將由SACOL0442及SACOL0720編碼之肽抗原決定基之融合物(參見圖21I中第VII項之序列-融合物)與含有SACOL0029及SACOL1867序列之多肽融合物(參見圖21I中第VII項融合物之序列)組合並用於對小鼠進行疫苗接種(疫苗#6)。 為製備免疫接種劑量，將肽融合物0442-0720及多肽融合物1867-0029混合並懸浮於含有20% EMULSIGEN®-D水包油乳液佐劑之PBS中，分別獲得每劑100 µg及5 µg最終劑量之肽融合物(0442-0720)及多肽融合物(0029-1867)。藉由在頸部中三次皮下注射對CD-1雌性小鼠(n=3)進行免疫接種。前兩次注射係間隔一週進行且第三次注射係在第二次注射之後3週進行。在整個實驗期間未觀察到不良副作用。在即將第一次初始注射之前(免疫前血清)及增強免疫接種之後十四天(免疫血清)取得血液樣品。使血液等分試樣在室溫下凝結，保持一小時，並且接著在4℃下以10,000 g離心10分鐘。收集血清並保持在-20℃，以待後續分析。 在ELISA分析中，自動物收集之血清中的IgG抗體能夠結合包含來自SACOL0442或SACOL0720之抗原決定基的胺基酸片段或多肽SACOL0029或SACOL1867，且抗體力價為1/6400或更高。用於免疫接種之肽及多肽之融合物以及在ELISA分析中用作抗體靶之多肽或胺基酸片段顯示於
下表 IV
中。
表 IV - 混合多肽融合物疫苗及抗體反應靶
由此證實，可以使用融合物組合(例如肽融合物0442-0720與多肽融合物0029-1867之混合物)對哺乳動物免疫接種並引起免疫反應。獲得的免疫反應包括產生識別由SACOL0442或SACOL0720或SACOL0029或SACOL1867編碼之胺基酸序列的抗體。
實例 15 ：有關減毒活突變株之材料及方法 細菌菌株及生長條件
. 實例15至25中使用的菌株列於表V中。金黃色葡萄球菌ATCC 29213及其同基因突變株Δ720如先前所描述(Allard等人, 2013)。除非另外規定，否則金黃色葡萄球菌菌株係在胰酶大豆培養液(TSB)及瓊脂(TSA)(BD, ON, Canada)中生長，且大腸桿菌DH5α係在LB及LBA培養基(BD)中生長。必要時，將安比西林(ampicillin) (100µg/ml)(Sigma, Oakville, Ontario, Canada)、氯黴素(chloramphenicol) (20 µg/ml)(ICN Biomedicals, Irvine, CA)及紅黴素(erythromycin)(10 µg/ml)(Sigma)添加至瓊脂盤中。對於免疫測試，選擇對應於在加拿大奶牛群及世界其他地方所發現的主要金黃色葡萄球菌
spa
類型中之一部分的四種不同之牛乳腺炎分離株(Veh等人, 2015；Mitra等人,2013)。菌株SHY97-3906(
spa
t529)係自在泌乳期間發生之臨床牛乳腺炎病例分離，且CLJ08-3(
spa
t359)最初係在乾奶期自患有持久乳腺炎之母牛分離(Allard等人, 2013)。菌株Sa3151(
spa
t13401)及Sa3181(
spa
t267)係自加拿大牛乳腺炎及牛奶品質研究網(Canadian Bovine Mastitis and Milk Quality Research Network，CBMMQRN)乳腺炎病原體培養物保藏中心(Mastitis Pathogen Culture Collection)(Université de Montréal, Faculté de médecine vétérinaire, St-Hyacinthe, QC, Canada)獲得，且自亞臨床***內感染病例分離。
表 V -
實例15至25中使用之菌株及質體
細胞培養條件
. 使用確定之牛***上皮細胞(BMEC)株MAC-T(Huynh等人, 1991)作為感染之細胞培養模型。在含有10%熱滅活胎牛血清(FBS)且補充有5 µg/ml胰島素(Roche Diagnostics Inc., Laval, Canada)及1 µg/ml羥皮質酮(hydrocortisone)(Sigma)之達爾伯克改良型伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中常規地培養並維持MAC-T細胞，且在37℃及5% CO
2
下於含濕氣培育箱中培育。細胞培養試劑係購自Wisent(St-Bruno, QC, Canada)。
DNA 操作
. 遵循製造商推薦之套組進行基因組DNA分離(Sigma)、質體DNA分離(Qiagen, ON, Canada)、自瓊脂糖凝膠提取DNA片段(Qiagen)以及PCR產物及消化之DNA片段之純化(Qiagen)。在分離基因組及質體DNA時，再使用200 µg/ml溶葡球菌酶(Sigma)處理1小時以實現金黃色葡萄球菌細胞之有效溶解。引子(IDT® Integrated DNA Technologies；Coraville, Iowa, USA)經設計以在擴增產物之上游及下游添加限制性位點。對於常規PCR，使用Taq DNA聚合酶(NEB, Pickering, ON, Canada)進行PCR，或對於選殖，使用Q5高保真度DNA聚合酶(NEB)，且循環時間及溫度針對各引物對進行優化。使用大腸桿菌DH5α(Invitrogen, Burlington, ON, Canada)、限制酶(NEB)及T4 DNA連接酶(NEB)產生質體構築體。在電穿孔放入金黃色葡萄球菌RN4220中(Kreiswirth等人, 1983)及最終宿主菌株中之前，藉由限制性消化模式及DNA測序驗證質體構築體。實例15至25中使用之質體列於上表V中。
產生減毒活金黃色葡萄球菌菌株 Δ 720 及 Δ hemB .
構築ATCC 29213菌株之同基因
hemB
突變株，其中
hemB
基因缺失且藉由同源重組***
emrA
卡匣替代。使用TargeTron™基因敲除系統(Gene Knockout System)(利用TargeTron™載體pNL9164(Sigma-Aldrich Canada Ltd.)(Chen等人, 2007)破壞細菌基因，藉由在金黃色葡萄球菌ATCC29213中之核苷酸803與804之間***第II組內含子(如先前所描述(Allard等人, 2013)，片段大小為約2Kb)來產生針對基因SACOL0720(Δ720)之金黃色葡萄球菌ATCC 29213突變株。遵循製造商之方案及推薦。
產生
Δ
hemB
Δ720
.
為了在基因
hemB
中實現第二突變以便在Δ720突變基因背景下獲得SCV表型，使用另一策略：在先前所描述之策略(Mitchell等人, 2008)中，稍加修改，使用溫度敏感性pBT2-
hemB
:
emrA
(pBT-E:
hemB
)。簡言之，藉由在溫度敏感性穿梭載體pBT2之XbaI與SalI位點之間***
ermA
卡匣來構築pBT-E質體(Brückner, 1997)。自金黃色葡萄球菌ATCC 29213擴增基因
hemB
(SACOL1715)DNA片段之側接區且選殖於質體pBT-E中之
ermA
卡匣的兩側上。接著將質體轉移至金黃色葡萄球菌RN4220(res-)中進行繁殖。在用溶葡球菌酶(200 µg/ml，在室溫下保持1小時)細菌溶解之後，分離質體DNA並藉由電穿孔而用於轉型ATCC 29213及Δ720。對於質體整合及突變株產生，先使細菌在30℃下在10 µg/ml紅黴素及1 µg/ml氯化血紅素補充物(Sigma-Aldrich, ON, Canada)存在下生長隔夜。接著以1:1000稀釋細菌並使其在42℃下在2.5 µg/ml紅黴素及1 µg/ml氯化血紅素存在下生長隔夜。該步驟重複兩次。最後，以1:1000稀釋細菌並在無抗生素存在下，使其在42℃下生長隔夜。選擇的帶有失活之
hemB
基因的突變株對紅黴素具有抗性且對氯黴素敏感，且帶有可以藉由在瓊脂盤上補充5 µg/ml氯化血紅素補充之SCV表型(亦即，反突變成正常生長表型)。藉由PCR確定ATCC 29213(亦即Δ
hemB
)及Δ720(亦即Δ
hemB
Δ720)菌株中
hemB
之缺失(參見圖8A及B)。
在培養液培養中之氯化血紅素補充
. 為了評價氯化血紅素使金黃色葡萄球菌∆
hemB
及雙重突變株∆720∆
hemB
恢復最佳生長動力學之能力，在包含補充有各種濃度氯化血紅素(Sigma)之新鮮BHI的培養管中，將隔夜細菌培養物稀釋至A
600 nm
為約0.1。在35℃(225 rpm)下培育期間的不同時間點監測培養物之A
600nm
。
金黃色葡萄球菌感染牛***上皮細胞
(BMEC). 使用MAC-T BMEC表徵ATCC 29213(WT)及其同基因突變株之細胞內感染性及存留性。在感染之前四十八小時，將1×10
5
個/毫升MAC-T細胞接種於經處理之24孔盤(Corning)上以獲得30%匯合。在37℃及10%CO
2
下，使單細胞層生長至匯合。在感染之前六小時，用DMEM洗滌單細胞層並與侵襲性培養基(invasion medium，IM)(不含抗生素且含有1%熱滅活FBS之生長培養基)一起培育。將隔夜細菌培養物以1:20稀釋於新鮮TSB中並使其生長至對數生長中期，接著用PBS洗滌並稀釋於IM中達到感染倍率10。藉由將單細胞層與細菌一起培育3小時來實現侵襲。接著用DMEM洗滌單細胞層並用含有20 μg/ml溶葡球菌酶之IM培育以殺滅細胞外細菌。先前在細胞侵襲分析中已驗證溶葡球菌酶在殺滅細胞外正常及SCV金黃色葡萄球菌方面之用途(Moisan等人, 2006及Tuchscherr等人, 2011)。處理30分鐘以測定感染3小時的CFU，或再處理12或24小時。接著，在用達爾伯克氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，DPBS)充分洗滌之後，藉由胰蛋白酶消化剝離單細胞層並用0.05% TritonX-100溶解，且添加PBS以獲得最終1×濃度。連續稀釋溶解產物並將其塗鋪於TSA上進行CFU測定。
BMEC 活力及代謝活性分析
. 為了測定MAC-T細胞上由金黃色葡萄球菌ATCC 29213(WT)及其同基因突變株造成的細胞毒性損傷，進行MTT細胞代謝活性分析，該分析量測活細胞中3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基四唑鎓溴化物(MTT)還原成不溶性甲䐶產物的情況。該分析遵循Kubica等人(Kubica等人, 2008)之方法且稍加修改。簡言之，如存留性分析中所描述實現細胞之金黃色葡萄球菌感染，但在12小時或24小時之後不溶解，而是在37℃下，用含100 µl MTT試劑(5 mg/ml)(Sigma)之DPBS培育細胞2小時。在此之後，添加具有16% SDS及40% PMF之pH 4.7酸性溶劑溶液以溶解細胞並溶解甲䐶晶體隔夜。在570 nm波長下，使用Epoch微量盤讀取器(Biotek Instruments Inc.)讀取樣品。所有分析均一式三份進行，且在每個盤中均包括含未感染細胞(高活力對照)或溶解的WT感染之細胞(細菌背景對照；在添加MTT之前，用0.05% tritonX-100處理10分鐘)的對照孔。使用下式計算代謝活性水準： (樣品吸光度-背景對照)/高對照)×100.
小鼠乳腺炎模型中之毒力
. 感染之小鼠乳腺炎模型係基於先前之描述(Brouillette, 2005；Brouillette, 2004)。用小鼠進行之所有實驗均得到倫理學委員會有關舍布魯克大學科學系(Facultédes sciences of theUniversitéde Sherbrooke)動物實驗之批准且根據加拿大動物護理委員會(Canadian Council on Animal Care)之指導原則進行。簡言之，在取出12至14天大的後代之後一小時，分別每用公斤體重87 mg及13 mg之***及甲苯噻嗪使哺乳期CD-1小鼠(Charles River Laboratories)麻醉並在雙眼顯微鏡下對乳腺接種。藉由在乳頭近端之小切口暴露出乳管並使用32號鈍針經乳頭導管注射在無內毒素之磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS，Sigma)中含有10
2
CFU之100 μl細菌懸浮液。對於每隻動物，接種兩個腺體(自頭至尾，右側第四個[R4]及左側第四個[L4])。在指定時間時以無菌方式收集乳腺，稱重並目測評價炎症。在PBS中進行機械組織均質化，連續稀釋並塗鋪於瓊脂上測定CFU之後，評價細菌負荷。在第二實驗中，保留均質化腺體進行蛋白質提取用於髓過氧化酶(MPO)活性酶分析。
乳腺蛋白質提取
. 利用先前所描述之優化方法(Pulli等人, 2013)且稍加修改，自乳腺提取總蛋白質。在含有最終濃度50 mM磷酸鉀(pH 6.0)及50 mM溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)(Sigma)之緩衝液中將***組織均質化。接著超音處理樣品，在液氮中冷凍-解凍，並在4℃下以2000 g離心15分鐘。最後，藉由抽吸移除脂肪層，並保留上清液，以15000 g最終離心15分鐘，以丟棄每個細胞殘渣。將上清液分配成數等分並保持在-80℃，直至用於酶分析或如藉由雙金雞納酸法(BCA)蛋白質分析套組(Thermo-Scientific)所量測之蛋白質濃度測定。
MPO 活性分析
. 藉由改良用於微孔盤之鄰二甲氧苯胺-H
2
O
2
方法(Bradley, RD.及Rothstein, GPPC., 1982)定量MPO酶活性來量測***組織中之嗜中性球募集。在96孔微量盤中，將10 µl組織提取上清液與鄰二甲氧苯胺鹽酸鹽(0.167 mg/mL)(Sigma)及0.0005%H
2
O
2
(Sigma)於50 mM CTAB磷酸鹽緩衝液50 mM(pH 6.0)中之溶液一起培育。在Epoch微量盤讀取器中，在460 nm下，經5分鐘之時間，間隔15秒動力學量測MPO活性。MPO單位視為在25℃下每分鐘降解1 µmol H
2
O
2
之酶量，假設在460 nm下鄰二甲氧苯胺之吸收係數為11.3 mM
- 1
cm
- 1
(Zhang等人, 2004)。結果表示為每公克腺體之MPO單位數。
用減毒活突變株 Δ 720 Δ hemB 免疫接種小鼠 .
在小鼠中評價以活毒疫苗形式投與的減毒菌株Δ
720
Δ
hemB
之免疫原性特性。在初步研究中，小鼠對肌肉內及皮下(SC)注射減毒菌株具有良好耐受性。選擇10
6
、10
7
及10
8
CFU劑量及SC途徑用於後續實驗。對於製備細菌接種物，在冰冷的PBS中洗滌預先在BHIA盤上生長之金黃色葡萄球菌Δ
720
Δ
hemB
菌落兩次並將其懸浮於含有15%甘油之PBS中，接著等分並保持在-80℃待用。藉由在BHIA塗鋪連續稀釋液來驗證接種物製劑中活細菌計數。將CD-1隨機分成3組：第1組(n=3)接受10
6
CFU劑量；第2組(n=3)，10
7
CFU；及第3組(n=3)，10
8
CFU。在頸部以間隔兩週方式兩次皮下注射於PBS(100 µl)中之細菌來對小鼠免疫接種。在即將初始注射之前(免疫前血清)及增強免疫接種之後十天(免疫血清)取得血液樣品。使血液等分試樣在室溫下凝結，保持一小時，並且接著在4℃下以10,000 g離心10分鐘。收集血清並保持在-20℃以待後續分析。
製備金黃色葡萄球菌細胞提取物
. 如先前所描述且稍加修改(Asli等人, 2016)，製備金黃色葡萄球菌全細胞提取物。簡言之，將隔夜細菌培養物以1/1000稀釋於新鮮BHI培養液中，並且接著在35℃(225 rpm)下培育，直至A
600nm
達到約0.8。對細菌細胞離心並在冰冷的PBS中洗滌細胞集結粒兩次並藉由添加每毫升集結粒5 ml PBS使其懸浮。首先在37℃下用溶葡球菌酶(Sigma)(100 µg/ml集結粒)處理細菌懸浮液1小時，並且接著將每毫升集結粒3 µg蛋白酶抑制劑混合液(Sigma)、8 µgRNA酶A(Sigma)及8 µgDNA酶(Qiagen)添加至該懸浮液中。在室溫下30分鐘之後，藉由3至4次通過SLMAminco™ French加壓細胞破碎儀(Pressure cell disrupter)以機械方式破壞細胞，並且接著在4℃下以12,000 g離心10分鐘以移除未破壞之細胞。收集上清液並如先前所描述，利用BCA蛋白質分析套組測定總蛋白質濃度。
藉由 ELISA 偵測小鼠總 IgG
. 偵測針對∆
720
∆
hemB
疫苗接種菌株及各牛IMI分離株之血清總IgG以展示並量測由小鼠免疫接種產生之全身體液反應。對於靶抗原，用100 µl各完整金黃色葡萄球菌細胞提取物(10 µg/ml於碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中稀釋，Sigma)塗佈NuncMaxiSorp™ 96孔盤(Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)，並在室溫下培育隔夜。接著，在37℃下用含有5%脫脂奶粉之PBS使該等盤飽和，保持1小時，隨後藉由添加5%豬血清以防止非特異性金黃色葡萄球菌蛋白質A相互作用進行第二個阻斷步驟。將一百微升於稀釋緩衝液(含2%牛奶、5%豬血清及0.025% Tween™ 20之PBS)中之血清的兩倍連續稀釋液裝載至該等盤中並在37℃下培育1小時。接著用含有0.05% Tween™20之PBS洗滌盤三次，且裝載在稀釋緩衝液中以1/5000稀釋的100 µl辣根過氧化酶(HRP)偶聯山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)。在37℃下培育1小時隨後洗滌3次之後，根據製造商之推薦，用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)試劑(KPL Inc., Gaithersburg, MD)偵測過氧化酶活性。
統計分析
. 用GraphPadPrism™軟體(6.02版)進行統計分析。在用於統計分析之前，將細胞內細菌CFU及細菌CFU/g腺體(小鼠中之IMI)轉換成以10為底的對數值。用於分析各實驗之統計檢定及顯著性在圖例中說明。
實例 16 ： 構築金黃色葡萄球菌 ATCC 29213 Δ 720 、 Δ hemB 及 Δ 720 Δ hemB 菌株
模擬天然感染之減毒活生物體以一種有效的方式刺激免疫系統，引起廣泛且穩定之免疫反應，由此產生血清及黏膜抗體，以及協同作用以防止疾病的效應及記憶T細胞(Detmer, 2006；Kollaritsch, 2000；Pasetti, 2011)。 在母牛實驗性IMI感染中，經顯示基因SACOL0720之突變可改變金黃色葡萄球菌之毒力(Allard等人, 2013)。 基於金黃色葡萄球菌SCV之表型特徵，製備其他減毒活菌株用於疫苗目的。SCV一般不產生侵襲性感染(亦即，額外減毒)且可以內化於宿主細胞中並因此除體液免疫反應外，還將刺激細胞介導之免疫反應。 先經由
hemB
基因缺失(Δ
hemB
)產生穩定金黃色葡萄球菌SCV(參見實例15，
產生減毒活金黃色葡萄球菌菌株
Δ720
及 Δ hemB
)。接著藉由使基因SACOL0720失活(Δ720)達成該SCV之進一步減毒(參見實例15，
產生 Δ hemB Δ 720
)。 在感染MAC-T牛***上皮細胞之後，相較於分別用Δ
hemB
及Δ720所觀察到的情形，雙重突變株(Δ720Δ
hemB
)明顯地顯示較少的內化及細胞破壞。
實例 17 ： 金黃色葡萄球菌 Δ hemB Δ 720 菌株在 MAC - T 細胞 中減毒
接著，在細胞內存留分析中使用MAC-T細胞比較ATCC 29213(WT)、∆720、∆
hemB
及Δ
hemB
Δ720菌株之感染性。藉由將該三個突變菌株與其同基因WT親株相比較，觀察基因
hemB
及SACOL0720突變之不同影響。基於活細胞內細菌之回收率(CFU)，將細菌與細胞單層培育3小時之較短時間，隨後添加溶葡球菌酶除去細胞外細菌WT及∆
hemB
菌株在MAC-T細胞中之較高內化程度(圖9A及B)。然而，相較於其親本WT菌株，單∆720突變株顯示明顯較低(P≤0.01)之內化(圖9A)。當比較雙重突變株Δ
hemB
Δ720與∆
hemB
時，在∆720中見到甚至更明顯之內化減少，且在該3小時內化分析中接種物回收率減小10倍(P≤0.001，圖9B)。如在侵襲(PI)後12及24小時相較於關於∆
hemB
所觀察之結果CFU/ml有1-log
10
減小所說明，對於雙重突變株Δ
hemB
Δ720(圖9C)，該內化細菌負載之初始降低在該兩個時間點仍顯而易見(P≤0.001)。單∆720突變株與WT菌株之間之初始細胞內細菌負載量差異(圖9A)隨著培育時間延長而逐漸消失(圖9C)，因為該兩種菌株無法良好地存留於MAC-T細胞中(圖10)。相反，在24小時PI時，所回收的單∆
hemB
菌株之細胞內CFU顯著高於所回收的該三種其他菌株之細胞內CFU(圖9C，針對全部，P≤0.001)。總體而言且正如關於SCV表型所預期的，相較於任何其他菌株，∆
hemB
菌株隨時間顯示較高的細胞內存留量(圖10)。該等結果表明，Δ720突變主要降低MAC-T細胞中之內化過程。結果進一步證實，Δ
hemB
Δ720突變株仍能夠內化且存留於BMEC中，但程度要比用單Δ
hemB
突變株所觀察到的程度低得多。
Δ hemB Δ 720 及 Δ hemB SCV 引起較少 BMEC 破壞
。如以上所報導，如由∆
hemB
及Δ
hemB
Δ
720
SCV菌株在12及24小時PI時具有持久活力所說明，該等菌株在MAC-T細胞中隨時間顯示比WT及∆720菌株高的存留量(圖9C及10)。對於雙重突變株及單
hemB
突變株，在溶葡球菌酶添加之後0至24小時，自細胞回收之接種物的百分含量保持大致相同，其中在12小時略有增加，指示細胞內生長(圖10)。在該感染時間後，兩種菌株開始以較慢速率減少。然而，在WT及∆720菌株之細胞內CFU的明顯降低之同時，目測觀察到細胞單層隨時間而損傷的增加，與利用具有SCV表型之菌株所觀察到的情形形成比較。
在感染之後亦藉由該四種研究菌株中之每一種評價 MAC - T 細胞 活力
。藉由MTT方法(Kubica等人, 2008)評價MAC-T細胞活力。結果顯示，兩種SCV菌株(Δ
hemB
及Δ
hemB
Δ720)在該分析中引起明顯不如WT及∆720菌株之MAC-T殺滅作用。當與∆
hemB
相比較時，在12小時，WT菌株使細胞活力降低接近一半(圖11A：WT：25.4%；∆
hemB
：48.4%)。該差異在24小時仍顯而易見(圖11B：分別為16.3%相對於34.5%)，即使∆
hemB
突變株之細菌負載量高出10倍(圖9C)。∆
hemB
對MAC-T細胞之破壞明顯超過雙重突變株∆720∆
hemB
，但僅在24小時存在顯著差異(P≤0.01)。當直接與WT菌株相比較時，雙重突變株Δ720Δ
hemB
在12小時保持的上皮細胞活力高出2.3倍(圖11A)且在24小時要高出2.7倍(圖11B)(12小時與24小時：P≤0.0001)。因此，兩種SCV菌株隨時間之細胞內存留量高於WT及∆720菌株(圖10)可能歸於SCV對MAC-T細胞之毒性較低(圖11)。綜合而言，自BMEC感染分析得到的結果證實∆
hemB
及∆720兩種突變對於WT菌株減毒呈現相加效應。
實例 18 ： 金黃色葡萄球菌 Δ hemB Δ 720 菌株在小鼠 IMI 模型中減毒
為了證明在活體內感染模型中Δ
hemB
Δ720減毒，在鼠類IMI模型中評價雙重突變株之毒力且與WT菌株相比較(Brouillette及Malouin, 2005)。用於兩種菌株，感染之指數期主要在感染後前12小時內發生，而最大細菌負荷對於雙重突變株係在24小時且對於WT菌株係在48小時(第2天[D2])達到(圖12)。在24小時的時候，雙重突變株顯示平均CFU/g腺體相較於WT有1.9 log
10
之減小(P≤0.05)。另外，在24小時之後，該突變株細菌負荷顯示持續減小直至在第12天細菌完全清除(在圖12上以星號顯示)。相比之下，相較於該突變株，親本WT菌株引起嚴重侵襲性感染，在第2天殺滅剩餘9隻小鼠中的3隻且在第7天殺滅3隻小鼠中的2隻(圖12；箭頭)，隨後可以收集該等組之腺體。在WT感染中存活之小鼠在第7天維持較高的活菌計數(9 log
10
CFU/g腺體)，細菌負荷相較於雙重突變株有近似5 log
10
之差異。該等結果清楚地展示菌株Δ
hemB
Δ720在乳腺中倍增及存活之能力明顯降低。因此，Δ
hemB
Δ720雙重突變株在小鼠***內感染(IMI)模型中明顯減毒且自乳腺高效地清除。 減毒菌株Δ
hemB
Δ720看來理想地用於疫苗接種目的及細胞內抗原遞送。實際上，Δ
hemB
Δ720較少且暫時性內化應有助於刺激細胞介導之免疫，該免疫係對於防禦金黃色葡萄球菌極為重要的免疫反應之組成部分(Fowler及Proctor, 2014)。
實例 19 ： 在 IMI 之後針對 Δ 720 Δ hemB 及 WT 菌株之炎症反應
為了監測小鼠對WT及突變菌株感染之炎症反應(免疫反應)，藉由腺體勻漿總蛋白質提取物之MPO酶活性評價腺體中之嗜中性球浸潤。如先前所述，生物樣品之MPO活性與嗜中性球絕對數存在較強相關性(Xia, 1997)，且因此為適當標記物。在感染之後前幾小時期間，雙重突變株及WT感染之腺體中嗜中性球募集遵循類似型態(圖13)，且在感染後12小時至24小時，明顯嗜中性球浸潤呈指數加強，與細菌生長一致，儘管存在一定延遲。先前已顯示與乳腺中細菌負載量有關之多形核細胞之絕對數目未必總是在相同時間達到峰值(Brouillette, 2005)。在6小時、12小時及24小時，在感染突變株與感染WT菌株之腺體之間未觀察到MPO活性之顯著差異(圖13)。不過，該同等的明顯嗜中性球浸潤與在24小時目測觀察到的炎症不相關，在24小時的時候，相較於雙重突變株，WT感染引起經感染腺體之大面積發紅(圖14之照片)。相反地，相較於PBS對照組，感染突變株之腺體在宏觀層面上目測無變化。目測炎症評估與嗜中性球浸潤結果之間的不一致可以歸於細菌負載量之差異(圖9A-C)及WT菌株之細胞毒性活性(圖11)，且可經由毒素及酶表現與該菌株之高侵襲性及傳播能力相關聯。因此，該等結果指示，感染突變株之腺體中的嗜中性球募集與用WT菌株所見到之情形相當且此足以引起突變株負載量之後續降低及清除。 最後，為了證明菌株之安全性，及評估該炎症反應並非不可接受之反應原性菌株所致，監測在感染之後4天及12天感染Δ720Δ
hemB
之腺體的MPO活性。接著，將活性水準與用注射PBS之小鼠獲得的水準相比較。如圖15中所示，感染突變株之腺體中之明顯存在之嗜中性球在感染之後4天仍大量存在，且活性範圍為8至21個單位/公克腺體。此外，腺體退化(使哺乳期腺體恢復成接近孕前狀態之形態的過程)通常與嗜中性球募集以允許在組織重塑期間吞噬凋亡細胞有關(Stein, 2007)。在此模型中感染後數天，如由小鼠腺體迅速收縮所指示，該等腺體已經處於改良之正常狀態。然而，感染突變株之腺體中的MPO含量在第4天與第12天之間大幅降低(P≤0.01)。接著，認為MPO含量在第12天恢復到正常水準，顯示與用注射PBS之小鼠所達到之含量無顯著差異。感染Δ720Δ
hemB
之腺體的炎症反應隨著細菌清除而恢復正常水準(圖15。
實例 20 ： 免疫接種 Δ 720G Δ hemB 產生針對若干金黃色葡萄球菌牛***內感染分離株之較強體液反應 .
為了證實免疫接種活Δ720Δ
hemB
實際上可以產生使其適合用作針對金黃色葡萄球菌***內感染之推定的活毒疫苗的較強免疫反應，用不同劑量之活毒疫苗對小鼠免疫接種並分析結合至多種金黃色葡萄球菌牛分離株之全細胞提取物的血清總IgG。首先，在頸部中皮下投與10
6
、10
7
及10
8
CFU劑量，未在整個免疫接種時間段內引起不良作用，諸如小鼠行為改變或在免疫接種部位之炎症或壞死跡象。另外，使用遞增量之活雙重突變株ATCC 29213 ∆
720
∆
hemB
免疫接種使針對其自身抗原之全細胞提取物的全身IgG抗體之力價增加(圖15B)。免疫血清力價明顯高於免疫前血清之力價，展示產生針對活毒疫苗中存在之金黃色葡萄球菌抗原的特異性抗體。最重要的是，使用遞增量之∆
720
∆
hemB
免疫接種亦引起針對自牛乳腺炎分離之變種金黃色葡萄球菌菌株，包括在加拿大及世界其他地方發現之主要
spa
類型菌株之抗體力價隨之升高(圖15C)。該等結果清楚地顯示，免疫接種雙重突變株可以產生免疫反應，及(ii)菌株背景(ATCC 29213)與牛乳腺炎菌株共有足夠的共同特徵，使得該抗體反應亦很大程度上識別主要
spa
類型之菌株。 如根據所量測的針對完整細菌細胞提取物之總IgG力價較高判斷，使用皮下注射存活Δ
720
Δ
hemB
免疫接種小鼠引起較強體液反應。另外，疫苗菌株Δ
720
Δ
hemB
與牛乳腺炎菌株具有足夠的共同特徵，使得該抗體反應亦很大程度上識別來自多種常見乳腺炎相關
spa
類型之菌株。 儘管此證實雙重突變株背景(ATCC 29213)與牛乳腺炎菌株共有許多共同的特徵，但若希望，則此類雙重突變株可以在任何所希望之遺傳背景下產生，特別是自牛乳腺炎分離之任何菌株，諸如(但不限於)金黃色葡萄球菌菌株RF122。 該等結果顯示，具有某些殘留細胞內能力之SCV菌株可以允許免疫細胞募集，但不產生嚴重感染。此類SCV菌株可以用作減毒活疫苗，充分地刺激免疫反應以對抗有細胞內能力之病原體。
實例 21 ： 材料及方法 - SACOL0442 、 SACOL0720 、 SACOL0029 以及 SACOL1867 與 SACOL0029 之間之融合物 + 減毒活細菌 ( 疫苗 # 7 ) 製備抗原
. 如實例6
製備 抗原
一節中所描述來製備抗原，不過另外存在抗原SACOL0029。
由
GenScript, Inc.(Piscataway, NJ)對His標記的SACOL0029之重組蛋白質進行工程改造及製造。(參見圖21A第I項，his標記之序列)。
產生減毒活金黃色葡萄球菌菌株 Δ 720 Δ hemB .
如實例15(
產生 Δ hemB Δ 720
)中所描述來產生減毒活金黃色葡萄球菌菌株。
對小鼠免疫接種 .
在小鼠中評價由SACOL0442、SACOL0720、SACOL0029基因以及SACOL0029及SACOL1867基因的融合物編碼的重組金黃色葡萄球菌蛋白質與或不與減毒活細菌菌株金黃色葡萄球菌Δ720Δ
hemB
組合的免疫原性特性。在小鼠頸部皮下注射及大腿肌肉內注射的10
3
、10
5
、10
6
、10
7
及10
8
CFU劑量具有良好耐受性。選擇10
5
劑量及皮下途徑用於後續實驗。 對於製備細菌接種物，在冰冷的PBS中洗滌預先在BHIA盤上生長之金黃色葡萄球菌Δ720Δ
hemB
菌落兩次並將其再懸浮於含有15%甘油之PBS中，接著等分並保持在-80℃待用。為了獲得對應於10
5
CFU減毒細菌之最終小鼠免疫接種劑量，藉由將連續稀釋液塗鋪於BHIA上來評價冷凍接種物細菌濃度，並且接著在免疫接種當天，在PBS中將其稀釋至10
5
CFU/ml之最終濃度。 對於製備蛋白質劑量，將SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及SACOL0029-1867融合多肽混合並懸浮於PBS中，各自獲得5 µg最終劑量。
將
CD-1雌性小鼠隨機分成3組：第1組(5隻小鼠)接受混合蛋白質劑量(蛋白質混合物)；第2組(5隻小鼠)接受減毒細菌(Δ720Δ
hemB
)劑量(Δ720Δ
hemB
)；第3組(6隻小鼠)接受混合蛋白質與減毒細菌之組合(組合)。在頸部以間隔兩週方式兩次皮下注射對CD-1雌性小鼠進行免疫接種。如先前所描述，在PBS中稀釋蛋白質及細菌菌株劑量並以100 µl最終體積投與每組小鼠。在整個實驗性免疫接種期間未觀察到不良副作用。在即將第一次初始注射之前(免疫前血清)及增強免疫接種之後十天(免疫血清)取得血液樣品。使血液等分試樣在室溫下凝結，保持一小時，在4℃下以10,000 g離心10分鐘。收集血清並保持在-20℃，以待後續分析。
藉由 ELISA 偵測總 IgG 、 IgG1 及 IgG2 .
如先前所描述且稍加修改(Ster等人,
Vet . Immunol . Immunopathol
. (2010), 136: 311-318)，偵測針對先前用於免疫接種之各抗原之血清總IgG、IgG1及IgG2。此外，亦偵測針對葡萄球菌表面蛋白質ClfA之IgG以展示使用活菌株增強及平衡針對金黃色葡萄球菌之免疫反應的補充優勢。用75 µl各測試抗原(6.67 µg/mL在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中稀釋，Sigma Aldrich, Oakville, ON)塗佈Nunc MaxiSorp™96孔盤(Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)並在室溫下培育隔夜。接著在37℃下，用含有5%脫脂奶粉之PBS使該等盤飽和，保持1小時。將一百微升在含有3%牛奶及0.025% Tween™ 20之PBS中之血清之四倍連續稀釋液裝載至盤中並在37℃下培育1小時。用含有0.05% Tween™ 20之PBS洗滌該等盤三次。接著將一百微升辣根過氧化酶(HRP)偶聯之二次抗體添加至該盤中。使用的二次抗體係在含有3%牛奶及0.025% Tween™20之PBS分別以1/5000稀釋的山羊抗小鼠IgG、IgG2a及IgG1(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)。在37℃下培育1小時隨後洗滌3次之後，根據製造商之推薦，用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)試劑(KPL Inc., Gaithersburg, MD)偵測過氧化酶活性。
統計分析
. 抗體力價及相關性之統計分析係使用GraphPad Prism™ v6.05進行。
實例 22 ： 抗原融合物及與減毒活金黃色葡萄球菌菌株之組合在小鼠中誘導高抗體力價
-
疫苗
#7 如實例21中所描述，製備抗原及減毒活金黃色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。如實例21中所描述，對小鼠免疫接種並偵測IgG。 圖16中之結果顯示，用SACOL0029-1867融合物免疫接種(當與其他抗原或與減毒活菌株共投與時)在小鼠中誘導較高特異性抗體反應。
實例 23 ： 減毒活金黃色葡萄球菌菌株明顯改善針對一些特異性抗原之抗體免疫反應 - 疫苗 # 7
如實例21中所描述，製備抗原及減毒活金黃色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。如實例21中所描述，對小鼠免疫接種並偵測IgG。 圖17中之結果顯示，相較於自僅用蛋白質混合物免疫接種之小鼠獲得的IgG抗體，用減毒活菌株Δ720Δ
hemB
免疫接種使針對SACOL0029抗原之特異性IgG抗體的產生明顯增加。
實例 24 ： 減毒活金黃色葡萄球菌菌株明顯誘導另外針對金黃色葡萄球菌表面蛋白質之抗體力價 - 疫苗 # 7
如實例21中所描述，製備抗原及減毒活金黃色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。如實例21中所描述，對小鼠免疫接種並偵測IgG。 圖18中之結果顯示，相較於用僅由SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及SACOL0029-1867構成之蛋白質混合物所實現之抗體產生，用減毒活菌株Δ720Δ
hemB
免疫接種(單獨或當與多肽抗原共投與時)使針對葡萄球菌表面蛋白質ClfA之特異性抗體的產生顯著增加。
實例 25 ： 減毒活金黃色葡萄球菌菌株明顯平衡 Th1 Th2 免疫反應 - 疫苗 # 7
如實例21中所描述，製備抗原及減毒活金黃色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。 如先前所描述，在經疫苗接種小鼠之血清中偵測針對SACOL0029-1867融合蛋白之血清IgG2a及IgG1同型，並測定各小鼠之IgG2a比IgG1力價比率。IgG2a同型與小鼠體內之Th1免疫反應相關，而IgG1係Th2反應之標記物。如實例5中所描述，如根據母牛之牛奶中相應體細胞(SCC)含量或細菌計數(CFU)判斷(圖4C)，在母牛中誘導產生IgG2及牛奶中IgG2力價之程度與保護母牛免受金黃色葡萄球菌激發影響明顯相關。 圖19及20中所示之結果證實，在組合免疫接種疫苗(Δ720Δ
hemB
金黃色葡萄球菌與SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及SACOL0029-1867一起投與)中包括減毒活菌株Δ720Δ
hemB
誘導的針對SACOL0029-1867融合物及SACOL0029蛋白質的IgG2a/IgG1抗體比率明顯高於用蛋白質混合物免疫接種(SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及SACOL0029-1867)所見到的比率，引起明顯更平衡的Th1/Th2反應。 以上實例21至25顯示，即使藉由免疫接種呈蛋白質混合物組合物形式之不同抗原(包括例如SACOL0029-1867融合物)獲得較強抗體反應，對小鼠免疫接種該等抗原與減毒活菌株之組合藉由誘導針對某些特定抗原(例如SACOL0029)之較高抗體力價、藉由產生針對其他葡萄球菌蛋白質(例如ClfA)之抗體及藉由達到針對與活菌株共投與之抗原更平衡之IgG2a/IgG1比率(較強Th1型反應之較佳標記物)，仍顯著提高針對金黃色葡萄球菌之免疫反應。
實例 26 ： 在金黃色葡萄球菌 Δ hemB Δ 720 菌株中重組蛋白質之表現 - 疫苗 # 8 、 9 、 10 等 將
基因SACOL0442、SACOL0720、SACOL0029及/或SACOL1867以及基因SACOL0029及SACOL1867(或其片段)之融合物(例如大小為50 AA或更多AA)(SACOL0029-SACOL1867)、SACOL720及/或SACOL0442之片段(例如抗原決定基)之融合物(融合物720-720)(融合物442-720)或基因或其片段之任何其他融合物，例如SACOL0029-SACOL0442、SACOL0029-SACOL0720、SACOL0029-SACOL0720-SACOL0442、SACOL0029-SACOL0720-SACOL1867、SACOL0029-SACOL1867-SACOL0442、SACOL0442-SACOL0029-SACOL0720、SACOL0442-SACOL0029-SACOL0720、SACOL0442-SACOL1867-SACOL0720、SACOL0720-SACOL0442-SACOL1867、SACOL04029-SACOL1867-SACOL0720-SACOL0442，選殖至質體pCN36(Charpentier等人, 2004)中，處於組成性啟動子(來自質體pCN40之P
blaZ
)(Charpentier等人, 2004)控制下並在金黃色葡萄球菌Δ
hemB
Δ720菌株中表現。預測本文中提出的某些蛋白質抗原係外毒素、腸毒素或超抗原(例如SACOL0442)或可用於針對宿主防禦進行保護之蛋白質(例如SACOL0720)且可能干擾哺乳動物免疫系統及抗體產生，及/或在宿主體內顯示一定毒性。儘管用本文所描述之疫苗組合物及調配物未觀察到此類干擾，但對金黃色葡萄球菌Δ
hemB
Δ720菌株中表現之蛋白質或多肽進行修飾以使選殖之基因不補充其毒力可能係有用的。出於此類目的，可使用分子生物學技術使此類蛋白質活性所涉及之推定區域缺失或突變，同時不喪失免疫原性(Chang等人, 2008)。該係申請人用於製備本發明之疫苗組合物之抗原的方法。 藉由LC-MS/MS分析驗證帶有該等構築表現載體之一之金黃色葡萄球菌Δ
hemB
Δ720菌株中每一種的個別重組蛋白產物之表現。簡言之，對在含15 µg/ml四環素之BHI中生長至對數中期的菌株離心且用乙醇使集結粒失活。樣品保持在-20℃，直至進行細胞溶解及胰蛋白酶消化程序。在37℃下，將樣品與溶葡球菌酶及胰蛋白酶一起培育，隨後藉由使用玻璃珠及珠磨器以機械方式均質化來破壞細胞。接著在4℃下以13 000 rpm將溶解產物離心25分鐘以便移除細胞碎片，隨後用胰蛋白酶消化蛋白質，藉由標準程序進行還原及烷基化，接著注射樣品以使用LC-MS/MS之MRM方法偵測蛋白質。 或者，亦藉由細菌溶解產物西方墨點確定重組蛋白之表現。
實例 27 ：用表現抗原之減毒菌株免疫接種小鼠 - 疫苗 # 8 等
以間隔兩週方式兩次皮下注射對CD-1雌性小鼠疫苗進行接種。在生理食鹽水中稀釋帶有或未帶有該等構築表現載體之一的金黃色葡萄球菌Δ
hemB
Δ720菌株中的每一種並以每劑100 µl最終體積投與。
第
1組僅接受雙重突變株；第2組接受表現融合物SACOL0029-1867之雙重突變株；第3組接受表現融合物SACOL0029-0442之雙重突變株；第4組接受表現融合物SACOL0029-0720之雙重突變株；第5組接受雙重突變株之混合物，一種表現融合物SACOL0029-1867且另一種表現融合物SACOL0029-0442；第6組接受雙重突變株之混合物，一種表現融合物SACOL0029-1867且另一種表現融合物SACOL0029-0720；及第7組接受雙重突變株之混合物。在即將第一次注射之前及在第二次注射之後十二天取得血液樣品。
使
樣品在室溫下凝結一小時，接著在4℃下以2 000 g離心10分鐘。收集上清液(血清)並保持在-20℃，以待後續分析。在第27天對小鼠實施安樂死並藉由心臟穿刺收集血液。回收免疫血清，等分並儲存作為免疫前血清。 藉由酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)關於針對金黃色葡萄球菌完整細胞(Wood株)或特定重組蛋白質之血清多株IgG抗體的存在評價針對疫苗接種之免疫反應。使用抗小鼠IgG-HRP(HRP：辣根過氧化酶)作為二次抗體，使用分光光度計偵測由過氧化酶活性氧化3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)受質產生之色度。
參考文獻
Allard M, Ster C., Jacob CL, Scholl D, Diarra MS, Lacasse P, and Malouin F, 2013. The expression of a putative exotoxin and an ABC transporter during bovine intramammary infection contributes to the virulence of Staphylococcus aureus. Vet. Microbiol. 162:761-70. Allard, M., C. Ster, L. St-James, P. Lacasse, M.S. Diarra, C. L. Jacob, and F. Malouin. 2008. Transcriptional Analysis of In Vivo-Expressed Genes in Staphylococcus aureus During Bovine Mastitis. American Society for Microbiology General Meeting. Boston, USA. June 1-5, 2008 (Poster) Allard, M., H. Moisan, E. Brouillette, A.L. Gervais, M. Jacques, P. Lacasse, M.S. Diarra, and F. Malouin. 2006. Transcriptional modulation of some Staphylococcus aureus iron-regulated genes during growth in vitro and in a tissue cage model in vivo. Microbes Infect. 7:1679-1690. Asli A, Brouillette E, Krause KM, Nichols WW, Malouin F. Distinctive binding of avibactam to penicillin-binding proteins of gram-negative and gram-positive bacteria. Antimicrob Agents Chemother. 2016;60: 752-756. Atalla, H., C. Gyles, and B. Mallard. 2010. Persistence of a Staphylococcus aureus small colony variants (S. aureus SCV) within bovine mammary epithelial cells. Vet. Microbiol. Elsevier B.V. 143:319-28. Atalla, H., C. Gyles, and B. Mallard. 2011. Staphylococcus aureus small colony variants (SCVs) and their role in disease. Anim. Health Res. Rev. 12:33-45. Atalla, H., C. Gyles, B. Wilkie, K. Leslie, and B. Mallard. 2009. Somatic cell scores and clinical signs following experimental intramammary infection of dairy cows with a Staphylococcus aureus small colony variant (S. aureus SCV) in comparison to other bovine strains. Vet. Microbiol. 137:326-34. Atalla, H., C. Gyles, C.L. Jacob, H. Moisan, F. Malouin, and B. Mallard. 2008. Characterization of a Staphylococcus aureus small colony variant (SCV) associated with persistent bovine mastitis. Foodborne Pathog 5:785-799. Barbagelata, M. S., L. Alvarez, M. Gordiola, L. Tuchscherr, C. von Eiff, K. Becker, D. Sordelli, and F. Buzzola. 2011. Auxotrophic mutant of Staphylococcus aureus interferes with nasal colonization by the wild type. Microbes Infect. 13:1081-90. Barkema, H.W., Y.H. Schukken, and R.N. Zadoks. 2006. Invited Review: The role of cow, pathogen, and treatment regimen in the therapeutic success of bovine Staphylococcus aureus mastitis. J Dairy Sci. 89:1877-1895. Barrio, M. B., P. Rainard, F.B.Gilbert, B. Poutrel. 2003. Assessment of the opsonic activity of purified bovine sIgA following intramammary immunization of cows with Staphylococcus aureus. J. Dairy Sci. 86 :2884-2894. Bharathan, M., and I. K. Mullarky. 2011. Targeting mucosal immunity in the battle to develop a mastitis vaccine. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 16:409-19. Bowdish, D.M.E., Davidson, D.J., Scott, M.G. and Hancock, R.E.W., 2005. Immunomodulatory Activities of Small Host Defense Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49(5): 1727-1732. Bradley RD Rothstein, G, P. P. C. 1982. Cellular and extracellular myeloperoxidase in pyogenic inflammation. Blood 60:618-622. Bradley, A. 2002. Bovine mastitis: an evolving disease. Vet J. 164:116-128. Brouillette, E., A. Martinez, B. J. Boyll, N. E. Allen, and F. Malouin. 2004. Persistence of a Staphylococcus aureus small-colony variant under antibiotic pressure in vivo. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 41:35-41. Brouillette, E., and F. Malouin. 2005. The pathogenesis and control of Staphylococcus aureus-induced mastitis: study models in the mouse. Microbes Infect. 7:560-8. Brouillette, E., G. Grondin, B. G. Talbot, and F. Malouin. 2005. Inflammatory cell infiltration as an indicator of Staphylococcus aureus infection and therapeutic efficacy in experimental mouse mastitis. Vet. Immunol. Immunopathol. 104:163-9. Brouillette, E., M. Hyodo, Y. Hayakawa, D. K. Karaolis, and F. Malouin. 2005. 3',5'-cyclic diguanylic acid reduces the virulence of biofilm-forming Staphylococcus aureus strains in a mouse model of mastitis infection. Antimicrob. Agents Chemother. 49:3109-3113. Brückner, R. 1997. Gene replacement in Staphylococcus carnosus and Staphylococcus xylosus. FEMS Microbiol. Lett. 151:1-8. Burlak, C., C.H. Hammer, M.A. Robinson, A.R. Whitney, M.J. McGavin, B.N. Kreiswirth, and F.R. Deleo. 2007. Global analysis of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus exoproteins reveals molecules produced in vitro and during infection. Cell Microbiol. 9:1172-1190. Buzzola, F. R., L. P. Alvarez, L. P. N. Tuchscherr, M. S. Barbagelata, S. M. Lattar, L. Calvinho, and D. O. Sordelli. 2007. Differential abilities of capsulated and noncapsulated Staphylococcus aureus isolates from diverse agr groups to invade mammary epithelial cells. Infect. Immun. 75:886-91. Buzzola, F. R., M. S. Barbagelata, R. L. Caccuri, and D. O. Sordelli. 2006. Attenuation and persistence of and ability to induce protective immunity to a Staphylococcus aureus aroA mutant in mice. Infect. Immun. 74:3498-506. Chang, B.S., J.S. Moon, H.M. Kang, Y.I. Kim, H.K. Lee, J.D. Kim, B.S. Lee, H.C. Koo, Y.H. Park. 2008. Protective effects of recombinant staphylococcal enterotoxin type C mutant vaccine against experimental bovine infection by a strain of Staphylococcus aureus isolated from subclinical mastitis in dairy cattle. Vaccine. 26:2081-2091. Charpentier E, Anton AI, Barry P, Alfonso B, Fang Y, Novick RP. 2004. Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria. Appl Environemental Microbiol 70:6076-6085. Chen J., H Liu., J. Yang, K. Chou. 2007. Prediction of linear B-cell epitopes using amino acid pair antigenicity scale. Amino Acids 33: 423-428. Chen et. al, Adv Drug Deliv Rev. (2013), 65(10):1357-69. Chen Y., L. Caruso, B. McClane, D. Fisher, P. Gupta. 2007. Disruption of a toxin by introduction of a foreign gene into the chromosome of Clostridium perfringens using targetron induced mutagenesis. Plasmid. 58:182-189. Cui, L., J. Lian, and H. Neoh. 2005. DNA microarray-based identification of genes associated with glycopeptide resistance in
Staphylococcus aureus
. Antimicrob. agents … 49:3404-3413. De Groot, A.S., J. McMurry, and L. Moise. 2008. Prediction of immunogenicity: in silico paradigms, ex vivo and in vivo correlates. Curr Opinion in Pharmacol. 8:620-626. Dehal PS, Joachimiak MP, Price MN, Bates JT, Baumohl JK, Chivian D, Friedland GD, Huang KH, Keller K, Novichkov PS, Dubchak IL, Alm EJ, Arkin AP. MicrobesOnline: an integrated portal for comparative and functional genomics. Nucleic Acids Res. 2010 Jan; 38(Database issue): D396-400. Epub 2009 Nov 11. Detmer, A., and J. Glenting. 2006. Live bacterial vaccines-a review and identification of potential hazards. Microb. Cell Fact. 12:1-12. Diarra, M. S., D. Petitclerc, and P. Lacasse. 2002. Response of Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis to exogenous iron sources. J. Dairy Sci. 85:2141-2148. EL-Manzalawy Y, Dobbs D, Honavar V. 2008a. Predicting linear B-cell epitopes using string kernels. J Mol Recognit 21: 243-255. EL-Manzalawy Y, Dobbs D, Honavar V. 2008b. Predicting flexible length linear B-cell epitopes. 7th International Conference on Computational Systems Bioinformatics, Stanford, CA. pp. 121-131 Eng, N.F., S. Garlapati, V. Gerdts, A. Potter, L.A. Babiuk, and G.K. Mutwiri. 2010. The Potential of Polyphosphazenes for Delivery of Vaccine Antigens and Immunotherapeutic Agents. Curr Drug Deliv. 7(1):13-30. Falla, T.J., D. Karunaratne, N., Hancock, R.E.W. 1996. Mode of Action of the Antimicrobial Peptide Indolicidin. The Journal of Biological Chemistry, 271(32), Issue of August 9, pp. 19298 -19303. Falord, M., G. Karimova, A. Hiron, and T. Msadek. 2012. GraXSR proteins interact with the VraFG ABC transporter to form a five-component system required for cationic antimicrobial peptide sensing and resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 56:1047-58. Falord, M., U. Mäder, A. Hiron, M. Débarbouillé, and T. Msadek. 2011. Investigation of the Staphylococcus aureus GraSR Regulon Reveals Novel Links to Virulence, Stress Response and Cell Wall Signal Transduction Pathways. PLoS One 6:e21323. Ferens, W. a, and G. a Bohach. 2000. Persistence of Staphylococcus aureus on mucosal membranes: superantigens and internalization by host cells. J. Lab. Clin. Med. 135:225-30. Foster, T. J. 2009. Colonization and infection of the human host by staphylococci: adhesion, survival and immune evasion. Vet. Dermatol. 20:456-70. Fowler, V., and R. Proctor. 2014. Where does a Staphylococcus aureus vaccine stand? Clin. Microbiol. Infect. 20 Suppl 5:66-75. García, V., M. Gómez, M. Iglesias, N. Sanjuan, M. Gherardi, M. C. Cerquetti, and D. Sordelli. 1996. Intramammary immunization with live-attenuated Staphylococcus aureus: microbiological and immunological studies in a mouse mastitis model. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 14:45-51. Gardy, J. L., M. R. Laird, F. Chen, S. Rey, C. J. Walsh, M. Ester and F. S. L. Brinkman. 2005. PSORTb v.2.0: Expanded prediction of bacterial protein subcellular localization and insights gained from comparative proteome analysis. Bioinformatics 21(5):617-623; doi:10.1093/bioinformatics/bti057 Garzoni, C., P. Francois, A. Huyghe, S. Couzinet, C. Tapparel, Y. Charbonnier, A. Renzoni, S. Lucchini, D.P. Lew, P. Vaudaux, W,L. Kelley, and J. Schrenzel. 2007. A global view of Staphylococcus aureus whole genome expression upon internalization in human epithelial cells. BMC Genomics. 8:171. Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005), pp. 571-607 Gaupp, R., N. Ledala, and G. a Somerville. 2012. Staphylococcal response to oxidative stress. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2:33. Gläser, R., K. Becker, C. von Eiff, U. Meyer-Hoffert, and J. Harder. 2014. Decreased Susceptibility of Staphylococcus aureus Small-Colony Variants Toward Human Antimicrobial Peptides. J. Invest. Dermatol. 134:2347-50. Goerke, C., S. Campana, M.G. Bayer, G. Döring, K. Botzenhart, and C. Wolz. 2000. Direct quantitative transcript analysis of the agr regulon of Staphylococcus aureus during human infection in comparison to the expression profile in vitro. Infect Immun. 68:1304-1311. Griffiths, K. L., and S. a Khader. 2014. Novel vaccine approaches for protection against intracellular pathogens. Curr. Opin. Immunol. Elsevier Ltd 28:58-63. Guidry, A.J., L.M. Berning, C.N. Hambleton.1993. Opsonization of Staphylococcus aureus by bovine immunoglobulin isotypes. J. of Dairy Sci. 76:1285-1289. Hancock, R.E.W., and Diamond, G., 2000. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends In Microbiology. 8(9):402
.
Haveri, M., A. Roslöf, L. Rantala, and S. Pyörälä. 2007. Virulence genes of bovine Staphylococcus aureus from persistent and nonpersistent intramammary infections with different clinical characteristics. J Appl Microbiol. 103:993-1000. Hogarth, C.J., J.L. Fitzpatrick, A.M. Nolan, F.J. Young, A. Pitt, and P.D. Eckersall. 2004. Differential protein composition of bovine whey: a comparison of whey from healthy animals and from those with clinical mastitis. Proteomics. 4:2094-2100. Horsburgh, M. J., J. L. Aish, I. J. White, J. K. Lithgow, S. J. Foster, and L. Shaw. 2002. σ B Modulates Virulence Determinant Expression and Stress Resistance: Characterization of a Functional rsbU Strain Derived from Staphylococcus aureus 8325-4. J. Bacteriol. 184:5457-5467. Jayarao, B.M., D.R. Henning. 2001. Prevalence of foodborne pathogens in bulk tank milk. J Dairy Sci. 84:2157-2162. Kafala, B., and a Sasarman. 1997. Isolation of the Staphylococcus aureus hemCDBL gene cluster coding for early steps in heme biosynthesis. Gene 199:231-9. Kahl B.C., 2014. Small colony variants (SCVs) of Staphylococcus aureus - A bacterial survival strategy. Infection, Genetics and Evolution 21: 515-522. Karaolis, D.K., T.K. Means, D. Yang, M. Takahashi, T. Yoshimura, E. Muraille, D. Philpott, J.T. Schroeder, M. Hyodo, Y. Hayakawa, B.G. Talbot, E. Brouillette, and F. Malouin. 2007. Bacterial c-di-GMP is an immunostimulatory molecule. J Immunol. 178:2171-2181. Kasturi, S.P. et al. 2011. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature 470:543-547. Kawada-Matsuo, M., and Y. Yoshida. 2011. Role of two-component systems in the resistance of Staphylococcus aureus to antibacterial agents. Virulence 2:427-430. Kawada-Matsuo, M., Y. Yoshida, T. Zendo, J. Nagao, Y. Oogai, Y. Nakamura, K. Sonomoto, N. Nakamura, and H. Komatsuzawa. 2013. Three distinct two-component systems are involved in resistance to the class I bacteriocins, Nukacin ISK-1 and nisin A, in Staphylococcus aureus. PLoS One 8: e69455. Kerro-Dego, O., T. Prysliak, A. a Potter, and J. Perez-Casal. 2006. DNA-protein immunization against the GapB and GapC proteins of a mastitis isolate of Staphylococcus aureus. Vet. Immunol. Immunopathol. 113:125-38. Kollaritsch, H., S. J. Cryz, a B. Lang, C. Herzog, J. U. Que, and G. Wiedermann. 2000. Local and systemic immune responses to combined vibrio cholerae CVD103-HgR and salmonella typhi ty21a live oral vaccines after primary immunization and reimmunization. Vaccine 18:3031-9. Koo, S. P., A. S. Bayer, H. G. Sahl, R. A. Proctor, M. R. Yeaman, S. Koo, A. S. Bayer, H. Sahl, and R. A. Proctor. 1996. Staphylocidal action of thrombin-induced platelet microbicidal protein is not solely dependent on transmembrane potential. These include: Staphylocidal Action of Thrombin-Induced Platelet Microbicidal Protein Is Not Solely Dependent on Transmembrane Pot 64. Kraus, D., S. Herbert, S. a Kristian, A. Khosravi, V. Nizet, F. Götz, and A. Peschel. 2008. The GraRS regulatory system controls Staphylococcus aureus susceptibility to antimicrobial host defenses. BMC Microbiol. 8:85. Kreiswirth, B. N., S. Löfdahl, M. J. Betley, M. O'Reilly, P. M. Schlievert, M. S. Bergdoll, and R. P. Novick. 1983. The toxic shock syndrome exotoxin structural gene is not detectably transmitted by a prophage. Nature 305:709-12. Kubica, M., K. Guzik, J. Koziel, M. Zarebski, W. Richter, B. Gajkowska, A. Golda, A. Maciag-Gudowska, K. Brix, L. Shaw, T. Foster, and J. Potempa. 2008. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One 3:e1409. Kuroda, M., K. Kuwahara-Arai, and K. Hiramatsu. 2000. Identification of the up- and down-regulated genes in vancomycin-resistant Staphylococcus aureus strains Mu3 and Mu50 by cDNA differential hybridization method. Biochem. Biophys. Res. Commun. 269:485-90. Lammers, A., E. Kruijt, K. C. van de, P. J. Nuijten, and H. E. Smith. 2000. Identification of Staphylococcus aureus genes expressed during growth in milk: a useful model for selection of genes important in bovine mastitis? Microbiology. 146:981-987. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H.*, Valentin F.*, Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J. and Higgins D.G. 2007. ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948. Leitner, G., O. Krifucks, M. D. Kiran, and N. Balaban. 2011. Vaccine development for the prevention of staphylococcal mastitis in dairy cows. Vet. Immunol. Immunopathol. Elsevier B.V. 142:25-35. Li, M., D. J. Cha, Y. Lai, A. E. Villaruz, D. E. Sturdevant, and M. Otto. 2007. The antimicrobial peptide-sensing system aps of Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 66:1136-47. Lin, L., A. S. Ibrahim, X. Xu, J. M. Farber, V. Avanesian, B. Baquir, Y. Fu, S. W. French, J. E. Edwards, and B. Spellberg. 2009. Th1-Th17 cells mediate protective adaptive immunity against Staphylococcus aureus and Candida albicans infection in mice. PLoS Pathog. 5:e1000703. Linghua, Z., T. Xingshan, Z. Fengzhen. 2006. The efficacy of CpG oligodinucleotides, in combination with conventional adjuvants, as immunological adjuvants to swine streptococcic septicemia vaccine in piglets in vivo. Int Immunopharmacol. 6:1267-76. Löffler, B., L. Tuchscherr, S. Niemann, and G. Peters. 2013. Staphylococcus aureus persistence in non-professional phagocytes. Int. J. Med. Microbiol. Elsevier GmbH. Loiselle, M.C., C. Ster, B.G. Talbot, X. Zhao, G.F. Wagner, Y.R. Boisclair, and P. Lacasse. 2009. Impact of postpartum milking frequency on the immune system and the blood metabolite concentration of dairy cows. J Dairy Sci. 92:1900-1912. Lowe, A.M., D.T. Beattie, and R.L. Deresiewicz. 1998. Identification of novel staphylococcal virulence genes by in vivo expression technology. Mol Microbiol. 27:967-976. Maresso, A.W., and O. Schneewind. 2006. Iron acquisition and transport in Staphylococcus aureus. Biometals. 19:193-203. Maresso AW, Schneewind O. Sortase as a target of anti-infective therapy. Pharmacol Rev. 2008 Mar;60(1):128-41. Mayer, S.J., A.E. Waterman, P.M. Keen, N. Craven, and F.J. Bourne. 1988. Oxygen concentration in milk of healthy and mastitic cows and implications of low oxygen tension for the killing of Staphylococcus aureus by bovine neutrophils. J Dairy Res 55:513-519. Meehl, M., S. Herbert, F. Götz, and A. Cheung. 2007. Interaction of the GraRS two-component system with the VraFG ABC transporter to support vancomycin-intermediate resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 51:2679-89. Melchior, M.B., M.H. vanOsch, R.M. Graat, E. van Duijkeren, D.J. Mevius, N. Nielen, W. Gaastra, J. Fink-Gremmels. 2009. Biofilm formation and genotyping of Staphylococcus aureus bovine mastitis isolates: evidence for lack of penicillin-resistance in Agr-type II strains. Vet. Microbiol. 137:83-89. Merino, N., A. Toledo-Arana, M. Vergara-Irigaray, J. Valle, C. Solano, E. Calvo, J. A. Lopez, T. J. Foster, J. R. Penadés, and I. Lasa. 2009. Protein A-mediated multicellular behavior in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 191:832-43. Middleton, J. R., C. D. Luby, and D. S. Adams. 2009. Efficacy of vaccination against staphylococcal mastitis: a review and new data. Vet. Microbiol. 134:192-8. Middleton, J.R. 2008. Staphylococcus aureus antigens and challenges in vaccine development. Expert Rev Vaccines. 7(6):805-815. Mitchell, G., A. Fugère, K. Pépin Gaudreau, E. Brouillette, E. H. Frost, A. M. Cantin, and F. Malouin. 2013. SigB is a dominant regulator of virulence in Staphylococcus aureus small-colony variants. PLoS One 8:e65018. Mitchell, G., C.A. Lamontagne, ,E. Brouillette, G. Grondin , B.G. Talbot, M. Grandbois, F. Malouin. 2008. Staphylococcus aureus SigB activity promotes a strong fibronectin-bacterium interaction which may sustain host tissue colonization by small-colony variants isolated from cystic fibrosis patients. Mol Microbiol 70:1540-1555. Mitchell, G., C.-A. Lamontagne, E. Brouillette, G. Grondin, B. G. Talbot, M. Grandbois, and F. Malouin. 2008. Staphylococcus aureus SigB activity promotes a strong fibronectin-bacterium interaction which may sustain host tissue colonization by small-colony variants isolated from cystic fibrosis patients. Mol. Microbiol. 70:1540-55. Mitchell, G., G. Grondin, G. Bilodeau, A. M. Cantin, and F. Malouin. 2011. Infection of Polarized Airway Epithelial Cells by Normal and Small-Colony Variant Strains of Staphylococcus aureus Is Increased in Cells with Abnormal Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Function and Is Influenced by NF-{kappa}B. Infect. Immun. 79:3541-51. Mitra SD, Velu D, Bhuvana M, Krithiga N, Banerjee A, Shome R, et al. Staphylococcus aureus spa type t267, clonal ancestor of bovine subclinical mastitis in India. J Appl Microbiol. 2013;114: 1604-1615. Moisan, H., E. Brouillette, C.L. Jacob, P. Langlois-Bégin, S. Michaud, and F. Malouin. 2006. Transcription of virulence factors in Staphylococcus aureus small-colony variants isolated from cystic fibrosis patients is influenced by SigB. J Bacteriol. 188:64-76. Myllys, V., J. Ridell, J. Bjorkroth, I. Biese, and S. Pyorala. 1997. Persistence in bovine mastitis of Staphylococcus aureus clones as assessed by random amplified polymorphic DNA analysis, ribotyping and biotyping. Vet Microbiol. 57:245-251. National Mastitis Council. 1996. Current Concept of Bovine Mastitis. 4 ed. National Mastitis Council, Madison, WI. Nickerson, S. C., W. E. Owens, L. K. Fox, C. C. Scheifinger, T. R. Shryock, and T. E. Spike. 1999. Comparison of tilmicosin and cephapirin as therapeutics for Staphylococcus aureus mastitis at dry-off. J Dairy Sci. 82:696-703. Novick RP.Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol Microbiol. 2003 Jun;48(6):1429-49. Novick RP, Geisinger E. Quorum sensing in staphylococci. Annu Rev Genet. 2008;42: 541-64. Overton, I. M., S. Graham, K. a Gould, J. Hinds, C. H. Botting, S. Shirran, G. J. Barton, and P. J. Coote. 2011. Global network analysis of drug tolerance, mode of action and virulence in methicillin-resistant S. aureus. BMC Syst. Biol. BioMed Central Ltd 5:68. Owens, W.E., C.H. Ray, J.L. Watts, and R.J. Yancey. 1997. Comparison of success of antibiotic therapy during lactation and results of antimicrobial susceptibility tests for bovine mastitis. J Dairy Sci. 80:313-317. Park, Y.K., H.C. Koo, S.H. Kim, S.Y. Hwang, W.K. Jung, J. Kim, S. Shin, R. Kim, and Y. Park. 2007. The analysis of milk components and pathogenic bacteria isolated from bovine raw milk in Korea. J Dairy Sci. 90:5405-5414. Pasetti, M. F., J. K. Simon, M. B. Sztein, and M. M. Levine. 2011. Immunology of gut mucosal vaccines. Immunol. Rev. 239:125-48. Peles, F., M. Wagner, L. Varga, I. Hein, P. Rieck, K. Gutser, P. Keresztúri, G. Kardos, I. Turcsányi, B. Béri, and A. Szabó. 2007. Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine milk in Hungary. Int J Food Microbiol. 118:186-93. Pellegrino, M., J. Giraudo, C. Raspanti, L. Odierno, and C. Bogni. 2010. Efficacy of immunization against bovine mastitis using a Staphylococcus aureus avirulent mutant vaccine. Vaccine 28:4523-8. Pellegrino, M., J. Giraudo, C. Raspanti, R. Nagel, L. Odierno, V. Primo, and C. Bogni. 2008. Experimental trial in heifers vaccinated with Staphylococcus aureus avirulent mutant against bovine mastitis. Vet. Microbiol. 127:186-90. Peterson, J. D., Umayam, L. A., Dickinson, T., Hickey, E. K., White, O. 2001. The Comprehensive Microbial Resource. Nucleic Acids Res. 29(1): 123-5. Petitclerc,D., K. Lauzon, A. Cochu, C. Ster, M.S. Diarra, and P. Lacasse. 2007. Efficacy of a lactoferrin-penicillin combination to treat {beta}-lactam-resistant Staphylococcus aureus mastitis. J Dairy Sci. 90:2778-2787. Pragman, A.A., and P.M. Schlievert. 2004. Virulence regulation in Staphylococcus aureus: the need for in vivo analysis of virulence factor regulation. FEMS Immunol Med Microbiol. 42:147-154. Proctor, R. a, C. von Eiff, B. C. Kahl, K. Becker, P. McNamara, M. Herrmann, and G. Peters. 2006. Small colony variants: a pathogenic form of bacteria that facilitates persistent and recurrent infections. Nat. Rev. Microbiol. 4:295-305. Proctor, R. a. 2012. Challenges for a universal Staphylococcus aureus vaccine. Clin. Infect. Dis. 54:1179-86. Proctor, R. a., A. Kriegeskorte, B. C. Kahl, K. Becker, B. Löffler, and G. Peters. 2014. Staphylococcus aureus Small Colony Variants (SCVs): a road map for the metabolic pathways involved in persistent infections. Front. Cell. Infect. Microbiol. 4:1-8. Pulli, B., M. Ali, R. Forghani, S. Schob, K. L. C. Hsieh, G. Wojtkiewicz, J. J. Linnoila, and J. W. Chen. 2013. Measuring myeloperoxidase activity in biological samples. PLoS One 8: e67976. Reyher, K. K., S. Dufour, H. W. Barkema, L. Des Côteaux, T. J. Devries, I. R. Dohoo, G. P. Keefe, J.-P. Roy, and D. T. Scholl. 2011. The National Cohort of Dairy Farms--a data collection platform for mastitis research in Canada. J. Dairy Sci. Elsevier 94:1616-26. Sadowska, B., A. Bonar, C. von Eiff, R. A. Proctor, M. Chmiela, W. Rudnicka, and B. Róźalska. 2002. Characteristics of Staphylococcus aureus, isolated from airways of cystic fibrosis patients, and their small colony variants. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 32:191-7. Saha, S and Raghava G.P.S., (2006) Prediction of Continuous B-cell Epitopes in an Antigen Using Recurrent Neural Network. Proteins, 65(1),40-48. Saha.S and Raghava G.P.S. BcePred: Prediction of Continuous B-Cell Epitopes in Antigenic Sequences Using Physico-chemical Properties. In G.Nicosia, V.Cutello, P.J. Bentley and J.Timis (Eds.) ICARIS 2004, LNCS 3239, 197-204, Springer, 2004. Sandholm, M., L. Kaartinen, and S. Pyorala. 1990. Bovine mastitis - why does antibiotic therapy not always work? An overview. J Vet Phamacol Therap. 13:248-260. Schaffer, A.C., and J.C. Lee. 2009. Staphylococcal vaccines and immunotherapies. Infect Dis Clin North Am. 23:153-171. Sears, P.M. and McCarthy, K.K. 2003. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet Clin North Am Food Anim Pract 19:171-185. Sendi, P., and R. a Proctor. 2009. Staphylococcus aureus as an intracellular pathogen: the role of small colony variants. Trends Microbiol. 17:54-8. Senn, M. M., M. Bischoff, C. Von Eiff, B. Berger-bächi, and B. Berger-ba. 2005. σ B Activity in a Staphylococcus aureus hemB Mutant. J. Bacteriol. 187:7397-7406. Sibbald, M.J., A.K. Ziebandt, S. Engelmann, M. Hecker, A. de Jong, H.J. Harmsen, G.C. Raangs, I. Stokroos, J.P. Arends, J.Y. Dubois, and J.M. van Dijl. 2006. Mapping the pathways to staphylococcal pathogenesis by comparative secretomics. Microbiol Mol Biol Rev. 70:755-788. Silanikove, N., F. Shapiro, and G. Leitner. 2007. Posttranslational ruling of xanthine oxidase activity in bovine milk by its substrates. Biochem Biophys Res Commun. 363:561-565. Somerville, G.A., and R.A. Proctor. 2009. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol Mol Biol Rev. 73:233-248. Spellberg, B., and R. Daum. 2012. Development of a vaccine against Staphylococcus aureus. Semin. Immunopathol. 34:335-48. Sprickler A.R. and J.A. Roth. Adjuvants in veterinary vaccines: mode of action and adverse effects. 2003. 17:273-281. Srinivasan, V., A.A. Sawant, B.E. Gillespie, S.J. Headrick, L. Ceasaris, and S.P. Oliver. 2006. Prevalence of enterotoxin and toxic shock syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus isolated from milk of cows with mastitis. Foodborne Pathog Dis. 3:274-83. Srivastava S, Singh V, Kumar V, Verma PC, Srivastava R, Basu V, Gupta V, Rawat AK. Identification of regulatory elements in 16S rRNA gene of Acinetobacter species isolated from water sample. Bioinformation. 2008; 3(4):173-6. Epub 2008 Dec 6. Ster, C., M. Allard, S. Boulanger, M. Lamontagne Boulet, J. Mulhbacher, D. a Lafontaine, E. Marsault, P. Lacasse, and F. Malouin. 2013. Experimental treatment of Staphylococcus aureus bovine intramammary infection using a guanine riboswitch ligand analog. J. Dairy Sci. Elsevier 96:1000-8. Sutra, L., and B. Poutrel. 1994. Virulence factors involved in the pathogenesis of bovine intramammary infections due to Staphylococcus aureus. J. Med. Microbiol. 40:79-89. Taverna, F., A. Negri, R. Piccinini, A. Zecconi, S. Nonnis, S. Ronchi, and G. Tedeschi. 2007. Characterization of cell wall associated proteins of a Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis case by a proteomic approach. Vet Microbiol. 119:240-247 Tollersrud, T., A.H. Kampen, and K. Kenny. 2006. Staphylococcus aureus enterotoxin D is secreted in milk and stimulates specific antibody responses in cows in the course of experimental intramammary infection. Infect Immun. 74:3507-3512. Tuchscherr, L., E. Medina, M. Hussain, W. Völker, V. Heitmann, S. Niemann, D. Holzinger, J. Roth, R. a Proctor, K. Becker, G. Peters, and B. Löffler. 2011. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Mol. Med. 3:129-41. Tuchscherr, L., V. Heitmann, M. Hussain, D. Viemann, J. Roth, C. von Eiff, G. Peters, K. Becker, and B. Löffler. 2010. Staphylococcus aureus small-colony variants are adapted phenotypes for intracellular persistence. J. Infect. Dis. 202:1031-40. Tuchscherr, L.P., F.R. Buzzola, L.P. Alvarez, J.C. Lee, and D.O. Sordelli. 2008. Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitis and the emergence of unencapsulated and small-colony variants of Staphylococcus aureus in mice. Infect Immun. 76:5738-5744. Tusnády, G.E. and Simon, I. 2001. The HMMTOP transmembrane topology prediction server" Bioinformatics 17, 849-850. Veh KA, Klein RC, Ster C, Keefe G, Lacasse P, Scholl D, et al. Genotypic and phenotypic characterization of Staphylococcus aureus causing persistent and nonpersistent subclinical bovine intramammary infections during lactation or the dry period. J Dairy Sci. 2015;98: 155-168 Von Eiff, C., P. McNamara, K. Becker, X. Lei, M. Ziman, B. R. Bochner, G. Peters, and R. A. Proctor. 2006. Phenotype Microarray Profiling of Staphylococcus aureus menD and hemB Mutants with the Small-Colony-Variant Phenotype Phenotype Microarray Profiling of Staphylococcus aureus menD and hemB Mutants with the Small-Colony-Variant Phenotype †. J. Bacteriol. 188:687-693. Voyich, J.M., K.R. Braughton, D.E. Sturdevant, A.R. Whitney, B. Saïd-Salim, S.F. Porcella, R.D. Long, D.W. Dorward, D.J. Gardner, B.N. Kreiswirth, J.M. Musser, and F.R. DeLeo. 2005. Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. J Immunol. 175:3907-3919. Watson, D. L. 1984. Evaluation of attenuated, live staphylococcal mastitis vaccine in lactating heifers. J. Dairy Sci. 67:2608-13. Whist, A. C., O. Osterås, and L. Sølverød. 2009. Association between isolation of Staphylococcus aureus one week after calving and milk yield, somatic cell count, clinical mastitis, and culling through the remaining lactation. J. Dairy Res. 76:24-35. WO/2003/091279 WO/2004/043405 WO/2005/007683 WO/2006/059846 WO/2008/152447 Xia, Y., and J. L. Zweier. 1997. Measurement of Myeloperoxidase in Leukocyte-Containing Tissues. Anal. Biochem. 245:93-96. Yang, S.-J., A. S. Bayer, N. N. Mishra, M. Meehl, N. Ledala, M. R. Yeaman, Y. Q. Xiong, and A. L. Cheung. 2012. The Staphylococcus aureus Two-Component Regulatory System, GraRS, Senses and Confers Resistance to Selected Cationic Antimicrobial Peptides. Infect. Immun. 80:74-81. Zecconi, A., R. Piccinini, and L. K. Fox. 2003. Epidemiologic study of intramammary infections with Staphylococcus aureus during a control program in nine commercial dairy herds. J. Am. Vet. Med. Assoc. 223:684-8. Zhang, C., J. Yang, and L. K. Jennings. 2004. Non - Leukocyte-Derived Reactive Oxygen Species. Diabetes 53:2950-2959. Ziebandt, A.K., H. Kusch, M. Degner, S. Jaglitz, M.J. Sibbald, J.P. Arends, M.A. Chlebowicz, D. Albrecht, R. Pantucek, J. Doškar, W. Ziebuhr, B.M. Bröker, M. Hecker, J.M. van Dijl, and S. Engelmann. 2010. Proteomics uncovers extreme heterogeneity in the Staphylococcus aureus exoproteome due to genomic plasticity and variant gene regulation. Proteomics 285(47)36794-36803.