TW201793B - - Google Patents

Description

fm 017ί>3 A6 B6 五、發明説明（3 ) 發明範圍 本發明是關於用於製造5/_次黃嘌呤核苷酸以及5'-鳥苷酸的重要原料之次黃瞟呤核苷和鳥苷的改良製造方法 ，以及用於此製法中之新穎微生物；以及用來誘生此新穎 微生物之新顆DNA。 發明背景 關於製造次黃嘌呤核苷以及鳥苷，認爲利用微生物的 醱酵方式是一種便利的方法，並且許多製法已被提出並實 施。 至今，根據許多硏究核酸醱酵的結果得知，一群生化 合成的物質，大致上可稱爲嘌呤核苷酸相關的物質，例如 ，次黃瞟呤核苷、鳥苷、黃質核苷、腺苷以及其基質（如 次黃嘌呤）和其磷酸化化合物（如5'_次黃嘌呤核苷酸） 受終產物，例如腺嘌呤相關物質（例如，腺核酸或其磷酸 化化合物，如5'-腺苷酸）或鳥嘌呤相關物質（例如，鳥 苷或其磷酸化化合物，如5'_鳥苷酸）之負反饋調節。 -濟邓中央標準局印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂. •線· 因而，通常在醱酵生産嘌呤核苷酸相關物質時，將培 養基中的腺嘌呤或其相關物質維持在低濃度，以避免嘌呤 核苷酸相關物質之生化合成途徑調節作用受到腺嘌呤相關 物質影響，並且，除此之外，使用一不含腺瞟呤琥珀酸鹽 合成酶的腺嘌呤-需求之突變菌種（Y. Nakao , Microbial Technology , Vo 1. 1, p311-3 54, edited by H。J. Peppier and D. Perlman, Academic Press, New York, U.S A )。不僅如此，一種應用屬於桿菌屬（美國 甲 4(210X297 公廣） 3 A6 B6 W"中央標準局印製 五、發明説明（4) 專利編號3,960,661、日本專利公開申請案41915/1982 、美國專利編號4,701,413、美國專利編號3,912,587 以及美國專利編號4,283,346 )以及短桿菌屬（美國專利 編號3,736,228以及日本專利公開申請案17592/ 1983 ) 的製法已被應用，其除具腺嘌呤需求之特性外，還提供 對多種藥物，例如，所謂的核酸同功異質體以及其類似物 之抵抗力，而有利於次黃嘌玲核苷以及/或鳥苷的生產。 誘生突變菌種的傳統方法爲進行導致遺傳突變的處理 ，例如，紫外線照射，用亞硝胍（NTG)處理以及類似之 方法，並且培養在適當選擇之培養基中，將所需之突變菌 種分離。 但是，因爲嘌呤核苷酸相關物質是負責微生物最重要 遺傳訊息之物質，所以在其生化合成中具複雜的調節機制 ，並且次黃嘌呤核苷以及/或鳥苷不容易過量生產。此外 *由傳統方法誘生之突變菌種不是經常令人滿意，因爲生 化合成嘌呤核苷酸的酶，其經突變得到的所需基因碼，在 導致遺傳突變的處理下，易與染色體其他部位不需要的突 變基因一同存在。因此，以嘌呤相關物質之工業重要性觀 點觀之，發展其改良之生產方法爲一重要需求。 發明目的 此^明的目的之一爲提供一種生產次黃嘌呤核苷以及 /或鳥改良方法。 此發明之另一目的爲提供一用於本發明生產方法之屬 於桿菌屬之新穎微生物。 (請先閱讀背面之注意事項再瑱寫本頁) •装· •訂· •線· 甲 4(210X297 公发） —4 — ®w邓中央標準局印製 A6 B6 五、發明説明（5 ) 此發明還有另一目的爲提供一新穎染色體DNA，其含 有控制屬於桿菌屬之微生物的嘌呤操縱子之表現順序，以 及3'-鄰近部位的順序，並且此部位會改變以誘生本發明 之新穎微生物。 於下述文獻描述中，配合所附圖表之參考，此發明中 這些目的和其它目的，以及其利益，爲熟知本技藝者顯而 易見的。 圖表之簡單描述 圖1表示一重組體質體PPBC32之限制***圖，其含 有在下文實施例1 ii)中所得到之用於嘌呤生化合成過程 之酶的基因（purE)碼。圖1中，實線表挿入之含purE DNA片段，空白部份代表pBR322。 圖2表示pPEC32以及pUH32之限制***圖，其含有 在下文實施例1 iii)中所得purE之5'-上游區域。圖2 中，點線表示由相同之限制酶所***之部位。 圖3表示核苷酸順序，其由下文中實施例1 iv) pUH32的EcoRV-SphI片段決定，其中purE的啓動因子及 起始密碼子，皆以圖解說明。 七 圖4表示由實施例1 v)設計出v質體PBX118-9的限制 ***圖，其缺乏嘌呤操縱子之控制區域，以及其部份核苷 酸順序表示在同一圖中。圖4中，實線表示含有purE的 DNA片段，以及空白部份代表PUC118。從ΚρηΙ的多-複 殖部位至purE的起始密碼子之核苷酸順序，於圖中表示 出。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) *故· •線· 甲 4 (210X297 公沒） 5 A6 B6 五、發明説明（6) 圖5表示下文實施例1 vii)中製備的SP啓動因子之 核苷酸順序。 圖6表示由實施例1 viii)中設計的重組體的質體 PBXSC19之限制***圖。黑色部份代表SP啓動因子、斜 線部份代表氯黴素-乙醯轉移酶基因、實線部份代表含有 purE的DNA片段，以及空白部份代表PUC19。 圖7表示由下文中實施例3設計出之重組體質體 PSB22的限制***圖，以及其部份之核苷酸順序。空白部 份代表PUC118。 圖8表示由下文中實施例3設計出之重組體質體 PBEI203的限制***圖，以及其部份之核苷酸順序。空白 部份代表PUC118。 圖9表示由下文中實施例3設計出之重組體質體 pDT32的限制***圖。空白部份代表pBR322以及斜線部 份代表氯黴素-乙醯轉移酶基因。 發明之概述 經濟邓中央標準局印裂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本百.) t 本發明之發明者廣泛的硏究誘生微生物菌株，其中抑 制由腺嘌呤相關物質以及鳥嘌呤相關物質生化合成嘌呤核 苷酸（嘌呤操縱子）之基因減少。硏究結果，發明者對於 DNA的結構已成功硏究出，用DNA重組技術將其中關於嘌 呤操縱子基因表現的DNA區域改良，以增m 基 因表現，以及/或以一適當選擇之不同啓因子f域:並 且亦成功地誘生一種新穎微生物，其中負責瞟呤核苷酸生 化合成的酶的基因表現不會被腺瞟呤相關物質，以及/或 甲 4(210X297 公廑） —6

Α6 Β6 經专邙中央標準局印$, 五、發明説明（7) 鳥瞟呤相關物質抑制。而後，用此技術以一屬於桿菌屬的 微生物爲接受者，謗生此新穎微生物，可不斷的累積大量 的次黃嚷啼核昔以及鳥昔。 本發明根據上述之發現而完成本發明，並提供染色體 DNA，其包括爲屬於桿菌屬的微生物之嘌呤操縱子基因表 現之DNA順序；以及3'-鄰近區域的DNA的順序，部份或 全部上述經改良之DNA順序，以增加基因表現。此外，此 發明亦提供一種含改良ΕΝΑ的載體，一種具生產由本發明 DNA或載體轉移之次黃嘌呤核苷以及/或鳥苷能力之屬於 桿菌屬的新顆微生物。及提供生產次黃嘌呤核苷以及/或 鳥苷之方法，其包括在培養基中培養此屬於桿菌屬的微生 物，以生產和累積次黃瞟呤核苷以及/或鳥苷，並且收集 此產物β 發明之詳述 在此所用以表示增加瞟呤操縱子基因表現的名詞「經 改良」或Γ改良」，其含義包括删除部份負責嘌呤操縱子 基因表現的DNA的順序、將一不同的DNA挿入順序中，以 及/或用不同的DNA代替部份或全部的順序。 用於此發明中，含有嘌呤操縱子基因表現控制區域的 DNA，不一定包含嘌呤操縱子整個區域，但是它包含一啓 動因子順序，一與嘌呤操縱子基因表現有關之DNA順序， 其受一個或更多的腺瞟呤相關物質，例如，腺瞟呤、腺嚷 呤核苷，單磷酸核腺苷、二磷酸核腺苷、三磷酸核腺苷所 調節，以及關於其基因表現受一個或更多的鳥嘌昤相關物 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· .訂· •線· 甲 4 (210X297 公廑） 7 — 017& A6 B6 經濟部中央標準局印製 五、發明説明（8 ) 質，例如，鳥嘌呤、鳥苷、單磷酸鳥苷、二磷酸鳥苷以及 三磷酸鳥苷調節之DNA順序，其位於啓動因子順序附近， 以及從這以下之3'-鄰近區域。此DNA又包含一些5'-鄰 近區域會更爲適宜。此種DNA是一個含有至少0。1千驗基 對（kb ρ)的3'-下游區域，以友從瞟呤操縱子的第一個開 放讀碼區的N -終端起5^上游區域，約0.4kbp。下文中 ，此部份是爲關於調節嘌呤操縱子基因表現之區域。 此種DNA可用重組DNA技術，方便地由一微生物的染 色體DNA中分離出。至於爲達此目的的宿主-載體系統， 常被採用的EK系統，可適當地使用。卽是，至於宿主可 適當地採用由大腸桿菌K-12菌株誘生而得之菌株，例如 ，大腸桿菌 C600 ( T. Maniatis et ale, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982，page 504 )、大腸桿菌 JA221 (IFO 143 59, ATCC 338 75 )、大腸桿菌 λΜ294 ( ATCC 33625 ) C Proc. Natl。Acad· Sc i . USA, 73，4174 (1976)〕，或其衍生物。至於載體可適當地選用pBR322 、PACYC184、pACYCl77、pUC18、PUC19、pHSG39 6、 pHSG298以及類似菌株。 此外，還有其它的宿主-載體系統可被採用，例如， 將噬菌體載體，如 Charon 4A ( Molecular Cl oning，31 頁）、EMBL 3 以及 EMBL 4 (J。Mol· Bi〇l·，170, 827 ) 以及類似菌株與大腸桿菌DP 50 supF (Molecular {請先Μ請背面之注意事項再填寫本頁·) .裝· .訂. •線· 甲 4 (210X297 公爱) 8 A6 B6 五、發明説明（9 )

Cloni ng, 5 04 頁）、大腸桿菌 NM 538 及 NM 539 ( J. Mol · Biol·，170，827 )、大腸桿菌 LE 392 ( J. Bil〇e Chem. , 218, 97 )以及類似菌株混合。當然，宿主-載 體系統，其中屬於桿菌屬之微生物，例如，枯草桿菌MI 114 ( Gene, 24, 255 )或其變種，可當作宿主；以及於 屬於桿菌屬的微生物，如PUB110、PC194、pE194、贞194 PSA2100、pHY300PLK或類似菌株中，具自治複製（ autonomous replication )能力之質體，亦可用作載體。 原則上，包含一區域爲關於調節嘌呤操縱子基因表現 之原始的DNA供體，.不會被特定限制在DNA供體的核苷酸 順序範圍內。此原始的DNA供體與下文中描述被用作接受 者的屬於桿菌屬的微生物的染色體，其中之DNA區域具高 度同種性，並且任何微生物可用作供體。其中，當使用屬 於桿菌屬的微生物時，其繁殖爲所謂的自我營養繁殖，並 且因爲這種情形很好處理故被偏好採用。再者，此所得之 轉形體，預期是穩定的。而且，供體未必具生產次黃瞟呤 核苷，鳥苷，黃嘌呤核苷或其嘌呤鹸基之能力。 經濟部中央標準局印裝 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 這類DNA供體的例子，包括枯草桿菌、pumilus桿菌 或苔狀桿菌。例如，可採用下列之微生物菌株：枯草桿菌 No. 168 ( BGSC 1A1 )、枯草桿菌 No。115 ( IFO 14187, FERM BP-1327 )、枯草桿菌MI 114 ( Gene, 24, 255 )、Bacil lus pumi lus ATCC 7061 以及苔狀桿菌 ATCC 14580 (其中BGSC是桿菌遺傳儲存中心，IFO是醱 酵協會，Osaka 以及 ATCC 是 The Ame ri can Type 甲 4(210X297 公发) 9 經濟部中央標準局印裝 A6 B6 五、發明説明（10 )

Culture Collection ) 〇 此染色體DNA可用傳統的方法從這些供體分離出，例 如*用酌卒取染色體DNA ( H. Sato and Mi u r a , Biochim· Biophy· Acta·, 72p 619 )。如此所得染色體 DNA，可用適當選擇的限制性酶將其分割，並且用DNA連 接酶將其連接在載體上。此連接混合物被用於一宿主的轉 形，（此宿主缺乏一種在嘌呤操縱子上的密碼的嘌呤核苷 酸生化合成酶），以選擇所缺部份已補足之轉形體。宿主 的轉形可根據傳統的方法進行。例如，在大腸桿菌的例子 中，轉形可根據 S.N. Cohen et al·〔 Proc。Natl.

Acad . Sc i . USA, 69，2110 )所描述的方法進行。在以 枯草桿菌菌株爲宿主的例子中，轉形可根據S。Chang以 及 S〇N· Cohen ( Molec. Gen. Genet., 168, 115 )所描 述的方法進行。 如此所得的轉形體，其所缺乏的生化合成所需之瞟呤 核苷酸酶被補足與否，可由其在含有或不含嘌呤核苷酸相 關物質，並且若需要的話，包括除嘌呤核苷酸相關物質外 的必須營養素的培養基中之生長情況，容易地確認出。 因此，包含調節嘌呤操縱子基因表現之相關區域的 ΕΝΑ是否存在於無性繁殖系DNA片段，可比較核苷酸順序 、限制分割部位以及類似情況及已知之枯草桿菌菌株之曜 呤操縱子者而確認。〔J. Biol. Chem., Vol。262 , pp82 74-8287 (19 87)〕，或可用啓動因子探測載體確認（ J. Bacteriol.，Vol. 146, ppll62-1165 )。另外，包 ......................................................8...............................ΐτ...................................终 (請先閱讀背面之注意事項再填¾本页) 甲 4(210X297公廣) -10 A6 B6 五、發明説明（11 ) 含調節嘌呤操縱子基因表現之相關區域的dna亦可用根據 已知枯草捍菌菌株之嘌呤操縱子的核苷酸順序數據之菌落 雜交 C colony hybridization )或斑雜交（plaque hybr i zat i on ) ( Molecular Cloning, 312 至 328 頁) 複殖。可根據上面提到的“ Mol ecular Cloni ng ” 86至93 頁所描述之方法.，大量的由轉形體製備含此基因的DNA。 由含有調節因此得到之瞟呤操縱子基因表現相關區域 的DNA，來建造以及分離本發明之新穎DNA，可方便的利 用重組DNA技術且如大腸桿菌的宿主-載體系統可適當地 採用。 在下列用大腸桿菌建造本發明DNA的步驟，在許多例 子中，可很方便地傳代無性繁殖系DNA片段在一新的載體 上，或用一多聯質將它連接在其上。爲此目的，較適宜利 用，例如PUC118以及PUC119的多聯質部份（其爲大腸桿 菌的媒傳者），進行傳代無性繁殖，因爲建造此新DNA以 及確認核苷酸順序皆可方便的進行。 經濟部中央標準局印焚· {請先閲讀背面之注意事項再填寫本耳) 本發明新穎DNA可用適當之限制酶，由含調節嘌呤操 縱子基因表現相關區域之質體，建造以及分離出此新顆 DNA，並且，若必要，具核酸外酵素活性之酶，其可由尾 端依序消化雙螺旋的DNA，例如，BAL31，以得到切短的 DNA片段，其中調節嘌呤操縱子基因表現相關區域被删除 掉。在此例中，爲得到DNA片段，其中每個被腺瞟呤相關 物質抑制的瞟呤操縱子的核苷酸順序、嘌呤操縱子啓動因 子，以及被鳥嘌呤相關物質抑制的嘌呤操縱子的核苷酸順 Ψ4(210Χ297 公鐘） —11 — A6 B6 五、發明説明（12 ) 序被删除掉，所需的DNA片段可採用不同量之酶，以及不 同之反應時間來選擇，而得到多種DNA片段，其具不同長 度以及不同種類的删除，並且用如下文所描述之適當方法 ，來選擇所需之ΕΝΑ片段，例如，根據DNA片段的核苷酸 順序確認結果。確認核苷酸順序可用建立傳代無性繁殖系 於用於確認核苷酸順序的載體上，例如，Μ13、pUCll8 或PUC119，然後採用一已知的方法，例如，F· Sanger et a 1.所描述的方法（Pore。Natl。Acad Sc i。USA, 74，5463 )來確認。 根據此方法，不只可將被腺嘌呤相關物質抑制的嘌呤 操縱子之區域以及/或被鳥嘌呤相關物質抑制的嘌呤操縱 子之區域除去，還可删除啓動因子區域，而用一適當選擇 之不同啓動因子代替。爲達此目的》其中嘌呤操縱子的啓 動因子區域已被删除之DNA片段，可將於屬於桿菌屬的微 生物中可表現啓動因子順序之下游與例如T4 DNA連接酿 連接。在此例中，若於屬於桿菌屬的微生物中可表現之標 記基因，例如，抗藥物性基因，被連接其上，則選擇下述 屬於桿菌屬的微生物之轉形體，可方便地進行。 經濟部中央標準局印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) •線· 此外，在此例中，將部份嘌呤操縱子啓動因子的5'-鄰近區域，連接在已連接啓動因子的5/-上游部份，此法 是方便的，因爲交錯型重組（double crossingover type r e c omb ination )是在如下述接受者的染色體上進行。 此發明中所用的啓動因子不必限制於一特定的啓動因 子，只要其具有可表現於一被用於後面步驟的接受者中， 甲 4(210X297 公爱） -12 L017&3 A6B6 五、發明説明（13 而不論其來源之DNA順序卽可，例如，原核體，眞核體或 合成的DNA。關於其例子，包括由屬於桿菌屬的微生物的 染色體誘生而_得的啓動因子、屬於桿菌屬的微生物的喷 菌體，或於屬於桿菌屬的微生物細胞中，具自主生長能力 的質體。當然此啓動因子可爲屬於桿菌屬的微生物的瞟時 操縱子。在後者的例中，改良係被限制在由腺嘌呤相關物 質以及/或鳥瞟呤相關物質調節的控制區域。此啓動因子 的特定例子如下：

AAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTATATACA SP01-15 [Lee, G and Pero, J, J. Mol. Biol., 152, 247 (1981)]

AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGCATAATAATCTTAAC ΞΡ01-26 [Lee et al., Mol. Gen. Genet., 180, 57 (1980)]

GAAAAGTGTTGAAAATTGTCGAACAGGGTGATATAATAAAAGAGTA Φ 29G3b [Marray, C.L. and Robinowtiz, J.C.,

J. Biol. Chem., 257, 1053 (1982)] GAAAAGGGTAGACAAACTATCGTTTAACATGTTATACTATAATAGAA Φ 29G2 [ Yoshikawa, H. et al. Proc. Natl. Acad .

Sci. USA, 7^, 1336 (1981)] «

ATTAATGTTTGACAACTATTACAGAGaATGCTATAATGGTAGTATC Φ 29A1 [Yoshikawa, H. et al., Proc. Natl. AcaS. 經 濟 部 中 央 標 準 局 印I 裝 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本耳)

Sci. USA, 21, 1336 (1981)] 該啓動因子可用適當的限制酶，將其由含此啓動因子 的ΕΝΑ (質體）中切除，可用例如洋菜糖凝膠電泳或聚丙 醯胺凝膠電泳分餾，並再回收。另外一種方法，可用市售 甲 4 (210X297 公尨） 13 - ιονη,ό Α6 Β6 五、發明説明（14 ) 之DNA合成器（例如，美國應用生化系統公司製造的儀器 )，以磷醯胺方法合成含上述啓動因子的核苷酸順序的 DNA，並且依據其方法步驟（protocol )。 爲大量地得到此發明新穎ΕΝΑ *用上述的連接混合物 將宿主微生物轉形，然後收集生長在經選擇的培養基中的 轉形體，例如，.在採用抗藥性爲選擇標記的例子中，可選 用含有其相對應的藥物之培養基。大量的DNA可根據已知 ，如上述“ Molecular Cloning ”第86至93頁中描述的方 法，由轉形體製得。 爲了從所得到的質體分離出含調節嘌呤操縱子基因表 現相關的改良區域的DNA片段，可根據傳統的方法，用一 限制酶將此質體分割，然後用洋菜糖凝膠電泳分離，接著 萃取並用例如電溶析（electr o-e luter )分離。 用含以此方法得到的新DNA的接受者的轉形，來誘生 出此新微生物的方法，於下文中被例解說明。 經濟部中央標準局印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· .線· 至於爲此轉形的接受者，任何具轉形能力的微生物均 可採用，例如，具有如由細胞外提供的DNA之性質者可併 入其中，並且在其具有與DNA之核苷酸順序有高度同種性 的染色體上部份引起重組反應，而改變其先天的特性。此 微生物未必與具調節嘌呤操縱子基因表現相關區域的供體 者相同，其於染色體DNA中之調節嘌呤操縱子基因表現相 關區域的3'-下游區域的核苷酸順序，與DNA外面，具調 節嘌呤操縱子基因表現相關區域的3。下游區域的核苷酸 順序，有高度的同種性。爲誘生具生產次黃嘌呤核苷以及 甲 4(210X297 公廣） -14 經濟部中央標準局印製 一 B6 五、發明説明（15 ) /鳥苷高度能力的轉形體，屬於桿菌屬的微生物，例如， 枯草桿菌、pumi lus捍菌、苔狀桿菌以及類似菌株，由其 可聚積兩種或兩種以上嘌呤核苷酸相關物質，例如次黃瞟 呤核苷、鳥苷以及黃核苷酸之觀點看，其具備轉形的能力 ，亦無致病性；以及它們具有醱酵工業上安全使用的歷史。 另外，當具.一個或一個以上對聚積嘌呤核苷酸相關物 質有利的已知特性，例如，嘌呤類似物的抵抗力、如8-氮鳥瞟呤抵抗力，核苷磷氧基酶缺乏、5/-鳥苷酸還原酶 缺乏、葉酸頡抗劑抵抗力，被提供給上述的微生物作爲接 受者，而導致生產次黃嘌呤核苷以及/或鳥苷方面可獲得 改進。 屬於桿菌屬的接受者的例子包括： 枯草桿菌 BM 1032 CIFO 14559, FERM BP-1242) 枯草桿菌 1A3 (BGSC No. 1A3) 枯草桿菌 ΝΑ-6011 (IFO 14189, FERM BP-291) 枯草桿菌 NA-6012 CIFO 14190, FERM BP-292) 枯草桿菌 NA-6128 CIFO 14373, FERM BP-617) 枯草桿菌 NA-7821 (IFO 14368，FERM BP-618) 枯草捍菌ATCC 19221 枯草桿菌ATCC 14662 pumi lus 桿菌（FERM P-2116) pumi lus 桿菌(FEiM P-4832) pumi lus 桿菌（FERM P—4 82 9) 苔狀桿菌IFO 12485 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •訂· •綠· 甲 4(210X297 公廣） 15 - 經 濟 部 中 標 準 Μ 印 A6 B6 五、發明説明（16 ) 本發明新穎DNA用來使屬於桿菌屬的微生物轉形，並 且，在此例中》可能使用之形式爲在質體中完整的形式、 或由***質體而得線狀DNA、或由本發明的DNA切出者。 用DNA片段來使屬於桿菌屬的微生物轉形，可根據已知之 方法進行〔C· Anagnostopoulos and J。Spizizen, J. Bacteriol·, 81, 741 (1961); etc。 〕 〇 轉形體的選擇，例如，選用抗藥性基因做爲選擇標記 的例子中，可容易地將其在含有相對應藥物的洋菜皿中培 養。以此方法得到的轉形體，可容易地用測量由嘌呤操縱 子譯成密碼的嘌呤核苷酸生化合成系統酶的活性，確認出 其是否爲具所需特性的新穎微生物。例如，在已被本發明 中的DNA轉形之屬於桿菌屬的轉形體，其中關於被腺嘌呤 相關物質抑制的區域已被改良。此轉形體之高酵素活性被 保留，因爲一嘌呤核苷酸生化合成酶（例如，PRPP氨基 轉移酶，其爲此生化合成的第一個酶），卽使在一培養肉 湯中加入過量的腺嘌呤，亦不會被抑制，並且轉形體和接 受者的活性差別很大。因此，此轉形體可容易地確認爲新 穎微生物。 本發明轉形體的典型例子包括於下文實施例中製得的 枯草桿菌 BM2032( IFO 14902 , FERM BP-2536)或枯草桿菌 EM2232 (IFO 15040, FERM BP-2937) 〇 當然，藉由啓動因子及接受者的選擇，多種轉形體可 容易地根據此處描述的方法誘生。 爲了使用本發明所得的轉形體製造次黃瞟呤核苷以及 ......................................................装..............................^:…..........................sf (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297 公发） 16 - A6 B6 經濟部中央標準局印裝 五、發明説明（17) /或鳥苷，可採用傳統製造次黃嘌呤核苷以及/或鳥苷之 醱酵方法。 亦卽，可使用含碳來源、氮來源、金屬離子，若需要 的話，亦包括其他營養素，如胺基酸、核酸、維生素以及 類似物質的培養基。至於碳來源*可採用葡萄糖、蔗糖、 麥芽糖、澱粉、酵母澱粉、糖蜜以及類似物質。其可單獨 使用或混合使用。至於氮來源，除有機氮來源，如蛋白腺 、大豆碎粉、乾酵母、尿素以及類似物質外，無機氮來源 ，如硫酸、硝酸、鹽酸、碳酸之銨鹽以及類似物質、氣態 氨、液態氨以及類似物質，亦可被單獨使用或混合使用。 至於其他營養素，可適當選擇此微生物生長所必須的各種 無機鹽、胺基酸、維生素以及類似物質，並可單獨使用或 混合使用。至於腺嘌呤來源，可採用腺嘌呤、腺苷和腺核 酸以及包含它們的微生物細胞和其萃取物以及類似物質。 - 此外，若需要的話，可於培養基中加入防沬劑，如聚 矽氧油、聚烷二醇醚或類似物質、界界活性劑以及類似物 質。 通常，培養是在嗜氧的條件下進行，如搖動、通空氣 於培養基中（aeration submerged culture )以及類似 方法。培養基適當的酸鹸値範圍爲4至9。當培養期間酸 鹼値改變時，可用硫酸、碳酸鈣、氫氧化鈉、氣態氨、液 態氨以及類似物質，將酸鹸値調至上述之適當範圍。通常 ，合宜的培養溫度範圍被選在20至45 °C。此溫度爲用來聚 積次黃嘌呤核苷以及/或鳥苷的微生物的適合生長溫度。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁.) k. •訂. •線· 甲 4(210X297 公尨） 17 - 3 -*'v -X o

A B 五、發明説明（18 ) 繼續培養至次黃嘌呤核苷以及/或鳥苷聚積到最大量。通 常，所需產物可在培養24至144小時後獲得。 已知的純化方法，例如，沉澱、以及分離和純化方法 ，如用離子交換樹脂層析、活性碳以及類似物質，可用來 分離並得到次黃嘌呤核苷以及/或鳥苷。 根據本發明，利於工業化大量生產次黃嘌呤核苷以及 /或鳥苷C其爲生產重要物質5'-次黃嘌呤核苷酸以及 5^-甲脒酸的起始原料）成爲可能。 亦卽，具經改良瞟呤核苷酸生化合成系統的酵素活性 的新穎微生物，可用具生產次黃嘌呤核苷以及/或鳥苷能 力，屬於桿菌屬的微生物，當作一接受者而得到，並且用 本發明DNA使其轉形，以解除腺嘌呤相關物質以及鳥嘌呤 相關物質的抑制，及/或以不同啓始因子取代啓始因子。 此新穎微生物可非常穩定地生產大量的次黃嘌呤核苷以及 /或鳥苷。 下列的實施例中，更進一步地詳細說明此發明，但不 限制其範圍。 除非另外說明，實施例中的操作皆根據下列之方法⑴ 至⑼進行。

⑴用限制酿消化DNA 經 濟 部 中 央 標 準 局 印 $1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 限制酶所用的緩衝液（由日本Takara Shuzo有限公 司製造）是由製造廠商指定的。消化反應在37 t，用10單 位/微克DNA的酶進行60分鐘。然後，將此反應混合物用 TE緩衝液飽和化的酚萃取〔1祕Tr丨s-鹽酸（PH 7 .5 甲 4(210X297公发） 18 — 經 濟 部 中 標 準 印 裝 Α6 Β6 五、發明説明（19 ) )以及lmM EDTA〕。將I/O體積的3Μ乙酸鈉（ΡΗ6) 加入萃取物中，然後再加入2.5體積的乙醇，然後將此混 合物離心以回收DNA。 ⑵質體的大量萃取 萃取是根據‘‘ Molecular Cloning ’，第86至93頁中所 描述的方法進行。亦卽，將潛伏質體DNA的大腸桿菌接種 至LB培養基（250毫升；細菌胰化蛋白臃1〇克/升，酵 母萃取物5克/升以及氯化鈉5克/升）。經過一夜的培 養，將細胞收集並洗滌。然後，將溶菌酶加入洗滌過的細 胞中，並且另外加入含1%月桂基硫酸鈉的0JN氫氧化 鈉溶液，以引起細胞的溶解。加入5M醋酸鉀後，離心得 到含質體的上淸液。將0.6體積的異丙醇加入上淸液中， 以使質體DNA沉澱，並且用乙醇洗滌後，將其溶解於TE 緩衝液。將氯化鉋加入溶液中使其比重變爲1。60，並且再 加入溴化乙基化合物使最後濃度爲600微克/毫升。此混 合物在20 °C用超離心機C轉子：V65Ti )以每分鐘轉速 50,000次的速度，離心12小時，並將以紫外線偵察到的 質體帶譜取出。在用正-丁醇將溴化乙基化合物除去後， 進行乙醇沉澱處理。 ⑶大腸桿菌的轉形 轉形是根據“ Molecular Cloning ”第250頁中所描 述的方法進行。

其方法爲，將大腸桿菌接種在LB培養基中（3毫升 )。經一夜的培養，從其中取出1毫升份量，接種於LB (請先閱讀背面之注意事項再填宵本頁) •装_ .線· 甲 4(210X297 公簷） 一 19 經濟部中央標準局印製 A6 B6 五、發明説明（20) 培養基中C 100毫升），在37 °c搖晃保溫至細胞濃度變爲 5 X 1〇7細胞/毫升。然後，收集細胞，並以加入含50 rrM氯化鈣以及1〇πΜ Tris-鹽酸緩衝液（PH 8 )的無菌 冰水，混懸及冰卻15分鐘。離心分離細胞，並且再將其混 懸於含50 πΜ氯化鈣以及10 nMTr is-鹽酸緩衝液的無菌水 (6.7毫升）Φ。從其中取出2毫升加入DNA，並且將細 胞懸浮液冰卻30分鐘。然後，加入LB培養基（〇β8毫升 )。將細胞懸浮液在37 °C培養1小時，將其塗在含藥物的 LB洋菜皿上，並且再在37 °c培養一夜。 ⑷BAL31消化處理 進行BAL31核酸酵素處理方式以由DNA兩頭終端消化 雙鍊DNA。亦卽是，將用限制酶處理過的DNA ( 10微克） 溶於BAL31緩衝溶液中〔100微升；12mM氯化鈣、12nM 氯化鎂、200πΜ氯化鈉以及2〇irM Tr i s-鹽酸（PH 8 )、 2nM EDTA〕，並加入BAL31核酸酵素（1單位，曰本 Taka ra Shuzo有限公司製造）。將此反應混合物在30°c 培養。消化後，進行酚萃取及乙醇沉澱。然後，爲了要使 已消化的DNA的終端轉換爲鈍終端，將上述DNA懸浮於緩 衝溶液中，其中加入T4 DNA聚合酶〔20微升；包含33 nM Tri s-醋酸（ΡΗ 7·9 )、ΙΟπΜ 醋酸鎂、（Κ5πΜ 二硫 赤蘚糖醇、66πΜ 醋酸鉀、0 · 01 % BAS、0 . lnM dATP、 O.lnM dGTP、Ο.ΙπΜ dCTP 以及 Ο,ΙπΜ dTTP〕以及 T4 DNA聚合酶。將此反應混合物在37 °C培養30分鐘。培養後 ，進行酚萃取及乙醇沉澱。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 缘· 甲 4(210X297 公楚） -20 - A6 B6 經濟郎中央標準局印裝 五、發明説明（21 ) ⑸DNA的連接 用DNA連接組具（日本Takara Shuzo有限公司製造 )連接2至3個DNA片段◊連接條件根據製造商指定的。 ⑻大腸桿菌的轉形 轉形是根據Dubnou et. al。所描述的方法進行。卽 是，將微生物接種於LB培養基（5毫升）中，並且在37 °(：培養一夜。將其中〇.5毫升部份量轉移至SPI培養基中 (20毫升；包含1.4%磷酸二鉀、0.6%磷酸一鉀、0.2 %硫酸銨、0。1%檸檬酸鈉、0.02%硫酸鎂、0.5%葡萄 糖、0.02%酸性水解酪酸、0.1%酵母萃取物、色胺酸 5〇微克/毫升以及白胺酸50微克/毫升），並在37 °C培養 4小時《然後，將後者培養菌種之10毫升份量轉移至 SPII培養基（100毫升；包含1.4%磷酸二鉀、0.6% 磷酸一鉀、0.2 %硫酸'鞍、0.1%檸檬酸鈉、〇.〇2 %硫 酸鎂、0.5为葡萄糖、氯化鈣75微克/毫升以及氯化鎂 508微克/毫升），並在37 °c培養9〇分鐘。在其1毫升份 量中加入DNA，並且將細胞懸浮液在37 °C培養30分鐘。然 後，將此細胞懸浮液塗在含藥物的洋菜皿*並且在37 °C培 養一夜0 ⑺PRPP氨基轉化酿活性之測定 將轉形體接種於LB培養基（5毫升中），並且在37 °(：培養一夜。將其中0.2毫升份量接種於含腺瞟呤或鳥嘌 呤（300微克/毫升）的SPI培養皿中（20毫升），並且 在37 °C培養3小時。收集細胞，並用0。85 %氯化鈉水溶 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁·) .5t· •打· •線· 甲 4(210X 297 公潑） 21 一 A6 B6 五、發明説明（22 ) 液洗滌。之後，再用丙酮洗滌並乾燥之。然後，將細胞混 懸於反應溶液I中〔1毫升；ΙΟΟπΜ Tri S-鹽酸（ΡΗ 7 · 5 )、3.2πΜ氯化鎂、2』nM PRPP以及12πΜ L-魅胺 〕，並且在37 °c培養15分鐘。將反應混合物持於沸水中3 分鐘，以終止反應。將此反應混合物離心，並且用DNA以 及魅胺.酸鹽去氣酿（日本Boehringer Ma nnhe im Yamanouchi有限公司製造）定量上淸液中麩胺酸的濃度 。以麩胺酸生產毫莫耳/分鐘/毫克乾細胞表示活性。 ⑻菌落雜交 將轉形的菌落接種於耐綸濾器（菌落/美國E.I. du

pont de Nemours <δ有限公司製作的菌落篩選NEF-978X

)，將其分別置於含胺苄靑黴素（50微克/毫升）的LB 洋菜皿，以及接種於含胺苄靑黴素的LB洋菜皿的主盤上 ，並且將它們在37 °C培養一夜。 將耐綸濾器從培養皿移開，並浸泡於0.5 N氫氧化鈉 水溶液中10分鐘，及於IMTris-鹽酸（ΡΗ 7·5 )又浸泡 10分鐘。然後，將濾器在室溫乾燥。 在另一方面，準備一探針。準備工作是採用一多種主 要DNA標記系統（日本Ama s ham Japan有限公司製造）， 依照製造商指定的方法步驟進行。 經濟部中央標準局印裂 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁.) 雜交方法是依照耐綸濾器擬定的方法步驟。 ⑼核苷酸順序的測定 Kabushiki' ^--( 核苷酸順序的測定是用次序酶（日本T〇y〇 Boseki Kaisha製造）依照製造商指定的方法進行。 甲 4(210X 297 公尨） 22 — A6 B6 五、發明説明（23 ) 此處所用的IFO號碼爲大阪醱酵協會之密碼（ a cc e s s i on numb e r ) »且FERM BP-號碼是布達佩斯條約 中，工業科學技術機構（Agency of Industrial Science and Technology )醱酵硏究協會的密碼。 實施例1 i )染色體DNA的製備 將枯草桿菌 No. 115〔IFO 14187, FERMBP-1327 (19 8 7,三月28日儲存）〕接^種於LB培養基， 並且在37 °C培養一夜。染色體DNA( 5毫克）可用酚萃取 得到。 i i ) purE的菌種 將上面i)中得到的染色體DNA ( 10微克）用Cl al 消化，並且用洋菜糖凝膠電泳分餾，並且用間接電溶析儀 (美國生化科技公司製造）回收相當於3。6至4.5kbP的 DNA。 另一方面，用Clal消化pBR322 ( 0。5微克），並且 與上面之DNA分餾物混合以進行連接反應。用此連接混合 物將缺乏purE之菌種大腸桿菌PC 0135 ( CGSC5403 )轉 形，塗抹於含胺苄靑黴素M9CA洋菜皿上（包含磯酸二鈉 6克/升、磷酸一鉀3克/升、氯化鈉0。5克/升、氯化 銨1克/升、葡萄糖2克/升、2πΜ硫酸鎂、O.lmM氯化 鈣以及酸性水解酪酸2克/升），並且在37 °c培養一天， 以得到轉形體大腸桿菌PC 0135 ( pPEC32 )〔 IFO 14899，FERM BP-2533 ( 1989,七月二十六儲存）〕〇 由 ......................................................^..............................^...................................^ (請先閏讀背面之注意事項再瑱寫本頁) 經濟部中央標準局印災* 甲 4(210X297 公沒） 23 — :、.or 财 A6 B6 經濟部中央樣準局印焚* 五、發明説明（24 ) 此轉形體可得到質體pPEC32。然後，萃取大量的PPECM 並且用各種限制酶將其切割。根據其電泳圖，如圖1所示 的限制分割圖，是以Hind III消化入DNA當作分子標準而 得。 iii) purE基因的上游部份DNA的製備 將上面i)中得到的染色體DNA ( 10微克），用 Hindlll消化，並且用洋菜糖凝膠電泳回收約相當於2。0 至 2 · 6 kb p 的 DN\ 〇 另一方面，PER322 ( 0·5微克）用Hindlll消化， 用鹸性磷酸酯酶去磷，並且用酚萃取以及用乙醇將其沉澱 。將此與上面的DNA片段混合並且連接。用此連接混合物 將大腸桿菌DH1 ( ATCC 33849 )轉形，並選出對胺苄靑 黴素具抗性的菌種。約選出500菌落並且用PPEC32的 Clal-StuI分餾物（62 0 bp )與其進行雜交，做爲探測 菌。在具有探測菌的雜交紫葚角丑A其中一菌種大腸桿菌 DHI ( pUH32 )〔 IFO 149000， FERM BP-2534 (1989,七 月二十六日儲存）〕被選出以得到質體PUH32。萃取出大 量PUH32並且用各種限制酶消化。根據其電泳圖可得到圖 2所示的限制分割圖。 iv) 瞟呤操縱子上游的核苷酸順序之測定 爲測定由上面i i i )所得pUH32的EcoRV-SphI片段（ 約500bp )的核苷酸順序，將pUH32 ( 1微克）用EcoRV 以及S phi雙消化（double-digest ed )，並且用洋菜凝 膠電泳分餾回收核苷酸片段C約500bp )。然後，將此片 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •訂· •線· 甲 4 (210X297 公尨） -24 - A6 __B6_ 五、發明説明（25 ) 段與經Smal以及SphI雙消化的PUC119 ( 0。5微克）連 接，並且用此連接混合物使大腸桿菌JM109 (日本 Taka r a Shuzo有限公司提供）轉形，以得到具胺苄靑黴 素抗性的菌種。由這些菌種其中之~，萃取出質體，並且 測定其核苷酸順序。核苷酸順序如圖3所示。此核苷酸順 序與 Ebbole , D。J„ e t al。，J。Biol . Chem· , 262 , 8274-82 87中報告的相同。 v )缺乏質體PBX118-9的建造 將上面i i)得到的PPEC32 ( 10微克）用Clal消化， 並且將其經BAL31消化處理30秒。然後，將其用Xbal完 全消化，並且用洋菜凝膠電泳分餾，以回收相當於約3 kbp的DNA片段。將此DNA片段連接在經Sma I和Xba I消 化兩次的PUC118 C 0.5微克）上，並且此連接混合物被 用來使大腸桿菌JM109轉形，以選出一具胺苄靑黴素抗性 的菌種。 vi) pSKC的建造 經濟部中央標準局印焚 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁·) 將PCAT15 ( 0·5微克，日本專利公開公報第62-82096 號）用BamHI和Ps 11雙消化，並且用Τ4 DNA聚此經 消化之終端，轉換爲鈍端。將此DNA與用Smal切割的 BLUESCRIPT SK ( 0.5 微克，曰本 T〇y〇 Boseki Kabushiki Kaisha製造）連接，並且將此用來使大腸桿 菌JM109轉形，以選出具胺苄靑徽素抗性，以及具氯黴素 抗性的菌種。由此具抗性之菌種得到質體pSKC。 vii) SP啓動因子製備 甲 4(210X 297 公发） -25 - l〇V7i3 Α6 Β6 經濟部中央標準局印裝 五、發明説明（26 ) 可表現於枯草桿菌（圖5)的啓動因子，可根據製造 商指定的方法步驟，用IKA合成器（日本Appl ied Bi 〇 s y s t ems Japan有限公司製造之DNA合成器％ ΙΑ )製 備。然後，將此連接在經EcoRI和SacI切割的PUC19 ( 0.5微克）之上，並且用來.使大腸桿菌JM109轉形，以得 到與SP啓動因子整合的質體PSP19。 viii)pBXSCl9 的建造 將由上面vii)得到的pSP19 ( 0.5微克）用ΚρηΙ和 Xbal雙消化。另一方面，將由上面vi)得到的pSKC用 Xbal消化，並且用洋菜糖凝膠電泳分餾，以得到cat基 因C約1.0 kbp )。另外，將上面v)所得的pBX118-9 用ΚρηΙ和Xbal雙消化，並且用洋菜糖凝膠電泳分餾，以 得到DNA片段（約3.6kbP )。 然後，將這三種片段混合、連接，並且用來使大腸桿 菌JM109轉形，以選出具胺苄靑徽素抗性的菌種，大腸桿 菌 JM109 (PBXSC19 ) 〔 IFO 14901， FERM BP-2535 ( 1989,七月二十六日儲存）〕。結果，得到如圖6所示的 質體 pBXSC19。 實施例2 i )用PBXSC19轉形的枯草桿菌168的PRPP氨基轉化酶 活性 用上面實施例1 Viii)得到的PBXSC19 ( 1微克）將 枯草桿菌168變性，以得到一具氯黴素抗性的菌種。將這 些菌種其中之一在SPI培養基、含腺嘌呤SPI培養基以及 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁·) •装_ •打. •線. 甲 4(210X297 公尨） 26 一 A6 B6 五、發明説明（27 ) 含鳥瞟呤SPI培養基中培養，並且測量PRPP氨基轉化酶 活性。控制組中枯草桿菌163的活性亦被測量。結果如表 1所示。 表 1 菌 種 SPI SPI + 腺嘌呤 SPI + 鳥嘌呤 祜草桿菌168 5.4 1*4 1.0 枯草桿菌：L68 18 18 11 (pBXSC19) {請先閲讀背面之注意事項再填寫本百.) 經濟部中央標準局印裝 ii) 次黃嘌呤核苷-鳥苷之生產者枯草桿菌BM1032的轉形 將枯草桿菌舰1032 ( IFO 14459, FERMBP-1242 ) 用實施例1 viii)中所得的pBXSCl9 ( 1微克）轉形，以 得到具氯徽素抗性（1〇微克/毫升）的菌種。其中一變種 命名爲枯草桿菌 BM203 2〔 IFO 14902, FERMBP-2 536 C 1989 ,七月二十六日儲存）〕。 iii) 枯草桿菌BM2032次黃嘌呤核苷以及鳥苷的生產力 將環量的枯草桿菌BM2032接種於LB培養皿中（5 毫升），並且在37 °C搖晃培養12小時。將其1毫升份量轉 移至表2所示的培養皿（20毫升），並且在37 °C培養48小 時。在培養完成後*用高性能液態色層分析測定累積在培 養肉湯中的次黃嘌呤核苷以及鳥苷。結果累積次黃嘌呤核 « 苷14毫克/毫升、鳥苷2毫克/毫升。 另一方面，將枯草桿菌BM1032菌種在與上述相同情 況下培養。結果只有累積次黃瞟呤核苷8.0毫克/毫升、 •裟· •線. 甲 4(210X297 公釐) -27 - 01ϊ&〇 Α6 Β6 五、發明説明（) 鳥苷1 1.1毫克/毫升。 Μ_2 培養基成份 濃度（克/升） 葡萄糖 120 麩酸鈉 12 硝酸銨 20 DL-«-丙胺酸 0.3 酸性水解酪酸 10 色胺醆 0.2 白胺酸 0 »2 RNA. 2 生物素 0.0002 磷酸一鉀 2 氯化鉀 1 硫酸鎂 1 硫酸亞鐵 0〇 005 硫酸錳 0.01 碳酸鈣 15 PH 7.5 實施例3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本耳) •裝· •線. 經濟部中央標準局印製 甲4(210X297公簷） 28 1 )缺乏質體pSB22的建造

將實施例1 i i i)所得的pUH32 ( 0。5微克）用Sac I

、S phi以及St ul消化三次，並且用洋菜糖凝膠電泳分餾 ，以回收含起動因子的片段（約800bp )。然後，將DNA or财 A6 B6 濟 部 中 央 標 準 局 印 製 五、發明説明（29 ) 連接在用SacI以及SphI雙消化的pUC118上，並且用來 使大腸桿菌JM109轉形。選出具胺苄靑黴素抗性的菌種， 以得到質體PUSS118。 然後，用SphI消化pUSSll8 ( 10微克）、經ML31 消化處理30秒、用SacI消化，並且用洋菜糖凝膠電泳分 餾，以回收相當於約5 00bp的DNA片段。將此DNA連接在 經SacI以及Smal雙消化的pUCll8 ( 〇。5微克）上，並且 用來使大腸桿菌JM109轉形，以選擇具胺苄靑黴素抗性的 菌種。結果，得到如圖7所示之質體pSB22。 ii) pBE203的建造 將實施例1 v)中，所得的pBX118-9 C 10微克）用 ΚρηΙ消化，並且經.BAL消化處理30秒。然後，將此用 EcoRI消化，並且用洋菜糖凝膠電泳分餾，以得到相當於 3 · 6kbp的DNA。將此DNA用Hi nc 11以及Ec oRI雙消化， 連接於pUCl 18 ( 0.5毫克）之上》並且用來使大腸桿菌 JM109轉形，以選出具胺苄靑黴素抗性的菌種。結果，得 到如圖8.所示之質體pBEI 203。 iii) pDT32的建造 將上面i )中所得pSB22 ( 0。5毫克）用EcoRV以及 Hi ndlll雙消化，並且用洋菜糖凝膠電泳分餾，以回收— 片段（約200bp )。將此DNA連接在用EcoRV以及H〇nd 111切割的BLUESCRIPTSK之上，並且用來使大腸桿菌 JM109轉形。選出具胺苄靑黴素抗性的菌種，以得到質體 ρ9ί22。然後，將 PSK22 ( 0·5 微克）用 EcoRI 以及 pstl (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁.) 甲 4(210X297 公廣) -29 - A6 B6 五、發明説明（30 ) 雙消化，並且用洋菜糖凝膠電泳分餾，以回收DNA片段（ 約220bP )。另一方面，將上面ii)中所得的pBEI 203 ( 0.5微克）用PstI以及Hi nl II雙消化，並且用洋菜糖凝 膠電泳分餾，以回收DNA片段（約1.2kbp )。另外，將 PCAT15 ( 0.5微克）用Hindlll以及BamHl雙消化，並 且用洋菜糖凝膠電泳分餾，以回收DNA片段（約l.Okbp )。同樣的，將pBR322 C 0。5微克）用EcoRl以及BanHI 消化兩次，並且用洋菜糖凝膠電泳分餾，以回收DNA片段 (約3.9kbp )。將此四種片段混合、連接，並且用來使 大腸桿菌1VM294 C ATCC 33625 )轉形，以選出具胺苄靑 黴素抗性的菌種。結果，得到如圖9所示之質體pDT32。 實施例4 i )用PDT32轉形之枯草桿菌168的PRPP氨基轉化酶活 性 用實施例3 i i i)所得的pDT32 C 1微克）使枯草桿 莖168轉形，以得到具氯徽素（1〇微克/毫升）抗性的菌 種。將此菌種分別培養在SPI培養基、含腺瞟呤的SPI培 養基以及含鳥嘌呤的SPI培養基，並且測定PRPP氨基轉 化酶活性。控制組中枯草桿菌168的活性亦被測定。結果 如表3所示。 (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁.) •装· .打. .線. 經濟部中央標準局印製 甲 4(210X297 公廣) 30 — 五、發明説明（31 ) 表 3 1 菌 種 SPI SPI + 腺嘌呤 SPI + 腺嘌呤： 枯草桿 菌 168 5.4 1.4 1.0 枯草禅 菌 168 2·2 5.7 (PDT32) Η)次黃嘌呤核苷-鳥苷之生產者枯草桿菌HVI1032菌種 的轉形 用實施例3 iii)所得之pDT32使枯草桿菌SVI1032菌 種轉形*以得到具氯黴素< 10微克/毫升）抗性的菌種。 其中一菌種被命名爲枯草桿菌BM2232〔 IFO 15040, FERM BP-2937 C 1990，五月二十八日儲存）〕。 iii)枯草桿菌BM2232菌種對次黃嘌呤核苷以及鳥苷的生 產力 將上面i i )所得的枯草桿菌BM2232菌種依實施例2 iii)中所述之相同方法培養，並且測量累積於培養肉湯 中的次黃瞟呤核苷以及鳥苷之量。結果，累積次黃瞟呤核 苷13毫克/毫升以及鳥苷2毫克/毫升。另—方面，控制 組的菌種，1享桿1 BM1032菌種，只累積次黃嘌呤核苷 8.0毫克/毫升以及鳥苷1.1毫克/毫升。 (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局印装 甲 4(210X 297 公潑） 31 -

Claims (1)

1. 第79105773號專利申請案 申謓專利範圍修正本 (81年12月29日） 1. 一種DNA,包括與來自枯簞捍菌細菌染色體曛昤操縱子 基因表現有關之區域及其3’-鄰近區域，該DNA參與該_ 昤操縱子之基因表現而改良下圔所示之DAN順序之部份， 以增加基因表現： 「Ε?σ[1Υ., 10 20 30 40 50 5' GpTAT匚TGCC TGTAAGGCGA ATGGAAGAGC CTATTTTTAT. GGAAAAAAAG 60 70 Π0 90 100 GAAAATGGGT CAATTCAGAT CGTTCCGTQC GGGAAAAAAA TCGTATTTGA 110 120 130 140 150 AGGGAAATTG ATCTAAAACA CGAACATTAG ^AGAATGAAT TTTTGTATCG 160 170 100 190! 200 TTCGATAATA TCGTTGACAT TATCCATGTC CGTTGTTAAG ΛΤΛΛΛ(：ΛΤσΛ '-35 ' 210 220 230 24Q 250 AATCAAAACA CGACCTCA’liA TAATCTTGGG AATATGGCCC.ATAAGTTTCT 260 270 280 290 300 ACCCGGCAAC CGTAAATTGC CGGACTATGC AGGAAAGTGA TCGATAAAAC .J10 320 330 340 350 TQ、CATGG/、T ATATCGCAGA AGCGAACG/'C TGACGATACA TGTACCATGC 360 370 380 390 400 CCGGTTTGTA TTGCTTCCTC ATAAGTGCAA TGCAGAGCGG.GTATTTTTTA 410 420 Ί30 440 450 TTTTCTGAAA ACAAAAGCAT TAGAAGGTGG GGAACAGAAT GCAGCCGCTA Inifciahicn αα&η IpxE) -460 470 400 490 500 GTAGGAATCA TCATGGGAAG CACTTCCGAT TGGGAGACAA·TGAAACAC.GC ATGC, ..Sph i

   甲4(210X297公趑）80. 5· 5,000張(Η) Η3 其中經改良之D Ν Α是關於以相當於上述D H Α順序之1 6 4〜 1 9 2塩基之嘌昤操縱子的啓動因子；且該嘌昤操縱子的 啓動因子被由屬於枯草捍_的撤生物，或屬於枯m捏蘭 的微生物的噬菌體之染色體DMA衍生之不同表現的啓動 因子代替。 2 . —種生産次黃嗉昤核苷以及/或鳥苷的方法，其包括於 培養基中培養以申請專利範圍第1項之DNA轉形之屬於 枯草桿菌的微生物，以生産並累積次黃嘌昤核甘以及/ 或鳥苷，並且收集産物。 3. —種生産次黃嘌昤核f以及/或鳥节的方法，其包括於 培養基中培養以申諳專利範圍笫1項之DNA整合之載體 轉形之屬於枯·_草桿菌釣徹生物，以生産並累積次黃嘌昤 核甘以及/或鳥甘，並且收集産物。 甲4(210X2972殚）80. 5ι 5,000張(11) 2