TW201812296A - 用於複用的旋轉成像生物測定的裝置和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了通用複用自轉/旋轉生物測定的系統和方法。該生物測定平臺可以利用高速自轉運動，其自然地以常規相機或雷射掃描技術無法達到的速率而以超快速成像模式提供即時細胞成像。更重要的是在本發明的實施例中，源自盤狀基底的功能化固體基底可以與黏附細胞培養及生物化學特異性細胞捕獲相容，其現在可以用超快速成像模式以>10MHz的超高速線掃描率測定。因此，大幅面自轉高通量成像測定可以成為用於在例如藥物發現和稀少的癌細胞篩選之類的許多應用中所要求的擴增測定通量以及含量/通用性這兩者的有效工具。

Description

用於複用的旋轉成像生物測定的裝置和方法
本發明涉及加速生物測定和增加採集的信息量的裝置和方法。
目前的生物測定技術通常可以根據目標標本的類型分為三類：(1)生物分子(親和力)測定(例如DNA/蛋白質微陣列，ELISA/EIA)，(2)基於細胞的測定(例如流式細胞術，成像細胞計數法)和(3)基於組織的測定(例如組織微陣列(TMA)和整體切片成像(WSI))。典型的測定策略包括：(a)懸浮液測定和(b)固體基底測定。這些技術通常在測量通量(即效率)和測量含量(即精度/準確度)之間具有基本的權衡。調和這種權衡的嘗試可以通過在流式細胞術中增加成像能力的新興興趣(細胞測定的黃金標準)來證明。
雖然訪問關於單個細胞的附加空間資訊，但是這些成像流式細胞儀只能實現約1000個細胞/秒的成像通量，比 非成像流式細胞儀(100,000個細胞/秒)慢許多數量級。與其中生物標本懸浮在流體中的流式細胞術相反，成像細胞計數法是對隔離的單細胞或大塊組織基體執行高含量測量的另一種廣泛的方法，其中標本大多附著在固體基底上。成像細胞計數法能夠即時提供高含量的定量高解析度圖像分析(諸如用於細胞週期研究的時移測量、藥物篩選實驗等)。然而，測量通量限於少量細胞(每單拍視場為100-1000個細胞)。通過機械掃描整個標本可以實現測量(成像)面積的擴大。這不僅是在成像細胞計數法中而且也是在WSI和TMA中採用的常見策略，WSI和TMA是數位病理學和藥物篩選的新興技術。製藥行業的高通量篩選已經擴展到TMA(來自單個組織塊的大於1000多個核)，其可以用於廣泛的技術，包括組織化學、免疫組織化學和免疫螢光染色，或者用於DNA或mRNA的原位雜交。
WSI和TMA技術與基於組織的測定相關。此類測定在常規病理診斷中迅速獲得普及，因為它們能夠進行自動化的組織切片掃描和數位化，減輕臨床實驗室和醫院中大量組織切片的手工檢查的巨大負擔。然而，此類技術的通量受到樣本級的通用光柵掃描速度的限制，這也與所使用的相機技術的最高可實現畫面播放速率緊密相關。為了保持高達約1μm地圖像空間解析度，WSI或TMA中的典型掃描處於在大於1分鐘的時間內二維(2D)面積<10mm2的數量級。同樣，這是目前測定技術中存在的通量對比含量權衡的一個明顯示例。當成像的組織為三維(3D)形式時，例 如，通過組織清除技術製備的3D組織塊/支架或3D組織，因為需要額外的軸向圖像掃描，通量進一步降低。
此外，絕大多數目前的生物測定技術依賴於使用分子特異性生物標誌物/對比劑來增強測量特異性和準確性。示例是用於流式細胞術和圖像細胞計數法的免疫螢光標記；以及用於腫瘤的組織病理學檢查的免疫組織化學染色(例如蘇木紫和曙紅(H & E)染色)。這些分子特異性生物標誌物/對比劑一直是生命科學研究和生物醫學診斷的主力。它們已被證明是揭示生物組織、細胞、細菌和病毒的形態和功能(基因型和表型)的有用工具，具有極高的化學特異性。儘管被廣泛採用，鑒於通過螢光的細胞毒性和光漂白引入的併發症，這些分子特異性對比劑並不總是理想的，更不用說與染色和標記相關聯的費力和昂貴的樣本製備過程。
相比之下，例如生物標本的光學(例如光散射率、折射率)、物理(例如尺寸、形態)和機械(例如品質密度、剛度或變形能力、細胞牽引力和黏附力)性質的內源(內在)參數現在已被認為是表型資訊的新維度，這在生物測定中對於備受讚譽的分子特異性資訊的補充有價值。然而，這些內在參數長期以來特別是在高通量生物測定的背景下一直沒有應用。因此，如果能夠將這些內在參數與黃金標準分子生物標誌物一起揭示，那麼它將成為一種變革性的生物測定技術，為高通量和高含量的生物醫學分析創造新的資訊/資料空間。
存在一類廣泛命名為“離心微流體”的微流體技術，其中在自轉/旋轉期間利用離心推進機構用於主動流體控制，從而用於片上樣本處理，例如，流體採樣、混合和閥門調節、以及與外部泵對接。例如，離心微流體在親和力免疫測定中增強了與抗體塗覆表面的抗原結合(親和力)。離心力也促進細胞分離和分選，這已經在迴圈腫瘤細胞篩選中得到應用。離心微流體技術已被商業化以用於包括血液參數分析、免疫測定和核酸分析的應用。然而，由於缺乏高速相機/雷射掃描技術，現有技術缺乏在旋轉/自轉操作期間提供超快速高解析度成像以用於即時高通量監測的能力。它們還缺乏提取生物標本的生物物理和生物化學特徵的組合以用於高含量分析的能力，特別是在基於細胞和基於組織的測定的背景下(因為它們壓倒性地依賴於慢螢光成像，這有助於僅提取生物化學資訊)。
為了克服傳統成像方法中存在的技術和基本限制，以及實現高通量和高解析度成像生物測定的能力的阻礙，基於類似於全光學雷射掃描成像概念的兩種新技術已被開發。一種被稱為“時間拉伸成像”。這種技術通過在空間和時間域中使用光的色散性質而建立在時間上拉伸的寬頻脈衝上。該技術以每秒1-100百萬幀的超高速畫面播放速率實現連續的圖像採集。參見Lei等人，“Optical time-stretch imaging：Principles and applications(光學時間拉伸成像：原理及應用)”，Appl.Phys.，Rev.3，011102(2016)；http：//dx.doi.org/10.1063/1.4941050，其全部 內容通過引用併入本文。另一種技術被稱為“自由空間角啁啾增強延遲(FACED)成像”，其基於使用具有高反射率(>99%)的一對準平行平面鏡將雷射脈衝束變換為用於雷射掃描的時空編碼子束陣列。FACED不僅可以實現與時間拉伸成像相似的高達10MHz的線掃描速率，而且可以實現時間拉伸成像是不可能實現的擴展成像模式，舉幾例，如亮場彩色成像螢光成像，多光子成像。參見Jianglai Wu等人的“Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths(可見波長的超快雷射掃描時間拉伸成像)”Light：Science & Applications 6,e16196(2017)。
本發明提供了用於2D或3D形式的生物分子、微生物和細胞到組織/支架部分範圍的高通量複用旋轉/自轉多尺度生物測定的有利的系統和方法。
本發明的實施例還涉及用於在超快速旋轉運動中執行高通量和高含量2D和3D成像生物測定的技術。本發明的許多實施例具有與通用大幅面生物測定平臺相結合的超快速、寬視場(FOV)、高解析度光學雷射掃描成像技術的特徵，其支援2D或3D形式的從生物分子、微生物和細胞中的生物標本、到整個組織切片/支架的超寬範圍的廣泛定量測量。基於全光學雷射掃描成像(例如時間拉伸或FACED成像)以超高速畫面播放速率運行，本發明的許多 實施例通過生物測定平臺或成像照射的超快速旋轉掃描運動以目前標準相機/雷射掃描技術無法實現的速度和FOV實現高通量測量(讀出)，以用於捕獲沒有運動模糊及犧牲圖像解析度的微觀圖像。通過不僅提取(例如由生物化學特異性生物標誌物輔助的)生物分子和生物化學資訊，而且還提取(特別是在高通量系統中的)其它生物測定平臺中通常缺失的定量參數的分選，來實現高含量測量(讀出)。這些包括生物標本的光學(例如光散射、折射率)、物理(例如尺寸、形態、品質、密度)和機械(例如硬度或變形能力、細胞牽引力和黏附力)性質。這是一種測定通量和含量的前所未有的組合，源於超快速運動連同超快速定量高解析度成像技術。
本發明的實施例獨特地提供大容量和高複雜度的生物醫學資料，引發了醫學科學研究和臨床診斷中的範式轉變，這是從基於假設到資料驅動的生物醫學的目前轉變。此類轉變的基本原理在於大規模資料不僅能夠做出更明智的決策，而且還會導致發現新的見解。例如，疾病的生物學和分子發病機理中的一個巨大挑戰是在巨大和異質的群體內識別稀少的幹細胞/祖細胞。它們的特性識別(從細胞水準到分子水準)的知識是必不可少的，但在再生醫學中是有限的。此外，各應用還可以擴展到在不同分化階段檢測細胞的臨床環境，或者可以在早期疾病過程期間特別是對於稀少的癌細胞篩選來量化稀少的異常細胞。另一個示例是藥物開發過程，其中迫切需要高度複用的成像生物 測定(涉及基於細胞或基於組織的測定)，以用於針對數十至數十萬種化合物的高通量表型藥物篩選。因此，迫切需要一種變革性技術，可以為異質群體內的多個個體細胞和組織收集(形態學、表型和分子的)高含量資料，以便對其進行高速、詳細地分析。
與常規生物測定技術相比，本發明的實施例涉及基於與高速旋轉測定基底或旋轉照射集成的超快速雷射掃描成像的高通量複用生物測定平臺。此外，本發明的成像測定平臺中實現的速度和FOV不能通過任何現有相機和雷射掃描/樣本掃描技術來實現，並且僅可能通過本發明實現。在本發明的許多實施例中，在高速基底/照射旋轉期間的單向軸向掃描允許即時地進行3D成像。此外，根據期望的應用，可以靈活地設計成像FOV的數量以及甚至跨整個平臺上的各個FOV的形狀，而不會影響成像速度和通量。再次注意，本發明顯示了與生物化學特異性分子結合測定、細胞捕獲測定、細胞培養測定和組織切片/支架測定相容的通用生物測定平臺。本發明的實施例提供了能夠同時提取生物物理學(光學、機械性質)和生物化學性質的高含量定量成像測定，其還能夠與主動離心微流體技術集成以用於採樣測定平臺上的全自動樣本處理、成像和分析。
用於實現本發明的裝置利用來自單個或多個脈衝雷射器或強度調製連續波(CW)雷射器的雷射脈衝。可以實現兩種不同成像模式中的任何一種，即，(1)涉及圖像的頻譜編碼的時間拉伸成像，或(2)不涉及頻譜編碼的 FACED成像。這些脈衝首先在介質(例如用於時間拉伸成像的色散光纖或用於FACED成像的准平行鏡對)內拉伸以形成時間波形，然後由分束器將其引導到成像系統。在時間拉伸成像中，全息衍射光柵連同中繼透鏡和物鏡被用來將波長掃描光束轉換成一維頻譜編碼的線掃描光束，其被投影到改進的自轉盤狀基底上。在FACED成像中，線掃描光束直接投影到自轉盤狀基底上。與盤狀基底上的標本接觸會導致光束被用樣本或標本的圖像編碼。通過在後物鏡的入射光瞳處放置反射鏡，沿著相同的路徑返回用樣本圖像編碼的線掃描光束，從而形成雙通道配置。當被重新組合成高斯光束輪廓時，被圖像編碼的光束最終由高速光接收器檢測並由高速即時數位化儀和電子信號處理器記錄。值得注意的是，圖像編碼的線掃描光束也可以通過後物鏡之後的透鏡系統重新耦合，其如雙通道配置中那樣形成高斯光束輪廓。重組的圖像編碼光束還可以最終由高速光檢測器檢測。這種單通傳輸配置與FACED成像特別相關，這是因為其在光耦合和光投射方面的簡單性而無需如在時間拉伸成像中那樣使用衍射光柵。
本發明中使用的改進的自轉盤(例如DVD)測定平臺可以具有四個測定孔/位點，儘管它們可以是任何整數。標本的樣本位於每個位元點中。在本發明的多個實施例中，包含測定網站的基底由兩層透明層組成(例如從兩個單獨的DVD獲得的聚碳酸酯層)，它們用UV固化的黏合劑結合在一起。這產生了由間隔件限定的約3-1000μm的測 定室，其也被仔細對準以穩定快速自轉運動。
當結合以下詳細描述和附圖考慮時，本發明的前述和其它目的和優點將變得更加明顯，其中類似的標稱在各視圖中表示相同的元件，並且其中：
圖1是本發明的操作方法的流程圖；圖2是根據本發明的通用生物測定平臺的流程圖，其與分子、細胞和組織切片/支架相容，並且其利用改進的盤狀基底以用於特異性捕獲、細胞培養和組織安裝；圖3A示出了對於本發明有用的具有靜態線掃描的旋轉/自轉平臺的總體佈置；圖3B示出了可以與本發明一起使用的具有靜態平臺的旋轉/自轉線掃描的總體佈置；圖3C示出了根據本發明的具有與旋轉載體集成的小型化光學元件的旋轉線掃描照射的實施例的示例；圖3D示出了根據本發明的具有與旋轉載體集成的小型化的基於反射鏡的光學元件的實現旋轉線掃描照射的示例；圖4A示出了根據本發明的系統的任意視場成像能力的示例；圖4B示出使用螺旋掃描方法實現全盤成像的示例；圖4C示出了使用環形掃描方法實現全盤成像的示例；圖4D示出了根據本發明實現的具有可重新配置區域的 分段視場陣列的示例。
圖5A示出了實現3D組織結構成像的圖示，該3D組織結構成像是通過將3D組織塊安裝到旋轉盤狀基底上來達成。因此，該旋轉樣品沿著軸向通過全光學雷射掃描成像進行光學分割，然後將2D光學分割圖像數位地堆疊，拼接並重建為3D體積組織塊結構。
圖5B示出了實現3D組織結構成像的圖示，該3D組織結構成像是通過將3D組織塊安裝到靜態盤狀基底上來達成。因此，該靜態樣品沿軸向通過旋轉全光學雷射掃描成像進行光學分割，然後將2D光學分割圖像數位地堆疊，拼接並重構成3D體積組織塊結構。
圖5C示出了實現3D組織結構成像的圖示，該3D組織結構成像通過將3D組織塊分割成多個組織切片來達成。然後將組織切片安裝在自轉盤狀基底上，由此通過全光學雷射掃描成像進行成像，然後將2D組織圖像數位地堆疊，拼接並重構成3D體積組織塊結構。
圖5D示出了實現3D組織結構成像的圖示，該3D組織結構成像是通過將3D組織塊分割成多個組織切片來達成。然後將組織切片安裝到靜態盤狀基底上，由此通過旋轉的全光學雷射掃描成像進行成像，然後將2D組織圖像數位地堆疊，拼接並重構成3D體積組織塊結構。
圖6A示出了基於時間拉伸雷射掃描成像的本發明的基於DVD成像細胞的測定系統的示意圖；圖6B示出了本發明的由用UV固化的黏合劑結合在一 起的由從兩個DVD獲得的兩個聚碳酸酯層組成的基底的示意圖；圖6C示出了根據本發明的圖像拼接演算法；圖6D示出了本發明的基底的示意圖，該基底由從DVD獲得的一個聚碳酸酯層和具有組織切片的玻璃基板組合，聚碳酸酯層和玻璃基板用氟凝膠結合在一起。
圖7A示出了在盤上培養的420μm×34mm MCF-7拼接圖像(以900rpm(線速度約4m/s)成像))；圖7B示出了圖7A中用虛線所示的區域的放大圖；圖7C示出了圖7B中MCF-7拼接圖像的圖7B中用虛線所示的上部區域的放大圖；圖7D示出了圖7B中MCF-7拼接圖像的圖7B中用虛線所示的中間區域的放大圖；圖7E示出了圖7B中MCF-7拼接圖像的圖7B中用虛線所示的底部區域的放大截面圖；圖7F示出了由商用光學顯微鏡拍攝的圖7C中MCF-7的相同區域的相位對比靜態圖像；圖7G示出了由商用光學顯微鏡拍攝的圖7D中MCF-7的相同區域的相位對比靜態圖像；圖7H示出了由商用光學顯微鏡拍攝的圖7E中MCF-7的相同區域的相位對比靜態圖像；圖8A示出了特異性捕獲的生物素化聚苯乙烯微粒的時間拉伸成像的改進的DVD測定設計；圖8B示出了在3000rpm(速度為14m/s)的自轉速度下 拍攝的在孔T(頂部)和C(底部)中的捕獲的微粒的時間拉伸圖像；圖8C示出了由普通光學顯微鏡拍攝的孔T(頂部)和C(底部)的靜態圖像；圖8D示出了根據時間拉伸圖像分析的捕獲的4657個微粒的統計尺寸分佈；圖9A示出了用於特異性捕獲的MCF-7的時間拉伸成像的改進的DVD測定設計；圖9B示出了自轉DVD(自轉速度為2400rpm，線速度為11m/s)上的目標孔中的抗體捕獲的MCF-7細胞的時間拉伸圖像；圖9C示出了圖9B中MCF-7的大區域拼接圖像的放大截面；圖9D示出了圖9B中MCF-7的大區域拼接圖像的放大截面；圖9E示出了圖9B中MCF-7的大區域拼接圖像的放大截面；圖9F示出了僅要對照的塗覆鏈酶親和素的區域中特異性捕獲的MCF-7細胞的圖像；圖9G顯示實驗中細胞捕獲的特異性分析；圖9H示出了在2分鐘自轉之後拍攝的在DVD基底上用活體染色(碘化丙啶)處理的捕獲細胞的靜態圖像(相位對比(左)和螢光(右))；圖9I示出了在32分鐘自轉之後拍攝的在DVD基底上用 活體染色(碘化丙啶)處理的捕獲細胞的靜態圖像(相位對比(左)和螢光(右))；圖10A示出了與用於抗體捕獲的人血紅棕黃層(75%)混合並因此富集MCF-7的MCF-7的標本(25%)；圖10B示出了在900rpm(線速度為4m/s)的自轉速度下拍攝的對照孔中和目標孔中的富集MCF-7(具有抗-EpCAM抗體)的時間拉伸圖像；以及圖10C示出了用綠色螢光染料進一步染色的富集MCF-7的靜態圖像(頂部：相位對比；底部：螢光)。
圖11A示出了人骨組織的拼接時間拉伸亮場圖像。
圖11B示出了人骨組織的拼接時間拉伸相位圖像。
圖11C示出了針對相位圖像拼接實現的拼接演算法。
本發明涉及用於高通量通用多尺度自轉/旋轉成像生物測定的系統和方法。更具體地，本發明體現在如圖1到圖11C所示的裝置、方法和結果中。應當理解，該裝置可以根據配置和部件的細節而變化，並且該方法不脫離本文所公開的基本概念的情況下可以在具體步驟和順序上變化。
本發明可以以具有超快自轉/旋轉運動的測定形式來體現。圖1示出了測定讀出是基於任何超快速雷射掃描成像策略(例如時間拉伸成像和FACED成像)，其可以超過傳統雷射掃描技術的速度限制(例如電流計鏡、自轉多面 鏡、聲光偏轉儀)。
用於實施本發明的一般方法包括將標本的樣本安裝在可旋轉盤狀驅動器上的第一步驟101，如圖1所示。在步驟102，發送驅動器的起始位置，並且在步驟103，設置用於盤狀驅動器的期望的自轉速率。接下來在步驟104開始對盤上的樣本進行成像，其產生串行輸出資料流程。在步驟105重構和分析該串列圖像資料以提供生物測定。
如圖2所示，該基本方法可以用特別為諸如捕獲來自特異性物件、細胞培養和組織安裝的資料之類的特定任務準備的盤或基底來實現。對於這些技術中的任何一種，第一步驟201是要創建在其上安裝樣本的基底。在應用DVD的許多個實施例中，這通過首先將DVD盤分成兩半並僅保留透明的一半來完成。在步驟202，用70%至100%的乙醇清潔該透明盤狀基底。
如果基底被用於捕獲特異性物件(標記為228)，則在步驟203將盤用鏈酶親和素塗覆。接下來，在步驟204施加生物素化二級抗體塗覆，然後在步驟205進行一級抗體塗覆。待測定對象被置於盤上的孔中，並在步驟206中培育一段時間。培育後，在步驟207將盤沖洗以減少非特異性結合。這樣可以去除不在結合位點的材料。最後(步驟208)，將基底輸送到用於成像的光學系統以便形成生物測定。
在步驟209，當用於細胞培養時，例如用70%的乙醇和紫外光對來自步驟202的清潔盤進行消毒。在步驟210， 將培養介質和細胞的混合物沉積在基底上。然後在步驟211將基底保存在培育箱中，直到所需細胞群體存在於基底上。最後，在步驟212將基底輸送到用於成像的光學系統，從而可執行生物測定。
如果希望將組織安裝在基底上(標記為230)，則在步驟213首先使組織樣本脫水。然後在步驟214，使組織達到用於將其包埋到最佳切割溫度(OCT)化合物中的最佳溫度。在步驟215，將被包埋的OCT的組織在低溫恆溫箱中冷凍至低於-20℃。而在步驟216，在低溫恆溫箱中將組織切成切片。在接下來的步驟217，將基底置於低溫恆溫箱中，並將組織切片安裝在其上。然後在步驟218，使具有冷卻組織的基底過夜達到室溫。在步驟219，沖洗具有安裝的組織的基底，並且在步驟220，將其輸送到成像的光學系統。
如果希望將組織安裝在具有較薄厚度的基底上(標記為230)，則在步驟213，首先使組織樣本脫水。然後在步驟221將組織包埋到熔融石蠟中。在步驟222，將組織連同包埋的石蠟冷卻至室溫。而在步驟223的低溫恆溫器中，在切片機中將組織切成切片。在下一步驟224，將玻璃基板帶入切片機並且將組織切片安裝在其上。然後在步驟225用二甲苯沖洗具有冷凍組織的玻璃基板。在步驟226，將具有安裝的組織的玻璃基板黏附在圖2的步驟202中提到的清潔的基底上，並且在步驟227將其輸送到成像的光學系統。
圖3A示出了在自轉平臺或基底302上的一維(1D)線掃描301照射陣列元件303。對於1D線掃描的速度要求必須超過1MHz，以便適應高速運動測定(例如自轉軌跡)。標本的2D高解析度圖像(例如組織、細胞或分子微陣列的微觀圖像)通過具有單向旋轉運動的測定樣本平臺的照射來捕獲，即，旋轉圖3A中所示的測定平臺(其由靜態線掃描312照射成像)，或者使如圖3B所示的靜態測定平臺上的線掃描照射旋轉/自轉。當如圖3B所示基底304是靜態或靜止時，來自光纖306的照射由載體305旋轉。注意，這種單向旋轉運動減輕了前後掃描或鋸齒形路徑掃描的常規策略帶來的機械不穩定性和反沖問題。旋轉/自轉照射通過但不限於以下方法(圖3C)來實現：線掃描光束可以被引導到安裝在旋轉載體305上的集成小型化光學元件(由漸變折射率(GRIN)透鏡308、小型中繼(迷你光柵)透鏡309和物鏡310組成)。這些元件安裝在外殼307中。照射由光纖306提供，光纖306借助於可旋轉接頭附接到旋轉載體305的外邊緣。接頭在載體旋轉時防止纖維扭轉。以這種方式，元件可充當將線掃描光束投射到靜態測定平臺上的作用。注意，依賴於超快速線掃描技術，線掃描光束可以通過光纖306或通過體光學器件在自由空間中被引導到元件(圖4A)。注意，在自轉期間，照射元件301,306,311也可以沿徑向致動，以便接近更寬的2D FOV。
成像生物測定系統的FOV可以任意設計。例如，它可以是覆蓋整個自轉盤401的連續FOV，或者由用戶定義的 具有不同尺寸的離散FOV陣列，或者甚至具有任意形狀402的FOV，包括但不限於如圖4A的線掃描區域。這可以通過自轉403/旋轉404照射或生物測定盤之間的相對運動來控制。對於整個盤的掃描可以採用包括但不限於如圖4B和4C所示的方案。FOV還可以是如圖4D所示具有可重構區域(具有405的標籤的藍色的段)的分段視場陣列。
值得注意的是，由於系統的旋轉速率可以從500轉到25,000轉/分鐘(rpm)靈活地調節，這意味著視頻畫面播放速率，即>10Hz的超大FOV成像(通常沿圓周方向)。再次，有效的FOV可以被設計為沿圓周方向的多個分立的區域。所有這些區域可以大規模(>cm2)同時成像，並以視頻速率進行成像。這種獨特的能力有助於對例如細胞增殖，細胞牽引的感興趣領域的即時視頻速率蜂窩動態監測。
除了對2D生物測定提供獨特的監測之外，本發明還可以以超快速率擴展到3D組織結構成像。圖5示出了如何通過本發明安裝和成像3D組織結構的圖示。與之前關於2D成像的圖示類似，這可以在自轉/靜態盤基底上進行。此外，3D組織結構可以被處理和成像以用於不同形式的樣品類型，例如，組織塊/組織切片。圖5A-5B描述了如何將3D組織塊503與軸向掃描一起光學地分割以實現3D組織成像。圖5A示出了實現3D組織結構成像的圖示，該3D組織結構成像是通過將3D組織塊503安裝到自轉盤狀基底501上來達成。因此，該旋轉樣品沿著軸向通過全光學雷射掃描 成像502進行光學分割504，然後將2D光學分割圖像505數位地堆疊，拼接並重建為3D體積組織塊結構506。圖5B示出了實現3D組織結構成像的圖示，該3D組織結構成像是通過將3D組織塊503安裝到靜態盤狀基底上來達成。因此，該靜態樣本507沿軸向通過旋轉的全光學雷射掃描成像508-509進行光學分割504，然後將2D光學分割圖像505數位地堆疊，拼接並重構成3D體積組織塊結構506。
另一方面，圖5C-5D描述了如何首先將3D組織塊機械地切片，然後將其安裝到盤狀基底上以實現3D組織成像。圖5C示出了實現3D組織結構成像的圖示，該3D組織結構成像通過將3D組織塊510分割成多個組織切片511來達成。然後將組織切片安裝在自轉盤狀基底501上，由此通過全光學雷射掃描成像502進行成像，然後將2D組織圖像512數位地堆疊，拼接並重構成3D體積組織塊結構506。圖5D示出了實現3D組織結構成像的圖示，該3D組織結構成像是通過將3D組織塊510分割成多個組織切片511來達成。然後將組織切片安裝到靜態盤狀基底501上，由此通過旋轉的全光學雷射掃描成像508-509進行成像，然後將2D組織圖像512數位地堆疊，拼接並重構成3D體積組織塊結構506。
圖6A描繪了本發明的裝置，其中來自光纖603(來自光纖鎖模雷射器601)的雷射脈衝首先在色散光纖602內被時間拉伸，從而形成波長掃描波形，然後由分束器(BS)604將其引導到成像系統。全息衍射光柵605與中繼透鏡606、607(L1和L2)和物鏡608(Obj1)一起被用於將波 長掃描光束轉換成1D光譜編碼的線掃描光束612，其被投射到改進的自轉DVD基底609上。通過在後物鏡610(Obj2)的入射光瞳處放置反射鏡611，沿著相同的路徑返回圖像編碼的線掃描光束，形成雙通道配置。當被重新組合回高斯光束輪廓時，圖像編碼光束最終被分束器引導然後由高速光接收器613(12GHz頻寬)檢測並由高速即時示波器614(16GHz頻寬、取樣速率為80GSa/s)記錄。
商業DVD的基底通常由聚碳酸酯製成，其是生物醫學應用中材料的普遍選擇，因為其生物相容性和優異的機械強度。然而，DVD上的反射塗層通常妨礙本工作採用的傳輸成像、成像配置(圖6B)。為此，在一個示例性實施例中，本發明的測定平臺設計基於從兩個單獨的DVD獲得的雙層聚碳酸酯基底。具體地說，每個DVD被分成兩半，每個具有相同的盤形，但是減小了厚度，從而可以去除原來夾入的反射層。只有DVD盤的透明半部(約0.6毫米)被用於進一步的表面功能化。
圖6B示出了在本發明的一個實施例中採用的改進的DVD測定平臺615的設計示意圖(這裡描繪了四個測定孔/位點616-619，其可以是整數數量)。參考圖6B中的截面圖626，上層透明聚碳酸酯620通過間隔件624、625與下層621分離。基底的各盤通過UV固化膠或黏合劑622保持在一起。因此，在細胞培養或特異性細胞捕獲過程之後，UV固化的黏合劑沉積在細胞標本位置623的周圍，使得被測細胞在固化之前不與UV固化的黏合劑622接觸。間隔件 624、625由任何固體材料(例如但不限於玻璃)製成，並且具有3-1000μm的高度。它們被小心地定位在基底621上的各個位置(如圖6B所示)，使得重量均勻地分佈在基底上，以確保穩定的自轉操作。
基底620與基底621相同，但是沒有被功能化。如所指示的那樣，它用間隔件堆疊並膠合在功能化基底621的頂部上。進一步按壓頂部基底620，以確保與所有間隔件624、625的完全接觸。此時，雙層盤626厚度約為1.3mm，並且包含N個預定的測定隔室(圖6B中示出四個)。將雙層盤元件暴露於空間受限的UV光(Thorlabs CS2010)中至少30秒以進一步固化。空間受限的UV照射避免UV暴露，從而避免隔室內細胞標本的光毒性。
由於電氣抖動，圖像不是水準或垂直地以精確的空間位置拍攝。如圖6C所示，在本發明的一般圖像拼接中，在拼接整個圖像之前，從2個圖像中獲取少部分圖像用於互相關。歸一化互相關允許無限拼接反覆運算和更快的模式識別，因為較少的圖元用於相關計算。通過在大規模圖像拼接之前的在各個空間位置執行成像，可以對大型的任意FOV進行成像。
圖6D顯示針對組織切片黏附的基底設計。僅使用單層聚碳酸酯基板(620/621)。在用例如氟橡膠的安裝介質636密封之前，將組織切片黏附在玻璃蓋片637上。多個組織切片(631-634)可以黏附到相同的玻璃蓋片上，使得可以在聚碳酸酯基底上處理數十個組織切片。對於用於組 織成像的基底，僅通過圖2中的步驟201-202處理襯底620/621。
本發明可用於細胞培養實驗。在這種情況下，用70%的乙醇和紫外(UV)光清潔並消毒聚碳酸酯基底。參見圖2中的步驟209-212。
可以使用本發明對人乳腺癌細胞系(MCF-7)執行一種類型的細胞培養實驗。在這種情況下，將細胞系在與90%的最小必需培養介質(MEM)、10%的胎牛血清(FBS)和1%青黴素-鏈黴素(Pen Strep)配製的標準細胞培養介質混合之前從培養皿中胰蛋白酶化並使其離心。將這種類型的細胞在CO2培育箱中培養，並且每週將介質更新2-3次。參見圖2中的步驟209-212。
使用該細胞培養物的測試結果示於圖7中。對於這些測試，將約30,000個MCF-7細胞與300μL標準細胞培養介質混合，然後裝載在半盤狀基底上的預定區域上。該混合物通過疏水性聚碳酸酯表面上的表面張力在空間上限制在該區域內。然後將該基底在與另一種非功能化聚碳酸酯半盤黏合之前培育兩天。
作為本發明的概念驗證實驗，線上掃描區域內以900rpm的自轉速度(其相當於線速度4m/s)在改進的DVD上執行這些MCF-7黏附細胞的時間拉伸成像。系統不但以11MHz的線掃描速率捕獲了大型FOV(大至34mm×420μm(圖7A))，而且還提供了高解析度的細胞成像，其顯示了沒有運動模糊的亞細胞結構。圖7B是圖7A中的附圖標 記701指示的區域的放大圖。圖7C、7D和7E分別表示由附圖標記702、703和704指示的區域的進一步放大。圖7中的附圖標記705指示的線表示50μm。
注意，通過使用干涉測量進行相位對比或通過非對稱檢測技術進行相位梯度對比，可以進一步增強圖像對比度。值得注意的是，兩種成像方案可以進一步量化細胞的相位資訊，從中可以提取一組生物物理表型，例如細胞尺寸、品質和密度。
已經發現，本發明採用的自轉速度方案可以確保在超快速自轉作用下黏附細胞的形態沒有可觀察到的變化。這可以通過使用10倍物鏡(Nikon Eclipse Ni-U)的常規光學顯微鏡拍攝的相同區域的靜態圖像來驗證。在靜態圖像中視覺化的細胞形態和時間拉伸自轉圖像總體上彼此一致(圖7F、7G、7H)。圖7C、7D、7E中的每個圖中的箭頭指示了圖7F、7G、7H的時間拉伸圖像和光學顯微鏡圖像這兩者中識別的關鍵細胞特徵。在當前系統中，時間拉伸圖像的FOV受到示波器提供的有限存儲深度的限制。當與高通量資料獲取平臺(例如，圖形處理單元(GPU)或現場可程式設計閘陣列(FPGA))集成時，即時全盤成像是可行的。
對於化學特異性微粒捕獲的測試，可以使用生物素化聚苯乙烯微球(Spherotech，7.79μm)。然後將20μL儲存的微球溶液在盤的所有預定捕獲(目標)孔上培育30分鐘(參見圖8A中所示的盤示意圖)。將所有孔用1×磷酸鹽緩 衝溶液(PBS)洗滌5次以防止非特異性微球捕獲。用反滲透(RO)水一次性輕輕洗滌位點5秒鐘可防止PBS乾燥後結晶。
化學特異性細胞/微粒捕獲實驗的結果顯示在圖8A-10C中。如圖8A所示，分別在N個(圖8A中的實施例中示出為4個)預定區域用鏈酶親和素塗覆進一步處理基底801，其稍後形成測定孔802-805。二級生物素化抗體可以在這些區域803、805中培育以便進一步的特異性捕獲。參見圖2的步驟203-208。圖8A中的DVD上的曲線指示記錄區域。
四個位點/孔對稱地分佈在盤狀基底801上。其中的兩個803、805塗覆有用於生物素化-微球結合的鏈酶親和素並被標記為T，而另外兩個孔802、804沒有塗覆鏈酶親和素，並被定義為標記為C的對照孔(圖8A)。為了成像演示和簡化，本實驗使用單層基底設計和反射成像。這通過去除後物鏡610和反射鏡611來實現，使得僅採集反射和反向散射的光。選擇這種佈置是因為與生物細胞相反，聚苯乙烯微球產生足夠高的反向散射光對比度，並且可以在成像期間暴露於空氣中，而不會對微球帶來任何不利影響。在用於時間拉伸成像的高速自轉之前，基底801在乾燥器內乾燥。將具有0.384mm×140mm的大型FOV的拼接圖像轉換成具有180°的弧的彎曲圖像(參見圖8A中所示的盤上重疊圖像的示意圖)。與在對照位元點拍攝的圖像相比，特異性捕獲的微球(4657個微球)在3000rpm的高旋轉速度 下或約14m/s的線速度下被清晰地視覺化(圖8B頂部)，即觀察不到微球(圖8B底部)。注意，自轉基底的時間拉伸圖像與由普通光學顯微鏡捕獲的相同區域的靜態圖像(圖8C)高度一致。用附圖標記806指示的所有比例尺表示50μm。為了進一步舉例說明從該高通量成像技術得到的定量分析的能力，將個體微球在圖像中數位分割並量化。尺寸的統計分佈(圖8D)是高斯曲線。測量的平均直徑，即7.85μm(0.68μm的標準差)，與供應商提供的規格一致。
對於化學特異性細胞捕獲的測試，其結果示於圖9中，四個或八個目標孔被限定在單層聚碳酸酯基底上，並用鏈酶親和素塗覆(遵循BioteZ Polystreptavidin R Coating Kit提供的協議)進行處理(圖9A)。將生物素化的馬抗-山羊抗體(Vector Labs BA-9500,10μg/mL)在鏈酶親和素塗覆的位點中培育30分鐘，然後用1×PBS沖洗5次。然後，將山羊抗上皮細胞黏附分子EpCAM抗體(RnD AF960,10μg/mL)僅在目標孔中進一步培育30分鐘，然後用1×PBS沖洗5次，使得目標孔可捕獲MCF-7，其中具有EpCAM作為表面標誌物。參見圖2的步驟203-208。
接下來將1×PBS中的10μL MCF-7裝載到基底上的所有孔中30分鐘，其允許抗體和EpCAM之間的結合，從而捕獲MCF-7(圖9A)。然後用1×PBS沖洗5次，以減少非特異性結合。通過標準生物化學方法分別測試和驗證所有塗層。使用生物素化辣根過氧化物酶H(Vector Labs PK- 6100)用3,3’-二氨基聯苯胺(DAB)染色測試鏈酶親和素層，使得染色時鏈酶親和素塗覆的基底顯色為棕色。在基底上用額外的Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠抗體(Life Technologies A-11001)培育之後，通過螢光成像驗證鏈酶親和素層頂部上的生物素化的馬抗山羊抗體(Vector Labs BA-9500)層(圖9A)。對於每個層，進行對照實驗以驗證最小的非特異性結合。
基底採用八孔設計901：四個孔是塗覆有抗-EpCAM抗體的目標孔(標記為T)902-905，而另外四個孔是僅具有鏈酶親和素塗覆的對照孔(標記為C)906-909。還示出了目標孔中抗體捕獲的MCF-7的示意圖。
可以使用被設計用於處理自轉運動中的千兆圖元的圖像的演算法來拼接所獲取的圖像。該演算法與全景演算法不同，不使用特徵識別演算法，即尺度不變特徵變換演算法。該演算法基於歸一化互相關，其在計算之前比較來自2個圖像的修剪區域。在計算相關性的期間，圖像同時重新整形，以補償高速自轉下的圖像變形。如圖6C所示，記錄最大相關發生的位置和變形係數，從而可以重構最終圖像。這種演算法還能夠監視旋轉速率的抖動。
在2400rpm的旋轉速度(即線速度高達11m/s)下，本發明的時間拉伸成像系統能夠在目標孔中獲得單個捕獲的MCF-7細胞的高解析度圖像(圖9B)。注意，最終拼接圖像具有0.55mm×70mm的FOV，覆蓋對照孔和目標孔這兩者(如圖9A中所示的跨90°的弧)。通過在目標孔和對照孔 的圖像之間進行比較(圖9B對比圖9F)，清楚地驗證了DVD表面改進過程和結合特異性。底部的比例尺表示50μm。圖9C-9E示出了圖9B中的虛線中的區域的放大截面。
確定特異性捕獲率為約95.8%，而非特異性捕獲率為約1.4%(圖9C)。應當注意，特異性捕獲率原則上受限於可用的結合區域。這種演示的意義在於，使用該基於自轉細胞的測定形式相結合的時間拉伸成像不僅可以揭示細胞的形態學資訊，還可以通過生物化學特異性結合揭示細胞的生物分子特徵(例如在這種情況下是MCF-7的表面標誌物EpCAM)，這是增強測定準確性和特異性的重要附加資訊。
圖9G示出了實驗中細胞捕獲特異性的分析。特異性和非特異性的百分數是根據剩餘細胞的數量分別比對除去在抗體塗覆和鏈酶親和素塗覆的孔中捕獲的MCF-7數量來計算。
圖9H示出了在2分鐘自轉之後拍攝的在DVD基底上用活體染色(碘化丙啶(PI))處理的捕獲細胞的靜態圖像(相位對比(左)和螢光(右))。圖9I示出了在32分鐘自轉之後拍攝的在DVD基底上用活體染色(碘化丙啶(PI))處理的捕獲細胞的靜態圖像(相位對比(左)和螢光(右))。
還通過本發明的高速自轉操作來評估待測細胞的活力。通過在基底上用PI培育捕獲的細胞來執行活體染色。 來自PI的橙紅色螢光發射作為死亡細胞的指示符。觀察到在2分鐘和32分鐘自轉操作之後細胞活力沒有顯著變化(死亡細胞計數僅增加0.5%)。其驗證了時間拉伸成像期間的高速自轉給細胞帶來的不利影響最小。此外，絕大多數捕獲的細胞在32分鐘的自轉持續時間內在盤上的其位置保持不變(圖9I)。它顯示出優異的結合強度，並因此證明了該細胞捕獲測定形式的魯棒性。
代替使用純MCF-7群體(如圖9所示)，用人血細胞和MCF-7的混合群體進行進一步的實驗。具體地說，將MCF-7細胞與人血沉棕黃層(從人全血提取)混合(圖10A)，然後在自轉盤上對MCF-7進行捕獲和篩選。採用與圖7A所示相同的基底設計。與純MCF-7群體的實驗類似(圖9)，將盤上八個位點中的四個位點902-905指定為目標孔，其塗覆有鏈酶親和素、生物素化的馬抗-山羊抗體、最後是山羊抗-EpCAM抗體。篩選/富集過程表現出高效的特異性細胞捕獲，其在900rpm的自轉速度下再次通過時間拉伸成像(圖10B左)視覺化。通過將額外的綠色螢光探針(Alexa Fluor-488)與抗-EpCAM抗體綴合並在時間拉伸自轉成像操作(圖10B右)之後檢測相應的螢光發射，進一步驗證MCF-7捕獲的特異性，確認捕獲的細胞不是白細胞。所有比例尺表示50μm。
對於MCF-7富集/篩選的測試，在實驗前一天獲得血沉棕黃層樣本，並在室溫下儲存過夜。另一方面，將MCF-7細胞從培養皿中胰蛋白酶化，並計數，從而將600,000個 MCF-7細胞與來自人血沉棕黃層(總計220μL)的3,000,000個細胞混合。然後將10μL的混合溶液在每個目標位元點培育30分鐘，隨後多個盤沖洗(約7次)，直到血塊完全消除。校準後應進行1次以上的沖洗。
圖10C示出了用綠色螢光染料進一步染色的富集MCF-7的靜態圖像(上部：相位對比；下部：螢光)。(Alexa Fluor-488抗-EpCAM(RnD FAB9601G，10μg/mL))。執行該附加染色步驟以進一步確認DVD上富集的MCF-7。
該測試與CTC富集、檢測和計數的應用特別相關。在該示例中，我們利用通常在上皮細胞上表達的細胞黏附分子EpCAM作為通過免疫結合方法將MCF-7細胞與白細胞區分開的生物標誌物。因此，本發明的實施例不僅可以與現有技術類似地執行基於EpCAM的CTC富集，而且由於高解析度和高通量成像能力還允許利用單細胞精度對捕獲的細胞進行現場定量圖像分析。值得注意的是，與定量相位時間拉伸成像相結合，這種基於細胞的高通量自轉成像測定可以允許單細胞生物物理表型，例如，細胞尺寸、品質、密度和其它細胞的機械性質。已知這些內在表型與惡性轉化密切相關，並因此是癌症篩選以及藥物開發的有效生物標誌物。特別是關於藥物開發過程，大幅面的自轉盤也有利於高度複用的成像測定，並且可以潛在地用於數百到數萬種化合物的有效(癌症)藥物篩選。
圖11示出了無標記的大型FOV組織切片成像(人軟骨組織切片)的另一種實施方式。在這種情況下，在自轉 (2,400rpm)期間捕獲亮場和定量相圖像。之後，使用亮場圖像進行模式識別和拼接。用於拼接的相同座標將用於拼接相應的相位圖像。這減少了用於處理亮場和定量相位圖像的拼接的總體計算時間(圖11A和11B)。對於相位圖像拼接，使用圖11C所示的方案對2個圖像1101-1102之間的重疊區域進行權重平均。因為由於光學像差和低光譜功率，重建的相位值可能對圖像的2個邊緣具有增加的誤差，所以該方法可以抵消誤差的一部分。
本發明的測定形式是高度通用的。旋轉的平面平臺代表了可以廣泛應用的功能化的通用測定形式，諸如但不限於黏附細胞培養物、生物化學特異性細胞捕獲、雙分子親和力測定、2D組織切片、3D組織支架，以及利用組織清除技術的3D組織標本。旋轉平臺的離心作用也可用於細胞的生物力學測量(例如細胞牽引力，細胞黏附力，細胞剛度)，這在任何現有的測定技術中尚未得到證實。注意，長期以來已知細胞和組織的生物力學性質與遺傳/表觀遺傳學特徵密切相關，並因此代表了用於細胞生物學研究和癌症篩選的有價值的內在生物標誌物，以及藥物開發過程期間藥物反應的評估。
在許多實施例中，細胞的生物力學測量可以在改進為與常用的牽引力顯微鏡配置相容的旋轉或靜態基底302，304(如圖3A和3B所示)上實現，除了高速自轉/旋轉動作的情況。該實現可以以單細胞精度和高通量來說明即時顯示細胞牽引、黏附力的空間分佈。在這種情況下，基底 302，304以最高可能的密度包括具有基準標記(例如螢光珠)的彈性層。該自轉平臺上的雷射掃描成像被用於跟蹤它們的移動並量化可以評估單細胞牽引力的位移場。
另一方面，可以通過在離心作用下由旋轉或靜態基底302，304上的剪切力引起的細胞變形的直接成像(例如，亮場和定量相位成像模態)來推斷細胞剛度。
與遭受緩慢的掃描速率和機械反沖常規樣本平臺的光柵掃描或用於成像的雷射光束不同，本發明依賴於高速單向旋轉，從而實現穩定的樣本或>1000rpm的照射掃描。該高速旋轉運動的特徵要求超快速雷射掃描技術，其可以實現超過10MHz的連續線掃描速率，以確保無運動模糊的高解析度成像。這就解釋了為什麼幾乎沒有一種基於離心平臺的現有測定技術能夠結合成像能力，即，因為當前相機技術的基本限制。
為了完全理解大多數(若並非全部的)細胞特徵，通常結合多模成像平臺。該測定平臺能夠提供超快速雷射掃描定量相位成像(用於細胞/組織的無標記的生物物理表型；用於生物分子結合的無標記讀出，用於親和力測定，例如免疫測定)以及雷射掃描螢光成像或檢測(用於分子、細胞或組織的生物化學表型或讀出)。利用時間拉伸成像或FACED成像使該成像能力成為可能。
為此，本發明的特徵在於全光學超快速雷射掃描成像(即，FACED成像或時間拉伸成像)，其被認為是能夠以超過10MHz的線掃描速率遞送定量相位和螢光成像的唯一 可用的成像技術。這種超快速、多模成像能力在統一的系統中實現，其允許即時、連續地同時進行生物標本的生物物理和生物化學測量。這是現有測定技術中通常不存在的特徵。此外，利用連續旋轉成像操作，可以通過掃描器裝置或樣本平臺的連續單向軸向平移來實現細胞和組織標本的寬FOV三維(3D)成像。同樣，在測定技術方面這種能力稀缺。這種單向自轉和軸向平移方法解決了幾乎在所有的電流計掃描鏡或在經典的自動顯微鏡中的大塊樣本掃描階段中出現的常見的反沖問題，從而提高了長期連續掃描操作的掃描精度。
本發明還與生物分子親和力測定(例如ELISA/EIA)、黏附2D或3D細胞培養、生物化學特異性細胞捕獲測定、WSI、TMA形式以及3D組織標本廣泛地相容。基於高速旋轉運動測定策略和超快速全光學雷射掃描技術的集成，本發明不僅可以顯著增強當前測定應用(例如，ELISA/EIA、使用細胞成像的表型藥物篩選，超高通量WSI或TMA成像)中的測定通量和含量，本發明還開啟了新類型的成像測定，否則通過利用離心作用的現有測定是不可能的，例如，(在離心作用下)在單細胞精度下的細胞生物力學的超聲大型FOV監測；(由離心力操縱的)高圖像解析度下的細胞/分子親和力動力學的即時監測。
大區域自轉/靜態平臺上的高密度測定和陣列矩陣可以容易地用現有的微細加工技術設計和製造，從而允許高通量的高度複用測定。
本發明還包括用於同一盤上的主動流體控制(例如，採樣、混合和閥門調節)的已建立的離心微流體技術。此類測定集成可以在樣本測定平臺上實現更先進的測定功能性和完全自動化的工作流(從樣本載入、處理和監測到分析)。因此，本發明的實施例代表了藥物篩選開發、常規病理學評估、癌症篩選等中的高通量篩選的獨特且通用的測定方法。
除了對細胞或生物分子特徵的理解之外，本發明可以結合到組織切片/支架中。組織安裝的過程示出但不限於以下，並且由兩個主要步驟組成：(1)在本發明中，將切片進行標準冷凍包埋並載入到基底上。將新鮮的組織/支架樣本在-20℃下冷凍，其準備用於將樣本修整成與支援物匹配的尺寸。然後將修整好的組織塊小心地放置在支持物的中心(設計用於低溫恆溫器)，然後在室溫下將OCT倒入支持物中。然後將含有內容物的支援物在-80℃下冷凍直至塊完全硬化。在第二步之前，將塊快速轉移至低溫恆溫器進行切割。
為了將切片載入到本發明的基底上，製備透明/反射基底(例如DVD)並用70%的乙醇清潔。可以任選地處理DVD以顯示親水性。值得注意的是，有幾種增強疏水聚碳酸酯表面親水性能的方法，包括電暈(空氣)等離子體放電、臭氧化、火焰等離子體放電和化學等離子體放電。雖然它們都用於類似的目的，即清潔表面，但它們依賴於不同的機制，並因此具有不同的缺點。
電暈等離子體放電要求具有高電位差的真空條件以將電弧放電到樣本上。其要求用於等離子體生成的特定室和仔細的手動檢查。經處理的基底在短時間內(小於5分鐘)顯示出良好的親水性。雖然所有其它方法也要求公眾不容易獲得的具體工具，但這些方法主要在工業中採用。
值得注意的是，火焰等離子體放電通常在老化時相對穩定，因為通過與火焰中的OH自由基的反應而被廣泛氧化。本發明的實施例基於在強烈的藍色火焰區域內組合和燃燒可燃氣體和大氣。本發明不要求複雜的儀器，而是用可擕式燃燒器操作的加壓液化丁烷氣體生成此類強烈的藍色火焰。由於DVD的相對低的熔點，藍色火焰和DVD之間的接觸一定不能是持續的。本發明採用重複的鋸齒形掃描路徑進行藍焰接觸。在DVD下方放置大面積、平坦的導熱金屬，以確保快速散熱。掃描應進行5次。親水性增強已顯示持續數周。
在用70%的乙醇處理基底DVD之後，將切割的組織切片(至多N個連續切片)轉移到DVD上。當DVD充滿樣本時，將其帶到室溫，並允許切片黏附。然後用RO水或PBS清潔DVD以清除OCT。也可以在DVD上執行可選的染色或其它光學改進。
雖然已經參考本發明的較佳實施例具體示出和描述了本發明；本領域技術人員將理解，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可以在形式和細節上進行各種改變。

Claims (29)

  1. 一種用於執行複用旋轉成像生物測定的裝置，包括：雷射器，生成用於全光學雷射掃描成像的雷射脈衝；改進的自轉盤狀基底，其上投射有光束，該基底具有位於其上的至少一個測定孔，該測定孔包含標本樣本；後物鏡，用於從該盤狀基底接收該光束，該光束已經用來自該樣本的資訊編碼，以形成圖像編碼光束；圖像耦合模組，用於將編碼光束引導至具有重組光束輪廓的分束器上；高速光電檢測器，從該分束器接收返回光束；以及高速即時資料記錄儀，記錄該光電檢測器的輸出。
  2. 一種用於執行複用旋轉成像生物測定的裝置，包括：雷射器，生成用於全光學雷射掃描成像的雷射脈衝；改進的靜態盤狀基底，自轉照射光束投射在其上，該基底具有位於其上的至少一個測定孔，該測定孔包含標本樣本；後物鏡，用於從該盤狀基底接收該光束，該光束已經用來自該樣本的資訊編碼，以形成圖像編碼光束；圖像耦合模組，用於將編碼光束引導至具有重組光束輪廓的分束器上；高速光電檢測器，從該分束器接收返回光束；以及高速即時資料記錄儀，記錄該光電檢測器的輸出。
  3. 如請求項1的裝置，其中全光學雷射掃描成像包括時間拉伸成像，其包括：色散光纖，其中該雷射脈衝首先被時間拉伸，以形成波長掃描波形；將該波長掃描波形引導到成像系統的分束器；形成該成像系統的全息衍射光柵以及中繼透鏡和物鏡，該成像系統將該波長掃描波形轉換成一維頻譜編碼的線掃描光束。
  4. 如請求項1或2的裝置，其中全光學雷射掃描成像包括FACED成像，其包括：具有高反射率的平面鏡對，其中雷射脈衝被轉換成時空編碼子束的陣列；分束器，其將子束引導到包括中繼透鏡和物鏡的成像系統，該成像系統將子束變換成一維線掃描光束。
  5. 如請求項1或2的裝置，其中該盤狀基底由從兩個獨立的盤狀基片獲得的兩個透明聚碳酸酯層組成，該兩個獨立的盤狀基片用UV固化的黏合劑結合在一起。
  6. 如請求項5的裝置，其中該盤狀基底還包括確定該聚碳酸酯層之間的間隔的高度以形成測定室的間隔件，該間隔件被基本上對準以穩定快速自轉運動。
  7. 如請求項6的裝置，其中該測定室具有由該間隔件限定的約3-1000μm的高度。
  8. 如請求項1或2的裝置，其中該盤狀基底具有至少四個測定孔。
  9. 如請求項1或2的裝置，其中該圖像耦合模組具有包括時間拉伸成像和FACED成像的成像配置，該成像配置包括後物鏡的入射光瞳處的反射鏡，該反射鏡反射該編碼光束使得它們沿著相同的路徑通過該盤狀基底和該成像系統返回，以便形成雙通道配置。
  10. 如請求項1或2的裝置，其中該圖像耦合模組具有包括FACED成像的成像配置，該成像配置包括在該後物鏡之後的透鏡系統，該透鏡系統將編碼光束引導到檢測光路上，以形成單程配置。
  11. 如請求項1或2的裝置，其中該改進的自轉盤狀基底包括與黏附細胞培養相容的測定孔。
  12. 如請求項1或2的裝置，其中該改進的自轉盤狀基底包括與生物化學特異性細胞捕獲相容的測定孔。
  13. 如請求項1或2的裝置，其中該改進的自轉盤狀基底包括與包括2D和3D組織結構的組織樣本相容的測定孔。
  14. 如請求項1或2的裝置，其中，可以通過全光學雷射掃描成像來旋轉和成像該改進的自轉盤狀基底以產生任意形狀的視場；螺旋掃描視場；或環形掃描視場；或具有可重新配置區域的分段視場陣列。
  15. 如請求項13的裝置，其中，用於安裝3D組織標本的改進的自轉盤狀基底包括：作為盤狀基底的一個聚碳酸酯層，其可以是DVD；以及具有組織切片的玻璃基板，其與安裝介質結合在一起。
  16. 如請求項15的裝置，其中，該安裝介質可以是氟橡膠。
  17. 如請求項13的裝置，其中，用於安裝2D或切片的3D組織的改進的自轉盤狀基底包括：兩個透明聚碳酸酯層作為兩個獨立的盤狀基片，該兩個獨立的盤狀基片用UV固化的黏合劑結合在一起；確定該聚碳酸酯層之間的間隔的高度以形成測定室的間隔件，該間隔基本上對準以穩定快速自轉運動； 該室包括用安裝介質結合在一起的組織切片。
  18. 如請求項17的裝置，其中該安裝介質可以是氟橡膠。
  19. 如請求項15的裝置，其中該3D組織結構能夠與旋轉的2D視場一起旋轉，同時沿著光束傳播的方向進行順序的軸向掃描，然後能夠以3D形式堆疊並重構圖像，以形成體積組織塊結構。
  20. 如請求項17的裝置，其中該3D組織結構可以僅用旋轉2D視場來旋轉，然後能夠以3D形式將圖像拼接，形成體積組織塊結構。
  21. 如請求項14的裝置，其中能夠以由旋轉速率支配的至少10Hz的2D畫面播放速率來觀察改進的自轉盤狀基底的成像視場，其大規模地促進了即時視頻速率動態監測。
  22. 一種製備如請求項1或2的系統的基底以用於捕獲特異性物件的方法，包括以下步驟：提供用70%至100%的乙醇清潔的透明盤狀基底；用鏈黴親和素塗覆該盤；在鏈黴親和素的頂部施加生物素化二級抗體塗層；施加一級抗體的塗層；將要測定的該對象放置在該盤上的孔中； 培育該盤一段時間；以及沖洗該盤，以減少非特異性結合。
  23. 一種製備如請求項1或2的系統的基底以用於細胞培養的方法，包括以下步驟：提供用70%至100%的乙醇清潔的透明盤狀基底；用乙醇和紫外光對該盤進行消毒；將培養介質和細胞的混合物沉積到該基底上；以及將該基底保持在培育箱中，直到所需細胞群體存在於基底上。
  24. 如請求項2的裝置，其中，自轉照射光束投射在改進的靜態盤狀基底上，自轉照射光束發生器包括旋轉載體以承載來自光纖的照射，以避免前後掃描或曲折路徑掃描的傳統策略引起的後退機械不穩定性和反沖的問題，該旋轉/自轉照射通過以下步驟實現：將線掃描光束引導到安裝在旋轉載體上的集成小型化光學元件上，該光學元件包括漸變折射率(GRIN)透鏡，小型中繼(迷你光柵)透鏡和物鏡；該元件安裝在外殼中；該照射由光纖提供，該光纖通過可旋轉接頭附接到該旋轉載體的外邊緣；該接頭在載體旋轉時保持纖維不發生扭曲。
  25. 如請求項1或2的裝置，其中該資料記錄器是示波器或高通量資料獲取平臺。
  26. 如請求項1或2的裝置，其中該高通量資料獲取平臺是圖形處理單元(GPU)以及現場可程式設計門控陣列(FPGA)。
  27. 如請求項1或2的裝置，其中從生物測定圖像檢索的內源或內在參數可以是以下至少之一：生物標本的光學、物理和機械性質。
  28. 如請求項27的裝置，其中該生物標本的光學性質可以是光散射率或折射率中的至少一種，該生物標本的物理性質可以是尺寸或形態中的至少一種，生物標本的機械性質可以是品質密度、剛度或變形能力、牽引力和黏附力中的至少一種。
  29. 如請求項1或2的裝置，其中該標本包括標準分子生物標誌物。
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