KR100729954B1 - Ｓｅｃ１ 변이 단백질의 제형 및 그것의 제형화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 건유기 또는 비유기 젖소의 면역 기능 개선을 통한 유방염의 예방, 증상 경감 및 치료에 우수한 효과를 나타내는 황색 포도상 구균의 독소들 중의 하나인 SEC1(Staphylococcal enterotoxin C1) 변이 단백질의 제형에 관한 것으로, 활성성분으로서 SEC1 변이 단백질, 단백질 안정화 부형제, 탄수화물계 보조 부형제 및 친유성 물질을 포함하고 있는 고체상 미세입자가 생체적합성 오일 및/또는 지방산 에스테르계 화합물에 분산되어 있는 구성으로 이루어져 있다.
본 발명에 따른 제형은 활성성분인 수용성 변이 단백질의 활성을 유지하면서 체내에 효과적으로 전달하고, 우수한 항체 형성능으로 인해 젖소에 투여시 면역효과 증대를 통해 유방염 예방 및 치료에 대해 우수한 효과를 가지며, 주사능 측면에서도 우수하여 주사제로 사용될 수 있다.

Description

ＳＥＣ１ 변이 단백질의 제형 및 그것의 제형화 방법 {Formulation of SEC1 Mutated Protein and Method for Formulation of the Same}
도 1은 본 발명에 따른 실시예 및 비교예의 제형을 마우스에 주사한 후 채취된 혈액으로부터 마우스 사이토카인 ELISA kit을 사용하여 γ-IFN을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 2는 본 발명에 따른 실시예 1의 제형을 체세포수 50만/㎖ 이상인 비유기 젖소들에 주사하고 젖소의 우유를 제형의 투여전 2 주, 4 주, 6 주 및 10 주까지 5 회 수집하여 우유내의 체세포수의 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1의 제형과 베링거 인겔하임 사의 라백 스타프(상표명)를 체세포수 50만/㎖ 이상인 비유기 젖소들에 주사한 후 젖소의 우유를 수집하여 우유내의 체세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 건유기 또는 비유기 젖소의 면역 기능 개선을 통한 유방염의 예 방, 증상 경감 및 우수한 치료 효과를 나타내는 황색 포도상 구균의 독소들 중의 하나인 Staphylococcal enterotoxin C1(SEC1) 변이 단백질의 제형과 그것의 제형화 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유효량의 SEC1 변이 단백질; 단백질 안정화 부형제; 탄수화물계 보조 부형제; 친유성 물질; 및 생체적합성 오일 및/또는 지방산 에스테르계 화합물을 포함하는 것으로 구성되어 있어서, 주사에 의한 투여가 용이하고 약효와 안정성을 극대화시킨 SEC1 변이 단백질의 제형과 그것의 제형화 방법을 제공한다.
황색 포도상 구균의 독소들 중의 하나인 SEC1 변이 단백질은, 황색 포도상 구균의 변이 독소 C1의 95 번째 아미노산인 시스테인(cysteine)을 세린(serine)으로 치환한 단백질로서, 특이적인 체액성 면역의 항체 생성뿐만 아니라 비특이적인 세포성 면역의 촉진을 유발시키는 백신으로서의 효과 적용 가능성이 알려져 있다(Terence N. Turner 등 (1992), Infection and immunity 62(2); 694-697., Carolyn J.Hovde 등 (1994), Molecular Microbiology 13(5); 897-909., Marcy L.Hoffann 등 (1994), Infection and Immunity 62(8); 3396-3407). SEC1 변이 단백질의 제조방법은 한국 특허 제382,239호, 호주 특허 제2001-11759호 등에 개시되어 있다.
이와 같은 유방염 예방, 증상 경감 및 치료 효과를 갖는 SEC1 변이 단백질은, 한국 특허 제382,239호에서 개시하고 있는 바와 같이, 대장균을 숙주로 하여 대량 생산할 수 있지만, 다른 단백질 의약품과 마찬가지로 장시간(2주 이상) 보관시 SEC1 변이 단백질의 변성 및 분산 매체(오일 등) 내에서 단백질의 응집현상(aggregation) 등 단백질의 안정성 유지면에서 문제점이 있다. 또한, 일반적인 단 백질과 마찬가지로 SEC1 변이 단백질도 열, pH, 염분, 유기 용매 등에 불안정하다(Weiqi Lu et al.PDA L.Pharm.Sci.Tech. 49,13-19 (1995)).
한편, 본 출원인의 한국특허 제359,252호에는 SEC1 변이 단백질의 미세입자 제조를 위해 3% 농도의 카르복시메틸셀룰로스와 2% 농도의 레시틴을 사용하여 분무건조법에 의해 미세입자를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 방법은 몇가지 문제점을 가지고 있는 바, 분무건조법에 의한 SEC1 변이 단백질의 생산량은 약 10 ~ 30% 정도 수준이므로 대량 생산에 의한 상용화에 적합하지 못하며, 분무건조 과정에서 SEC1 변이 단백질이 접하는 내부온도는 50 ~ 70℃이므로 단백질의 변성에 영향을 줄 수 있다. 이러한 이유로 SEC1 변이 단백질을 외부 환경에서 충분한 기간 동안 안정한 상태가 되도록 유지하면서 투여 후, 생체내로 효과적으로 전달할 수 있는 제형의 개발과 대량생산이 가능한 기술의 개발이 요구되었다.
그러한 이유로, 생분해성 고분자인 폴리에스테르 계열의 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리락타이드(polylactide) 등과 이들의 중합체들을 이용하여 고체상 미세입자로 제형화하는 많은 연구가 행해졌다. 이들 제형들은 체내에서 분해효소로부터의 방어 효과와 일정기간 약물 효과의 지속성 등을 나타내어 효과를 더 극대화할 수 있지만, 제형화 과정 중 생분해성 고분자 물질이 유기용매에 대해서만 용해되는 특성으로 인해 단백질의 심한 변성이 초래되는 문제점이 있기 때문에, 실용화시키기에는 어려움이 있다. 또 다른 제형으로서 리포좀을 이용한 경구 투여용 제형이 시도되고 있으나, 입자 구조의 불안정성과 동물용 제제로서의 비경제성으로 인해 실용화되지 못하는 실정이다.
본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 수많은 실험과 심도 있는 연구를 거듭한 끝에, 유효량의 SEC1 변이 단백질을 활성성분으로서 포함하고, 여기에 특정한 성분의 단백질 안정화 부형제, 탄수화물계 보조 부형제, 및 친유성 물질을 혼합하여 고체상 미세입자로 만들고 이를 생체적합성 오일 및/또는 지방산 에스테르계 화합물(분산 매체)에 분산시켜 제조된 제형은, SEC1 변이 단백질을 용액상태에서 장기간 보관시 발생되는 변성, 분산 매체내에서의 응집현상, 다양한 외부조건들에 의한 단백질의 불안정성 등을 방지할 수 있고, 체내에서 유방염의 예방, 증상 경감 및 치료 효과를 극대화시킬 수 있음을 확인하였을 뿐만 아니라, 대량생산에 의한 상용화가 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 첫 번째 목적은 수용성 단백질인 SEC1 변이 단백질을 안정성을 유지하면서 쉽게 주사 투여할 수 있고 투여시 생체내에서 장기간 활성을 유지할 수 있는 제형을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 제형을 효과적으로 대량생산을 통한 상용화가 가능하도록 하는 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 제형은, 활성성분으로서 황색 포도상 구균의 독소들 중의 하나인 SEC1(Staphylococcal enterotoxin C1) 변이 단백질 0.001 내지 50 중량%, 단백질 안정화 부형제 0.1 내지 90 중량%, 탄수화물계 보조 부형제 0.1 내지 90 중량%, 및 친유성 물질 0.1 내지 10 중량%를 포함하고 있는 고체상 미세입자가 생체적합성 오일 및/또는 지방산 에스테르계 화합물에 분산되어 있는 구성으로 이루어져 있다.
본 발명에 따른 제형은 특히 주사용으로 적합하고, 높은 약효 지속성과 우수한 안정성을 나타낸다.
상기 SEC1 변이 단백질은, 앞서 설명한 바와 같이, 건유기 또는 비유기 젖소의 면역기능 개선을 통한 유방염의 예방, 증상 경감 및 치료에 우수한 효과를 나타내는 활성성분으로서, 다양한 방법들에 의해 제조된 것들이 사용될 수 있다. 상기 활성성분의 함량은 앞서 정의한 바와 같이 고체상 미세입자의 중량을 기준으로 0.001 내지 50 중량%이며, 함량이 너무 적으면 약리 효과를 발휘하기 어렵고, 반대로 너무 많으면 비수용성 용매 내에서 응집현상 및 변성이 발생할 수 있다. 더욱 바람직한 함량은 0.01 내지 20 중량%이다.
본 발명의 제형에는 수용성 변이 단백질의 물리화학적 안정성을 증대시키고 안정화된 고체상 미세입자를 제조할 목적에서 특정한 성분들이 함유되어 있다.
그러한 성분들 중, 상기 단백질 안정화 부형제는 활성성분인 SEC1 변이 단백질을 안정화시키면서 입자상으로 만들 수 있는 성분이다.
본 발명자들은 SEC1 변이 단백질을 안정화된 고체상 미세입자로 제조할 수 있는 부형제를 확인하기 위하여, 단백질을 안정화시키는 것으로 알려져 있는 다수의 부형제들에서 우선 가능성이 예측되는 부형제 후보군들을 선택하였고, 이들 후보군들에 대해 고체상 미세입자의 형성 여부와 단백질 안정성에 대한 확인 실험을 수행하였다. 미세입자화는 앞서 설명한 바와 같은 분무건조법의 문제점을 고려하여 동결건조법으로 수행하였다.
하기 표 1에는 SEC1 변이 단백질과 이들 부형제의 혼합물을 동결건조시켰을 때 고체상 입자가 형성되는지 여부와, 그러한 고체상 미세입자를 오일에 분산시킨 제형을 실온조건(25℃, 60% RH)과 가혹조건(40℃, 75% RH)에서 4 주 동안 보관하였을 때의 단백질 순도의 변화율에 대한 실험 결과가 기재되어 있다. 또한, 비교를 위하여, 수용성 SEC1 변이 단백질만을 오일에 분산시킨 결과가 함께 기재되어 있다.
Figure 112005065899039-pat00001
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 실험에 사용된 부형제들 중 실리카와 인산칼슘은 수용성 SEC1 변이 단백질의 고체상 입자를 형성하지 못함을 알 수 있다. 고체상 입자를 형성하는 부형제들 중에서는, 염화나트륨, 폴리에틸렌글리콜 8000이 단백질에 대하여 가장 우수한 안정성을 나타내며, 락토오즈, 삼중블럭 공합체(플루로닉), 폴리메틸메타크릴레이트, 포도당, 설탕, 테트라메틸글루코오즈 등이 일반적으로 SEC1 변이 단백질에 대해 우수한 안정성을 나타냄을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 제형에 사용될 수 있는 바람직한 단백질 안정화 부형제로는, 염화나트륨, 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG 8000), 이당류(예를 들어, 락토오즈, 말토오즈, 수크로즈 등), 포도당, 테트라메틸글루코오즈, 및 플루로닉(삼중블록 공중합체)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물이 바람직하게 사용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 그 중에서도, 폴리에틸렌글리콜이 더욱 바람직하고, 폴리에틸렌글리콜과 염화나트륨의 혼합물이 특히 바람직하다.
상기 단백질 안정화 부형제의 함량은 앞서 정의한 바와 같이 고체상 미세입자의 중량을 기준으로 0.1 내지 90 중량%이며, 함량이 너무 적으면 첨가에 따른 효과를 발휘하기 어렵고, 반대로 너무 많으면 동결건조 공정 시 단백질의 손상 및 동결건조 후 비수용성 용매 내에서 입자의 응집현상 및 변성의 결과를 초래할 수 있다. 더욱 바람직한 함량은 30 내지 60 중량%이다.
본 발명의 제형에 사용되는 또 다른 성분인 상기 탄수화물계 보조 부형제는 상기 단백질 안정화 부형제의 작용을 보조하면서 활성성분인 SEC1 변이 단백질의 면역효과 등을 극대화시키는 역할을 하며, 다음의 것으로 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 소디움카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 키토산, 알지이트, 크실로즈, 갈락토즈, 프럭토즈, 사카로즈, 덱스트란, 및 콘드로이친 셀페이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물이 사용될 수 있다. 그 중에서도, 카르복시메틸셀룰로스가 특히 바람직하다.
상기 탄수화물계 보조 부형제의 함량은 앞서 정의한 바와 같이 고체상 미세입자의 중량을 기준으로 0.1 내지 90 중량%이며, 함량이 너무 적으면 첨가에 따른 효과를 발휘하기 어렵고, 반대로 너무 많으면 동결건조시 고체입자가 형성되지 않을 수 있다. 더욱 바람직한 함량은 0.5 내지 50 중량%이다.
본 발명의 제형에는 친유성 물질이 첨가되는 바, 상기 친유성 물질은 활성성분인 SEC1 변이 단백질이 포함되어 있는 미세입자의 분산성을 향상시키고 그에 따라 제형의 주사능을 개선하는 역할을 하며, 다음의 것으로 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 레시틴, 포스파티딜콜린계 물질(e.g., 스테아로일 포스파티딜콜린, 아라키도일 포스파티딜콜린), 미리스트산, 파미트산, 스테아르산, 소르비탄 모조올레이트, 폴리소르베이트, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 및 소르비탄 스테아레이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물이 사용될 수 있다. 그 중에서도, 특히 포스파티딜콜린계 물질이 바람직하다.
상기 친유성 물질의 함량은 앞서 정의한 바와 같이 고체상 미세입자의 중량을 기준으로 0.1 내지 10 중량%이며, 함량이 너무 적으면 첨가에 따른 효과를 발휘하기 어렵고, 반대로 너무 많으면 동결건조 후 고체입자가 형성되지 않을 수 있다. 바람직한 함량은 0.1 내지 5 중량%이다.
SEC1 변이 단백질, 단백질 안정화 부형제, 탄수화물계 보조 부형제 및 친유성 물질을 포함하고 있는 고체상 미세입자를 주사용 제형으로서 분산시킬 수 있는 매체(분산 매체)들 중의 하나로서 상기 생체적합성 오일은, 다음의 것으로 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 식용유, 미네랄, 오일, 스쿠알렌, 스쿠알란 및 모노-, 디- 및 트리 글리세라이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 식용유의 예로는 대두유, 옥배유, 올리브유, 홍화유, 면실유, 땅콩유, 호마유, 해바라기유 등이 있으며, 특히 대두유가 바람직하다.
상기 고체상 미세입자의 분산 매체로서 사용될 수 있는 또 다른 물질인 지방산 에스테르계 화합물은, 다음의 것으로 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 모노글리세리드, 디글리세리드, 이소프로필팔미테이트, 이소프로필미리스테이트, 트리글리세리드, 안식향산벤젠, 에틸리놀레이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물이 사용될 수 있다. 그 중에서도 특히 이소프로필미리스테이트가 바람직하다.
상기 생체적합성 오일과 지방산 에스테르계 화합물은 단독으로 사용될 수도 있고 함께 사용될 수도 있다. 분산 매체로서 이들의 혼합 사용은 주사능의 개선 및 분산 효과의 극대화라는 측면에서 더욱 바람직하며, 이러한 사실은 이후에 설명하는 실험예 3의 결과로부터도 확인할 수 있다. 특히, 생체적합성 오일 중 대두유와 지방산 에스테르계 화합물 중 이소프로필미리스테이트를 혼합하여 사용하는 경우에는 제형의 주사능이 더욱 우수하다.
혼합 사용의 경우, 예를 들어, 분산 매체 전체 중량을 기준으로 생체적합성 오일을 1 내지 99 중량%로 구성할 수 있다. 상기와 같은 혼합 사용시, 지방산 에스테르계 화합물로서 이소프로필미리스테이트을 사용하는 경우, 특히 바람직한 이소프로필미리스테이트의 함량은 20 내지 40 중량%이다.
상기 분산 매체에 대한 미세입자의 첨가량은 적정한 1 회 주사량, 분산액의 주사능 등을 고려하여, 전체 부피를 기준으로 1 내지 99%가 바람직하다. 경우에 따라서는, 상기 분산액을 식염수 등에 재차 분산시킨 제형도 가능하다.
본 발명에 따른 제형에는 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 당업계에 공지되어 있는 기타의 성분들이 첨가될 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 또한 상기 SEC1 변이 단백질 제형을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 제형의 제조방법은,
(a) SEC1 변이 단백질, 단백질 안정화 부형제, 탄수화물계 보조 부형제, 및 친유성 물질을 혼합하는 단계;
(b) 상기에서 얻어진 혼합물을 동결건조하여 고체상 미세입자를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 고체상 미세입자를 생체적합성 오일 및/또는 지방산 에스테르계 화합물에 분산시키는 단계;
를 포함하는 것으로 구성되어 있다.
상기 단계(b)에서, 고체상 미세입자는 대략 5 내지 200 ㎛의 입경을 가지도록 제작된다. 입경이 너무 작으면 응집되어 분산을 이루기 어렵고 활성성분의 서방성이 떨어지며, 반대로 입경이 너무 크면 입자들이 분산 매체에서 침전되어 분산 상태를 유지하기가 어려우므로 바람직하지 않다.
상기 미세입자의 제조를 위한 동결건조법은 당업계에 공지되어 있으므로, 그에 대한 자세한 설명은 본 명세서에서 생략한다.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 예시일 뿐이므로, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 및 비교예: SEC1 변이 단백질 제형의 제조
하기 표 2에서와 같은 조성으로 SEC1 변이 단백질 제형들을 제조하였다. 예를 들어, 실시예 1의 경우, SEC1 변이 단백질, 염화나트륨, 카르복시메틸셀룰로스 및 포스파티딜콜린을 혼합한 후 이를 동결건조하여 평균 입경 약 50 ~ 80 ㎛의 고체상 미세입자를 제조하고, 이를 대두유에 분산시켜 소망하는 제형을 제조하였다.
Figure 112005065899039-pat00002
Figure 112005065899039-pat00003
실험예 1: 주사용 SEC1 변이 단백질을 포함한 제형의 안정성 실험
실시예 1 ~ 3 및 비교예 1 ~ 3의 제형들이 주사용 제형으로서 사용될 때, 제형 중의 SEC1 변이 단백질이 체내에서 활성을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 마우스를 이용하여 실험하였다. 구체적으로는 제형을 대두유에 첨가하여 SEC1 변이 단백질의 농도가 40 ㎍이 되도록 희석하고 각각 4 주령 수컷 Balb/c 마우스에 복강 주사한 후 0, 2, 4, 8, 16 및 24 일 후에 마우스로부터 혈액을 채취하였다. 이 혈액으로부터 마우스 사이토카인 ELISA kit을 사용하여 γ-IFN을 측정하였다. 측정된 결과를 도 1에 개시하였다.
도 1에서와 같이 γ-IFN 수치는 제형의 투여 후 24 일까지 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 2의 순으로 원제 40 ㎍을 투여한 경우보다 월등히 높았고 우수한 지속성을 나타내었다. 반면에, 비교예 1의 경우, 투여 8 일까지 γ-IFN 수치의 우수한 증가를 보였지만, 8 일 이후 감소하는 경향을 나타내었다. 실시예 1과 비교예 1의 결과를 비교하면, 탄수화물계 보조 부형제인 카르복시메틸셀룰로스가 생체내에서 SEC1 변이 단백질의 면역효과를 극대화시킴을 알 수 있다. 또한, 실시예 1의 결과를 비교예 2와 비교예 3의 결과와 비교해 볼 때, 비교예 2와 3의 제형은 투여 8 일까지 증가한 후 급격히 감소하였는데, 이는 SEC1 변이 단백질의 안정성에 있어서 본 발명의 조성들이 필수적임을 의미한다.
실험예 2: 주사용 SEC1 변이 단백질을 포함한 제형의 주사능 실험
본 발명의 SEC1 변이 단백질을 포함하고 있는 고체상 미세입자가 비수성 용액, 또는 비수성 용액과 수용액의 혼합액에 균일하게 분산되는지 여부를 정량적으로 평가하기 위하여, 각각의 제형(분산액)들을 주사기로 주사할 때의 힘(주사능)을 측정하였다. 구체적으로, 각각의 분산액을 3 ㎖ 씩 충진한 주사기(주사 바늘: 18 게이지(gauge))를 80 ㎜/분의 일정 속도로 밀었을 때 압출에 필요한 힘(주사능)을 보관 후 0 및 28 일째에 각각 측정하였다. 비교를 위하여, 대조군으로서 대두유를 사용하였고, 실시예 1의 성분 중에서 포스파티딜콜린 만을 제외시킨 제형을 제조하여 비교예 4로서 사용하였다. 이들 분산액의 주사능을 하기 표 3에 나타낸다.
Figure 112005065899039-pat00004
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 제형 보관 후 28 일째의 분산액 중, 실시예 1, 2 및 3과 비교예 1의 분산액은 분산성이 우수하여 대조군으로서의 대두유와 마찬가지로 주사하기에 용이하였다. 반면에, 비교예 2 및 3의 분산액은 주사에 어려움이 있거나 주사가 되지 않음을 알 수 있다. 특히, 본 발명에서의 친유성 물질이 포함되어 있지 않은 분산액(비교예 4)은 주사가 되지 않음을 알 수 있다.
실험예 3: 주사용 SEC1 변이 단백질을 포함한 제형의 주사능 실험
시험 조건은 상기 실험예 2와 동일하며 보관 후 0 및 24 주 후에 각각 측정하였다. 비교를 위하여 실시예 1과 대두유와 이소프로필미리스테이트를 혼합한 실시예 4, 5, 6을 사용하여 이들 분산액의 주사능을 하기 표 4에 나타낸다.
Figure 112005065899039-pat00005
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 제형 보관 후 24 주째의 분산액 중, 실시예 4, 5, 6의 분산액은 실시예 1의 주사능과 분산성을 현저하게 개선한 효과를 나타냄을 알 수 있다. 이상의 결과를 바탕으로 생체적합성 오일(특히, 대두유)을 지방산 에스테르계 화합물과 혼합하였을 경우 주사능이 더욱 향상됨을 알 수 있다. 특히, 이소프로필미리스테이트인 경우 분산 매체 전체 중량을 기준으로 20 내지 40% 중량%로 사용될 때 더욱 바람직하다고 할 수 있다.
실험예 4: 염화나트륨 첨가 농도에 따른 주사용 SEC1 변이 단백질의 안정성 실험
하기 표 5에는 SEC1 변이 단백질과 이들 부형제의 혼합물을 동결건조시켰을 때 고체상 입자를 오일에 분산시킨 제형을 실온조건(25℃, 60% RH)과 가혹조건(40℃, 75% RH)에서 24 주 동안 보관하였을 때의 단백질 함량이 기재되어 있다. 또한, 염화나트륨의 함량에 따른 단백질 함량의 변화를 비교하기 위하여, 실시예 7 ~ 10의 단백질 함량 결과가 함께 기재되어 있다.
Figure 112005065899039-pat00006
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 제형은 실온조건과 가혹조건에서 24 주 동안 함량변화 없이 안정된 결과를 나타내었고, 실시예 7 ~ 10의 제형은 단백질의 함량이 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 SEC1 변이 단백질의 고체상 입자를 구성하는 염화나트륨의 함량이 단백질의 안정성에 영향을 줌을 보여 준다. 따라서, 단백질 안정화 부형제로서 염화나트륨을 사용하는 경우, 그것의 특히 바람직한 함량은 60 중량% 이하임을 알 수 있다. 그러나, 상기 실험 결과는, 실시예 7 ~ 10의 제형을 포함하는 본 발명의 제형이 가혹조건(40℃, 75% RH)에서 장기간(24 주간)의 보관 시에도 전반적으로 SEC1 변이 단백질의 우수한 안정성을 보장함을 확인시켜 준다.
실험예 5: 주사용 SEC1 변이 단백질을 포함한 제형의 항체 생성능 실험
실험예 1의 결과를 바탕으로 실시예 1의 제형의 동물 복강 투여시의 생물학적 활성을 조사하기 위하여, 실시예 1의 제형 0.3 ㎖ (400 ㎍)를 대두유에 10 배 희석하여 0.3 ㎖ (40 ㎍) 및 100 배 희석하여 제조된 0.03 ㎖ (4 ㎍)을 마우스의 복강에 2 주 간격으로 3 차례 면역투여 실시하였다. 1, 2 및 3 차 투여시마다 14 일 후에 마우스(10 마리/차)로부터 혈액을 채취하고 혈청을 분리하여, 염소 유래 항 마우스 IgG와 결합된 peroxidase (ICN. #55550)를 사용하여, SEC1 변이 단백질에 대한 특이적인 항체의 역가를 분석하였다. 그 결과가 하기 표 6에 개시되어 있다.
Figure 112005065899039-pat00007
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 제형은 마우스의 생체 내에서 SEC1 변이 단백질의 함량에 대하여 우수한 항체 생성능력을 나타냄을 알 수 있다.
실험예 6: 주사용 SEC1 변이 단백질을 포함한 제형의 체세포수 감소 효과 실험
젖소의 면역 증강 효과를 검증하기 위한 대상동물의 체세포 실험으로서, 실시예 1의 제형을 체세포수 50만/㎖ 이상인 비유기 젖소 295 마리를 대상으로 근육 주사하여 젖소의 우유를 제형의 투여 후 2 주, 4 주, 6 주 및 10 주까지 5 회 수집하여 우유내의 체세포수의 변화를 측정하였다. 그 결과가 도 2에 개시되어 있다.
도 2에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 제형은 투여 4 주 후부터 10 주까지 지속적으로 우유내의 체세포수 감소 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실험예 7: 주사용 SEC1 변이 단백질을 포함한 제형의 체세포수 감소 효과 비교 실험
대상동물의 체세포 실험은 실시예 1의 제형의 젖소의 면역 증강 효과를 비교 검증하기 위하여, 베링거 인겔하임 사의 젖소 황색 포도상 구균 유방염 백신인 라백 스타프(상표명)를 비교예로 하여, 체세포수 50 만개/㎖ 이상인 비유기 젖소 295 마리를 대상으로, 실시예 1의 제형을 젖소 278 마리, 비교예의 제형을 젖소 17 마리에 각각 근육 주사한 후 젖소의 우유를 수집하여 우유내의 체세포수를 측정하였다. 그 결과가 도 3에 개시되어 있다.
도 3에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 제형은 비교예의 라백 스타프와 비교하여 우유내의 체세포 감소율에 있어서 더 우수한 결과를 나타내었다.
실험예 8: 동결건조 방식과 분무건조 방식에 의한 SEC1 변이 단백질 미세입자의 생산율 비교 실험
SEC1 변이 단백질의 안정성이 유지되면서 입자형성이 되는 가장 이상적인 건조온도(Eutectic point) 조건을 갖는 동결건조 방식과, 한국특허 제359,252호에 기재된 분무건조 방식에 의해, 각각 SEC1 변이 단백질의 미세입자를 제조하였다. 실험 조건과 그것의 결과가 하기 표 5에 개시되어 있다.
Figure 112005065899039-pat00008
상기 표 7에서 보는 바와 같이, 분무건조 방식에 의한 생산율이 약 11%임에 반하여, 본 발명에 따른 동결건조 방식에 의한 생산율(yield %)은 약 99%로서 매우 큰 차이를 나타냄을 알 수 있다. 즉, SEC1 변이 단백질의 경우, 동결건조 방식에 의한 제조방법만이 대량생산을 위한 상용화에 적합함을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 SEC1 변이 단백질 함유 제형은 단백질 안정화 부형제, 탄수화물 보조 부형제, 친유성 물질 및 분산 매체를 포함함으로써 수용성 변이 단백질의 활성을 유지하면서 체내에 효과적으로 전달하고, 우수한 항체 형성능으로 인해 젖소에 투여시 면역효과 증대를 통해 유방염 예방 및 치료에 대해 우수한 효과를 가지며, 주사능 측면에서도 우수하여 주사제로 사용될 수 있다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims (16)

  1. 활성성분으로서 황색 포도상 구균의 독소들 중의 하나인 SEC1(Staphylococcal enterotoxin C1) 변이 단백질 0.001 내지 50 중량%; 염화나트륨, 폴리에틸렌글리콜, 이당류, 포도당, 테트라메틸글루코오즈, 및 플루로닉(삼중블록 공중합체)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 단백질 안정화 부형제 0.1 내지 90 중량%; 소디움카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 하이드로필셀룰로스, 키토산, 알지이트, 크실로즈, 갈락토즈, 프럭토즈, 사카로즈, 덱스트란, 및 콘드로이친 셀페이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 탄수화물계 보조 부형제 0.1 내지 90 중량%; 및 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 레시틴, 포스파티딜콜린계 물질, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 소르비탄 모조올레이트, 폴리소르베이트, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 및 소르비탄 스테아레이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 친유성 물질 0.1 내지 10 중량%;를 포함하고 있고, 동결건조하여 제조된 고체상 미세입자가 생체적합성 오일 및/또는 지방산 에스테르계 화합물에 분산되어 있는 것으로 구성된 SEC1 변이 단백질 제형.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 생체적합성 오일은 대두유, 면실유, 올리브유, 참기름, 옥수수유, 땅콩유, 팜유, 미네랄, 스쿠알렌, 스쿠알란 및 모노-, 디- 및 트리 글리세라이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 지방산 에스테르계 화합물은 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 이소프로필팔미테이트, 이소프로필미리스테이트, 안식향산벤젠 및 에틸리놀레이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 고체상 미세입자는 생체적합성 오일과 지방산 에스테르계 화합물의 혼합물에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 안정화 부형제는 염화나트륨 및/또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 탄수화물계 보조 부형제는 카르복시메틸셀룰로스인 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 친유성 물질은 0.1 내지 10 중량%인 포스파티딜콜린계 물질인 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 단백질 안정화 부형제인 염화나트륨 및/또는 폴리에틸렌글리콜의 함량은 고체상 미세입자의 중량을 기준으로 30 내지 60 중량%인 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  12. 제 5 항에 있어서, 상기 생체적합성 오일은 대두유인 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 지방산 에스테르계 화합물은 이소프로필미리스테이트인 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 고체상 미세입자는 평균 5 내지 200 ㎛의 입경을 가 지는 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 이소프로필미리스테이트의 함량은 분산 매체 전체 중량을 기준으로 20 내지 40% 중량%인 것을 특징으로 하는 SEC1 변이 단백질 제형.
  16. 하기 단계를 포함하는 것으로 구성된 제 1 항에 따른 SEC1 변이 단백질 제형의 제조방법:
    (a) SEC1 변이 단백질, 단백질 안정화 부형제, 탄수화물계 보조 부형제, 및 친유성 물질을 혼합하는 단계;
    (b) 상기에서 얻어진 혼합물을 동결건조하여 고체상 미세입자를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 고체상 미세입자를 생체적합성 오일 및/또는 지방산 에스테르계 화합물에 분산시키는 단계.
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