TW201742636A - 聯合療法 - Google Patents

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史考特 寇尼格
萊斯利 強生
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Abstract

本發明涉及用於治療癌症和病原體相關疾病的聯合療法，其包括施用：(1)能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子(例如，雙抗體、ScFv、抗體、TandAb等)，和(2)能夠介導對表達疾病抗原的靶細胞(例如，癌細胞或病原體感染的細胞等)的重定向殺傷的分子(例如，雙抗體、BiTe、雙特異性抗體、CAR等)。本發明尤其涉及其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子是雙特異性結合分子的實施方式，其中所述雙特異性結合分子包含能夠免疫特異性結合效應細胞的細胞表面分子的表位的第一表位結合位點和能夠免疫特異性結合這類靶細胞(即，疾病抗原如癌抗原或病原體相關抗原)的表位的第二表位結合位點。本發明還涉及包含這類分子(一種或多種)的藥物組合物。

Description

聯合療法
[相關申請的交叉引用]
本申請主張美國專利申請案第62/346,854號(於2016年6月7日提交；申請中)和第62/432,299號(於2016年12月9日提交；申請中)的優先權，每一申請案通過引用以其整體併入本文。
[序列表的參考]
根據37 C.F.R. 1.821以及下面的條款，本申請包括一個或多個序列表，其以電腦-可讀介質(檔案名：1301_0142TW_ST25.txt，2017年6月5日創建，並且大小為223,132位元組)公開，該檔通過引用以其整體併入本文。
本發明涉及用於治療癌症和病原體相關疾病的聯合療法，其包括施用：(1)能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子(例如，雙抗體、ScFv、抗體、TandAb等)，和(2)能夠介導對表達疾病抗原的靶細胞(例如，癌細胞或病原體感染的細胞等)的重定向殺傷的分子(例如，雙抗體、BiTe、雙特異性抗體、CAR等)。本發明尤其涉及其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子是雙特異性結合分子的實施方式，其中所述雙特異性結合分子包含能夠免疫特異性結合效應細胞的細胞表面分子的表位的第一表位結合位點和能夠免疫特異性結合這種靶細胞(即，疾病抗原如癌抗原或病原體相關抗原)的表位的第二表位結合位點。本發明還涉及包含這類分子(一種或多種)的藥物組合物。
I . 哺乳動物免疫系統 哺乳動物免疫系統用作抵抗各種病況的防禦，所述病況包括，例如損傷、感染和瘤形成。人類和其他哺乳動物發展對病原體、外來物質和癌抗原的免疫學應答的效率取決於兩個特徵：免疫應答對抗原識別的精緻特異性，以及在以相同抗原再啟動後允許更快和更有力的應答的免疫記憶(Portolés, P.等人, (2009) “The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination ,” Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300；Guy, C.S.等人, (2009) “Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex ,” Immunol Rev. 232(1):7-21；Topalian, S.L.等人, (2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy ,” Cancer Cell 27:450-461)。
在健康的個體中，免疫系統處於靜態，其受到各種抑制性受體和受體配體的庫(repertoire)的抑制。在識別癌抗原、微生物病原體或過敏原後，一系列啟動受體和受體配體被觸發以誘導免疫系統的啟動。這類啟動引起巨噬細胞、天然殺傷(NK)細胞和抗原特異性細胞毒性T-細胞的啟動，並且促進各種細胞因數的釋放，其中全部用來反抗感知的對受試者健康的威脅(Dong, C.等人, (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48；Viglietta, V.等人, (2007) “Modulating Co-Stimulation ,” Neurotherapeutics 4:666-675；Korman, A.J.等人, (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy ,” Adv. Immunol. 90:297-339)。當抗衡的抑制性免疫信號強過啟動免疫信號時，免疫系統能夠返回至其正常的靜態。
因此，可認為癌症的疾病狀態(以及甚至傳染病的疾病狀態)反映了未能適當啟動受試者的免疫系統。這種失敗可反映啟動免疫信號的不充分的呈遞，或其可反映減少受試者中的抑制性免疫信號的能力不足。在一些情況中，研究者已經確定癌細胞能夠拉攏(co-opt)免疫系統以避免被免疫系統檢測到(Topalian, S.L.等人, (2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy ,” Cancer Cell 27:450-461)。
哺乳動物免疫系統通過兩個分開但是相關的系統：體液免疫系統和細胞免疫系統介導。通常來講，體液系統通過由B 細胞 產生的可溶分子(抗體或免疫球蛋白)介導。這類分子具有結合和中和已被識別為對於身體是外來的抗原的能力。細胞免疫系統涉及起到各種治療作用的稱為“T 細胞 ”的某些細胞的動員。T細胞是在胸腺中成熟並且在組織、淋巴系統和循環系統間迴圈的淋巴細胞。響應於外來結構(抗原)的存在和識別，T細胞成為“啟動的 ”以啟動免疫應答。在許多情況中，由於瘤形成或感染，這些外來抗原在宿主細胞上表達。雖然T細胞本身不分泌抗體，但是它們通常是為第二類淋巴細胞B 細胞 (其衍生自骨髓)進行抗體分泌所必需的。關鍵的是，T細胞具備特別的免疫特異性，從而能夠區分一種抗原與另一種抗原)。
兩種相互作用對於T細胞啟動是必需的(Viglietta, V.等人, (2007) “Modulating Co-Stimulation ,” Neurotherapeutics 4:666-675；Korman, A.J.等人, (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy ,” Adv. Immunol. 90:297-339)。在第一種相互作用中，細胞必須展示結合至細胞的I類或II類主要組織相容性複合體(“MHC ”)的相關靶抗原，以使其可結合幼稚T淋巴細胞的T細胞受體(“TCR ”)。雖然幾乎所有細胞類型皆可用作抗原呈遞細胞，但是一些細胞如巨噬細胞、B細胞和樹突細胞專門呈遞外源性抗原因而是“專業的”“抗原抗原呈遞細胞”。結合至抗原呈遞細胞的MHC I類分子的抗原的免疫檢測導致產生細胞毒性T細胞。結合至抗原呈遞細胞的MHC II類分子的抗原的免疫檢測導致產生細胞毒性T細胞。在第二種相互作用中，抗原呈遞細胞的配體必須結合T細胞的共受體(Dong, C.等人, (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48；Lindley, P.S.等人, (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation ,” Immunol. Rev. 229:307-321)。經歷兩種刺激信號的T細胞然後能夠響應細胞因數(如白介素-2和白介素-12)。
在TCR接合(TCR engagement)期間沒有兩種共同刺激信號的情況下，T細胞進入功能上無應答狀態，其稱作克隆無反應性(Khawli, L.A.等人, (2008) “Cytokine , Chemokine , and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors ,” Exp. Pharmacol. 181:291-328)。在病理狀態中，T細胞是各種器官特異性自身免疫疾病，如I型糖尿病、類風濕性關節炎和多發性硬化症的關鍵作用因素(Dong, C.等人, (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48)。
該免疫“檢查點”途徑在維持自身耐受性(即， 防止受試者對他/她自己的細胞進行免疫系統攻擊(“自身免疫”反應))中並且在抗微生物或抗過敏免疫應答期間限制附屬組織損傷中是重要的。在T細胞的接觸導致產生兩種所需信號中的僅一種的情況中，T細胞不會啟動並且適應性免疫應答不會發生。因此，T細胞啟動的“兩種信號”機制為免疫系統避免不期望的應答提供一種手段，所述不期望的應答如對以其他方式導致對受試者的自身細胞的免疫系統攻擊(“自身免疫”反應)的自身抗原的應答。 II. 細胞免疫***的細胞表面分子 A．CD3、CD4和CD8
免疫系統的細胞特徵在於其專門的糖蛋白細胞表面分子的表達。這類分子和其它細胞分子之間的相互作用觸發、維持或阻抑免疫應答。具體的，所有T細胞特徵在於其CD3 的表達。CD3是包括四條不同鏈的T細胞共受體(Wucherpfennig, K.W.等人, (2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140；1-14頁；Chetty, R.等人, (1994) “CD3 : Structure , Function , And Role Of Immunostaining In Clinical Practice ,” J. Pathol. 173(4):303-307；Guy, C.S.等人, (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex ,” Immunol. Rev. 232(1):7-21)。
在哺乳動物中，複合物包含CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈。這些鏈與TCR締合，以在T淋巴細胞中產生啟動信號(Smith-Garvin, J.E.等人, (2009) “T cell Activation ,” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619)。在沒有CD3的情況下，TCR不正確組裝並且被降解(Thomas, S.等人, (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2):170–177)。發現CD3結合至所有成熟T細胞的膜，並且實際上不結合其它細胞類型的膜(參見，Janeway, C.A.等人, (2005) 在以下中：Immunobiology: The IMMUNE SYSTEM In Health And Disease,”第六版, Garland Science Publishing, NY, 214- 216頁；Sun, Z. J.等人, (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3 ε : γ Heterodimer ,” Cell 105(7):913-923；Kuhns, M.S.等人, (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex ,” Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139)。
T細胞上的TCR複合物的恆定CD3ε信號組分已經被用作靶標以迫使在T細胞和癌細胞之間形成免疫突觸。CD3和腫瘤抗原的共接合啟動T細胞，觸發表達腫瘤抗原的癌細胞的裂解(Baeuerle等人, (2011) “Bispecific T Cell Engager For Cancer Therapy ,” 在以下中：Bispecific ANTIBODIES, Kontermann, R.E. (Ed.) Springer-Verlag；2011:273-287)。該途徑允許雙特異性抗體以對癌細胞的高特異性全面地與T細胞室(T cell compartment)相互作用，並且廣泛適用於一系列的細胞表面腫瘤抗原，並且也已經被實施以靶向病原體感染的細胞(參見，例如，Sloan等人(2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells ,” PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233；WO 2014/159940；和WO 2016/054101)。
T細胞的第一子集，稱為“輔助 T 細胞 ”，特徵在於CD4 的表達(即，他們是“CD4+ ”)。CD4+ T細胞是大多數哺乳動物免疫應答和自身免疫應答的主要組織者(Dong, C.等人, (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48)。已經發現CD4+ T細胞的啟動通過抗原：主要組織相容性II類(MHC II )分子複合物和兩種分子(TCR和CD3 細胞表面受體配體)的複合物之間的共刺激相互作用被介導，其中所述MHC II分子複合物排列在抗原呈遞細胞(如B細胞、巨噬細胞或樹突細胞)的表面上，所述TCR和CD3細胞表面受體配體兩者皆排列在幼稚CD4+ T細胞的表面上。啟動的T輔助細胞能夠增殖成Th1細胞，所述Th1細胞能夠介導對靶細胞的炎症反應。
T細胞的第二子集，稱為“細胞毒性 T 細胞 ”，特徵在於CD8 的表達(即，它們是“CD8+”以及CD3+ )。CD8是包括兩條不同的鏈的T-細胞共受體(Leahy, D.J. (1995) “A Structural View of CD4 and CD8 ,” FASEB J. 9:17-25)，其在細胞毒性T細胞上表達。已經發現CD8+ T細胞的啟動通過抗原：主要組織相容性I類(MHC I )分子複合物以及CD8和T細胞受體的複合物之間的共刺激相互作用被介導，其中所述MHC I分子複合物排列在靶細胞的表面上，並且所述CD8和T細胞受體排列在CD8+ T細胞的表面上((Gao, G.等人, (2000) “Molecular Interactions Of Coreceptor CD8 And MHC Class I: The Molecular Basis For Functional Coordination With The T-Cell Receptor,” Immunol. Today 21:630-636)。與僅通過某些免疫系統細胞表達的主要組織相容性II類(MHC II )分子不同，MHC I類分子被非常廣泛地表達。因此，細胞毒性T細胞能夠結合許多種類的細胞類型。啟動的細胞毒性T細胞通過其釋放細胞毒素穿孔素、粒酶和粒溶素來介導細胞殺傷。通過穿孔素的作用，粒酶進入靶細胞的細胞質，並且它們的絲氨酸蛋白酶作用觸發胱天蛋白酶級聯系統，其是最終導致靶向的細胞的凋亡(程式性細胞死亡)的一系列半胱氨酸蛋白酶。 B. CD2
CD2 是在T-細胞和天然殺傷(NK)細胞的表面上發現的細胞黏附分子。CD2增強NK細胞毒性，可能作為NK細胞納米管形成的啟動子(Mace, E.M.等人, (2014) “Cell Biological Steps and Checkpoints in Accessing NK Cell Cytotoxicity ,” Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255；Comerci, C.J.等人, (2012) “CD2 Promotes Human Nature Killer Cell Membrane Nanotube Formation ,” PLoS One 7(10):e47664:1-12). C. T細胞受體(“TCR”)
T細胞受體(“TCR ”)由CD4+或CD8+ T細胞天然表達，並且允許這類細胞識別抗原肽，所述抗原肽通過抗原呈遞細胞的I類或II類MHC蛋白質結合和呈遞。通過TCR識別pMHC (肽–MHC)複合物引發導致細胞因數產生和抗原呈遞細胞裂解的細胞免疫應答的傳播(參見，例如，Armstrong, K.M.等人, (2008) “Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide–MHC Complexes ,” Biochem. J. 415(Pt 2):183–196；Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragment s Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy ,” Cytometry A. 73(11):1093-1099；Beier, K.C.等人, (2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation ,” Eur. Respir. J. 29:804-812；Mallone, R.等人, (2005) “Targeting T Lymphocyte s For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes ,” Am. J. Ther. 12(6):534–550)。CD3是結合至TCR的受體 (Thomas, S.等人, (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2):170-177；Guy, C.S.等人, (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex ,” Immunol. Rev. 232(1):7-21；St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity ,” Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657；Baeuerle, P.A.等人, (於2009年6月9日電子出版) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944；Smith-Garvin, J.E.等人, (2009) “T Cell Activation ,” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619；Renders, L.等人, (2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression ,” Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309)。
TCR和CD3複合物，連同CD3 ζ鏈ζ鏈(也稱為T細胞受體T3ζ鏈或CD247)構成“TCR 複合物 ” (van der Merwe, P.A. 等(於2010年12月3日電子出版) “Mechanisms For T Cell Receptor Triggering ,” Nat. Rev. Immunol. 11:47-55；Wucherpfennig, K.W.等人, (2010) “Structural Biology of the T Cell Receptor : Insights into Receptor Assembly , Ligand Recognition , and Initiation of Signaling ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140)。複合物是尤其重要的，因為其包含大量(十種)的基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(ITAM)。 D．Fc受體：CD16、CD32和CD64
如以下詳細討論的，天然IgG抗體包括四條多肽鏈：兩條相同的“輕”鏈和兩條相同的“重”鏈。重鏈包含C-末端“CH2”和“CH3”結構域，並且兩條重鏈的締合形成“Fc 結構域 ”，其能連接(結合)至多種類型的免疫系統細胞(例如，B淋巴細胞、濾泡樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、中性白細胞、嗜酸性細胞、嗜鹼性細胞和肥大細胞)的表面上發現的受體(單個稱為“Fcγ 受體 ”“Fc γ R ”，並且統稱為“Fc γ Rs ”)。這類受體具有“細胞外 ”部分(其因而能夠連接至Fc結構域)，“跨膜 ”部分(其延伸通過細胞膜)和“細胞質 ”部分(位於細胞內)。已鑑定多種類型的FcγRs：CD16A (Fc γ RIIIA )、CD16B (Fc γ RIIIB )、CD32A (Fc γ RIIA )、CD32B (Fc γ RIIB )和CD64 (Fc γ RI )。這類結合導致啟動信號或抑制性信號向免疫系統的轉導。
CD16 是啟動Fc受體、Fc γ RIIIA (CD16A )和Fc γ RIIIB (CD16B )的一般名稱。CD16通過中性白細胞、嗜酸性細胞、天然殺傷(NK)細胞和結合聚集的但不是單體的人IgG的組織巨噬細胞表達(Peltz, G.A.等人, (1989) “Human Fc Gamma RIII : Cloning , Expression , And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017；Bachanova, V.等人, (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer ,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141；Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications ： Natural killer C ells In The Clinic ,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253；Youinou, P.等人, (2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases ,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19；Peipp, M.等人, (2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cell s ,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511)。這些受體結合IgG抗體的Fc部分，從而觸發細胞因數的釋放。如果這類抗體被結合至在細胞(例如，癌細胞，病原體感染細胞等)表面上表達的疾病抗原，那麼這樣的釋放介導對靶向細胞的殺傷。由於這樣的殺傷是抗體依賴性的，其被命名為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC )。
CD32A (FcγRIIA ) (Brandsma, A.M. (2015) “FcReceptor Inside-Out Signaling And Possible Impact On Antibody Therapy,” Immunol Rev. 268(1):74-87；van Sorge, N.M.等人, (2003) “FcgammaR Polymorphisms : Implications For Function , Disease Susceptibility And Immunotherapy ,” Tissue Antigens 61(3):189-202；Selvaraj, P.等人, (2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors,” Immunol. Res. 29(1-3):219-230)和CD64 (FcγRI ) (Lu, S.等人, (2015) “Structural Mechanism Of High Affinity FcγRI recognition Of Immunoglobulin G,” Immunol. Rev. 268(1):192-200；Swisher, J.F.等人, (2015) “The Many Faces Of FcγRI：Implications For Therapeutic Antibody Function,” Immunol. Rev. 268(1):160-174；Thepen，T.等人, (2009) “FcgammaReceptor 1 (CD64), A Target Beyond Cancer,” Curr. Pharm. Des. 15(23):2712-2718；Rouard, H.等人, (1997) “Fc Receptors As Targets For Immunotherapy,” Int. Rev. Immunol. 16(1-2):147-185)是巨噬細胞、中性白細胞、嗜酸性細胞和樹突細胞上(並且對於CD32A ，還在血小板和朗格漢斯細胞上)表達的啟動Fc受體。相比之下，CD32B (Fc γ RIIB )是B淋巴細胞(巨噬細胞、中性白細胞和嗜酸性細胞)上的抑制性Fc受體(Stopforth, R.J.等人, (2016) “Regulation of Monoclonal Antibody Immunotherapy by FcγRIIB,” J. Clin. Immunol. [於2016年2月27日電子出版], 1-7頁；Bruhns, P.等人, (2009) “Specificity And Affinity Of Human Fcgamma Receptors And Their Polymorphic Variants For Human IgG Subclasses,” Blood. 113(16):3716-3725；White, A.L.等人, (2014) “FcγRIIB As A Key Determinant Of Agonistic Antibody Efficacy,” Curr. Top. Microbiol. Immunol. 382:355-372；Selvaraj, P.等人, (2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors ,” Immunol. Res. 29(1-3):219-230)。
不同FcγRs介導完全相反的作用的能力反映了其結構的不同，尤其是FcγR是具有基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(“ITAM ”)還是具有基於免疫受體酪氨酸的抑制性基序(“ITIM ”)。不同細胞質酶向這些結構的募集支配FcγR-介導的細胞應答的結果。含ITAM的FcγRs包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，並且當結合至Fc結構域(例如，存在於免疫複合物中的聚集的Fc結構域)時啟動免疫系統。FcγRIIB是目前唯一已知的含ITIM的天然FcγR；當結合至聚集的Fc結構域時，其用來阻抑或抑制免疫系統。 E．NKG2D受體
天然殺傷細胞組2D(“NKG2D ”)受體在所有人類(和其他哺乳動物)天然殺傷細胞上表達(Bauer, S.等人, (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D , A Receptor For Stress-Inducible MICA ,” Science 285(5428):727-729；Jamieson, A.M.等人, (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1):19-29)以及在所有CD8+ T細胞上表達(Groh, V.等人, (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells ,” Nat. Immunol. 2(3):255-260；Jamieson, A.M.等人, (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1):19-29)。在正常細胞表面上，NKG2D配體完全不存在，或僅以低水準存在，但是其由被感染的、轉化的、衰老的或受脅迫的細胞過表達。這類結合配體，尤其是在正常細胞上不表達的那些，包括組織相容性60 (H60)分子、視黃酸早期可誘導基因-1(RAE-1)的產物和鼠科UL16-結合蛋白質樣轉錄物1 (MULT1) (Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands ,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790；Coudert, J.D.等人, (2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand- Expressing Tumor Cells ,” Blood 106:1711-1717)。 III. 免疫系統細胞的相互作用分子
涉及幾種不同類型的抗原呈遞細胞分子和T細胞分子的相互作用影響所需的免疫應答的第二種相互作用。 A．CD80/CD86和CD28/CTLA-4
抗原呈遞細胞的B7.1 (CD80 )和B7.2 (CD86 )配體以及CD4+ T淋巴細胞的CD28 和CTLA-4 受體之間的結合對於所需的免疫應答的第二種相互作用是特別重要的(Sharpe, A.H.等人, (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126；Dong, C.等人, (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48；Lindley, P.S.等人, (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation ,” Immunol. Rev. 229:307-321)。B7.1或B7.2與CD28的結合刺激T-細胞啟動；B7.1或B7.2與CTLA-4的結合抑制這樣的啟動(Dong, C.等人, (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48；Lindley, P.S.等人, (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation ,” Immunol. Rev. 229:307-321；Greenwald, R.J.等人, (2005) “The B7 Family Revisited ,” Ann. Rev. Immunol. 23:515-548)。CD28在T-細胞的表面上組成型表達(Gross, J.，等人, (1992) “Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse ,” J. Immunol. 149:380–388)，而CTLA-4表達在T-細胞啟動後被快速上調(Linsley, P.等人, (1996) “Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement ,” Immunity 4:535–543)。由於CTLA-4是更高親和性的受體(Sharpe, A.H.等人, (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126；Topalian, S.L.等人, (2015) “Immune Checkpoint Blockade : A Common Denominator Approach to Cancer Therapy ,” Cancer Cell 27:450-461)，結合首先(經由CD28)啟動T-細胞增殖，然後抑制它(經由CTLA-4的新生表達)，從而當不再需要增殖時阻抑該作用。 B．PD-1和B7-H1/B7-DC
程式性死亡-1 (“PD-1 ”，還稱為“CD279”)是廣泛負調節免疫應答的T-細胞調節劑的擴展的CD28/CTLA-4家族的I型膜蛋白成員(Ishida, Y.等人, (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death ,” EMBO J. 11:3887-3895；美國專利公開號2007/0202100；2008/0311117；2009/00110667；美國專利號6,808,710；7,101,550；7,488,802；7,635,757；7,722,868；PCT專利公開號WO 01/14557)。
雖然PD-1和CTLA-4皆提供抑制性免疫信號，但是由PD-1提供的信號隨後在疾病過程中上升，並且可通過限制回應疾病的T-細胞的初始產量(“突發(burst)”)而充分減弱免疫應答。因此，這類PD-1可部分地將潛在有效的T-細胞應答轉化為耐受性中的一種(Topalian, S.L.等人, (2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy ,” Cance Cell 27:450-461)。
PD-1系統的受體-配體相互作用似乎比CD28/CTLA-4系統的那些甚至更複雜。PD-1在啟動的T-細胞、B-細胞和單核細胞的細胞表面上表達(Agata, Y.等人, (1996) “Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes ,” Int. Immunol. 8(5):765-772；Yamazaki, T.等人, (2002) “Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And APC ,” J. Immunol. 169:5538-5545)，並且以低水準在天然殺傷(NK) T-細胞中表達(Nishimura, H.等人, (2000) “Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice ,” J. Exp. Med. 191:891-898；Martin-Orozco, N.等人, (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity ,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。
PD-1的胞外區由與CTLA-4中的等同結構域具有23%同一性的單一免疫球蛋白(Ig)V結構域組成(Martin-Orozco, N.等人, (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity ,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。細胞外IgV結構域後面是跨膜區和胞內尾部。胞內尾部包含位於基於免疫受體酪氨酸的抑制性基序和基於免疫受體酪氨酸的轉換基序中的兩個磷酸化位點，這表明PD-1負調節TCR信號(Ishida, Y.等人, (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death ,” EMBO J. 11:3887-3895；Blank, C.等人, (2006) “Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer ,” Immunol. Immunother. 56(5):739-745)。
PD-1通過結合B7-H1 和B7-DC (也稱為PD-L1和PD-L2)介導其對免疫系統的抑制(Flies, D.B.等人, (2007) “The New B7s : Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity ,” J. Immunother. 30(3):251-260；美國專利號6,803,192；7,794,710；美國專利公開號2005/0059051；2009/0055944；2009/0274666；2009/0313687；PCT專利公開號WO 01/39722；WO 02/086083)。
B7-H1和B7-DC在許多類型的人和鼠科組織的表面上廣泛表達，所述組織如心臟、胎盤、肌肉、胎肝、脾、淋巴結和胸腺以及鼠科肝、肺、腎、胰腺的胰島細胞以及小腸(Martin-Orozco, N.等人, (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity ,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。在人類中，B7-H1蛋白質表達已經在以下中發現：人類內皮細胞(Chen, Y.等人, (2005) “Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells ,” Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92；de Haij, S.等人, (2005) “Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1 ” Kidney Int. 68:2091-2102；Mazanet, M.M.等人, (2002) “B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis ,” J. Immunol. 169:3581-3588)、心肌(Brown, J.A.等人, (2003) “Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production ,” J. Immunol. 170:1257-1266)、合胞體滋養層(Petroff, M.G.等人, (2002) “B7 Family Molecules : Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface ,” Placenta 23:S95-S101)。分子也通過一些組織的駐留型巨噬細胞、通過已經經干擾素(IFN)-γ或腫瘤壞死因數(TNF)-α啟動的巨噬細胞表達(Latchman, Y.等人, (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation ,” Nat. Immunol 2:261-268)以及在腫瘤中表達(Dong, H. (2003) “B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity ,” J. Mol. Med. 81:281-287)。
已發現B7-H1和PD-1之間的相互作用向T細胞和B細胞提供關鍵的負共刺激信號(Martin-Orozco, N.等人, (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity ,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)，並且用作細胞死亡誘導物(Ishida, Y.等人, (1992) “Induced Expression Of PD-1 ， A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily , Upon Programmed Cell Death ,” EMBO J. 11:3887-3895；Subudhi, S.K.等人, (2005) “The Balance Of Immune Response s : Costimulation Verse Coinhibition ,” J. Molec. Med. 83:193-202)。更具體的，已發現低濃度PD-1受體和B7-H1配體之間的相互作用導致抑制性信號的傳輸，所述抑制性信號強烈抑制抗原特異性CD8+ T細胞的增殖；在更高濃度，與PD-1的相互作用未抑制T細胞增殖，但是明顯地降低多種細胞因數的產生(Sharpe, A.H.等人, (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。已發現通過靜息CD4和CD8 T細胞和先前啟動的CD4和CD8 T細胞以及甚至來自臍帶血的幼稚T-細胞進行的T-細胞增殖和細胞因數產生，受到可溶性B7-H1-Fc融合蛋白的抑制(Freeman, G.J.等人, (2000) “Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation ,” J. Exp. Med. 192:1-9；Latchman, Y.等人, (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation ,” Nature Immunol. 2:261-268；Carter, L.等人, (2002) “PD-1: PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2 ,” Eur. J. Immunol. 32(3):634-643；Sharpe, A.H.等人, (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。
B7-H1和PD-1在抑制T細胞啟動和增殖中的作用已經表明這些生物分子可用作用於治療炎症和癌症的治療用靶標。因此，已經提出使用抗-PD-1抗體治療感染和腫瘤並且上調節適應性免疫應答(參見，美國專利公開號2010/0040614；2010/0028330；2004/0241745；2008/0311117；2009/0217401；美國專利號7,521,051；7,563,869；7,595,048；PCT專利公開號WO 2004/056875；WO 2008/083174)。能夠特異性結合PD-1的抗體已經由下述文獻提出：Agata, T.等人, (1996) “Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes ,” Int. Immunol. 8(5):765-772；和Berger, R.等人, (2008) “Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011 ， A Humanized Antibody Interacting With PD-1 , In Patients With Advanced Hematologic Malignancies ,” Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051 (也參見，美國專利號8,008,449和8,552,154；美國專利公開號2007/0166281；2012/0114648；2012/0114649；2013/0017199；2013/0230514和2014/0044738；和PCT專利公開號WO 2003/099196；WO 2004/004771；WO 2004/056875；WO 2004/072286；WO 2006/121168；WO 2007/005874；WO 2008/083174；WO 2009/014708；WO 2009/073533；WO 2012/135408，WO 2012/145549；和WO 2013/014668)。
儘管在鑑定參與哺乳動物免疫應答的分子中的這類進步，對於治療癌症和傳染病的改進療法仍存在需要。本發明涉及該目標和其它目標。
本發明涉及用於治療癌症和病原體相關疾病的聯合療法，其包括施用：(1)能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子(例如，雙抗體、ScFv、抗體、TandAb等)，和(2)能夠介導對表達疾病抗原的靶細胞(例如，癌細胞或病原體感染的細胞等)的重定向殺傷的分子(例如， 雙抗體、BiTe、雙特異性抗體、CAR等)。本發明尤其涉及其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子是雙特異性結合分子的實施方式，所述雙特異性結合分子包含能夠免疫特異性結合效應細胞的細胞表面分子的表位的第一表位結合位點和能夠免疫特異性結合這類靶細胞(即，疾病抗原如癌抗原或病原體相關抗原)的表位的第二表位結合位點。本發明還涉及包含這類分子(一種或多種)的藥物組合物。
詳細地，本發明提供用於治療癌症或病原體相關疾病的方法，其包括向需要其的受試者施用治療有效量的： (1) 能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子，和 (2) 能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子，其中所述靶細胞是： (a) 表達癌抗原的癌細胞；或 (b) 表達病原體相關抗原的病原體感染細胞。
本發明尤其涉及其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子能夠抑制PD-1和PD-1的天然配體之間的結合的這類方法的實施方式。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中所述方法包括施用兩種結合分子，其累計地包括三個表位-結合結構域，所述兩種結合分子是： (A) 結合分子，其包含能夠結合PD-1的抗體的表位元-結合結構域或能夠結合PD-1的天然配體的抗體的表位元-結合結構域；和 (B) 結合分子，其包含以下： (1) 能夠結合效應細胞的細胞表面分子的抗體的表位元-結合結構域；和 (2) 能夠結合靶細胞的癌抗原或病原體抗原的抗體的表位元-結合結構域； 其中所述結合分子(A)的表位元-結合結構域能夠結合PD-1或PD-1的天然配體，並且結合分子(B)的表位元-結合結構域(1)和(2)能夠介導對靶細胞的重定向殺傷。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的結合分子包括雙抗體、ScFv、抗體或TandAb，並且所述結合分子(B)包括雙特異性雙抗體、CAR、BiTe或雙特異性抗體。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的結合分子包含結合至PD-1的抗體的表位-結合結構域。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的結合分子包含結合至PD-1的天然配體的抗體的表位-結合結構域。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的結合分子包含能夠結合PD-1的第二表位-結合結構域，其中這類表位-結合結構域： (a) 競爭結合PD-1的相同表位；或 (b) 不競爭結合PD-1的相同表位。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中PD-1表位-結合結構域能夠同時結合至相同的PD-1分子。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的結合分子包含能夠結合PD-1的天然配體的第二表位-結合結構域，其中這類表位-結合結構域： (a) 競爭結合至PD-1的這類天然配體的相同表位；或 (b) 不競爭結合至PD-1的這類天然配體的相同表位。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中PD-1配體-表位-結合結構域能夠同時結合PD-1的天然配體的相同分子。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的結合分子包含第二表位-結合結構域，其能夠結合不是PD-1或PD-1的天然配體的分子的表位。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中第二表位元-結合結構域結合CD137、LAG-3、OX40、TIGIT、TIM-3或VISTA的表位。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的結合分子包含能夠結合效應細胞的細胞表面分子的第三表位-結合結構域。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的結合分子的第三表位結合-結構域能夠結合效應細胞的不同細胞表面分子，以使能夠介導重定向殺傷的結合分子能夠結合效應細胞的兩種不同細胞表面分子。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的結合分子包含能夠結合至靶細胞的癌抗原或病原體相關抗原的第三表位-結合結構域。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的結合分子的第三表位結合-結構域能夠結合靶細胞的不同癌抗原或不同病原體抗原，以使能夠介導重定向殺傷的結合分子能夠結合至靶細胞的兩種不同癌抗原或兩種不同病原體抗原。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中效應細胞的細胞表面分子選自：CD2、CD3、CD8、CD16、TCR和NKG2D。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中所述癌抗原選自以下癌抗原：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-聯蛋白、血型ALeb /Ley 、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、細胞角蛋白8、D1.1、D1 56-22、DR5、E1 系列、EGFR、肝配蛋白受體、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神經節苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整聯蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4全癌抗原、L6,L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、間皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙醯葡糖氨基轉移酶、擬糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制癌蛋白M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、***酸磷酸鹽(prostatic acid phosphate)、R24 、ROR1、鞘脂類、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T細胞受體衍生的肽、T5 A7 、TAG-72、TL5、TNF-受體、TNF-γ受體、TRA-1-85、轉鐵蛋白受體、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受體、VEP8、VEP9、VIM-D5和Y半抗原Ley 。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中所述方法包括施用藥物組合物，並且其中所述病原體相關抗原選自以下病原體相關抗原：單純皰疹病毒感染的細胞蛋白質(ICP)47、單純皰疹病毒gD、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr)LMP-1、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2A、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2B、人免疫缺陷病毒gp160、人免疫缺陷病毒gp120、人免疫缺陷病毒gp41等)、人乳頭瘤病毒E6、人乳頭瘤病毒E7、人T-細胞白血病病毒gp64、人T-細胞白血病病毒gp46和人T-細胞白血病病毒gp21。
本發明進一步提供藥物組合物，其包含： (A) 治療有效量的： (1) 能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子，和 (2) 能夠介導對表達癌抗原或病原體抗原的靶細胞的重定向殺傷的分子；和 (B) 藥學可接受的載體。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中所述藥物組合物包含兩種結合分子，其累計地包含三個表位-結合結構域，所述兩種結合分子是： (A) 結合分子，其包含能夠結合PD-1的抗體的表位元-結合結構域或能夠結合PD-1的天然配體的抗體的表位元-結合結構域；和 (B) 結合分子，其包含以下： (1) 能夠結合效應細胞的細胞表面分的抗體的表位元-結合結構域；和 (2) 能夠結合靶細胞的癌抗原或病原體相關抗原的抗體的表位元-結合結構域； 其中結合分子(A)的表位元-結合結構域能夠結合PD-1或PD-1的天然配體，並且結合分子(B)的表位元-結合結構域(1)和(2)能夠介導對靶細胞的重定向殺傷。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中所述結合分子(A)包括雙抗體、ScFv、抗體或TandAb，並且所述結合分子(B)包括雙抗體、CAR、BiTe或雙特異性抗體。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述分子包含結合至PD-1的抗體的表位-結合結構域。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述分子包含結合至PD-1的天然配體的抗體的表位-結合結構域。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述分子包含能夠結合PD-1的第二表位-結合結構域，其中這類PD-1-表位-結合結構域： (a) 競爭結合至PD-1的相同表位；或 (b) 不競爭結合PD-1的相同表位。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中所述PD-1表位-結合結構域能夠同時結合相同PD-1分子。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包含能夠結合PD-1的天然配體的第二表位-結合結構域，其中這類表位-結合結構域： (a) 競爭結合至PD-1的這類天然配體的相同表位；或 (b) 不競爭結合至PD-1的這類天然配體的相同表位。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中所述PD-1配體表位-結合結構域能夠同時結合PD-1的天然配體的相同分子。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包含第二表位-結合結構域，其能夠結合不是PD-1或PD-1的天然配體的分子的表位。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中第二表位元-結合結構域結合CD137、LAG-3、OX40、TIGIT、TIM-3或VISTA的表位。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的所述分子包含第三表位-結合結構域，其中這樣的三個表位-結合結構域能夠同時結合，並且其中第三表位-結合位點能夠結合效應細胞的細胞表面分子的表位。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的結合分子的第三表位結合-結構域能夠結合效應細胞的不同細胞表面分子，以使能夠介導重定向殺傷的所述結合分子能夠結合效應細胞的兩種不同細胞表面分子。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的所述結合分子包含能夠結合至靶細胞的癌抗原或病原體相關抗原的第三表位-結合結構域。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的結合分子的第三表位結合-結構域能夠結合靶細胞的不同癌抗原或不同病原體相關抗原，以使能夠介導重定向殺傷的所述結合分子能夠結合至靶細胞的兩種不同癌抗原或兩種不同病原體相關抗原。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中效應細胞的細胞表面分子選自：CD2、CD3、CD8、CD16、TCR和NKG2D。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中癌抗原選自以下癌抗原：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-聯蛋白、血型ALeb /Ley 、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、細胞角蛋白8、D1.1、D1 56-22、DR5、E1 系列、EGFR、肝配蛋白受體、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神經節苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整聯蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4全癌抗原、L6,L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、間皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙醯葡糖氨基轉移酶、擬糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制癌蛋白M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、***酸磷酸鹽、R24 、ROR1、鞘脂類、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T細胞受體衍生的肽、T5 A7 、TAG-72、TL5、TNF-受體、TNF-γ受體、TRA-1-85、轉鐵蛋白受體、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受體、VEP8、VEP9、VIM-D5和Y半抗原Ley 。
本發明進一步涉及這類藥物組合物的實施方式，其中所述病原體相關抗原選自以下病原體抗原：單純皰疹病毒感染的細胞蛋白質(ICP)47、單純皰疹病毒gD、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-1、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2A、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2B、人免疫缺陷病毒gp160、人免疫缺陷病毒gp120、人免疫缺陷病毒gp41等)、人乳頭瘤病毒E6、人乳頭瘤病毒E7、人T-細胞白血病病毒gp64、人T-細胞白血病病毒gp46和人T-細胞白血病病毒gp21。
本發明進一步提供包括任何上述藥物組合物的試劑盒，其中其結合分子以一個或多個容器被分開(compartmentalized)。
本發明涉及用於治療癌症和病原體相關疾病的聯合療法，其包括施用：(1) 能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子(例如，雙抗體、ScFv、抗體、TandAb等)，和(2) 能夠介導對表達疾病抗原的靶細胞(例如，癌細胞或病原體感染的細胞等)的重定向殺傷的分子(例如，雙抗體、BiTe、雙特異性抗體、CAR等)。本發明尤其涉及其中能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子是雙特異性結合分子的實施方式，所述雙特異性結合分子包含能夠免疫特異性結合效應細胞的細胞表面分子的表位的第一表位結合位點和能夠免疫特異性結合這類靶細胞的表位(即，疾病抗原如癌抗原或病原體相關抗原)的第二表位結合位點。本發明還涉及保護這類分子(一種或多種)的藥物組合物。
本發明分子的結合結構域以“免疫特異性 ”方式結合表位元。如本文使用的，如果抗體、雙抗體或其它表位結合分子，相對於可選的表位，與另一分子的區域(即，表位元)更經常、更快速、以更長的持久性和/或以更大的親和力反應或締合，則認為抗體、雙抗體或其它表位結合分子“免疫特異性 ”結合該表位。例如，免疫特異性地結合至病毒表位元的抗體是這樣的抗體，該抗體以比其免疫特異性地結合至其它病毒表位元或非病毒表位元更大的親和力、親合力、更容易和/或以更長的持久性結合該病毒表位元。通過閱讀該定義也可理解，例如，免疫特異性地結合至第一靶標的抗體(或部分或表位元)可以特異性地或優先地結合第二靶標或可以不特異性地或優先地結合第二靶標。因此，“免疫特異性結合”不一定要求(儘管其可包括)排它性結合。一般而言，但是不是必須的，提及結合意指“免疫特異性”結合。如果這類結合展示受體結合其各自配體的特異性，則認為這兩種分子能夠以“生理特異性 (physiospecific) ”方式彼此結合。
如以上指出的，本發明的治療分子特別包括雙特異性結合分子，其包含能夠免疫特異性結合效應細胞的細胞表面分子的表位的表位-結合位點以及還有能夠免疫特異性地結合表達疾病抗原的靶細胞的表位的表位-結合位點。如本文使用的，術語“疾病抗原 ”表示這樣的抗原：其在異常細胞或受感染的細胞的表面上表達，並且是這類異常或感染所特有的，或其在外源細胞的表面上表達並且是這類外來來源所特有的。如本文使用的，在其細胞表面上表達疾病抗原並且因此被本發明治療分子結合並且從而被這類治療分子靶向用於殺傷的細胞是“靶細胞 ”。與本發明具體相關的是作為“癌抗原 ”或“病原體相關抗原 ”的疾病抗原。 I.抗體和其結合結構域
本發明結合分子可以是抗體。“抗體 ”是能夠通過位於免疫球蛋白分子的可變結構域中的至少一種抗原識別位點而特異性結合靶標如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文使用的，術語“抗體 (antibody) ”和“抗體 (antibodies) ”指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝化(camelized)抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的雙特異性Fvs (sdFv)、胞內抗體以及任何上述抗體或片段的表位-結合片段。具體的，術語“抗體”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性片段，即，包含表位-結合位點的分子。免疫球蛋白分子可屬於任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 和IgA2 )或子類。由於在這類分子上存在特定結構域或部分或構象(“表位 ”)，抗體能夠“免疫特異性地結合 ”多肽或蛋白質或非蛋白質分子。含表位的分子可具有免疫原活性，以使其在動物中引發抗體產生應答；這類分子稱為“抗原 ”。最近幾十年，已經見證了對抗體的治療潛力的興趣的復興，並且抗體已經成為一種領先類別的生物技術衍生的藥物(Chan, C.E.等人, (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases ,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。超過200種基於抗體的藥物已經被批准使用或在開發中。
術語“單克隆抗體 ”指同質型(homogeneous)抗體群體，其中單克隆抗體包括參與抗原的選擇性結合的氨基酸(天然產生的或非天然產生的)。單克隆抗體是高度特異性的，直接針對單個表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也包括其片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv片段等)、單鏈(scFv)結合分子及其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有結合抗原的必要的特異性和能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構造(configuration)。就抗體的來源或製備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言，不旨在是限制性的。術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據“抗體”的定義描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,” Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用免疫原性量的細胞、細胞提取物或包含期望的表位的蛋白質製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)，然後將它們用作免疫原。細胞它們本身或聯合非變性佐劑，比如Ribi，可用作免疫原(見，例如，Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production ,” ILAR J. 37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原時，細胞應保持完整並且優選地有活性。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑，例如，弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂，因此，其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序，並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中，並且，可然後擴展和冷凍宿主細胞，用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用於基因操作，以產生本發明的單特異性或多特異性(例如，雙特異性、三特異性和四特異性)分子以及親和力優化的嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化(caninized)抗體，以改善抗體的親和力或其他特徵。人源化抗體的一般原理涉及保留抗體的抗原結合的部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。
天然抗體(如IgG抗體)由與兩條“重鏈 ”複合的兩條“輕鏈 ”構成。每條輕鏈包含可變結構域(“VL ”)和恆定結構域(“CL ”)。每條重鏈包含可變結構域(“VH ”)、三個恆定結構域(“CH1 ”、“CH2 ”和“CH3 ”)和位於CH1 和CH2 結構域之間的“鉸鏈 ”區(“H ”)。相比之下，scFvs是通過經由短連接肽將輕鏈和重鏈可變結構域連接在一起而製備的單鏈分子。
因此，天然產生的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本結構單元因此是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，通常作為約150,000 Da的糖蛋白被表達。每條鏈的氨基端(“N-末端”)部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多氨基酸的可變結構域。每條鏈的羧基端(“C-末端”)部分限定了恆定區，其中輕鏈具有單個恆定結構域而重鏈通常具有三個恆定結構域和鉸鏈結構域。因此，IgG分子的輕鏈的結構是n-VL-CL-c並且IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中n和c分別表示多肽的N-末端和C-末端)。 A．抗體可變結構域的特徵
IgG分子的可變結構域由互補決定區(“CDR”)和稱為框架區段(“FR”)的非CDR區段組成，所述互補決定區(“CDR”)包含與表位接觸的殘基，所述框架區段一般維持結構和決定CDR環的定位，以便允許這類接觸(儘管某些框架殘基也可接觸抗原)。因此，VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。是(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為：CDRL 1 結構域、 CDRL 2 結構域和 CDRL 3 結構域 。類似地，是(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為：CDRH 1 結構域、 CDRH 2 結構域和 CDRH 3 結構域 。因此，術語CDRL 1結構域、CDRL 2結構域、CDRL 3結構域、CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域指當併入到蛋白質中時使得該蛋白質能夠結合特異性表位的多肽，無論這樣的蛋白質是具有輕鏈和重鏈的抗體還是雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv、BiTe等)或是另一類型的蛋白質。因此，如本文所使用，術語“表位結合片段 ”表示能夠免疫特異性結合表位的分子。表位結合片段可包含抗體的1、2、3、4或5個CDR結構域，或可包含抗體的所有6個CDR結構域，並且儘管能夠免疫特異性結合這類表位，但可展示對與這樣的抗體的表位不同的這樣的表位的特異性、親和力或選擇性。但是，優選地，表位結合片段將包含這類抗體的所有6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單個多肽鏈(例如，scFv)，或可包括兩條或更多條多肽鏈，每條鏈均具有氨基末端和羧基末端(例如，雙抗體、Fab片段、Fab2 片段等)。除非具體指出，否則本文所述的蛋白質分子的結構域的順序是從“N-末端至C-末端”方向。
本發明還特別包括表位-結合分子，其包含人源化抗體的VL和/或VH結構域。術語“人源化抗體 ”指一般使用重組技術製備的嵌合分子，其具有來自非人物種的免疫球蛋白的表位-結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的分子的剩餘免疫球蛋白結構。這類抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於遺傳操作，以產生這類衍生物和改善這類抗體的親和力或其他特徵。人源化抗體的一般原則涉及保留抗體的表位元結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。人源化單克隆抗體有四個基本步驟。這些是：(1)確定開始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即，決定在人源化或犬源化過程中使用哪種抗體框架區域；(3)實際人源化或犬源化方法/技術；和(4)轉染和表達人源化抗體。見，例如，美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
表位-結合位元點可包括融合到恆定結構域融合上的完整的可變結構域或僅僅包括移植至適當框架區的這類可變結構域的互補決定區(CDR)。表位元結合結構域可以是野生型或通過一個或多個氨基酸取代被修飾。這消除了人個體中作為免疫原的恆定區，但是仍保留對外源可變結構域的免疫應答的可能性(LoBuglio, A.F.等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一種方法不僅僅關注提供源自人的恆定區，而且也修飾可變結構域，以便重塑它們使其盡可能地與人形式接近。已知重鏈和輕鏈的可變結構域都包含三個互補決定區(CDR)，側翼是四個框架區(FR)，所述互補決定區(CDR)對所討論的抗原回應不同並且決定結合能力，所述框架區(FR)在給定物種中相對保守並且推定其為CDR提供支架。當針對特定抗原製備非人抗體時，通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上可“重塑”或“人源化”可變結構域。已經報導了該方法應用於各種抗體：Sato, K.等(1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等(1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等(1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等(1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,” J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施方式中，人源化抗體保留所有的CDR序列(例如，人源化鼠抗體，其包含來自小鼠抗體的所有六個CDR)。在其他實施方式中，人源化抗體具有一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個或六個)，其序列相對於初始抗體不同。
已經描述了包含源自非人免疫球蛋白的表位結合位點的許多人源化抗體分子，包括具有齧齒動物或修飾的齧齒動物可變結構域和它們與人恆定結構域融合的相關的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(見，例如，Winter等(1991) “Man-made Antibodies ,” Nature 349:293-299；Lobuglio等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw等(1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen ,” J. Immunol. 138:4534-4538, and Brown等(1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody ,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其他參考文獻描述了移植至人支撐框架區(FR)的齧齒動物CDR，其然後與適當的人抗體恆定結構域融合(見，例如，Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；和Jones等(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,” Nature 321:522-525)。另外的參考文獻描述了由重組修飾的齧齒動物框架區支撐的齧齒動物CDR。見，例如，歐洲專利公開號519,596。這些“人源化的”分子被設計，以使對齧齒動物抗人抗體分子的不利免疫應答最小化，所述不利免疫應答限制了這些部分在人接受者中治療應用的持續時間和效力。也可使用的人源化抗體的其他方法，其公開在以下文獻中：Daugherty等(1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。 B．抗體恆定區的特徵
遍及本說明書，在IgG重鏈的恆定區中的殘基的編號是如Kabat等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, Public Health Service, NH1, MD (1991) (“Kabat ”)的EU索引的編號，其通過引用明確併入本文。術語“Kabat 中的 EU 索引 ”指人IgG1 EU抗體的恆定結構域的編號。來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變結構域的氨基酸通過氨基酸在鏈中的位置而命名。Kabat描述了抗體的許多氨基酸序列，鑑定了每個子群的氨基酸共有序列，並且指定了每種氨基酸的殘基編號，並且CDR如通過Kabat定義的被鑑定(應該理解，如通過Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins ,” J. Mol. Biol. 196:901-917)定義的，CDRH 1提前五個殘基開始)。通過參考保守的氨基酸比對所討論的抗體與Kabat中的共有序列中的一條，Kabat的編號方案可擴展至未包括在其綱要中的抗體。用於賦予殘基編號的該方法已經成為本領域的標準並且容易鑑定在不同抗體，包括嵌合或人源化的變體中等同位置處的氨基酸。例如，在人抗體輕鏈50位的氨基酸佔據與在小鼠抗體輕鏈的50位氨基酸等同的位置。 1. 重鏈的恆定區：Fc結構域
抗體的兩條重鏈的CH1結構域與抗體的輕鏈的“CL”恆定區複合，並且經由間插鉸鏈結構域連接至重鏈CH2結構域。
示例性CH1結構域是人IgG1 CH1結構域。示例性人IgG1 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1 )： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
示例性CH1結構域是人IgG2 CH1結構域。示例性人IgG2 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
示例性CH1結構域是人IgG4 CH1結構域。示例性人IgG4 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
一種示例性鉸鏈結構域是人IgG1鉸鏈結構域。示例性人IgG1鉸鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4 )：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示例性鉸鏈結構域是人IgG2鉸鏈結構域。示例性人IgG2鉸鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:5 )：ERKCCVECPPCP。
另一示例性鉸鏈結構域是人IgG4鉸鏈結構域。示例性人IgG4鉸鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:6 )：ESKYGPPCPSCP。如本文所述，IgG4鉸鏈結構域可包含穩定化突變如S228P取代。示例性S228P-穩定化的人IgG4鉸鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:7 )：ESKYGPPCPPCP。
抗體的兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用，以形成“Fc 結構域 ”，其是由細胞Fc 受體 ，包括但不限於Fcγ受體(Fc γ R) ，識別的結構域。如本文使用的，術語“Fc結構域”用來限定IgG重鏈的C-末端區域。如果Fc結構域的氨基酸序列相對於其它IgG同種型與特定IgG同種型最同源，則認為該Fc結構域屬於該IgG同種型、類或子類。除了其在診斷劑中的已知用途，還證明了抗體可用作治療劑。
示例性人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8 )： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如通過Kabat中闡釋的EU索引編號的，其中X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 9)： 231 240 250 260 270 280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如通過Kabat中闡釋的EU索引編號的，其中X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10 )： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 440 447 ALHNRFTQKS LSLSPG X 如通過Kabat中闡釋的EU索引編號的，其中X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:11 )： 231 240 250 260 270 280 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340 350 360 370 380 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSLG X 如通過Kabat中闡釋的EU索引編號的，其中X是賴氨酸(K)或不存在。
在抗體恆定區中的許多不同位置(例如，Fc位置，包括但不限於270、272、312、315、356和358位，如在Kabat闡釋的EU索引編號)處已經觀察到了多態性，因此示出的序列和現有技術的序列之間可能存在輕微的差別。已經充分表徵了人免疫球蛋白的多態性形式。目前，已知18個Gm同種異型：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc, 等, “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation. ”Pergamon, Oxford, 43-78頁(1990)；Lefranc, G. 等1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體考慮本發明的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型(allotype)、異同種異型(isoallotype)或單倍型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、異同種異型或單倍型。此外，在一些表達體系中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上面粗體顯示的)可在翻譯後去除。因此，CH3結構域的C-末端殘基是本發明的結合分子中的任選的氨基酸殘基。本發明具體考慮缺少CH3結構域的C-末端殘基的結合分子。本發明也具體考慮包括CH3結構域的C-末端賴氨酸殘基的這類構建體。 1. 輕鏈的恆定區
如以上指出的，抗體的每條輕鏈包含可變結構域(“VL ”)和恆定結構域(“CL ”)。
優選的CL結構域是人IgG CL κ結構域。示例性人CL κ結構域的氨基酸序列是(SEQ I D NO:12 )： RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
可選地，示例性CL結構域是人IgG CL λ結構域。示例性人CL λ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13 )： QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS II. 嵌合抗原受體
能夠介導對靶細胞(即，癌細胞、病原體感染的細胞等)的重定向殺傷的本發明結合分子可以可選地是單特異性單鏈分子，如併入能夠結合癌抗原 或病原體相關抗原 的單鏈可變片段(scFv )的嵌合抗原受體(“CAR ”)。如以上指出的，scFvs通過經由短連接肽將輕鏈和重鏈可變結構域連接在一起來製備。第一代CAR通常具有來自CD3 ζ-鏈的胞內結構域，其是來自內源性TCR的信號的主要遞質。二代CAR在CAR的細胞質尾部具備來自各種共刺激蛋白質受體(例如，CD28、41BB、ICOS等)的另外的胞內信號轉導結構域，以向T-細胞提供另外的信號。三代CAR結合多種信號轉導結構域，如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以進一步增強效價(Tettamanti, S.等人, (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Gill, S.等人, (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells ,” Blood 123(15)：2343-2354；Mardiros, A.等人, (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia ,” Blood 122:3138-3148；Pizzitola，I.等人, (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo ,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62。
本發明CAR的胞內結構域優選地選自下述任一項的胞內結構域：41BB-CD3ζ、b2c-CD3ζ、CD28、CD28-4-1BB-CD3ζ、CD28-CD3ζ、CD28-FcεRIγ、CD28mut-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD3ζ、CD4-CD3ζ、CD4-FcεRIγ、CD8-CD3ζ、FceRIγ、FcεRIγCAIX、Heregulin-CD3ζ、IL-13-CD3ζ或Ly49H-CD3ζ (Tettamanti, S.等人, (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Gill, S.等人, (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells ,” Blood 123(15): 2343-2354；Mardiros, A.等人, (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia ,” Blood 122:3138-3148；Pizzitola, I.等人, (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo ,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。 III. 雙特異性抗體和多特異性雙抗體
抗體結合抗原表位的能力取決於抗體的VL和VH結構域的存在和氨基酸序列。抗體的輕鏈和重鏈的相互作用，具體的，其VL和VH結構域的相互作用形成天然抗體如IgG的兩種表位-結合結構域中的一種。天然抗體能夠結合僅一個表位種類(即，它們是單特異性的)，儘管它們可結合該種類的多個拷貝(即，展示二價或多價)。
抗體的功能可通過以下手段得到增強：產生基於多特異性抗體的分子，其可同時結合兩種單獨的且不同的抗原(或相同抗原的不同表位)；和/或產生基於抗體的分子，其對於相同的表位和/或抗原具有更高價(即，多於兩個結合位點)。
為了提供具有比天然抗體更大能力的分子，已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(見，例如，PCT專利公開號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分使用連接肽，所述連接肽與其他表位結合片段(例如，scFv、VL、VH等)融合或在抗體核心中(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或與多個表位結合片段(例如，兩個Fab片段或scFvs)融合。可選的形式使用連接肽，以將表位結合片段(例如，scFv、VL、VH等)與二聚化結構域，比如CH2-CH3結構域，或可選的多肽融合(WO 2005/070966、WO 2006/107786 WO 2006/107617、WO 2007/046893)。PCT專利公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了三特異性抗體，其中CL和CH1結構域由其各自的天然位置被轉變，並且VL和VH結構域已經被多樣化(WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允許它們結合大於一種抗原。PCT專利公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域，以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。PCT專利公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc結構域已經用另外的VL和VH結構域替換，以便形成三價結合分子。PCT專利公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體，其單個鏈包含scFv結構域。PCT專利公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子，其作為單多肽鏈被合成，然後經歷蛋白酶解，以產生異源二聚化結構。PCT專利公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或功能集團至抗體或抗體部分(例如，添加雙抗體至抗體的輕鏈或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈或添加異源融合蛋白或彼此連結多個Fab結構域)。
本領域已經另外注意到產生在能夠結合兩個或多個不同表位種類(即，除了雙價或多價之外顯示雙特異性或多特異性)方面不同於這樣的天然抗體的雙抗體的能力(見，例如，Holliger等人, (1993) “’Diabodies’ : Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragment s, ” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Hollinger等人)；US 2004/0220388 / WO 02/02781 (Mertens等人)；Alt等人, (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D.等人, (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等人)；Olafsen, T.等人, (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications ,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27；Wu, A.等人, (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange ,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等人, (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683，J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等人, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody ) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A.等人, (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。
雙抗體的設計是基於單鏈可變結構域片段(scFv )的結構，其中輕鏈和重鏈可變結構域使用短連接肽彼此連接。Bird等人(1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)描述了連接肽的例子，其在一個可變區的羧基末端和另一可變區的氨基末端之間橋接約3.5 nm。已經設計和使用了其他序列的連接體(Bird等人(1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)。連接體進而可被修飾用於另外的功能，比如藥物的附著或附著至固體載體。可重組或合成產生單鏈變體。為了合成產生scFv，可使用自動合成儀。為了重組體產生scFv，可將包含編碼scFv的多核苷酸的合適質粒引入適當的宿主細胞中，所述宿主細胞可以是真核細胞，比如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，或原核細胞，比如大腸埃希氏菌。可通過常規操作比如多核苷酸的連接製備編碼感興趣的scFv的多核苷酸。可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
雙特異性結合分子(例如，非單特異性雙抗體)的供應提供相比抗體的明顯優勢，包括但不限於足以共連接和/或共定位表達不同表位的不同細胞的“反式(trans)”結合能力和/或足以共連接和/或共定位由相同細胞表達的不同分子的“順式(cis)”結合能力。因此，雙特異性結合分子(例如，非單特異性雙抗體)具有廣泛的應用，包括治療和免疫診斷。在各種應用中，雙特異性在設計和工程化雙抗體方面允許大的靈活性，提供對多聚抗原的增強的親合力、不同抗原的交聯和對特定細胞類型的導向靶向，這取決於兩個靶抗原的存在。由於其增加的價、低離解速率和從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體，為~50 kDa或以下)，本領域中已知的雙抗體分子在腫瘤成像領域還顯示特別的用途(Fitzgerald等人(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221-1225)。
產生雙特異性雙抗體的能力已經導致它們(以“反式”)將兩個細胞共連接在一起的用途，例如，通過共連接在不同細胞表面上存在的受體(例如，交連細胞毒性T-細胞與靶細胞，如表達疾病抗原的癌細胞或病原體感染細胞) (Staerz等人, (1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cell ,” Nature 314:628-631，和Holliger等人, (1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bis pecifc Diabody ,” Protein Eng. 9:299-305；Marvin等人, (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Diabody ,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658；Sloan等人, (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cell by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cell ” PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233))。可選地(或另外)，雙特異性(或三特異性或多特異性)雙抗體可用於(以“順式”)共連接存在於相同細胞表面上的分子，如受體等。不同細胞和/或受體的共連接可用於調節效應子功能和/或免疫細胞信號轉導。包含表位-結合結構域的多特異性分子(例如，雙特異性雙抗體)可被引導至任何在T淋巴細胞、天然殺傷(NK)細胞、抗原呈遞細胞或其它單核細胞上表達的免疫細胞的表面決定子如CD2，CD3，CD8，CD16，TCR，NKG2D等。具體的，被引導至存在於免疫效應細胞上的細胞表面受體的表位-結合結構域可用於產生能夠介導重定向細胞殺傷的多特異性結合分子。
但是，上述雙特異性雙抗體的優勢需要突出的成本。這類非單特異性雙抗體的形成需要成功組裝兩個或更多個獨特和不同的多肽(即，這樣的形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化而形成雙抗體)。該事實與單特異性雙抗體不同，其通過一致的多肽鏈的同源二聚化而形成。由於至少兩個不同的多肽(即，兩個多肽種類)必須被提供以形成非單特異性雙抗體並且由於這樣的多肽的同源二聚化導致失活分子(Takemura, S.等人(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)，這樣的多肽的產生必須以防止相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(即，以便防止同源二聚化) (Takemura, S.等人, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)。因此，現有技術已經教導了這類多肽的非共價締合(參見，例如，Olafsen等人, (2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等人, (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683，J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等人, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody ) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Lu, D.等人,( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
但是，現有技術已經認識到由非共價締合的多肽構成的雙特異性雙抗體不穩定並且容易解離成非功能單體(參見，例如，Lu, D.等人, (2005) “A Fully Human RecombinantIgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
面對這樣的挑戰，本領域已經成功地開發了穩定的、共價結合的異源二聚非單特異性雙抗體，稱為DART® (雙親和性重靶向 )雙抗體；參見，例如，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT專利公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538；以及Sloan, D.D.等人, (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells ,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. Doi: 10.1371/journal.ppat.1005233；Al Hussaini, M.等人, (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform ,” Blood pii: blood-2014-05-575704；Chichili, G.R.等人, (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia : Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates ,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Moore, P.A.等人, (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Veri, M.C.等人, (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Johnson, S.等人, (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion ,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449)。這樣的雙抗體包含兩條或多條共價複合的多肽並涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化到每個應用的多肽種類中，其允許形成二硫鍵，從而將一對或多對這類多肽鏈彼此共價結合。例如，將半胱氨酸殘基添加至這樣的構建體的C-末端已經被證明允許涉及的多肽鏈之間的二硫結合，穩定了產生的雙抗體，而不干擾雙抗體的結合特性。
已經描述了這類分子的許多變型(參見，例如，美國專利公開號2015/0175697、2014/0255407、2014/0099318、2013/0295121、2010/0174053、2009/0060910、2007-0004909；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221、EP 1868650和PCT專利公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665)，並且在本文中被提供。
用於期望雙特異性或四價分子而不需要Fc的應用的可選的構建體在本領域中是已知的，包括但不限於雙特異性T細胞銜接分子，也稱為“BiTE ” (參見，例如，PCT專利公開號WO 1993/11161和WO 2004/106381)和四價串聯抗體，也稱為“TandAb ” (參見，例如美國專利公開號2011-0206672、歐洲專利公開號EP 2371866和PCT專利公開號WO 1999/057150、WO 2003/025018和WO 2013/013700)。BiTE由包含串聯連接的scFv的單多肽鏈形成，而TandAb由兩條相同多肽鏈的同源二聚化形成，每條多肽鏈具備VH1、VL2、VH2和VL2結構域。
本發明提供能夠介導對表達疾病抗原的靶細胞(例如，癌細胞或病原體感染的細胞等)的重定向殺傷的雙特異性結合分子。這類雙特異性結合分子能夠結合“第一表位 ”和“第二表位 ”，這類表位彼此不同。這類雙特異性分子包含能夠結合第一表位的“VL1 ”/“VH1 ”結構域和能夠結合第二表位的“VL2 ”/“VH2 ”結構域。符號“VL1 ”和“VH1 ”分別表示結合這類雙特異性分子的“第一”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。類似地，符號“VL2 ”和“VH2 ”分別表示結合這類雙特異性分子的“第二”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。具體的表位被指定為第一還是第二表位是無關緊要的；這樣的符號僅僅與本發明的結合分子的多肽鏈的結構域的存在和取向相關。在一個實施方式中，這類表位中的一種是存在於效應細胞如T淋巴細胞、天然殺傷(NK)細胞或其它單核細胞上的分子(例如，CD2、CD3、CD8、CD16、T-細胞受體(TCR)、NKG2D等)的表位，並且另一表位是疾病抗原(例如，癌抗原或病原體相關抗原)的表位。在某些實施方式中，雙特異性分子包含多於兩個表位-結合位點。本發明具體包括雙特異性雙抗體、BiTEs、抗體以及使用本文提供的任意方法產生的TandAb。 A. 缺少Fc結構域的雙抗體
在一個實施方式中，本發明雙抗體是雙特異性的並且包含能夠結合第一和第二表位元二者的結構域，但是缺少Fc結構域，因此不能結合FcγR分子。雙特異性雙抗體的這類實施方式的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端、能夠結合第一或第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即，VL表位 1 或VL表位 2 )、第一間插間隔肽(連接體1)、能夠結合第二表位的單克隆抗體的VH結構域(如果這類第一多肽鏈包含VL表位 1 )或能夠結合第一表位的單克隆抗體的VH結構域(如果這類第一多肽鏈包含VL表位 2 )、任選地包含半胱氨酸殘基的第二間插間隔肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域和C-末端(圖 1 )。
雙特異性雙抗體的該實施方式的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端、能夠結合第一或第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即，VL表位 1 或VL表位 2 ，並且是未被選擇包含於雙抗體的第一多肽鏈中的VL結構域)、間插間隔肽(連接體1)、能夠結合第一或第二表位的單克隆抗體的VH結構域(即，VH表位 1 或VH表位 2 ，並且是未被選擇包含於雙抗體的第一多肽鏈中的VH結構域)、任選地包含半胱氨酸殘基的第二間插間隔肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域和C-末端(圖 1 )。所採用的對於具體表位具有特異性的VL和VH結構域優選地獲自或衍生自相同的單克隆抗體。但是，這類結構域可衍生自不同單克隆抗體，條件是它們締合以形成能夠免疫特異性地結合這類表位的功能性結合位點。這類不同抗體在本文中被稱為“相應的”抗體。
第一多肽鏈的VL結構域與第二多肽鏈的VH結構域相互作用，以形成對表位之一(例如，第一表位)特異性的第一功能性表位-結合位點。類似地，第二多肽鏈的VL結構域與第一多肽鏈的VH結構域相互作用，以形成對其它表位(即，第二表位)特異性的第二功能性表位-結合位點。因此，第一和第二多肽鏈的VL和VH結構域的選擇是“協同的 (coordinated) ”，以使雙抗體的兩條多肽鏈總共包含能夠結合第一表位和第二表位二者的VL和VH結構域(即，它們總共包含VL表位 1 /VH表位 1 和VL表位 2 /VH表位 2 )。
最優選地，選擇間插間隔肽(即，“連接體 1 ”，其分開這類VL和VH結構域)的長度，以基本上或完全防止多肽鏈的VL和VH結構域彼此結合(例如由0、1、2、3、4、5、6、7、8或9個間插連接體氨基酸殘基組成)。因此，第一多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。同樣地，第二多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。優選的間插間隔體肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO:14 )：GGGSGGGG。
基於促進這類二聚化的一個或多個多肽結構域(即，“異源二聚體促進結構域 ”)的選擇來選擇第二間插間隔肽(“連接體2”)的長度和組成。一般地，第二間插間隔體肽(連接體2)包含3-20個氨基酸殘基。尤其地，當採用的異源二聚體促進結構域(一個或多個)包含/不包含半胱氨酸殘基時，使用包含半胱氨酸的第二間插間隔肽(連接體2)。包含半胱氨酸的第二間插間隔體肽(連接體2)將包含1、2、3或更多個半胱氨酸。優選的含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)具有序列GGCGGG (SEQ ID NO:15 )。可選地，連接體2不包含半胱氨酸(例如，GGG、GGGS (SEQ ID NO:16 )、LGGGSG (SEQ ID NO:17 )、GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:18 )、ASTKG (SEQ ID NO:19 )、LEPKSS (SEQ ID NO:20 )、APSSS (SEQ ID NO:21 )等)，並且，使用如以下所述的含半胱氨酸的異源二聚體促進結構域。任選地，使用含半胱氨酸的連接體2和含半胱氨酸的異源二聚體促進結構域二者。
異源二聚體促進結構域可以是在一條多肽鏈上的GVEPKSC (SEQ ID NO:22 )或VEPKSC (SEQ ID NO:23 )或AEPKSC (SEQ ID NO:24 )和在另一條多肽鏈上的GFNRGEC (SEQ ID NO:25 )或FNRGEC (SEQ ID NO:26 ) (US2007/0004909)。
在優選的實施方式中，異源二聚體促進結構域將包含具有相反電荷的串聯重複的螺旋結構域，例如，“E-螺旋”異源二聚體促進結構域(SEQ ID NO:27 ： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸殘基在pH 7形成負電荷，或“K-螺旋”異源二聚體促進結構域(SEQ ID NO:28 ： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)，其賴氨酸殘基在pH 7形成正電荷。這類帶電結構域的存在促進了第一和第二多肽之間的締合，因此有助於異源二聚體形成。可以使用包括上述E-螺旋和K-螺旋序列的修飾的異源二聚體促進結構域，以便包括一個或多個半胱氨酸殘基。這類半胱氨酸殘基的存在允許在一條多肽鏈上存在的螺旋與另一多肽鏈上存在的互補螺旋成為共價結合的，從而彼此共價結合多肽鏈並且增加雙抗體的穩定性。這樣的尤其優選的例子是異源二聚體促進結構域包括修飾的E-螺旋，其具有氨基酸序列 E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:29 )和修飾的K-螺旋，其具有氨基酸序列 K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:30 )。
如WO 2012/018687中公開的，為了提高雙抗體的體內藥物代謝動力學特性，雙抗體可被修飾，以在雙抗體的一個或多個末端處包含血清結合蛋白的多肽部分。最優選地，血清結合蛋白的這類多肽部分設置在雙抗體的多肽鏈的C-末端。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質並且在人中半衰期是19天。白蛋白具有若干小分子結合位點，這允許其非共價結合其他蛋白，從而延長它們的血清半衰期。鏈球菌屬(Streptococcus)菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3 (ABD3)由形成穩定的三螺旋束的46個氨基酸殘基組成並且具有廣泛的白蛋白結合特異性(Johansson, M.U.等(2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Module s,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120。因此，對於改善雙抗體的體內藥物代謝動力學特性，尤其優選的血清結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域(ABD)，更優選地，鏈球菌屬菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3 (ABD3) (SEQ ID NO:31 )：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。
如在WO 2012/162068 (通過引用併入本文)中公開的，SEQ ID NO:31 的“去免疫化 ” 的變體具有削弱或消除II類MHC結合的能力。基於組合突變結果，對於形成這樣的去免疫化的ABD，如下取代的組合被認為是優選的取代：66D/70S +71A、66S/70S +71A、66S/70S +79A、64A/65A/71A、64A/65A/71A+66S、64A/65A/71A+66D、64A/65A/71A+66E、64A/65A/79A+66S、64A/65A/79A+66D、64A/65A/79A+66E。變異的ABD具有修飾L64A、I65A和D79A或修飾N66S、T70S和D79A。具有下述氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66 NAK S 70 A 71 EGVKALIDE ILAALP (SEQ ID NO:32 )、 或氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65 NNAKT VEGVKALI A 79 E ILAALP (SEQ ID NO:33) 、 或氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66 NAK S 70 VEGVKALI A 79 E ILAALP (SEQ ID NO:34) 、 的變異的去免疫話ABD是特別優選的，因為這類去免疫化的ABD展示基本上野生型結合，同時提供削弱的II類MHC結合。因此，具有ABD的這類雙抗體的第一多肽鏈包含第三連接體(連接體3)，其優選地位於這類多肽鏈的E螺旋(或K螺旋)結構域的C-末端，以便插在E螺旋(或K螺旋)結構域和ABD (其優選地是去免疫化的ABD)之間。用於這類連接體3的優選的序列是SEQ ID NO:16 ：GGGS。 B. 包含Fc結構域的雙抗體
本發明的一個實施方式涉及包含Fc結構域的能夠同時結合第一和第二表位(即，相同抗原分子的不同表位或為不同抗原的分子的表位)的多特異性雙抗體(例如，雙特異性、三特異性、四特異性等)。這類分子的Fc結構域可屬於任何同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。分子可進一步包含CH1結構域和/或鉸鏈結構域。當存在時，CH1結構域和/或鉸鏈結構域可屬於任何同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，並且優選地與期望的Fc結構域屬於相同的同種型。
添加IgG CH2-CH3結構域至雙抗體多肽鏈之一或兩條中，以便雙抗體鏈的複合導致形成Fc區，延長了生物半衰期和/或改變了雙抗體的效價。這類雙抗體包含兩條或多條多肽鏈，其序列允許多肽鏈彼此共價結合，以形成能夠同時結合第一表位和第二表位的共價締合的雙抗體。將IgG CH2-CH3結構域併入到兩條雙抗體多肽上允許形成包含Fc-區域的雙鏈雙特異性雙抗體(圖 2 )。
可選地，僅僅在一條雙抗體多肽上併入IgG CH2-CH3結構域允許形成更複雜的、包含Fc結構域的四鏈雙特異性雙抗體(圖 3A-3C )。圖 3C 顯示具有恆定輕鏈(CL)結構域和恆定重鏈CH1結構域的代表性四鏈雙抗體，然而，可以可選地採用這類結構域的片段以及其他多肽(參見，例如，圖 3A 和 3B ，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT專利公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。因此，例如，代替CH1結構域，可採用源自人IgG的鉸鏈結構域的、具有氨基酸序列GVEPKSC (SEQ ID NO:22 )、VEPKSC (SEQ ID NO:23 )或AEPKSC (SEQ ID NO:24 )的肽，並且代替CL結構域，可採用人κ輕鏈的C-末端6個氨基酸GFNRGEC (SEQ ID NO:25 )或FNRGEC (SEQ ID NO:26 )。包含代表性肽的四鏈雙抗體顯示在圖 3A 中。可選地，或另外，可採用包含具有相反電荷的串聯螺旋結構域的肽，比如“E-螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO:27 ： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K或SEQ ID NO:29 ： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)；和“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:28 ： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E或SEQ ID NO:30 ： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)。含螺旋結構域的代表性四鏈雙抗體顯示在圖 3B 中。
本發明的含Fc結構域的雙抗體分子可包含另外的間插間隔肽(連接體)，通常這類連接體將併入在異源二聚體促進結構域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3結構域之間和/或在CH2-CH3結構域和可變結構域(即，VH或VL)之間。一般地，另外的連接體將包含3-20個氨基酸殘基並且可任選地包含全部或部分IgG鉸鏈結構域的全部或部分(優選地，IgG鉸鏈結構域的含半胱氨酸部分)。本發明的含Fc結構域的雙特異性雙抗體分子中可採用的連接體包括：GGGS (SEQ ID NO:16 )、LGGGSG (SEQ ID NO:17 )、GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:18 )、ASTKG (SEQ ID NO:19 )、LEPKSS (SEQ ID NO:20 )、APSSS (SEQ ID NO:21 )、APSSSPME (SEQ ID NO:35 )、VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:36 )、LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:37 )、DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:38 )、GGC和GGG。可使用LEPKSS (SEQ ID NO:20 )代替GGG或GGC，以便於克隆。另外地，氨基酸GGG或LEPKSS (SEQ ID NO:20 )之後緊接著可以是DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:38) 以形成可選的連接體：GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:39 )；和LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40 )。除了連接體以外或代替連接體，本發明含Fc結構域的雙特異性分子可併入IgG鉸鏈結構域。示例性鉸鏈結構域包括：來自IgG1的EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:4 )、來自IgG2的ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:5 )、來自IgG4的ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:6 )、和ESKYGPPCP P CP (SEQ ID NO:7 )，IgG4鉸鏈變體包含穩定化的S228P取代(如通過Kabat中闡釋的EU索引編號的)以減少鏈交換。
如圖 3A-3C 中提供的，本發明含Fc結構域的雙抗體可包含四條鏈。這類雙抗體的第一和第三多肽鏈包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域、和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。第二和第四多肽鏈包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第一/第三多肽鏈與第二/第四多肽鏈的二聚化。第三和第四多肽鏈的VL和/或VH結構域，以及第一和第二多肽鏈的VL和/或VH結構域可以相同或不同，以便允許單特異性、雙特異性或四特異性的四價結合。符號“VL3 ”和“VH3 ”分別表示結合這類雙抗體的“第三”表位元的輕鏈可變結構域和可變重鏈結構域。類似地，符號“VL4 ”和“VH4 ”分別表示結合這類雙抗體的“第四”表位元的輕鏈可變結構域和可變重鏈結構域。本發明的包含Fc結構域的、代表性四鏈雙特異性雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表 1 中： HPD = 異源二聚體促進結構域
在具體的實施方式中，本發明的雙抗體是雙特異性的、四價(即，具有四個表位元-結合結構域)、包含Fc的雙抗體，其由總共四條多肽鏈構成(圖 3A-3C )。本發明的雙特異性、四價、含Fc的雙抗體保護兩個第一表位-結合結構域和兩個第二表位-結合結構域。
在進一步的實施方式中，本發明的含Fc結構域的雙抗體包含括三條多肽鏈。這類雙抗體的第一多肽包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。這類雙抗體的第二多肽包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。這類雙抗體的第三多肽包含CH2-CH3序列。因此，這類雙抗體的第一和第二多肽鏈締合在一起以形成能夠結合第一或第二表位的VL1/VH1表位-結合位點以及能夠結合這類表位的另一個的VL2/VH2 表位-結合位點。第一和第二多肽通過涉及在它們各自的第三結構域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合，以形成經二硫鍵穩定的Fc結構域。這類雙特異性雙抗體具有增強的效價。圖 4A 和 4B 闡釋了這類雙抗體的結構。這類包含Fc區的雙抗體可具有兩個取向之一(表 2 )： HPD = 異源二聚體促進結構域
在具體的實施方式中，本發明的雙抗體是雙特異性的、二價的(即，具備兩個表位-結合結構域)、含Fc的雙抗體，其由總共三條總多肽鏈構成(圖 4A-4B )。本發明的雙特異性、二價的、含Fc的雙抗體包含一個對於第一或第二表位免疫特異性的表位-結合位點，以及能夠結合這類表位中的另一個的VL2/VH2表位-結合位點。
在進一步的實施方式中，含Fc結構域的雙抗體可包含總計五條多肽鏈。在具體的實施方式中，五條多肽鏈的兩條具有相同的氨基酸序列。這類雙抗體的第一多肽鏈包含：(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。第一多肽鏈可以是抗體的重鏈，其包含VH1和重鏈恆定結構域。這類雙抗體的第二和第五條多肽鏈包含：(i)包含VL1的結構域和(ii)包含CL的結構域。這類雙抗體的第二和/或第五多肽鏈可以是抗體的輕鏈，其包含與第一/第三多肽鏈的VH1互補的VL1。第一、第二和/或第五多肽鏈可分離自天然產生的抗體。可選地，它們可以是重組構建的。這類雙抗體的第三多肽鏈包含：(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域、(iii)包含CH2-CH3序列的結構域、(iv)包含VL2的結構域、(v)包含VH3的結構域和(vi)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這類雙抗體的第四多肽包含：(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH2的結構域和(iii)促進與雙抗體的第三多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。
因此，這類雙抗體的第一和第二以及第三和第五多肽鏈締合在一起以形成兩個能夠結合第一表位的VL1/VH1表位-結合結構域。這類雙抗體的第三和第四多肽鏈締合在一起以形成能夠結合第二表位的VL2/VH2表位-結合位點以及能夠結合第三表位的VL3/VH3結合位點。第一和第三多肽通過涉及在它們各自恆定區中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合以形成Fc結構域。這類多特異性雙抗體具有增強的效力。圖 5 闡釋這類雙抗體的結構。應該理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以是相同的或不同的，以允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。
選擇多肽鏈的VL和VH結構域，以便形成對於期望的表位特異性的VL/VH結合位點。通過多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以相同或不同，以便允許單特異性、雙特異性、三特異性或四特異性的四價結合。尤其地，可選擇VL和VH結構域，以便多特異性雙抗體包含括針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點，或針對第一表位的三個結合位點和針對第二表位的一個結合位點，或針對第一表位的兩個結合位點，針對第二表位的一個結合位點和針對第三表位的一個結合位點(如圖 5 中所描繪)。本發明的包含Fc結構域的代表性五鏈雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表 3 中： HPD = 異源二聚體促進結構域
在具體的實施方式中，本發明的雙抗體是雙特異性、四價的(即，具備四個表位-結合結構域)、含Fc的雙抗體，其由總共五條多肽鏈組成，其具有對於第一表位免疫特異性的兩個表位-結合結構域和對於第二表位特異性的兩個表位-結合結構域。在另一實施方式中，本發明的雙特異性、四價的、含Fc的雙抗體包含對於第一表位免疫特異性的三個表位-結合結構域和對於第二表位特異性的一個表位-結合位點。如上提供的，VL和VH結構域可被選擇以允許三特異性結合。因此，本發明還包括三特異性、四價的、含Fc的雙抗體。本發明的三特異性、四價的、含Fc的雙抗體包含對於第一表位免疫特異性的兩個表位-結合結構域和對於第二分子免疫特異性的一個表位-結合位點以及對於第三表位免疫特異性的一個表位-結合位點。
在傳統的免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統的細胞的相互作用產生各種各樣的應答，範圍從效應子功能，比如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫粒和吞噬，到免疫調節信號，比如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用通過抗體或免疫複合物的Fc結構域與造血細胞上專用細胞表面受體的結合來啟動。由抗體和免疫複合物引發的細胞應答的多樣性由三種Fc受體：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)和FcγRIII (CD16)的結構異質性造成。FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)和FcγRIII (CD16)是啟動(即，免疫系統增強)性受體；FcγRIIB (CD32B)是抑制(即，免疫系統抑制)性受體。另外，與新生Fc受體(FcRn)的相互作用介導IgG分子從內體至細胞表面的再迴圈並且釋放進入血液中。上面呈現了示例性野生型IgG1 (SEQ ID NO:8 )、IgG2 (SEQ ID NO:9 )、IgG3 (SEQ ID NO:10 )和IgG4 (SEQ ID NO:11 )的氨基酸序列。
Fc結構域的修飾可導致改變的表型，例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應子功能。因此，就效應子功能而言，可期望修飾本發明的包含Fc結構域的結合分子，例如，以便增強這類分子治療癌症的效力。在某些情況下，例如在作用機制涉及阻斷或拮抗，但是不殺傷攜帶靶抗原的細胞的抗體的情況下，期望降低或消除Fc結構域介導的效應子功能。當涉及非期望的細胞，比如腫瘤和外源細胞時，其中FcγRs以低水準表達，例如，具有低水準的FcγRIIB腫瘤特異性B細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)，一般期望增加的效應子功能。本發明的分子具有這樣的賦予的或改變的效應子功能活性，可用於治療和/或預防其中期望增強的效應子功能活性效力的疾病、病症或感染。
因此，在某些實施方式中，本發明的包含Fc結構域的分子的Fc結構域可以是工程化的變異的Fc結構域。儘管本發明雙特異性包含Fc結構域的分子的Fc結構域可以具有結合一個或多個Fc受體(例如，FcγR)的能力，但是更優選地這類變異的Fc結構域具有對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)改變的結合(相對於野生型Fc結構域展示的結合)，例如，具有與啟動性受體增強的結合和/或具有對抑制性受體基本上降低的結合能力或沒有結合抑制性受體的能力。因此，本發明包含Fc結構域的分子的Fc結構域可包括完整的Fc結構域的一些或所有CH2結構域和/或一些或所有CH3結構域，或可包括變異的CH2和/或變異的CH3序列(其相對於完整的Fc結構域的CH2或CH3結構域，可包括，例如，一個或多個***和/或一個或多個缺失)。這類Fc結構域可包括非Fc多肽部分，或可包括非天然完整Fc結構域的部分，或可包括非天然產生的取向的CH2和/或CH3結構域(比如，例如，兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或者在N-末端至C-末端方向上，連接至CH2結構域的CH3結構域等)。
鑑定為改變效應子功能的Fc結構域修飾是本領域已知的，包括增加與啟動性受體(例如，FcγRIIA (CD16A)結合的修飾和減少與抑制性受體(例如，FcγRIIB (CD32B)結合的修飾(例如，FcγRIIB (CD32B) (見，例如，Stavenhagen, J.B.等(2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors ,” Cancer Res. 57(18):8882-8890)。表 4 列舉了示例性修飾的示例性單、雙、三、四和五取代((根據EU索引的)編號和取代是相對於上面示出的SEQ ID NO:8 的氨基酸序列)，其增加與啟動性受體的結合和/或降低與抑制性受體的結合。
具有與CD32B降低的結合和/或與CD16A增加的結合的人IgG1 Fc結構域的示例性變體包括F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。這些氨基酸取代可以任何組合存在於人IgG1 Fc結構域中。在一個實施方式中，變異的人IgG1 Fc結構域包含F243L、R292P和Y300L取代。在另一實施方式中，變異的人IgG1 Fc結構域包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代。
在某些實施方式中，優選的，本發明含Fc結構域的結合分子的Fc結構域優選展示與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有)結合(相對於野生型IgG1 Fc結構域(SEQ ID NO:8 )展示的結合)。在具體的實施方式中，本發明含Fc結構域的結合分子包含展示降低的ADCC效應子功能的IgG Fc結構域。在優選的實施方式中，這類結合分子的CH2-CH3結構域包含以下取代中的任意1、2、3或4個：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G。在另一實施方式中，CH2-CH3結構域包含N297Q取代、N297G取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因為這些突變消除FcR結合。可選地，使用天然存在的Fc結構域的CH2-CH3結構域，其固有地展示與FcγRIIIA (CD16a)降低的(或基本上沒有)結合和/或減少的效應子功能(相對於野生型IgG1 Fc結構域(SEQ ID NO:8 )展示的結合和效應子功能)。在具體的實施方式中，本發明的含Fc結構域的結合分子包含IgG2 Fc結構域(SEQ ID NO:9 )或IgG4 Fc結構域(SEQ ID NO:11 )。當利用IgG4 Fc結構域時，本發明也包括引入穩定化突變，比如上述的鉸鏈區S228P取代(見，例如，SEQ ID NO: 7 )。因為N297G、N297Q、L234A、L235A和D265A取代消除了效應子功能，在期望效應子功能的情況下，優選地將不採用這些取代。
對於具有降低的或消除的效應子功能的本發明的包含Fc結構域的分子的CH2和CH3結構域，優選的IgG1序列包括取代L234A/L235A (SEQ ID NO :41 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
可通過增加Fc結構域對於FcRn的結合親和力而延長包含Fc結構域的蛋白質的血清半衰期。如本文使用的術語“半衰期”意思是分子的藥物代謝動力學性質，是對在其施用之後分子的平均生存時間的衡量。半衰期可表示為從受試者的身體(例如，人患者或其他哺乳動物)或其特定區室消除百分之五十(50%)的已知量的分子需要的時間，例如，如在血清中測量的，即，迴圈半衰期，或在其他組織中測量的。一般而言，半衰期的增加導致施用的分子在迴圈中的平均停留時間(MRT)的增加。
在一些實施方式中，本發明的含Fc結構域的結合分子包含變異的Fc結構域，其包含相對於野生型Fc結構域的至少一個氨基酸修飾，使得該分子具有增加的半衰期(相對於包含野生型Fc結構域的這類分子)。在一些實施方式中，本發明含Fc結構域的結合分子包含變異的IgG Fc結構域，其在選自下述的一個或多個位置包含括延長半衰期的氨基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436。能夠延長包含Fc結構域的分子的半衰期的許多突變是本領域已知的，包括例如M252Y、S254T、T256E和其組合。例如，參見美國專利號6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376；美國專利公開號2002/0147311、2007/0148164；以及PCT專利公開號WO 98/23289、WO 2009/058492和WO 2010/033279中描述的突變，這些專利通過引用一起整體併入本文。
在一些實施方式中，展示增強的半衰期的本發明含Fc結構域的結合分子具備變異的Fc結構域，所述變異的Fc結構域在Fc結構域殘基250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435和436中的兩個或多個處包含取代。具體的，兩個或多個取代選自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I。在具體的實施方式中，這類分子可具備變異的IgG Fc結構域，其包含下述取代： (A) M252Y、S254T和T256E； (B) M252Y和S254T； (C) M252Y和T256E； (D) T250Q和M428L； (E) T307Q和N434A； (F) A378V和N434A； (G) N434A和Y436I； (H) V308P和N434A；或 (I) K288D和H435K。
在優選的實施方式中，本發明含Fc結構域的結合分子具備變異的IgG Fc結構域，所述變異的IgG Fc結構域包含下述取代：M252Y、S254T和T256E中的任何1、2或3個。本發明進一步包括這類具備變異的Fc結構域的結合分子，所述變異的Fc結構域包含： (A)改變效應子功能和/或FcγR結合的一個或多個突變；和 (B)延長血清半衰期的一個或多個突變。
對於期望具有不同氨基酸序列的含Fc-結構域的多肽鏈(例如，其含Fc結構域的第一和第三多肽鏈期望是不同的)的某些抗體、雙抗體和三價結合分子，期望減少或防止兩個第一多肽鏈的CH2-CH3結構域之間或兩個第三多肽鏈的CH2-CH3結構域之間發生同源二聚化。這類多肽鏈的CH2和/或CH3結構域不需要序列相同，並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。例如，氨基酸取代(優選以包括形成“杵(knob)”的大側基的氨基酸例如色氨酸進行取代)可被引入CH2或CH3結構域中，以便空間干擾將防止與類似的突變結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域——即“臼(hole)”(例如，用甘氨酸取代)——配對。這樣的突變組可被工程化到任意對的、包含形成Fc結構域的CH2-CH3結構域的多肽中，以促進異源二聚化。蛋白質工程化以相對於同源二聚化利於異源二聚化的方法在本領域中是悉知的，尤其就工程化免疫球蛋白樣分子而言，這些都包括在本文中(參見，例如，Ridgway等人, (1996)“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621, Atwell等人, (1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270：26-35，和Xie等人, (2005)“A New Format Of Bispecific Antibody : Highly Efficient Heterodimerization , Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；其中每一篇在此通過引用以其整體併入本文)。
通過修飾IgG Fc結構域以包含修飾T366W而產生優選的杵。通過修飾IgG Fc結構域以包含修飾T366S、L368A和Y407V而產生優選的臼。為了有助於從最終的雙特異性的、異源二聚化的、包含Fc結構域的分子中純化含臼的第三多肽鏈同源二聚體，優選地通過在435位的氨基酸取代(H435R)突變第三多肽鏈的含臼的CH2和CH3結構域的蛋白質A結合位點。因此，含臼的第三多肽鏈同源二聚體不結合蛋白質A，而雙特異性的異源二聚體經在第一多肽鏈上的蛋白質A結合位點而保持其結合蛋白質A的能力。在可選的實施方式中，含臼的第三多肽鏈可併入在434和435位的氨基酸取代(N434A/N435K)。
對於本發明含Fc結構域的分子的第一多肽鏈的CH2和CH3結構域，優選IgG氨基酸序列將具有“攜帶杵的 ”序列(SEQ ID NO:42 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在。
對於具有兩條多肽鏈的本發明的包含Fc結構域的分子的第二多肽鏈(或具有三、四或五條多肽鏈的包含Fc結構域的分子的第三多肽鏈)的CH2和CH3結構域，優選的IgG氨基酸序列具有“攜帶臼 ”的序列(SEQ ID NO:43 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在。
如將注意到，SEQ ID NO:42 和SEQ ID NO:43 的CH2-CH3結構域包含在位置234用丙氨酸的取代和在位置235用丙氨酸的取代，並且因此形成展示與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有)結合的Fc結構域(相對於野生型Fc區(SEQ ID NO:8 )展示的結合)。本發明也包括這類CH2-CH3結構域，其包括野生型丙氨酸殘基，修飾Fc結構域的效應子功能和/或FγR結合活性的可選的和/或另外取代。本發明也包括這類CH2-CH3結構域，其進一步包括一個或多個延長半衰期的氨基酸取代。尤其地，本發明包括這類包含臼的和這類包含杵的CH2-CH3結構域，其進一步包含M252Y/S254T/T256E。
優選的，第一多肽鏈具有“攜帶杵的”CH2-CH3序列，如SEQ ID NO:42 的序列。但是，如將認識到，“攜帶臼的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:43 可在第一多肽鏈中採用，在該情況中，“攜帶杵的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:42 )將在具有兩條多肽鏈的本發明含Fc結構域的分子的第二多肽鏈中(或在具有三條、四條或五條多肽鏈的含Fc結構域的分子的第三多肽鏈中)採用。
在其它實施方式中，本發明包括包含CH2和/或CH3結構域的含Fc結構域的結合分子，所述CH2和/或CH3結構域已使用本領域已知的突變被工程化成相對於同源二聚化利於異源二聚化，如PCT專利公開號WO 2007/110205、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/06867中公開的那些，其所有通過引用以其整體併入本文。 IV.包含Fc結構域的三價結合分子
本發明進一步的實施方式涉及三價結合分子，其包含能夠同時結合第一表位、第二表位和第三表位的Fc結構域，其中這類表位中的至少一個與另一個表位不同。這類三價結合分子包含三個表位-結合結構域，其中兩個是雙抗體類型結合結構域，其提供結合位點A和結合位點B，並且其中的一個是Fab類型結合結構域，或scFv類型結合結構域，其提供結合位點C (參見，例如，圖 6A-6F ，PCT專利公開號WO 2015/184207和WO 2015/184203)。這類三價結合分子因而包含能夠結合第一表位的“VL1 ”/“VH1 ”結構域和能夠結合第二表位的“VL2 ”/“VH2 ”結構域和能夠結合這類三價結合分子的“第三”表位的“VL3 ”和“VH3 ”結構域。“雙抗體型結合結構域”是如上所述的雙抗體中存在的表位-結合位點的類型。每個“Fab型結合結構域”和“scFv型結合結構域”是通過免疫球蛋白輕鏈的VL結構域和免疫球蛋白重鏈的互補VH結構域相互作用形成的表位元-結合結構域。Fab型結合結構域與雙抗體型結合結構域的差異在於形成Fab型結合結構域的兩條多肽鏈僅僅包括單個表位-結合位點，而形成雙抗體型結合結構域的兩條多肽鏈包括至少兩個表位元-結合結構域。類似地，scFv型結合結構域與雙抗體型結合結構域的差異也在於它們僅僅包括單個表位-結合位點。因此，如本文使用的Fab型和scFv型結合結構域與雙抗體型結合結構域不同
一般地，本發明的三價結合分子包括四條不同的多肽鏈(見圖 6A-6B )，但是，例如，通過彼此融合這類多肽鏈(例如，經肽鍵)或通過分開這類多肽鏈，以形成另外的多肽鏈，或通過經二硫鍵締合更少的或另外的多肽鏈，分子可包括更少或更多數量的多肽鏈。圖 6C-6F 通過示意性描繪具有三條多肽鏈的這類分子闡釋了本發明的這個方面。如圖 6A-6F 中提供的，本發明的三價結合分子可具有可選的取向，其中雙抗體型結合結構域在Fc結構域的N-末端(圖 6A 、6C 和6D )或C-末端(圖 6B 、6E 和6F )。用於產生三價結合分子的CH2和CH3結構域在上面提供，其包含攜帶杵和攜帶臼的結構域。
在某些實施方式中，本發明的這類三價結合分子的第一多肽鏈包含：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。VL1和VL2結構域位於包含CH2-CH3的結構域的N-末端或C-末端，如表 4 (也見圖 6A 和6B )中所顯示。這類實施方式的第二多肽鏈包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域。這類實施方式的第三多肽鏈包含：(i)包含VH3的結構域、(ii)包含CH1的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。第三多肽鏈可以是包含VH3和重鏈恆定區的抗體的重鏈，或包含這樣的結構域的多肽。這類實施方式的第四多肽包含：(i)包含VL3的結構域和(ii)包含CL的結構域。第四多肽鏈可以是包含與第三多肽鏈的VH3互補的VL3的抗體的輕鏈，或包含這樣的結構域的多肽。第三或第四多肽鏈可分離自天然產生的抗體。可選地，它們可經重組、合成通過其方式而構建。
第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結構域通過間插間隔體肽與這類多肽鏈的重鏈可變結構域分開，所述間插間隔體肽長度太短而不允許它們的VL1/VH2 (或它們的VL2/VH1)結構域締合在一起形成能夠結合第一或第二表位的表位結合位點。用於該目的的優選間插間隔體肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO: 14 )：GGGSGGGG。三價結合分子的其他結構域可通過任選地包括半胱氨酸殘基的一個或多個間插間隔體肽(連接體)分開。尤其地，如上面提供，這類連接體通常被併入在可變結構域(即，VH或VL)和肽異源二聚體促進結構域(例如，E-螺旋或K-螺旋)之間和這類肽異源二聚體促進結構域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3結構域之間。上面提供了用於產生三價結合分子的示例性連接體，並且其也提供在PCT專利公開號：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076中。因此，這類三價結合分子的第一和第二多肽鏈締合在一起，形成能夠結合第一表位的VL1/VH1結合位點，以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。這類三價結合分子的第三和第四多肽鏈締合在一起而形成能夠結合第三表位的VL3/VH3結合位點。
如上所描述的，本發明的三價結合分子可包括三條多肽。包括三條多肽鏈的三價結合分子可通過將第四多肽N-末端的結構域連接至第三多肽的包含VH3的結構域(例如，使用間插間隔體肽(連接體 4 ))而獲得。可選地，使用包含下述結構域的本發明的三價結合分子的第三多肽鏈：(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH3的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域，其中VL3和VH3通過間插間隔體肽彼此間隔開，所述間插間隔體肽足夠長(至少9個或更多個氨基酸殘基)，以便允許這些結構域的締合形成表位-結合位點。對於該目的，一個優選的間插間隔體肽具有序列：GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:44 )。
應當理解，這類三價結合分子的VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以不同，以便允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。具體的，VL和VH結構域可被選擇，以便三價結合分子包含針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的一個結合位點，或針對第一表位的一個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點，或針對第一表位的一個結合位點、針對第二表位的一個結合位點和針對第三表位的一個結合位點。
本發明代表性三價結合分子的多肽鏈的一般結構提供在圖 6A-6F 中和表 5 中： HPD =異源二聚體促進結構域
如以上提供的，這類三價結合分子可包括三條、四條、五條或更多條多肽鏈。V. 本發明的實施方式
如以上所陳述的，本發明涉及用於治療癌症的聯合療法，其包括施用： (1) 能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子；和 (2) 能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子(例如，雙抗體、BiTe、雙特異性抗體等)。 本發明還涉及包含這類分子(一種或多種)的藥物組合物。
如本文使用的，術語“施用 (administration) ”涉及以相對劑量和在時間上接近地提供這類分子，以為接收者提供與PD-1或PD-1的天然配體的結合以及對靶細胞(例如，癌細胞或病原體感染的細胞)的重定向殺傷二者。
關於能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子，本發明尤其涉及其中這類分子具備免疫特異性地結合PD-1的表位以抑制(即，阻斷或干涉)PD-1的抑制活性的能力的實施方式。例如，這類分子可結合PD-1，從而抑制細胞信號轉導和/或抑制PD-1和PD-1的天然配體之間的結合。可選地，這類分子可結合PD-1的天然配體(例如，B7-H1或B7-DC)，以便抑制(即，阻斷或干涉)這類天然配體的抑制活性。例如，這類分子可結合PD-1的天然配體，從而抑制細胞信號轉導和/或這類配體和PD-1之間的結合。在一個實施方式中，這類分子是單特異性的，以便具備結合單一表位(例如，PD-1的表位或PD-1的天然配體的表位)的能力。可選地，這類分子可以是多特異性的，即，能夠結合PD-1的兩個或多於兩個的表位(例如，PD-1的2、3、4個或多於4個表位)，或能夠結合PD-1的一個或多個天然配體(一種或多種)的兩個或多於兩個(例如，2、3、4個或多於4個)表位，或能夠結合PD-1的至少一個表位和PD-1的天然配體的至少一個表位。可選地，這類多特異性分子能夠結合PD-1的至少一個表位和結合不是PD-1的不同分子的至少一個表位，或能夠結合PD-1的天然配體的至少一個表位和不是PD-1的天然配體的不同分子的至少一個表位。優選地，不同分子的表位是參與調節存在於免疫細胞表面上的免疫檢查點的分子(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD40L、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳糖凝集素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、MHC I或II類、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3或VISTA，尤其是CD137、LAG-3、OX40、TIGIT、TIM-3或VISTA，參見例如PCT專利公開號WO 2015/200119和WO 2011/159877)的表位。因此，例如，這類分子可結合： (1) PD-1的單一表位； (2) PD-1兩個或多個表位； (3) PD-1的天然配體的單一表位； (4) PD-1的相同天然配體的兩個或多個表位； (5) PD-1的第一天然配體的表位和PD-1的第二天然配體的表位； (6) PD-1的第一天然配體的兩個或多個表位和PD-1的第二天然配體的一個或多個表位； (7) PD-1的一個或多個表位和PD-1的天然配體的一個或多個表位； (8) PD-1的一個或多個表位和不同分子的一個或多個表位；或 (9) PD-1的天然配體的一個或多個表位和不同分子的一個或多個表位。
關於能夠介導對靶細胞(例如，癌細胞或病原體感染的細胞)的重定向殺傷的本發明分子，本發明尤其涉及這樣的實施方式，其中這類分子包含能夠免疫特異性結合效應細胞的細胞表面分子的表位的第一表位結合位點和能夠免疫特異性地結合排列在這類靶細胞的表面上的疾病抗原的表位的第二表位結合位點。在一個實施方式中，這類分子具備結合效應細胞的細胞表面分子的僅單一表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的僅單一表位的能力。可選地，關於任一種或兩種結合特異性，這類分子可以能夠結合效應細胞的細胞表面分子(一種或多種)的一個、兩個或多於兩個表位，並且能夠結合疾病抗原(一種或多種)的一個、兩個或多於兩個表位。因此，例如，這類分子可結合： (1) 效應細胞的細胞表面分子的僅單一表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的單一表位； (2) 這類效應細胞的這類細胞表面分子的僅單一表位和這類疾病抗原的兩個或多於兩個表位； (3) 這類效應細胞的這類細胞表面分子的僅單一表位和這類疾病抗原的一個、兩個或多於兩個表位和不同疾病抗原的一個、兩個或多於兩個表位； (4) 這類效應細胞的這類細胞表面分子的兩個或多於兩個表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的單一表位； (5) 這類效應細胞的這類細胞表面分子的兩個或多於兩個表位和這類疾病抗原的兩個或多於兩個表位； (6) 這類效應細胞的這類細胞表面分子的兩個或多於兩個表位和這類疾病抗原的一個、兩個或多於兩個表位和這類不同疾病抗原的一個、兩個或多於兩個表位； (7) 這類效應細胞的這類細胞表面分子的一個、兩個或多於兩個表位和效應細胞(其可以是相同類型的效應細胞或可以是不同類型的效應細胞)的不同細胞表面分子的一個、兩個或多於兩個表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的單一表位； (8) 這類效應細胞的這類細胞表面分子的一個、兩個或多於兩個表位和效應細胞(其可以是相同類型的效應細胞或可以是不同類型的效應細胞)的不同細胞表面分子的一個、兩個或多於兩個表位和這類疾病抗原的兩個或多於兩個表位；或 (9) 這類效應細胞的這類細胞表面分子的一個、兩個或多於兩個表和效應細胞(其可以是相同類型的效應細胞或可以是不同類型的效應細胞)的不同細胞表面分子的一個、兩個或多於兩個表位和這類疾病抗原的一個、兩個或多於兩個表位和這類不同疾病抗原的一個、兩個或多於兩個表位。
作為實例，本發明考慮這樣的結合分子，其包含能夠免疫特異性地結合CD3(作為效應細胞的細胞表面分子)的表位的第一表位結合位點；能夠免疫特異性地結合排列在這類靶細胞的表面上的疾病抗原的表位的第二表位結合位點；和能夠免疫特異性地結合CD8(作為效應細胞的不同細胞表面分子)的表位的第三表位-結合位點。
表 6A 闡釋了能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的本發明示例性分子的可能的組合結合特異性。表 6B 闡釋了能夠結合PD-1或PD-1的天然配體以及不是PD-1或PD-1的天然配體的分子的本發明示例性多特異性分子的可能的組合結合特異性。表 7 闡釋了能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的本發明示例性分子的可能的組合結合特異性。
對於可由本發明分子結合的表位或另外的表位的性質沒有限制，除了這類另外的結合能力不妨礙能夠抑制結合PD-1或PD-1的天然配體的分子進行這類結合，並且未不妨礙能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子介導這類重定向殺傷。 A. 能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的示例性分子 1. 對於PD-1免疫特異性的結合分子
對於PD-1免疫特異性的抗體是已知的，並且可被採用或改造以用作能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的根據本發明的分子(例如，雙抗體、ScFv、抗體、CAR、TandAb等) (參見，例如，美國專利申請號62/198,867、62/239,559、62/255,140；美國專利號8,008,449、8,552,154；PCT專利公開號WO 2012/135408、WO 2012/145549和WO 2013/014668)。能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的優選的分子將展現結合人PD-1的連續或非連續(例如，構象)部分(表位 )(CD279)的能力，並且優選地同樣展現結合一種或多種非人物種，尤其是靈長類物種(和尤其是靈長類物種，比如食蟹猴)的PD-1分子的能力。可通過分離使用PD-1或其肽片段引起的分泌抗體的雜交瘤來製備另外期望的抗體。代表性人PD-1多肽(NCBI序列NP_005009.2；包括20個氨基酸殘基信號序列，加底線顯示)和268個氨基酸殘基成熟蛋白質)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:45 )： MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL
可用於結合PD-1的優選PD-1-結合分子特徵在於任意(一個或多個)的下述標準： (1) 特異性結合在刺激的人T細胞表面上內源性地表達的人PD-1； (2) 以40 nM或更少的平衡結合常數(KD )特異性結合人PD-1； (3) 以5 nM或更少的平衡結合常數(KD )特異性結合人PD-1； (4) 以1.5 x 104 M-1 min-1 或更多的結合速率(on rate) (ka )特異性結合人PD-1； (5) 以90.0 x 104 M-1 min-1 或更多的結合速率(ka )特異性結合人PD-1； (6) 以7 x 10-4 min-1 或更少的解離速率(off rate)(kd )特異性結合人PD-1； (7) 以2 x 10-4 min-1 或更少的解離速率(kd )特異性結合人PD-1； (8) 特異性結合非-人靈長類動物PD-1 (例如，食蟹猴的PD-1)； (9) 抑制(即，阻斷或干涉)PD-1配體(PD-L1/PD-L2)與PD-1的結合/抑制活性； (10) 刺激免疫應答；和/或 (11) 用抗-人LAG-3抗體協同作用以刺激抗原特異性T細胞應答。
本發明優選的可用於結合PD-1的抗-人PD-1-結合分子具備鼠科抗-人PD-1單克隆抗體“PD-1 mAb 1 ”、“PD-1 mAb 2 ”、“PD-1 mAb 3 ”、“PD-1 mAb 4 ”、“PD-1 mAb 5 ”、“PD-1 mAb 6”、“PD-1 mAb 7 ”、“PD-1 mAb 8 ”、“PD-1 mAb 9 ”、“PD-1 mAb 10 ”、“PD-1 mAb 11 ”、“PD-1 mAb 12 ”、“PD-1 mAb 13 ”、“PD-1 mAb 14 ”或“PD-1 mAb 15 ”的人源化VH和/或VL結構域，並且更優選地具備VH結構域的1、2或全部3個CDRH 和/或這類抗體的VL結構域的1、2或全部3個CDRL 。本發明尤其涉及這類PD-1-結合分子，其包含PD-1結合結構域，所述PD-1結合結構域具備： (A) (1)PD-1 mAb 1 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 1 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 1 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 1 的VL結構域的三個CDRL ； (4)hPD-1 mAb 1 VH1 的VH結構域； (5)hPD-1 mAb 1 VL1 的VL結構域； (6)hPD-1 mAb 1 的VH和VL結構域； (B) (1)PD-1 mAb 2 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 2 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 2 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 2 的VL結構域的三個CDRL ； (4)hPD-1 mAb 2 VH1 的VH結構域； (5)hPD-1 mAb 2 VL1 的VL結構域； (6)hPD-1 mAb 2 的VH和VL結構域； (C) (1)PD-1 mAb 3 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 3 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 3 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 3 的VL結構域的三個CDRL ； (D) (1)PD-1 mAb 4 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 4 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 4 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 4 的VL結構域的三個CDRL ； (E) (1)PD-1 mAb 5 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 5 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 5 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 5 的VL結構域的三個CDRL ； (F) (1)PD-1 mAb 6 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 6 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 6 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 6 的VL結構域的三個CDRL ； (G) (1)PD-1 mAb 7 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 7 或hPD-1 mAb 7 VL2 或hPD-1 mAb 7 VL3 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 7 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 7 或hPD-1 mAb 7 VL2 、hPD-1 mAb 7 VL3 的VL結構域的三個CDRL ； (4)hPD-1 mAb 7 VH1 或hPD-1 mAb 7 VH2 的VH結構域； (5)hPD-1 mAb 7 VL1 或hPD-1 mAb 7 VL2 或hPD-1 mAb 7 VL 3 的VL結構域； (6)hPD-1 mAb 7(1.1) 或hPD-1 mAb 7(1.2) 或hPD-1 mAb 7(1.3) 或hPD-1 mAb 7(2.1) 或hPD-1 mAb 7(2.2) 或hPD-1 mAb 7(2.3) 的VH和VL結構域； (H) (1)PD-1 mAb 8 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 8 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 8 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 8 的VL結構域的三個CDRL ； (I) (1)PD-1 mAb 9 或hPD-1 mAb 9 VH2 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 9 或hPD-1 mAb 9 VL2 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 9 或hPD-1 mAb 9 VH2 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 9 或hPD-1 mAb 9 VL2 的VL結構域的三個CDRL ； (4)hPD-1 mAb 9 VH1 或hPD-1 mAb 9 VH2 的VH結構域； (5)hPD-1 mAb 9 VL1 或hPD-1 mAb 9 VL2 的VL結構域； (6)hPD-1 mAb 9(1.1) 或hPD-1 mAb 9(1.2) 或hPD-1 mAb 9(2.1) 或hPD-1 mAb 9(2.2) 的VH和VL結構域； (J) (1)PD-1 mAb 10 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 10 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 10 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 10 的VL結構域的三個CDRL ； (K) (1)PD-1 mAb 11 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 11 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 11 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 11 的VL結構域的三個CDRL ； (L) (1)PD-1 mAb 12 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 12 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 12 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 12 的VL結構域的三個CDRL ； (M) (1)PD-1 mAb 13 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 13 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 13 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 13 的VL結構域的三個CDRL ； (N) (1)PD-1 mAb 14 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 14 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 14 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 14 的VL結構域的三個CDRL ； (O) (1)PD-1 mAb 15 的VH結構域的三個CDRH ； (2)PD-1 mAb 15 的VL結構域的三個CDRL ； (3)PD-1 mAb 15 的VH結構域的三個CDRH 和PD-1 mAb 15 的VL結構域的三個CDRL ； (4)hPD-1 mAb 15 VH1 的VH結構域； (5)hPD-1 mAb 15 VL1 的VL結構域； (6)hPD-1 mAb 15 的VH和VL結構域； 或 所述PD-1結合結構域結合或競爭結合與PD-1 mAb 1 、PD-1 mAb 2 、PD-1 mAb 3 、PD-1 mAb 4 、PD-1 mAb 5 、PD-1 mAb 6 、PD-1 mAb 7 、PD-1 mAb 8 、PD-1 mAb 9 、PD-1 mAb 10 、PD-1 mAb 11 、PD-1 mAb 12 、PD-1 mAb 13 、PD-1 mAb 14 或PD-1 mAb 15 相同的表位。 (a) PD-1 mAb 1
鼠科抗-人PD-1 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:46 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 DVQLQESGPG RVKPSQSLSL TCTVTGFSIT NDYAWN WIRQ FPGNKLEWMG HITYSGSTSY NPSLKS RISI TRDTSKNHFF LQLSSVTPED TATYYCAR DY GSGYPYTLDY WGQGTSVTVS S PD-1 mAb 1的CDRH 1(SEQ ID NO:47 ):NDYAWN PD-1 mAb 1的CDRH 2 (SEQ ID NO:48 ):HITYSGSTSYNPSLKS PD-1 mAb 1的CDRH 3 (SEQ ID NO:49 ):DYGSGYPYTLDY
鼠科抗-人PD-1 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:50 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： QIVLTQSPAL MSASPGEKVT MTC SATSIVS YVY WYQQKPG SSPQPWIY LT SNLAS GVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYC QQW SDNPYT FGGG TKLEIK PD-1 mAb 1 CDRL 1 (SEQ ID NO:51 ):SATSIVSYVY PD-1 mAb 1的CDRL 2 (SEQ ID NO:52 ):LTSNLAS PD-1 mAb 1的CDRL 3 (SEQ ID NO:53 ):QQWSDNPYT
當抗原表位被識別時，上述鼠科抗-人PD-1抗體PD-1 mAb 1 被人源化並且進一步被去免疫化，以證明人源化抗-人PD-1抗體的能力時，從而降低其在施用至人接收者後的抗原性。人源化產生一種人源化VH結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 1 VH1 ”，和一種人源化VL結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 1 VL1 ”。因此，包含與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域的抗體被稱為“hPD-1 mAb 1 ”。
hPD-1 mAb 1 VH1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:54 )如下顯示 (CDRH 殘基以底線顯示)： DVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGFSIS NDYAWN WIRQ PPGKGLEWIG HITYSGSTSY NPSLKS RLTI TRDTSKNQFV LTMTNMDPVD TATYYCAR DY GSGYPYTLDY WGQGTTVTVS S
hPD-1 mAb 1 VL1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:55 )如下顯示 (CDRH 殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSVSPGEKVT ITC SATSIVS YVY WYQQKPG QAPQPLIY LT SNLAS GIPAR FSGSGSGTDF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SDNPYT FGGG TKVEIK (b) PD-1 mAb 2
鼠科抗-人PD-1 mAb 2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:56 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSGSMSISY ADTVKG RFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCAS LS DYFDY WGQGT TLTVSS PD-1 mAb 2的CDRH 1(SEQ ID NO:57 ):SFGMH PD-1 mAb 2的CDRH 2 (SEQ ID NO:58 ):YISSGSMSISYADTVKG PD-1 mAb 2的CDRH 3 (SEQ ID NO:59 ):LSDYFDY
鼠科抗-人PD-1 mAb 2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:60 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSTGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY RVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV FFC SQTTHVP WT FGGGTKLE IK PD-1 mAb 2的CDRL 1 (SEQ ID NO:61 ):RSSQSLVHSTGNTYLH PD-1 mAb 2的CDRL 2 (SEQ ID NO:62 ):RVSNRFS PD-1 mAb 2的CDRL 3 (SEQ ID NO:63 ):SQTTHVPWT
當抗原表位被識別時，上述的鼠科抗-人PD-1抗體PD-1 mAb 2 被人源化並且進一步被去免疫化，以證明人源化抗-人PD-1抗體的能力，從而降低其施用至人接收者後的抗原性。人源化產生一種人源化VH結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 2 VH1 ”，和一種人源化VL結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 1 VL1 ”。因此，包含與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域的抗體被稱為“hPD-1 mAb 2 ”。
hPD-1 mAb 2 VH1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:64 如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSGSMSISY ADTVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCAS LS DYFDY WGQGT TVTVSS
h PD-1 mAb 2 VL1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:65 如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISC RSSQSLV HSTGNTYLH W YLQKPGQSPQ LLIY RVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC SQTTHVP WT FGQGTKLE IK (c) PD-1 mAb 3
鼠科抗-人PD-1 mAb 3 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:66 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 QVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFT DYVMH WVKQT PVHGLEWIG T IDPETGGTAY NQKFKG KAIL TADKSSNTAY MELRSLTSED SAVYYFTR EK ITTIVEGTYW YFDV WGTGTT VTVSS PD-1 mAb 3的CDRH 1(SEQ ID NO:67 ):DYVMH PD-1 mAb 3的CDRH 2 (SEQ ID NO:68 ):TIDPETGGTAYNQKFKG PD-1 mAb 3的CDRH 3 (SEQ ID NO:69 ):EKITTIVEGTYWYFDV
鼠科抗-人PD-1 mAb 3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:70 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DVLLTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQNIV HSNGDTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHLP YT FGGGTKLE IK PD-1 mAb 3的CDRL 1 (SEQ ID NO:71 ):RSSQNIVHSNGDTYLE PD-1 mAb 3的CDRL 2 (SEQ ID NO:72 ):KVSNRFS PD-1 mAb 3的CDRL 3 (SEQ ID NO:73 ):FQGSHLPYT (d) PD-1 mAb 4
鼠科抗-人PD-1 mAb 4 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:74 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSGSMSISY ADTVKG RFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCAS LT DYFDY WGQGT TLTVSS PD-1 mAb 4的CDRH 1(SEQ ID NO:75 ):SFGMH PD-1 mAb 4的CDRH 2 (SEQ ID NO:76 )：YISSGSMSISYADTVKG PD-1 mAb 4的CDRH 3 (SEQ ID NO:77 ):LTDYFDY
鼠科抗-人PD-1 mAb 4 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:78 )如下顯示(CDRL殘基以底線顯示)： DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSTGNTYFH W YLQKPGQSPK LLIY RVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQTTHVP WT FGGGTKLE IK PD-1 mAb 4的CDRL 1 (SEQ ID NO:79 ):RSSQSLVHSTGNTYFH PD-1 mAb 4的CDRL 2 (SEQ ID NO:80 ):RVSNRFS PD-1 mAb 4的CDRL 3 (SEQ ID NO:81 ):SQTTHVPWT (e) PD-1 mAb 5
鼠科抗-人PD-1 mAb 5 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:82 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 QVQLQQPGVE LVRPGASVKL SCKASGYSFT AYWMN WMKQR PGQGLEWIG V IHPSDSETWL NQKFKD KATL TVDKSSSTAY MQLISPTSED SAVYYCAR EH YGSSPFAY WG QGTLVTVSA PD-1 mAb 5的CDRH 1(SEQ ID NO:83 ):AYWMN PD-1 mAb 5的CDRH 2 (SEQ ID NO:84 ):VIHPSDSETWLNQKFKD PD-1 mAb 5的CDRH 3 (SEQ ID NO:85 ):EHYGSSPFAY
鼠科抗-人PD-1 mAb 5 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:86 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RANESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIY AASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDTAMY FC QQSKEVPY T FGGGTKLEI K PD-1 mAb 5的CDRL 1 (SEQ ID NO:87 ):RANESVDNYGMSFMN PD-1 mAb 5的CDRL 2 (SEQ ID NO:88 ):AASNQGS PD-1 mAb 5的CDRL 3 (SEQ ID NO:89 ):QQSKEVPYT (f) PD-1 mAb 6
鼠科抗-人PD-1 mAb 6 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:90 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVKLVESGGG LVNPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGSDTYY PDSVKG RFTI SRDNAKNNLY LQMSSLRSED TALYYCAR QK ATTWFAY WGQ GTLVTVST PD-1 mAb 6的CDRH 1(SEQ ID NO:91 ):SYGMS PD-1 mAb 6的CDRH 2 (SEQ ID NO:92 ):TISGGGSDTYYPDSVKG PD-1 mAb 6的CDRH 3 (SEQ ID NO:93 ):QKATTWFAY
鼠科抗-人PD-1 mAb 6 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:94 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RASESVD NYGISFMN WF QQKPGQPPKL LIY PASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FC QQSKEVPW T FGGGTKLEI K PD-1 mAb 6的CDRL 1 (SEQ ID NO:95 ):RASESVDNYGISFMN PD-1 mAb 6的CDRL 2 (SEQ ID NO:96 ):PASNQGS PD-1 mAb 6的CDRL 3 (SEQ ID NO:97 ):QQSKEVPWT (g) PD-1 mAb 7
鼠科抗-人抗-人PD-1 mAb 7 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:98 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYSFT SYWMN WVKQR PGQGLEWIG V IHPSDSETWL DQKFKD KATL TVDKSSTTAY MQLISPTSED SAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS CDRH 1 of PD-1 mAb 7(SEQ ID NO:99 ):SYWMN PD-1 mAb 7的CDRH 2 (SEQ ID NO:100 ):VIHPSDSETWLDQKFKD PD-1 mAb 7的CDRH 3 (SEQ ID NO:101 ):EHYGTSPFAY
鼠科抗-人PD-1 mAb 7 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:102 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RANESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS GVPARFSGSG FGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FC QQSKEVPY T FGGGTKLEI K PD-1 mAb 7的CDRL 1 (SEQ ID NO:103 ):RANESVDNYGMSFMN PD-1 mAb 7的CDRL 2 (SEQ ID NO:104 ):AASNQGS PD-1 mAb 7的CDRL 3 (SEQ ID NO:105 ):QQSKEVPYT
當抗原表位被識別時，上述鼠科抗-人PD-1抗體PD-1 mAb 7 被人源化並且進一步被去免疫化，以證明人源化抗-人PD-1抗體人的能力，從而降低其施用至人接收者後的抗原性。人源化產生兩種人源化VH結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 7 VH1 ”和“hPD-1 mAb 7 VH2 ”，以及三個人源化VL結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 7 VL1 ”、“hPD-1 mAb 7 VL2 ”和“hPD-1 mAb 7 VL3 ”。任何人源化VL結構域可與任一人源化VH結構域配對。因此，包含與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域的一種的任何抗體總體上被稱為“hPD-1 mAb 7 ” ，並且具體的人源化VH/VL結構域的組合通過參照特定的VH/VL結構域被命名，例如包含hPD-1 mAb 7 VH1 和hPD-1 mAb 1 VL2 的人源化抗體被具體稱為“hPD-1 mAb 7(1.2) ”。
hPD-1 mAb 7 VH1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:106 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWIG V IHPSDSETWL DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS
hPD-1 mAb 7 VH2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:107 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWAG V IHPSDSETWL DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS
hPD-1 mAb 7 VL1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:108 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RANESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K
hPD-1 mAb 7 VL2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:109 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K
hPD-1 mAb 7 VL3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:110 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNRGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K
hPD-1 mAb 7 VL2 和hPD-1 mAb 7 VL3 的VL結構域的CDRL 1包含天冬醯胺至絲氨酸的氨基酸取代並且具有氨基酸序列：RA S ESVDNYGMSFMN(SEQ ID NO:111 )，取代的絲氨酸以底線顯示)。考慮類似的取代可併入至上述的任意PD-1 mAb 7 CDRL 1結構域中。
另外，hPD-1 mAb 7 VL3 的VL結構域的CDRL 2包含穀氨醯胺至精氨酸的氨基酸取代並且具有氨基酸序列：AASN R GS (SEQ ID NO:112 )，取代的精氨酸以底線顯示)考慮類似的取代可併入至任意上述PD-1 mAb 7 CDRL 2結構域中。 (h) PD-1 mAb 8
鼠科抗-人PD-1 mAb 8 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:113 )如下顯示 (CDRH 殘基以底線顯示)。 EGQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMN WVKQN HGKSLEWIG D INPKNGDTHY NQKFKG EATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCAS DF DY WGQGTTLT VSS PD-1 mAb 8的CDRH 1(SEQ ID NO:114 ):DYYMN PD-1 mAb 8的CDRH 2 (SEQ ID NO:115 ):DINPKNGDTHYNQKFKG PD-1 mAb 8的CDRH 3 (SEQ ID NO:116 ):DFDY
鼠科抗-人PD-1 mAb 8 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:117 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DVVMTQTPLS LPVGLGDQAS ISC RSSQTLV YSNGNTYLN W FLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP FT FGSGTKLE IK PD-1 mAb 8的CDRL 1 (SEQ ID NO:118 ):RSSQTLVYSNGNTYLN PD-1 mAb 8的CDRL 2 (SEQ ID NO:119 ):KVSNRFS PD-1 mAb 8的CDRL 3 (SEQ ID NO:120 ):SQSTHVPFT (i) PD-1 mAb 9
鼠科抗-人PD-1 mAb 9 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:121 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGGNTYY SDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQISSLRSED TALYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS PD-1 mAb 9的CDRH 1(SEQ ID NO:122 ):SYLVS PD-1 mAb 9的CDRH 2 (SEQ ID NO:123 ):TISGGGGNTYYSDSVKG PD-1 mAb 9的CDRH 3 (SEQ ID NO:124 ):YGFDGAWFAY
鼠科抗-人PD-1 mAb 9 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:125 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPAS LSASVGDIVT ITC RASENIY SYLA WYQQKQ EKSPQLLVY N AKTLAA GVPS RFSGSGSGTQ FSLTINSLQP EDFGNYYC QH HYAVPWT FGG GTRLEIT PD-1 mAb 9的CDRL 1 (SEQ ID NO:126 ):RASENIYSYLA PD-1 mAb 9的CDRL 2 (SEQ ID NO:127 ):NAKTLAA PD-1 mAb 9的CDRL 3 (SEQ ID NO:128 ):QHHYAVPWT
當抗原表位被識別時，上述鼠科抗-人PD-1抗體PD-1 mAb 9 被人源化並且進一步被去免疫化，以證明人源化抗-人PD-1抗體人的能力，從而降低其施用至人接收者後的抗原性。人源化產生兩種人源化VH結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 9 VH1 ”和“hPD-1 mAb 9 VH2 ”，以及兩種人源化VL結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 9 VL1 ”和“hPD-1 mAb 9 VL2 ”。任意人源化VL結構域可與人源化VH結構域配對。因此，包含與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域中的一種的任何抗體總體上被稱為“hPD-1 mAb 9 ”，並且具體的人源化VH/VL結構域的組合參照特定的VH/VL結構域被命名，例如包含hPD-1 mAb 9 VH1 和hPD-1 mAb 9 VL2 的人源化抗體被具體稱為“hPD-1 mAb 9(1.2) ”。
hPD-1 mAb 9 VH1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:129 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVRPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVS WVRQA PGKGLEWVA T ISGGGGNTYY SDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS
hPD-1 mAb 9 VH2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:130 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LARPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVG WVRQA PGKGLEWTA T ISGGGGNTYY SDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSARAED TATYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS
hPD-1 mAb 9 VH2 的VH結構域的CDRH 1包含絲氨酸至甘氨酸的氨基酸取代並且具有氨基酸序列：SYLV G ((SEQ ID NO:131 )，取代的甘氨酸以底線顯示)。考慮類似的取代可併入至任意上述的PD-1 mAb 9 CDRH 1結構域中。
hPD-1 mAb 9 VL1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:132 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASENIY SYLA WYQQKP GKAPKLLIY N AKTLAA GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYAVPWT FGQ GTKLEIK
hPD-1 mAb 9 VL2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:133 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASENIY NYLA WYQQKP GKAPKLLIY D AKTLAA GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYAVPWT FGQ GTKLEIK
hPD-1 mAb 9 VL2 的VL結構域的CDRL 1包含絲氨酸至天冬醯胺的氨基酸取代並且具有氨基酸序列：RASENIY N YLA (SEQ ID NO:134 )，取代的天冬醯胺以底線顯示)。考慮類似的取代可併入至任意上述PD-1 mAb 9 CDRL 1結構域中。
hPD-1 mAb 9 VL2 的VL結構域的CDRL 2包含天冬醯胺至天冬氨酸的氨基酸取代並且具有氨基酸序列： D AKTLAA ((SEQ ID NO:135 )，取代的天冬氨酸以底線顯示)。考慮類似的取代可併入至任意上述的PD-1 mAb 7 CDRL 2結構域中。 (j)PD-1 mAb 10
鼠科抗-人PD-1 mAb 10 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:136 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVILVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS NYLMS WVRQT PEKRLEWVA S ISGGGSNIYY PDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRSED TALYYCAR QE LAFDY WGQGT TLTVSSPD-1 mAb 10 的CDRH 1(SEQ ID NO:137 ):NYLMS PD-1 mAb 10 的CDRH 2 (SEQ ID NO:138 ):SISGGGSNIYYPDSVKG PD-1 mAb 10 的CDRH 3 (SEQ ID NO:139 ):QELAFDY
鼠科抗-人PD-1 mAb 10 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:140 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RTSQDIS NFLN WYQQKP DGTIKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GSTLPWT FGG GTKLEIIPD-1 mAb 10 的CDRL 1 (SEQ ID NO:141 ):RTSQDISNFLN PD-1 mAb 10 的CDRL 2 (SEQ ID NO:142 ):YTSRLHS PD-1 mAb 10 的CDRL 3 (SEQ ID NO:143 ):QQGSTLPWT (k) PD-1 mAb 11
鼠科抗-人PD-1 mAb 11 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:144 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVQLQQSGTV LARPGASVKM SCKTSGYTFT GYWMH WVKQR PGQGLKWMG A IYPGNSDTHY NQKFKG KAKL TAVTSASTAY MELSSLTNED SAIYYCTT GT YSYFDV WGTG TTVTVSSPD-1 mAb 11 的CDRH 1(SEQ ID NO:145 ):GYWMH PD-1 mAb 11 的CDRH 2 (SEQ ID NO:146 ):AIYPGNSDTHYNQKFKG PD-1 mAb 11 的CDRH 3 (SEQ ID NO:147 ):GTYSYFDV
鼠科抗-人PD-1 mAb 11 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:148 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSC RASQSIG TSIH WYQHRT NGSPRLLIK Y ASESIS GIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYC QQ SNSWLT FGAG TKLELKPD-1 mAb 11 的CDRL 1 (SEQ ID NO:149 ):RASQSIGTSIH PD-1 mAb 11 的CDRL 2 (SEQ ID NO:150 ):YASESIS PD-1 mAb 11 的CDRL 3 (SEQ ID NO:151 ):QQSNSWLT (l) PD-1 mAb 12
鼠科抗-人PD-1 mAb 12 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:152 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 QGHLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGFTFT DYEMH WVKQT PVHGLEWIG T IDPETGGTAY NQKFKG KAIL TVDKSSTTTY MELRSLTSED SAVFYCSR ER ITTVVEGAYW YFDV WGTGTT VTVSSPD-1 mAb 12 的CDRH 1(SEQ ID NO:153 ):DYEMH PD-1 mAb 12 的CDRH 2 (SEQ ID NO:154 ):TIDPETGGTAYNQKFKG PD-1 mAb 12 的CDRH 3 (SEQ ID NO:155 ):ERITTVVEGAYWYFDV
鼠科抗-人PD-1 mAb 12 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:156 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQNIV HSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIC KVSTRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP YT FGGGTKLE IKPD-1 mAb 12 的CDRL 1 (SEQ ID NO:157 ):RSSQNIVHSNGNTYLE PD-1 mAb 12 的CDRL 2 (SEQ ID NO:158 ):KVSTRFS PD-1 mAb 12 的CDRL 3 (SEQ ID NO:159 ):FQGSHVPYT (m) PD-1 mAb 13
鼠科抗-人PD-1 mAb 13 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:160 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SHTMS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGSNIYY PDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCAR QA YYGNYWYFDV WGTGTTVTVS SPD-1 mAb 13 的CDRH 1(SEQ ID NO:161 ):SHTMS PD-1 mAb 13 的CDRH 2 (SEQ ID NO:162 ):TISGGGSNIYYPDSVKG PD-1 mAb 13 的CDRH 3 (SEQ ID NO:163 ):QAYYGNYWYFDV
鼠科抗-人PD-1 mAb 13 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:164 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPAT QSASLGESVT ITC LASQTIG TWLA WYQQKP GKSPQLLIY A ATSLAD GVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVSYYC QQ LDSIPWT FGG GTKLEIKPD-1 mAb 13 的CDRL 1 (SEQ ID NO:165 ):LASQTIGTWLA PD-1 mAb 13 的CDRL 2 (SEQ ID NO:166 ):AATSLAD PD-1 mAb 13 的CDRL 3 (SEQ ID NO:167 ):QQLDSIPWT (n) PD-1 mAb 14
鼠科抗-人PD-1 mAb 14 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:168 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYNFI SYWIT WVKQR PGQGLQWIG N IYPGTDGTTY NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MHLSRLTSED SAVYYCAT GL HWYFDV WGTG TTVTVSSPD-1 mAb 14 的CDRH 1(SEQ ID NO:169 ):SYWIT PD-1 mAb 14 的CDRH 2 (SEQ ID NO:170 ):NIYPGTDGTTYNEKFKS PD-1 mAb 14 的CDRH 3 (SEQ ID NO:171 ):GLHWYFDV
鼠科抗-人PD-1 mAb 14 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:172 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTC KASQSVG TNVA WYQQKP GQSPKALIY S ASSRFS GVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFC QQ YNSYPYT FGG GTKLEIKPD-1 mAb 14 的CDRL 1 of (SEQ ID NO:173 ):KASQSVGTNVA PD-1 mAb 14 的CDRL 2 of (SEQ ID NO:174 ):SASSRFS PD-1 mAb 14 的CDRL 3 of (SEQ ID NO:175 ):QQYNSYPYT (o) PD-1 mAb 15
鼠科抗-人PD-1 mAb 15 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:176 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFIFS SYLIS WVRQT PEKRLEWVA A ISGGGADTYY ADSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCTR RG TYAMDY WGQG TSVTVSSPD-1 mAb 15 的CDRH 1(SEQ ID NO:177 ):SYLIS PD-1 mAb 15 的CDRH 2 (SEQ ID NO:178 ):AISGGGADTYYADSVKG PD-1 mAb 15 的CDRH 3 (SEQ ID NO:179 ):RGTYAMDY
鼠科抗-人PD-1 mAb 15 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:180 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPAS QSASLGESVT ITC LASQTIG TWLA WYQQKP GKSPQLLIY A ATSLAD GVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVNYYC QQ LYSIPWT FGG GTKLEIKPD-1 mAb 15 的CDRL 1 (SEQ ID NO:181 ):LASQTIGTWLA PD-1 mAb 15 的CDRL 2 (SEQ ID NO:182 ):AATSLAD PD-1 mAb 15 的CDRL 3 (SEQ ID NO:183 ):QQLYSIPWT
當抗原表位被識別時，上述鼠科抗-人PD-1抗體PD-1 mAb 15 被人源化並且進一步被去免疫化，以證明人源化抗-人PD-1抗體人的能力，從而降低其施用至人接收者後的抗原性。人源化產生一種人源化VH結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 15 VH1 ”，和一種人源化VL結構域，本文指定為“hPD-1 mAb 15 VL1 ”。包含與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域的抗體被稱為“hPD-1 mAb 15 ”。
hPD-1 mAb 15 VH1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:184 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLIS WVRQA PGKGLEWVA A ISGGGADTYY ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCAR RG TYAMDY WGQG TLVTVSS
hPD-1 mAb 15 VL1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:185 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC LASQTIG TWLA WYQQKP GKAPKLLIY A ATSLAD GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDFATYYC QQ LYSIPWT FGQ GTKLEIK (p) 另外的抗PD-1抗體
可用於產生能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的可選的分子的抗-PD-1抗體具備下述抗-人PD-1單克隆抗體的VL和/或VH結構域：尼魯單抗 (nivolumab) (CAS登記號:946414-94-4，也稱為5C4、BMS-936558、ONO-4538、MDX-1106並且由Bristol-Myers Squibb以OPDIVO®售賣)；派姆單抗 (pembrolizumab) ，(之前稱為蘭羅利珠單抗(lambrolizumab))，CAS登記號:1374853-91-4，也稱為MK-3475、SCH-900475，並且由Merck以KEYTRUDA®售賣)；EH12.2H7 (Dana Farber)；皮地珠單抗 (pidilizumab )，CAS登記號：1036730-42-3，也稱為CT-011，CureTech,)，或表 8 中的任何抗PD-1抗體；並且更優選地具有這類抗PD-1單克隆抗體的VL區的1、2或所有3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或所有3個CDRH 。尼魯單抗(WHO藥物資訊，2013，推薦的INN：列表69, 27(1):68-69)、派姆單抗(WHO藥物資訊，2014，推薦的INN：列表75, 28(3):407)和皮地珠單抗(WHO藥物資訊，2013，推薦的INN：列表70, 27(3):303-304)的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列是本領域中已知的。可用於本發明方法和組合物中的具備獨特的結合特徵的另外的抗-PD-1抗體最近已經被鑒別(參見，美國專利申請號62/198,867；62/239,559；62/255,140)。 (q) 示例性IgG4 PD-1抗體
在某些實施方式中，可用於本發明方法和組合物的抗-PD-1抗體包含以上提供的任意抗體(例如，PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8等或表 6 中的任意抗-PD-1抗體)的VL和VH結構域、κCL結構域(SEQ ID NO:12 )和IgG4 Fc結構域，任選地缺少C-末端賴氨酸殘基。這類抗體優選地包含IgG4 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )和鉸鏈結構域，並且更優選地包括含S228P取代的穩定化IgG4鉸鏈(其中編號根據Kabat中的EU索引，SEQ ID NO:7 )和IgG4 CH2-CH3結構域 (SEQ ID NO:7 )。
被命名為“hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) ”的示例性抗-PD-1抗體是人源化抗-人PD-1抗體。如以上指出的，hPD-1 mAb 7(1.2) 包含hPD-1 mAb 7 VH1 的VH結構域和抗體hPD-1 mAb 7 VL2 的VL結構域。
hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4 (P) 的完整重鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:186 (CDRH 殘基和S228P殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWIG V IHPSDSETWL DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCP P CPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG
在SEQ ID NO:186 中，殘基1-119對應於hPD-1 mAb 7 VH1 的VH結構域(SEQ ID NO:106 )，氨基酸殘基120-217對應於人IgG4 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )，氨基酸殘基218-229對應於包括S228P取代的人IgG4鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7 )，氨基酸殘基230-245對應於人IgG4 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:11 ，其中X不存在)。
抗體hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4 (P) 的完整輕鏈的氨基酸序列具備κ恆定區並且是(SEQ ID NO:18 7 )： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
在SEQ ID NO:187 中，氨基酸殘基1-111對應於hPD-1 mAb 7 VL2 VL的結構域(SEQ ID NO:109 )，並且氨基酸殘基112-218對應於輕鏈κ恆定區 (SEQ ID NO:12 )。
具有IgG4恆定區的其它示例性抗-PD-1抗體是尼魯單抗 ，其是人抗體，以及派姆單抗 ，其是人源化抗體。每種各包含如上所描述的κ CL結構域、IgG4 CH1結構域、穩定化的IgG4鉸鏈和IgG4 CH2-CH3結構域。 (r) 能夠結合PD-1和LAG-3的示例性雙特異性分子
如本文中提供的，能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子可以是雙特異性分子。在某些實施方式中，雙特異性分子優選包含任意以上提供的抗-PD-1抗體(例如，PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8等或表 6 中的任意抗-PD-1抗體)的VL和VH結構域以及結合CD137、LAG-3、OX40、TIGIT、TIM-3或VISTA的表位的抗體的VL和VH結構域。這類雙特異性分子可以是雙抗體、BITEs®、雙特異性抗體或三價結合分子。
被命名為“DART-1 ”的、能夠結合PD-1和LAG-3的示例性雙特異性分子是包括四條多肽鏈的雙抗體。DART-1 是雙特異性四鏈含Fc區的雙抗體，其具有對於PD-1特異性的兩個結合位點、對於LAG-3特異性的兩個結合位點、為了延長半衰期而被工程化的變異的IgG4 Fc區和包含半胱氨酸的E/K-螺旋異源二聚體促進結構域(參見，例如，圖 3B )。DART-1的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端、能夠結合至LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(SEQ ID NO:273 中的底線)；間插連接體肽(連接體 1 ： GGGSGGGG (SEQ ID NO:14 ))、hPD-1 mAb 7 VH1 的VH結構域(SEQ ID NO:106 )；包含半胱氨酸的間插連接體肽(連接體 2 ： GGCGGG (SEQ ID NO:15 ))；包含半胱氨酸的異源二聚體促進(E-螺旋)結構域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:29 ))；穩定化的IgG4鉸鏈區(SEQ ID NO:7 )；另外包含氨基酸取代M252Y/S254T/T256E並且缺少C-末端殘基的變異的IgG4 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:11 ))；和C-末端。DART-1 的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是 (SEQ ID NO:273 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIK GGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
DART-1 的第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端、hPD-1 mAb 7 VL2 的VL結構域(SEQ ID NO:109 )；間插連接體肽(連接體 1 ： GGGSGGGG (SEQ ID NO:14 ))；能夠結合 LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(SEQ ID NO:274 中的底線)；包含半胱氨酸的間插連接體肽(連接體 2 ： GGCGGG (SEQ ID NO:15 ))；包含半胱氨酸的異源二聚體促進(K-螺旋)結構域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:30 )；和C-末端。DART-1 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:274 )： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGG Q VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSS GGC GGGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
命名為“DART-2 ”的能夠結合PD-1和LAG-3的另一示例性雙特異性分子具有與DART-1 相同的結構但是併入可選的LAG-3 VL和VH結構域。 2. 對於PD-1的天然配體免疫特異性的結合分子
如以上討論的，PD-1的天然配體，例如B7-H1 (PD-L1)和B7-DC (PD-L2)，已經被描述(Ohigashi等人, (2005) “Clinical Significance Of Programmed Death-1 Ligand-1 And Programmed Death-1 Ligand-2 Expression In Human Esophageal Cancer ,” Clin. Cancer Res. 11:2947-2953；Dong, H.等人, (1999) “B7-H1, A Third Member Of The B7 Family, Co-Stimulates Cell Proliferation And Interleukin-10 Secretion ,” Nat. Med. 5:1365-1369；Freeman, G.J.等人, (2000) “Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation ,” J. Exp. Med. 192:1027-1034；Tseng, S.Y.等人, (2001) “B7-DC, A New Dendritic Cell Molecule With Potent Costimulatory Properties For T Cells ,” J. Exp. Med 193:839-846；Latchman, Y.等人, (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation ,” Nat. Immunol. 2:261-268；Iwai等人, (2002) “Involvement Of PD-L1 On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy By PD-L1 Blockade ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 99:12293-12297)。
代表性人B7-H1 (PD-L1)多肽(NCBI序列NP_001254635.1，包括預測的18個氨基酸信號序列)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:188 )： MRIFAVFIFM TYWHLLNAPY NKINQRILVV DPVTSEHELT CQAEGYPKAE VIWTSSDHQV LSGKTTTTNS KREEKLFNVT STLRINTTTN EIFYCTFRRL DPEENHTAEL VIPELPLAHP PNERTHLVIL GAILLCLGVA LTFIFRLRKG RMMDVKKCGI QDTNSKKQSD THLEET
代表性人B7-DC (PD-L2)多肽(NCBI序列NP_079515.2；包括預測的18個氨基酸信號序列)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:189 )： MIFLLLMLSL ELQLHQIAAL FTVTVPKELY IIEHGSNVTL ECNFDTGSHV NLGAITASLQ KVENDTSPHR ERATLLEEQL PLGKASFHIP QVQVRDEGQY QCIIIYGVAW DYKYLTLKVK ASYRKINTHI LKVPETDEVE LTCQATGYPL AEVSWPNVSV PANTSHSRTP EGLYQVTSVL RLKPPPGRNF SCVFWNTHVR ELTLASIDLQ SQMEPRTHPT WLLHIFIPFC IIAFIFIATV IALRKQLCQK LYSSKDTTKR PVTTTKREVN SAI
雖然B7-H1和B7-DC共用氨基酸序列的34%同一性，但是它們的表達已經表明它們被差別調節(Youngnak, P.等人, (2003) “Differential Binding Properties Of B7-H1 And B7-DC To Programmed Death- 1,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:672-677；Loke, P.等人, (2003) “PD-L1 And PD-L2 Are Differentially Regulated By Th1 And Th2 Cells ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 100:5336-5341)。已表明PD-L1通過增加抗原-特異性T細胞克隆的凋亡而在腫瘤免疫中起作用(Dong等人, (2002) “Tumor-Associated B7-H1 Promotes T-Cell Apoptosis: A Potential Mechanism Of Immune Evasion ,” Nat Med 8:793-800)。同樣已經表明B7-H1可涉及腸黏膜炎症，並且抑制B7-H1壓制與結腸炎有關的消耗病(Kanai等人, (2003) “Blockade Of B7-H1 Suppresses The Development Of Chronic Intestinal Inflammation ,” J. Immunol. 171:4156-4163)。已經報導了在肺、卵巢和結腸的人類癌症中以及在黑色素瘤中的B7-H1表達(Dong等人, (2002) “Tumor-Associated B7-H1 Promotes T-Cell Apoptosis: A Potential Mechanism Of Immune Evasion ,” Nat Med 8:793-800)。另一方面，B7-DC在腫瘤中的作用在很大程度上仍是未知的(Liu, X.等人, (2003) “B7-DC/PD-L2 Promotes Tumor Immunity By A PD-1-Independent Mechanism ,” J. Exp. Med. 197:1721-1730；Radhakrishnan, S.等人, (2004) “Immunotherapeutic Potential Of B7-DC (PD-L2) Cross-Linking Antibody In Conferring Antitumor Immunity ,” Cancer Res 64:4965-4972。已經證明癌細胞上的B7-DC表達在抗腫瘤免疫的誘導和效應期促進CD8 T細胞介導的排斥(Liu, X.等人, (2003) “B7-DC/PD-L2 Promotes Tumor Immunity By A PD-1-Independent Mechanism ,” J. Exp. Med. 197:1721-1730)。
抗-B7-H1抗體可使用具有以上提供的B7-H1氨基酸序列的蛋白質作為免疫原來獲得。可選地，可用於產生能夠結合PD-1的天然配體的分子的抗-B7-H1抗體可具備下述抗-人B7-H1抗體的VL和/或VH結構域：阿特朱單抗 (atezolizumab) (CAS註冊號1380723-44-3，也稱為MPDL3280A)、度伐魯單抗 (durvalumab) (CAS註冊號1428935-60-7，也稱為MEDI-4736)、阿維魯單抗 (avelumab) ，MDX1105 (CAS註冊號1537032-82-8，也稱為BMS-936559)，5H1)；(同樣參見，美國專利號9,273,135、9,062,112、8,981,063、8,779,108、8,609,089和8,460,927；McDermott, D.F.等人, (2016) “Atezolizumab, an Anti-Programmed Death-Ligand 1 Antibody, in Metastatic Renal Cell Carcinoma: Long-Term Safety, Clinical Activity, and Immune Correlates From a Phase Ia Study ,” J. Clin. Oncol. 34(8):833-842；Antonia, S.等人, (2016) “Safety And Antitumour Activity Of Durvalumab Plus Tremelimumab In Non-Small Cell Lung Cancer: A Multicentre, Phase 1b Study ,” Lancet Oncol. 17(3):299-308；Boyerinas, B.等人, (2015) “Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Activity of a Novel Anti-PD-L1 Antiobdy Avelumab (MSB0010718C) on Human Tumor Cells ,” Cancer Immunol Res. 3(10):1148-1157；Katy, K.等人, (2014) “PD-1 And PD-L1 Antibodies For Melanoma ,” Hum. Vaccin. Immunother. 10(11):3111-3116；Voena, C.等人, (2016) “Advances In Cancer Immunology And Cancer Immunotherapy ,” Discov. Med. 21(114):125-133)和/或商業上可得的抗體VL和/或VH結構域(例如，兔抗-人PDL-1單克隆，1:25，克隆SP142；Ventana, Tuscon, AZ)。
可根據本發明使用的示例性抗-人B7-H1抗體包括阿特朱單抗、度伐魯單抗和阿維魯單抗。阿特朱單抗(WHO藥物資訊，2015，推薦的INN：列表74, 29(3):387)、度伐魯單抗(WHO藥物資訊，2015，推薦的INN：列表74, 29(3):393-394)和阿維魯單抗(WHO藥物資訊，2016，推薦的INN：列表74, 30(1):100-101)的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列是本領域已知的。
抗-B7-DC抗體可同樣使用具有以上提供的B7-DC氨基酸序列的蛋白質作為免疫原來獲得。可選地，先前描述的抗-B7-DC抗體(例如，2C9、MIH18等)或商業上可得的抗-B7-DC抗體(例如，MIH18，Affymetrix eBioscience)可根據本發明採用(參見，美國專利公開號2015/0299322；Ritprajak, P.等人, (2012) “Antibodies Against B7-DC With Differential Binding Properties Exert Opposite Effects ,” Hybridoma (Larchmt). 31(1):40-47；Tsushima, F.等人, (2003) “Preferential Contribution Of B7-H1 To Programmed Death-1-Mediated Regulation Of Hapten-Specific Allergic Inflammatory Responses ,” Eur. J. Immunol. 33(10):2773-2782。
可根據本發明使用的示例性抗-人抗-B7-DC抗體是商業上可得的抗-B7-DC抗體MIH18 (eBioscience, Inc.)。 B. 能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子
具有介導對靶細胞(例如，癌細胞或病原體感染的細胞)的重定向殺傷的能力的本發明分子優選地具有兩種結合親和力。第一，這類分子具有免疫特異性地結合效應細胞的細胞表面分子的表位的能力。第二，這類分子具有免疫特異性地結合排列在靶細胞表面上的疾病抗原(例如，癌抗原或病原體相關抗原)的表位的能力。這兩種結合親和力的聯合存在用來將效應細胞定位至所述靶細胞的位點(即，以“重定向”效應細胞)，以使其可介導對靶細胞的殺傷。如以上討論的，這類分子可以是雙特異性的，或可能夠結合多餘兩個表位。 1. 效應細胞的示例性細胞表面分子
如本文使用的，術語“效應細胞 ”表示直接或間接介導對靶細胞(例如，外源細胞、感染的細胞或癌細胞)的殺傷的細胞。效應細胞的實例包括輔助T細胞、細胞毒性T細胞、天然殺傷(NK)細胞、漿細胞(分泌抗體的B細胞)、巨噬細胞和粒細胞。這類細胞的優選細胞表面分子包括CD2、CD3、CD8、CD16、TCR和NKG2D受體。因此，能夠免疫特異性地結合這類分子或結合其它效應細胞表面分子的表位元的分子可根據本發明的原理使用。以下提供示例性抗體，其VH和VL結構域可用於構建能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子。 (a) CD2結合能力
在一個實施方式中，能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的本發明分子通過免疫特異性地結合存在於這類效應細胞的表面上的CD2的表位來結合效應細胞。特異性結合CD2的分子包括抗-CD2抗體“CD2 mAb Lo-CD2a ”。
CD2 mAb Lo-CD2a (ATCC登記號：11423)的VH結構域的氨基酸序列；SEQ ID NO:190 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMY WVKQR PKQGLELVG R IDPEDGSIDY VEKFKK KATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCAR GK FNYRFAY WGQ GTLVTVSS
CD2 mAb Lo-CD2a (ATCC登記號：11423；SEQ ID NO:191 )的VL結構域的氨基酸序列如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISC RSSQSLL HSSGNTYLN W LLQRTGQSPQ PLIY LVSKLE S GVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYC MQFTHYP YT FGAGTKLE LK (b) CD3 結合能力
在一個實施方式中，能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的本發明分子通過免疫特異性地結合存在於這類效應細胞表面上的CD3的表位來結合這類效應細胞。特異性結合CD3的分子包括抗-CD3抗體“CD3 mAb 1 ”和“OKT3 ”。抗-CD3抗體CD3 mAb 1 能夠結合非-人靈長類動物(例如，食蟹猴)。
CD3 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:192 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVK D RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSS
CD3 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:193 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG
這類抗體的優選變體命名為“CD3 mAb 1 (D65G) ”，並且包含具有D65G取代(Kabat位置65，對應於SEQ ID NO:192 的殘基68)的CD3 mAb 1 VH結構域和CD3 mAb 1 的VL結構域(SEQ ID NO:193 )。CD3 mAb 1 (D65G) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:194 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示，取代的位置(D65G)以雙底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVK G RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSS
可選地，可採用CD3 mAb 1 的親和性變體。變體包括低親和性變體，命名為“CD3 mAb 1 低 ”，和具有更快解離速率的變體，命名為“CD3 mAb 1 快 ”。以下提供CD3 mAb 1 低 和CD3 mAb1 快 的每一種的VH結構域的氨基酸序列。
抗-人CD3 mAb 1 低 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:195 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVKG RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVT WFAY WGQGTL VTVSS
抗-人CD3 mAb 1 快 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:196 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVKG RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HKNFGNSYVT WFAY WGQGTL VTVSS
CD3 mAb 1 的VL結構域(SEQ ID NO:193 )對於CD3 mAb 1 低 和CD3 mAb1 快 是共有的，並且在上面提供。
另一可使用的抗-CD3抗體是抗體莫羅單抗-CD3 “OKT3 ” (Xu等人, (2000)“In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26)；Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3 ,” Ther. Drug Monit. 17(6):615-620；Canafax, D.M.等人, (1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) TreatmentOf Acute Renal Allograft Rejection ,” Pharmacotherapy 7(4):121-124；Swinnen, L.J.等人, (1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin -10 ： A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation ,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678)。
OKT3 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:197 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMH WVKQR PGQGLEWIG Y INPSRGYTNY NQKFKD KATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCAR YY DDHYCL DYWG QGTTLTVSS
OKT3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:198 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTC SASSSVS YMN WYQQKSG TSPKRWIY DT SKLAS GVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYC QQW SSNPFTF GSG TKLEINR
另外的可使用的抗-CD3抗體包括但不限於PCT專利公開號WO 2008/119566；和WO 2005/118635中描述的那些。 (c) CD8 結合能力
在一個實施方式中，能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的本發明分子通過免疫特異性地結合存在於效應細胞表面上的CD8的表位來結合這類效應細胞。特異性結合CD8的抗體包括抗-CD8抗體“OKT8 ”和X2 ”。(i) OKT8
OKT8 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:199 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKA SGYTFT DYNMH WVKQS HGKSLEWIG Y IYPYTGGTGY NQKFKN KATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
OKT8 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:200 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMH WY QQKPGQPPKV LIY LASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YC QQNNEDPY T FGGGTKLEI KR(ii) TRX2
TRX2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:201 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMN WVRQA PGKGLEWVA L IYYDGSNKFY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK PH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
TRX2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:202 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KGSQDIN NYLA WYQQKP GKAPKLLIY N TDILHT GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYC YQ YNNGYT FGQG TKVEIK (d) CD16 結合能力
在一個實施方式中，能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的本發明分子將過免疫特異性地結合存在於效應細胞表面上的CD16的表位來結合這類效應細胞。特異性結合CD16的分子包括抗-CD16抗體“3G8 ”和“A9 ”。人源化A9抗體在PCT專利公開號WO 03/101485中被描述。(i) 3G8
3G8 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:203 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVG WIR QPSGKGLEWL A HIWWDDDKR YNPALKS RLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQ I NPAWFAY WGQ GTLVTVSA
3G8 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:204 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC KASQSVD FDGDSFMN WY QQKPGQPPKL LIY TTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YC QQSNEDPY T FGGGTKLEI K(ii) A9
A9 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:205 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLG WVKQR PGHGLEWIG D IYPGGGYTNY NEKFKG KATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCAR SA SWYFD VWGAR TTVTVSS
A9 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:206 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTC RSNTGT VTTSNYAN WV QEKPDHLFTG LIG HTNNRAP GVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FC ALWYNNHW V FGGGTKLTVL
另外的可使用的抗-CD19抗體包括但不限於PCT專利公開號WO 03/101485；和WO 2006/125668中描述的那些。 (e) TCR結合能力
在一個實施方式中，能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的本發明分子通過免疫特異性地結合存在於效應細胞表面上的TCR的表位來結合這類效應細胞。
特異性結合T細胞受體的分子包括抗-TCR抗體“BMA 031 ” (EP 0403156；Kurrle, R.等人, (1989) “BMA 031 – A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application ,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019；Nashan, B.等人, (1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex ,” Transplant Proc. 19(5):4270-4272；Shearman, C.W.等人, (1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell ,” J. Immunol. 146(3):928-935；Shearman, C.W.等人, (1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor ,” J. Immunol. 147(12):4366-4373)。
BMA 031 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:207 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMH WVRQA PGQGLEWIG Y INPYNDVTKY NEKFKG RVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCAR GS YYDYDGFVY W GQGTLVTVSS
BMA 031 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:208 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC SATSSVS YMH WYQQKPG KAPKRWIY DT SKLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYC QQW SSNPLT FGQG TKLEIK (f) NKG2D結合能力
在一個實施方式中，能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的本發明分子通過免疫特異性地結合存在於效應細胞表面上的NKG2D受體的表位來結合這類效應細胞。特異性結合NKG2D受體的分子包括抗-NKG2D抗體“KYK-1.0 ”和“KYK-2.0 ” (Kwong, KY等人, (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity ,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156；和PCT/US09/54911)。(iii) KYK-1.0
KYK-1.0 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:209 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR FGYYLDY WGQ GTLVTVSS
KYK-1.0 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:210 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： QPVLTQPSSV SVAPGETARI PC GGDDIETK SVH WYQQKPG QAPVLVIY DD DDRPS GIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYC QVW DDNNDEWV FG GGTQLTVL(iv) KYK -2.0
KYK-2.0 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:211 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S
KYK-2.0 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:212 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： QSALTQPASV SGSPGQSITI SC SGSSSNIG NNAVN WYQQL PGKAPKLLIY YDDLLPS GVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYC A AWDDSLNGPV FGGGTKLTVL C．排列在癌細胞表面上的示例性癌抗原
如本文使用的，術語“癌抗原 ”表示在癌細胞表面上特徵性表達並且因而可以用基於抗體的分子或免疫調節分子處理的抗原。癌抗原的實例包括但不限於：如在結腸癌、胃癌黏蛋白中發現的19.9 ；4.2 ；A33 (結直腸癌抗原；Almqvist, Y. (2006) “In vitro and in vivo Characterization of 177Lu-huA33: A Radioimmunoconjugate Against Colorectal Cancer ,” Nucl. Med. Biol. 33(8):991-998)；ADAM-9 (美國專利公開號2006/0172350；PCT專利公開號WO 06/084075)；胃癌中發現的AH6 ；ALCAM (PCT專利公開號WO 03/093443)；APO-1 ( 惡性人淋巴細胞抗原 ) (Trauth, B.C.等人, (1989)“Monoclonal Antibodies-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,” Science 245:301-304)；B1 (Egloff, A.M.等人, (2006) “Cyclin B1 And Other Cyclins As Tumor Antigens In Immunosurveillance And Immunotherapy Of Cancer ,”Cancer Res . 66(1):6-9)；B7-H3 (Collins, M.等人, (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands ,” Genome Biol. 6:223.1-223.7)。Chapoval, A.等人, (2001)“B7-H3: A Costimulatory Moleculer For T Cell Activation and IFN-γ Production ,” Nature Immunol. 2:269–274；Sun, M.等人, (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297 )；BAGE (Bodey, B. 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(2015) “Bevacizumab And Glioblastoma: Scientific Review, Newly Reported Updates, And Ongoing Controversies ,” Cancer 121(7):997-1007；Suh, D.H.等人, (2015) “Major Clinical Research Advances In Gynecologic Cancer In 2014 ,” J. Gynecol. Oncol. 26(2):156-167；Liu, K.J.等人, (2015) “Bevacizumab In Combination With Anticancer Drugs For Previously Treated Advanced Non-Small Cell Lung Cancer ,” Tumour Biol. 36(3):1323-1327；Di Bartolomeo, M.等人, (2015) “Bevacizumab Treatment In The Elderly Patient With Metastatic Colorectal Cancer ,” Clin. Interv. Aging 10:127-133)；VEGF 受體(O’Dwyer. P.J. (2006) “The Present And Future Of Angiogenesis-Directed Treatments Of Colorectal Cancer ,” Oncologist 11(9):992-998)；VEP8 ；VEP9 ；VIM-D5 ；和Y 半抗原 ，如胚胎癌性細胞中發現的Ley 。另外的癌抗原和結合它們的分子(例如，抗體)公開於表 10 中 。5T4、B7-H3、CEACAM5/CEACAM6、CD123、DR5、EGFR、肝配蛋白受體、gpA33、HER2/neu、IL13Rα2、ROR1和VEGF是本發明特別優選的“癌抗原 ”。 D. 能夠結合癌抗原的示例性抗體
以上表 10 中列出了示例性抗體，其VH和VL結構域可用於構建能夠結合排列在癌細胞表面上的癌抗原的分子，下面提供另外的抗體。 2. 結合B7-H3的抗體
B7-H3 是在很多實體腫瘤類型上過表達的癌抗原，並且是參與免疫調節的分子的B7族的成員(參見，美國專利號8,802,091；US 2014/0328750；US 2013/0149236；Loo, D.等人, (2012) “Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity ,” Clin. Cnacer Res. 18(14):3834-3845)。具體的，幾項獨立的研究已經證明人惡性癌細胞(例如，成神經細胞瘤和胃癌、卵巢癌和非小細胞肺癌的癌細胞)展示顯著增加的B7-H3蛋白質的表達，並且該增加的表達與增加的疾病嚴重性有關(Zang, X.等人, (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition ,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279)，這表明B7-H3被腫瘤用作免疫逃避路徑(Hofmeyer, K.等人, (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。
也已發現B7-H3共刺激CD4+和CD8+ T細胞增殖。B7-H3同樣刺激IFN-γ產生和CD8+裂解活性(Chapoval, A.等人, (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production ,” Nature Immunol. 2:269–274；Sharpe, A.H.等人, (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。但是，蛋白質同樣可能通過NFAT (啟動的T細胞的核因數)、NF-κB (核因數κB)和AP-1 (啟動蛋白質-1)因數起作用，以抑制T細胞啟動(Yi. K.H.等人, (2009) “FineTuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151)。也認為B7-H3體內抑制Th1、Th2或Th17 (Prasad, D.V.等人, (2004) “Murine B7–H3 Is A Negative Regulator Of T Cells ,” J. Immunol. 173:2500-2506；Fukushima, A.等人, (2007) “B7–H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice ,” Immunol. Lett. 113:52-57；Yi. K.H.等人, (2009) “FineTuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151)。
優選的抗-B7-H3-結合分子具備抗-人B7-H3單克隆抗體“B7-H3 mAb 1 ”、“B7-H3 mAb 2 ”或“B7-H3 mAb 3 ”或本文提供的任意抗-B7-H3抗體的VL和/或VH結構域；並且更優選地，具備這類抗-B7-H3單克隆抗體的VL區的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH 。特別優選的是具備人源化VH和/或VL結構域的B7-H3-結合分子。 (g) B7-H3 mAb 1
B7-H3 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:213 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQ WVKQR PGQGLEWIG T IYPGDGDTRY TQKFKG KATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GAGTTVTVSS
B7-H3 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:214 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK
以下提供本文指定為“hB7-H3 mAb 1 VH1 ”和“hB7-H3 mAb 1 VH2 ”的B7-H3 mAb 1 的兩個示例性人源化VH結構域，以及本文指定為“hB7-H3 mAb 1 VL1 ”和“hB7-H3 mAb 1 VL2 ”的B7-H3 mAb 1 的兩個示例性人源化VL結構域。應注意到，hB7-H3 mAb 1 VL2 包括CDRL 1和CDRL 2中的氨基酸取代，並且hB7-H3 mAb 1 VH2 包括CDRH 2中的氨基酸取代。任意人源化VL結構域可與任意人源化VH結構域配對以產生B7-H3結合結構域。因此，包含與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域中之一的任何抗體總體上稱為“hB7-H3 mAb 1 ”，並且人源化VH/VL結構域的具體組合通過參照具體的VH/VL結構域命名，例如包含hB7-H3 mAb 1 VH1 和hB7-H3 mAb 1 VL2 的 人源化抗體具體稱為“hB7-H3 mAb 1 (1.2) ”。
hB7-H3 mAb 1 VH1 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:215 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGDGDTRY TQKFKG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
hB7-H3 mAb 1 VH2 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:216 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGGGDTRY TQKFQG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
hB7-H3 mAb 1 VL1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:217 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK
hB7-H3 mAb 1 VL2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:218 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQSIS SYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK (h) B7-H3 mAb 2
B7-H3 mAb 2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:219 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTLTV SS
B7-H3 mAb 2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:220 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTC KASQNVD TNVA WYQQKP GQSPKALIY S ASYRYS GVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFC QQ YNNYPFT FGS GTKLEIK
以下提供本文指定為“hB7-H3 mAb 2 VH1 ”、“hB7-H3 mAb 2 VH2 ”、“hB7-H3 mAb 2 VH3 ”和“hB7-H3 mAb 2 VH4 ”的B7-H3 mAb 2 的四個示例性人源化VH結構域，和本文指定為“hB7-H3 mAb 2 VL1 ”、“hB7-H3 mAb 2 VL2 ”、“hB7-H3 mAb 2 VL3 ”、“hB7-H3 mAb 2 VL4 ”、“hB7-H3 mAb 2 VL5 ”和“hB7-H3 mAb 2 VL6 ”的B7-H3 mAb 2 的六個示例性人源化VL結構域。任意人源化VL結構域可與任意人源化VH結構域配對，以產生B7-H3結合結構域。因此，包含與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域之一的任何抗體總體上被稱為“hB7-H3 mAb 2 ”，並且人源化VH/VL結構域的具體組合通過參照具體特定的VH/VL結構域命名，例如包含hB7-H3 mAb 2 VH1 和hB7-H3 mAb 2 VL2 的人源化抗體具體稱為“hB7-H3 mAb 2 (1.2) ”。
hB7-H3 mAb 2 VH1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:221 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCAR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS
hB7-H3 mAb 2 VH2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:222 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS
hB7-H3 mAb 2 VH3 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:223 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAMYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS
hB7-H3 mAb 2 VH4 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:224 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRSED TAVYYCAR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS
hB7-H3 mAb 2 VL1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:225 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK
hB7-H3 mAb 2 VL2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:226 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKALIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK
hB7-H3 mAb 2 VL3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:227 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVS VTC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK
hB7-H3 mAb 2 VL4 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:228 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GQAPKLLIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK
hB7-H3 mAb 2 VL5 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:229 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GQAPKALIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK
hB7-H3 mAb 2 VL6 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:230 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK (i) B7-H3 mAb 3
B7-H3 mAb 3 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:231 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)。 EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMS WVRQT PDKRLEW VAT INSGGSNTYY PDSLKG RFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCAR HD GGAMDY WGQG TSVTVSS
B7-H3 mAb 3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:232 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITC RASESIY SYLA WYQQKQ GKSPQLLVY N TKTLPE GVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYC QH HYGTPPWT FG GGTNLEIK (j) 其它抗-B7-H3結合分子
除了以上鑑定的優選的抗-B7-H3結合分子，本發明考慮使用任意下述抗-B7-H3結合分子：LUCA1 ； BLA8 ； PA20; 或 SKN2 (參見，美國專利號7,527,969；8,779,098和PCT專利公開號WO 2004/001381)；M30 ； cM30 ； M30-H1-L1 ； M30-H1-L2 ； M30-H1-L3 ； M30-H1-L4 ； M30-H1-L5 ； M30-H1-L6 ； M30-H1-L7 ； M30-H4-L1 ； M30-H4-L2 ； M30-H4-L3 ；和 M30-H4-L4 (參見，美國專利公開號2013/0078234和PCT專利公開號WO 2012/147713；和8H9 (參見美國專利號7,666,424；7,737,258；7,740,845；8,148,154；8,414,892；8,501,471；9,062,110；美國專利公開號2010/0143245和PCT專利公開號WO 2008/116219)。 3. 結合CEACAM5和CEACAM6的抗體
已經發現癌胚抗原-相關的細胞黏附分子5 (CEACAM5)和6 (CEACAM6)與各種類型的癌症有關，所述各種類型的癌症包括甲狀腺髓質癌、結直腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、***癌、子宮癌、子宮內膜癌、乳腺癌、造血系統癌症(hematopoietic cancer)、白血病和卵巢癌(PCT專利公開號WO 2011/034660)，尤其是結直腸癌、胃腸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌(NSCL)、乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌、卵巢癌和子宮癌(Zheng, C.等人, (2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity ,” PLoS One 6(6):e21146, 1-11頁)。
已經發現CEACAM5在90%的胃腸癌、結直腸癌和胰腺癌、70%的非小細胞肺癌細胞和50%的乳腺癌中過表達(Thompson, J.A.等人, (1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives ,” J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366)。過表達的癌胚抗原相關的細胞黏附分子6 (CEACAM6)在各種人癌症的侵入和轉移中起到重要作用，所述各種人癌症包括甲狀腺髓質癌、結直腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、***癌、子宮癌、子宮內膜癌、乳腺癌、造血系統癌症、白血病和卵巢癌(PCT專利公開號WO 2011/034660；Deng, X.等人, (2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma ,” Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697；Cameron, S.等人, (2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis ,” Mol. Cancer 11:74, 1-11頁；Chapin, C.等人, (2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adehesion Molecule 6 In Human Lung ,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25；Riley, C.J.等人, (2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer ,” Cancer Res. 69(5):1933-1940；Lewis-Wambi, J.S.等人, (2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells ,” Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779；Blumenthal, R.D.等人, (2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers ,” BMC Cancer. 7:2, 1-15頁)。免疫特異性地結合CEACAM5和CEACAM6的抗體是商業上可得的(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Novus Biologicals LLC；Abnova Corporation)。 (k) 抗體16C3
人源化抗-CEACAM5/抗-CEACAM6抗體16C3 (EP 2585476)的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:233 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMH WVKQS HAKSLEWIG L ISTYSGDTKY NQNFKG KATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAR GD YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S
人源化抗-CEACAM5/抗-CEACAM6抗體16C3 (EP 2585476) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:234 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC GASENIY GALN WYQRKP GKSPKLLIW G ASNLAD GMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYY CQN VLSSPYT FGG GTKLEIK (l) 抗體hMN15
人源化抗-CEACAM5/CEACAM6抗體hMN15 的VH結構域的氨基酸序列(WO 2011/034660) (SEQ ID NO:235 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMS WVRQA PGKGLEWLG F IANKANGHTT DYSPSVKG RF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S
人源化抗-CEACAM5/CEACAM6抗體hMN15 的VL結構域的氨基酸序列(WO 2011/034660) (SEQ ID NO:236 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTC SASSRVS YIH WYQQKPG KAPKRWIY GT STLAS GVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYC QQW SYNPPT FGQG TKVEIKR 4. 結合EGFR的抗體
表皮生長因數受體(EGFR)是某些轉移性結直腸癌、轉移性非小細胞肺癌和頭頸癌的癌抗原。結合人EGRF的示例性抗體是“西妥昔單抗 ”和“帕尼單抗 ”。西妥昔單抗是重組人-小鼠嵌合表皮生長因數受體(EGFR)IgG1單克隆抗體(Govindan R. (2004) “Cetuximab In Advanced 非 -Small Cell Lung Cancer ,” Clin. Cancer Res. 10(12 Pt 2):4241s-4244s；Bou-Assaly, W.等人, (2010) “Cetuximab (Erbitux) ,” Am. J. Neuroradiol. 31(4):626-627)。帕尼單抗(Vectibix®，Amgen)是全人源化表皮生長因數受體(EGFR)IgG2單克隆抗體(Foon, K.A.等人, (2004) “Preclinical And Clinical Evaluations Of ABX-EGF, A Fully Human Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody ,” Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 58(3):984-990；Yazdi, M.H.等人, (2015) “A Comprehensive Review of Clinical Trials on EGFR Inhibitors Such as Cetuximab and Panitumumab as Monotherapy and in Combination for Treatment of Metastatic Colorectal Cancer ,” Avicenna J. Med. Biotechnol. 7(4):134-144)。 (m) 西妥昔單抗
嵌合抗-EGFR抗體“西妥昔單抗 ”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:237 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVS GFSLT NYGVH WVRQS PGKGLEWLG V IWSGGNTDYN TPFTS RLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCAR ALT YYDYEFAY WG QGTLVTVSA
嵌合抗-EGFR抗體“西妥昔單抗 ”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:238 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSC RASQSIG TNIH WYQQRT NGSPRLLIK Y ASESIS GIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYC QQ NNNWPTT FGA GTKLELKR (n) 帕尼單抗
帕尼單抗的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:239 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVS GGSVS SGDYY WTWIR QSPGKGLEWI G HIYYSGNTN YNPSLKS RLT ISIDTSKTQF SLKLSSVTAA DTAIYYCVR D RVTGAFDI WG QGTMVTVSS
帕尼單抗的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:240 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY D ASNLET GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QH FDHLPLA FGG GTKVEIKR 5. 結合EphA2的抗體
受體酪氨酸激酶、蝶素型-A受體2(EphA2 )通常在成人上皮組織中細胞與細胞接觸的位點處表達，但是，最近的研究已經證明其也在各種類型的上皮癌(epithelial carcinomas)中過表達，其中以在轉移性病變中觀察到的EphA2表達水準最高。已經在很大範圍的癌症和許多癌細胞系，包括***癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和黑色素瘤，中發現高表達水準的EphA2 (Xu, J.等人, (2014) “High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome ,” Oncol. Lett. Aug 2014；8(2): 687-692；Miao, B.等人, (2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma ,” Cancer Discov. Pii: CD-14-0295)。EphA2似乎不僅僅是癌症的標記物，而似乎在許多人類癌症中被持續地過表達並且功能上被改變(Chen, P.等人, (2014) “EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells ,” Oncol. Lett. 8(1):41-46)。結合人EphA2的示例性抗體是“EphA2 mAb 1 ”、“EphA2 mAb 2 ”和“EphA2 mAb 3 ”。 (o) EphA2 mAb 1
EphA2 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:241 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVH WVRQP PGKGLEWLG M IWGGGSTDYN SALKS RLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCAR KHG NYYTMDY WGQ GTSVTVSS
EphA2 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:242 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GYTLYT FGGG TKLEIK (p) EphA2 mAb 2
EphA2 mAb 2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:243 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMN WVKQA PGKGLKWMG W INTYIGEPTY ADDFKG RFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAR EL GPYYFDY WGQ GTTLTVSS
EphA2 mAb 2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:244 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSSGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP T FGSGTKLEI K (q) EphA2 mAb 3
EphA2 mAb 3 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:245 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMY WVRQT PEKRLEWVA T ISDGGSFTSY PDSVKG RFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTR DE SDRPFPY WGQ GTLVTVSS
EphA2 mAb 3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:246 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITC KASQDVT TAVA WYQQKP GQSPKLLIF W ASTRHA GVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYC QQ HYSTPYT FGG GTKLEIK 6. 結合gpA33的抗體
43kD跨膜糖蛋白A33 (gpA33 )在＞95%的所有結腸癌中被表達(Heath, J.K.等人, (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474；Ritter, G.等人, (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium ,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686；Wong, N.A.等人, (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia ,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263)。結合至人gpA33的示例性抗體是“gpA33 mAb 1 ”。
gpA33 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:247 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMN WVRQA PGQGLEWIG R IYPGDGETNY NGKFKD RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR IY GNNVYFDV WG QGTTVTVSS
gpA33 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:248 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC SARSSIS FMY WYQQKPG KAPKLLIY DT SNLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGQG TKLEIK 7. 結合HER2/neu的抗體
HER2/neu是185 kDa受體蛋白質，其起初被鑑定為來自經化學手段處理的大鼠的成神經細胞瘤的轉化基因的產物。由於其在幾種人類癌症和在哺乳動物開發中的作用，HER2/neu已經被大規模地研究(Hynes等人, (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184；Dougall等人, (1994) Oncogene 9:2109-2123；Lee等人, (1995) Nature 378:394-398)。結合人HER2/neu的示例性抗體包括“瑪格妥昔單抗 ”、“曲妥珠單抗 ”和“帕妥株單抗 ”。瑪格妥昔單抗(也稱為MGAH22；CAS註冊號1350624-75-7)是結合至HER2/neu並且介導增強的ADCC活性的Fc-優化的單克隆抗體。曲妥珠單抗(也稱為rhuMAB4D5，並且作為Herceptin®銷售；CAS註冊號180288-69-1；參見美國專利號5,821,337)是具有IgG1/κ恆定區的抗體4D5的人源化形式。帕妥株單抗(也稱為rhuMAB2C4，並且作為Perjeta™銷售；CAS註冊號380610-27-5；參見例如，WO2001/000245)是具有IgG1/κ恆定區的抗體2C4的人源化形式。 (r) 瑪格妥昔單抗
瑪格妥昔單抗的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:250 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS
瑪格妥昔單抗的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:251 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GHSPKLLIY S ASFRYT GVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYC QQ HYTTPPT FGG GTKVEIK
瑪格妥昔單抗的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列是本領域已知的(參見，例如，WHO藥物資訊，2014，推薦的INN：列表71, 28(1):93-94)。 (s) 曲妥珠單抗
曲妥珠單抗 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:252 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DT Y IH WVRQA PGKGLEWVA R IY PTN G Y T R Y ADSVKG RFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSR WG GDG F Y A MD Y W GQGTLVTVSS
曲妥珠單抗 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:253 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQ DVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S AS F L Y SGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ H Y T TPPT FGQ GTKVEIK (t)帕妥株單抗
帕妥株單抗 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:254 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMD WVRQA PGKGLEWVA D VNPNSGGSIY NQRFKG RFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR NL GPSFYFDY WG QGTLVTVSS
帕妥株單抗 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:255 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVS IGVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YYIYPYT FGQ GTKVEIK (u) 其它抗-HER2/neu抗體
除了上述鑑定的優選的抗-HER2/neu結合分子，本發明還考慮使用任意下述抗-Her-2結合分子：1.44.1；1.140；1.43；1.14.1；1.100.1；1.96；1.18.1；1.20；1.39；1.24；和1.71.3 (美國專利號8,350,011；8,858,942；和PCT專利公開號WO 2008/019290)；F5 和C1 (美國專利號7,892,554；8,173,424；8,974,792；和PCT專利公開號WO 99/55367)；並且也考慮美國專利公開號US2013017114和PCT專利公開號WO2011/147986的抗-Her-2結合分子)。 8. 結合VEGF的抗體
VEGF-A是在各種疾病中，尤其在某些轉移性癌症如轉移性結腸癌和在某些肺癌、腎癌、卵巢癌和腦的多形性成膠質細胞瘤中，刺激血管生成的化學信號。結合至人VEGF-A的示例性抗體是“貝伐珠單抗 ”(Avastin®)。貝伐珠單抗是重組人源化IgG1單克隆抗體(Midgley, R.等人, (2005) “Bevacizumab – Current Status And Future Directions ,” Ann. Oncol. 16(7):999-1004；Hall, R.D.等人, (2015) “Angiogenesis Inhibition As A Therapeutic Strategy In Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) ,” Transl. Lung Cancer Res. 4(5):515-523；Narita, Y. (2015) “Bevacizumab For Glioblastoma ,” Ther. Clin. Risk Manag. 11:1759-1765)。
貝伐珠單抗 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:256 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMN WVRQA PGKGLEWVG W INTYTGEPTY AADFKR RFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCA KYP HYYGSSHWYF DV WGQGTLVT VSS
貝伐珠單抗 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:257 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC SASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKVLIY F TSSLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YSTVPWT FGQ GTKVEIKR 9. 結合5T4的抗體
癌胚蛋白質5T4 是腫瘤相關的蛋白質，其在許多癌症(包括腎癌、結腸癌、***癌、肺癌)的細胞膜上展示並在急性成淋巴細胞性白血病中展示(參見，Boghaert, E.R.等人, (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin ,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234；Eisen, T.等人, (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin ,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, 1-6頁)。結合至人5T4的示例性抗體包括“5T4 mAb 1 ”和“5T4 mAb 2 ”。 (v) 5T4 mAb 1
5T4 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:258 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT SFWMH WVRQA PGQGLEWMG R IDPNRGGTEY NEKAKS RVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAG GN PYYPMDY WGQ GTTVTVSS
示例性5T4 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:259 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQGIS NYLA WFQQKP GKAPKSLIY R ANRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC LQ YDDFPWT FGQ GTKLEIK (w) 5T4 mAb 2
5T4 mAb 2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:260 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKAS GYTFT SYWIT WVKQR PGQGLEWIG D IYPGSGRANY NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCAR YG PLFTTVVDPN SYAMDY WGQG TSVTVSS
5T4 mAb 2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:261 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSIV YSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP FT FGSGTKLE IK 10. 結合IL13Rα2的抗體
白介素-13受體α2 (IL13Rα2 )在各種癌症中過表達，所述癌症包括成膠質細胞瘤、結直腸癌、宮頸癌、胰腺癌、多發性黑素瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、***癌和肺癌(PCT專利公開號WO 2008/146911；Brown, C.E.等人, (2013) “Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis ,” PLoS One. 18;8(10):e77769；Barderas, R.等人, (2012) “High Expression Of IL-13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis ,” Cancer Res. 72(11):2780-2790；Kasaian, M.T.等人, (2011) “IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2 ,” J. Immunol. 187(1):561-569；Bozinov, O.等人, (2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas ,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621；Fujisawa, T.等人, (2009) “A Novel Role Of Interleukin-13 Receptor Alpha2 In Pancreatic Cancer Invasion And Metastasis ,” Cancer Res. 69(22):8678-8685)。免疫特異性地結合至IL13Rα2的抗體是商業上可得的，並且已經在現有技術中被描述(Abnova Corporation、Biorbyt、LifeSpan BioSciences、Unite States Biologicals；也參見PCT專利公開號WO 2008/146911)。結合至人IL13Rα2的示例性抗體包括“hu08 ” (參見，例如，PCT專利公開號WO 2014/072888)。
hu08 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:262 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS RNGMS WVRQA PGKGLEWVA T VSSGGSYIYY ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR QG TTALATRFFD V WGQGTLVTV SS
hu08 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:263 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVG TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRST GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYSAPWT FGG GTKVEIK 11. 結合CD123的抗體
CD123 (白介素3受體α，IL-3Ra)是40 kDa分子，其是白介素3受體複合物的一部分(Stomski, F.C.等人, (1996) “Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding ,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046)。白介素3 (IL-3)驅動多能幹細胞早期分化為類紅細胞、髓系細胞和淋巴樣祖細胞。已經報導CD123在很大範圍的血液學惡性腫瘤(包括急性髓細胞樣白血病(AML)和脊髓增生異常綜合征(MDS))中的惡性細胞上過表達(Muñoz, L.等人, (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies ,” Haematologica 86(12):1261-1269)。CD123的過表達與AML中的較差的預後有關(Tettamanti, M.S.等人, (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401)。
結合至人CD123的示例性抗體是“CD123 mAb 1 ” (參見，例如，PCT專利公開號WO 2015/026892)。
CD123 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:264 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMK WVRQA PGQGLEWIG D IIPSNGATFY NQKFKG RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SH LLRAS WFAYW GQGTLVTVSS
CD123 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:265 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSC KSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIY WASTR ES GVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC QNDYSY PYT FGQGTKL EIK E. 示例性病原體相關抗原
如本文使用的，術語“病原體抗原 ”指這類抗原：所述抗原在病原體感染的細胞表面上特徵性地表達，並且因而可以用基於抗體的分子或免疫調節分子處理。病原體抗原的實例包括但不限於在被下述病毒感染的細胞表面上表達的抗原：單純皰疹病毒(例如、 感染的細胞蛋白質(ICP)47、gD等)、水痘帶狀皰疹病毒、卡波西肉瘤相關的皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒(例如、LMP-1、LMP-2A、LMP-2B等)、巨細胞病毒(例如、UL11等)、人免疫缺陷病毒(例如、env蛋白質gp160、gp120、gp41等)、人乳頭瘤病毒(例如、E6、E7等)、人T細胞白血病毒(例如、env蛋白質gp64、gp46、gp21等)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢桿菌綱(Bacilli )、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter )、霍亂(Cholera )、白喉(Diphtheria )、腸桿菌屬(Enterobacter )、***(Gonococci )、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori )、克雷伯氏菌屬(Klebsiella )、軍團菌屬(Legionella )、腦膜炎球菌(Meningococci )、分歧桿菌(mycobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas )、Pneumonococci 、立克次氏體細菌(rickettsia bacteria)、沙門氏菌屬(Salmonella )、沙雷菌屬(Serratia )、葡萄球菌屬(Staphylococci )、鏈球菌屬(Streptococci )、破傷風(Tetanus )、曲黴菌屬(Aspergillus )(煙麯黴(fumigatus )、黑麯黴(niger )等)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis )、念珠菌屬(Candida )(白色念珠菌(albicans )、克柔假絲酵母(krusei )、光滑念珠菌(glabrata )、熱帶念珠菌(tropicalis )等)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans )、毛黴目(Mucorales )的屬(毛黴屬(mucor )、犁頭黴屬(absidia )、根黴屬(rhizopus ))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii )、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis )、粗球黴菌(Coccidioides immitis )、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum )、細螺旋體病(Leptospirosis )、包柔氏螺旋體(Borrelia burgdorferi )、蠕蟲寄生蟲(鉤蟲、絛蟲、吸蟲、扁形蟲(例如血吸蟲(Schistosomia ))、藍氏賈第蟲(Giardia lambia )、旋毛蟲(t richinella )、脆雙核阿米巴(Dientamoeba Fragilis )、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei )、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi )和杜氏利什曼蟲(Leishmania donovani )。 這類抗體可從各種來源商購獲得，或可通過用這類抗原對小鼠或其它動物進行免疫接種(包括用於產生單克隆抗體)來獲得。 F．能夠結合病原體相關抗原的示例性抗體
以下提供示例性抗體，其VH和VL結構域可用於構建能夠結合排列在病原體感染的細胞表面上的病原體抗原的分子，另外的抗體是本領域已知的。
HIV的Env蛋白質是示例性病原體相關抗原，並且結合HIV的Env蛋白質的抗體是能夠結合病原體相關抗原的示例性抗體。
HIV-1感染中的最初步驟伴隨著細胞表面CD4與三聚HIV-1包膜糖蛋白(Env)、跨膜糖蛋白(gp41)和表面糖蛋白(gp120)的異源二聚體的結合而發生。gp120和gp41糖蛋白最初作為單gp160多肽被合成，該多肽隨後被切割，以產生非共價締合的gp120/gp41複合物。Env的胞外域是具有大約140 kDa品質的異源二聚體，由全部gp120組分和大約20 kDa的gp41構成(Harris, A.等人, (2011) “Trimeric HIV-1 Glycoprotein Gp140 Immunogens And Native HIV-1 Envelope Glycoproteins Display The Same Closed And Open Quaternary Molecular Architectures ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108(28):11440-11445)。免疫特異性地結合至env蛋白質的抗體是商業上可得的，並且已經在現有技術中被描述(參見，例如，GenBank登記號AFQ31503；Buchacher, A.等人, (1994) “Generation Of Human Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Proteins ； Electrofusion And Epstein-Barr Virus Transformation For Peripheral Blood Lymphocyte Immortalization ,” AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(4):359-369；Shen, R. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium ,” J. Immunol. 184(7):3648-3655；WO 2012/162068；和WO 2016/054101)。結合至HIV env的示例性抗體包括“7B2 ” (GenBank登記號AFQ31503)和“h3G8 ” (PCT公開號WO 2012/162068)。
7B2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:266 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMT WVRQA PGKGLEWLAY ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SR DNAKNS VF LQLDRLSADD TAVYYCAR AD GLTYFSELLQ YIFDL WGQGA RVTVSS
7 B2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:267 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCK SSQTLL YSSN NRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG S GSGTD FTLT INNLQAEDVA IYYCHQ YSSH PPT FGHGTRV EIK
h3G8 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:268 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVG WIR QPPGKALEWL A HIWWDDDKR YNPALKS RLT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCAQ I NPAWFAY WGQ GTLVTVSS
h3G8 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:269 )如下顯示(CDR殘基以底線顯示)： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INC KASQSVD FDGDSFMN WY QQKPGQPPKL LIY TTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YC QQSNEDPY T FGQGTKLEI K 本發明示例性結合分子
如以下討論的，使用以下兩種施用的分子的聯合療法闡釋本發明：能夠結合PD-1的分子(例如，以上描述的hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4 (P) 、DART-1 或 DART-2 )，和能夠介導對腫瘤細胞的重定向殺傷的分子(例如，以下描述的“DART-A ”或“DART-B ”)。
DART-A 是能夠結合效應細胞的CD3 細胞表面分子和B7-H3癌抗原的雙特異性雙抗體。它是由三條多肽鏈構成的含Fc區的雙抗體，具有針對B7-H3一個結合位點、針對B7-H3的一個結合位點、攜帶杵和臼的IgG1 Fc區和E/K-螺旋異源二聚體促進結構域(參見，例如，圖 4A )。
DART-A 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含N-末端、能夠結合B7-H3的單克隆抗體(hB7-H3 mAb 2 VL2 )的VL結構域(SEQ ID NO:226 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:14 ))、能夠結合CD3的單克隆抗體(CD3 mAb 1 VH )的VH結構域(SEQ ID NO:192 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:15 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:27 ))、間插連接體肽(間隔 - 連接體 3 ；GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:39 ))、“攜帶杵的 ” Fc結構域(SEQ ID NO:42 )和C-末端。因此，DART-A 的第一多肽鏈由以下構成：SEQ ID NO:226 ─ SEQ ID NO:14 ─ SEQ ID NO:192 ─ SEQ ID NO:15 ─ SEQ ID NO:27 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:42 。DART-A 的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:270 )： DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
DART-A 的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體(CD3 mAb 1 VL )的VL結構域(SEQ ID NO:193 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:14 ))、能夠結合B7-H3的單克隆抗體(hB7-H3 mAb 2 VH2 )的VH結構域(SEQ ID NO:222 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:15 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:28 )和C-末端。因此，DART-A 的第二多肽由以下構成：SEQ ID NO:193 ─ SEQ ID NO:14 ─ SEQ ID NO:222 ─ SEQ ID NO:15 ─ SEQ ID NO:28 。DART-A 的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:271 )： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SDSSAIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRDEDTA VYYCGRGREN IYYGSRLDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
DART-A 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含N-末端、肽(連接體 3 ；DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:38 ))、“攜帶臼的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:43 )和C-末端。因此，DART-A 的第三多肽由以下構成：SEQ ID NO:38 ─SEQ ID NO:43 。DART-A 的第三多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:272 )： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
能夠介導對腫瘤細胞的重定向殺傷的另一示例性分子是DART-B 。 DART-B 是能夠結合效應細胞的CD3細胞表面分子和IL13Rα2癌抗原的雙特異性雙抗體。DART-B 由三條多肽鏈構成並且具有與DART-A 一樣的一般結構。
另外，可用於本發明方法中的能夠介導對腫瘤細胞的重定向殺傷的示例性分子包括能夠結合以下的雙特異性分子：CD19和CD3 (參見，例如，美國專利號7,235,641和WO 2016/048938)；CD123和CD3 (參見，例如，Kuo, S.R.等人, (2012) “Engineering a CD123xCD3 bispecific scFv immunofusion for the treatment of leukemia and elimination of leukemia stem cells ,” Protein Eng Des Sel. 25:561-9；PCT公開WO 2015/026892)；gpA33和CD3 (例如，WO 2015/026894)；以及三特異性分子(參見，例如，WO 2015/184203；和WO 2015/184207)。 VI. 生產方法
本發明分子最優選地通過重組表達編碼這類多肽的核酸分子來產生，如本領域眾所周知的。
本發明多肽可使用固相肽合成法被方便地製備(Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis ,” Science 232(4748):341-347；Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135；Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century ,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10)。
可重組製備抗體和使用本領域已知的任何方法表達。可如下經重組製備抗體：首先從宿主動物分離製備的抗體，獲得基因序列，和使用基因序列在宿主細胞(例如，CHO細胞)中重組表達抗體。可採用的另一方法是在植物(例如，煙草)或轉基因奶中表達抗體序列。用於在植物或奶中重組表達抗體的適當的方法已經被公開了(見，例如Peeters等(2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants ,” Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等(1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice ,” Int. Rev. Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies ,” J. Immunol Methods 231:147-157)。製備抗體衍生物，例如，人源化抗體、單鏈抗體等的適當的方法是本領域已知的，並且已經在上面描述過了。在另一可選方案中，可通過噬菌體展示技術重組製備抗體(見，例如，美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150；和Winter, G.等(1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology ,” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455)。
包含感興趣的多核苷酸(例如，編碼本發明的結合分子的多肽鏈的多核苷酸)的載體可通過一些適當手段中的任意手段被引入到宿主細胞中，所述適當手段包括電穿孔；採用氯化鈣、銣氯化物、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質的轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂轉染；和感染(例如，在載體是感染劑諸如痘苗病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇常常取決於宿主細胞的特徵。
能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞均可用於表達感興趣的多肽或蛋白質的目的。合適的哺乳動物宿主細胞的非限制性例子包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。
本發明包括包含本發明結合分子的氨基酸序列的多肽。可通過本領域已知的程式製備本發明的多肽。可通過抗體的蛋白水解或其他降解、如上述的重組方法(即，單個或融合多肽)或化學合成來產生多肽。抗體的多肽，尤其地，上至約50個氨基酸的較短的多肽，通過化學合成被常規製備。化學合成方法在本領域中是已知的，並且是商業上可得到的。
本發明包括所公開的結合分子的變體，包括不明顯影響這類分子的特性的功能上等同的多肽以及具有增強的或降低的活性的變體。多肽的修飾在本領域中是常規操作，因而不需要在本文詳細描述。修飾的多肽的實例包括這樣的多肽：其具有氨基酸殘基的保守取代、未明顯有害改變功能活性的氨基酸的一個或多個缺失或添加，或使用化學類似物。可彼此保守取代的氨基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/谷氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯基丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻譯後修飾的多肽，所述其它翻譯後修飾，諸如例如，用不同糖進行糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地，氨基酸取代應該是保守的，即，取代的氨基酸會具有與原始氨基酸類似的化學性質。這樣的保守取代在本領域中是已知的，並且已經在上文提供實例。氨基酸修飾範圍可從改變或修飾一個或多個氨基酸到區域諸如可變結構域的完全重新設計(redesign)。可變結構域中的變化可改變結合親和力和/或特異性。修飾的其它方法包括利用本領域中已知的偶合技術，包括但不限於酶促手段、氧化取代和螯合。修飾可用於例如，連接標籤用於免疫分析，諸如連接放射性部分用於放射免疫分析。修飾的多肽利用本領域中確定的方法製備，並且可利用本領域中已知的標準測定來篩選。
本發明包括包含下述抗體的VH和/或VL結構域中的一個或多個的融合蛋白，所述抗體為：結合至PD-1(或PD-1的天然配體)的抗體、或結合至效應細胞的細胞表面分子的抗體、或結合至疾病抗原(例如，癌抗原或病原體相關抗原)的抗體。在一個實施方式中，提供包括輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈兩者的融合多肽。在另一實施方式中，融合多肽包含異源免疫球蛋白恆定區。在另一實施方式中，融合多肽包含由公開保藏的雜交瘤產生的抗體的VH和VL結構域。為了本發明的目的，抗體融合蛋白包含特異性結合PD-1(或PD-1的天然配體)或結合至效應細胞的細胞表面分子的一個或多個多肽結構域，並且其包含在天然分子中未連接的另外的氨基酸序列，例如，異源序列或來自另一區域的同源序列。
本發明尤其包括綴合至診斷或治療部分的這類結合分子(例如，抗體、雙抗體、三價結合分子等)。為了診斷目的，本發明結合分子可偶聯至可檢測檢測的物質。這類結合分子可用於作為臨床測試程式的一部分檢測監控和/或預測疾病的發展或進展，如測定具體療法的功效。可檢測檢測的物質的實例包括各種酶(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)、輔基(例如，抗生素蛋白/生物素)、螢光物質(例如，傘形酮、螢光素或藻紅蛋白)、發光物質(例如，魯米諾)、生物發光物質(例如，螢光素酶或水母發光蛋白)、放射物質(例如，碳-14、錳-54、鍶-85或鋅-65)、正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。可檢測檢測的物質可直接偶聯或綴合至結合分子或使用本領域已知的技術通過中間體(例如，連接體)間接偶聯或綴合至結合分子。
為了治療目的，本發明結合分子可以與治療部分如細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α-發射體)綴合。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害的任何試劑，例如假單胞菌外毒素、白喉毒素、肉毒桿菌毒素A至F、蓖麻毒蛋白相思豆毒蛋白、肥皂草毒蛋白和這些試劑的細胞毒性片段。治療劑包括具有預防性或治療性治療病症的治療效果的任何試劑。這樣的治療劑可以是化學治療劑、蛋白質或多肽治療劑，並且包括具有所需生物活性和/或改變給定生物應答的治療劑。治療劑的實例包括烷化劑、血管生成抑制劑、抗有絲***劑、激素治療劑和用於治療細胞增殖性病症的抗體。治療部分可以使用本領域已知的技術與結合分子直接偶聯或綴合，或通過中間體(例如，連接體)與結合分子間接偶聯或綴合。 VII. 本發明結合分子的用途
如以上討論的，能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子和能夠介導對靶細胞(即，癌細胞或病原體感染的細胞)的重定向細胞殺傷的分子可用於治療目的，例如在患有癌症或感染的受試者中用於治療目的。因此，本發明結合分子具有治療疾病或病況的能力，所述疾病或病況與這類靶細胞表面上的疾病抗原(尤其是癌抗原或病原體相關抗原)的表達有關或特徵為這類靶細胞表面上的疾病抗原(尤其是癌抗原或病原體相關抗原)的表達。因此，非限制性地，可採用本發明結合分子治療癌症，尤其是特徵為癌抗原的表達的癌症。可採用本發明結合分子治療感染，尤其是特徵為病原體相關抗原的表達的感染。
具體的，本發明包括這類方法，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子包含能夠結合PD-1的抗體的表位-結合結構域或能夠結合PD-1的天然配體的抗體的表位-結合結構域，並且其中能夠介導重定向殺傷的分子包含能夠結合效應細胞(例如，輔助T細胞、細胞毒性T細胞、天然殺傷(NK)細胞、漿細胞(分泌的抗體B細胞)、巨噬細胞和粒細胞)的細胞表面分子(例如，CD2、CD3、CD8、CD16、TCR、NKG2D等)的表位-結合結構域，並且也包含能夠結合靶細胞表面上的疾病抗原(具體的，癌抗原或病原體相關抗原)以介導對靶細胞的重定向殺傷(例如，通過介導重定向細胞殺傷(例如，重定向T細胞毒性))的表位-結合結構域。
在具體的實施方式中，能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子是抗體，並且能夠介導重定向細胞殺傷的分子是雙抗體。在另一具體實施方式中，能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子是抗體，並且能夠介導重定向細胞殺傷的分子是三價結合分子。
在具體的實施方式中，能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子是雙抗體並且能夠介導重定向細胞殺傷的分子是雙抗體。在另一具體實施方式中，能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子是雙抗體並且能夠介導重定向細胞殺傷的分子是三價結合分子。
在一個實施方式中，能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子和能夠介導重定向細胞殺傷的分子被同時施用。如本文使用的，這類“同時”施用意圖表示： (A) 施用包含能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子和能夠介導重定向細胞殺傷的分子二者的單一藥物組合物；或 (B) 分開施用兩種或多種藥物組合物，其中一種組合物包含能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子，並且其中另一種組合物包含能夠介導重定向細胞殺傷的分子，其中組合物在48小時期間內被施用。
在第二實施方式中，分子被“順序地”施用(例如，施用能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子，並且，在隨後的時間，施用能夠介導重定向細胞殺傷的分子，或反之亦然)。在這類順序施用中，在施用第一施用的組合物後至少48小時或更久施用第二施用的組合物。
“提供治療 (providing therapy) ”或“治療 (treating) ”指任何與有益或期望結果的任何跡象有關的組合物的施用，所述有益或期望結果包括而不限於任何臨床結果，如減少由疾病導致的症狀、減弱感染的症狀(例如，病毒載量、發燒、疼痛、敗血症等)、縮小腫瘤尺寸(在癌症的背景中，例如，***腫瘤、胃癌或***癌)、延遲癌細胞生長、延緩轉移的發作、發展或進展、減少由疾病導致的症狀、提高接收受試者的生活品質、減少被提供來治療受試者的疾病的其它藥物的劑量、增強另一藥物的作用如通過靶向和/或內在化、延緩疾病的進展和/或延長接收受試者的生存期(survial)。
用於治療的受試者包括動物，最優選哺乳動物物種如非靈長類動物(例如，牛、馬、貓、犬、齧齒動物等)或靈長類動物(例如，食蟹猴，人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
可通過本發明各種實施方式治療的示例性病症包括但不限於增殖性疾病、細胞增殖疾病和癌症(尤其是表達由能夠介導重定向細胞殺傷的分子結合的癌抗原的癌症)、病原體相關疾病(尤其是與由能夠介導重定向細胞殺傷的分子結合的病原體相關抗原的表達有關的慢性病毒感染)。在各種實施方式中，本發明包括用於治療、預防或管理受試者的疾病或病症的方法和組合物，包括施予受試者治療有效量的能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子和能夠介導對靶細胞(例如，腫瘤細胞、病原體感染細胞或外源細胞)的重定向殺傷的分子。這類分子的組合尤其可用於預防、抑制、減少原發腫瘤的生長或復原和腫瘤的轉移，並且可用於減少病原體載量或消除病原體感染的細胞。雖然不意欲被具體的作用機制所限制，但是這類分子可介導抵抗靶細胞的效應子功能，促進針對靶細胞的免疫系統的啟動，交聯靶細胞上的細胞表面抗原和/或受體並且提高凋亡或負生長調節信號轉導或其組合，導致靶細胞的清除和/或數量減少。
可通過本發明分子和本發明方法治療的癌症包括但不限於：腎上腺癌症 ，包括但不限於，嗜鉻細胞瘤(pheochromocytom)或腎上腺皮質癌；AIDS 相關癌症；軟組織腺泡狀肉瘤 (alveolar soft part sarcoma) ；星形細胞瘤；基底癌 (basal cancer) ；膀胱癌 ，包括但不限於，移行細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌或癌肉瘤；骨肉瘤和結締組織肉瘤 ，如但不限於，骨肉瘤(bone sarcoma)\骨肉瘤(osteosarcoma)、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性巨細胞瘤、骨的纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤(血管內皮瘤)、纖維肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、***肉瘤、神經鞘瘤、橫紋肌肉瘤或滑膜肉瘤；腦癌 ，包括但不限於，神經膠質瘤、星形細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、室管膜細胞瘤、少突神經膠質瘤、非神經膠質腫瘤(nonglial tumor)、聽神經瘤、顱咽管癌、成神經管細胞瘤、腦膜瘤、成松果體細胞瘤(pineocytoma)、松果體母細胞瘤(pineoblastoma)或原發性腦淋巴瘤；腦和脊髓癌；乳腺癌 ，包括但不限於，腺癌、小葉(小細胞)癌、導管內癌(intraductal carcinoma)、乳腺髓樣癌、乳腺黏液癌、管狀乳腺癌、乳頭狀乳腺癌(papillary breast cancer)、派傑病或炎性乳腺癌；勁動脈體瘤；宮頸癌 ，包括但不限於，鱗狀細胞癌或腺癌；膽管癌 ，包括但不限於，乳突狀、結節性膽管癌或彌漫性膽管癌；軟骨肉瘤；脊索瘤；嫌色腎細胞癌；透明細胞癌；結腸癌；結直腸癌；皮膚良性纖維組織細胞瘤；促結締組織增生性小圓細胞腫瘤；室管膜細胞瘤；眼癌 ，包括，但不限於眼黑素瘤如虹膜黑素瘤、脈絡膜黑素瘤和睫狀體黑素瘤和成視網膜細胞瘤；食管癌 ，包括但不限於鱗癌、腺癌、腺樣囊性癌(adenoid cyctic carcinoma)、黏液表皮樣癌、腺鱗癌、肉瘤、黑素瘤、漿細胞瘤、疣狀癌(verrucous carcinoma)和燕麥細胞(小細胞)癌；尤文氏腫瘤；骨骼外黏液樣軟骨肉瘤；不完全性骨纖維生成；骨纖維異常增殖症；膽囊癌或膽管癌 ，包括但不限於腺癌；胃癌；妊娠期滋養層病；生殖細胞腫瘤；頭頸癌；肝細胞癌；重鏈病；胰島細胞瘤；卡波西肉瘤；白血病 ，包括但不限於急性白血病；急性淋巴細胞性白血病；急性髓細胞性白血病 ，如，但不限於成髓細胞性白血病、早幼粒細胞白血病、骨髓單核細胞性白血病、單核細胞性白血病或紅白血病或脊髓增生異常綜合征；慢性白血病 ，如但不限於慢性髓細胞(粒細胞)白血病、慢性淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病；脂肪瘤 / 良性脂肪腫瘤；脂肪肉瘤 / 惡性脂肪腫瘤；肝癌 ，包括但不限於肝細胞癌或肝母細胞癌；淋巴瘤 ，如但不限於霍奇金病；非霍奇金病；肺癌 ，包括但不限於非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌(表皮樣癌)、腺癌、大細胞肺癌或小細胞肺癌；成神經管細胞瘤；黑素瘤；腦膜瘤；良性單克隆性丙種球蛋白病；意義未明的單克隆性丙種球蛋白病；多發性內分泌瘤 ；多發性骨髓瘤 ，如但不限於鬱積型多發性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、漿細胞白血病、孤立性漿細胞瘤和髓外漿細胞瘤；脊髓增生異常綜合征 ；成神經細胞瘤；神經內分泌腫瘤；口腔癌 ，包括但不限於鱗狀細胞癌；卵巢癌 ，包括但不限於卵巢上皮癌、交界瘤、生殖細胞腫瘤和間質腫瘤；胰腺癌 ，包括但不限於胰島瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、血管活性腸肽瘤(vipoma)、促生長素抑制素分泌腫瘤或類癌瘤或胰島細胞瘤；甲狀旁腺腫瘤；兒科癌症；嚴重癌症 (penal cancer) ；周圍神經鞘瘤；嗜鉻細胞瘤；咽喉癌 ，包括但不限於鱗狀細胞癌或疣狀癌；垂體癌 ，包括但不限於，庫欣病、催乳素分泌腫瘤(prolactin-secreting tumor)、肢端肥大症或糖尿病尿崩症(insipius)腫瘤；***癌 ，包括但不限於腺癌、平滑肌肉瘤或橫紋肌肉瘤；真性紅細胞增多症 (polycythemia vera) ；後葡萄膜黑素瘤 (posterious uveal melanoma) ；罕見血液病症；腎癌 ，包括但不限於腺癌、腎上腺樣瘤(hypernephroma)、纖維肉瘤、腎轉移性癌症或移行細胞癌(腎盂和/或uterer)；橫紋肌樣瘤 ；唾腺癌 ，包括但不限於腺癌、黏液表皮樣癌或腺樣囊性癌；肉瘤；皮膚癌症 ，包括但不限於基底細胞癌、鱗狀細胞癌和黑素瘤、淺表擴散性黑素瘤、結節性黑素瘤、雀斑樣惡性黑素瘤或肢端黑素瘤；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；胃癌 ，包括但不限於腺癌、蕈狀(息肉樣)、潰瘍性、淺表擴散性、彌漫擴散性或惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和癌肉瘤；滑膜肉瘤；睾丸癌 ，包括但不限於胚組織瘤、精原細胞瘤、未分化癌(anaplastic)、傳統(典型)癌、***細胞性腫瘤、非精原細胞瘤、胚胎性癌、畸胎癌或絨毛膜癌(卵巢內胚層竇瘤(yolk-sac tumor))；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌 ，如但不限於乳頭狀甲狀腺癌或濾泡甲狀腺癌、轉移性甲狀腺癌、甲狀腺髓質癌或未分化甲狀腺癌；子宮癌 ，包括但不限於子宮內膜癌或子宮肉瘤；***癌 ，包括但不限於鱗狀細胞癌、腺癌或黑素瘤；外陰癌 ，包括但不限於鱗狀細胞癌、黑素瘤、腺癌、基底細胞癌、肉瘤或派傑病；華氏巨球蛋白血症 (Waldenström macroglobulinemia) 或威爾姆斯瘤 。另外，癌症包括黏液肉瘤、骨源性肉瘤、內皮肉瘤(endotheliosarcoma)、***內皮肉瘤(lymphangio-endotheliosarcoma)、間皮瘤、滑膜瘤、成血管細胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支氣管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌和乳頭狀腺癌(對於這類病症的綜述，參見Fishman等人, 1985, Medicine, 第二版, J.B. Lippincott Co., Philadelphia和Murphy等人, 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis，Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc.)。
具體的，本發明結合分子可用於治療腎癌、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、成膠質細胞瘤、腎癌、非小細胞肺癌、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓樣白血病、毛細胞白血病、伯基特淋巴瘤、彌散性大B細胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、皮膚癌、腎細胞癌、睾丸癌症和子宮癌。
可由本發明LAG-3-結合分子治療的病原體相關疾病包括慢性病毒、細菌、真菌和寄生蟲感染。可由本發明LAG-3-結合分子治療的慢性感染包括愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus)、甲肝病毒(HAV)；乙肝病毒(HBV)；丙肝病毒(HCV)；皰疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、HHV-6、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢桿菌綱、檸檬酸桿菌屬、霍亂、白喉、腸桿菌屬、***、幽門螺旋桿菌、克雷伯氏菌屬、軍團菌屬、腦膜炎球菌、分歧桿菌、假單胞菌屬、Pneumonococci 、立克次氏體細菌、沙門氏菌屬、沙雷菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、破傷風、曲黴菌屬(煙麯黴、黑麯黴等)、皮炎芽生菌、念珠菌屬白色念珠菌、克柔假絲酵母、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新生隱球菌、毛黴目的屬、犁頭黴屬、根黴屬)、申克氏胞絲菌、巴西芽生菌、粗球黴菌、莢膜組織胞漿菌、細螺旋體病、包柔氏螺旋體、蠕蟲寄生蟲(鉤蟲、絛蟲、吸蟲、扁形蟲(例如血吸蟲)、藍氏賈第蟲、旋毛蟲、脆雙核阿米巴、布氏錐蟲、克氏錐蟲和杜氏利什曼蟲。 VIII. 藥物組合物
本發明包括這類組合物，其包含能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子、能夠介導對腫瘤細胞的重定向殺傷的分子，或這類分子的組合物。本發明的組合物包括原料藥物組合物，其可用於製造藥物組合物(例如，不純的或非無菌組合物)和可用於製備單位劑型的藥物組合物(即，適於施用至受試者或患者的組合物)。這類組合物包含預防或治療有效量的能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子、能夠介導對靶細胞(例如，癌細胞、病原體感染細胞等)的重定向殺傷的分子，或這類劑的組合以及藥學可接受的載體。優選地，本發明組合物包含預防或治療有效量的本發明結合分子和藥學可接受的載體。在優選的方面，這類組合物是基本上純的(即，基本上沒有限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。
在多於一種治療劑被施用的情況下，這些劑可在相同的製劑中被製備在一起或可被製備為單獨的組合物。因此，在一些實施方式中，能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子和能夠介導對靶細胞(例如，癌細胞、病原體感染細胞等)的重定向殺傷的分子在相同的藥物組合物中被製備在一起。在可選的實施方式中，分子在單獨的藥物組合物中被製備。
能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子、能夠介導對靶細胞(例如，癌細胞、病原體感染細胞等)的重定向殺傷的分子或這類分子的組合的各種製劑可用於施用。除了藥學活性劑(一種或多種)，本發明組合物還可包含合適的藥學可接受的載體，所述載體包括賦形劑和輔助劑，所述賦形劑和輔助劑是本領域中已知的並且是相對惰性的物質，其促進藥學有效物質的施用或有助於活性化合物加工成在被製藥上用於遞送至作用位點的製劑。例如，賦形劑可具有給定的形式或或稠度，或用作稀釋劑。合適的賦形劑包括但不限於穩定劑、潤濕劑和乳化劑、用於改變滲透壓的鹽、封裝劑、緩衝劑和皮膚滲透增強劑。
在具體的實施方式中，術語“藥學上可接受的 ”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體 ”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。一般而言，本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥學級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物，則可以提供一安瓿注射用無菌水或鹽水，以便可以在施用前混合所述成分。
本發明也提供藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充本發明的結合分子，單獨地或與這類藥學上可接受的載體一起。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可包括在藥物包裝或試劑盒中。本發明也提供了這樣的藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器(一個或多個)關聯的可以是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的佈告(notice)，所述佈告反映了管理機構許可用於人類施用的製造、使用或銷售。
本發明提供了可用於上述方法的試劑盒。試劑盒可以包括本發明的任何結合分子。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包括可用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑。 IX. 施用方法
通過向受試者施用有效量的包含本發明能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子的藥物組合物，和包含本發明能夠介導對腫瘤細胞的重定向殺傷的分子的藥物組合物；或包括本發明這類分子的組合的藥物組合物，可提供本發明組合物用於治療、預防和改善與疾病、病症或感染有關的一種或多種症狀。在優選的方面，這類組合物基本上是純的(即，基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
施用本發明的分子或組合物的方法包括但不限於腸胃外施用(例如皮內、肌肉、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及黏膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方式中，本發明的結合分子經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚被覆(lining) (例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。
本發明也使得本發明的結合分子的製劑包裝在密封容器中，比如指示分子的數量的安瓿或小袋中。在一個實施方式中，這樣的分子作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以用例如水或鹽水重構至適當濃度，用於施用於受試者。優選地，本發明的結合分子作為無菌凍幹粉末提供在密封容器中。
本發明結合分子的凍幹製劑應在它們的初始容器中儲存在2°C和8°C之間，並且分子應該在重構之後12小時內，優選地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內施用。在可選的實施方式中，這樣的分子以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，這類結合分子在以液體形式提供時，被供應在密封容器中。
可通過標準臨床技術確定本發明的這類製劑有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的量。製劑中採用的精確劑量還將取決於施用的路徑和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線推斷。
如本文使用的，藥物組合物的“有效量 ”是足以實現有益或期望的結果的量，所述結果包括但不限於臨床結果，比如減少源自疾病的症狀、減少感染的症狀(例如，病毒量、發燒、疼痛、敗血症等)或癌症的症狀(例如，癌細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而提高遭受疾的患者的生命品質，降低治療疾病需要的其他藥物治療的劑量、比如經靶向和/或內化增強另一藥物的作用、延遲疾病的進展，和/或延長個體的生存期。當應用於單獨施用的單一活性成分時，該術語僅指該成分。當應用於組合物時，該術語指無論連續地或同時地組合施用，引起治療效果的活性成分的組合的量。
可在一次或多次施用中施加有效量。為了本發明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量是這樣的量，所述量足以：直接或間接地殺傷和/或減少癌症細胞的增殖，和/或消除、降低和/或延遲從癌症的原發位點(primary site)轉移的發展；或減少感染病原體的增殖(或影響)和降低和/或延遲病原體介導的疾病的發展。在一些實施方式中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可聯合或不聯合另一藥物、化合物或藥物組合物實現。因此，“有效量”可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮，並且如聯合一種或多種其他劑，可實現或實現期望的結果，則單劑可視為以有效量施用。儘管個體的需要不同，但是測定每種組分的有效量的最佳範圍是本領域技術人員已知的。
對於本發明包括的結合分子，施用於患者的劑量優選基於接受受試者的體重(kg)確定。對於本發明包括的ROR1-結合分子，施用於患者的劑量通常為受試者體重的約0.01 μg/kg至約30 mg/kg或更多。
可通過修飾比如，例如脂質化而增強分子的吸收和組織滲透，來減少或改變本發明的結合分子的給藥劑量和頻率。
對於用作單劑療法，可計算向患者施用的本發明的結合分子的劑量。可選地，分子可與其他治療組合物聯合使用，並且向患者施用的劑量小於當所述分子用作單劑療法時的劑量。
本發明藥物組合物可被局部施用至需要治療的區域；這可通過例如，但不限於下述方式實現：局部注入、通過注射、或通過植入物的手段，所述植入物是多孔的、非多孔的或膠狀材料，包括膜，比如矽橡膠膜或纖維。優選地，當施用本發明的分子時，必須注意使用不吸收該分子的材料。
本發明組合物可以在泡狀體(vesicle)，尤其是脂質體中遞送(見Langer (1990)“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)；Treat等,在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein和Fidler (編輯), Liss, New York, 353- 365頁(1989)中；Lopez-Berestein, 同上, 317-327頁)。
在本發明的組合物是編碼本發明的結合分子的核酸的情況下，核酸可被體內施用，以通過如下方式促進其編碼的結合分子的表達：將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用其從而其成為細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic), Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑塗覆，或通過與已知進入核的同源框樣肽聯合施用(見例如，Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad.Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868)等。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表達。
用治療或預防有效量的本發明的結合分子對受試者的治療可包括單治療，或優選地，可包括一系列治療。在優選的實施例中，用本發明的藥物組合物治療受試者，持續約1至10周，優選地2至8周，更優選地約3至7周，和甚至更優選地持續約4、5或6周。本發明的藥物組合物可以每天施用一次，其中這樣的給藥每週發生一次、每週發生兩次、每兩周發生一次、每月發生一次、每六周發生一次、每兩月發生一次、每年發生兩次或每年發生一次等。可選地，本發明的藥物組合物可每天施用兩次，其中這樣的給藥每週發生一次、每週發生兩次、每兩周發生一次、每月發生一次、每六周發生一次、每兩月發生一次、每年發生兩次或每年發生一次等。可選地，本發明的藥物組合物可每天施用三次，其中這樣的給藥每週發生一次、每週發生兩次、每兩周發生一次、每月發生一次、每六周發生一次，每兩月發生一次、每年發生兩次或每年發生一次等。還應當理解，用於治療的分子的有效劑量可以在特定治療過程中增加或減少。實施例
現在已經大體上描述了本發明，通過參照下述實施例可更容易理解本發明，所述實施例以示例的方式提供，並不意欲限制本發明，除非指出。 實施例1聯合治療研究： LOX-IMVI 腫瘤模型
為了闡釋本發明的原理，使用重建的腫瘤模型進行聯合治療研究，在所述腫瘤模型中，LOX-IMVI人轉移性黑素瘤癌細胞被皮下注射至經人PBMC重構的MHCI-/- 小鼠中。然後向小鼠施用媒介物或下述的治療： (1) 人源化抗-人PD-1抗體：hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) ，這類抗體是能夠結合PD-1的分子；和/或 (2) CD3 x B7-H3雙特異性雙抗體DART-A ，這類雙抗體是能夠結合效應細胞的細胞表面分子(即，CD3)並且能夠結合癌抗原(即，B7-H3)的分子，從而能夠介導對表達B7-H3的癌細胞的重定向殺傷。 這類施用的分子的氨基酸序列如上描述。表 11 顯示了該研究的參數。每組由6只雌性小鼠組成。對於所有組，小鼠接受5 x 106 LOX-IMVI癌細胞(ID；在研究的第33天施用)和106 人PBMC (IP；在研究的第0天施用)。每週提供治療(在研究的第42天開始施用的分子(一種或多種)或媒介物)，達三個劑量(Q7Dx3)；通過靜脈注射施用劑量。
測量隨著時間變化的腫瘤體積。圖 7 顯示該研究的結果，並且證明聯合療法相對於僅施用hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 或僅使用DART-A 具有不可預料的益處。 實施例2聯合治療研究： Detroit562 腫瘤模型
為了進一步闡釋本發明的原理，使用重建的腫瘤模型進行聯合治療研究，在所述腫瘤模型中，Detroit562人轉移性咽癌癌細胞被皮下注射至經人PBMC重構的MHCI-/- 小鼠中。然後向小鼠施用媒介物對照，1 mg/kghPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 、0.5 mg/kgDART-A 或1 mg/kghPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 和0.5 mg/kgDART-A 二者。表 12 顯示該研究的參數。每組由8只雄性小鼠組成。對於所有組，小鼠接受5 x 106 Detroit562癌細胞(ID)和106 人PBMC (IP；在研究的第0天施用)。每週提供治療(在研究的第7天開始施用的分子(一種或多種)或媒介物)，進行四周(Q7Dx4)，或每14天提供治療一次，達兩個劑量(Q14Dx2)；通過靜脈注射施用劑量。
測量隨著時間變化的腫瘤體積。圖 8A-8B 顯示該研究的結果，其再次證明聯合療法相對於僅施用hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 或僅使用DART-A 具有不可預料的益處。圖 8A 顯示組1-3和5的結果；圖 8B 顯示組1-4和6的結果。
小鼠中CD3+ 細胞的濃度在研究結束時測定。令人驚訝地發現，這類細胞的濃度在已經接受聯合療法的小鼠中已經增加(圖 9 )，從而表明本發明療法已經增強了動物的免疫應答。 實施例3信號傳導模型
為了進一步闡釋本發明的原理，在T細胞/腫瘤細胞共培養系統中使用Jurkat-luc-NFAT/腫瘤細胞螢光素酶報告測定來檢驗協作的T細胞信號轉導。簡言之，將表達PD-1和B7-H3的MDA-MB-231腫瘤靶細胞與MNFAT-luc2/PD-1 Jurkat T細胞以1:1 (圖 10A )或3:1 (圖 10B )的效應子：靶細胞比混合，並且在存在增加濃度的DART-A 的情況下，單獨培養或與固定濃度(12.5 nM)的PD-1結合分子hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 、DART-1 、 對照抗體一起培養。發光作為細胞啟動和信號轉導的指示(indicator)被測量。圖 10A-10B 顯示了該研究的結果，其證明了能夠結合PD-1的分子(例如，hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 、DART-1 )和能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子(例如，DART-A )的組合增強了效應細胞信號轉導活性。 實施例4聯合治療研究：在 A375 腫瘤模型中比較正常 T 細胞與無反應性 T 細胞
為了進一步闡釋本發明的原理，使用重建的腫瘤模型進行聯合治療研究，在所述腫瘤模型中，A375人黑色素瘤細胞被皮下注射至經啟動的或無反應性的人T細胞重構的NOG小鼠中。然後向小鼠施用媒介物或下述的治療： (1) PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體：DART-2 ，這類雙抗體是能夠結合PD-1的分子；和/或 (2) CD3 x IL13Rα2雙特異性雙抗體DART-B ，這類雙抗體是能夠結合效應細胞的細胞表面分子(即，CD3)並且能夠結合癌抗原(即，IL13Rα2)的分子，從而能夠介導對表達IL13Rα2的癌細胞的重定向殺傷。
通過在IL-2的存在下用CD3/CD28啟動珠培養純化的人T細胞，進行兩輪，製備啟動的T細胞。通過在IL-2的存在下用CD3/CD28啟動珠培養純化的人T細胞，進行一輪，接著在沒有IL-2的情況下用CD3/CD28啟動珠培養一輪，製備無反應性的T細胞。小鼠組(n=8只雌性)在研究的第0天接受皮下接種5 x 106 的A375黑色素瘤細胞(用0.1 μg/mL IFNγ預處理24小時)和5 x 106 人T細胞(啟動的或無反應性的)，並且然後施用媒介物對照、0.5 mg/kgDART-2 、0.5 mg/kgDART-B 或0.5 mg/kgDART-2 和0.5 mg/kgDART-B 兩者。每週提供治療(施用的分子(一種或多種)或媒介物)，進行四個劑量(Q7Dx4)，或在研究的第0天作為單治療提供(QD (SD))；通過靜脈注射施用劑量。表 13 顯示該研究的參數。
測量隨著時間變化的腫瘤體積。圖 11A-11B 顯示該研究的結果，證明能夠結合PD-1的分子(例如，hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 、DART-1 、 DART-2 )和能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子(例如，DART-A 、 DART-B )的聯合療法在存在無反應性T細胞的情況下降低腫瘤復發率。這些結果再次證明了能夠結合PD-1的分子和能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子的聯合療法相對於單獨施用任一種分子具有不可預料的益處。圖 11A 顯示用正常活性的T細胞接種的組1-4的結果；圖 11B 顯示用無反應性T細胞接種的組5-8的結果。
本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，達到如同具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的相同程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步修改，並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理並且包括與本公開的偏離的本發明的任何變型、用途或改變，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且如可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。
無
圖 1 提供了具有兩個表位-結合結構域的代表性共價結合雙抗體的示意圖，其中所述雙抗體由兩條多肽鏈構成，每一條多肽鏈各具有E-螺旋或K-螺旋異源二聚體促進結構域(以下提供了可選的異源二聚體促進結構域)。半胱氨酸殘基可存在於連接體和/或異源二聚體促進結構域中，如圖 3B 中顯示的。使用相同網底或填充式樣顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。
圖 2 提供具有兩個表位-結合結構域的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖，所述雙抗體由兩條多肽鏈構成，每一條多肽鏈各具有CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成Fc結構域的全部或部分。使用相同網底或填充式樣顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。
圖 3A-3C 提供顯示具有四個表位元-結合結構域的代表性共價結合的四價雙抗體的示意圖，所述雙抗體由兩對多肽鏈(即，總計四條多肽鏈)構成。每對中的一條多肽具有CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成Fc結構域的全部或部分。使用相同網底或填充式樣顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。兩對多肽鏈可相同。在其中兩對多肽鏈相同並且VL和VH結構域識別不同表位元(如圖 3A-3B 中顯示的)的這類實施方式中，所得分子具備四個表位-結合結構域並且就每個結合的表位而言是雙特異性和二價的。在其中VL和VH結構域識別相同表位元(例如，在兩條鏈上使用相同VL結構域CDR和相同VH結構域CDR)的這類實施方式中，所得分子具備四個表位-結合結構域並且相對於單表位而言是單特異性的和四價的。可選地，兩對多肽可不同。在其中兩對多肽鏈不同並且每對多肽的VL和VH結構域識別不同表位元(如由圖 3C 中的不同網底和樣式所顯示的)的這類實施方式中，所得分子具備四個表位-結合結構域並且相對於每個結合的表位而言是四特異性的和單價的。圖 3A 顯示了含Fc結構域的雙抗體，其包含含有半胱氨酸殘基的肽異源二聚體促進結構域。圖 3B 顯示了含Fc結構域的雙抗體，其包含含有半胱氨酸殘基和連接體(具有任選的半胱氨酸殘基)的E-螺旋和K-螺旋異源二聚體促進結構域。圖 3C 顯示了含Fc結構域的雙抗體，其包含抗體CH1和CL結構域。
圖 4A-4B 提供了具有兩個表位-結合結構域的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖，所述雙抗體分子由三條多肽鏈構成。多肽鏈中的兩條具備CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成Fc結構域的全部或部分。包含VL和VH結構域的多肽鏈進一步包含異源二聚體促進結構域。使用相同網底或填充式樣顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。
圖 5 提供了具有四個表位-結合結構域的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖，所述雙抗體分子由五條多肽鏈構成。多肽鏈中的兩條具備CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成包含Fc結構域的全部或部分的Fc結構域。包含連接的VL和VH結構域的多肽鏈進一步包含異源二聚體促進結構域。使用相同網底或填充式樣顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。
圖 6A-6F 提供了具有三個表位-結合結構域的代表性含Fc結構域的三價結合分子的示意圖。圖 6A 和6B 分別示意性地闡釋了包含兩個雙抗體型結合結構域和具有不同結構域取向(其中所述雙抗體型結合結構域在Fc結構域的N-末端或C-末端)的Fab型結合結構域的三價結合分子的結構域。圖 6A 和6B 中的分子包含四條鏈。圖 6C 和6D 分別示意性地闡釋了三價結合分子的結構域，其包括在Fc結構域的N-末端的兩個雙抗體型結合結構域，和其中輕鏈和重鏈通過多肽間隔物連接的Fab型結合結構域，或scFv型結合結構域。圖 6E 和6F 中的三價結合分子分別示意性地闡釋了三價結合分子的結構域，其包括在Fc結構域的C-末端的兩個雙抗體型結合結構域，和其中輕鏈和重鏈通過多肽間隔物連接的Fab型結合結構域，或scFv型結合結構域。圖 6C -6F 中的三價結合分子包含三條鏈。使用相同網底或填充式樣顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。
圖 7 顯示了提供MHCI-/- 小鼠的結果，所述小鼠已接受5 x 106 LOX-IMVI人轉移性黑素瘤癌細胞(ID)和106 人PBMC (IP)，連同人源化抗-人PD-1抗體hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 、CD3 x B7-H3雙特異性雙抗體DART-A 、連同hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 和DART-A 兩者，或連同僅僅媒介物(對照)。
圖 8A-8B 顯示了提供MHCI-/- 小鼠的結果，所述小鼠已接受5 x 106 Detroit562人轉移性咽癌癌細胞(ID)和106 人PBMC (IP)，連同人源化抗-人PD-1抗體hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 、CD3 x B7-H3雙特異性雙抗體DART-A 、連同hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 和DART-A 兩者，或連同僅僅媒介物(對照)。圖 8A 顯示了媒介物對照hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) (Q7Dx5)、DART-A (Q7Dx5)和hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) + DART-A (Q7Dx5)的結果。圖 8B 顯示了媒介物對照hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) (Q7Dx5)、DART-A (Q7Dx5)、hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) + DART-A (Q7Dx5)和hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) + DART-A (Q14Dx3)的結果。
圖 9 顯示了對施用本發明聯合療法的效果的研究結果。結果顯示受體動物的免疫應答的增強，如通過其CD3+ 細胞的濃度增加所確定的。
圖 10A-10B 顯示了在螢光素酶報告測定中對於本發明聯合療法對T-細胞信號轉導的作用的研究結果。以1:1(圖 10A )或3:1 (圖 10B )的效應子:靶細胞比將表達PD-1和B7-H3的MDA-MB-231腫瘤靶細胞與MNFAT-luc2/PD-1 Jurkat T-細胞混合，並且在存在增加濃度的DART-A 的情況下單獨培養或與固定濃度(12.5 nM)的PD-1結合分子hPD-1 mAb7 (1.2) IgG4(P) 、DART-1 或對照抗體(hIgG)一起培養。這些結果顯示在存在兩種分子時信號轉導活性的增強，如通過增加的光照所測定的。
圖 11A-11B 顯示在存在無反應性T-細胞的情況下施用本發明聯合療法降低腫瘤復發。NOG小鼠已接受5 x 106 A375 INFγ處理的黑色素瘤細胞和5 x 106 啟動的或無反應性人T-細胞以及僅僅媒介物、0.5 mg/kgDART-2 (Q7Dx4)、0.5 mg/kgDART-B (QDx1)或0.5 mg/kgDART-2 (Q7Dx4)和0.5 mg/kgDART-B (QDx1)兩者。圖 11A 顯示接受啟動的T-細胞的小鼠的結果，並且圖 11B 顯示接受無反應性T-細胞的小鼠的結果。

Claims (38)

  1. 一種用於治療癌症或病原體相關疾病的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療有效量的： (1) 能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子，和 (2) 能夠介導對靶細胞的重定向殺傷的分子，其中所述靶細胞是： (a) 表達癌抗原的癌細胞；或 (b) 表達病原體相關抗原的病原體感染細胞。
  2. 如請求項1所述的方法，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述分子能夠抑制PD-1和PD-1的天然配體之間的結合。
  3. 如請求項1所述的方法，其中所述方法包括施用累計包含三個表位元-結合結構域的兩種結合分子，所述兩種結合分子是： (A) 包含能夠結合PD-1的抗體的表位元-結合結構域或能夠結合PD-1的天然配體的抗體的表位元-結合結構域的結合分子；和 (B) 包含下述的結合分子： (1) 能夠結合所述效應細胞的細胞表面分子的抗體的表位元-結合結構域；和 (2) 能夠結合所述靶細胞的所述癌抗原或所述病原體抗原的抗體的表位元-結合結構域； 其中所述結合分子(A)的所述表位元-結合結構域能夠結合PD-1或PD-1的天然配體，並且所述結合分子(B)的所述表位元-結合結構域(1)和(2)能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷。
  4. 如請求項3所述的方法，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包括雙抗體、ScFv、抗體或TandAb，並且所述結合分子(B)包括雙特異性雙抗體、CAR、BiTe或雙特異性抗體。
  5. 如請求項3或4中任一項所述的方法，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包含結合PD-1的抗體的表位元-結合結構域。
  6. 如請求項3或4中任一項所述的方法，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包含結合PD-1的天然配體的抗體的表位元-結合結構域。
  7. 如請求項5所述的方法，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包含能夠結合PD-1的第二表位元-結合結構域，其中這類表位元-結合結構域： (a) 競爭結合PD-1的相同表位；或 (b) 不競爭結合PD-1的相同表位。
  8. 如請求項7所述的方法，其中所述PD-1表位元-結合結構域能夠同時結合至相同的PD-1分子。
  9. 如請求項6所述的方法，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包含能夠結合所述PD-1的天然配體的第二表位元-結合結構域，其中這類表位元-結合結構域： (a) 競爭結合PD-1的這類天然配體的相同表位；或 (b) 不競爭結合PD-1的這類天然配體的相同表位。
  10. 如請求項9所述的方法，其中所述PD-1配體-表位元-結合結構域能夠同時結合所述PD-1的天然配體的相同分子。
  11. 如請求項5或6所述的方法，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包含第二表位元-結合結構域，其能夠結合不是PD-1或不是PD-1的天然配體的分子的表位。
  12. 如請求項11所述的方法，其中所述第二表位元-結合結構域結合CD137、LAG-3、OX40、TIGIT、TIM-3或VISTA的表位。
  13. 如請求項1-12中任一項所述的方法，其中能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷的所述結合分子包含第三表位元-結合結構域，其能夠結合所述效應細胞的細胞表面分子。
  14. 如請求項13所述的方法，其中能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷的所述結合分子的所述第三表位元結合-結構域能夠結合所述效應細胞的不同細胞表面分子，以便能夠介導所述重定向殺傷的所述結合分子能夠結合所述效應細胞的兩種不同細胞表面分子。
  15. 如請求項2-12中任一項所述的方法，其中能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷的所述結合分子包含第三表位元-結合結構域，其能夠結合至所述靶細胞的癌抗原或病原體相關抗原。
  16. 如請求項15所述的方法，其中能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷的所述結合分子的所述第三表位元結合-結構域能夠結合所述靶細胞的不同癌抗原或不同病原體抗原，以便能夠介導所述重定向殺傷的所述結合分子能夠結合至所述靶細胞的兩種不同癌抗原或兩種不同病原體抗原。
  17. 如請求項2-16中任一項所述的方法，其中所述效應細胞的所述細胞表面分子選自：CD2、CD3、CD8、CD16、TCR和NKG2D。
  18. 如請求項2-17中任一項所述的方法，其中所述癌抗原選自下述癌抗原：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-聯蛋白、血型ALeb /Ley 、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、細胞角蛋白8、D1.1、D1 56-22、DR5、E1 系列、EGFR、肝配蛋白受體、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神經節苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整聯蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4全癌抗原、L6,L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、間皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙醯葡糖氨基轉移酶、擬糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制癌蛋白M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、***酸磷酸鹽、R24 、ROR1、鞘脂類、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T細胞受體衍生的肽、T5 A7 、TAG-72、TL5、TNF-受體、TNF-γ受體、TRA-1-85、轉鐵蛋白受體、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受體、VEP8、VEP9、VIM-D5和Y半抗原Ley 。
  19. 如請求項2-17中任一項所述的方法，其中所述方法包括所述藥物組合物的所述施用，並且其中所述病原體相關抗原選自下述病原體相關抗原：單純皰疹病毒感染的細胞蛋白質(ICP)47、單純皰疹病毒gD、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-1、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2A、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2B、人免疫缺陷病毒gp160、人免疫缺陷病毒gp120、人免疫缺陷病毒gp41等、人乳頭瘤病毒E6、人乳頭瘤病毒E7、人T細胞白血病病毒gp64、人T細胞白血病病毒gp46和人T細胞白血病病毒gp21。
  20. 一種藥物組合物，其包含： (A) 治療有效量的： (1) 能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的分子，和 (2) 能夠介導對表達癌抗原或病原體抗原的靶細胞的重定向殺傷的分子；和 (B) 藥學上可接受的載體。
  21. 如請求項20所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含累計包含三個表位元-結合結構域的兩種結合分子，所述兩種結合分子是： (A) 包含能夠結合PD-1的抗體的表位元-結合結構域或能夠結合PD-1的天然配體的抗體的表位元-結合結構域的結合分子；和 (B) 包含下述的結合分子： (1) 能夠結合所述效應細胞的細胞表面分子的抗體的表位元-結合結構域；和 (2) 能夠結合所述靶細胞的癌抗原或病原體相關抗原的抗體的表位元-結合結構域； 其中所述結合分子(A)的所述表位元-結合結構域能夠結合PD-1或PD-1的天然配體，並且所述結合分子(B)的所述表位元-結合結構域(1)和(2)能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷。
  22. 如請求項21所述的藥物組合物，其中所述結合分子(A)包括雙抗體、ScFv、抗體或TandAb，並且所述結合分子(B)包括雙抗體、CAR、BiTe或雙特異性抗體。
  23. 如請求項21-22中任一項所述的藥物組合物，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述分子包含結合PD-1的抗體的表位元-結合結構域。
  24. 如請求項21-22中任一項所述的藥物組合物，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述分子包含結合PD-1的天然配體的抗體的表位元-結合結構域。
  25. 請求項23所述的藥物組合物，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述分子包含能夠結合PD-1的第二表位元-結合結構域，其中這類PD-1表位元-結合結構域： (a) 競爭結合PD-1的相同表位；或 (b) 不競爭結合PD-1的相同表位。
  26. 如請求項25所述的藥物組合物，其中所述PD-1表位元-結合結構域能夠同時結合相同的PD-1分子。
  27. 如請求項24所述的藥物組合物，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包含能夠結合所述PD-1的天然配體的第二表位元-結合結構域，其中這類表位元-結合結構域： (a) 競爭結合PD-1的這類天然配體的相同表位；或 (b) 不競爭結合PD-1的這類天然配體的相同表位。
  28. 如請求項27所述的藥物組合物，其中所述PD-1配體-表位元-結合結構域能夠同時結合所述PD-1的天然配體的相同分子。
  29. 如請求項23或24所述的方法，其中能夠結合PD-1或PD-1的天然配體的所述結合分子包含第二表位元-結合結構域，其能夠結合不是PD-1或不是PD-1的天然配體的分子的表位。
  30. 如請求項29所述的方法，其中所述第二表位元-結合結構域結合CD137、LAG-3、OX40、TIGIT、TIM-3或VISTA的表位。
  31. 如請求項20-29中任一項所述的藥物組合物，其中能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷的所述分子包含第三表位元-結合結構域，其中這樣的三個表位元-結合結構域能夠同時結合，並且其中所述第三表位-結合位點能夠結合所述效應細胞的細胞表面分子的表位。
  32. 如請求項31所述的藥物組合物，其中能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷的所述結合分子的所述第三表位元結合-結構域能夠結合所述效應細胞的不同細胞表面分子，以便能夠介導所述重定向殺傷的所述結合分子能夠結合所述效應細胞的兩種不同細胞表面分子。
  33. 如請求項20-30中任一項所述的藥物組合物，其中能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷的所述結合分子包含能夠結合所述靶細胞的癌抗原或病原體相關抗原的第三表位元-結合結構域。
  34. 如請求項33所述的藥物組合物，其中能夠介導對所述靶細胞的重定向殺傷的所述結合分子的所述第三表位元結合-結構域能夠結合所述靶細胞的不同癌抗原或不同病原體相關抗原，以便能夠介導所述重定向殺傷的所述結合分子能夠結合所述靶細胞的兩種不同癌抗原或兩種不同病原體相關抗原。
  35. 如請求項21-34中任一項所述的藥物組合物，其中所述效應細胞的所述細胞表面分子選自：CD2、CD3、CD8、CD16、TCR和NKG2D。
  36. 如請求項20-35中任一項所述的藥物組合物，其中所述癌抗原選自下述癌抗原：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-聯蛋白、血型ALeb /Ley 、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、細胞角蛋白8、D1.1、D1 56-22、DR5、E1 系列、EGFR、肝配蛋白受體、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神經節苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整聯蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4全癌抗原、L6、L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、間皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙醯葡糖氨基轉移酶、擬糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制癌蛋白M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、***酸磷酸鹽、R24 、ROR1、鞘脂類、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T細胞受體衍生的肽、T5 A7 、TAG-72、TL5、TNF-受體、TNF-γ受體、TRA-1-85、轉鐵蛋白受體、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受體、VEP8、VEP9、VIM-D5和Y半抗原Ley 。
  37. 如請求項20-35中任一項所述的藥物組合物，其中所述病原體相關抗原選自下述病原體抗原：單純皰疹病毒感染的細胞蛋白質(ICP)47、單純皰疹病毒gD、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-1、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2A、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2B、人免疫缺陷病毒gp160、人免疫缺陷病毒gp120、人免疫缺陷病毒gp41等、人乳頭瘤病毒E6、人乳頭瘤病毒E7、人T細胞白血病病毒gp64、人T細胞白血病病毒gp46和人T細胞白血病病毒gp21。
  38. 一種試劑盒，其包括如請求項20-37中任一項所述的藥物組合物，其中其所述結合分子被分裝在一個或多個容器中。
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