TW201731872A - 標靶CD32b之抗體及其使用方法 - Google Patents

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斯特凡 艾偉特
艾倫 哈利斯
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伊莎貝爾 依斯那第
海慧 呂
馬修 約翰 美亞
尼可拉斯 威爾森
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Abstract

本發明係關於選擇性結合人類CD32b之經分離抗體及其抗原結合片段。本文中亦提供包含該等抗體或其抗原結合片段之組合物、使用該等抗體或其抗原結合片段之方法及製造該等抗體或其抗原結合片段之方法。

Description

標靶CD32b之抗體及其使用方法
本發明係關於結合人類CD32b之抗體及其抗原結合片段，及其組合物及使用方法。
Fc γ受體(FcγR)會結合IgG且其係由多種免疫細胞表現，使得其能用作先天免疫性與體液性免疫性之間之連接。活化性FcγR含有免疫受體酪胺酸基活化基序(ITAM)，其直接在其細胞內部分中或在相關信號傳導單元之細胞質結構域(例如同二聚共同γ鏈)中。當受體經抗原-抗體複合物交聯時，該等ITAM基序會發生磷酸化。活化性FcγR含有免疫受體酪胺酸基活化基序(ITAM)或與其相關，該等基序當受體經抗原-抗體複合物交聯時會發生磷酸化。在活化後，該等受體介導免疫反應，包括吞噬作用及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(Nimmerjahn及Ravetch,Nature Rev.Immunol.2008：8(1)34-47)。CD32b係唯一抑制性FcγR且含有細胞內免疫受體酪胺酸基抑制性基序(ITIM)。CD32b由包括樹突細胞及巨噬細胞之免疫細胞表現(Nimmerjahn及Ravetch,Nature Rev.Immunol.2008：8(1)34-47)且係在B細胞上表現之唯一FcγR(Amigorena等人，Eur.J.Immunol.1989：19(8)1379-1385)。CD32b之活化及ITIM磷酸化導致抑制活化性 FcγR功能(Smith及Clatworthy,Nat.Rev.Immunol.2010：(5)328-343)，或在交聯至B細胞受體時導致降低B細胞功能(Horton等人，J.Immunol.2011：186(7)：4223-4233)。與其抑制性作用一致，具有Fc依賴性活性/ADCC作用模式之治療性抗體在剔除CD32b之小鼠中具有較WT小鼠更穩健之抗腫瘤反應(Clynes等人，Nat.Med.2000：6(4)：443-6)。另外，損傷CD32b功能之多型性與自體免疫性之發展相關(Floto等人，Nat.Med.2005：11(10)1056-1058)。
CD32b表現為兩種剪接變體CD32b1及CD32b2，其具有類似細胞外結構域但具有不同細胞內結構域，顯示其內化傾向。全長變體CD32b1(UniProtKB P31944-1)係在淋巴樣細胞上表現且具有防止內化之細胞內信號序列。在骨髓細胞上表現之CD32b2(UniProtKB P31944-2)缺少此信號序列且因此更易內化(Brooks等人，J.Exp.Med.1989：170(4)1369-1385)。
除了在B細胞成熟期間始終表現以外，發現CD32b在該等細胞之惡性對應細胞上大量表現。具體而言，發現CD32b在B細胞淋巴瘤(包括CLL、NHL、多發性骨髓瘤)上表現，且已提出將CD32b作為該等適應症(例如Rankin等人，Blood 2006：108(7)2384-2391)及其他適應症(包括全身性輕鏈類澱粉變性)之治療標靶(Zhou等人，Blood 2008：111(7)3403-3406)。
已顯示CD32b在腫瘤細胞上之表現與含利妥昔單抗(rituximab)治療方案之臨床益處降低有關(Lim等人，Blood 2011：118(9)2530-2540)。此外，發現在活體內發展對阿倫單抗(alemtuzumab)之抗性後，CD32b表現在B細胞白血病模型中增加，且敲低CD32b使白血病細胞對阿倫單抗介導 之ADCC活性重新敏感(Pallasch等人，Cell 2014：156(3)590-602)。綜上所述，該等資料支持CD32b作為對具有Fc依賴性(例如ADCC介導之)抗腫瘤活性之抗體之抗性的機制。此機制尚未完全理解且有若干種假說。Lim等人，(Blood 2011：118(9)2530-2540)及Vaughan等人，(Blood 2014：123(5)669-677)以淋巴瘤細胞證實，CD32b結合CD20結合之利妥昔單抗之Fc，引起三結合聯合體內化且最終導致包被淋巴瘤細胞表面之CD20結合之利妥昔單抗減少。亦已提出，淋巴瘤細胞上之CD32b順式嚙合例如CD20結合之利妥昔單抗之Fc區，從而有效遮蔽利妥昔單抗Fc。利妥昔單抗Fc遮蔽之預期後果係反式嚙合效應細胞上之活化性FcγR之機會減少(Vaughan等人，Blood 2014：123(5)669-677)。已在單純皰疹病毒感染期間顯示FcγR可以此方式發生作用之證據，其中病毒編碼之FcγR嚙合結合至受感染細胞所表現病毒抗原之抗體之Fc區，由此保護其抵抗抗體依賴性細胞毒性(Van Vliet等人，Immunology 1992：77(1)109-115)。在上文所概述之兩種機制中，CD32b有效減少治療性mAb Fc(例如利妥昔單抗)與效應細胞上之活化性FcγR之間之相互作用，從而導致免疫反應/ADCC活性減小。
本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區CDR1：SEQ ID NO：1、4、7、53、56、59、105、108、111、157、160、163、209、212、215、261、264、267、313、316、319、365、368、371、417、420、423、469、472、475、521、524、527、547、550、553、573、576、579、625、628及631； (b)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：2、5、8、54、57、60、106、109、112、158、161、164、210、213、216、262、265、268、314、317、320、366、369、372、418、421；424、470、473、476、522、525、528、548、551、554、574、577、580、626、629及632；(c)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區CDR3：SEQ ID NO：3、6、9、55、58、61、107、110、113、159、162、165、211、214、217、263、266、269、315、318、321、367、370、373、419、422、425、471、474、477、523、526、529、549、552、555、575、578、581、627、630及633；(d)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區CDR1：SEQ ID NO：14、17、20、66、69、72、118、121、124、170、173、176、222、225、228、274、277、280、326、329、332、378、381、384、430、433、436、482、485、488、534、537、540、560、563、566、586、589、592、638、641、644；(e)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：15、18、21、67、70、73、119、122、125、171、174、177、223、226、229、275、278、281、327、330、333、379、382、385、431、434、437、483、486、489、535、538、541、561、564、567、587、590、593、639、642及645；及(f)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區CDR3：SEQ ID NO：16、19、22、68、71、74、120、123、126、172、175、178、224、227、230、276、279、282、328、331、334、380、383、 386、432、435、438、484、487、490、536、539、542、562、565、568、588、591、594、640、643及646；其中該抗體選擇性結合人類CD32b。
在另一實施例中，本申請案揭示抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區：SEQ ID NO：10、62、114、166、218、270、322、374、426、478、530、556、582及634；及包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區：SEQ ID NO：23、75、127、179、231、283、335、387、439、491、543、569、595及647，其中該抗體選擇性結合人類CD32b。
在另一實施例中，本申請案揭示抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含：包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈：SEQ ID NO：12、64、116、168、220、272、324、376、428、480、584及636；及包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈：SEQ ID NO：25、77、129、181、233、285、337、389、441、493、597及649，其中該抗體選擇性結合人類CD32b。
本申請案進一步揭示抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈：SEQ ID NO：38、90、142、194、246、298、350、402、454、506、532、558、610及662；及包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈：SEQ ID NO：51、103、155、207、259、311、363、415、467、519、545、571、623及675，其中該抗體選擇性結合人類CD32b。
在另一實施例中，本申請案揭示抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含： (a)分別SEQ ID NO：1、2及3之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：14、15及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(b)分別SEQ ID NO：4、5及6之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：17、18及19之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(c)分別SEQ ID NO：7、8及9之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：20、21及22之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(d)分別SEQ ID NO：53、54及55之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：66、67及68之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(e)分別SEQ ID NO：56、57及58之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：69、70及71之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(f)分別SEQ ID NO：59、60及61之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：72、73及74之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(g)分別SEQ ID NO：105、106及107之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：118、119、120之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(h)分別SEQ ID NO：108、109及110之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：121、122、123之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(i)分別SEQ ID NO：111、112及113之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：124、125、126之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(j)分別SEQ ID NO：157、158及159之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：170、171、172之LCDR1、LCDR2及 LCDR3序列；(k)分別SEQ ID NO：160、161及162之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：173、174、175之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(l)分別SEQ ID NO：163、164及165之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：176、177、178之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(m)分別SEQ ID NO：209、210及211之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：222、223及224之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(n)分別SEQ ID NO：212、213及214之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：225、226及227之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(o)分別SEQ ID NO：215、216及217之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：228、229及230之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(p)分別SEQ ID NO：261、262及263之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：274、275及276之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(q)分別SEQ ID NO：264、265及266之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：277、278及279之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(r)分別SEQ ID NO：267、268及269之HCDR1、HCDR2及 HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：280、281及282之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(s)分別SEQ ID NO：313、314及315之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：326、327及328之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(t)分別SEQ ID NO：316、317及318之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：329、330及331之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(u)分別SEQ ID NO：319、320及321之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：332、333及334之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(v)分別SEQ ID NO：365、366及367之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：378、379及380之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(w)分別SEQ ID NO：368、369及370之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：381、382及383之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(x)分別SEQ ID NO：371、372及373之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：384、385及386之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(y)分別SEQ ID NO：417、418及419之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：430、431及432之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列； (z)分別SEQ ID NO：420、421及422之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：433、434及435之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(aa)分別SEQ ID NO：423、424及425之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：436、437及438之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(bb)分別SEQ ID NO：469、470及471之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：482、483及484之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(cc)分別SEQ ID NO：472、473及474之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：485、486及487之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(dd)分別SEQ ID NO：475、476及477之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：488、489及490之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(ee)分別SEQ ID NO：521、522及523之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：534、535及536之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(ff)分別SEQ ID NO：524、525及526之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：537、538及539之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(gg)分別SEQ ID NO：527、528及529之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：540、541及542之LCDR1、LCDR2及 LCDR3序列；(hh)分別SEQ ID NO：547、548及549之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：560、561及562之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(ii)分別SEQ ID NO：550、551及552之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：563、564及565之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(jj)分別SEQ ID NO：553、554及555之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：566、567及568之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(kk)分別SEQ ID NO：573、574及575之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：586、587及588之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(ll)分別SEQ ID NO：576、577及578之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：589、590及591之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(mm)分別SEQ ID NO：579、580及581之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：592、593及594之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(nn)分別SEQ ID NO：625、626及627之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：638、639及640之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(oo)分別SEQ ID NO：628、629及630之HCDR1、HCDR2及 HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：641、642及643之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或(pp)分別SEQ ID NO：631、632及633之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：644、645及646之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在其他實施例中，本申請案揭示經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：10之VH序列及SEQ ID NO：23之VL序列；(b)SEQ ID NO：62之VH序列及SEQ ID NO：75之VL序列；(c)SEQ ID NO：114之VH序列及SEQ ID NO：127之VL序列；(d)SEQ ID NO：166之VH序列及SEQ ID NO：179之VL序列；(e)SEQ ID NO：218之VH序列及SEQ ID NO：231之VL序列；(f)SEQ ID NO：270之VH序列及SEQ ID NO：283之VL序列；(g)SEQ ID NO：322之VH序列及SEQ ID NO：335之VL序列；(h)SEQ ID NO：374之VH序列及SEQ ID NO：387之VL序列；(i)SEQ ID NO：426之VH序列及SEQ ID NO：439之VL序列；(j)SEQ ID NO：478之VH序列及SEQ ID NO：491之VL序列；(k)SEQ ID NO：530之VH序列及SEQ ID NO：543之VL序列；(l)SEQ ID NO：556之VH序列及SEQ ID NO：569之VL序列；(m)SEQ ID NO：582之VH序列及SEQ ID NO：595之VL序列；或(n)SEQ ID NO：634之VH序列及SEQ ID NO：647之VL序列。
在另一實施例中，本申請案揭示經分離抗體或其抗原結合片段，其包含： (a)SEQ ID NO：12之重鏈序列；及SEQ ID NO：25之輕鏈序列；(b)SEQ ID NO：64之重鏈序列；及SEQ ID NO：77之輕鏈序列；(c)SEQ ID NO：116之重鏈序列；及SEQ ID NO：129之輕鏈序列；(d)SEQ ID NO：168之重鏈序列；及SEQ ID NO：181之輕鏈序列；(e)SEQ ID NO：220之重鏈序列；及SEQ ID NO：233之輕鏈序列；(f)SEQ ID NO：272之重鏈序列；及SEQ ID NO：285之輕鏈序列；(g)SEQ ID NO：324之重鏈序列；及SEQ ID NO：337之輕鏈序列；(h)SEQ ID NO：376之重鏈序列；及SEQ ID NO：389之輕鏈序列；(i)SEQ ID NO：428之重鏈序列；及SEQ ID NO：441之輕鏈序列；(j)SEQ ID NO：480之重鏈序列；及SEQ ID NO：493之輕鏈序列；(k)SEQ ID NO：584之重鏈序列；及SEQ ID NO：597之輕鏈序列；或(l)SEQ ID NO：636之重鏈序列；及SEQ ID NO：649之輕鏈序列。
在一個實施例中，本申請案揭示經分離抗體或其抗原結合片段，其 包含：(a)SEQ ID NO：38之重鏈序列；及SEQ ID NO：51之輕鏈序列；(b)SEQ ID NO：90之重鏈序列；及SEQ ID NO：103之輕鏈序列；(c)SEQ ID NO：142之重鏈序列；及SEQ ID NO：155之輕鏈序列；(d)SEQ ID NO：194之重鏈序列；及SEQ ID NO：207之輕鏈序列；(e)SEQ ID NO：246之重鏈序列；及SEQ ID NO：259之輕鏈序列；(f)SEQ ID NO：298之重鏈序列；及SEQ ID NO：311之輕鏈序列；(g)SEQ ID NO：350之重鏈序列；及SEQ ID NO：363之輕鏈序列；(h)SEQ ID NO：402之重鏈序列；及SEQ ID NO：415之輕鏈序列；(i)SEQ ID NO：454之重鏈序列；及SEQ ID NO：467之輕鏈序列；(j)SEQ ID NO：506之重鏈序列；及SEQ ID NO：519之輕鏈序列；(k)SEQ ID NO：532之重鏈序列；及SEQ ID NO：545之輕鏈序列；(l)SEQ ID NO：558之重鏈序列；及SEQ ID NO：571之輕鏈序列； (m)SEQ ID NO：610之重鏈序列；及SEQ ID NO：623之輕鏈序列；或(n)SEQ ID NO：662之重鏈序列；及SEQ ID NO：675之輕鏈序列。
本申請案亦揭示經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：157、160或163之胺基酸序列之HCDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：158、161或164之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含選自SEQ ID NO：159、315、367、419、471、523、549、575或627之胺基酸序列之HCDR3；(d)包含選自SEQ ID NO：170、173或176之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：171、174或177之胺基酸序列之LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列之LCDR3。
在另一實施例中，本申請案提供經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：157、160或163之胺基酸序列之HCDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：158、161或164之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含胺基酸序列EQX1 PX2 X3 GX4 GGX5 PX6 EAMDV之 HCDR3，其中X1 係D或S，X2 係E或S，X3 係Y、F、A或S；X4 係Y或F；X5 係F或Y，且X6 係Y或F；(d)包含選自SEQ ID NO：170、173或176之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：171、174或177之胺基酸序列之LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列之LCDR3。
在另一實施例中，本申請案揭示經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：157、160或163之胺基酸序列之HCDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：158、161或164之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含SEQ ID NO：159、315、367或419之胺基酸序列之HCDR3；(d)包含選自SEQ ID NO：170、173或176之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：171、174或177之胺基酸序列之LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列之LCDR3。
在另一實施例中，本申請案揭示經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：417之胺基酸序列之HCDR1； (b)包含選自SEQ ID NO：418之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含SEQ ID NO：419之胺基酸序列之HCDR3；(d)包含選自SEQ ID NO：430之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：431之胺基酸序列之LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：432之胺基酸序列之LCDR3。
在本申請案之一個實施例中，提供無岩藻糖基化抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：417之胺基酸序列之HCDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：418之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含SEQ ID NO：419之胺基酸序列之HCDR3；(d)包含選自SEQ ID NO：430之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NQ：431之胺基酸序列之LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：432之胺基酸序列之LCDR3。
在另一實施例中，本申請案提供無岩藻糖基化抗體或其抗原結合片段，其包含包含SEQ ID NO：426之胺基酸序列之可變重鏈區及包含SEQ ID NO：441之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一實施例中，本申請案揭示無岩藻糖基化抗體或抗原結合片段，其包含包含SEQ ID NO：428之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：441之胺基酸序列之輕鏈。
本申請案亦提供抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，其包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：10、62、114、166、218、270、322、374、426、478、530、556、582及634；及輕鏈可變區，其包含與 選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：23、75、127、179、231、283、335、387、439、491、543、569、595及647；其中該抗體特異性結合至人類CD32b蛋白。
本申請案進一步提供經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈，其包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：12、38、64、90、116、142、168、194、220、246、272、298、324、350、376、402、428、454、480、506、532、558、584、610、636及662；及輕鏈，其包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：25、51、77、103、129、155、181、207、233、259、285、311、337、363、389、415、441、467、493、519、545、571、597、623、649及675；其中該抗體特異性結合至人類CD32b蛋白。
本申請案提供，在一些上文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之實施例中，抗體經無岩藻糖基化。在其他實施例中，抗體之Fc部分經修飾以增強ADCC活性。
在本文所述之所有實施例中，經分離抗體或其抗原結合片段相對於人類CD32a選擇性結合人類CD32b。
在本申請案中揭示之一些實施例中，經分離抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群之IgG：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在其他實施例中，經分離抗體或抗原結合片段選自由以下組成之群：單株抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab及scFv。在其他實施例中，本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段係嵌合、人類化或完全人類抗體。
在一個實施例中，本申請案中揭示之抗體或其抗原結合片段抑制人 類CD32b與免疫球蛋白Fc結構域之結合。
在另一實施例中，本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段係免疫偶聯物之組份。
在本申請案之一些實施例中，多價抗體包含本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段中之任一者。在另一實施例中，多價抗體係雙特異性抗體。
本文亦揭示組合物，其包含本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段或多價抗體，與一或多種額外抗體之組合，該一或多種額外抗體結合在細胞上與CD32b共表現之細胞表面抗原。細胞表面抗原及CD32b可在B細胞上共表現。在一些實施例中，細胞表面抗原選自由以下組成之群：CD20、CD38、CD52、CS1/SLAMF7、CD56、CD138、KiR、CD19、CD40、Thy-1、Ly-6、CD49、Fas、Cd95、APO-1、EGFR、HER2、CXCR4、HLA分子、GM1、CD22、CD23、CD80、CD74或DRD。在一些實施例中，額外抗體選自由以下組成之群：利妥昔單抗、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、達雷木單抗(daratumumab)及阿倫單抗。
在另一實施例中，本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段或多價抗體或包含本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段或多價抗體之組合物可進一步包含額外治療性化合物。在一些實施例中額外治療性化合物係免疫調節劑。在一個實施例中，免疫調節劑係IL15。在另一實施例中，免疫調節劑係選自以下之共刺激分子之激動劑：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、 NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、CD83配體及STING。在另一實施例中，免疫調節劑係選自以下之標靶之抑制劑分子：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFR β及IDO。在另一實施例中，額外治療性化合物選自奧法木單抗、依魯替尼(ibrutinib)、貝林司他(belinostat)、羅米地辛(romidepsin)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、奧妥珠單抗、普拉曲沙(pralatrexate)、噴司他汀(pentostatin)、***(dexamethasone)、艾代拉裡斯(idelalisib)、阿西咗脒(ixazomib)、脂質體多柔比星(liposomal doxyrubicin)、泊馬竇邁(pomalidomide)、帕比司他(panobinostat)、埃羅妥珠單抗、達雷木單抗、阿倫單抗、沙利竇邁(thalidomide)及雷利竇邁(lenalidomide)。
本申請案亦提供醫藥組合物，其包含本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段、多價抗體、或包含該經分離抗體或其抗原結合片段或多價抗體之組合物及醫藥上可接受之載劑。
在另一實施例中，本申請案揭示經分離抗體或其抗原結合片段，其在CD32b之Fc結合結構域內特異性結合至CD32b。在一些實施例中，抗體結合在CD32b之胺基酸殘基107-123(VLRCHSWKDKPLVKVTF)內。在其他實施例中，抗體防止或減少CD32b結合至第二抗體之免疫球蛋白Fc結構域，該第二抗體結合至在B細胞上與CD32b共表現之腫瘤抗原。在一些實施例中，第二抗體結合至選自由以下組成之群之腫瘤抗原：CD20、CD38、CD52、CS1/SLAMF7、CD56、CD138、KiR、CD19、CD40、Thy-1、Ly-6、CD49、Fas、Cd95、APO-1、EGFR、HER2、CXCR4、 HLA分子、GM1、CD22、CD23、CD80、CD74或DRD。在特定實施例中，第二抗體結合至選自由以下組成之群之腫瘤抗原：CD20、CD38、CS1/SLAMF7及CD52。在其他實施例中，第二抗體選自由以下組成之群：利妥昔單抗、埃羅妥珠單抗、奧法木單抗、奧妥珠單抗、達雷木單抗及阿倫單抗。在一些實施例中，在CD32b之Fc結合結構域內特異性結合至CD32b之經分離抗體或抗原結合片段係如本文所揭示之抗體。
在另一實施例中，本申請案揭示經分離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合至CD32b且抑制或減少由結合至在B細胞上與CD32b共表現之腫瘤抗原之第二抗體介導之CD32b免疫受體酪胺酸基抑制基序(ITIM)信號傳導。B細胞可為正常B細胞或惡性B細胞。
在另一實施例中，本申請案揭示抑制或減少因投與結合至在B細胞上與CD32b共表現之腫瘤抗原之治療性抗體誘導之CD32b ITIM信號傳導之方法，其包含投與特異性結合至CD32b之Fc結合結構域之經分離抗體或其抗原結合片段。經分離抗體或其抗原結合片段不刺激ITIM信號傳導。在此方法之一些實施例中，治療性抗體結合至選自由以下組成之群之腫瘤抗原：CD20、CD38、CD52、CS1/SLAMF7、CD56、CD138、KiR、CD19、CD40、Thy-1、Ly-6、CD49、Fas、Cd95、APO-1、EGFR、HER2、CXCR4、HLA分子、GM1、CD22、CD23、CD80、CD74或DRD。在該方法之其他實施例中，治療性抗體選自由以下組成之群：利妥昔單抗、埃羅妥珠單抗、奧法木單抗、奧妥珠單抗、達雷木單抗及阿倫單抗。
本申請案亦提供治療有需要之個體之CD32b相關病況之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、多 價抗體、或包含該經分離抗體或其抗原結合片段或多價抗體之組合物。亦提供如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、多價抗體、或包含該經分離抗體或其抗原結合片段或多價抗體之組合物，其用於治療有需要之個體之CD32b相關病況。進一步提供如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、多價抗體、或包含該經分離抗體或其抗原結合片段或多價抗體之組合物之用途，其用於治療有需要之個體之CD32b相關病況，或用於製造用於治療有需要之個體之CD32b相關病況之藥劑。在一些實施例中，CD32b相關病況選自B細胞惡性病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、急性淋巴球性白血病、慢性淋巴球性白血病、小淋巴球性淋巴瘤、瀰漫性小裂細胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或全身性輕鏈類澱粉變性。
本申請案亦揭示治療抵抗使用結合至在細胞上與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體之治療或該治療難治之患者之方法，其包含共投與該抗體與本文所揭示之經分離抗CD32b抗體或其抗原結合片段或多價抗體中之任一者。本申請案亦揭示本文所揭示之經分離抗CD32b抗體或其抗原結合片段或多價抗體中之任一者之用途，其用於治療抵抗使用結合至在細胞上與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體之治療或該治療難治之患者，包含共投與該抗體與該等抗CD32b抗體或其抗原結合片段。本申請案進一步揭示本文所揭示之經分離抗CD32b抗體或其抗原結合片段或多價抗體，其用於治療抵抗使用結合至在細胞上與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體之治療或該治療難治之患者，包含共投與該抗體與該等抗CD32b抗體或其抗原結合片段。
本申請案亦提供編碼本文揭示之抗體或其抗原結合片段之核酸以及包含該核酸之載體，及包含該核酸或該載體之宿主細胞。亦提供產生本文揭示之抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含：培養表現編碼該抗體之核酸之宿主細胞；及自該培養收集該抗體。
本申請案亦提供編碼選擇性結合包含表1中所列示CDR之人類CD32b抗體之抗體或其抗原結合片段之經分離多核苷酸。
圖1繪示抗體NOV1216之電泳圖。哺乳動物表現之呈IgG之NOV1216之毛細管區帶電泳(CZE)分析揭露，抗體存在為三種主要種類：未經修飾、+80道爾頓及+160道爾頓。
圖2繪示藉由毛細管區帶電泳獲得之8種CD32b結合CDR-H3突變體抗體之電泳圖。
圖3係一系列圖表，其繪示一組CD32b結合抗體與表現CD32b或CD32a之CHO細胞之結合分析之結果，如藉由流式細胞術所量測。
圖4係一系列圖表，其繪示一組CD32b結合抗體與表現人類CD16及CD64之變體之CHO細胞之結合分析之結果，如藉由流式細胞術所量測。
圖5係一系列圖表，其繪示一組CD32b結合抗體與人類B細胞之結合分析之結果，如藉由流式細胞術所量測。
圖6係一系列圖表，其繪示一組CD32b結合抗體與BJAB細胞之結合分析之結果，如藉由流式細胞術所量測。
圖7a及圖7b繪示WT及突變體CD32b蛋白之一系列3D模型，該等蛋白質經設計以表徵CD32b結合抗體之結合表位。
圖8a-圖8c係一系列圖表，其繪示如藉由流式細胞術所量測，一組 CD32b結合抗體與表現經設計以表徵抗體之結合表位之WT及突變體CD32b蛋白之CHO細胞之結合特徵。
圖9係一系列圖表，其繪示一組CD32b結合抗體與多種細胞系之結合特徵，該等細胞系之特徵為多種CD32b表現、CD32a表現或無CD32b或CD32a表現。
圖10係一系列圖表，其繪示一組CDR-H3突變體CD32b結合抗體與細胞系之結合特徵，該等細胞系之特徵為多種CD32b表現、CD32a表現或無CD32b或CD32a表現。
圖11a及圖11b係一系列圖表，其繪示一組具有野生型Fc區(Fc WT)之CD32b結合抗體在原代NK細胞ADCC分析中之活性。
圖12係繪示一組Fc WT之CD32b結合抗體針對免疫受損小鼠中之已建立播散性外套細胞淋巴瘤Jeko1異種移植物之活體內抗腫瘤活性之圖表。
圖13係一系列圖表，其繪示Fc WT之CD32b結合抗體NOV1216針對免疫受損小鼠中之已建立Daudi異種移植物之劑量反應性活體內抗腫瘤活性。
圖14a-圖14d係一系列圖表，其繪示Fc WT、增強之ADCC(eADCC)Fc突變體、無岩藻糖基化或N297A Fc突變體CD32b結合抗體在以Daudi及Jeko1作為標靶細胞之原代NK細胞ADCC分析及CD16a活化報導基因分析中之活性。
圖15係一系列圖表，其繪示Fc WT、eADCC Fc突變體及N297A Fc突變體形式之CD32b結合抗體在以Jeko1作為標靶細胞之原代NK細胞ADCC分析中之活性。
圖16係一系列圖表，其繪示Fc WT、eADCC Fc突變體及N297A Fc突變體形式之CD32b結合抗體NOV1216在使用顯示多種CD32b表現之標靶細胞之CD16a報導基因分析中之活性。
圖17係一系列圖表，其繪示無岩藻糖基化CD32b結合CDR-H3突變體抗體在使用顯示多種CD32b表現之標靶細胞之CD16a報導基因分析中之活性。
圖18係一系列圖表，其繪示無岩藻糖基化CD32b結合CDR-H3突變體抗體在原代NK細胞ADCC分析中之活性。
圖19係繪示無岩藻糖基化CD32b結合CDR-H3突變體抗體在原代NK細胞ADCC分析中之活性之圖表。
圖20係一系列圖表，其繪示Fc WT、N297A及eADCC Fc突變體形式之CD32b結合抗體NOV1216針對已建立Daudi異種移植物之活體內抗腫瘤活性。
圖21係繪示無岩藻糖基化CDR-H3突變體CD32b結合抗體針對已建立Daudi異種移植物之活體內抗腫瘤活性之圖表。
圖22係一系列圖表，其繪示利妥昔單抗及奧妥珠單抗在與Fc沉默之CD32b結合抗體NOV1216 N297A組合時在CD16a活化分析中之活性。
圖23係繪示在與Fc沉默CD32b結合CDR-H3突變體抗體組合時在CD16活化分析中之利妥昔單抗活性之改良之圖表。
圖24係一系列圖表，其繪示與CD32b結合抗體NOV1216 eADCC Fc突變體組合之利妥昔單抗或奧妥珠單抗在載有已建立Daudi異種移植物之小鼠中之活體內抗腫瘤活性。
圖25係繪示在與Fc沉默之CD32b結合CDR-H3突變體NOV2108 N297A組合時在CD16a活化分析中之達雷本單抗活性之改良之圖表。
圖26係繪示與野生型純系10抗體相比，野生型及無岩藻糖基化NOV1216及CDR-H3突變體NOV2108介導人類巨噬細胞之Daudi標靶細胞殺死之能力之圖表。
圖27係一系列圖表，其繪示CD32b結合抗體2B6及NOV1216對原代人類B細胞中基底及交聯之抗IgM刺激之CD32b ITIM磷酸化之影響。
圖28係繪示無岩藻糖基化之CD32b結合抗體NOV1216在原代人類B細胞、Daudi細胞及Karpas422細胞中調節利妥昔單抗刺激之CD32b ITIM磷酸化之能力之圖表。
圖29係繪示如藉由流式細胞術所評價，CD32b在原發性患者多發性骨髓瘤樣品、血漿B細胞及兩種已確立細胞系上之表現之圖表。
圖30係繪示與野生型純系10抗體相比，Fc沉默、Fc野生型及無岩藻糖基化形式之抗體NOV2108介導人類NK細胞之Daudi標靶細胞殺死之能力之圖表。
圖31係一系列圖表，其繪示NOV1216及NOV2108與WT huCD32b及huCD32b突變體之結合。
圖32繪示如在氘交換實驗中所測定之人類CD32b構築體(aa1-175)(SEQ ID NO：682)之肽覆蓋圖譜以定位CD32b抗體NOV2108之推定結合位點。圖表上之每一條形代表其氘攝取經監測之肽。
圖33係繪示人類CD32b及Ab NOV2108 Fab複合物對胺基酸1至175之氘攝取差異之圖表。
圖34繪示在定位於人類CD32b晶體結構上之Ab NOV2108 Fab之結合後，人類CD32b上之氘交換保護位點。
圖35係繪示NOV2108在使用KARPAS422細胞之分析中之CDC活性之圖表。
圖36係一系列圖表，其繪示藉由流式細胞術進行之細胞表面CD32b表現分析。
圖37係繪示與作為標靶細胞之巨噬細胞相比，Daudi細胞對NOV2108Ab介導之NK細胞之ADCC之敏感性之圖表。
圖38係繪示在4小時期間由細胞示蹤綠(Cell tracker green)標記之巨噬細胞吞噬之細胞之量化之圖表。對每個時間框4個位置/孔之重複取平均值。
圖39a-圖39c係一系列圖表，其繪示在全血分析中Ab NOV2108(WT及無岩藻糖基化)對B細胞、單核球及顆粒球之效應。無岩藻糖基化NOV2108增強B細胞殺死且保持單核球及顆粒球之存活率。
圖40係繪示NOV2108介導之多發性骨髓瘤(MM)細胞系Karpas620由原代NK細胞溶解之圖表。
圖41係繪示PBMC之雷利竇邁(LEN)處理增強NOV1216之ADCC活性之圖表。在T細胞自PBMC耗竭時，該增強顯著減小。
圖42係繪示KMS-12-BM多發性骨髓瘤細胞系上之CD32b表現之FACS評價之圖表。
圖43係一系列圖表，其繪示在載有CD32b低KMS-12-BM MM皮下異種移植物之小鼠中與組合Fc增強之抗CD32b mAb及HDAC抑制劑帕比司他相關之活體內抗腫瘤活性。
圖44係繪示靜脈內投與載有皮下Daudi異種移植物之裸小鼠之無岩藻糖基化NOV2108之劑量依賴性抗腫瘤活性之圖表。
圖45係繪示無岩藻糖基化NOV2108在載有KARPAS620 MM細胞系之皮下異種移植物之裸小鼠中之抗腫瘤活性之圖表。
圖46係繪示靜脈內eADCC Fc突變體NOV2108投與對皮下植入裸小鼠中之Daudi異種移植物中之F4/80陽性之影響之圖表。
本發明提供特異性結合至人類CD32b蛋白之抗體及其抗原結合片段，及醫藥組合物、產生方法及該等抗體及組合物之使用方法。
定義
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所瞭解相同之意義。
如本文所用「CD32A」或「CD32a」意指人類CD32a蛋白，亦稱為人類FCγ受體2A或FCγR2A或FCGR2a或FCGR2A。存在兩種變體，稱為H131及R131(在無信號序列之情況下提及時)或H167及R167(在具有信號序列之情況下提及時)。H167變體之胺基酸序列保存為登錄號UniProtKB P12318且闡述如下： (SEQ ID NO：677)。
如本文所用「CD32B」或「CD32b」意指人類CD32b蛋白，亦稱為人類FCγ受體2B或FCγR2B或FCGR2b或FCGR2B。CD32b變體1之胺基酸序列保存為登錄號UniProtKB P31994-1且闡述如下： (SEQ ID NO：678)。
CD32b變體2之胺基酸序列保存為登錄號UniProtKB P31994-2且闡述如下： (SEQ ID NO：679)。
如本文所述，結合至CD32b之抗體或其抗原結合片段結合至人類CD32b蛋白。如本文所用「huCD32b」係指人類CD32b蛋白或其片段。
如本文所用術語「抗體」等包括完整抗體及其任一抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或單鏈。天然「抗體」係包含由二硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈之醣蛋白。每一重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個結構域：CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域CL。可將VH及VL區進一步細分成超變性之區(稱為互補決定區(CDR))，其中散佈有更保守區域(稱為框架區(FR))。各VH及VL由三個CDR及四個FR組成，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包含免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組份(C1q))之結合。
如本文所用術語抗體之「抗原結合片段」、「其抗原結合片段」、「抗原結合部分」及諸如此類係指完整抗體之一或多個保留特異性結合至給定抗原(例如，CD32b)之能力之片段。可藉由完整抗體之片段實施抗體之抗 原結合功能。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段之實例包括Fab片段，其係由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；F(ab)2 片段，其係包含兩個由鉸鏈區之二硫橋連接之Fab片段的二價片段；由VH及CH1結構域組成之Fd片段；由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；由VH結構域組成之單結構域抗體(dAb)片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)；及經分離互補決定區(CDR)。
另外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由人工肽連接體接合，該人工肽連接體使該兩個結構域能夠形成單一蛋白質鏈，其中VL及VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；例如，參見Bird等人，1988 Science 242：423-426；及Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。該等單鏈抗體包括抗體之一或多個「抗原結合片段」。該等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習用技術獲得，且該等片段經篩選以與完整抗體相同之方式使用。
亦可將抗原結合部分併入單一結構域抗體、大抗體、微小抗體、內抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及雙-scFv中(例如，參見Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136)。可將抗體之抗原結合部分移植至基於多肽(例如III型纖連蛋白(Fn3))之支架中(參見美國專利第6,703,199號，其闡述纖連蛋白多肽單價抗體)。
可將抗原結合部分併入單鏈分子中，該單鏈分子包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)，該等串聯Fv區段與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；及美國專利第5,641,870號)。
如本文所用術語「親和力」係指單一抗原性位點處抗體與抗原之間 之相互作用的強度。在每一抗原性位點內，抗體「臂」之可變區在多個位點經由弱非共價力與抗原相互作用；相互作用愈多，親和力愈強。
如本文所用術語「親抗原性(Avidity)」係指抗體-抗原複合物之總體穩定性或強度之資訊性量度。其係藉由三種主要因素來控制：抗體表位親和力；抗原及抗體二者之效價；及相互作用部分之結構配置。最終，該等因素界定抗體之特異性，亦即特定抗體結合至精確抗原表位之概度。
術語「胺基酸」係指天然及合成胺基酸以及以類似於天然胺基酸之方式發揮功能之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸係由遺傳密碼編碼之彼等以及稍後經修飾之彼等胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷絲胺酸。胺基酸類似物係指基本化學結構與天然胺基酸相同(即，α-碳結合至氫、羧基、胺基及R基團)之化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾R基團(例如，正白胺酸)或經修飾肽骨架，但保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指結構與胺基酸之一般化學結構不同但以類似於天然胺基酸之方式發揮功能之化學化合物。
如本文所用術語「結合特異性」係指個別抗體組合位點與一個抗原性決定子反應且不與不同抗原性決定子反應之能力。抗體之組合位點位於分子之Fab部分中且係自重鏈及輕鏈之超變區構築。抗體之結合親和性係單一抗原性決定子與抗體上之單一組合位點之間之反應的強度。其係在抗原性決定子與抗體組合位點之間運作之引力及斥力之總和。
兩個實體之間之特異性結合意指平衡常數(KA或KA )為至少1×107 M-1 、108 M-1 、109 M-1 、1010 M-1 、1011 M-1 、1012 M-1 、1013 M-1 或1014 M-1 之結合。片語「特異性(或選擇性)結合」至抗原(例如，CD32b結合抗 體)係指決定蛋白質及其他生物製品之異質性群體中同源抗原(例如，人類CD32b蛋白)之存在之結合反應。本發明之CD32b結合抗體以大於對非特異性抗原(例如，CD32a)之親和力結合至CD32b。片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。
術語「嵌合抗體」(或其抗原結合片段)係抗體分子(或其抗原結合片段)，其中(a)恆定區或其部分經改變、替代或交換，使得抗原結合位點(可變區)連接至類別、效應物功能及/或物種不同或經改變之恆定區，或賦予嵌合抗體新性質之完全不同之分子，例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區或其部分經改變、替代或交換，且可變區具有不同或經改變之抗原特異性。舉例而言，小鼠抗體可藉由用人類免疫球蛋白之恆定區替代其恆定區經修飾。由於用人類恆定區替代，嵌合抗體可保留其識別抗原之特異性，同時在人類中具有與原始小鼠抗體相比降低之抗原性。
術語「保守修飾變體」適用於胺基酸序列及核酸序列二者。關於特定核酸序列，保守修飾變體係指彼等編碼一致或基本上一致之胺基酸序列之核酸，或在該核酸不編碼胺基酸序列時係指基本上一致之序列。由於遺傳密碼之簡併性，大量功能相同之核酸編碼任一給定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在密碼子指定丙胺酸之每一位置，密碼子可在不改變所編碼多肽之情況下改變為所述任一相應密碼子。該等核酸變異為「沉默變異」，其係保守修飾變異中之一種。本文中編碼多肽之每一核酸序列亦闡述核酸之每一可能的沉默變異。熟習此項技術者將認識到，核酸中之每一密碼子(AUG除外，其通常為甲 硫胺酸之唯一密碼子，且TGG除外，其通常為色胺酸之唯一密碼子)可經修飾以產生功能相同之分子。因此，編碼多肽之核酸之每一沉默變異隱含在每一所述序列中。
對於多肽序列，「保守修飾變體」包括對多肽序列之個別取代、缺失或添加，其導致用化學類似之胺基酸取代胺基酸。提供功能相似胺基酸之保守取代表為業內所熟知。該等保守修飾變體不同於且不排除本發明之多態變體、種間同源物及等位基因。以下8個群含有互為保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)***酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(例如，參見Creighton,Proteins(1984))。在一個實施例中，術語「保守序列修飾」用於指不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體之結合特徵之胺基酸修飾。
如本文所用術語「阻斷」係指停止或防止相互作用或過程，例如停止配體依賴性或非配體依賴性信號傳導。
如本文所用術語「識別」係指抗體或其抗原結合片段發現其構象表位且與其相互作用(例如，結合)。
術語「交叉阻斷」、「經交叉阻斷」、「交叉阻斷性」、「競爭」、「交叉競爭」及相關術語在本文中可互換使用，意指在標準競爭性結合分析中抗體或其他結合劑干擾其他抗體或結合劑結合至CD32b之能力。
可使用標準競爭結合分析測定抗體或其他結合劑能干擾另一抗體或結合分子結合至CD32b之能力或程度，及因此確定是否可根據本發明稱其 交叉阻斷。一種適宜分析涉及使用Biacore技術(例如藉由使用BIAcore 3000儀器(Biacore,Uppsala,Sweden))，其可使用表面電漿共振技術量測相互作用程度。用於量測交叉阻斷之另一分析使用基於ELISA之方法。儘管預期該等技術可產生基本上相似之結果，但藉由Biacore技術量測被視為限定性。
術語「中和」意指抗體在結合至其標靶後降低標靶之活性、含量或穩定性；例如CD32b抗體在結合至CD32b後藉由至少部分降低CD32b之活性、含量或穩定性(例如其在嚙合抗體Fc部分中之作用)來中和CD32b。
術語「表位」意指能特異性結合至抗體之蛋白質決定簇。表位通常由分子之化學活性表面基團(例如胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。構象性及非構象性表位之區別在於，在變性溶劑存在下，與構象性表位之結合喪失，但與非構象性表位之結合不喪失。
術語「表位」包括能特異性結合至免疫球蛋白或以其他方式與分子相互作用之任一蛋白質決定簇。表位決定簇通常由分子之化學活性表面基團(例如，胺基酸或碳水化合物或糖側鏈)組成，且可具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。表位可為「線性」或「構象性」。
術語「線性表位」係指蛋白質與相互作用分子(例如抗體)之間之所有相互作用點皆沿蛋白質之一級胺基酸序列(連續)線性存在之表位。
如本文所用術語IgG抗體之「高親和力」係指抗體對標靶抗原(例如CD32b)之KD為10-8 M或更低、10-9 M或更低或10-10 M或10-11 M或更低。然而，對於其他抗體同型，「高親和力」結合可變。舉例而言，IgM同型之「高親和力」結合係指抗體之KD為10-7 M或更低，或10-8 M或更 低。
如本文所用術語「人類抗體」(或其抗原結合片段)意欲包括具有可變區之抗體(及其抗原結合片段)，在該等可變區中框架區及CDR區二者源自人類來源之序列。另外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦源自該等人類序列，例如人類種系序列或人類種系序列之突變形式。本發明之人類抗體或其抗原結合片段可包括並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機誘變或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。
如本文所用片語「單株抗體」或「單株抗體組合物」(或其抗原結合片段)係指具有實質上一致之胺基酸序列或源自相同遺傳來源之多肽，包括抗體、抗體片段雙特異性抗體等。此術語亦包括單一分子組合物之抗體分子製劑。單株抗體組合物顯示對特定表位之單一結合特異性及親和力。
術語「人類單株抗體」(或其抗原結合片段)係指具有可變區之顯示單一結合特異性之抗體(或其抗原結合片段)，在該等可變區中框架區及CDR區二者源自人類序列。在一個實施例中，人類單株抗體由雜交瘤產生，該雜交瘤包括自轉基因非人類動物(例如轉基因小鼠)獲得之B細胞，該B細胞具有與永生化細胞融合之包含人類重鏈轉基因及輕鏈轉基因之基因體。
如本文所用片語「重組人類抗體」(或其抗原結合片段)包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體(或其抗原結合片段)，例如自人類免疫球蛋白基因之轉基因或轉染色體動物(例如小鼠)或自其製備之雜交瘤分離之抗體；自經轉變以表現人類抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離之抗體；自重組之組合人類抗體庫分離之抗體；及藉由任何涉及將人類免疫球蛋白基因、序列之全部或一部分剪接至其他DNA序列之其他方 式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有其中框架區及CDR區源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區。在一個實施例中，該等重組人類抗體可經受活體外誘變(或者，在使用人類Ig序列之轉基因動物時，經受活體內體細胞誘變)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列係儘管源自人類種系VH及VL序列並與其相關，但可並非天然存在於活體內人類抗體種系譜內之序列。
如本文所用「人類化」抗體(或其抗原結合片段)係保留非人類抗體之反應性同時在人類中免疫原性較低之抗體(或其抗原結合片段)。此可藉由(例如)保留非人類CDR區並用其人類對應體(即恆定區以及可變區之框架部分)替代該抗體之其餘部分來達成。例如，參見Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855,1984；Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44：65-92,1988；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28：489-498,1991；及Padlan,Molec.Immun.,31：169-217,1994。人類工程化技術包括但不限於美國專利第5,766,886號中所揭示之Xoma技術。
術語「一致」或「一致性」百分比在兩個或更多個核酸或多肽序列之情況下係指兩個或更多個序列或子序列相同。若當在比較窗口或指定區域中比較且比對以獲得最大對應性時，如使用一種以下序列比較算法中之一者或藉由手動比對及目測觀察來量測，兩個序列具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(即在指定區中或在未指定時在整個序列中，60%一致性，視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)，則兩個序列「實質上一致」。視情況，在長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域中，或更佳在長度為100至500 或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多胺基酸)之區域中存在一致性。視情況，在長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域中，或更佳在長度為100至500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多胺基酸)之區域中存在一致性。
對於序列比較，通常一個序列用作參照序列，測試序列與其相比較。當使用序列比較算法時，將測試序列及參照序列輸入電腦中，若需要則指定子序列坐標，且指定序列算法程式參數。可使用默認程式參數或可指定替代參數。然後序列比較算法基於程式參數計算測試序列相對於參照序列之序列一致性百分比。
如本文所用「比較窗口」包括提及選自由以下組成之群之鄰接位置數中任一者之區段：20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150，其中可在兩個序列經最佳比對後比較序列與相同鄰接位置數之參照序列。比對序列以供比較之方法為業內所熟知。比較用序列之最佳比對可藉由例如以下方法來實施：Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源性算法、Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443,1970之同源性比對算法、Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444,1988之相似性搜索方法、該等算法之電腦化執行(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)或手動比對及目視檢查(例如，參見Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(ringbou編輯，2003))。
適於測定序列一致性百分比及序列相似性之算法之兩個實例係BLAST及BLAST 2.0算法，其分別闡述於以下文獻中：Altschul等人， Nuc.Acids Res.25：3389-3402,1977；及Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410,1990。用於實施BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此算法涉及首先藉由鑑別詢問序列中長度W之短字組來鑑別高評分序列對(HSP)，其在與資料庫序列中相同長度之字組比對時匹配或滿足某一正值臨限評分T。T稱作鄰近字組評分臨限值(Altschul等人，參見上文)。該等初始鄰近字組命中用作種子以供起始搜索來發現含有其之更長HSP。字組命中沿每一序列在兩個方向上延伸，只要累積比對評分可增加即可。對於核苷酸序列，累積評分係使用參數M(一對匹配殘基之獎勵評分；始終>0)及N(不匹配殘基之懲罰評分；始終<0)來計算。對於胺基酸序列，使用評分矩陣來計算累積評分。字組命中在每一方向上之延伸在以下情況下停止：累積比對評分自其所達成之最大值降低數量X；累積評分由於一或多個負評分殘基比對之累加而變為零或負值；或到達任一序列之終點。BLAST算法參數W、T及X決定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用字組長度(N)11、預期值(E)10、M=5、N=-4及兩個股之比較作為默認。對於胺基酸序列，BLASTN程式使用字組長度3及預期值(E)10及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915,1989)比對(B)50、預期值(E)10、M=5、N=-4及兩個股之比較作為默認。
BLAST算法亦實施兩個序列間之相似性之統計學分析(例如，參見Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787,1993)。BLAST算法所提供相似性之一個量度係最小和機率(P(N))，其指示兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配之機率。例如，若測試核酸與參照核 酸之比較中之最小和機率小於約0.2、更佳小於約0.01且最佳小於約0.001，則認為該核酸與該參照序列相似。
兩個胺基酸序列之間之一致性百分比亦可使用已併入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller之算法(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,1988)，使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來測定。另外，兩個胺基酸序列之間之一致性百分比可使用已併入GCG軟體包(可在www.gcg.com獲得)之GAP程式中之Needleman及Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453,1970)算法，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣、及空位權重16、14、12、10、8、6或4及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。
除上述序列一致性百分比以外，兩個核酸序列或多肽實質上一致之另一指示係，第一核酸編碼之多肽與針對第二核酸編碼之多肽產生之抗體在免疫上具有交叉反應性，如下文所述。因此，若多肽與第二多肽之區別僅為保守取代，則該兩個肽通常實質上一致。兩個核酸序列實質上一致之另一指示係，兩個分子或其補體在嚴格條件下相互雜交，如下文所述。兩個核酸序列實質上一致之另一指示係，可使用相同引子來擴增序列。
如本文所用術語「經分離抗體」(或其抗原結合片段)係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體之抗體(或其抗原結合片段)(例如特異性結合CD32b之經分離抗體實質上不含特異性結合非CD32b抗原之抗體)。另外，經分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學品。
術語「同型」係指依據重鏈恆定區基因提供之抗體類別(例如IgM、IgE、IgG，例如IgG1或IgG4)。同型亦包括該等類別中之一者之經修飾形式，其中已進行修飾以改變Fc功能，例如增強或降低效應物功能或與Fc 受體之結合。
如本文所用術語「Kassoc」、「Ka」或「Kon 」欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所用術語「Kdis」、「Kd」或「Koff 」欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。在一個實施例中，如本文所用術語「KD」欲指解離常數，其係自Kd對Ka之比率(即Kd/Ka)獲得且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可使用業內公認方法來測定。測定抗體KD之方法係藉由使用表面電漿共振，或使用生物感測器系統，例如Biacore®系統。倘若解離常數小於約10-9 M，則溶液平衡動力學排斥KD量測(MSD-SET)係測定抗體KD之較佳方法(例如，參見Friquet,B.、Chaffotte,A.F.、Djavadi-Ohaniance,L.及Goldberg,M.E.(1985).Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay.J Immnunol Meth 77,305-319；以引用方式併入本文中)。
如本文所用術語「IC50」係指抗體或其抗原結合片段之濃度，其在活體外或活體內分析中誘導抑制性反應，該抑制性反應係最大反應之50%，即最大反應與基線之間之中點。
如本文所用術語「單株抗體」(或其抗原結合片段)或「單株抗體(或其抗原結合片段)組合物」係指單一分子組合物之抗體分子(或其抗原結合片段)製劑。單株抗體組合物顯示對特定表位之單一結合特異性及親和力。
術語「效應物功能」係指抗體分子之活性，其係由經由除抗原結合結構域以外之抗體結構域之結合來介導，通常由效應物分子之結合來介導。效應物功能包括補體介導之效應物功能，其係由例如補體之C1組份 與抗體之結合來介導。補體之活化在調理作用及細胞病原體之溶解中很重要。補體之活化亦刺激發炎性反應且亦可參與自體免疫過敏性。效應物功能亦包括Fc受體(FcR)介導之效應物功能，其可在抗體恆定結構域結合至Fc受體(FcR)後觸發。抗體結合至細胞表面上之Fc受體觸發多種重要的不同生物反應，包括抗體塗佈顆粒之吞沒及破壞、免疫複合物之清除、殺手細胞對抗體塗佈標靶細胞之溶解(稱為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性或ADCC)、發炎介質之釋放、免疫球蛋白產生之胎盤轉移及控制。抗體之效應物功能可藉由改變(例如增強或降低)抗體對效應物分子(例如Fc受體或補體組份)之親和力來改變。結合親和性通常將藉由修飾效應物分子結合位點而變化，且在此情形中定位所關注位點並以適宜方式修飾該位點之至少一部分係適當的。亦設想，抗體上針對效應物分子之結合位點中之改變未必顯著改變總體結合親和性，但如在非產生性結合中，可改變使效應物機制無效之相互作用之幾何學。另外設想，效應物功能亦可藉由修飾並非直接參與效應物分子結合，而以其他方式參與效應物功能實現之位點來改變。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，且係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾骨架殘基或鍵聯之核酸，其係合成、天然及非天然核酸，其具有與參照核酸類似之結合性質，且其以與參照核苷酸類似之方式代謝。該等類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另有說明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾之變體 (例如，簡併密碼子取代)及互補序列，以及明確指示之序列。具體而言，如下文所詳述，簡併密碼子取代可藉由生成其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081,1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608,1985；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98,1994)。
術語「可操作連接」係指兩個或更多個多核苷酸(例如DNA)區段之間之功能性關係。通常，其係指轉錄調控序列與經轉錄序列之功能性關係。例如，若啟動子或增強子序列刺激或調節適當宿主細胞或其他表現系統中編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子序列可操作連接至該編碼序列。通常，可操作連接至經轉錄序列之啟動子轉錄調控序列與該經轉錄序列在物理上鄰接，即其順式作用。然而，一些轉錄調控序列(例如增強子)不需要在物理上鄰接其增強轉錄之編碼序列或緊鄰該編碼序列定位。
如本文所用術語「最佳化」意指，核苷酸序列已經改變以使用在產生細胞或生物體(通常真核細胞，例如，畢赤酵母菌屬(Pichia)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中較佳之密碼子編碼胺基酸序列。經最佳化核苷酸序列經工程化以完全或儘可能多地保留最初由起始核苷酸序列(其亦稱為「親代」序列)編碼之胺基酸序列。本文中之經最佳化序列已經工程化以具有在哺乳動物細胞中較佳之密碼子。然而，本文中亦設想該等序列在其他真核細胞或原核細胞中之最佳化表現。由經最佳化核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦稱為經最佳化。
術語「多肽」及「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基係相應天然 胺基酸之人工化學模擬物之胺基酸聚合物，以及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。除非另外指示，否則特定多肽序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變體。
如本文所用術語「重組人類抗體」(或其抗原結合片段)包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體(或其抗原結合片段)，例如自人類免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體之動物(例如小鼠)或自其製備之雜交瘤分離之抗體、自經轉變以表現人類抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離之抗體、自重組之組合人類抗體庫分離之抗體，及藉由任何涉及將人類免疫球蛋白基因、序列之全部或一部分剪接至其他DNA序列之其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有其中框架區及CDR區源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在一個實施例中，該等重組人類抗體可經受活體外誘變(或在使用人類Ig序列之轉基因動物時，經受活體內體細胞誘變)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列係儘管源自人類種系VH及VL序列並與其相關，但可並非天然存在於活體內人類抗體種系譜中之序列。
術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意指已將重組表現載體引入其中之細胞。應理解，該等術語不僅意欲指特定個體細胞，且亦指此一細胞之子代。由於突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，故該子代實際上可能與母細胞不同，但仍包括於如本文所用術語「宿主細胞」之範圍內。
術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，例如非人靈長類動物、綿羊、犬、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除非指明，否則術語「患者」或「個體」在本 文中可互換使用。
術語「治療(treat)」、「治療(treated)」、「治療(treating)」及「治療(treatment)」包括投與組合物或抗體以預防或延遲疾病之症狀、併發症或生物化學指標之發作、緩和症狀、或停止或抑制疾病、病況或病症之進一步發展。治療可為預防性(預防或延遲疾病之發作，或預防其臨床或亞臨床症狀之表現)或在疾病表現後治療性抑制或緩和症狀。治療可藉由本文所述之治療性量度來量測。本發明「治療」方法包括向個體投與CD32b抗體或其抗原結合片段以治癒纖維變性疾病或病況、降低其嚴重性或改善其一或多種症狀，以延長個體之健康或存活超過該治療不存在時所預期。舉例而言，「治療」包括緩和個體之疾病症狀至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。
術語「載體」欲指能運輸其已連接之另一多核苷酸之多核苷酸分子。一類載體為「質體」，其係指其他DNA區段可連接至其中之環形雙鏈DNA環。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA區段可連接至病毒基因體中。某些載體能在已引入其之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中後整合至該宿主細胞之基因體中，並藉此與宿主基因體一起複製。此外，某些載體能引導與其可操作連接之基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用，此乃因質體係載體之最常 用形式。然而，本發明意欲包括可提供等效功能之該等其他形式之表現載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
CD32b抗體及其抗原結合片段
本發明提供特異性結合至人類CD32b之抗體及其抗原結合片段。
在一個實施例中，本發明提供以高於人類CD32a蛋白之親和力結合人類CD32b蛋白之經分離抗體或其抗原結合片段。期望相對於CD32a對CD32b之選擇性以確保選擇性結合至CD32b陽性B細胞惡性病及B細胞，同時不結合至CD32a陽性免疫細胞(包括單核球及嗜中性球)。
本發明抗體包括(但不限於)如本文所述分離之人類及人類化單株抗體，包括實例。
該等抗人類CD32b抗體之實例係抗體NOV0281、NOV0308、NOV0563、NOV1216、NOV1218、NOV1219、NOV2106、NOV2107、NOV2108、NOV2109、NOV2110、NOV2111、NOV2112及NOV2113(包括具有野生型Fc區或含有Fc區中之N297A突變之抗體)，其序列列示於表1中。關於本文所述抗體之生成及表徵之其他詳情提供於實例中。
本發明提供特異性結合CD32b(例如，人類CD32b蛋白)之抗體，該等抗體包含表1中列示之VH結構域。本發明亦提供特異性結合至CD32b蛋白之抗體，該等抗體包含具有表1中列示之VH CDR中任一者胺基酸序列之VH CDR。具體而言，本發明提供特異性結合至CD32b蛋白之抗體，該等抗體包含(或者替代地，由其組成)1、2、3、4、5或更多個具有表1中列示之VH CDR中任一者胺基酸序列之VH CDR。
本發明亦提供特異性結合至CD32b之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含(或者替代地，由其組成)表1中列示之VH胺基酸序列，其中框架序列(例如，並非CDR之序列)中不超過約10個胺基酸已突變(其中如各個非限制性實例，突變係添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合至CD32b之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含(或者替代地，由其組成)表1中列示之VH胺基酸序列，其中框架序列(例如，並非CDR之序列)中不超過10個胺基酸已突變(其中如各個非限制性實例，突變係添加、取代或缺失)。
本發明亦提供特異性結合至CD32b之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含(或者替代地，由其組成)表1中列示之VH胺基酸序列，其中框架序列(例如，並非CDR之序列)中不超過約20個胺基酸已突變(其中如各個非限制性實例，突變係添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合至CD32b之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含(或者替代地，由其組成)表1中列示之VH胺基酸序列，其中框架序列(例如，並非CDR之序列)中不超過20個胺基酸已突變(其中如各個非限制性實例，突變係添加、取代或缺失)。
本發明提供特異性結合至CD32b蛋白之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含表1中列示之VL結構域。本發明亦提供特異性結合至CD32b蛋白之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含具有表1中列示之VL CDR中任一者胺基酸序列之VL CDR。具體而言，本發明提供特異性結合至CD32b蛋白之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含(或者替代地，由其組成)1、2、3或更多個具有表1中列示之VL CDR中任一者胺基酸序列之VL CDR。
本發明亦提供特異性結合至CD32b之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含(或者替代地，由其組成)表1中列示之VL胺基酸序列，其中框架序列(例如，並非CDR之序列)中不超過約10個胺基酸已突變(其中如各個非限制性實例，突變係添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合至CD32b之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含(或者替代地，由其組成)表1中列示之VL胺基酸序列，其中框架序列(例如，並非CDR之序列)中不超過10個胺基酸已突變(其中如各個非限制性實例，突變係添加、取代或缺失)。
本發明亦提供特異性結合至CD32b之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含(或者替代地，由其組成)表1中列示之VL胺基酸序列，其中框架序列(例如，並非CDR之序列)中不超過約20個胺基酸已突變(其中如各個非限制性實例，突變係添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合至CD32b之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含(或者替代地，由其組成)表1中列示之VL胺基酸序列，其中框架序列(例如，並非CDR之序列)中不超過20個胺基酸已突變(其中如各個非限制性實例，突變係添加、取代或缺失)。
本發明之其他抗體及其抗原結合片段包括已經突變，但在CDR區中仍與表1中所述序列中繪示之CDR區具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性百分比之胺基酸。在一態樣中，本發明之其他抗體及其抗原結合片段包括突變體胺基酸序列，其中與表1中所述序列中繪示之CDR區相比，CDR區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已突變。
本發明亦提供編碼特異性結合至CD32b蛋白之抗體及其抗原結合片 段之VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈之核酸序列。該等核酸序列可經最佳化以在哺乳動物細胞中表現(例如，表1顯示抗體NOV0281、NOV0308、NOV0563、NOV1216、NOV1218、NOV1219、NOV2106、NOV2107、NOV2108、NOV2109、NOV2110、NOV2111、NOV2112及NOV2113之重鏈(包括具有野生型Fc區或含有Fc區中之N297A突變之抗體之序列)及輕鏈之實例核酸序列)。
在本申請案正文通篇中，若說明書正文(例如，表1)與序列表之間不一致，應以說明書正文為准。
本發明之其他抗體及其抗原結合片段包括其中胺基酸或編碼胺基酸之核酸已經突變，但仍與表1中所述序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性百分比之彼等。在一個實施例中，其包括突變體胺基酸序列，其中與表1中所述序列中繪示之可變區相比，可變區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已經突變，同時保留實質上相同之治療性活性。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：1、2及3之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：14、15及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：4、5及6之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：17、18及19之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：7、8及9之HCDR1、HCDR2 及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：20、21及22之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：53、54及55之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：66、67及68之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：56、57及58之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：69、70及71之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：59、60及61之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：72、73及74之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：105、106及107之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：118、119、120之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：108、109及110之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：121、122、123之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段， 其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：111、112及113之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：124、125、126之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：157、158及159之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：170、171、172之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：160、161及162之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：173、174、175之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：163、164及165之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：176、177、178之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：209、210及211之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：222、223及224之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：212、213及214之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：225、226及227之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：215、216及217之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：228、229及230之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：261、262及263之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：274、275及276之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：264、265及266之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：277、278及279之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：267、268及269之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：280、281及282之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：313、314及315之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：326、327及328之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：316、317及318之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：329、330及331之LCDR1、 LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：319、320及321之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：332、333及334之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：365、366及367之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：378、379及380之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：368、369及370之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：381、382及383之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：371、372及373之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：384、385及386之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：417、418及419之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：430、431及432之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：420、421及422之HCDR1、 HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：433、434及435之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：423、424及425之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：436、437及438之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：469、470及471之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：482、483及484之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：472、473及474之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：485、486及487之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：475、476及477之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：488、489及490之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：521、522及523之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：534、535及536之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段， 其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：524、525及526之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：537、538及539之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：527、528及529之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：540、541及542之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：547、548及549之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：560、561及562之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：550、551及552之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：563、564及565之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：553、554及555之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：566、567及568之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：573、574及575之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：586、587及588之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：576、577及578之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：589、590及591之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：579、580及581之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：592、593及594之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：625、626及627之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：638、639及640之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：628、629及630之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：641、642及643之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含分別SEQ ID NO：631、632及633之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：644、645及646之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：10之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：23之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：62之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：75之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：114之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：127之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：166之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：179之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：218之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：231之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：270之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：283之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：322之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：335之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：374之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：387之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：426之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：439之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：478之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：491之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：530之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：543之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：556之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：569之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：582之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：595之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：634之VH胺基酸序列及SEQ ID NO：647之VL胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：12之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：25之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：38之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：51之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段， 其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：64之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：77之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：90之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：103之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：116之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：129之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：142之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：155之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：168之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：181之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：194之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：207之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：220之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：233之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：246之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：259之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：272之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：285之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：298之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：311之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：324之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：337之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：350之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：363之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：376之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：389之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：402之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：415之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：428之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：441之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：454之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：467之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：480之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：493之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：506之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：519之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：532之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：545之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：558之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：571之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：584之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：597之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：610之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：623之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：636之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：649之輕鏈胺基酸序列。
在另一具體實施例中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段， 其結合人類CD32b且包含SEQ ID NO：662之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：675之輕鏈胺基酸序列。
由於該等抗體可各自結合至CD32b，VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼該等胺基酸序列之核苷酸序列)可「經混合及匹配」以產生本發明之其他CD32b結合抗體及其抗原結合片段。該等「經混合及匹配」之CD32b結合抗體可使用業內已知之結合分析來測試(例如，ELISA，及實例部分中闡述之其他分析)。在該等鏈經混合及匹配時，來自特定VH/VL配對之VH序列應經結構類似之VH序列替代。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長重鏈序列應經結構類似之全長重鏈序列替代。同樣，來自特定VH/VL配對之VL序列應經結構類似之VL序列替代。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長輕鏈序列應經結構類似之全長輕鏈序列替代。
在另一態樣中，本發明提供CD32b結合抗體，其包含如表1中所述之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或其組合。CDR區係使用Kabat系統(Kabat等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242)或使用Chothia系統(Chothia等人，1987 J.Mol.Biol.196：901-917；及Al-Lazikani等人，1997 J.Mol.Biol.273：927-948)描繪。可替代地使用其他描繪CDR區之方法。舉例而言，Kabat及Chothia二者之CDR定義可組合，使得CDR可包含人類VH中之胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)及人類VL中之胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)之一些或全部。
慮及該等抗體可各自結合至CD32b且抗原結合特異性主要由CDR1、 2及3區提供，VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可經「混合及匹配」(即來自不同抗體之CDR可經混合及匹配，但每一抗體必須含有VH CDR1、2及3及VL CDR1、2及3以產生本發明之其他結合CD32b之結合分子。該等「經混合及匹配」之CD32b結合抗體可使用業內已知之結合分析及實例中闡述之彼等(例如，ELISA)來測試。在VH CDR序列經混合及匹配時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列替代。同樣，在VL CDR序列經混合及匹配時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列替代。熟習此項技術者將易知，新穎VH及VL序列可藉由用來自本文針對本發明單株抗體所示之CDR序列之結構上類似之序列使一或多個VH及/或VL CDR區序列突變來產生。
因此，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合區，其包含包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區CDR1：SEQ ID NO：1、4、7、53、56、59、105、108、111、157、160、163、209、212、215、261、264、267、313、316、319、365、368、371、417、420、423、469、472、475、521、524、527、547、550、553、573、576、579、625、628及631；包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：2、5、8、54、57、60、106、109、112、158、161、164、210、213、216、262、265、268、314、317、320、366、369、372、418、421；424、470、473、476、522、525、528、548、551、554、574、577、580、626、629及632；包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區CDR3：SEQ ID NO：3、6、9、55、58、61、107、110、113、159、162、165、211、214、217、263、266、269、 315、318、321、367、370、373、419、422、425、471、474、477、523、526、529、549、552、555、575、578、581、627、630及633；包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區CDR1：SEQ ID NO：14、17、20、66、69、72、118、121、124、170、173、176、222、225、228、274、277、280、326、329、332、378、381、384、430、433、436、482、485、488、534、537、540、560、563、566、586、589、592、638、641、644；包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：15、18、21、67、70、73、119、122、125、171、174、177、223、226、229、275、278、281、327、330、333、379、382、385、431、434、437、483、486、489、535、538、541、561、564、567、587、590、593、639、642及645；及包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區CDR3：SEQ ID NO：16、19、22、68、71、74、120、123、126、172、175、178、224、227、230、276、279、282、328、331、334、380、383、386、432、435、438、484、487、490、536、539、542、562、565、568、588、591、594、640、643及646；其中該抗體特異性結合CD32b。
本發明亦提供經分離單株抗體或其抗原結合區，其包含包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區：SEQ ID NO：10、62、114、166、218、270、322、374、426、478、530、556、582及634；及包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區：SEQ ID NO：23、75、127、179、231、283、335、387、439、491、543、569、595及647。
本發明亦提供經分離單株抗體或其抗原結合區，其包含包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈：SEQ ID NO：12、38、64、90、116、 142、168、194、220、246、272、298、324、350、376、402、428、454、480、506、532、558、584、610、636及662；及包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈：SEQ ID NO：25、51、77、103、129、155、181、207、233、259、285、311、337、363、389、415、441、467、493、519、545、571、597、623、649及675。
在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係闡述於表1中之抗體。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV0281。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV0281_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV0308。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV0308_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV0563。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV0563_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV1216。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV1216_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV1218。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV1218_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV1219。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV1219_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2106。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV02106_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2107。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2107_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2108。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係 NOV2108_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2109。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2109_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2110_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2111_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2112。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2112_N297A。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2113。在一個實施例中，特異性結合至CD32b之抗體係NOV2113_N297A。
在本文所揭示之CD32b結合抗體或其抗原結合片段之一些實施例中，抗體包含野生型(WT)Fc序列。在一些實施例中，抗體經無岩藻糖基化。在其他實施例中，抗體包含經修飾Fc區，其包含增強抗體之ADCC(eADCC)活性之突變。在其他實施例中，抗體包含經修飾Fc區，其包含使Fc區之ADCC活性沉默之突變(Fc沉默之突變體)。
在一個實施例中，CD32b結合抗體係無岩藻糖基化NOV2108，其包含WT Fc。在具體實施例中，CD32b結合抗體包含分別包含SEQ ID NO：417、418及419之胺基酸序列之HCDR1、HCDR2及HCDR3，及分別包含SEQ ID NO：430、431及432之胺基酸序列之LCDR1、LCDR2及LCDR3，且其中抗體經無岩藻糖基化。在另一具體實施例中，CD32b結合抗體包含包含SEQ ID NO：426之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：439之胺基酸序列之VL，且其中抗體經無岩藻糖基化。在另一實施例中，CD32b結合抗體包含包含SEQ ID NO：428之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：441之胺基酸序列之輕鏈，其中抗體經無岩藻糖基化。
如本文所用，若人類抗體之可變區或全長鏈係自使用人類種系免疫球蛋白基因之系統獲得，則該抗體包含係特定種系序列「之產物」或「源自」該序列之重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈。該等系統包括用所關注抗原對攜帶人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠進行免疫或用所關注抗原篩選噬菌體上顯示之人類免疫球蛋白基因庫。為人類種系免疫球蛋白序列「之產物」或「源自」其之人類抗體可由此藉由以下方式來鑑別：比較該人類抗體之胺基酸序列與人類種系免疫球蛋白之胺基酸序列並選擇序列與該人類抗體之序列最接近(即最大一致性%)之人類種系免疫球蛋白序列。為特定人類種系免疫球蛋白序列「之產物」或「源自」其之人類抗體可含有與該種系序列相比歸因於(例如)天然體細胞突變或有意引入之定點突變之胺基酸差異。然而，在VH或VL框架區中，所選人類抗體之胺基酸序列通常與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有與其他物種之種系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類種系序列)相比時將該人類抗體鑑別為人類之胺基酸殘基。在某些情形中，人類抗體之胺基酸序列可與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%或至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，重組體人類抗體將在VH或VL框架區中顯示與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列之不超過10個胺基酸差異。在某些情形中，人類抗體可顯示與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列之不超過5個，或甚至不超過4個、3個、2個或1個胺基酸差異。
同源抗體
在另一實施例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含與表1中所述序列同源之胺基酸序列，且該抗體結合至CD32b並保留表1中所述 彼等抗體之期望功能性質。
舉例而言，本發明提供經分離單株抗體(或其功能性抗原結合片段)，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：10、62、114、166、218、270、322、374、426、478、530、556、582及634；該輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：23、75、127、179、231、283、335、387、439、491、543、569、595及647；其中該抗體特異性結合至人類CD32b蛋白。
在一個實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可與表1中所述序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一個實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可除了不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸位置中之胺基酸取代以外一致。具有與表1中所述彼等抗體之VH及VL區具有高(即，80%或更高)一致性之VH及VL區之抗體可藉由分別編碼SEQ ID NO：10、62、114、166、218、270、322、374、426、478、530、556、582或634；及編碼23、75、127、179、231、283、335、387、439、491、543、569、595或647之核酸分子之誘變(例如，定點或PCR介導之誘變)獲得，之後使用本文所述功能分析測試所編碼經改變抗體之保留功能。
在一個實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈胺基酸序列可與表1中所述序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。具有分別與SEQ ID NO：12、38、64、90、116、142、168、194、220、246、272、298、324、350、376、402、428、454、480、506、 532、558、584、610、636及662中任一者之全長重鏈；及SEQ ID NO：25、51、77、103、129、155、181、207、233、259、285、311、337、363、389、415、441、467、493、519、545、571、597、623、649及675中任一者之全長輕鏈具有高(即，80%或更高)一致性之全長重鏈及全長輕鏈之抗體可藉由分別編碼該等多肽之核酸分子之誘變(例如，定點或PCR介導之誘變)獲得，之後使用本文所述功能分析測試所編碼經改變抗體之保留功能。
在一個實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈核苷酸序列可與表1中所述序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
在一個實施例中，重鏈及/或輕鏈核苷酸序列之可變區可與表1中所述序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
如本文所用，兩個序列之間之一致性百分比隨該等序列共享之一致位置數而變化(即，一致性%=一致位置數/位置總數×100)，其中慮及兩個序列之最佳比對需要引入之空位數及每一空位之長度。序列之比較及兩個序列之間之一致性百分比之測定可使用數學算法來完成，如下文非限制性實例中所述。
另外或替代地，本發明之蛋白質序列可進一步用作「詢問序列」針對公共資料庫進行搜索以(例如)鑑別相關序列。例如，該等搜索可使用Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.215：403-10之BLAST程式(2.0版)實施。
具有保守修飾之抗體
在一個實施例中，本發明抗體具有包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中一或 多個該等CDR序列具有基於本文所述抗體或其保守修飾之指定胺基酸序列，且其中該等抗體保留本發明之CD32b結合抗體及其抗原結合片段之期望功能性質。因此，本發明提供經分離單株抗體或其功能性抗原結合片段，其由包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區組成，其中：重鏈可變區CDR1包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：1、4、7、53、56、59、105、108、111、157、160、163、209、212、215、261、264、267、313、316、319、365、368、371、417、420、423、469、472、475、521、524、527、547、550、553、573、576、579、625、628及631，或其保守變體；重鏈可變區CDR2包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：2、5、8、54、57、60、106、109、112、158、161、164、210、213、216、262、265、268、314、317、320、366、369、372、418、421；424、470、473、476、522、525、528、548、551、554、574、577、580、626、629及632，或其保守變體；重鏈可變區CDR3包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：3、6、9、55、58、61、107、110、113、159、162、165、211、214、217、263、266、269、315、318、321、367、370、373、419、422、425、471、474、477、523、526、529、549、552、555、575、578、581、627、630及633，或其保守變體；輕鏈可變區CDR1包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：14、17、20、66、69、72、118、121、124、170、173、176、222、225、228、274、277、280、326、329、332、378、381、384、430、433、436、482、485、488、534、537、540、560、563、566、586、589、592、638、641、644，或其保守變體；輕 鏈可變區CDR2包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：15、18、21、67、70、73、119、122、125、171、174、177、223、226、229、275、278、281、327、330、333、379、382、385、431、434、437、483、486、489、535、538、541、561、564、567、587、590、593、639、642及645，或其保守變體；且輕鏈可變區CDR3包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：16、19、22、68、71、74、120、123、126、172、175、178、224、227、230、276、279、282、328、331、334、380、383、386、432、435、438、484、487、490、536、539、542、562、565、568、588、591、594、640、643及646，或其保守變體；其中抗體或其抗原結合片段特異性結合至CD32b且介導經抗體結合之CD32b陽性標靶細胞之巨噬細胞及NK細胞殺死二者。
在一個實施例中，經最佳化以在哺乳動物細胞中表現之本發明抗體具有重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該等序列中之一或多個具有基於本文中所述抗體或其保守修飾之指定胺基酸序列，且其中該等抗體保留本發明之CD32b結合抗體及其抗原結合片段之期望功能性質。因此，本發明提供經最佳化以在哺乳動物細胞中表現之經分離單株抗體，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區其中：重鏈可變區包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：10、62、114、166、218、270、322、374、426、478、530、556、582及6342及其保守修飾；且輕鏈可變區包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：23、75、127、179、231、283、335、387、439、491、543、569、595及647及其保守修飾；其中該抗體特異性結合至CD32b且介導經抗體結合之CD32b陽性標靶細胞之巨噬細胞及NK細胞殺死二者。
在一個實施例中，經最佳化以在哺乳動物細胞中表現之本發明抗體具有全長重鏈序列及全長輕鏈序列，其中該等序列中之一或多者具有基於本文中所述抗體或其保守修飾之指定胺基酸序列，且其中該等抗體保留本發明之CD32b結合抗體及其抗原結合片段之期望功能性質。因此，本發明提供經最佳化以在哺乳動物細胞中表現之經分離單株抗體，其包含全長重鏈及全長輕鏈，其中：全長重鏈包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：12、38、64、90、116、142、168、194、220、246、272、298、324、350、376、402、428、454、480、506、532、558、584、610、636及662及其保守修飾；且全長輕鏈包含選自以下中之任一者胺基酸序列：SEQ ID NO：25、51、77、103、129、155、181、207、233、259、285、311、337、363、389、415、441、467、493、519、545、571、597、623、649及675及其保守修飾；其中該抗體特異性結合至CD32b且介導經抗體結合之CD32b陽性標靶細胞之巨噬細胞及NK細胞殺死二者。
結合至相同表位之抗體
本發明提供結合至與表1中列示之CD32b結合抗體相同之表位之抗體。因此可在CD32b結合分析中基於其與本發明之其他抗體及其抗原結合片段交叉競爭(例如，以統計學顯著之方式競爭性抑制結合)之能力鑑別額外抗體。測試抗體抑制本發明抗體及其抗原結合片段與CD32b蛋白結合之能力顯示，測試抗體可與該抗體競爭結合至CD32b；根據非限制性理論，此一抗體可與其所競爭之抗體結合至CD32B上之相同或相關(例如，結構上類似或空間上靠近)表位。在某一實施例中，與本發明抗體及其抗原結合片段結合至CD32B上之相同表位之抗體係人類單株抗體。該等人類單 株抗體可如本文所述來製備並分離。
在測定抗原上之期望表位後，可能使用例如本發明中所述之技術生成針對該表位之抗體。或者，在該發現過程期間，抗體之生成及表徵可闡明關於可期望表位之資訊。則自此資訊可能競爭性篩選結合至相同表位之抗體。達成此之方法係實施交叉競爭研究以發現彼此競爭性結合之抗體，例如抗體競爭結合至抗原。基於其交叉競爭將抗體「分箱(binning)」之高通量方法闡述於國際專利申請案第WO 2003/48731號中。如熟習此項技術者將瞭解，實際上抗體可特異性結合至其之任何物質皆可係表位。表位可包含抗體結合之彼等殘基。
通常，對特定標靶抗原具有特異性之抗體將優先識別蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之標靶抗原上之表位。
給定多肽中包括表位之區域可使用業內熟知之任何數目之表位定位技術來鑑別。例如，參見Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編輯，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。舉例而言，線性表位可藉由例如以下方法來測定：在固體載體上同時合成大量肽，該等肽對應於蛋白質分子之各部分，且在該等肽仍附接至載體時使該等肽與抗體反應。該等技術為業內已知且闡述於例如以下文獻中：美國專利第4,708,871號；Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：3998-4002；Geysen等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：78-182；Geysen等人，(1986)Mol.Immunol.23：709-715。類似地，構象表位係藉由測定胺基酸CD32b之空間構象來鑑別，例如藉由例如氫/氘交換、x射線結晶學及二維核磁共振來測定。例如，參見上文之Epitope Mapping Protocols。蛋白質之抗原性區域亦可使 用標準抗原性及親水性曲線來鑑別，例如使用例如可自Oxford Molecular Group獲得之Omiga 1.0版軟體程式所計算之彼等。此電腦程式採用Hopp/Woods方法，Hopp等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：3824-3828測定抗原性譜；且採用Kyte-Doolittle技術，Kyte等人，(1982)J.MoI.Biol.157：105-132測定親水性曲線。
經工程化及修飾之抗體
本發明抗體可進一步使用具有本文所示VH及/或VL序列中之一或多者之抗體作為起始材料工程化經修飾抗體來製備，該經修飾抗體可具有自起始抗體改變之性質。抗體可藉由修飾一個或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區內及/或一或多個框架區內)之一或多個殘基來工程化。另外或替代地，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基來工程化，以(例如)改變該抗體之效應物功能。
一類可實施之可變區工程化係CDR移植。抗體主要經由位於6個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中之胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。出於此原因，在個別抗體之間，CDR內之胺基酸序列較CDR外側之序列差異更大。由於CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，故可能藉由構築包括來自移植至來自具有不同性質之不同抗體之框架序列上之特異性天然抗體之CDR序列之表現載體來表現模擬特異性天然抗體之性質之重組抗體(例如，參見Riechmann等人，1998 Nature 332：323-327；Jones,P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen,C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86：10029-10033；頒予Winter之美國專利第5,225,539號及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
該等框架序列可自包括種系抗體基因序列或重排抗體序列之公開DNA資料庫或公開參考文獻獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DNA序列可發現於「VBase」人類種系序列資料庫中(可在網際網路上獲得，www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及以下文獻中：Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部，NIH公開號91-3242；Tomlinson,I.M.，等人，1992 J.fol.Biol.227：776-798；及Cox,J.P.L.等人，1994 Eur.J Immunol.24：827-836；該等文獻各自之內容係以引用方式明確併入本文中。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因及重排抗體序列之種系DNA序列可發現於「IMGT」資料庫中(可在網際網路上獲得，www.imgt.org；參見Lefranc,M.P.等人，1999 Nucleic Acids Res.27：209-212；該等文獻各自之內容係以引用方式明確併入本文中。)
用於本發明抗體及其抗原結合片段中之框架序列之實例係結構上類似於所選本發明抗體及其抗原結合片段使用之框架序列(例如本發明單株抗體使用之共有序列及/或框架序列)之彼等框架序列。VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可移植至框架區上，該等框架區具有與在衍生框架序列之種系免疫球蛋白基因中所發現序列相同之序列，或CDR序列可移植至與種系序列相比含有一或多個突變之框架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，有益地使框架區內之殘基突變以維持或增強抗體之抗原結合能力(例如，參見頒予Queen之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
另一類可變區修飾係使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基突變，以由此改良所關注抗體之一或多種結合性質(例如親和 力)，稱為「親和力成熟」。可實施定點誘變或PCR介導之誘變以引入突變，且可在如本文所述且提供於實例中之活體外或活體內分析中評估對抗體結合或所關注之其他功能性質之效應。可引入保守修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。另外，通常，CDR區內不超過1、2、3、4或5個殘基經改變。
將抗原結合結構域移植至替代框架或支架中
可採用眾多種抗體/免疫球蛋白框架或支架，只要所得多肽包括至少一個特異性結合至CD32b之結合區即可。該等框架或支架包括人類免疫球蛋白、其抗原結合片段之5個主要個體遺傳型，且包括其他動物物種之免疫球蛋白，較佳具有人類化態樣。就此而言，單一重鏈抗體(例如駱駝科動物中所鑑別之彼等)特別值得關注。熟習此項技術者繼續發現並研發新穎框架、支架及片段。
在一態樣中，本發明係關於使用本發明CDR可移植至其上之非免疫球蛋白支架生成基於非免疫球蛋白之抗體之方法。可採用已知或未來的非免疫球蛋白框架及支架，只要其包含對標靶CD32b蛋白具有特異性之結合區即可。已知非免疫球蛋白框架或支架包括(但不限於)纖連蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,Mass.)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、結構域抗體(Domantis,Ltd.,Cambridge,Mass.，及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小型模組免疫醫藥劑(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,Wash.)、大抗體(Avidia,Inc.,Mountain View,Calif.)、蛋白質A(Affibody AG,Sweden)及人泛蛋白(affilin)(γ-晶體蛋白或泛蛋白)(SciI Proteins GmbH,Halle,Germany)。
纖連蛋白支架係基於纖連蛋白III型結構域(例如纖連蛋白III型之第十模組(10 Fn3結構域))。纖連蛋白III型結構域具有7個或8個分佈於兩個β褶疊之間之β股，該等β股自身彼此包裹以形成蛋白質之核心，且該結構域進一步含有將β股彼此連接並暴露於溶劑之環(類似於CDR)。在β褶疊夾心結構之每一邊緣存在至少三個此類環，其中該邊緣係蛋白質垂直於β股之方向之邊界(參見美國專利第6,818,418號)。該等基於纖連蛋白之支架並非免疫球蛋白，但整體摺疊與最小功能抗體片段(重鏈之可變區，其包含駱駝及駱馬IgG中之完整抗原識別單元)之摺疊緊密相關。由於此結構，非免疫球蛋白抗體模擬在性質及親和力方面與抗體之彼等類似之抗原結合性質。該等支架可用於活體外環隨機化及改組策略，該策略類似於抗體之活體內親和力成熟過程。該等基於纖連蛋白之分子可用作支架，其中該分子之環區可使用標準選殖技術經本發明之CDR替代。
錨蛋白技術係基於使用以錨蛋白衍生之重複模組作為支架之蛋白質攜帶可用於結合至不同標靶之可變區。錨蛋白重複模組係33個胺基酸之多肽，其由兩個反向平行之α-螺旋及β-轉折組成。可變區之結合主要藉由使用核糖體顯示來最佳化。
高親和性多聚體(avimer)源自含有天然A-結構域之蛋白質，例如LRP-1。該等結構域天然地用於蛋白質-蛋白質相互作用，且在人類中超過250種蛋白質在結構上基於A-結構域。高親和性多聚體係由多個經由胺基酸連接體連接之不同「A-結構域」單體(2-10)組成。可使用闡述於例如美國專利申請公開案第20040175756號、第20050053973號、第20050048512號及第20060008844號中之方法產生可結合至標靶抗原之高親和性多聚體。
親合體親和力配體係小型簡單蛋白質，其由基於蛋白質A之一個IgG結合結構域之支架之三螺旋束組成。蛋白質A係來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之表面蛋白質。此支架結構域由58個胺基酸組成，其中13個經隨機化以生成具有大量配體變體之親合體庫(例如，參見美國專利第5,831,012號)。親合體分子模擬抗體，與抗體之分子量(其係150kDa)相比，其具有6kDa之分子量。儘管其大小較小，但親合體分子之結合位點與抗體類似。
抗運載蛋白係由公司Pieris ProteoLab AG研發之產品。其源自脂質運載蛋白，即經常參與化學敏感或不溶性化合物之生理學運輸或儲存之小型穩健蛋白質之廣泛群組。若干天然脂質運載蛋白存在於人類組織或體液中。蛋白質架構類似於免疫球蛋白，在剛性框架頂部具有超變環。然而，與抗體或其重組片段相比，脂質運載蛋白係由具有160至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈組成，該單一多肽鏈僅略大於單一免疫球蛋白結構域。4個環之集合構成結合袋，顯示顯著結構塑性並容許存在多個側鏈。因此結合位點可於專門過程中重塑，從而以高親和力及特異性識別指定不同形狀之標靶分子。脂質運載蛋白家族之一種蛋白質、即歐洲粉蝶(Pieris Brassicae)之膽汁三烯結合蛋白(BBP)，已用於藉由誘變4個環之集合來研發抗運載蛋白。闡述抗運載蛋白之專利申請案之一個實例在PCT公開案第WO 199916873號中。
人泛蛋白分子係經設計用於針對蛋白質及小分子之特異性親和力之小型非免疫球蛋白蛋白質。可自兩個庫極快地選擇新人泛蛋白分子，每一庫係基於不同人類源支架蛋白質。人泛蛋白分子不顯示對免疫球蛋白蛋白質之任何結構同源性。當前採用兩種人泛蛋白支架，其中一者係γ結晶之 人類結構性眼晶狀體蛋白，且另一者係「泛蛋白」超家族蛋白質。兩種人類支架皆極小，顯示高溫度穩定性，且幾乎抵抗pH變化及變性劑。此高穩定性主要歸因於蛋白質之經擴展β褶疊結構。γ結晶衍生蛋白質之實例闡述於WO200104144中，且「泛蛋白樣」蛋白質之實例闡述於WO2004106368中。
蛋白質表位模擬物(PEM)係模擬蛋白質之β髮夾二級結構(參與蛋白質-蛋白質相互作用之主要二級結構)之中等大小的環狀肽樣分子(MW 1-2kDa)。
人類CD32b結合抗體可使用業內已知方法來生成。舉例而言，humaneering技術用於將非人類抗體轉化為工程化人類抗體。美國專利公開案第20050008625號闡述在抗體中用人類可變區替代非人類抗體可變區同時相對於非人類抗體維持相同結合特徵或提供更佳結合特徵之活體內方法。該方法依賴於表位引導之用完全人類抗體替代非人類參照抗體可變區。所得人類抗體通常在結構上與參照非人類抗體無關，但結合至與參照抗體相同之抗原上之相同表位。簡言之，連續表位引導之互補替代方法係藉由在對測試抗體結合至抗原反應之報導基因系統存在下，在細胞中在「競爭者」與參照抗體之不同雜合體之庫(「測試抗體」)之間設定競爭結合至有限量之抗原來實施。競爭者可為參照抗體或其衍生物，例如單鏈Fv片段。競爭者亦可為抗原之天然或人工配體，其結合至與參照抗體相同之表位。競爭者之唯一要求係其結合至與參照抗體相同之表位，且其與參照抗體競爭結合抗原。測試抗體具有一個與非人類參照抗體共同之抗原結合V區，且另一V區隨機選自不同來源，例如全套人類抗體庫。與參照抗體之共同V區用作引導，將測試抗體定位於抗原上之相同表位上及相同取向 上，使得選擇偏向與參照抗體之最高抗原結合保真度。
可使用多種類型之報導基因系統檢測測試抗體與抗原之間之期望相互作用。舉例而言，互補報導基因片段可分別連接至抗原及測試抗體，使得報導基因藉由片段互補活化僅在測試抗體結合至抗原時發生。在測試抗體-報導基因及抗原-報導基因片段融合與競爭者共表現時，報導基因活化變得依賴於測試抗體與競爭者競爭之能力，該能力與測試抗體對抗原之親和力成比例。其他可用報導基因系統包括如美國專利申請案第10/208,730號(公開號20030198971)中所揭示之自抑制報導基因再活化系統(RAIR)之再活化劑，或美國專利申請案第10/076,845號(公開號20030157579)中所揭示之競爭性活化系統。
使用連續表位引導之互補替代系統，進行選擇以鑑別表現單一測試抗體以及競爭者、抗原及報導基因組份之細胞。在該等細胞中，每一測試抗體一對一地與競爭者競爭結合至有限量之抗原。報導基因之活性與結合至測試抗體之抗原之量成比例，該抗原之量繼而與測試抗體對該抗原之親和力及測試抗體之穩定性成比例。首先相對於參照抗體表現為測試抗體時之活性，基於測試抗體之活性選擇測試抗體。第一輪選擇之結果係一組「雜合體」抗體，其各自包括來自參照抗體之相同非人類V區及來自庫之人類V區，且其各自結合至抗原上與參照抗體相同之表位。在第一輪中選擇之一或多種雜合體抗體將具有與參照抗體相當或高於參照抗體之對抗原之親和力。
在第二V區替代步驟中，使用在第一步驟中選擇之人類V區作為引導來選擇同源人類V區之不同庫對剩餘非人類參照抗體V區之人類替代。在第一輪中選擇之雜合體抗體亦可用作第二輪選擇之競爭者。第二輪選擇之 結果係一組完全人類抗體，其結構上與參照抗體不同，但其與參照抗體競爭結合至相同抗原。一些所選人類抗體結合至與參照抗體相同之抗原上之相同表位。在該等所選人類抗體中，一或多者以與參照抗體相當或高於參照抗體之親和力結合至相同表位。
另外，人類CD32b結合抗體亦可以商業方式自常規生產人類抗體之公司獲得，例如KaloBios,Inc.(Mountain View,Calif.)。
駱駝科動物抗體
已關於大小、結構複雜性及對人類個體之抗原性表徵自駱駝及單峰駝(雙峰駱駝(Camelus bactrianus)及單峰駱駝(Calelus dromaderius))家族成員(包括新世界成員，例如駝馬物種(羊駝(Lama paccos)、大羊駝(Lama glama)及瘦駝(Lama vicugna)))獲得之抗體蛋白質。來自如在自然界中發現之此家族哺乳動物之某些IgG抗體缺乏輕鏈，且因此在結構上與來自其他動物之抗體之具有兩個重鏈及兩個輕鏈之典型四鏈四級結構不同。參見PCT/EP93/02214(WO 94/04678，1994年3月3日公開)。
駱駝科動物抗體中係經鑑別為VHH之小型單一可變結構域之區域可藉由遺傳工程化以產生對標靶具有高親和力之小型蛋白質，從而產生低分子量抗體衍生之蛋白質(稱為「駱駝科動物奈米抗體」)來獲得。參見1998年6月2日授權之美國專利第5,759,808號；亦參見Stijlemans,B.等人，2004 J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin,M.等人，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger,M.等人，2003 Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo,V.等人，2002 Int J Cancer 89：456-62；及Lauwereys,M.等人，1998 EMBO J 17：3512-3520。駱駝科動物抗體及抗體片段之工程化庫購自例如Ablynx,Ghent,Belgium。如同非人類來源 之其他抗體及其抗原結合片段一般，駱駝科動物抗體之胺基酸序列可經重組改變以獲得與人類序列更相似之序列，即奈米抗體可經「人類化」。因此，可進一步降低駱駝科動物抗體對人類之天然低抗原性。
駱駝科動物奈米抗體之分子量為人類IgG分子之約十分之一，且該蛋白質之物理直徑僅為幾奈米。較小大小之一個後果係駱駝科動物奈米抗體能結合至在功能上對較大抗體蛋白質不可見之抗原位點，即駱駝科動物奈米抗體可用作檢測使用經典免疫技術時原本隱藏之抗原之試劑，且可用作可能的治療劑。因此，較小大小之另一後果係駱駝科動物奈米抗體可因結合至標靶蛋白質之溝或窄縫中之特定位點而起抑制作用，且因此可發揮較經典抗體與經典低分子量藥物之功能更相似之能力。
低分子量及緊湊大小進一步導致駱駝科動物奈米抗體具有極高熱穩定性，對極端pH及對蛋白水解消化穩定，且抗原性較低。另一後果係，駱駝科動物奈米抗體易於自循環系統移動至組織中，且甚至跨越血腦障壁且可治療影響神經組織之病症。奈米抗體可進一步促進跨越血腦障壁之藥物運輸。參見2004年8月19日公開之美國專利申請案20040161738。該等特徵與對人類之低抗原性組合指示顯著治療性潛力。此外，該等分子可在原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))中充分表現且表現為與噬菌體之融合蛋白且具有功能。
因此，本發明之特徵係對CD32b具有高親和力之駱駝科動物抗體或奈米抗體。在本文之一個實施例中，駱駝科動物抗體或奈米抗體係在駱駝科動物中天然產生，即由駱駝科動物在使用本文中針對其他抗體所述之技術經CD32b或其肽片段免疫後產生。或者，CD32b結合駱駝科動物奈米抗體經工程化，即藉由使用如本文實例中所述以CD32b作為標靶之淘選程序 自例如顯示經適當誘變之駱駝科動物奈米抗體蛋白質之噬菌體之庫選擇來產生。工程化奈米抗體可藉由遺傳工程化進一步經客製化以在接受個體中具有45分鐘至2週之半衰期。在具體實施例中，駱駝科動物抗體或奈米抗體係藉由將本發明人類抗體之重鏈或輕鏈之CDR序列移植至奈米抗體或單一結構域抗體框架序列中來獲得，如例如PCT/EP93/02214中所述。
雙特異性分子及多價抗體
在另一態樣中，本發明之特徵為包含本發明CD32b結合抗體或其片段之雙特異性或多特異性分子。本發明抗體或其抗原結合區可衍生或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配體)，以生成結合至至少兩個不同結合位點或標靶分子之雙特異性分子。事實上，本發明抗體可衍生或連接至一個以上其他功能分子，以生成結合至兩個以上不同結合位點及/或標靶分子之多特異性分子；該等多特異性分子亦意欲涵蓋於如本文所用術語「雙特異性分子」中。為產生本發明之雙特異性分子，本發明抗體可功能連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以其他方式)至一或多個其他結合分子(例如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物)，使得產生雙特異性分子。
因此，本發明包括雙特異性分子，其包含至少一種針對CD32b之第一結合特異性及針對第二標靶表位之第二結合特異性。例如，第二標靶表位係CD32b之不同於第一標靶表位之另一表位。
另外，對於其中雙特異性分子為多特異性之本發明，該分子除第一及第二標靶表位以外可進一步包括第三結合特異性。
在一個實施例中，本發明之雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段作為結合特異性，包括(例如)Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或單鏈 Fv。該抗體亦可係輕鏈或重鏈二聚體或其任一最小片段，例如Fv或單鏈構築體，如Ladner等人，美國專利第4,946,778號中所述。
雙價抗體係二價雙特異性分子，其中VH及VL結構域在單一多肽鏈上表現，藉由過短而不容許在同一鏈上之兩個結構域之間配對之連接體連接。VH及VL結構域與另一鏈之互補結構域配對，由此產生兩個抗原結合位點(例如，參見Holliger等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人，1994 Structure 2：1121-1123)。雙價抗體可藉由在同一細胞內表現兩個多肽鏈來產生，該等多肽鏈具有結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL構形)或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH構形)中之任一者。其大部分可以可溶形式於細菌中表現。單鏈雙價抗體(scDb)係藉由用約15個胺基酸殘基之連接體連接兩個形成雙價抗體之多肽鏈來產生(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36)。scDb可以可溶活性單體形式在細菌中表現(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(34)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36；Pluckthun及Pack,1997 Immunotechnology,3(2)：83-105；Ridgway等人，1996 Protein Eng.,9(7)：617-21)。雙價抗體可與Fc融合以生成「二-雙價抗體(di-diabody)」(參見Lu等人，2004 J.Biol.Chem.,279(4)：2856-65)。
可用於本發明之雙特異性分子之其他抗體係鼠類、嵌合及人類化單株抗體。
本發明之雙特異性分子可藉由使用業內已知方法偶聯組成型結合特異性來製備。例如，雙特異性分子之每一結合特異性可分開生成且然後彼 此偶聯。在結合特異性為蛋白質或肽時，可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價偶聯。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、S-乙醯基-硫代乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SATA)、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰-伸苯基二馬來醯亞胺(oPDM)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)及4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-SMCC)(例如，參見Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,M A等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.No.78-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83及Glennie等人，1987 J.Immunol.139：2367-2375中所述之彼等。偶聯劑係SATA及磺基-SMCC，二者均可自Pierce Chemical Co.(Rockford,Ill.)獲得。
在結合特異性係抗體時，其可藉由兩個重鏈之C端鉸鏈區之硫氫基鍵結來偶聯。在特定實施例中，在偶聯之前，鉸鏈區經修飾以含有奇數個硫氫基(例如，1個)。
或者，兩種結合特異性可在同一載體中編碼，並在同一宿主細胞中表現及組裝。若雙特異性分子係mAb X mAb、mAb X Fab、Fab X F(ab')2或配體X Fab融合蛋白，則此方法尤其有用。本發明之雙特異性分子可係包含一個單鏈抗體及結合決定簇之單鏈分子，或包含兩個結合決定簇之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法闡述於例如美國專利第5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號中。
雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由(例如)酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(REA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點(Western Blot)分析來確認。每一該等分析通常藉由採用對所關注複合物具有特異性之經標記試劑(例如抗體)檢測尤其關注之蛋白質-抗體複合物之存在。
在另一態樣中，本發明提供多價化合物，其包含本發明結合至CD32b之抗體及其抗原結合片段之至少兩個相同或不同抗原結合部分。抗原結合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價鍵聯連接在一起。或者，已闡述用於雙特異性分子之連接方法。四價化合物可藉由(例如)使本發明抗體及其抗原結合片段與結合至本發明抗體及其抗原結合片段之恆定區(例如Fc或鉸鏈區)之抗體或抗原結合片段交聯來獲得。
三聚化結構域闡述於(例如)Borean專利EP 1 012 280B1中。五聚化模組闡述於(例如)PCT/EP97/05897中。
具有延長半衰期之抗體
本發明提供具有延長活體內半衰期之特異性結合至CD32b之抗體。
多種因素可影響蛋白質之活體內半衰期。例如，腎過濾、肝中之代謝、蛋白水解酶(蛋白酶)之降解及免疫原性反應(例如抗體之蛋白質中和及巨噬細胞及樹突細胞之攝取)。可使用多種策略延長本發明抗體及其抗原結合片段之半衰期。例如，藉由化學鍵聯至聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗體支架、聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合配體及碳水化合物遮罩；藉由遺傳融合至結合至血清蛋白之蛋白質，例如白蛋白、IgG、FcRn及運鐵蛋白；藉由偶合(遺傳方式或化學方式)至結合至血清蛋白之其他結合部分，例如奈米抗體、Fab、DARPin、高親和性多聚 體、親合體及抗運載蛋白；藉由遺傳融合至rPEG、白蛋白、白蛋白結構域、白蛋白結合蛋白及Fc；或藉由併入奈米載體、緩釋調配物或醫療裝置中。
為延長活體內抗體之血清循環，可將惰性聚合物分子(例如高分子量PEG)經由PEG與抗體N端或C端之位點特異性偶聯或經由存於離胺酸殘基上之ε-胺基使用或不使用多官能基連接體附接至抗體或其片段。為將抗體聚乙二醇化，通常使抗體、其抗原結合片段與聚乙二醇(PEG)(例如PEG之反應性酯或醛衍生物)在其中一或多個PEG基團變得附接至抗體或抗體片段之條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來實施。如本文所用術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之PEG之任一形式，例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在一個實施例中，欲聚乙二醇化之抗體係無醣基化抗體。將使用產生最低生物活性損失之直鏈或具支鏈聚合物衍生。偶聯程度可藉由SDS-PAGE及質譜密切監測以確保PEG分子與抗體適當偶聯。可藉由粒徑篩析或藉由離子交換層析將未反應PEG自抗體-PEG偶聯物分離。可使用熟習此項技術者熟知之方法、例如藉由本文所述免疫分析測試PEG衍生抗體之結合活性以及活體內效能。蛋白質之聚乙二醇化方法為業內已知，且可應用於本發明之抗體及其抗原結合片段。例如，參見Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
其他經修改聚乙二醇化技術包括重構化學正交定向工程化技術(ReCODE PEG)，其將化學上指定之側鏈經由包括tRNA合成酶及tRNA之重構系統併入生物合成蛋白質中。此技術使得能將多於30個新胺基酸併入 大腸桿菌、酵母及哺乳動物細胞中之生物合成蛋白質中。tRNA將標準胺基酸併入定位琥珀密碼子之任一位置，將琥珀自終止密碼子轉化為發出併入化學指定胺基酸之信號之密碼子。
亦可使用重組體聚乙二醇化技術(rPEG)延長血清半衰期。此技術涉及將300-600個胺基酸之未結構化蛋白質尾遺傳融合至現有醫藥蛋白質中。由於此一未結構化蛋白質鏈之視分子量較實際分子量高約15倍，故該蛋白質之血清半衰期顯著延長。與需要化學偶聯及再純化之傳統聚乙二醇化相比，該製程顯著簡化且產物係均一的。
聚唾液酸化係另一種技術，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)延長治療性肽及蛋白質有效壽命並改良治療性肽及蛋白質之穩定性。PSA係唾液酸(一種糖)之聚合物。在用於蛋白質及治療性肽藥物遞送時，聚唾液酸提供對偶聯之保護性微環境。此延長治療性蛋白質在循環中之有效壽命且防止其被免疫系統識別。PSA聚合物天然發現於人體中。某些進化數百萬年之細菌攝取該聚合物並用其覆蓋其壁。則該等天然聚唾液酸化細菌能由於分子相似性而擾亂身體防禦系統。PSA係自然界之最終隱密技術，其可自該等細菌容易地大量產生且具有預定物理特徵。即使偶合至蛋白質，細菌PSA亦完全無免疫原性，此乃因其在化學上與人體內之PSA相同。
另一種技術包括使用連接至抗體之羥乙基澱粉(「HES」)衍生物。HES係衍生自蠟質玉蜀黍澱粉之經修飾天然聚合物且可由體內之酶代謝。通常投與HES溶液以取代缺少的血液體積並改良血液之流變性質。抗體之羥乙基澱粉化使得能藉由增強分子之穩定性以及藉由降低腎清除來延長循環半衰期，從而提高生物活性。藉由改變不同參數(例如HES分子量)，可客製化眾多種HES抗體偶聯物。
具有延長活體內半衰期之抗體亦可藉由將一或多個胺基酸修飾(即，取代、***或缺失)引入IgG恆定結構域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈Fc結構域片段)中來生成。例如，參見國際公開案第WO 98/23289號；國際公開案第WO 97/34631號；及美國專利第6,277,375號。
此外，抗體可偶聯至白蛋白以使抗體或抗體片段在活體內更穩定或具有更長活體內半衰期。該等技術為業內所熟知，例如，參見國際公開案第WO 93/15199號、第WO 93/15200號及第WO 01/77137號；及歐洲專利第EP 413,622號。
延長半衰期之策略尤其可用於期望延長活體內半衰期之奈米抗體、基於纖連蛋白之結合劑及其他抗體或蛋白質。
抗體偶聯物
本發明提供特異性結合至CD32b之抗體或其抗原結合片段，其重組融合或化學偶聯(包括共價偶聯及非共價偶聯二者)至異源蛋白質或多肽(或其抗原結合片段，較佳融合或偶聯至至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個胺基酸之多肽)之以生成融合蛋白。具體而言，本發明提供包含本文所述抗體之抗原結合片段(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2 片段、VH結構域、VH CDR、VL結構域或VL CDR)及異源蛋白質、多肽或肽之融合蛋白。將蛋白質、多肽或肽融合或偶聯至抗體或抗體片段之方法為業內已知。例如，參見美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號及第5,112,946號；歐洲專利第EP 307,434號及第EP 367,166號；國際公開案第WO 96/04388號及第WO 91/06570號；Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539； Zheng等人，1995,J.Immunol.154：5590-5600；及Vil等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341。
其他融合蛋白可經由基因改組、基序改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)之技術生成。DNA改組可用於改變本發明抗體及其抗原結合片段之活性(例如，具有較高親和力及較低解離速率之抗體及其抗原結合片段)。一般參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，1997,Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，1999,J.Mol.Biol.287：265-76；及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques 24(2)：308-313(該等專利及出版物各自係全文以引用方式併入本文中)。抗體及其抗原結合片段或所編碼抗體及其抗原結合片段可在重組前藉由經受藉由易錯PCR、隨機核苷酸***或其他方法進行之隨機誘變來改變。編碼特異性結合至CD32b之抗體或其抗原結合片段之多核苷酸可與一或多種異源分子之一或多種組份、基序、節段、部分、結構域、片段等重組。
此外，抗體及其抗原結合片段可融合至標記物序列(例如肽)以促進純化。在一個實施例中，標記物胺基酸序列尤其係六組胺酸肽，例如pQE載體(QIAGEN,Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供之標籤，其中多者市面有售。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如，六組胺酸提供融合蛋白之便捷純化。可用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)血球凝集素(「HA」)標籤，其對應於衍生自流行性感冒血球凝集素蛋白之表位(Wilson等人，1984,Cell 37：767)；及「旗(flag)」標籤。
在一個實施例中，本發明之CD32b結合抗體及其抗原結合片段可偶聯至診斷劑或可檢測劑。該等抗體可用於監測或預測疾病或病症之發作、發展、進展及/或嚴重性作為臨床測試程序(例如測定特定療法之效力)之一部分。該診斷及檢測可藉由將抗體偶合至可檢測物質來完成，該可檢測物質包括(但不限於)各種酶，例如(但不限於)辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，例如(但不限於)鏈黴抗生物素蛋白/生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光材料，例如(但不限於)傘形酮、螢光黃、異硫氰酸螢光黃、玫瑰紅、二氯三嗪基胺螢光黃、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，例如(但不限於)發光胺；生物發光材料，例如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素；放射性材料，例如(但不限於)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In及111In)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149 Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；及使用各種正電子發射斷層攝影之正電子發射金屬及非放射性順磁性金屬離子。
本發明進一步涵蓋偶聯至治療性部分之抗體及其抗原結合片段之用途。抗體或其抗原結合片段可偶聯至治療性部分，例如細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α-發射體)。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害之任一藥劑。
此外，抗體或其抗原結合片段可偶聯至修改給定生物反應之治療性部分或藥物部分。不認為治療性部分或藥物部分受限於古典化學治療劑。 例如，藥物部分可係具有期望生物活性之蛋白質、肽或多肽。該等蛋白質可包括(例如)毒素，例如相思子素、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌屬外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，例如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、細胞凋亡劑、抗血管生成劑；或生物反應調節劑，例如淋巴介質。
此外，抗體可偶聯至治療性部分，例如放射性金屬離子，例如α-發射體，例如213Bi；或可用於將放射性金屬離子(包括但不限於131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)偶聯至多肽之大環螯合劑。在一個實施例中，大環螯合劑可經由連接體分子附接至抗體之係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)。該等連接體分子一般為業內已知且闡述於以下文獻中：Denardo等人，1998,Clin Cancer Res4(10)：2483-90；Peterson等人，1999,Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；及Zimmerman等人，1999,Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，其各自係全文以引用方式併入。
將治療性部分偶聯至抗體之技術眾所周知，例如，參見Amon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編輯)，第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編輯)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」，Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編輯)，第475-506頁(1985)；「Analysis, Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編輯)，第303-16頁(Academic Press 1985)；及Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62：119-58。
抗體亦可附接至固體載體，該等載體尤其可用於標靶抗原之免疫分析或純化。該等固體載體包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸(nylon)、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
產生本發明抗體之方法
編碼抗體之核酸
本發明提供實質上經純化之核酸分子，其編碼多肽包含上文所述CD32b結合抗體鏈之區段或結構域。本發明之一些核酸包含編碼SEQ ID NO：10、62、114、166、218、270、322、374、426、478、530、556、582或634之任一者中所示重鏈可變區之核苷酸序列及/或編碼SEQ ID NO：23、75、127、179、231、283、335、387、439、491、543、569、595或647之任一者中所示輕鏈可變區之核苷酸序列。在具體實施例中，核酸分子係表1中所鑑別之彼等。本發明之一些其他核酸分子包含與表1中所鑑別之彼等之核苷酸序列實質上一致(例如，至少65%、80%、95%或99%)之核苷酸序列。在自適當表現載體表現時，該等多核苷酸編碼之多肽能展現CD32b抗原結合能力。
本發明亦提供編碼來自表1中所述CD32b結合抗體之重鏈或輕鏈之至少一個CDR區且通常所有三個CDR區之多核苷酸。一些其他多核苷酸編碼表1中所述CD32b結合抗體之重鏈及/或輕鏈之所有或實質上所有可變區 序列。由於密碼之簡併性，多個核酸序列將編碼免疫球蛋白胺基酸序列中之每一者。
本發明之核酸分子可編碼抗體之可變區及恆定區二者。本發明之一些核酸序列包含編碼與SEQ ID NO：12、38、64、90、116、142、168、194、220、246、272、298、324、350、376、402、428、454、480、506、532、558、584、610、636或662中之任一者中所述之成熟重鏈可變區序列一致或實質上一致(例如，至少80%、90%或99%)之成熟重鏈可變區序列之核苷酸。本發明之一些核酸序列包含編碼與SEQ ID NO：25、51、77、103、129、155、181、207、233、259、285、311、337、363、389、415、441、467、493、519、545、571、597、623、649及675中之任一者所述之成熟輕鏈可變區序列一致或實質上一致(例如，至少80%、90%或99%)之成熟輕鏈可變區序列之核苷酸。
多核苷酸序列可藉由重新固相DNA合成或藉由編碼CD32b結合抗體或其結合片段之現有序列(例如下文實例中所述之序列)之PCR誘變來產生。核酸之直接化學合成可藉由業內已知方法來完成，例如Narang等人，1979,Meth.Enzymol.68：90之磷酸三酯方法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯方法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之二乙基亞磷醯胺方法；及美國專利第4,458,066號之固體載體方法。藉由PCR將突變引入多核苷酸序列可如例如以下文獻中所述來實施：PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編輯)，Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編輯)，Academic Press,San Diego,Calif.,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。
本發明亦提供用於產生上文所述CD32b結合抗體之表現載體及宿主細胞。可採用多種表現載體來表現編碼CD32b結合抗體鏈或結合片段之多核苷酸。可使用基於病毒之表現載體及非病毒表現載體二者在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包括質體、通常具有用於表現蛋白質或RNA之表現盒之游離型載體及人類人工染色體(例如，參見Harrington等人，Nat Genet.15：345,1997)。例如，可用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現CD32b結合多核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,Calif.)、MPSV載體及多種業內已知用於表現其他蛋白質之其他載體。可用病毒載體包括基於反轉錄病毒之載體、基於腺病毒之載體、基於腺相關病毒之載體、基於皰疹病毒之載體、基於SV40之載體、基於乳頭狀瘤病毒之載體、基於HBP艾伯斯坦-巴爾病毒(HBP Epstein Barr virus)之載體、牛痘病毒載體及基於塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus(SFV))之載體。參見Brent等人(參見上文)；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇取決於其中欲表現該載體之既定宿主細胞。通常，表現載體含有啟動子及可操作連接至編碼CD32b結合抗體鏈抗原結合片段之多核苷酸之其他調控序列(例如增強子)。在一個實施例中，採用可誘導啟動子以防止表現***序列(在誘導條件下除外)。可誘導啟動子包括(例如)***糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子。經轉變生物體之培養物可在非誘導條件下擴展，且不使該群體偏向編碼其表現產物由宿 主細胞更佳耐受之序列。除啟動子外，有效表現CD32b結合抗體鏈抗原結合片段亦可能需要或期望其他調控元件。該等元件通常包括ATG起始密碼子及相鄰核糖體結合位點或其他序列。另外，表現效率可藉由將適當增強子引入所用細胞系統來提高(例如，參見Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。例如，可使用SV40增強子或CMV增強子來增加在哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信號序列位置以形成與所***CD32b結合抗體序列編碼之多肽之融合蛋白。更通常地，所***CD32b結合抗體序列係在引入載體中之前連接至信號序列。欲用於接收編碼CD32b結合抗體輕鏈及重鏈可變結構域之序列之載體有時亦編碼其恆定區或部分。該等載體容許表現作為與恆定區之融合蛋白之可變區，由此導致產生完整抗體及其抗原結合片段。通常，該等恆定區係人類恆定區。
包含並表現CD32b結合抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核。大腸桿菌係一種可用於選殖並表現本發明多核苷酸之原核宿主。其他適用微生物宿主包括桿菌(例如枯草桿菌(Bacillus subtilis))及其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)(例如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia))及各種假單胞菌屬(Pseudomonas species)。在該等原核宿主中，亦可製造通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)之表現載體。另外，將存在任何數目之各種熟知啟動子，例如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子通常視情況與操縱子序列一起控制表現，且具有核糖體結合位點序列及諸如此類，用以起始並完成轉錄及轉譯。亦可採用其他微 生物(例如酵母)表現本發明之CD32b結合多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。
在一個實施例中，使用哺乳動物宿主細胞表現並產生本發明之CD32b結合多肽。舉例而言，其可係表現內源免疫球蛋白基因之雜交瘤細胞系或包含外源表現載體之哺乳動物細胞系。該等細胞系包括任何正常短命細胞或正常或異常永生動物或人類細胞。例如，已研發多種能分泌完整免疫球蛋白之適宜宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、經轉變B細胞及雜交瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物表現多肽通常論述於(例如)Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。用於哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列(例如複製起點、啟動子及增強子)(例如，參見Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68，1986)及必要處理資訊位點(例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點及轉錄終止子序列)。該等表現載體通常含有源自哺乳動物基因或源自哺乳動物病毒之啟動子。適宜啟動子可為組成型、細胞類型特異性、階段特異性及/或可調節或可調控的。可用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、***(dexamethasone)誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP poIIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素(tetracycline)誘導型CMV啟動子(例如入類立即早期CMV啟動子)、組成型CMV啟動子及業內已知之啟動子-增強子組合。
用於引入含有所關注多核苷酸序列之表現載體之方法端視細胞宿主之類型而變。例如，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。(一般參見Sambrook等人，參見上文)。其他方法 包括(例如)電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉變、注射及顯微注射、彈道學方法、病毒體、免疫脂質體、多陽離子：核酸偶聯物、裸DNA、人工病毒顆粒、與皰疹病毒結構蛋白VP22之融合物(Elliot及O’Hare,Cell 88：223,1997)、DNA之試劑增強攝取及離體轉導。對於重組蛋白之長期高產率產生，通常將期望穩定表現。舉例而言，穩定表現CD32b結合抗體鏈或結合片段之細胞系可使用含有病毒複製起點或內源表現元件及可選標記物基因之本發明表現載體來製備。在引入載體後，可容許細胞在滋養培養基中生長1-2天，然後將其切換至選擇性培養基。可選標記物之目的係賦予對選擇之抗性，且其存在容許順利表現所引入序列之細胞在選擇性培養基中生長。穩定轉染之抗性細胞可使用對該細胞類型適當之組織培養技術來增殖。
本發明單株抗體之生成
單株抗體(mAb)可藉由多種技術產生，包括習用單株抗體方法，例如，Kohler及Milstein,(1975)Nature 256：495之標準體細胞雜交技術。可採用多種產生單株抗體之技術，例如，B淋巴球之病毒或致癌轉變。
用於製備雜交瘤之動物系統係鼠類系統。小鼠中之雜交瘤產生係已確立程序。用於分離融合用經免疫脾細胞之免疫方案及技術為業內已知。亦已知融合伴侶(例如，鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。
在某一實施例中，本發明抗體係人類化單株抗體。本發明之嵌合或人類化抗體及其抗原結合片段可基於如上文所述製備之鼠類單株抗體之序列來製備。編碼免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之DNA可自所關注之鼠類雜交瘤獲得並使用標準分子生物學技術工程化以含有非鼠類(例如，人類)免疫球蛋白序列。例如，為產生嵌合抗體，可使用業內已知方法將鼠類可變區 連接至人類恆定區(例如，參見Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，可使用業內已知方法將鼠類CDR區***人類框架中。例如，參見Winter之美國專利第5,225,539號及Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6180370號。
在某一實施例中，本發明抗體係人類單株抗體。該等針對CD32b之人類單株抗體可使用攜帶人類免疫系統之部分而非小鼠系統之轉基因或轉染色體小鼠來生成。該等轉基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」之小鼠。
HuMAb Mouse®(Medarex,Inc.)含有編碼未重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微小基因座，以及使內源μ及κ鏈基因座不活化之標靶突變(例如，參見Lonberg等人，1994 Nature 368(6474)：856-859)。因此，該等小鼠展現減少之小鼠IgM或K之表現，且因應免疫，所引入人類重鏈及輕鏈轉基因經歷類別轉換及體細胞突變，以生成高親和力人類IgG-κ單株抗體(Lonberg,N.等人，1994，參見上文；綜述於Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93；以及Harding,F.及Lonberg,N.,1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中)。HuMAb小鼠之製備及應用及該等小鼠攜帶之基因體修飾進一步闡述於以下參考文獻中：Taylor,L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人，1993International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，1993 Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，1994 J.Immunol.152：2912- 2920；Taylor,L.等人，1994 International Immunology 579-591；及Fishwild,D.等人，1996 Nature Biotechnology 14：845-851，所有該等文獻之內容係全文以引用方式明確併入本文中。進一步參見皆頒予Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號；Surani等人之美國專利第5,545,807號；皆頒予Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92103918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97113852號、第WO 98/24884及第WO 99/45962號；及頒予Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在另一實施例中，本發明人類抗體可使用在轉基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠(例如攜帶人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)來產生。該等小鼠在本文中稱為「KM小鼠」，詳細闡述於頒予Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉基因動物系統可在業內獲得，且可用於產生本發明之CD32b結合抗體及其抗原結合片段。例如，可使用稱為Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代性轉基因系統。該等小鼠闡述於(例如)頒予Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號；第6,075,181號；第6,114,598號；第6,150,584號及第6,162,963號中。
此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統可在業內獲得，且可用於產生本發明之CD32b結合抗體。例如，可使用攜帶人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體二者之小鼠(稱為「TC小鼠」)；該等小鼠闡述於Tomizuka等人，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727 中。此外，業內已闡述攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20：889-894)，且可用於產生本發明之CD32b結合抗體。
本發明之人類單株抗體亦可使用用於篩選人類免疫球蛋白基因之庫之噬菌體顯示方法來製備。用於分離人類抗體之該等噬菌體顯示方法在業內已確立或闡述於下文實例中。例如，參見：頒予Ladner等人之美國專利第5,223,409號；第5,403,484號；及第5,571,698號；頒予Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；頒予McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及頒予Griffiths等人之美國專利第5,885,793號；第6,521,404號；第6,544,731號；第6,555,313號；第6,582,915號及第6,593,081號。
本發明之人類單株抗體亦可使用SCID小鼠來製備，已在該等SCID小鼠中重構人類免疫細胞，使得可在免疫後生成人類抗體反應。該等小鼠闡述於(例如)頒予Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
框架或Fc工程化
本發明之經工程化抗體及其抗原結合片段包括其中已對VH及/或VL內之框架殘基進行修飾以(例如)改良抗體性質之彼等。通常，進行該等框架修飾以降低抗體之免疫原性。例如，一種方法係使一或多個框架殘基「回復突變」至相應種系序列。更具體而言，已經歷體細胞突變之抗體可含有與衍生該抗體之種系序列不同之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生該抗體之種系序列來鑑別。為使框架區序列返回至其種系構形，可藉由(例如)定點誘變使體細胞突變「回復突變」至種系序列。該 等「經回復突變」抗體亦意欲涵蓋於本發明內。
另一類型之框架修飾涉及使框架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以去除T細胞表位，從而由此降低該抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫化」，且更詳細地闡述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
除了在框架區或CDR區內進行之修飾以外或替代地，本發明抗體可經工程化以包括Fc區內之修飾，以通常改變抗體之一或多種功能性質，例如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明抗體可經化學修飾(例如可將一或多個化學部分附接至抗體)或經修飾以改變其醣基化，以再次改變該抗體之一或多個功能性質。該等實施例各自更詳細地闡述於下文中。Fc區中之殘基係根據Kabat之EU索引編號。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾，使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數改變，例如增加或減少。此方法進一步闡述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變，以(例如)促進輕鏈及重鏈之組裝或提高或降低該抗體之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短該抗體之生物學半衰期。更具體而言，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區中，使得抗體相對於天然Fc-鉸鏈結構域葡萄球菌蛋白A(SpA)結合具有受損之SpA結合。此方法更詳細地闡述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中，該抗體經修飾以延長其生物學半衰期。各種方法皆可。例如，可引入一或多個以下突變：T252L、T254S、T256F，如頒 予Ward之美國專利第6,277,375號中所述。或者，為延長生物學半衰期，該抗體可於CH1或CL區內經改變，以含有取自IgG之Fc區之CH2結構域之兩個環之補救受體結合表位，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。
在一個實施例中，Fc區係藉由用不同胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來改變，以改變該抗體之效應物功能。例如，一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基替代，使得該抗體具有經改變之對效應物配體之親和力，但保留親代抗體之抗原結合能力。對其之親和力經改變之效應物配體可係(例如)Fc受體或補體之C1組份。此方法更詳細地闡述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號二者中。
在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基之胺基酸可經不同胺基酸殘基替代，使得該抗體具有經改變之C1q結合及/或經降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法更詳細地闡述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變以由此改變該抗體固定補體之能力。此方法進一步闡述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在又一實施例中，Fc區經修飾以增強該抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或以藉由修飾一或多個胺基酸增強該抗體對Fc-γ受體之親和力。此方法進一步闡述於例如Presta之PCT公開案WO 00/42072及Lazar等人，2006 PNAS 103(110)：4005-4010中。此外，已定位Fc-γ RI、Fc-γ RII、Fc-γ RIII及FcRn在人類IgG1上之結合位點且已闡述具有改良結合之變體(參見Shields,R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591- 6604)。
在又一實施例中，抗體之醣基化經修飾。舉例而言，可製備無醣基化抗體(亦即抗體未醣基化)。可改變醣基化以(例如)增強抗體對「抗原」之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來完成。例如，可進行一或多個胺基酸取代，其導致消除一或多個可變區框架醣基化位點，由此消除該位點之醣基化。該醣基化可增強抗體對抗原之親和力。此一方法更詳細地闡述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
另外或或者，可製造具有經改變醣基化類型之抗體，例如具有減少量之岩藻糖基殘基之低岩藻糖基化或無岩藻糖基化抗體，或具有增加之二等分型GlcNac結構之抗體。已顯示該等經改變醣基化模式增強抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)在具有經改變醣基化機構之宿主細胞中表現抗體來完成。具有經改變醣基化機構之細胞已闡述於業內文獻中且可用作其中表現本發明之重組抗體以由此產生具有經改變醣基化之抗體之宿主細胞。例如，Hang等人之EP 1,176,195闡述具有功能破壞之編碼岩藻糖基轉移酶之FUT8基因之細胞系，使得在此一細胞系中表現之抗體展現低岩藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835闡述變體CHO細胞系LecI3細胞，其將岩藻糖附接至Asn(297)-連接之碳水化合物之能力下降，亦導致在該宿主細胞中表現之抗體之低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342闡述如下細胞系：其經工程化以表現糖蛋白修飾之醣基轉移酶(例如β(1,4)--N乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))，使得在該經工程化細胞系中表現之抗體展現增加之二等分型GlcNac結 構，此導致該等抗體之ADCC活性增強(亦參見Umana等人，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。Von Horsten等人在2010 Glycobiology 20(12)：1607-18中亦闡述藉由在CHO細胞中共表現抗體與異源GDP-6-去氧-D-來蘇-4-己酮糖還原酶產生非岩藻糖基化抗體之方法。
工程化經改變抗體之方法
如上文所論述，具有本文所示VH及VL序列或全長重鏈及輕鏈序列之CD32b結合抗體可用於藉由修飾附接至其之全長重鏈及/或輕鏈序列、VH及/或VL序列或恆定區來產生新穎CD32b結合抗體。因此，在本發明之另一態樣中，本發明CD32b結合抗體之結構特徵用於產生保留本發明抗體及其抗原結合片段之至少一種功能性質(例如結合至人類CD32b亦及抑制CD32b之一或多種功能性質)之結構相關之CD32b結合抗體。
例如，本發明抗體及其抗原結合片段之一或多個CDR區或其突變可與已知框架區及/或其他CDR重組組合，以產生如上文所論述之其他經重組工程化之本發明CD32b結合抗體及其抗原結合片段。其他類型之修飾包括先前部分中所述之彼等。工程化方法之起始材料係本文中所提供VH及/或VL序列中之一或多者或其一或多個CDR區。為產生經工程化抗體，實際上無需製備(即表現為蛋白質)具有本文中所提供之VH及/或VL序列中之一或多者或其一或多個CDR區之抗體。而係使用序列中所含資訊作為起始材料來產生源自原始序列之「第二代」序列，且然後製備「第二代」序列並表現為蛋白質。
經改變抗體序列亦可藉由篩選具有固定CDR3序列或如US20050255552中所述之最小必需結合決定簇以及CDR1及CDR2序列之多樣性之抗體庫來製備。該篩選可根據任何適於自抗體庫篩選抗體之篩選 技術(例如噬菌體顯示技術)來實施。
可使用標準分子生物學技術來製備並表現經改變抗體序列。經改變抗體序列編碼之抗體係保留本文所述CD32b結合抗體之一種、一些或所有功能性質者，該等功能性質包括(但不限於)特異性結合至人類CD32b蛋白及/或抑制CD32b之一或多種功能性質。
經改變抗體之功能性質可使用業內可獲得及/或本文中所述之標準分析(例如實例中所述之彼等，例如ELISA)來評價。
在工程化本發明抗體及其抗原結合片段之方法之一個實施例中，可沿CD32b結合抗體編碼序列之全部或一部分隨機或選擇性引入突變，且可針對結合活性及/或如本文所述之其他功能性質篩選所得經修飾CD32b結合抗體。業內已闡述突變方法。例如，Short之PCT公開案WO 02/092780闡述使用飽和誘變、合成連接組裝或其組合產生並篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679闡述使用計算篩選方法最佳化抗體之生理化學性質之方法。
本發明抗體之表徵
本發明抗體及其抗原結合片段可藉由多種功能分析來表徵。舉例而言，其可依據其抑制CD32b之能力經表徵。
抗體結合至CD32b之能力可藉由直接標記目標抗體來檢測，或抗體可未經標記並使用業內已知之多種夾心式分析格式間接進行結合檢測。
在一個實施例中，本發明之CD32b結合抗體及其抗原結合片段阻斷參照CD32b結合抗體與CD32b多肽之結合或與該參照CD32b結合抗體競爭結合至該CD32b多肽。該等抗體可係上文所述完全人類或人類化CD32b結合抗體。其亦可係結合至與參照抗體相同之表位之其他人類、小鼠、嵌合 或人類化CD32b結合抗體。阻斷參照抗體結合或與該參照抗體競爭結合之能力指示，所測試CD32b結合抗體結合至與參照抗體所界定相同或類似之表位，或結合至與參照CD32b結合抗體所結合表位足夠接近之表位。該等抗體尤其可能共享針對參照抗體鑑別之有利性質。阻斷參照抗體或與其競爭之能力可藉由例如競爭結合分析來測定。使用競爭結合分析檢查所測試抗體抑制參照抗體與共同抗原(例如CD32b多肽)特異性結合之能力。若過量測試抗體顯著抑制參照抗體之結合，則測試抗體與參照抗體競爭特異性結合至抗原。顯著抑制意指，測試抗體通常將參照抗體之特異性結合降低至少10%、25%、50%、75%或90%。
已知多種競爭結合分析可用於評價抗體與參照抗體對結合至特定蛋白質(在此情形中，CD32b)之競爭。該等分析包括(例如)固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心式競爭分析(參見Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242-253,1983)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人，J.Immunol.137：3614-3619,1986)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心式分析(參見Harlow及Lane，參見上文)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel等人，Molec.Immunol.25：7-15,1988)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176：546-552,1990)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77-82,1990)。通常，此一分析涉及使用結合至固體表面或細胞之純化抗原，該固體表面或細胞載有未經標記之測試CD32b結合抗體及經標記參照抗體中之任一者。競爭性抑制係藉由測定在測試抗體存在下結合至固體表面或細胞之標記之量來量測。通常，測試抗體過量存在。藉由競爭分析鑑別之抗體(競爭性抗體)包括結 合至與參照抗體相同之表位之抗體，及結合至與參照抗體所結合表位足夠接近之毗鄰表位以產生立體阻礙之抗體。
為測定所選CD32b結合單株抗體是否結合至獨特表位，每一抗體可使用市售試劑(例如，來自Pierce,Rockford,Ill.之試劑)經生物素化。使用未經標記之單株抗體及生物素化單株抗體之競爭性研究可使用經CD32b多肽塗佈之ELISA板來實施。生物素化MAb結合可用鏈黴-抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶探針來檢測。為測定經純化CD32b結合抗體之同型，可實施同型ELISA。舉例而言，可在4℃下用1μg/ml抗人類IgG塗佈微量滴定板之孔過夜。在用1% BSA封阻後，在環境溫度下使板與1μg/ml或更少單株CD32b結合抗體或純化同型對照反應1-2小時。然後使孔與人類IgG1或人類IgM特異性鹼性磷酸酶偶聯探針反應。然後使板顯影並分析，使得可測定經純化抗體之同型。
為顯示單株CD32b結合抗體與表現CD32b多肽之活細胞之結合，可使用流式細胞術。簡言之，表現CD32b之細胞系(在標準生長條件下生長)可與各種濃度之CD32b結合抗體在含有0.1% BSA及10%胎牛血清之PBS中混合，並在37℃下培育1小時。在洗滌後，使細胞與經螢光黃標記之抗人類IgG抗體在與一級抗體染色相同之條件下反應。可藉由FACScan儀器分析樣品，使用光及側向散射性質在單一細胞上分選。除了流式細胞術分析以外可採用使用螢光顯微鏡術之替代性分析，或使用其代替流式細胞術分析。可如上文所述將細胞精確染色並藉由螢光顯微鏡術來檢查。此方法容許個別細胞之可視化，但可端視抗原密度具有降低之靈敏度。
可藉由西方墨點法(Western blotting)進一步測試本發明之CD32b結合抗體及其抗原結合片段與CD32b多肽或抗原性片段之反應性。簡言之， 可製備經純化CD32b多肽或融合蛋白或來自表現CD32b之細胞之細胞提取物並使其經受十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。在電泳後，將經分離抗原轉移至硝化纖維素膜，用10%胎牛血清封阻，並用欲測試之單株抗體探測。人類IgG結合可使用抗人類IgG鹼性磷酸酶檢測並用BCIP/NBT基質錠劑(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)顯影。
功能分析之實例亦闡述於下文實例部分中。
預防性及治療性用途
本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明之任何抗體或其抗原結合片段治療與增加之CD32b活性或表現相關之疾病或病症之方法。在具體實施例中，本發明提供治療適應症之方法，該等適應症包括但不限於B細胞惡性病，包括霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、急性淋巴球性白血病、慢性淋巴球性白血病、小淋巴球性淋巴瘤、瀰漫性小裂細胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤及濾泡性淋巴瘤以及包括全身性輕鏈類澱粉變性之其他疾病。
在一個實施例中，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體及其抗原結合片段治療CD32b相關疾病或病症之方法。所揭示CD32b結合抗體或其抗原結合片段可用於其之已知CD32b相關疾病或病症之實例包括但不限於：B細胞惡性病，包括霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、急性淋巴球性白血病、慢性淋巴球性白血病、小淋巴球性淋巴瘤、瀰漫性小裂細胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤及濾泡性淋巴瘤，以及包括全身性輕鏈類澱粉變性之其他疾病。
另外，本發明抗體或其抗原結合片段尤其可與結合至與CD32b共表現之細胞表面抗原之另一抗體組合使用，以提高該另一抗體之效能。在一些實施例中，CD32b及細胞表面抗原在B細胞上共表現。在一些實施例中，細胞表面抗原選自由以下組成之群：CD20、CD38、CD52、CS1/SLAMF7、KiR、CD56、CD138、CD19、CD40、Thy-1、Ly-6、CD49、Fas、Cd95、APO-1、EGFR、HER2、CXCR4、HLA分子、GM1、CD22、CD23、CD80、CD74或DRD。在一些實施例中，本發明之其他CD32b結合抗體或其抗原結合片段與選自由以下組成之群之抗體組合使用：利妥昔單抗、奧妥珠單抗、奧法木單抗、達雷木單抗、埃羅妥珠單抗、阿倫單抗或任何其他標靶與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體。對本發明抗CD32b抗體或其抗原結合片段增強結合至與CD32b共表現之細胞表面抗原之其他抗體之活性之觀察之解釋係，抗CD32b抗體結合至CD32b且阻斷CD32b結合細胞表面抗原結合抗體之Fc區，此容許細胞表面抗原結合抗體嚙合免疫效應細胞並介導細胞殺死功能(例如經由ADCC)，且潛在地防止細胞表面抗原結合抗體內化至細胞中並因此不介導細胞殺死(例如經由ADCC)。
此外，本發明之CD32b結合抗體或其抗原結合片段尤其可用於治療、例如預防、延遲或逆轉已變得抵抗使用結合至與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體之治療或該等治療難治之患者之疾病進展。藉由阻斷CD32b與本文所揭示CD32b結合抗體或其抗原結合片段，可增強細胞表面抗原結合抗體之效能且因此可完全或部分逆轉對該等抗體之抵抗。
在一個實施例中，可將本文所揭示之經分離抗CD32b抗體或其抗原結合片段結合治療性方法或程序(例如本文所述或業內已知)投與有需要之 患者。另外，單獨或與一或多種結合與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體組合之本揭示之抗CD32b抗體或其抗原結合片段可與如下文所論述之另一治療劑進一步組合。
例如，組合療法可包括與一或多種其他治療劑(例如一或多種抗癌劑、細胞毒性劑或細胞抑制劑、激素治療、疫苗及/或其他免疫療法)共調配及/或共投與之本發明組合物。在其他實施例中，抗體分子係與其他治療性治療方法組合投與，該等其他治療性治療方法包括手術、輻射、冷凍手術及/或溫熱療法。該等組合療法可有利地利用較低劑量之所投與治療劑，由此避免與各種單一療法有關之可能毒性或併發症。
「與......組合」不欲暗指療法或治療劑必須同時投與及/或經調配以一起遞送，但該等遞送方法在本文所述之範圍內。抗CD32b抗體分子可在一或多種其他額外療法或治療劑的同時、之前或之後投與。抗CD32b抗體分子及另一藥劑或治療性方案可以任一順序投與。通常，每一藥劑將以針對該藥劑所確定之劑量及/或時間方案來投與。另外應瞭解，在此組合中所用之額外治療劑可在單一組合物中一起投與或在不同組合物中分開投與。通常，預期組合中所用額外治療劑係以不超過其個別利用時之劑量的劑量來利用。在一些實施例中，組合中所用劑量將低於個別利用時之劑量。
本揭示之抗CD32b抗體或其抗原結合片段之實例性組合包括將該等抗體與係用於治療血液惡性病(包括多發性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤及慢性淋巴球性淋巴瘤)之標準照護劑之化合物組合使用，該等化合物例如奧法木單抗、依魯替尼、貝林司他、羅米地辛、貝倫妥單抗維多汀、奧妥珠單抗、普拉曲沙、噴司他汀、***、艾代拉裡斯、阿西咗脒、脂質 體多柔比星、泊馬竇邁、帕比司他、埃羅妥珠單抗、達雷木單抗、阿倫單抗、沙利竇邁及雷利竇邁。
在一個實施例中，抗CD32b抗體分子係與共刺激分子之調節劑(例如激動劑)組合投與。在一個實施例中，調節劑係IL15。在一個實施例中，共刺激分子之激動劑選自STING、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配體之激動劑(例如，激動劑抗體或其抗原結合片段，或可溶融合物)。
實例性GITR激動劑包括(例如)GITR融合蛋白及抗GITR抗體(例如，二價抗GITR抗體)，例如美國專利第6,111,090號、歐洲專利第090505B1號、美國專利第8,586,023號、PCT公開案第WO 2010/003118號及第2011/090754號中所述之GITR融合蛋白；或例如美國專利第7,025,962號、歐洲專利第1947183B1號、美國專利第7,812,135號、美國專利第8,388,967號、美國專利第8,591,886號、歐洲專利第EP 1866339號、PCT公開案第WO 2011/028683號、PCT公開案第WO 2013/039954號、PCT公開案第WO2005/007190號、PCT公開案第WO 2007/133822號、PCT公開案第WO2005/055808號、PCT公開案第WO 99/40196號、PCT公開案第WO 2001/03720號、PCT公開案第WO99/20758號、PCT公開案第WO2006/083289號、PCT公開案第WO 2005/115451號、美國專利第7,618,632號及PCT公開案第WO 2011/051726號中所述之抗GITR抗體。
在一個實施例中，抗CD32b抗體分子係與選自以下之抑制性(或免疫檢查點)分子之抑制劑組合投與：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFR β及IDO(吲哚胺-2,3雙加氧酶)。對抑制性分子之抑制可藉由在DNA、RNA或蛋白質層面抑制來實施。
在某些實施例中，本文所述抗CD32b分子係與業內已知之PD-1、PD-L1及/或PD-L2之一或多種抑制劑組合投與。抑制劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
在一些實施例中，抗PD-1抗體選自WO2015/112900中所揭示抗體、MDX-1106、Merck 3475或CT-011中之任一者。在一些實施例中，PD-1抑制劑係免疫黏附素(例如，包含與恆定區(例如，免疫球蛋白序列之Fc區)融合之PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分之免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1抑制劑係AMP-224。在一些實施例中，PD-L1抑制劑係抗PD-L1抗體。在一些實施例中，抗PD-L1結合拮抗劑選自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。MDX-1105亦稱為BMS-936559，係WO2007/005874中所述之抗PD-L1抗體。抗體YW243.55.S70(重鏈及輕鏈可變區序列分別顯示於SEQ ID No.20及21中)係WO 2010/077634中所述之抗PD-L1。
MDX-1106亦稱為MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558，係WO2006/121168中所述之抗PD-1抗體。Merck 3745亦稱為MK-3475或SCH-900475，係WO2009/114335中所述之抗PD-1抗體。匹利珠單抗(Pidilizumab，CT-011；Cure Tech)係結合至PD-1之人類化IgG1k單株抗體。匹利珠單抗及其他人類化抗PD-1單株抗體揭示於WO2009/101611中。在其他實施例中，抗PD-1抗體係派姆單抗(pembrolizumab)。派姆單 抗(商標名Keytruda，曾稱為蘭布魯珠單抗(lambrolizumab)，亦稱為MK-3475)揭示於例如Hamid,O.等人(2013) New England Journal of Medicine 369(2)：134-44中。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如揭示於WO2010/027827及WO2011/066342中)係阻斷PD-1與B7-H1之間之相互作用之PD-L2 Fc融合可溶受體。其他抗PD-1抗體尤其包括AMP 514(Amplimmune)，例如US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中所揭示之抗PD-1抗體。
在一些實施例中，抗PD-1抗體係MDX-1106。MDX-1106之替代名稱包括MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或尼沃魯單抗(Nivolumab)。在一些實施例中，抗PD-1抗體係尼沃魯單抗(CAS登記號：946414-94-4)。尼沃魯單抗(亦稱為BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)係完全人類IgG4單株抗體，其特異性阻斷PD-1。尼沃魯單抗(純系5C4)及特異性結合至PD-1之其他人類單株抗體揭示於US 8,008,449及WO2006/121168中。蘭布魯珠單抗(亦稱為派姆單抗或MK03475；Merck)係結合至PD-1之人類化IgG4單株抗體。派姆單抗及其他人類化抗PD-1抗體揭示於US 8,354,509及WO2009/114335中。其他抗PD1抗體尤其包括AMP 514(Amplimmune)，例如US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中揭示之抗PD1抗體。
MDPL3280A(Genentech/Roche)係結合至PD-L1之人類Fc最佳化IgG1單株抗體。MDPL3280A及針對PD-L1之其他人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。其他抗PD-L1結合劑包括YW243.55.S70(重鏈及輕鏈可變區顯示於WO2010/077634中之SEQ ID NO.20及21中)及MDX-1105(亦稱為BMS-936559，及例如 WO2007/005874中所揭示之抗PD-L1結合劑)。
在一些實施例中，抗PD-L1抗體係MSB0010718C。MSB0010718C(亦稱為A09-246-2；Merck Serono)係結合至PD-L1之單株抗體。派姆單抗及其他人類化抗PD-L1抗體揭示於WO2013/079174中。
AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如揭示於WO2010/027827及WO2011/066342中)係PD-L2 Fc融合可溶受體，其阻斷PD1與B7-H1之間之相互作用。
在一些實施例中，抗LAG-3抗體係BMS-986016。BMS-986016(亦稱為BMS986016；Bristol-Myers Squibb)係結合至LAG-3之單株抗體。BMS-986016及其他人類化抗LAG-3抗體揭示於US 2011/0150892、WO2010/019570及WO2014/008218中。
在一個實施例中，抑制劑係可溶配體(例如，CTLA-4-Ig)或結合至CTLA4之抗體或抗體片段。實例性抗CTLA4抗體包括曲美目單抗(Tremelimumab，IgG2單株抗體，可自Pfizer獲得，曾稱為替西木單抗(ticilimumab)，CP-675,206)、伊匹單抗(Ipilimumab，CTLA-4抗體，亦稱作MDX-010，CAS編號477202-00-9)。
在一個實施例中，CEACAM(例如，CEACAM-1、-3及/或-5)之抑制劑係抗CEACAM抗體分子。據信癌胚抗原細胞黏著分子(CEACAM，例如CEACAM-1及CEACAM-5)可至少部分介導對抗腫瘤免疫反應之抑制(例如，參見Markel等人， J Immunol. 2002 Mar 15；168(6)：2803-10；Markel等人， J Immunol. 2006 Nov 1；177(9)：6062-71；Markel等人， Immunology. 2009 Feb；126(2)：186-200；Markel等人， Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb；59(2)：215-30；Ortenberg等人， Mol Cancer Ther. 2012 Jun；11(6)：1300-10；Stern等人， J Immunol. 2005 Jun 1；174(11)：6692-701；Zheng等人， PLoS One. 2010 Sep 2；5(9).pii：e12529)。舉例而言，已闡述CEACAM-1作為TIM-3之異嗜性配體且在TIM-3介導之T細胞耐受及耗竭中發揮作用(例如，參見WO 2014/022332；Huang等人(2014) Nature doi：10.1038/nature13848)。在實施例中，已顯示CEACAM-1及TIM-3之共阻斷可增強異種移植物結腸直腸癌模型中之抗腫瘤免疫反應(例如，參見WO 2014/022332；Huang等人(2014)，參見上文)。在其他實施例中，CEACAM-1及PD-1之共阻斷降低T細胞耐受，如例如WO 2014/059251中所述。實例性抗CEACAM-1抗體闡述於WO 2010/125571、WO 2013/082366及WO 2014/022332中，例如單株抗體34B1、26H7及5F4；或其重組體形式，如例如US 2004/0047858、US 7,132,255及WO 99/052552中所述。在其他實施例中，抗CEACAM抗體結合至CEACAM-5，如例如Zheng等人， PLoS One. 2010 Sep 2；5(9).pii：e12529(DOI：10：1371/journal.pone.0021146)中所述，或與CEACAM-1及CEACAM-5交叉反應，如例如WO 2013/054331及US 2014/0271618中所述。
抗CD32b抗體分子(單獨或與其他刺激劑組合)與癌症標準照護之實例性組合包括至少以下組合。
放射療法可經由若干種方法中之一者或方法之組合來投與，包括但不限於外束療法、內部放射療法、植入物輻射、立體定位放射手術、全身放射療法、放射療法及永久性或暫時性插種近接治療。術語「近接治療」係指藉由在腫瘤或其他增殖性組織疾病位點或附近***體內之空間受限之放射性材料遞送之放射療法。該術語意欲無限制地包括暴露於放射性同位 素(例如，At-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32及Lu之放射性同位素)。適用作本發明細胞調理因子之輻射源包括固體及液體二者。藉助非限制性實例，輻射源可為放射性核種，例如作為固體來源之I-125、I-131、Yb-169、Ir-192、作為固體來源之I-125或發射光子、β顆粒、γ輻射或其他治療性射線之其他放射性核種。放射性材料亦可為自放射性核種之任何溶液(例如I-125或I-131之溶液)製備之流體，或放射性流體可使用含有固體放射性核種(例如Au-198、Y-90)之小顆粒之適宜流體製造。此外，放射性核種可以凝膠或放射性微球體體現。
單獨或與結合與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體組合及/或與免疫調節劑(例如，抗PD1、抗LAG3、抗PD-L1或抗TIM-3抗體分子)組合之抗CD32b抗體分子可與一或多種用於治療癌症之現有方法組合使用，包括但不限於：手術；放射療法(例如，外束療法，其涉及三維順形放射療法，其中輻射場係經設計之局部輻射(例如，指向預先選擇之標靶或器官之輻射)，或聚焦輻射)。聚焦輻射可選自由以下組成之群：立體定位放射手術、分次立體定位放射手術及強度經調節之放射療法。聚焦輻射可具有選自由以下組成之群之輻射源：顆粒束(質子)、鈷-60(光子)及直線加速器(x射線)，例如如WO 2012/177624中所述。
如熟習此項技術者將瞭解，包括本發明抗體或其抗原結合片段(包括表1中所述之彼等)之組合療法可包含包括上述多個藥劑類別之組合療法。在本發明治療劑與其他一或多種藥劑一起投與時，兩者(或更多者)可以任何順序依序投與或同時投與。在一些態樣中，將本發明抗體投與亦接受使用一或多種其他藥劑或方法之療法之個體。在其他態樣中，結合分子係與手術治療組合投與。組合治療方案可為加和性，或其可產生協同結果。
診斷性用途
在一態樣中，本發明涵蓋在生物學樣品(例如，血液、血清、細胞、組織)情況下或自受疾病或病症困擾之個體測定CD32b及/或核酸表現以及CD32b功能之診斷性分析。
診斷性分析(例如競爭性分析)依賴於經標記類似物(「示蹤劑」)與測試樣品分析物競爭共同結合配偶體上只有嫺熟拇指結合位點之能力。通常在競爭之前或之後使結合配偶體不溶，隨後將結合至結合配偶體之示蹤劑及分析物與未結合之示蹤劑及分析物分離。此分離係藉由傾析(其中預先使結合配偶體不溶)或藉由離心(其中結合配偶體在競爭性反應後沈澱)來完成。測試樣品分析物之量與如藉由標記物質量測之已結合示蹤劑之量成反比。製備具有分析物之已知量之劑量-反應曲線並與測試結果相比，以定量地測定測試樣品中存在之分析物之量。在使用酶作為可檢測標記物時，該等分析稱為ELISA系統。在此形式之分析中，抗體與CD32b結合抗體之間之競爭性結合產生經結合CD32b、較佳本發明之CD32b表位，其係血清樣品中抗體(包括血清樣品中之中和抗體)之量度。
該分析之顯著優點在於，直接進行中和抗體(即，干擾CD32b、尤其表位之結合之彼等)之量測。尤其呈ELISA測試形式之此一分析在臨床環境中及在常規血液篩選中極其適用。
在患有與CD32b相關之病症之患者之臨床診斷或監測中，檢測到與來自正常個體之相應生物學樣品中之含量相比，CD32b蛋白或mRNA之含量升高，指示患者患有與CD32b相關之病症。
活體內診斷或成像闡述於US2006/0067935中。簡言之，該等方法通常包含將診斷有效量之CD32b結合分子投與或引入患者中，該CD32b結合 分子可操作附接至可藉由非侵入性方法檢測之標記物或標記。使抗體-標記物偶聯物有足夠時間定位並結合至CD32b。然後使患者暴露於檢測裝置以鑑別可檢測標記物，由此形成CD32b結合分子在患者組織中之位置之影像。CD32b結合抗體或其抗原結合片段之存在係藉由測定抗體-標記物是否結合至組織組份來檢測。檢測到與正常個體相比CD32b蛋白或蛋白質組合之含量增加可指示與CD32b相關之病症之易患病體質及/或發作。本發明之該等態樣亦係關於在組織成像方法及組合診斷及治療方法中之用途。
本發明亦係關於預測性醫學領域，其中使用診斷性分析、預後分析、藥物基因體學及監測臨床試驗用於預後(預測性)目的，以由此預防性治療個體。
本發明亦提供預後(或預測性)分析用於確定個體是否具有發生與CD32b失調相關之病症之風險。舉例而言，可在生物學樣品中分析CD32b基因中之突變。可使用該等分析進行預後或預測性目的，以由此在特徵為CD32b核酸表現或活性或與其相關之病症發作之前預防性治療個體。
本發明之另一態樣提供測定個體中之CD32b核酸表現或CD32b活性，以由此選擇用於該個體之適當治療性或預防性藥劑(本文中稱作「藥物基因體學」)。藥物基因體學容許基於個體之基因型(例如，經檢查以確定個體對特定藥劑反應之能力之基因型)選擇用於個體之治療性或預防性治療之藥劑(例如，藥物)。
本發明之另一態樣提供在臨床試驗中監測藥劑(例如，藥物)對CD32b之表現或活性之影響之方法。
醫藥組合物
本發明提供醫藥組合物，其包含與醫藥上可接受之載劑調配在一起 之CD32b結合抗體或其結合片段。該等組合物可另外含有一或多種適於治療或預防CD32b相關疾病(例如，B細胞惡性病，包括霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、急性淋巴球性白血病、慢性淋巴球性白血病、小淋巴球性淋巴瘤、瀰漫性小裂細胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤及濾泡性淋巴瘤以及包括全身性輕鏈類澱粉變性之其他疾病)之其他治療劑。醫藥上可接受之載劑增強或穩定該組合物，或有助於該組合物之製備。醫藥上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及諸如此類。
本發明之醫藥組合物可藉由業內已知之多種方法投與。投與途徑及/或模式端視期望結果而變。投與可為靜脈內、肌內、腹膜內或皮下，或靠近標靶位點投與。醫藥上可接受之載劑應適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如，藉由注射或輸注)。端視投與途徑，活性化合物(即抗體、雙特異性及多特異性分子)可包被於材料中，以保護該化合物免受酸及可使該化合物不活化之其他天然條件之作用。
組合物應為無菌且係流體。適當流動性可(例如)藉由使用諸如卵磷酯等包衣材料、藉由維持所需粒徑(在分散液情形中)及藉由使用表面活性劑來維持。在多種情形中，組合物中較佳包括等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)及氯化鈉。可注射組合物之長期吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鋁或明膠)來實現。
本發明醫藥組合物可根據業內熟知且以常規方式實踐之方法來製備。例如，參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。醫藥組合物較佳在GMP條件下製造。通常，本發明醫藥組合物中採用治療有效劑量(effective dose或efficacious dose)之CD32b結合抗體。藉由熟習此項技術者已知之習用方法將CD32b結合抗體調配為醫藥上可接受之劑型。調整劑量方案以提供最佳期望反應(例如治療反應)。例如，可投與單次推注，可隨時間投與若干分開劑量或劑量可如治療狀況緊急性所指示按比例減少或增加。尤其有利地以劑量單元形式調配非經腸組合物以便於投與及劑量一致性。如本文所用劑量單元形式係指適於作為用於欲治療個體之單位劑量之物理離散單元；各單元含有與所需醫藥載劑締合之經計算以產生期望治療效應之預定量之活性化合物。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量值可變，以獲得對於特定患者、組合物及投與模式有效達成期望治療反應，且對患者無毒性之活性成份之量。所選劑量值取決於多種藥物動力學因素，包括所用本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用特定化合物之***速率、治療持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康情況及先前病史以及類似因素。
醫師或獸醫可以低於達成期望治療效應所需之劑量開始醫藥組合物中所用本發明抗體及其抗原結合片段之劑量，並逐漸增加劑量直至達成期望效應為止。通常，對於治療本文所述過敏性發炎病症，本發明組合物之有效劑量端視多種不同因素而變，包括投與手段、標靶位點、患者之生理狀態、患者係人類或係動物、所投與之其他藥品及治療係預防性或係治療性。治療劑量需經調整以使安全性及效力最佳化。對於抗體之全身投與， 劑量在約0.0001至100mg/kg、且更通常0.01至15mg/kg宿主體重之範圍內。實例性治療方案使得需要每兩週一次或每個月一次或酶3至6個月一次全身投與。
抗體通常多次投與。單一劑量之間之間隔可為每週、每個月或每年。間隔亦可不規則，如藉由量測CD32b結合抗體在患者中之血液含量所指示。在一些全身投與方法中，調整劑量以達成1-1000μg/ml之血漿抗體濃度，且在一些方法中為25-500μg/ml。或者，抗體可作為持續釋放調配物投與，其中所需投與頻率較低。劑量及頻率端視抗體在患者中之半衰期而變。通常，人類化抗體顯示半衰期長於嵌合抗體及非人類抗體。投與之劑量及頻率可端視治療係預防性或係治療性而變。在預防性應用中，在長時間內以相對不頻繁之間隔投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要相對較短間隔之相對較高劑量，直至疾病進展降低或終止為止，且較佳直至患者顯示疾病症狀部分或完全改善為止。此後，可向患者投與預防方案。
實例
提供以下實例以進一步闡釋本發明但不限制其範圍。本發明之其他變體將為熟習此項技術者顯而易見且涵蓋於隨附申請專利範圍中。
實例1：CD32B抗體之鑑別
來自Morphosys HuCAL PLATINUM ®噬菌體庫淘選之抗體
對於特異性識別人類CD32b(人類FCGR2B,UniProtKB P31994胺基酸43-222(SEQ ID NO：680)，具有APP及avi-標籤)而非人類CD32a-R(人類FCGR2A,UniProtKB P12318變體H167R，胺基酸34-218(SEQ ID NO：681)，具有APP及avi-標籤)之抗體之選擇，使用Morphosys HuCAL PLATINUM®庫。噬粒庫係基於HuCAL®概念(Knappik等人，2000 J Mol Biol 296：57-86)且採用CysDisplayTM技術顯示噬菌體表面上之Fab(WO01/05950)。最終得到人類CD32b特異性抗體之淘選策略係使用液相淘選策略來選擇。
對人類CD32b 之液相淘選
使用生物素化人類CD32b實施三輪抗原選擇過程。用封阻劑封阻噬菌體溶液，之後在經中性抗生物素蛋白塗佈之孔上耗竭可能的中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)結合劑之溶液。將所營救噬菌體與生物素化人類CD32b一起培育1小時，之後在經中性抗生物素蛋白塗佈之孔上捕獲噬菌體-抗原複合物。使用PBST(補充有0.05% Tween之PBS)，然後用PBS洗去未結合噬菌體。對於特異性結合之噬菌體之溶析，在RT下經10分鐘(min)添加25mM DTT(二硫蘇糖醇)。使用DTT溶析物感染大腸桿菌(Escherichia coli)TG-F+細胞。在感染後，將細菌離心並將沈澱再懸浮於100ml 2YT(酵母-胰蛋白腖(Trypton))培養基/Cam(氯黴素)/1%葡萄糖中，並在37℃下培育過夜且以220rpm振盪。使用過夜培養物進行噬菌體營救、所選純系之多株擴增及用於下一輪之噬菌體產生。第二輪及第三輪液相淘選係根據第一輪之方案來實施，但洗滌條件更嚴格。
實施第4輪分析型淘選以選擇不結合至人類CD32a-R之人類CD32b特異性抗體。此輪淘選係基於對人類CD32b之第3輪淘選之輸出且對所有3種不同蛋白質實施。此第4輪分析型淘選之輸出經歷次世代定序(NGS)分析，而非古典ELISA篩選。
ELISA 篩選
使用ELISA篩選，鑑別特異性結合至人類CD32b而非人類CD32a-R 之單一Fab純系。使用含有Fab之粗製大腸桿菌溶解物測試Fab。
對於人類CD32b抗原結合Fab片段之鑑別，用10ug/ml中性抗生物素蛋白塗佈MaxisorpTM (Nunc)384孔板，之後添加生物素化抗原：人類CD32b及人類CD32a-R。在用Superblock封阻板後，添加含有Fab之大腸桿菌溶解物。藉由AP偶聯之山羊抗人類Fab特異性抗體(Fab格式)(Jackson Immuno Research)檢測Fab之結合。添加AttoPhos受質並記錄在535nm下之螢光發射及在430nm下之激發。
次世代定序(NGS) 分析
提取第4輪分析型淘選之DNA並在兩個連續PCR反應中擴增HCDR3區域。該等PCR反應亦用於將Illumina接頭序列添加至PCR片段之3’端及5’端。另外，在一個轉接區域中添加Illumina指示物以多路複用用於測序反應之樣品。
使用呈FastQ格式之原始數據提取胺基酸序列，比對該等序列並計數個別序列之出現。藉由比較源自不同淘選策略之個別純系之出現次數，可鑑別具有期望結合譜(在人類CD32b上富集且在人類CD32a-R上缺失)之純系。
藉由組裝PCR自多株輸出池分離所關注純系。使用側接輕鏈及重鏈之引子以及HCDR3特異性引子來檢索期望純系。
轉化為IgG 及IgG 表現
為在CAP-T細胞中表現全長IgG，將重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變結構域片段自Display載體(pMORPHx30)亞選殖至用於人類IgG1之適當pMorph®_hIg載體中。在轉染後7天收穫細胞培養上清液。在無菌過濾後，使用液體處理站使溶液經受蛋白質A親和層析。將樣品在50nM檸檬 酸鹽、140nM NaOH且pH經1M Tris中和之緩衝液中溶析，並無菌過濾(0.2μm孔徑)。藉由UV-分光光度法在280nm下測定蛋白質濃度並在SDS-PAGE中在變性、還原條件下分析IgG之純度。
淘選策略及篩選之總結
除了古典噬菌體顯示淘選及之後的ELISA篩選外，實施使用第4輪分析型淘選及後續NGS分析之新穎方法。使用古典方法，鑑別兩種抗體：NOV0281及NOV0308。使用新穎NGS分析方法，鑑別3種額外抗體：NOV0563、NOV0627及NOV0628(論述於下文中)。
實例2：NOV0627及NOV0628之工程化
將NOV0628之框架區種系化至最接近之人類種系(VH3-23及Vlambda-3j)。另外，使CDR-H2(SYDGSE)中之潛在天冬胺酸異構位點自DG變為DA以得到抗體NOV1218，且自DG變為EG以得到抗體NOV1219。
將NOV0627之框架區種系化至最接近之人類種系(VH1-69及Vlambda-3j)，得到抗體NOV1216。哺乳動物表現之呈IgG之NOV1216之毛細管區帶電泳(CZE)分析揭露，抗體以三種主要種類存在：未經修飾、+80道爾頓及+160道爾頓(圖1、表2)。在Beckman Coulter PA800 Enhanced儀器上用熔融矽石毛細管實施CZE分析。總毛細管長度為40cm，內徑為50μm且自入口至檢測器之毛細管長度為30cm。電泳運行緩衝液由400mM 6-胺基己酸/乙酸(pH 5.7)及2mM三伸乙基四胺及0.03%聚山梨醇酯20組成。將1mg/mL樣品保持在15℃自動檢樣機中並以0.5psi注射12s。在25℃下在20kV之分離電壓下實施分離30分鐘。檢測係依據在214nm下之UV吸光度。在注射之間，將毛細管用電泳運行緩衝液以20 psi沖洗3分鐘。
哺乳動物表現之呈IgG格式之NOV1216之質譜分析揭露，CDR-H3(EQDPEYGYGGYPYEAMDV,SeqID：159)之4個酪胺酸中之一個易於經由硫酸化發生轉譯後修飾。假設此係+80及+160道爾頓種類之來源。起始藉由使CDR-H3中之特定殘基突變來移除PTM之努力。儘管酪胺酸硫酸化不存在共有識別序列，據報導側接有酸性或小型胺基酸之酪胺酸更易硫酸化(Nedumpully-Govindan等人，2014,Bioinformatics 30：2302-2309)。表3概述所生成之CDR-H3突變體。簡言之，藉由***酸(NOV2106)、丙胺酸(NOV2107)及絲胺酸(NOV2108)交換側接有酸性及小型胺基酸之第一酪胺酸，藉由***酸(NOV2109、2110、2111)交換第二至第四酪胺酸。另外，將第一酪胺酸之前之兩個酸性胺基酸交換為絲胺酸(NOV2112及2113)。
表3中概述之CDR-H3突變體之毛細管區帶電泳總結於圖2及表4中。用***酸(NOV2106)、丙胺酸(NOV2107)或絲胺酸(NOV2108)替代第一酪胺酸成功防止硫酸化事件且獲得缺少+80及+160道爾頓修飾之IgG1抗體。其餘CDR-H3突變體以與NOV1216一致之方式保留+80及+160道爾頓種類，從而證實僅CDR-H3中之第一酪胺酸經修飾之假設。同樣，第一酪胺酸之前之第二酸性胺基酸(NOV1213)之突變未消除+80及+160種類。第一酪胺酸之前之第一酸性胺基酸(NOV1212)之突變未防止酪胺酸硫酸化，然而，其減少藉由+160Da修飾之比例(圖2、表4)。
實例3：無岩藻糖基化IgG抗體之產生
無岩藻糖基化IgG抗體係藉由應用GlymaxX技術(Probiogen AG,Berlin.)來產生。簡言之，用編碼抗體輕鏈及重鏈二者之表現質體瞬時轉 染HEK293T細胞。同時，將編碼酶GDP-6-去氧-D-來蘇-4-己酮糖還原酶之表現質體(「RMD」、「偏轉酶」，由Probiogen AG,Berlin提供)共轉染至細胞中。酶在經成功轉染細胞中之活性導致抑制岩藻糖重新合成路徑。表現酶及IgG基因二者之細胞產生無岩藻糖基化IgG蛋白質。使用聚乙烯亞胺作為轉染劑。藉由離心收穫細胞培養上清液且使用用於精製之蛋白質A層析及製備型粒徑篩析層析藉由標準層析方法純化IgG蛋白質(MabSelect SURE、GE Healthcare及HiLoad 26/600 Superdex 200 pg)。在SDS-PAGE中在變性、還原及非還原條件下及藉由HP-SEC在天然狀態中分析IgG之純度。藉由質譜測定攜帶無核心岩藻糖之N-聚醣結構之重鏈之百分比。
無岩藻糖基化IgG抗體亦係由CHO細胞產生。在含有富含胺基酸、維生素及微量元素之化學成份確定培養基(含有10nM MTX之培養基)中培養CHO細胞。在37℃溫度及振盪下實施分批培養。在14天之分批培養過程後，收集分批培養物之樣品以使用Vi-Cell細胞存活率分析儀(Beckman Coulter)測定活細胞密度及存活率，並測定細胞培養基中之蛋白質效價。在分批培養結束時(第14天)，停止培養過程。自振盪燒瓶收穫條件化培養基(30ml培養物)並使用0.22μm Steriflip過濾器過濾。
藉由標準層析方法使用用於精製之蛋白質A層析及製備型粒徑篩析層析純化IgG蛋白質(MabSelect SURE、GE Healthcare及HiLoad 26/600 Superdex 200 pg)。在SDS-PAGE中在變性、還原及非還原條件下及藉由HP-SEC在天然狀態下分析IgG之純度。藉由質譜測定攜帶無核心岩藻糖之N-聚醣結構之重鏈之百分比。
實例4. HUCD32B結合抗體與表現HUCD32A或HUCD32B變體之CHO細 胞之結合
HuCD32b及huCD32a具有高度序列同源性。為評價huCD32b結合抗體之特異性，藉由流式細胞術使用表現WT huCD32a變體(即huCD32aH131 或huCD32aR131 )或WT人類CD32b1之穩定CHO細胞系評估其結合。在用含有2mM EDTA之PBS脫離後，收集CHO細胞並使其沈澱。將細胞糰粒在PBS中洗滌一次並懸浮於FACS緩衝液(PBS1×，含有2%BSA、2mM EDTA及0.1% NaN3)中，計數並以0.25×106 細胞/ml懸浮。然後在V形底96孔板中分配50’000個細胞/孔(200μl)。將板以1600rpm旋轉5分鐘並棄去上清液。然後將細胞懸浮於50μl含有指示濃度之huCD32b結合抗體(皆在人類IgG1[N297A]支架上)之FACS緩衝液中並在4℃下培育30分鐘。在用FACS緩衝液3次連續洗滌後，將細胞懸浮於50μl含有1/100稀釋度之F(ab’)2抗人類F(ab’)2-PE(Jackson Immunoresearch編號109-116-097)之FACS緩衝液中並在4℃下再培育30分鐘。將細胞洗滌兩次並懸浮於200μl FACS緩衝液中且在FACS Canto II上採集(在活細胞分選中採集5000個細胞)。使用幾何平均螢光(PE通道中之GMFI)作為每一抗體之結合強度之量度。圖3顯示huCD32b結合抗體之實例，其在huCD32b與huCD32a變體之間顯示不同程度之差異。所有huCD32b結合抗體與huCD32b變體之結合皆較與huCD32a變體之結合更牢固。
實例5. HuCD32b結合抗體與表現HuCD16變體及HuCD64之CHO細胞之結合
藉由流式細胞術使用表現低親和力人類CD16變體(即huCD16a或huCD16b變體)及高親和力huCD64(FcγRI)之穩定CHO細胞系評估huCD32b特異性抗體之結合。經huCD16a變體轉染之CHO細胞亦經共有 Fcγ鏈轉染以容許表面表現。在用含有2mM EDTA之PBS脫離後收集CHO細胞並使其沈澱。將細胞糰粒在PBS中洗滌一次並懸浮於FACS緩衝液(PBS1×，含有2%BSA、2mM EDTA及0.1% NaN3)中，計數並以0.25×106 細胞/ml懸浮。然後在V形底96孔板中分配50'000個細胞/孔(200μl)。將板以1600rpm旋轉5分鐘並棄去上清液。然後使細胞懸浮於50μl含有指示濃度之huCD32b結合抗體(皆在人類IgG1[N297A]支架上)之FACS緩衝液中並在4℃下培育30分鐘。在用FACS緩衝液3次連續洗滌後，使細胞懸浮於50μl含有1/100稀釋度之F(ab')2抗人類F(ab')2-PE(Jackson Immunoresearch編號109-116-097)之FACS緩衝液中並在4℃下再培育30分鐘。將細胞洗滌兩次並懸浮於200μl FACS緩衝液中並在FACS Canto II上採集(在活細胞分選中採集5000個細胞)。使用幾何平均螢光(PE通道中之GMFI)作為每一抗體之結合強度之量度。所測試所有huCD32b結合抗體皆顯示對表現huCD16變體之CHO細胞無反應性及部分劑量依賴性結合至高親和力huCD64受體(圖4)。劑量依賴性結合至huCD64受體可能經由所測試抗體之Fc部分與huCD64之高親和力Fc結合結構域之結合而發生，此乃因此獨立於Ab之表位特異性而發生且藉由用人類IgG1預培育CHO-huCD64細胞而被阻斷(數據未顯示)。
實例6：人類CD32B結合抗體與人類原代B細胞之結合
CD32b係在B細胞上表現之唯一Fc受體。藉由流式細胞術在藉由負向選擇使用人類B細胞富集套組(STEMCELL Technologies編號19054)根據供應商說明書自血沉棕黃層分離之經純化B細胞上評估huCD32b特異性抗體與原代人類B細胞之結合。使經純化B細胞懸浮於FACS緩衝液(PBS1×，含有2%BSA,2mM EDTA)中，計數並以0.5×106 細胞/ml懸浮。 然後在V形底96孔板中分配100’000個細胞/孔(200μl)。將板以1500rpm旋轉5分鐘並棄去上清液。然後使細胞懸浮於50μl含有指示濃度之生物素化huCD32b結合抗體(皆在人類IgG1[N297A]支架上)之FACS緩衝液中並在4℃下培育20分鐘。使用來自Innova Biosciences(目錄號704-0010)之Lightning-Link生物素偶聯套組(A型)根據供應商說明書實施抗體之生物素化。在用FACS緩衝液2次連續洗滌後，使細胞懸浮於50μl含有1/500稀釋度之鏈黴抗生物素蛋白-PE(Invitrogen S21388)及1μl APC偶聯之抗huCD20 Ab(來自Biolegend 302310之純系2H7)之FACS緩衝液中並在4℃下再培育20分鐘。將細胞洗滌兩次並懸浮於200μl FACS緩衝液中且在FACS Fortessa上採集。使用CD20+ B細胞分選中之幾何平均螢光(PE通道中之GMFI)作為每一抗體之結合強度之量度。所有huCD32b結合抗體皆顯示與人類B細胞之牢固結合，且NOV1216、NOV0281及NOV0308具有最高結合親和性(分別為1.4、5.4及8.7nM；圖5)。
實例7：HUCD32B結合抗體與人類BJAB細胞之結合
藉由流式細胞術評估huCD32b特異性抗體與BJAB細胞系之結合。收集BJAB細胞並將其懸浮於FACS緩衝液(PBS1×，含有2%BSA,2mM EDTA)中，計數並以0.25×106 細胞/ml懸浮。然後在V形底96孔板中分配50'000個細胞/孔(200μl)。將板以1500rpm旋轉5分鐘並棄去上清液。然後使細胞懸浮於50μl含有指示濃度之生物素化huCD32b結合抗體(皆在人類IgG1[N297A]支架上)之FACS緩衝液中並在4℃下培育20分鐘。使用來自Innova Biosciences(目錄號704-0010)之Lightning-Link生物素偶聯套組(A型)根據供應商說明書實施抗體之生物素化。在用FACS緩衝液2次連續洗滌後，使細胞懸浮於50μl含有1/500稀釋度之鏈黴抗生物素蛋白-PE (Invitrogen S21388)之FACS緩衝液中並在4℃下再培育20分鐘。將細胞洗滌兩次並懸浮於200μl FACS緩衝液中且在FACS Fortessa上採集。使用幾何平均螢光(PE通道中之GMFI)作為每一抗體之結合強度之量度。所有huCD32b結合抗體皆顯示與親代BJAB細胞之牢固結合，且NOV1216、NOV0281、NOV0308及NOV0563具有最高結合親和性(圖6)。
實例8：抗人類CD32B結合抗體之表位識別.
a)藉由FACS結合進行之表位分析
用於表徵抗CD32b 抗體之結合表位之WT 及突變體huCD32b 轉染之CHO 細胞之概述
使用Flp-InTM 技術生成表現WT人類CD32b或包涵下文所論述胺基酸突變之CD32b之穩定CHO細胞系。使用潮黴素B選擇穩定細胞轉染子。在人類CD32b之3D模型結構中以黑色突出顯示之殘基突出顯示huCD32b與huCD32a之間不同之胺基酸(圖7a)。EDI103、EDI104、EDI105、EDI106及EDI107 CHO細胞表現具有特定胺基酸突變之huCD32b，該等突變將所指示胺基酸回復為人類CD32a中之相應胺基酸。每一細胞系中經修飾之胺基酸在相應3D結構上藉由空心圓突出顯示(Sondermann等人，The EMBO Journal(1999)18,1095-1103)並針對每一細胞系加以指定。對huCD32b結合抗體與該等不同huCD32b變體之結合之評價容許鑑別抗體識別之主要表位區域。huCD32b結構之左側部分界定為表位I且對應於huCD32b之Fc結合結構域。右側界定為表位II且不參與Fc結合。在EDI103、EDI104及EDI105突變體中，藉由使表位II與huCD32a一致來破壞該表位(圖7a)。在EDI106及EDI107突變體中，藉由使huCD32b之表位I與huCD32a一致來破壞該表位(圖7b)。
經設計以表徵抗huCD32b 結合抗體識別之結合表位之FACS 結合實驗
藉由流式細胞術使用表現WT人類CD32b或突變體CD32b變體之穩定CHO細胞系評估huCD32b特異性抗體之結合表位，在該等突變體CD32b變體中，在Fc結合結構域(表位I)或CD32b分子之相對端(表位II)中在huCD32b與huCD32a之間不同之胺基酸藉由將特定huCD32b殘基回復為CD32a中之相應胺基酸而消除。EDI103、EDI104及EDI105 CHO變體表現表位2胺基酸與huCD32a一致之huCD32b突變體，而EDI106及EDI107表現表位I胺基酸與人類CD32a一致之huCD32b(圖7a)。在用含有2mM EDTA之PBS脫離後收集CHO細胞並使其沈澱。將細胞糰粒在PBS中洗滌一次並懸浮於FACS緩衝液(PBS1×，含有2% BSA、2mM EDTA及0.1% NaN3)中，計數並以0.25×106 細胞/ml懸浮。然後在V形底96孔板中分配50'000個細胞/孔(200μl)。將板以1600rpm旋轉5分鐘並棄去上清液。然後使細胞懸浮於50μl含有指示濃度之huCD32b結合抗體(皆在人類IgG1[N297A]支架上)之FACS緩衝液中並在4℃下培育30分鐘。在用FACS緩衝液3次連續洗滌後，使細胞懸浮於50μl含有1/100稀釋度之F(ab')2抗人類F(ab')2-PE(Jackson Immunoresearch編號109-116-097)之FACS緩衝液中並在4℃下再培育30分鐘。將細胞洗滌兩次並懸浮於200μl FACS緩衝液中並在FACS Canto II上採集(在活細胞分選中採集5000個細胞)。使用幾何平均螢光(PE通道中之GMFI)作為每一抗體之結合強度之量度。圖8顯示基於降低之與表現特定huCD32b-突變體之CHO細胞之結合顯示不同結合表位之huCD32b結合抗體之實例。NOV0281及NOV1216顯示降低之與表位I缺陷型EDI106及EDI107 huCD32b突變體之結合，指示該等抗體主要識別表位I(即Fc結合結構域區域)(圖8a、圖8b)。抗體NOV0563顯示類似 之與所測試所有huCD32b CHO變體之結合，表明該抗體識別表位I及表位II覆蓋區域之間之表位，或者替代地在3D huCD32b結構背側之涵蓋huCD32b與huCD32a之間之另一單一胺基酸差異之另一區域，本文中定義為表位III(圖8c)。圖8a、圖8b及圖8c中結合資料之總結呈現於表5A中。
NOV2108 識別CD32b Fc 結合結構域(表位I )
藉由流式細胞術使用表現WT人類CD32a、CD32b或突變體CD32b變體之穩定CHO細胞系評估huCD32b特異性抗體NOV2108及NOV1216之結合表位，在該等突變體CD32b變體中在Fc結合結構域(表位I)或CD32b分子之相對端(表位II)中在huCD32b與huCD32a之間不同之胺基酸藉由將特定huCD32b殘基回復為CD32a中之相應胺基酸而消除。在EDI103及EDI105突變體中，藉由使表位II與huCD32a一致來破壞該表位(圖7a)。在EDI106及EDI107突變體中，藉由使huCD32b之表位I與huCD32a一致來破壞該表位(圖7b)。使黏附型CHO細胞系在DMEM(Lonza目錄號：12-604F)、10% FBS(Seradigm產品號1500-500，批號112B15)、600ug/ml 潮黴素B(Life Tech 10687-010)中生長。藉由用PBS(Lonza目錄號17-516F)沖洗且用培養物中之0.25%胰蛋白酶(Gibco 25200-056)處理來收穫匯合細胞。在使脫離細胞沈澱後，在PBS中洗滌一次，且再懸浮於FACS緩衝液(PBS1×，含有2% FBS)中。將各細胞系以2×106 個細胞/ml再懸浮，之後在96孔u形底板(Falcon 351177)中等分為100μl/孔。將板以1200rpm旋轉沉降5分鐘並棄去上清液。然後將細胞再懸浮於100μl含有指示濃度之Alexa Fluor 647標記(Molecular Probes A20186)之huCD32b-反應性抗體(皆在人類IgG1[N297A]支架上)之FACS緩衝液中並在4℃下培育30分鐘。對於圖31，製備AlexaFluor 647標記之NOV1216及AlexaFluor 647標記之NOV2108之以100ug/ml開始之四點1：10連續稀釋液。各CHO細胞系分別如圖中所指示用一種抗體來培育。在用FACS緩衝液3次連續洗滌後，使細胞懸浮於100μl FACS緩衝液中。在最終洗滌後，將細胞再懸浮於100μl FACS緩衝液中並在FACS Canto II上採集(在活細胞分選中採集5000個細胞)。使用幾何平均螢光強度(AF647通道中之GMFI)作為每一抗體之結合強度之量度。
NOV2108及NOV1216顯示降低之與表位I缺陷型EDI106及EDI107 huCD32b突變體之結合(圖31)，指示該等抗體識別表位I(即Fc結合結構域)。兩種抗體顯示類似的與WT CD32b及表位II缺陷型EDI103及105 huCD32b突變體之結合，指示兩種抗體之結合不需要表位II。結合資料之總結概述於表5B中。
b)藉由氫-氘交換進行之NOV2108在huCD32b上之表位定位
使用氫-氘交換(HDx)與質譜(MS)組合(Woods VL,Hamuro Y(2001)High-Throughput Amide Deuterium Exchange-Mass Spectrometry(DXMS)Determination of Protein Binding Site Structure and Dynamics：Utility in Pharmaceutical Design.J.Cell.Biochem.Supp.；84(37)：89-98)定位Fab抗體NOV2108在人類CD32b(aa1-175)(SEQ ID NO：682)上之推定結合位點。在HDx中，蛋白質之可交換醯胺氫經氘替代。由於此過程對蛋白質結構/動力學及溶劑可及性敏感，且因此能報告關於在配體結合時經歷氘攝取減少之位置。氘攝取之變化對直接結合及別位事件二者敏感。
使用類似於文獻中所述方法之方法實施HDx-MS實驗(Chalmers MJ、Busby SA、Pascal BD、He Y、Hendrickson CL、Marshall AG、Griffin PR(2006),Probing protein Ligand Interactions by Automated Hydrogen/deuterium Exchange Mass Spectrometry.Anal.Chem.；78(4)：1005-1014)。在該等實驗中，在以Fab格式呈現之抗體NOV2108 不存在及存在下量測人類CD32b(aa1-175)之氘攝取。人類CD32b(aa1-175)中在抗體結合時顯示氘攝取減少之區域可能與表位有關；然而，由於量測之性質，亦可能偵測到遠離直接結合位點之變化(別位效應)。通常，具有最大保護量之區域參與直接結合，但可能並非始終如此。為描繪來自別位效應之直接結合事件，需要正交量測(例如X射線結晶學、丙胺酸誘變等)。
在Waters HDx-MS平臺上實施人類CD32b(aa1-175)表位定位實驗，該平臺包括LEAP自動檢樣機、nanoACQUITY UPLC系統及Synapt G2質譜儀。用於用氘標記人類CD32b(aa1-175)之蛋白質主鏈之氘緩衝液係125mM PBS、150mM NaCl,pH 7.2；溶液中氘之總百分比為95%。對於在抗體不存在下進行之人類CD32b(aa1-175)氘標記實驗，將9μl體積之175pmol人類CD32b(aa1-175)在4℃下使用100μl氘緩衝液稀釋25分鐘。然後用100μl冷凍驟冷緩衝液在2℃下將標記反應物驟冷5分鐘，之後將其注射至LC-MS上以供自動化胃蛋白酶消化及肽分析。對於在NOV2108存在下進行之人類CD32b(aa1-175)氘標記實驗，將175pmol人類CD32b(aa1-175)與210pmol呈Fab格式之NOV2108抗體混合，總體積為9μl。然後使用100μl氘緩衝液在4℃下將溶液稀釋25分鐘。然後將標記反應在2℃下用100μl冷凍驟冷緩衝液驟冷5分鐘，之後將其注射至LC-MS系統上以供自動化胃蛋白酶消化及肽分析。
所有實驗皆係使用最低三次重複分析來實施。所有氘交換實驗皆係使用0.5M TCEP及3M Urea(pH=2.5)驟冷。在驟冷後，將抗原注射至UPLC系統中，其中該抗原在12℃下進行線上即時胃蛋白酶消化，之後在Waters CSH C18 1×100mm管柱(維持在1℃下)上以40uL/min之流速經 受8分鐘之快速2至35%乙腈梯度。
對於人類CD32b(aa1-175)，藉由氘交換實驗監測94%序列，如圖32中所指示。在此圖中，每一條形代表在所有氘交換實驗中監測之肽。
對於結合與未結合狀態之抗體NOV2108 Fab之間之差異性實驗，檢查兩種狀態之間之氘攝取差異可提供資訊。在圖33中，負值指示，人類CD32b-抗體複合物相對於人類CD32b經歷較少氘攝取。氘攝取減少係由於防止該區域受到可交換氘之作用或氫鍵網絡之穩定作用。與之相比，正值指示，複合物相對於人類CD32b經歷更多氘攝取。氘攝取增加係由於氫鍵網絡之去穩定(即蛋白質之局部解摺疊)。在該等實驗中，未觀察到由於NOV2108 Fab結合至CD32b所致之任何顯著去穩定化作用。
在檢查兩種不同狀態(例如未結合人類CD32b及與抗體NOV2108複合之人類CD32b)之間氘交換之差異性變化時，利用多種方法測定變化是否顯著。在一種方法中(Houde等人，J Pharm Sci 100(6)：2071-2086(2011))，只要差異大於0.5Da(在圖33中表示為虛線)，即可將差異視為顯著。使用先前所提及之方法，在Ab NOV2108 Fab結合時，單一區域aa107-123(VLRCHSWKDKPLVKVTF)顯著受保護。先前公開之資料表明，若干個殘基對於Fc結合至關重要：aa112-119(SWKDKPLV)及aa133-138(SRSDPNF)(Hulett MD、Witort E、Brinkworth RI、McKenzie IF及Hogarth PM.(1995),Multiple Regions of Human FcgRII(CD32)Contribute to the Binding of IgG.The J.Bio Chem.；36(270)：21188-21194)。在本發明HDx-MS實驗中，區域aa112-119(SWKDKPLV)受NOV2108結合保護。在本發明HDx-MS實驗中無法監測對應於133-138(SRSDPNF)之區域；此區域對應於C’/E環。在圖34中，受Ab NOV2108保護之區域(呈黑色)定位至已公開人類CD32b晶體結構上(Sondermann P.、Huber R.及Jacob U.(1999),Crystal structure of the soluble form of the human fcgamma-receptor IIb：a new member of the immunoglobulin superfamily at 1.7Å resolution.The EMBO J.；5(18)：1095-1103)。此區域包括B/C環結構以及B+C β-褶疊。該等資料支持功能分析之觀察，指示NOV2108結合CD32b Fc結合結構域。
實例9：人類CD32B結合抗體結合至特徵為一系列人類CD32B表現之細胞之測定.
為測定抗CD32b抗體與特徵為不同CD32b表現程度之細胞之結合，對內源性表現huCD32b之KARPAS422(Sigma Aldrich 06101702)人類癌細胞系；BJAB(DSMZ；ACC 757)實施FACS分析。亦如同缺少CD32b及CD32a二者之RAMOS細胞一般評估表現CD32b及CD23a之穩定CHO細胞系。對於黏附型CHO細胞系，藉由在含有0.25%胰蛋白酶(Gibco 25200-056)之培養物中處理細胞使細胞懸浮。一旦細胞懸浮起來，用MACs緩衝液(Miltenyi biotec 130-091-222，含有BSA原液(Miltenyi biotec 130-091-376))洗滌並再懸浮細胞。對於懸浮系(Karpas422、BJAB、Ramos)細胞，使11×106 個細胞旋轉沉降，用MACs緩衝液洗滌並再懸浮。將所有細胞系再懸浮至4×106 個細胞/ml，之後在96孔圓底板(Costar 29442-066)中等分為50μl/孔。製備Alexa-647標記(Molecular Probes A20186)之N297A抗體之七點1：3連續稀釋液，且將25μl添加至每孔。使用非標靶IgG1[N297A支架]抗體作為陰性對照。將細胞與抗體(皆在人類IgG1[N297A]支架上)一起在冰上培育30分鐘。洗滌細胞，然後再懸浮於100μl含有10μl/ml 7AAD(eBiocience 00-6993-50)之MACs緩衝液中，且在 BD FACs Canto(BD Biosciences)上分析。對於所有CD32b陽性細胞系，CD32b結合抗體之結合係劑量依賴性(圖9)。該等抗體顯示與CD32b陰性Ramos或CHO_CD32a細胞系之結合受到限制。如所預期，非標靶同型對照抗體未結合至細胞。
實例10：CDR-H3突變體人類CD32B結合抗體結合特徵為一系列人類CD32B表現、CD32A表現或無FCGAMMA受體之細胞之測定
為測定CDR-H3突變體抗CD32b抗體與細胞之結合，對內源性表現huCD32b之KARPAS422(Sigma Aldrich 06101702)、DAUDI(ATCC；CCL-213)及親代BJAB(DSMZ；ACC 757)人類癌細胞系以及表現CD32b之穩定BJAB及CHO細胞系實施FACS分析。亦如同缺少CD32b及CD32a二者之親代CHO細胞一般，評估可表現CD32a之穩定CHO細胞系。
對於KARPAS422、DAUDI及BJAB細胞系，使11×106 個細胞旋轉沉降，用MACs緩衝液(Miltenyi biotec 130-091-222，含有BSA原液(Miltenyi biotec 130-091-376))洗滌並再懸浮。對於黏附型CHO細胞系，藉由在含有0.25%胰蛋白酶(Gibco 25200-056)之培養物中處理細胞使細胞懸浮。一旦細胞懸浮起來，洗滌細胞然後用MACs緩衝液(Miltenyi biotec 130-091-222，含有BSA原液(Miltenyi biotec 130-091-376))再懸浮。將所有細胞系再懸浮至4×106 個細胞/ml，之後在96孔圓底板(Costar 29442-066)中等分為50μl/孔。製備Alexa-647標記(Molecular Probes A20186)之抗體(皆在人類IgG1[N297A]支架上)之八點1：3連續稀釋液，且將25μl添加至每孔。使用非標靶抗體(人類IgG1[N297A]支架)作為陰性對照。將細胞與抗體一起在冰上培育30分鐘，然後洗滌，再懸浮於含有10μl/ml 7AAD(eBiocience 00-6993-50)之MACs緩衝液中並在Novoctye 3000 (ACEA Biosciences 2010011)上分析。使用Weasel軟體測定每個樣品之信號的幾何平均值。對於所有人類CD32b陽性細胞系，HCD-R3突變體NOV2107及NOV2108顯示類似於親代抗體NOV1216之最牢固結合(圖10)。對於所測試之所有抗體，相對於表現人類CD32b之細胞，僅觀察到與人類CD32a轉染之CHO細胞之最低結合，且與無CD32a/CD32b之CHO親代細胞無/極低結合。該等資料顯示抗體與人類CD32b之特異性。
實例11：對由FC WT抗CD32B抗體介導之針對JEKO-1及KARPAS422癌細胞系之原代NK細胞驅動之特異性ADCC活性的評價
在基於原代NK細胞之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)分析中評估Fc野生型抗CD32b抗體(人類IgG1)之活性。簡言之，經由聚蔗糖(ficoll)梯度自供體血液分離PBMC。然後使用Miltenyi珠粒(目錄號130-092-657)對NK細胞進行陰性選擇。用10ng/ml I1-2(Peprotech目錄號200-02)將該等效應細胞刺激過夜。在後一天，用鈣黃綠素乙醯氧基-甲基酯(Calcein-AM；Molecular Probes目錄號C3100MP)對Jeko-1及Karpas422細胞進行染色，洗滌兩次，並以10,000個細胞/孔之濃度轉移至96孔U形底微量滴定板。然後將細胞與上文所提及抗體之連續稀釋液一起預培育20分鐘，之後以3：1之效應物對標靶比率添加效應細胞。在共培育後，將微量滴定板離心並將上清液流體之等份試樣轉移至另一微量滴定板(Corning Costar，目錄號3904)，並用螢光計數器(Envision,Perkin Elmer)測定溶液中游離鈣黃綠素之濃度。
為計算標靶細胞之抗體特異性溶解，無抗體或效應細胞之標靶細胞之平行培育用作基線對照(自發釋放)，而陽性對照或最大釋放係藉由僅使用1% Triton-X 100溶液之標靶細胞之溶解來測定。特異性溶解百分比係 使用以下公式來計算：(樣品-自發)/(最大釋放-自發)*100%。
所有Fc野生型抗CD32b抗體皆顯示對所評估兩種癌細胞系之濃度依賴性特異性細胞溶解，如圖11a及圖11b中所說明。相對於所剖析之其他抗體，Ab NOV1216顯示顯著增加之針對Jeko1之活性(圖11a)。針對KARPAS422細胞系，NOV1216、NOV0281、NOV0308及NOV0563顯示大致類似之活性，且NOV1216活性略高(圖11b)。如所預期，非標靶IgG1 Fc野生型陰性對照抗體在該等分析中無活性。
實例12：FC WT人類CD32B結合抗體在已建立播散性JEKO1異種移植物中之活體內抗腫瘤活性.
在包含已建立外套細胞淋巴瘤Jeko1播散性異種移植物之SCID.Beige小鼠中評估5種Fc WT人類IgG1 CD32b結合抗體之抗腫瘤活性。經由尾靜脈向雌性SCID.Beige小鼠中靜脈內(i.v.)注射1×106 個經穩定轉染具有組成型活性啟動子驅動之螢光素酶表現之Jeko1細胞。使細胞懸浮於PBS中並向小鼠i.v.接種最終體積0.2ml之細胞懸浮液。藉由向小鼠腹膜內(i.p.)注射10ml/kg螢光素(15mg/ml)並在螢光素投與後10分鐘開始用Xenogen IVIS-200光學活體內成像系統(Perkin Elmer)成像來評價主要限制於骨髓隙(例如，後股骨、脊椎骨、下頜骨；數據未顯示)且表示為相對光單位(RLU)之全身腫瘤負荷。藉由使未投與螢光素之小鼠成像來評價背景RLU。
使小鼠成像並在細胞接種後10天以1.2×106 RLU之平均腫瘤負荷入選研究。在隨機分配至5個組(n=5/組)中之一組後，向小鼠投與單一5mg/kg i.v.注射之PBS、NOV0281、NOV1216、NOV0308或NOV0563。每週兩次將小鼠稱重並成像以評價體重及全身腫瘤負荷之變化。
在細胞植入後22天(在治療投與後10天)評價腫瘤負荷，其表示為T/C百分比(非標靶IgG1治療之小鼠之δ RLU除以經治療小鼠之δ RLU)。如所預期，腫瘤負荷在投與非標靶陰性對照抗體後快速增加。所有CD32b結合抗體皆在單一靜脈內注射後有效控制腫瘤生長，且NOV1216及NOV0563活性最高(分別為3%及2% T/C)(圖12)。
實例13：FC WT NOV1216在載有已建立DAUDI異種移植物之小鼠中之劑量反應活體內效能研究
為進一步評價Fc WT NOV1216之活體內活性，在包含已建立柏基特淋巴瘤(Burkett’s lymphoma)Daudi異種移植物之小鼠中實施劑量反應效能研究。向雌性裸小鼠皮下植入懸浮於經PBS稀釋之50%無酚紅基質膠(BD Biosciences)中之5×106 個Daudi細胞(100μl注射體積)。小鼠在植入後18天以140mm3 之平均腫瘤體積入選研究。在隨機分配至5個實驗組(n=6/組)中之一組後，每週向小鼠投與靜脈內注射之以下中之一種：PBS、Fc沉默之NOV1216 N297A(20mg/kg qw*12)或Fc WT NOV1216(5、10或20mg/kg qw*12)。在細胞植入後35天及治療投與後18天評價腫瘤負荷，其表示為T/C百分比(PBS治療小鼠之δ腫瘤體積除以經治療小鼠之δ腫瘤體積)。亦評估至終點之時間，該終點定義為腫瘤達到800mm3 。
用Fc WT NOV1216觀察劑量依賴性抗腫瘤活性及至終點之時間。最高劑量顯示最牢固抗腫瘤活性(4%T/C，在植入後35天)及最長的至終點之時間(圖13)。Fc沉默之NOV1216 N297A抗體對腫瘤體積及至終點之時間之效應極其有限。該等資料顯示，NOV1216在裸小鼠中具有針對已建立柏基特淋巴瘤Daudi異種移植物之牢固且耐久之Fc依賴性抗腫瘤活性。
實例14：在報導基因分析或原代NK細胞驅動之細胞溶解中對針對CD16A 活化之FC修飾之評價
在活體外研究無岩藻糖基化(抗體經產生具有缺少核心岩藻糖之N-聚醣結構，如上文實例3中所述)或Fc工程化(eADCC Fc突變S239D/A330L/I332E)增強NOV1216 ADCC功能之能力。在Jurkat-NFAT報導基因分析及原代NK細胞ADCC分析中評估Fc活性。
Fc WT 、無岩藻糖基化及Fc 經修飾之(eADCC 或N297A)CD32b 結合NOV1216 在Jurkat-NFAT 報導基因系統中活化人類CD16a 之能力
使用Jurkat-NFAT報導基因分析評價CD32b結合抗體結合CD32b陽性標靶細胞且隨後活化Jurkat-NFAT v158報導基因細胞上之CD16a之能力。使用具有可變量之CD32b表現之標靶細胞系(DAUDI；ATCC CCL-213及Jeko-1；DSMZ ACC533)。在此分析中剖析NOV1216 Fc WT及使用多種Fc工程化策略之形式。該等包括NOV1216之Fc增強之(無岩藻糖基化及eADCC Fc突變)及Fc沉默之(N297A)形式。收集細胞系，在PBS(Gibco 14190-144)中洗滌，在分析培養基(RPMI Glutamax(61870-036)+10% FBS(Gibco 26140-079))中再懸浮至0.5×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分至96孔白色板(Costar編號3917)中。收集Jurkat NFAT v158報導基因細胞系，在PBS中洗滌，在分析培養基中再懸浮至3×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分，得到6：1之最終效應物對標靶比率。以一式三份製備每一抗體(Fc野生型、N297A或eADCC Fc突變體)之七點1：10連續稀釋液。對照孔包括單獨之Jurkat NFAT v158報導基因細胞、Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及抗體、或Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及CD32b陽性標靶細胞系。將Bright Glo(Promega編號E2620)添加至除了適當陰性對照孔以外之每個孔(60μl/孔)，且隨後在Envision(Perkin Elimer)上讀取板。將所 得發光信號針對每一抗體在細胞系內之最高信號正規化。將此最高信號指定為「100」且細胞系內之所有其他抗體信號皆針對其正規化。使用Daudi及Jeko-1標靶細胞系二者時，無岩藻糖基化及eADCC Fc突變體NOV1216產生類似之高於使用Fc WT NOV1216觀察到之CD16a活化(圖14a、圖14b)。如所預期，Fc沉默之NOV1216 N297A在此報導基因分析中未活化CD16a。
Fc WT 及Fc 修飾( 無岩藻糖基化或N297A) 之CD32b 結合NOV1216 引發原代NK 細胞驅動之針對CD32b 陽性標靶細胞之ADCC 活性之能力
藉由經分離人類天然殺手細胞殺死CD32b陽性標靶細胞之能力量測CD32b抗體之Fc依賴性ADCC活性。在此分析中使用之CD32b標靶細胞係DAUDI(ATCC CCL-213)及Jeko-1(DSMZ ACC533)。簡言之，經由聚蔗糖梯度(GE Healthcare 17-1440-02)自Leukopak(HemaCare目錄號PB001F-3)分離PBMC。然後使用Miltenyi珠粒(目錄號130-092-657)對NK細胞進行陰性選擇，然後在基礎培養基中培育過夜(RPMI/10%FBS/1%抗有絲***素/抗生素)。在後一天，用鈣黃綠素乙醯氧基-甲基酯(Calcein-AM；Molecular Probes目錄號C3100MP)對CD32b陽性標靶細胞進行染色，洗滌兩次，並以10,000個細胞/孔之濃度轉移至96孔U形底微量滴定板。然後將細胞與抗體之連續稀釋液一起預培育20分鐘，之後以20：1之效應物對標靶比率添加效應細胞。在4.0小時共培育後，將微量滴定板離心並將上清液流體之等份試樣轉移至另一微量滴定板(Corning Costar，目錄號3904)且用EnVision讀板儀(Perkin Elmer)測定溶液中游離鈣黃綠素之濃度。
為計算標靶細胞之抗體特異性溶解，無抗體或效應細胞之標靶細胞 之平行培育用作基線對照(自發釋放)，而陽性對照或最大釋放係藉由僅使用1% Triton-X 100溶液之標靶細胞之溶解來測定。特異性溶解百分比係使用以下公式來計算：(樣品-自發)/(最大釋放-自發)*100%。在所評估之兩種細胞系中，NOV1216之無岩藻糖基化形式之活性高於Fc WT形式(圖14c、圖14d)。如所預期，NOV1216之Fc沉默之N297A形式無活性。
Fc WT 及Fc 經修飾(eADCC Fc 突變體或N297A) 之CD32b 結合抗體引發針對CD32b 陽性Jeko-1 細胞之原代NK 細胞驅動之ADCC 活性之能力
在第三實驗中，藉由經分離人類天然殺手細胞殺死CD32b陽性Jeko-1細胞(DSMZ ACC533)之能力量測一組CD32b抗體之Fc依賴性ADCC活性。簡言之，經由聚蔗糖梯度(GE Healthcare 17-1440-02)自Leukopak(HemaCare目錄號PB001F-3)分離PBMC。然後使用Miltenyi珠粒(目錄號130-092-657)對NK細胞進行陰性選擇。用10ng/ml I1-2(Peprotech編號200-02)將該等效應細胞刺激過夜。在後一天，用鈣黃綠素乙醯氧基-甲基酯(Calcein-AM；Molecular Probes目錄號C3100MP)將Jeko-1細胞染色，洗滌兩次，並以10,000個細胞/孔之濃度轉移至96孔U形底微量滴定板。然後將細胞與抗體之連續稀釋液一起預培育20分鐘，之後以3：1之效應物對標靶比率添加效應細胞。在共培育後，將微量滴定板離心並將上清液流體之等份試樣轉移至另一微量滴定板(Corning Costar，目錄號3904)且用EnVision讀板儀(Perkin Elmer)測定溶液中游離鈣黃綠素之濃度。
為計算標靶細胞之抗體特異性溶解，無抗體或效應細胞之標靶細胞之平行培育用作基線對照(自發釋放)，而陽性對照或最大釋放係藉由僅使用1% Triton-X 100溶液之標靶細胞之溶解來測定。特異性溶解百分比係使用以下公式來計算：(樣品-自發)/(最大釋放-自發)*100%。在所剖析 之每一抗體(NOV0281、NOV1216及NOV1218)之情形中，eADCC Fc修飾相對於Fc WT IgG1提高ADCC活性(圖15)。如所預期，抗體之Fc沉默之N297A形式在此分析中活性最低。
實例15：在使用特徵為一系列人類CD32B表現之標靶細胞之報導基因分析中對NOV1216之FC WT、eADCC FC突變體及N297A形式活化CD16A之評價
使用Jurkat-NFAT報導基因分析用一組特徵為一系列人類CD32b表現之標靶細胞系評價CD32b結合抗體活化Jurkat-NFAT v158報導基因細胞上之CD16a之能力。CD32b陽性標靶細胞系如下：Lama-84(DSMZ ACC168)、Jeko-1(DSMZ ACC 553)、Karpas-620(DSMZ ACC 514)、MOLP-2(DSMZ ACC 607)及Raji(ATCC CCL-86)。CD32b陰性Ramos細胞系(ATCC CRL-1596)用作陰性對照。在此實驗中剖析NOV1216之Fc WT、eADCC Fc突變體(S239D/A330L/I332E)及N297A形式。
簡言之，收集細胞系，在PBS(Gibco 14190-144)中洗滌，在分析培養基(RPMI Glutamax(61870-036)+10% FBS(Gibco 26140-079))中再懸浮至0.5×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分至96孔白色板(Costar編號3917)中。收集Jurkat NFAT v158報導基因細胞系，在PBS中洗滌，在分析培養基中再懸浮至3×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分，得到6：1之最終效應物對標靶比率。以一式三份製備每一抗體(Fc野生型、N297A或eADCC Fc突變體)之七點1：10連續稀釋液。對照孔包括單獨之Jurkat NFAT v158報導基因細胞、Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及抗體、或Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及CD32b陽性標靶細胞系。將Bright Glo(Promega編號E2620)以60μl/孔添加至除了適當陰性對照孔以外之每 個孔，且隨後在Envision(Perkin Elmer)上讀取板。將所得發光信號針對每一抗體在細胞系內之最高信號正規化。將此最高信號指定為「100」且細胞系內之所有其他抗體信號皆針對其正規化。NOV1216之Fc WT及eADCC Fc突變體形式二者在此分析中皆引發CD16a之活化，且後一Fc增強形式產生更穩健信號(圖16)。此在所剖析之所有細胞系中皆觀察到，CD32b陰性Ramos細胞系除外。如所預期，Fc沉默之NOV1216 N297A在此報導基因分析中未活化CD16a。
實例16：在使用特徵為一系列人類CD32B表現之標靶細胞之報導基因分析中對CD16A之無岩藻糖基化CDR-H3突變體CD32B結合抗體活化之評價.
使用Jurkat-NFAT報導基因分析用一組特徵為一系列人類CD32b表現之標靶細胞系評價無岩藻糖基化(afuc)CD32b結合CDR-H3抗體活化Jurkat-NFAT v158報導基因細胞上之CD16a之能力。CD32b陽性標靶細胞系如下：Daudi(ATCC CCL-213)、親代BJAB(DSMZ,ACC 757)及KARPAS422(Sigma Aldrich 06101702)及表現人類CD32b之穩定BJAB細胞。
簡言之，收集細胞系，在PBS(Gibco 14190-144)中洗滌，在分析培養基(RPMI Glutamax(61870-036)+10% FBS(Gibco 26140-079))中再懸浮至0.5×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分至96孔白色板(Costar編號3917)中。收集Jurkat NFAT v158報導基因細胞系，在PBS中洗滌，在分析培養基中再懸浮至3×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分，得到6：1之最終效應物對標靶比率。以一式三份製備每一無岩藻糖基化抗體(NOV1216、NOV2106、NOV2107、NOV2108)之五點1：10連續稀釋液。對照孔包括 單獨之Jurkat NFAT v158報導基因細胞、Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及抗體、或Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及CD32b陽性標靶細胞系。將Bright Glo(Promega編號E2620；60μl)添加至除了適當陰性對照孔以外之所有孔，且隨後在Envision(Perkin Elmer)上讀取板。所有三種無岩藻糖基化CD32b結合CDR-H3突變體(NOV2106、NOV2107、NOV2108)及無岩藻糖基化NOV1216且有效活化CD16a(圖17)。在三種CD32b陽性細胞系之每一種中觀察到穩健CD16a活化。如所預期，NOV1216之N297A Fc沉默之形式在此報導基因分析中未活化CD16a。
實例17：在原代NK細胞分析中評價無岩藻糖基化CDR-H3突變體抗體ADCC活性.
在原代NK 細胞ADCC 分析中無岩藻糖基化NOV1216 及CDR-H3 突變體NOV2106、NOV2107 及NOV2108 之活性
使用原代NK細胞ADCC分析評價無岩藻糖基化CDR-H3突變體及無岩藻糖基化NOV1216之Fc依賴性活性。CD32b陽性Daudi(ATCC CCL-213)及KARPAS422(Sigma Aldrich 06101702)細胞用作標靶細胞。
簡言之，經由聚蔗糖梯度自Leukopak(HemaCare目錄號PB001F-3)分離PBMC。然後使用Miltenyi珠粒(目錄號130-092-657)對NK細胞進行陰性選擇，然後在基礎培養基中培育過夜(RPMI/10%FBS/1%抗有絲***素/抗生素)。在後一天，用鈣黃綠素乙醯氧基-甲基酯(Calcein-AM；Molecular Probes目錄號C3100MP)將Daudi及Karpas 422細胞染色，洗滌兩次，並以10,000個細胞/孔之濃度轉移至96孔U形底微量滴定板。然後將細胞與抗體之連續稀釋液一起預培育20分鐘，之後以20：1之效應物對標靶比率添加效應細胞。在共培育後，將微量滴定板離心並將上清液流體之等 份試樣轉移至另一微量滴定板(Corning Costar，目錄號3904)，並用螢光計數器(Envision,Perkin Elmer)測定溶液中游離鈣黃綠素之濃度。
為計算標靶細胞之抗體特異性溶解，無抗體或效應細胞之標靶細胞之平行培育用作基線對照(自發釋放)，而陽性對照或最大釋放係藉由僅使用1% Triton-X 100溶液之標靶細胞之溶解來測定。特異性溶解百分比係使用以下公式來計算：(樣品-自發)/(最大釋放-自發)*100%。所有三種無岩藻糖基化CDR-H3突變體抗體(NOV2106、NOV2107及NOV2108)及無岩藻糖基化NOV1216皆顯示Daudi及Karpas422標靶細胞系二者之穩健特異性細胞溶解(圖18)。如所預期，非標靶無岩藻糖基化抗體在此分析中無活性。
在原代NK 細胞ADCC 分析中無岩藻糖基化NOV1216 及CDR-H3 突變體NOV2107 及NOV2108 之活性
在另一實驗中，使用原代NK細胞ADCC分析評價無岩藻糖基化CDR-H3突變體抗體及無岩藻糖基化NOV1216之Fc依賴性活性。CD32b陽性Daudi(ATCC CCL-213)細胞用作標靶細胞。
簡言之，經由聚蔗糖梯度自外包(outsourced)Leukopak(HemaCare目錄號PB001F-3)分離PBMC。然後使用Miltenyi珠粒(目錄號130-092-657)對NK細胞進行陰性選擇並用100pg/ml IL-2(Peprotech編號200-02)刺激過夜。在後一天，用鈣黃綠素乙醯氧基-甲基酯(Calcein-AM；Molecular Probes目錄號C3100MP)將Daudi及Karpas 422細胞染色，洗滌兩次，並以10,000個細胞/孔之濃度轉移至96孔U形底微量滴定板。然後將細胞與抗體之連續稀釋液一起預培育20分鐘，之後以3：1之效應物對標靶比率添加效應細胞。在共培育後，將微量滴定板離心並將上清液流體之等 份試樣轉移至另一微量滴定板(Corning Costar，目錄號3904)，並用螢光計數器(Envision,Perkin Elmer)測定溶液中游離鈣黃綠素之濃度。
為計算標靶細胞之抗體特異性溶解，無抗體或效應細胞之標靶細胞之平行培育用作基線對照(自發釋放)，而陽性對照或最大釋放係藉由僅使用1% Triton-X 100溶液之標靶細胞之溶解來測定。特異性溶解百分比係使用以下公式來計算：(樣品-自發)/(最大釋放-自發)*100%。兩種無岩藻糖基化CDR-H3突變體抗體NOV2107及NOV2108以及無岩藻糖基化NOV1216顯示Daudi標靶細胞之穩健特異性細胞溶解(圖19)。
實例18：NOV1216之FC WT、eADCC FC突變體及N297A形式針對DAUDI異種移植物模型之活體內活性.
為探索eADCC Fc突變(S239D/A330L/1332E)對NOV1216活體內活性之效應，在包含已建立柏基特淋巴瘤Daudi異種移植物之小鼠中實施效能研究。向雌性裸小鼠皮下植入懸浮於經PBS稀釋之50%無酚紅基質膠(BD Biosciences)中之5×106 個Daudi細胞(100μl注射體積)。小鼠在植入後18天以140mm3 之平均腫瘤體積入選研究。在隨機分配至4個實驗組(n=6/組)中之一組後，每週向小鼠投與靜脈內注射之以下中之一種：PBS、Fc沉默之NOV1216 N297A(20mg/kg qw*12)、Fc WT NOV1216(10mg/kg qw*12)或NOV1216eADCC Fc突變體(10mg/kg qw*3)。在細胞植入後35天及治療投與後18天評價腫瘤負荷，其表示為T/C百分比(PBS治療小鼠之δ腫瘤體積除以經治療小鼠之δ腫瘤體積)。亦評估至終點之時間，該終點定義為腫瘤達到800mm3 。
與活體外觀察一致，在活體內包含eADCC Fc突變之NOV1216之活性高於Fc WT NOV1216，如在細胞植入後34天之較小腫瘤體積及至終點 之時間所說明(圖20)。Fc沉默之NOV1216 N297A抗體對腫瘤體積及至終點之時間之效應極其有限。該等資料顯示，在已建立活體內異種移植物模型中，Fc增強之NOV1216 eADCC Fc突變體之活性高於Fc wt NOV1216。重要的是，NOV1216 eADCC Fc突變體之抗腫瘤反應相當耐久，如以下事實所證實：相對於以qw*12給藥之其他實驗組，儘管僅接受三次i.v.劑量(即qw*3)，至終點之時間仍有所延長。
實例19：無岩藻糖基化NOV1216及無岩藻糖基化CDR-H3突變體之針對DAUDI異種移植物之活體內抗腫瘤活性
在已建立柏基特淋巴瘤Daudi異種移植物中實施多劑量效能研究以評價CD32b結合之無岩藻糖基化NOV1216抗體及無岩藻糖基化CDR-H3突變體抗體NOV2106、NOV2107及NOV2108之活體內活性。向雌性裸小鼠皮下植入在含有PBS(100μl總注射體積)中之50%無酚紅基質膠(BD Biosciences)之懸浮液中之5×106 個Daudi細胞。小鼠在植入後13天以197mm3 之平均腫瘤體積入選研究。在隨機分配至4組(n=6/組)中之一組後，每週向小鼠投與靜脈內注射之PBS(10ml/kg qw*3)或20mg/kg qw*3之以下無岩藻糖基化抗體中之一者：NOV1216、NOV2106、NOV2107或NOV2108。所有四種CD32b結合抗體皆具有活性，產生穩健腫瘤生長控制(圖21)。
實例20：在報導基因分析中用FC沉默之NOV1216 N297A阻斷CD32B增強利妥昔單抗及奧妥珠單抗活化CD16A之能力.
實施研究以在Jurkat-NFAT報導基因分析中評估人類CD32b表現CD20陽性細胞對利妥昔單抗及奧妥珠單抗活化CD16a之能力之影響。亦評估組合Fc沉默之NOV1216與利妥昔單抗或奧妥珠單抗對其活化CD16a 之能力之後果。
CD32b陰性親代Ramos細胞係自ATCC(CRL-1596)獲得且生成穩定表現人類CD32b之Ramos細胞。簡言之，對於外源性表現人類CD32b之穩定Ramos細胞系之生成，使用Gateway技術用Gateway LR Clonase II酶混合物(Invitrogen 11791-020)將全長人類CD32b1序列(UniProtKB P31994-1)***慢病毒表現載體OPS_v19_pLenti6.3-EF1a-gw中。為生成病毒，之後將huCD32b1 /V19質體與包裝載體PCG及VSV-G在TransIT-193轉染劑(Mirus MIR2700)及Optimem無血清培養基(Invitrogen編號11058021)中混合。將混合物在室溫下培育20分鐘，然後添加至Biocoat膠原塗佈之10cm板(BD編號356450)上之HEK-293T細胞。第二天，將培養基更換為DMEM(Gibco 11965-092)+10%FBS(Gibco 26140-079)+1X NEAA(Gibco 11965-092)並返回至37℃保持72小時。在病毒收穫時，收集上清液，彙集並經由0.45uM乙酸纖維素過濾器(Corning編號430314)過濾。
對於用病毒轉導穩定Ramos細胞系，將1×106 個細胞平鋪於平底24孔板(Costar 3526)中。向細胞添加1ml升溫至37℃之CD32b1/V19病毒及8ug/ml聚凝胺(Sigma H9268)。使細胞在室溫下以2250rpm旋轉1.5小時。然後移除病毒上清液並將3ml新鮮培養基添加至細胞，然後將其轉移至6孔板(Costar 3516)。將細胞在37℃下培育2天，之後轉移至T25燒瓶中。一旦細胞完全回收，施加含有殺稻瘟菌素(Blasticidin)之選擇性培養基。最終穩定系係如藉由流式細胞術所測定，相對於未經轉導之親代系，一致地表現大量人類CD32b1之彙集群體。
一旦發展出該等細胞系，將其收集，在PBS(Gibco 14190-144)中洗滌，在分析培養基(RPMI Glutamax(61870-036)+10% FBS(Gibco 26140-079))中再懸浮至0.5×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分至96孔白色板(Costar編號3917)中。收集Jurkat NFAT v158報導基因細胞系，在PBS中洗滌，在分析培養基中再懸浮至3×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分，得到6：1之最終效應物對標靶比率。以一式三份製備利妥昔單抗或奧妥珠單抗之七點1：10連續稀釋液。自僅含有利妥昔單抗或奧妥珠單抗之對照孔排除Fc沉默之NOV1216 N297A以用作基線對照或將其與30μg/ml利妥昔單抗或奧妥珠單抗組合。將所有連續稀釋液以一式三份平鋪。對照孔包括單獨之Jurkat NFAT v158報導基因細胞、Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及抗體、或Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及標靶陽性標靶細胞系。將Bright Glo(Promega編號E2620)以60μl/孔添加至除了適當陰性對照孔以外之每個孔，且隨後在Envision(Perkin Elmer)上讀取板。
利妥昔單抗及奧妥珠單抗二者皆有效結合至Ramos細胞並活化報導基因細胞上之CD16a，而此活化在Ramos細胞上過表現人類CD32b時較弱，表明CD32b正在干擾CD20標靶之利妥昔單抗(圖22，上圖)及奧妥珠單抗(圖22，下圖)之CD16a活化。在與單獨之Ramos huCD32b細胞一起培育時，NOV1216 N297A(Fc沉默之)無法活化報導基因細胞上之CD16a。然而，相對於與單獨之利妥昔單抗或奧妥珠單抗一起培育之細胞，與利妥昔單抗或奧妥珠單抗組合之NOV1216 N297A促進Ramos huCD32b對CD16a之活化。綜上所述，該等資料顯示，在CD32b及CD20在相同標靶細胞上共表現時，NOV1216 N297A增強利妥昔單抗及奧妥珠單抗之CD16a活化。認為該增強係由於阻斷CD32b結合至利妥昔單抗及奧妥珠單抗之Fc部分所致。
實例21：用FC沉默之NOV1216 N297A或FC沉默之N297A CDR-H3突變 體抗體阻斷CD32B增強利妥昔單抗活化CD16A之能力.
實施研究以CD20及CD32b陽性BJAB細胞作為標靶細胞系評估組合Fc沉默之NOV1216及Fc沉默之CDR-H3突變體抗體NOV2106、NOV2107及NOV2018與利妥昔單抗對利妥昔單抗活化CD16a之能力之影響。
BJAB細胞係自(DSMZ；ACC 757)獲得且經工程化以穩定表現人類CD32b1(使用實例20中概述之相同方法產生)。簡言之，收集細胞系，在PBS(Gibco 14190-144)中洗滌，在分析培養基(RPMI Glutamax(61870-036)+10% FBS(Gibco 26140-079))中再懸浮至0.5×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分至96孔白色板(Costar編號3917)中。收集Jurkat NFAT v158報導基因細胞系，在PBS中洗滌，在分析培養基中再懸浮至3×106 個細胞/ml，且以30μl/孔等分，得到6：1之最終效應物對標靶比率。以一式三份製備利妥昔單抗之七點1：10連續稀釋液。自僅含有利妥昔單抗之對照孔排除NOV1216、NOV2106、NOV2107或NOV2108之Fc沉默之N297A變體以用作基線對照或將其與30μg/ml利妥昔單抗組合。對照孔包括單獨之Jurkat NFAT v158報導基因細胞、Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及抗體、或Jurkat NFAT v158報導基因細胞系及標靶陽性標靶細胞系。將Bright Glo(Promega編號E2620)以60μl/孔添加至除了適當陰性對照孔以外之每個孔，且隨後在Envision(Perkin Elmer)上讀取板。結合至hCD32b BJAB細胞之利妥昔單抗有效活化報導基因細胞上之CD16a。相對於與單獨之利妥昔單抗一起培育之細胞，與利妥昔單抗組合之NOV1216、NOV2106、NOV2107或NOV2108 Fc沉默之N297A變體促進BJAB huCD32b之CD16a活化(圖23)。綜上所述，該等資料顯示，在CD32b及CD20於相同標靶細胞上共表現時，Fc沉默之CD32b標靶抗體增 強利妥昔單抗之CD16a活化。一種解釋係，該增強係由於阻斷CD32b結合至利妥昔單抗之Fc部分所致。
實例22：NOV1216 eADCC FC突變體作為單一藥劑或與利妥昔單抗或奧妥珠單抗組合在DAUDI異種移植物模型中之活體內抗腫瘤活性.
上文所述活體外發現顯示，CD32b之表現降低利妥昔單抗(I型)及奧妥珠單抗(II型)CD20標靶治療劑及與該等CD20標靶治療劑中之每一者牢固組合之CD32b標靶Ab之Fc依賴性活性。為探索該等活體內觀察，在包含已建立柏基特淋巴瘤Daudi異種移植物之小鼠中實施組合效能研究。向雌性裸小鼠皮下植入5×106 個Daudi細胞。將細胞懸浮於含有PBS中之50%無酚紅基質膠(BD Biosciences)之懸浮液中。含有懸浮液中之細胞之總注射體積為100μl。小鼠在植入後18天以201mm3 之平均腫瘤體積入選研究。在隨機分配至6個組(n=7/組)中之一組後，每週向小鼠投與靜脈內注射(10mg/kg qw)之利妥昔單抗、奧妥珠單抗、NOV1216 eADCC Fc突變體(S239D/A330L/I332E)、利妥昔單抗+NOV1216 eADCC Fc突變體(各自10mg/kg qw)或奧妥珠單抗+NOV1216 eADCC Fc突變體(各自10mg/kg qw)。在細胞植入後31天及在治療投與後18天評價腫瘤負荷且其表示為T/C百分比(PBS治療小鼠之δ腫瘤體積除以經治療小鼠之δ腫瘤體積)。亦評估至終點之時間，該終點定義為腫瘤達到800mm3 。
在治療起始後31天，使用單一藥劑利妥昔單抗或奧妥珠單抗(分別為69% T/C及55% T/C)觀察到有限抗腫瘤活性，而NOV1216 eADCC Fc突變體顯示穩健抗腫瘤活性(17% T/C)(圖24)。此轉變為至終點之時間之差異。NOV1216 eADCC Fc突變體與利妥昔單抗或奧妥珠單抗之組合導致至終點之時間相對於每一單一藥劑有所延長(圖24)。
實例23：用FC沉默之N297A CDR-H3突變體抗體NOV2108阻斷CD32B增強達雷木單抗活化CD16A之能力.
CD38在多發性骨髓瘤細胞上表現且抗CD38抗體達雷木單抗最近已經FDA批准用於治療多發性骨髓瘤。在CD32b及CD38在相同細胞上共表現時，CD32b可能可結合至達雷木單抗之Fc並導致治療性抗體內化或隔離達雷木單抗Fc活化在效應細胞上表現之FcγR。此實例評估NOV2108是否可阻斷CD32b與達雷木單抗Fc之結合並由此容許達雷木單抗更穩健地活化CD16a(FcγRIIIa)。
MM1.S細胞係自ATCC(CRL-2974)獲得。收集親代MM1.S細胞及穩定表現人類CD32b1之MM1.S細胞(使用實例20中概述之相同方法產生)，在PBS(Gibco 14190-144)中洗滌，再懸浮於分析培養基(RPMI Glutamax(Gibco 61870-036)+10% FBS(Gibco 26140-079))中並以15,000個細胞/孔等分至96孔白色板(costar編號3917)中。將Jurkat NFAT v158報導基因細胞系以90,000個細胞/孔添加至每孔中。以10ug/ml之開始濃度製備達雷木單抗之八點1：10連續稀釋液。以10ug/ml向含有達雷木單抗與NOV2108之組合之每孔中添加飽和量之NOV2108-N297A抗體。所有條件皆係以一式三份平鋪。對照孔包括單獨之報導基因細胞、報導基因細胞及抗體、或報導基因細胞及MM1.S或MM1.S huCD32b細胞。將板在37℃培育器及5% CO2 中培育4小時。在共培育後，將Britelite plus(Perkin Elmer，目錄號6066769；70μl)添加至除了背景對照孔以外之所有孔。隨後在Envision(Perkin Elmer)上讀取所得發光且之後使用Prism軟體繪製曲線。結合至MM1.S細胞之達雷木單抗有效活化報導基因細胞上之CD16a，而此活化在MM1.S細胞上過表現人類CD32b時較弱，表明 CD32b正在干擾達雷木單抗之CD16a活化(圖25)。在與單獨之MM1.S huCD32b細胞一起培育時，NOV2108-N297A(Fc沉默之)無法活化報導基因細胞上之CD16a。然而，相對於與單獨之達雷木單抗一起培育之細胞，與達雷木單抗組合之NOV2108-N297A增強MM1.S huCD32b之CD16a活化。綜上所述，該等資料顯示，在CD32b及CD38於相同標靶細胞上共表現時，NOV2108-N297A增強達雷木單抗之CD16a活化。所觀察到之增強之一種解釋係，抗CD32b抗體阻斷CD32b結合至達雷木單抗之Fc部分，從而使Fc部分可用於與活化性Fc γ受體(例如CD16a)之相互作用。
實例24：野生型及FC增強之NOV1216及NOV2108有效介導人類巨噬細胞之DAUDI標靶細胞殺死.
已顯示巨噬細胞作為有效效應細胞用於抗體介導之腫瘤細胞清除(參見Uchida等人，J Exp Med.199(12)：1659-69(2004)；Pallasch等人，Cell 156(3)：590-602(2014)；Overdijk等人，MAbs 7(2)：311-21(2015)；Dilillo等人，Cell 161(5)：1035-45(2015))。此實例評估Fc WT、Fc沉默之N297A突變體及無岩藻糖基化形式之抗體NOV1216；Fc WT、Fc沉默之N297A突變體及無岩藻糖基化形式之抗體NOV2108；及來自WO 2012/022985之抗CD32b抗體純系10之Fc WT及Fc沉默之N297A形式介導巨噬細胞之標靶細胞殺死之效率。抗體純系10之CDR、VH及VL序列似乎與來自WO2015/173384之抗體6G11一致。
實施巨噬細胞介導之細胞殺死分析以量測人類單核球源巨噬細胞(hMDM)殺死經調理CD32b+ 螢光素化Daudi細胞之能力。簡言之，使用聚蔗糖梯度離心自Leukopak(HemaCare，目錄號PB001F-3)分離PBMC。然後使用Miltenyi人類單核球分離套組II(目錄號130-091-153)對單核球進行 陰性選擇。將經分離單核球進一步以300,000個細胞/孔之濃度接種於96孔平底微量滴定板(Corning，目錄號3596)上且在補充有10ng/ml M-CSF(PeproTech，目錄號300-25)之完全巨噬細胞培養基[(X-VIVO15(Lonza，目錄號04-744Q)+10% FBS)]中培養7天。收穫螢光素化Daudi細胞並與抗體之連續稀釋液一起預培育10分鐘。將具有相應抗體之該等標靶細胞以10,000個細胞/孔轉移至hMDM板。包括具有或無抗體(無巨噬細胞)之標靶細胞作為對照。將板在37℃培育器及5% CO2 中培育4小時。在共培育後，將Britelite plus(Perkin Elmer，目錄號6066769；70μl)添加至除了背景對照孔(僅Daudi細胞)以外之所有孔。具有Britelite之標靶細胞用作最大信號對照，而無Britelite之標靶細胞用作背景對照。將上清液流體之等份試樣轉移至另一微量滴定板(Corning Costar，目錄號3917)且隨後在Envision(Perkin Elmer)上量測發光信號。使用下式計算標靶細胞之殺死百分比：[1-(樣品-背景)/最大值)]×100%。
Fc野生型(WT)抗體NOV1216或NOV2108介導Daudi細胞之穩健殺死，而WT純系10抗體顯示最小效應(圖26)。無岩藻糖基化進一步增強NOV1216或NOV2108之巨噬細胞介導之標靶細胞殺死。對於與同型(抗雞溶菌酶抗體)對照一起培育之Daudi細胞未觀察到巨噬細胞介導之殺死，指示細胞殺死需要抗體與Daudi細胞上表現之CD32b之特異性結合。另外，Fc沉默之(N297A)突變體抗體(NOV1216、NOV2108或純系10)未介導巨噬細胞之標靶細胞殺死，表明在此分析中細胞殺死需要巨噬細胞Fcγ受體之活化。
實例25：CD32B結合抗體2B6及NOV1216(FC WT及FC經修飾)對原代人類B細胞中基底及交聯之抗IGM刺激之pCD32B含量之影響.
已知交聯抗IgM可活化B細胞並隨後產生CD32b ITIM之磷酸化。實施一系列實驗以評價各種CD32b結合抗體對基底pCD32b含量(酪胺酸292)以及抗IgM刺激之pCD32含量之影響。
簡言之，藉由聚蔗糖梯度自所捐贈之人類全血分離PBMC。然後使用Miltenyi B細胞分離套組II(Miltenyi Biotech 130-091-151)及方案分離B細胞。將B細胞以1×106 個細胞/孔平鋪於24孔板(costar 3526)中之RPMI中。在實驗孔中設定為評價在交聯抗IgM存在或不存在下最終濃度5nM之CD32b結合抗體2B6(參見Rankin等人，2006 Blood 108(7)：2384-2391及美國專利第7,521,542號)或NOV1216抗體(Fc WT、eADCC Fc突變體(S239D/A330L/I332E)、無岩藻糖基化及N297A形式)對pCD32b含量之影響。對照孔無處理，僅具有交聯抗IgM，僅具有CD32b結合抗體，或僅具有無岩藻糖基化非標靶抗體(同型對照)。在37℃下培育10分鐘後，收穫B細胞並用含有Halt蛋白酶抑制劑(Thermo Scientific 78430)及Phosphostop(Roche 04-906-837-001)之Ripa緩衝液(Boston Bioproducts BP-115)溶解。使蛋白質溶解物還原，在PVDF凝膠(BioRad 170-4157)上運行，轉移至PVDF膜(BioRad 567-1084)，並用Odyssey封阻緩衝液(Licor 927-40000)封阻。用pCD32b(Abam ab68423)及β肌動蛋白(Abcam ab8226)一級抗體探測膜過夜，兩種抗體皆具有1：25000稀釋度。在四次洗滌(含有Tween之Tris緩衝鹽水(TBST)；Boston BioProducts 1BB-181X)後，添加以1：10000稀釋度於Odyssey封阻緩衝液中之二級抗體(IR800抗小鼠Licor 925-32210及IR680抗兔Licor 925-68071)。隨後洗滌膜(在TBST中四次，在Tris緩衝鹽水(Boston BioProducts BM-30IX)中一次)，然後在Odyssey CLx上讀取。將pCD32b信號針對β-肌動蛋白正規化且表示為僅抗IgM處 理之比率，該比率設定為100。如所預期，交聯抗IgM導致CD32b ITIM磷酸化增加(圖27)。抗體2B6(Fc wt、N297A及eADCC Fc突變體形式)係CD32b ITIM之有效激動劑，如pCD32b含量顯著增加所指示(圖27，左圖)。此與NOV1216(Fc wt、N297A、eADCC Fc突變體及無岩藻糖基化形式)相反，其缺少穩健pCD32b激動劑活性(圖27，右圖)。發現2B6之激動劑活性依賴於嚙合Fc，即Fc沉默之N297A形式不產生CD32b ITIM磷酸化。所有NOV1216形式皆具有精細減少交聯抗IgM活化CD32b之能力(圖27)。此在使用2B6時未觀察到。
實例26：無岩藻糖基化之CD32B結合抗體NOV1216在原代B細胞、DAUDI細胞及KARPAS422細胞中調節利妥昔單抗刺激之CD32B ITIM之能力.
已知利妥昔單抗可引起人類B細胞及CD20陽性癌細胞系上之CD32b ITIM磷酸化。實施若干個實驗以探索無岩藻糖基化之CD32b結合抗體NOV1216在原代B細胞及CD20陽性Daudi(ATCC；CCL-213)及Karpas422(Sigma Aldrich 06101702)癌細胞系中調節此利妥昔單抗驅動之pCD32b增加之能力。亦研究無岩藻糖基化NOV1216在該等細胞中對CD32b ITIM磷酸化之基底程度之效應。簡言之，藉由聚蔗糖分離自全血分離PBMC。然後使用Miltenyi B細胞分離套組II(Miltenyi Biotech 130-091-151)及方案自PBMC分離B細胞。將B細胞、Daudi細胞及Karpas422細胞以1×106 個細胞/孔平鋪於24孔板(costar 3526)中之RPMI中。用利妥昔單抗(50nM)刺激一半實驗孔。將無岩藻糖基化NOV1216以50nM之最終濃度添加至未經處理或利妥昔單抗刺激之孔二者。對照孔由未經處理、僅利妥昔單抗或僅無岩藻糖基化NOV1216組成。
在37℃下培育30分鐘後，收穫細胞並用含有Halt蛋白酶抑制劑(Thermo Scientific 78430)及Phosphostop(Roche 04-906-837-001)之Ripa緩衝液(Boston Bioproducts BP-115)溶解。使蛋白質溶解物還原，在PVDF凝膠(BioRad 170-4157)上運行，轉移至PVDF膜(BioRad 567-1084)，並用Odyssey封阻緩衝液(Licor 927-40000)封阻。用pCD32b(Abam ab68423)及β肌動蛋白(Abcam ab8226)一級抗體探測膜過夜，兩種抗體皆具有1：25000稀釋度。在四次洗滌(含有Tween之Tris緩衝鹽水(TBST)；Boston BioProducts 1BB-181X)後，添加以1：10000稀釋度於Odyssey封阻緩衝液中之二級抗體(IR800抗小鼠Licor 925-32210及IR680抗兔Licor 925-68071)。隨後洗滌膜(在TBST中四次，在Tris緩衝鹽水(Boston BioProducts BM-30IX)中一次)，然後在Odyssey CLx上讀取。
如在圖28中所見，相對於未經處理之對照，無岩藻糖基化NOV1216對CD32b ITIM磷酸化具有極小至無影響。如所預期，將利妥昔單抗添加至該等細胞群體導致CD32b之穩健激動作用，如pCD32b含量增加所證實。將無岩藻糖基化CD32b結合NOV1216與利妥昔單抗共培育顯著降低利妥昔單抗驅動之pCD32b含量增加(圖28)。此在原代B細胞以及CD20及CD32b陽性Daudi及Karpas422癌細胞系中可見。
實例27：CD32B蛋白在原發性患者多發性骨髓瘤樣品及兩種已確立細胞系上之表現
CD32b Fc受體在正常及惡性漿細胞二者上表現。藉由流式細胞術評估huCD32b特異性抗體與來自新鮮未加工骨髓(Lonza)及多發性骨髓瘤骨髓單核細胞患者樣品(Conversant)之正常人類漿細胞之結合。用PBS洗滌未加工骨髓，然後用RBG溶解緩衝液(eBioscience)處理以移除任何污染紅 血球。使用漿細胞分離套組II(Miltenyi Biotec 130-093-628)根據製造商說明書自骨髓單核細胞分離正常漿細胞。使多發性骨髓瘤患者樣品在37℃水浴中快速解凍並用預升溫之RPMI培養基逐滴稀釋。用RPMI培養基洗滌樣品，然後用RBC溶解緩衝液(eBioscience)處理以移除任何污染紅血球。使用腫瘤B細胞系JeKo-1(外套細胞淋巴瘤)及MOLP-2(多發性骨髓瘤)作為對照來評價huCD32b染色。
使正常及惡性漿細胞樣品再懸浮於0.5ml補充有20% FBS之FACS緩衝液(含有2% BSA、2mM EDTA之PBS)中並分配至96孔圓底板(100ul/孔)中。計數對照腫瘤樣品並以2×105 個細胞/孔分配至96孔圓底板中。然後將樣品在相同體積之含有FITC-CD38、PE-CD138、PE-Cy7-CD45及AlexaFluor 647-CD32b純系2B6[N297A]或AlexaFluor 647-hIgG1同型對照[N297A]之2×抗體混合劑中染色。將樣品在冰上培育30分鐘。在用FACS緩衝液2次連續洗滌後，將細胞再懸浮於稀釋於FACS緩衝液中之7-AAD染色溶液中並在BD LSR II流式細胞計數器上採集。使用CD45+CD38+CD138+分選中之中位螢光強度(AlexaFluor 647通道中之MFI)作為CD32b抗體結合強度之量度。正常漿細胞之CD32b染色強度低於對照腫瘤B細胞系，而5個多發性骨髓瘤患者樣品中之4個之CD32b染色強度高於對照腫瘤B細胞系及正常漿細胞二者(圖29)。該等資料指示，CD32b可為治療B細胞惡性病(包括多發性骨髓瘤)之期望標靶。
實例28：野生型及FC增強之NOV2108有效介導人類NK細胞之DAUDI標靶細胞殺死
在此實例中，測試上文實例24中所論述之抗CD32b抗體純系10及NOV2108之介導NK細胞之ADCC之能力。在以經分離人類天然殺手細胞 殺死DAUDI細胞之ADCC分析中測試呈無岩藻糖基化(Afuc)、野生型(WT)及N297A(經沉默)格式之NOV2108以及純系10(WT及N297A)。簡言之，經由聚蔗糖梯度(GE Healthcare 17-1440-02)自Leukopak(HemaCare目錄號PB001F-3)分離PBMC。然後使用Miltenyi珠粒(目錄號130-092-657)對NK細胞進行陰性選擇，然後在含有IL2之培養基中培育過夜(RPMI/10%FBS及0.1ng/ml IL-2)。將螢光素化Daudi細胞在96孔微量滴定板(Corning Costar，目錄號3917)中以10,000個細胞/孔之濃度與抗體之連續稀釋液一起預培育20分鐘。然後以3：1之效應物對標靶之比率添加NK細胞。在共培育2小時後，將Britelite plus(Perkin Elmer，目錄號6066769；70μl)添加至除了背景對照孔(僅Daudi細胞)以外之所有孔。含有Britelite之標靶細胞(無Ab或NK)用作最大信號對照，而無Britelite之標靶細胞用作背景對照。隨後在Envision(Perkin Elmer)上量測發光信號。使用下式計算標靶細胞之殺死百分比：[1-(樣品-背景)/最大值)]×100%。NOV2108-WT介導較純系10-WT Ab更有效之ADCC，而無岩藻糖基化NOV2108顯示進一步增強之Daudi細胞殺死(圖30)。
在NK介導及巨噬細胞介導之殺死分析(實例24)中，比較具有相同Fc格式(WT)之NOV2108及純系10，且NOV2108-WT介導較純系10-WT更穩健之兩種效應細胞類型之標靶細胞殺死。因此，與純系10相比，NOV2108係經改良抗CD32b ADCC抗體。
實例29：在GMB白血病模型之骨髓中評價具有不同FC功能突變之抗CD32B抗體在調節阿倫單抗或利妥昔單抗抗性中之作用
Leskov等人在「Rapid generation of human B-cell lymphomas via combined expression of Myc and Bcl2 and their use as a preclinical model for biological therapies」，Oncogene 32(8)：1066-72(Leskov等人，2013)中報導藉由在人類化小鼠之發育B細胞中共表現人類原癌基因myc及bcl-2二者之侵襲性人類B細胞白血病模型GMB。GMB白血病細胞對阿倫單抗敏感，阿倫單抗係對人類CD52具有特異性之人類化單株抗體，從而導致自NSG小鼠之脾、肝及血液而並非骨髓消除該等GMB白血病細胞。使用此模型，顯示巨噬細胞在頑固性骨髓微環境中係抗體介導之細胞毒性之關鍵決定因素。有趣的是，顯示一種抵抗阿倫單抗療法之機制係上調骨髓、而非脾中白血病細胞上之CD32b(FcγRIIb)，指示特定微環境因素調控ADCC活性(Pallasch等人(2014)「Sensitizing protective tumor microenvironments to antibody mediated therapy.」 Cell 156：590-162)。此外，在阿倫單抗抗性GBM細胞中經由shRNA敲低CD32b使該等細胞對阿倫單抗介導之ADCC殺死重新敏感。該等資料表明，增加之CD32b表現係抵抗阿倫單抗之機制。假定用阻斷CD32b Fc結合結構域之mAb標靶CD32b可產生與經由shRNA耗竭CD32b類似之結果。另外，共投與阿倫單抗(或具有Fc依賴性作用模式之其他mAb)及抗CD32b mAb可延遲抵抗之發作。
GMB白血病細胞以巨噬細胞依賴性方式對阿倫單抗介導之殺死敏感(Pallasch等人2014)。在已發表研究中，將GMB白血病細胞轉移至缺少人類免疫細胞之非人類化NSG小鼠中。阿倫單抗成功地自NSG小鼠之脾、肝及血液而非骨髓消除GMB白血病細胞。
將在GMB白血病模型中藉由以下方式監測抗CD32b抗體(NOV1206 WT、Fc沉默、ADCC增強(S239D/A330L/I332E Fc增強之突變體))在調節阿倫單抗或利妥昔單抗抗性中之作用：給予抗CD32b標靶mAb且藉由在 活體標靶CD32b以恢復白血病細胞對阿倫單抗之敏感性在GMB活體內白血病模型中量測阿倫單抗或利妥昔單抗抗性之延遲或預防。若無法獲得阿倫單抗，則將使用利妥昔單抗來代替，之後確認BM中之利妥昔單抗抗性GBM細胞顯示上調之CD32b表現。
在此實例中，將用GMB白血病細胞接種NSG小鼠且隨機分配之以下實驗組中之一組：
第1組：PBS
第2組：如在Pallasch等人之論文中給予之阿倫單抗(或利妥昔單抗)
第3組：抗CD32b mAb(具有Fc沉默突變N297A)[20mg/kg i.v.qw]
第4組：抗CD32b mAb(Fc增強或WT Fc)[20mg/kg i.v.qw]
第5組：抗CD32b mAb(Fc增強或WT Fc)[20mg/kg i.v.qw]+阿倫單抗或利妥昔單抗
第6組：抗CD32b mAb(具有Fc沉默突變N297A)[20mg/kg i.v.qw]+阿倫單抗或利妥昔單抗
第7組：如Pallasch等人之論文中給予之阿倫單抗(或利妥昔單抗)及環磷醯胺。
將在抵抗阿倫單抗後自第2組小鼠骨髓收集GMB細胞並藉由FACS評價CD32b表現(未治療小鼠之時間匹配隊列將用作對照)。第3組將係評價抗CD32b mAb之非Fc依賴性單一藥劑活性之對照。第5組及第6組應揭露尤其在骨髓隙中，用Fc WT(或FC增強之)或Fc沉默之(N297A)mAb標靶CD32b對GMB疾病負荷及對反應耐久性之治療性影響。第6組應揭露尤其在骨髓中，在CD32b抗體之Fc功能不存在下，用CD32b標靶抗體阻斷CD32b對阿倫單抗或利妥昔單抗之反應深度及耐久性之特定影響(CDR特 異性活性)。此將有助於描繪源自抗CD32b mAb之Fc依賴性及CDR依賴性(非Fc依賴性)活性之治療性益處。
將用GMB白血病細胞接種NSG小鼠並用阿倫單抗或利妥昔單抗治療直至骨髓中之抗性發作為止，如Pallasch等人(2014)所述。若無法獲得阿倫單抗，則將使用利妥昔單抗來代替，之後確認BM中之利妥昔單抗抗性細胞顯示上調之CD32b表現。在骨髓中之阿倫單抗或利妥昔單抗抗性發作時，將小鼠隨機分配至以下實驗治療組中之一組。另外，在此時，一小鼠隊列將被安樂死且將收集骨髓隙中之GMB白血病細胞用於經由FACS評價CD32b表現且與未治療小鼠相比較。基於Pallasch之論文中之發現，預期骨髓中之阿倫單抗抗性GMB細胞具有增加之CD32b表現。
第1組：PBS
第2組：阿倫單抗或利妥昔單抗
第3組：抗CD32b mAb(N297A)
第4組：抗CD32b mAb(Fc增強或WT Fc)
第5組：抗CD32b mAb(Fc增強或WT Fc)+阿倫單抗
第6組：抗CD32b mAb(N297A)+阿倫單抗或利妥昔單抗
第7組：阿倫單抗或利妥昔單抗+環磷醯胺
第1組、第2組及第3組係對照組且預期其不影響病程。第4組應揭露用aFc增強之抗CD32b mAb處理阿倫單抗或利妥昔單抗抗性GMB之治療性益處。第5組及第6組應揭露Fc WT(或Fc增強之)及Fc沉默之(分別)抗CD32b mAb在骨髓利基(niche)中逆轉阿倫單抗或利妥昔單抗抗性之潛力。具有Fc沉默突變之後一組應明確揭露CD32b Fc結合結構域阻斷對GMB細胞對阿倫單抗或利妥昔單抗之反應之潛在效應(抗CD32b mAb之 CDR特異性活性)。
實例30：對抗CD32B AB之補體依賴性細胞毒性(CDC)活性之評價
實施一系列活體外研究以評價無岩藻糖基化NOV2108藉由補體依賴性細胞毒性(CDC)殺死CD32b陽性細胞之能力。在CDC分析中，將KARPAS-422細胞與不同抗體濃度及固定濃度之兔補體一起培育。在2h後藉由經由細胞內ATP濃度(即消耗ATP之螢光素-螢光素酶酶系統產生之發光)量測細胞之存活率來分析KARPAS-422細胞之濃度依賴性殺死。
收穫KARPAS-422細胞並調整至1.7×105 個細胞/mL之濃度並將50μl懸浮液添加至白色平底96孔微量滴定板之所有孔中。然後，在U形底微量滴定板中以一式三份製備無岩藻糖基化NOV2108(62.8mg/mL)及MabThera(批號H0165B09,10mg/mL)於分析緩衝液中之八次連續稀釋液，以得到30,000ng/mL、6000ng/mL、1200ng/mL、240ng/mL、48ng/mL、10ng/mL、2ng/mL及0.4ng/mL之最終分析濃度，並將50μl稀釋液轉移至含有KARPAS-422細胞之分析板中。最後，將50μl以1：8稀釋於分析緩衝液中之兔補體添加至分析板並將板在板振盪器上溫和搖動60s。
作為對照，以與樣品類似之方式模擬稀釋分析緩衝液。另外，一式八份包括含有無樣品及補體之細胞之空白對照、缺少抗體之陰性對照及缺少抗體但含有1% Tfiton X-100以供完全溶解細胞之陽性對照。
在37℃、5% CO2下培育2h後，將100μL經重構CellTiterGlo溶液添加至所有孔並將板在室溫下培育30分鐘且在最初15分鐘期間溫和振盪。最後，量測發光。
NOV2108及陽性對照MabThera在此CDC分析中顯示對KARPAS- 422細胞之劑量依賴性殺死(圖35)。該等資料顯示，無岩藻糖基化NOV2108能嚙合補體並藉由CDC殺死CD32b陽性細胞。如所預期，在此實驗中緩衝液對照未減少活細胞數。
實例31：巨噬細胞係CD32B陽性但對抗CD32B AB介導之溶解(藉由NK細胞)或吞噬作用(藉由其他巨噬細胞)之抗性更強
已知巨噬細胞表現CD32b以及FcγR家族之其他成員。巨噬細胞可能被抗CD32b抗體標靶並經由ADCC或ADCP機制殺死。
巨噬細胞表現CD32b.
首先確定抗CD32b抗體是否結合至巨噬細胞。如實例24中所述區分人類單核球源巨噬細胞。將附接至96孔平底板之巨噬細胞與Alexaflour 647標記之抗CD32b Ab 2B6(N297A Fc沉默之突變體)之0.5ug/ml染色溶液PBS+2% IFS一起在冰上培育30分鐘。在用FACS緩衝液連續洗滌兩次後，使細胞懸浮於120μl FACS緩衝液中且在FACS Fortessa上採集。使用Daudi細胞作為陽性對照且用相同染色條件作為懸浮液細胞來染色。使用Alexaflour647標記之抗雞溶菌酶Ab(N297A突變體)作為IgG對照。FACS直方圖顯示呈MFI之染色相對程度(x-軸)相對於所記錄事件數(y-軸)。藉由抗CD23b Ab 2B6染色(實線)與IgG對照之染色(填充虛線)疊加。巨噬細胞顯示與IgG對照之背景結合，如藉由多個FcγR(尤其FcγRI，高親和力Fc受體)所預期(圖36a)。結合至巨噬細胞之2B6高於IgG對照，指示巨噬細胞係CD32b陽性。然而，2B6與IgG對照對於巨噬細胞之變化小於Daudi細胞(圖36a、圖36b)。
巨噬細胞不如Daudi 對抗CD32b Ab 介導之NK 細胞之ADCC 敏感.
然後，在使用抗CD32b Ab NOV2108(無岩藻糖基化)之活體外 ADCC分析中比較巨噬細胞與Daudi。NK細胞自如實例17中所述不同之供體分離。在96孔平底板(4ug/ml，於含有10% FBS之RPMI中，60ul/孔)中用鈣黃綠素AM標記黏附型巨噬細胞1hr。用於巨噬細胞或Daudi之標靶細胞數為60,000/孔且120,000個NK細胞/孔用於2：1之效應物：標靶比率。如實例17中所述實施ADCC分析。在2hr後量測標靶細胞溶解。藉由NK細胞有效溶解Daudi細胞，而巨噬細胞對ADCC抗性更強(圖37)，僅在較高濃度之無岩藻糖基化NOV2108下觀察到低溶解程度。
巨噬細胞抵抗抗CD32b Ab 介導之ADCP
NOV2108可經由ADCP機制介導對CD32bpos細胞系Daudi之有效殺死(實例24)。由於巨噬細胞係CD32bpos，企圖確定巨噬細胞是否可在抗CD32b Ab存在下彼此吞噬。使用間時共焦成像使經細胞示蹤劑染料(Molecular Probes)標記之細胞之吞噬作用可視化。對於巨噬細胞區分，使用皮氏培養皿(petri dish)減少附接至表面之細胞。在無血清RPMI培養基中將效應細胞巨噬細胞用0.2μM細胞示蹤綠(目錄號C7025)標記10分鐘。將標靶細胞daudi或巨噬細胞用0.5uM細胞示蹤紅(目錄號C34552)標記10分鐘。在成像前一天標記效應物巨噬細胞(綠色)並平鋪於8孔μ-Slide(Ibidi，目錄號80826)上，而標靶細胞係在即將成像前標記。
成像係在具有40×/1.30 Oil Ph3物鏡之Zeiss轉盤式共焦顯微鏡(Axio Observer.Z1)上實施。拍攝Z-堆疊影像以使完整細胞成像(側向解析度約0.5um，軸向解析度約2um)。對於405nm(SYTOX®藍色)、488nm(CellTrackerTM 綠色CMFDA染料)、561nm(CellTraclkerTM 紅色CMTPX染料)及633nm(抗體標記之Alexa-647)雷射，將雷射功率分別設定為3.00%、3.50%、5.80%及4.00%。對於405nm、488nm、561nm及633 nm通道，將照相機曝光分別設定為30ms、40ms、60ms及35ms曝光。在完整成像時間中，使用顯微鏡培育器將細胞保持在37℃及5% CO2。經4小時以10分鐘間隔採集4個位置/孔之影像。所有影像採集及影像加工皆係使用Zen Blue軟體實施。為量化吞噬之細胞數，在長達240分鐘中(24個時間點)逐個畫面地手動計數CellTrackerTM 紅色CMTPX標記之Daudi細胞或巨噬細胞。然後計算每個畫面中所吞噬細胞之百分比。最後，將3-4個位置/孔之每個時間點之百分比取平均值以獲得每個處理孔之吞噬作用之平均百分比。圖38中顯示之所有資料代表對於每種處理條件4個位置/孔之重複。
紅色標記之Daudi細胞被綠色巨噬細胞有效吞噬(在30分鐘內達到80%且截至60分鐘達到95%)。檢測在4hr實驗期間彼此吞噬之巨噬細胞之最小數目，且在添加無岩藻糖基化NOV2108與添加IgG對照之孔之間無差異。
實例32：抗CD32B AB對CD32B之結合親和力
實施三個以共價固定於生物感測器上之IgG及huCD32b受體用作分析物之獨立直接結合分析以測定IgG對huCD32b之結合親和力。藉由隨後在所有流動槽上注射分析物連續稀釋液採集動力學資料。流動槽1(晶片1)用作參照。
使用標準胺偶合化學將550RU無岩藻糖基化NOV2108及Fc沉默之NOV2108[N297A]固定於CM5感測器晶片上。另外，將用作陰性對照以排除經由Fc部分結合至CD32b之沉默抗雞-溶菌酶-hIgG1[N297A]固定於該晶片上。將0.61-5000nM運行緩衝液中之huCD32b-去醣之系列稀釋液(1：2系列稀釋液)注射於表面上(流速：30μl/min，締合時間：60sec，解 離時間：120sec)。在每次分析物注射(30μl/min；接觸時間：30sec，穩定期：250sec)之前，用一個鹼性洗滌步驟使晶片表面再生。使用Biacore T200評估軟體1.0版評估資料。原始資料經雙重參照，即針對參照流動槽之反應校正量測流動槽之反應，且在第二步驟中減去空白注射之反應。若需要，移除離群值感測圖。藉由應用1：1結合模型計算動力學速率常數及解離平衡常數來擬合感測圖。Rmax係總體地設定，而RI係局部擬合。個別處理每次運行之資料。使用所生成值計算各別動力學常數之平均值及標準偏差。
NOV2108之Fc沉默形式(N297A)以18±3nM之KD結合CD32b(參見表6)。NOV2108(無岩藻糖基化形式)在單一實驗中以16nM之KD顯示與Fc沉默之NOV2108類似之親和力。對於經沉默抗雞-溶菌酶IgG與人類CD32b之相互作用未觀察到結合。因此，可排除經由Fc部分結合至CD32b。
實例33：NOV2108之無岩藻糖基化促進增強之B細胞殺死且保持單核球及顆粒球之存活率
對Fc wt 及無岩藻糖基化抗hu CD32b 反應性mAb NOV2108 在人類全血中誘導之殺死選擇性之評價
在人類全血中評估Fc wt及無岩藻糖基化抗hu CD32b mAb NOV2108 誘導CD32a/b陽性免疫細胞亞組之殺死之潛力。將不同濃度之測試及對照抗體(匹配同型之Fc WT及無岩藻糖基化(afuc))與來自10個不同健康供體之肝素化全血一起培育24h。在使用存活率染料排除死細胞後，在用針對CD19、CD14及CD45之標記物抗體對經刺激全血進行免疫分型後，在流式細胞計數器上量測B細胞、單核球及顆粒球之絕對計數。基於與使用緩衝液對照量測之絕對計數相比測試抗體誘導之絕對計數之變化來計算耗竭百分比：100-(絕對計數(測試條件)*100/絕對計數(緩衝液))。NOV2108之無岩藻糖基化Fc變體總體誘導與Fc WT變體相比更強之B細胞殺死(圖39a)且不影響單核球(圖39b)及顆粒球(圖39c)之存活率。
實例34：對FC WT及FC經修飾抗CD32B抗體之針對KARPAS620癌細胞系之原代NK細胞驅動之特異性ADCC活性之評價
使用原代NK細胞ADCC分析評價CD32b反應性抗體針對CD32b陽性Karpas620細胞之Fc依賴性活性。簡言之，經由聚蔗糖梯度自Leukopak(HemaCare目錄號PB001F-3)分離PBMC。然後使用Miltenyi珠粒(目錄號130-092-657)對NK細胞進行陰性選擇，然後在100pg/ml rhIL-2(PeproTech，目錄號200-02)存在下在基礎培養基(RPMI/10%FBS/15mM HEPES/1% L-麩醯胺酸/1%青黴素鏈黴素)中培育過夜。在後一天，用鈣黃綠素乙醯氧基-甲基酯(Calcein-AM；Molecular Probes目錄號C3100MP)將Karpas620細胞染色，洗滌兩次，並以10,000個細胞/孔之濃度轉移至96孔U形底微量滴定板。然後將細胞與抗體之連續稀釋液一起預培育20分鐘，之後以5：1之效應物對標靶比率添加效應細胞。在共培育後，將微量滴定板離心並將上清液流體之等份試樣轉移至另一微量滴定板(Corning Costar，目錄號3904)，並用螢光計數器(Envision,Perkin Elmer)測定溶液中游離鈣黃綠素之濃度。包括僅標靶細胞以及標靶細胞及1% Triton(Sigma,93443)作為對照。僅標靶細胞用作自發釋放，而標靶細胞及1% triton用作最大釋放。使用下式計算特定標靶細胞溶解百分比：[(樣品-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)]×100%。
測試3種形式之抗CD32b抗體NOV2108：Fc WT、無岩藻糖基化(Fc增強)及N297A(Fc沉默)。Fc WT NOV2108介導對Karpas620細胞之有效ADCC，且活性由無岩藻糖基化NOV2108增強(圖40)。如所預期，NOV2108之Fc沉默之N297A形式與IgG同型同樣無活性，從而確認NK細胞活化及MM細胞溶解需要功能性Fc。
實例35：經雷利竇邁預處理之PBMC加強NOV1216-AFUC之ADCC活性
雷利竇邁(LEN)係免疫調節藥物，可調節淋巴球功能之抗腫瘤效應，繼而活化NK細胞並增加細胞毒性。為確定LEN是否可加強ADCC活性，使用PBMC或T細胞耗竭之PBMC作為效應細胞且使用Daudi作為標靶。簡言之，經由聚蔗糖梯度自Leukopak(HemaCare目錄號PB001F-3)分離PBMC。藉由使用CD3珠粒(Miltenyi，目錄號130-050-101)確實自PBMC耗竭T細胞。在NK細胞分離及ADCC分析之前，將PBMC或T細胞耗竭之PBMC在補充有3μM LEN或等體積DMSO(模擬)之無重組體IL-2基礎培養基(RPMI/10%FBS/15mM HEPES/1% L-麩醯胺酸/1%青黴素鏈黴素)中培育72小時(如實例17中所述)。在抗CD32b Ab無岩藻糖基化NOV1216存在下，自經LEN預處理之PBMC分離之NK細胞顯示對Daudi細胞之ADCC活性高於來自經模擬處理之PBMC之NK細胞(圖41)。此資料為CD32b+淋巴瘤及骨髓瘤之治療中之抗CD32b抗體與雷利竇邁之組合提供支持。
已表明，LEN可活化T細胞並增加T細胞之IL-2分泌，此繼而活化NK細胞。因此，在分離後自PBMC耗竭T細胞並重複LEN之72hr預處理。單獨之T細胞耗竭對自模擬處理之PBMC分離之NK細胞之NOV1216介導之ADCC活性具有最低效應。在ADCC分析中僅使用NK細胞作為效應細胞，因此LEN對NK細胞活性之直接效應不顯著。然而，在LEN處理之前耗竭T細胞時，藉由LEN預處理PBMC增強之ADCC活性大部分消除，證實了T細胞在對LEN之反應及NK細胞活化中之重要作用。
實例36：在載有CD32B低KMS-12-BM皮下異種移植物之小鼠中與組合抗CD32B eADCC FC突變體抗體及HDAC抑制劑帕比司他相關之活體內活性
此實例探索組合eADCC Fc突變體CD32b標靶抗體與市售HDAC抑制劑帕比司他在載有CD32b低MM異種移植物KMS-12-BM之小鼠中之治療性益處。
經由流式細胞術使用2B6抗體測定KMS-12-BM細胞系上之CD32b表現程度。計數KMS-12-BM細胞並將其以1×106 個細胞/ml懸浮於FACS緩衝液(PBS1×，含有2%FBS)中。然後將200’000個細胞/孔(200μl)分配於U形底96孔板中。將板以1200rpm旋轉5分鐘並棄去上清液。然後使細胞懸浮於100μl含有1ug/ml 2B6抗體或IgG對照之FACS緩衝液中並在4℃下培育30分鐘。在用FACS緩衝液連續洗滌兩次後，使細胞懸浮於120μl FACS緩衝液中且在FACS Fortessa上採集。FACS直方圖顯示呈MFI之染色相對程度(x-軸)相對於所記錄之事件數(y-軸)。藉由抗CD32b mAb染色(實線)與IgG對照之染色(填充虛線)疊加(圖42)。該等資料顯示，KMS-12-BM表現極少CD32b。
向雌性裸小鼠皮下植入懸浮於經PBS稀釋之50%無酚紅基質膠(BD Biosciences)中之10×106 個KMS-12-BM細胞(100μl注射體積)。小鼠在植入後7天以210mm3 之平均腫瘤體積入選研究。在隨機分配至4個實驗組(n=7/組)中之一組後，以上文所提及之劑量及時間表向小鼠靜脈內投與以下治療：(1)PBS、(2)NOV2108(eADCC小鼠IgG2a(S239D/I332E),10mg/kg q2w)、(3)帕比司他(在14天循環中，12mg/kg q2d*5，之後暫停4天)及(1)+(3)之組合。每週兩次評價腫瘤負荷及體重。亦評估至終點之時間，該終點定義為腫瘤達到800mm3 。利用NOV2108之eADCC小鼠IgG2a形式反映與最佳治療性Ab Fc與FcγR之間之相互作用相關之對小鼠免疫效應細胞之治療性潛力。
NOV2108(eADCC Fc突變體小鼠IgG2a)及帕比司他之單一藥劑治療對平均腫瘤體積之影響有限(圖43)。該兩種治療之組合導致增加之抗腫瘤活性。具體而言，組合治療產生較單一藥劑組更顯著(P<0.05)之抗腫瘤活性(腫瘤體積變化百分比)(在所有3個實驗組皆保持治療時，第28天代表終點)。該組合亦延長至終點(800mm3 )之時間。該等資料指示，HDAC抑制劑帕比司他使CD32b低MM異種移植物對CD32b標靶NOV2108(eADCC Fc突變體小鼠IgG2a)敏感。資料為在MM患者中測試抗CD32b標靶抗體與HDAC抑制劑(例如帕比司他)之組合提供合理性。
實例37：無岩藻糖基化抗CD32b抗體NOV2108在載有DAUDI異種移植物之裸小鼠中之劑量反應活體內活性
在載有皮下Daudi異種移植物之裸小鼠中實施活體內效能實驗以探索無岩藻糖基化抗CD32b NOV2108人類IgG1之劑量依賴性抗腫瘤活性。NOV1216亦包括於此實驗中作為eADCC Fc突變體(S239D/I332E)小鼠 IgG2a框架。向雌性裸小鼠皮下植入懸浮於經PBS稀釋之50%無酚紅基質膠(BD Biosciences)中之5×106 個Daudi細胞(100μl注射體積)。小鼠在植入後10天以約220mm3 之平均腫瘤體積入選研究。在隨機分配至6個實驗組(n=7/組)中之一組後，向小鼠靜脈內投與以下治療：(1)PBS、(2)非標靶無岩藻糖基化同型對照(30mg/kg qw)、(3)無岩藻糖基化NOV2108(3mg/kg qw)、(4)無岩藻糖基化NOV2108(10mg/kg qw)、(5)無岩藻糖基化NOV2108(30mg/kg qw)及(6)eADCC Fc突變體小鼠IgG2a NOV1216(10mg/kg q3w)。每週兩次評價腫瘤體積及體重。利用NOV1216之eADCC小鼠IgG2a形式反映與治療性Ab Fc與FcγR之間之最佳相互作用相關之對小鼠免疫效應細胞之治療性潛力。
無岩藻糖基化NOV2108在載有皮下植入之Daudi異種移植物之小鼠中顯示劑量依賴性抗腫瘤活性(圖44)。一隻來自NOV1216 eADCC mIgG2a組之小鼠對治療無反應且在第28天由於腫瘤體積過大而自研究移除。投與3mg/kg qw劑量之小鼠之腫瘤生長與投與PBS或非標靶對照抗體(30mg/kg qw)之小鼠無區別。然而，以10或30mg/kg qw投與之無岩藻糖基化NOV2108產生顯著腫瘤生長抑制。作為eADCC Fc突變體小鼠IgG2a投與之具有與NOV2108非常類似之可變區之NOV1216產生與使用以顯著較高之劑量(30mg/kg qw)投與之無岩藻糖基化NOV2108大致類似之顯著抗腫瘤活性。該等資料突出顯示與宿主免疫效應細胞FcγR與治療性mAb Fc區之間之最佳相互作用相關之治療性益處。
實例38：無岩藻糖基化NOV2108在載有KARPAS620 MM皮下異種移植物之裸小鼠中之抗腫瘤活性
在載有皮下KARPAS620 MM異種移植物之裸小鼠中實施活體內效能 實驗以探索無岩藻糖基化抗CD32b NOV2108人類IgG1之劑量依賴性抗腫瘤活性。向雌性裸小鼠皮下植入懸浮於經PBS稀釋之50%無酚紅基質膠(BD Biosciences)中之1×107 個KARPAS620細胞(100μl注射體積)。小鼠在植入後10天以約220mm3 之平均腫瘤體積入選研究。在隨機分配至3個實驗組(n=8/組)中之一組後，向小鼠靜脈內投與以下治療：(1)PBS、(2)無岩藻糖基化NOV2108(10mg/kg qw)及(3)無岩藻糖基化NOV2108(30mg/kg qw)。每週兩次評價腫瘤體積及體重。
無岩藻糖基化NOV2108在載有皮下植入之KARPAS620異種移植物之小鼠中顯示顯著抗腫瘤活性(圖45)。在兩個劑量值下觀察到類似抗腫瘤活性，表明此可係可達成之最大抗腫瘤活性。該等資料提供無岩藻糖基化NOV2108在MM患者中可具有之治療性益處之證據。
實例39：在載有DAUDI異種移植物之裸小鼠中靜脈內投與eADCC FC突變體NOV2108對腫瘤內巨噬細胞含量之影響.
在載有皮下Daudi異種移植物之裸小鼠中實施活體內實驗以探索如F4/80 IHC陽性所測定，靜脈內投與eADCC Fc突變體NOV2108(S239D/A330L/I332E)對腫瘤內巨噬細胞含量之影響。向雌性裸小鼠皮下植入懸浮於經PBS稀釋之50%無酚紅基質膠(BD Biosciences)中之5×106 個Daudi細胞(100μl注射體積)。小鼠在植入後10天以約200mm3 之平均腫瘤體積入選研究。實驗由兩部分組成。第一隊列(n=3/組)接受(1)PBS、(2)eADCC Fc突變體非標靶同型對照10mg/kg qw*2或(3)eADCC Fc突變體NOV2108 10mg/kg qw*2。在第二次劑量後3天(第一次劑量後10天)收集腫瘤並經由IHC評估F4/80免疫反應性。第二隊列接受eADCC Fc突變體NOV2108之單一靜脈內劑量。隨後在劑量後第7天、第10天、第14天及第 21天(每個時間點n=3)收集腫瘤並經由IHC評估F4/80免疫反應性。
在每一預定時間點，立即切除腫瘤，在10%緩衝福馬林中固定24小時並轉移至70% EtOH中直至處理為止(使用常規組織學程序嵌入石蠟中；以3.5um切割組織切片)。使用兔單株抗小鼠F4/80 IgG(純系SP115；Spring Bioscience)。正常小鼠淋巴樣組織用作陽性對照。
最佳化IHC方案(Ventana無生物素DAB檢測系統；Ventana DISCOVERY XT生物標記平臺)包括於Ventana細胞調理1號抗原修復劑中之標準暴露。將一級抗體於DAKO Cytomation抗體稀釋劑中稀釋至1：200濃度，以100ul體積施加並在室溫下培育60分鐘。隨後用Ventana OmniMap預稀釋之HRP偶聯之抗兔二級抗體(目錄號760-4311)實施4分鐘培育。然後使用ChromoMap DAB套組檢測二級抗體並將載玻片用Ventana蘇木素複染4分鐘，之後用Ventana上藍劑複染4分鐘。使載玻片在濃度遞增之乙醇(95-100%)中去水，然後在二甲苯中去水，之後加蓋玻片。加蓋玻片之載玻片藉由光學顯微術評估並藉由Leica/Aperio ScanScope載玻片掃描儀(Vista,CA)掃描。然後觀察數位影像並藉由Indica Labs HALO(Corrales,NM)分析，其運行來自Leica eSlide Manager/Aperio Spectrum之影像。使用Indica Labs HALO(Corrales,NM)內之製圖模組捕獲代表性組織學影像。在自整合Leica eSlide Manager/Aperio Spectrum(Vista,CA)開啟之Indica Labs HALO(Corrales,NM)上運行經染色載玻片之經掃描影像。資料呈現為陽性組織百分比。
相對於PBS處理之對照，在DAUDI異種移植物中在10mg/kg qw*2給藥方案後3天，eADCC Fc突變體NOV2108導致F4/80免疫反應性增加 (圖46)。在此圖中，空心形狀代表來自一個動物之資料，而實心形狀代表處理。該等資料指示，i.v.投與eADCC Fc突變體NOV2108導致腫瘤內巨噬細胞數增加。此在投與非標靶eADCC Fc突變體陰性對照抗體之小鼠中未觀察到，從而確認需要CDR介導之與Daudi細胞上之CD32b之結合將巨噬細胞招募至腫瘤。另外，在作為單一10mg/kg靜脈內劑量投與時，eADCC Fc突變體NOV2108在劑量後7天導致腫瘤內巨噬細胞數增加。腫瘤內巨噬細胞含量在後續時間點下降，在劑量後之後續時間點接近給藥前含量。該等資料證實小鼠巨噬細胞在活體內介導eADCC Fc突變體NOV2108之Fc及CDR依賴性活性中之作用。該等資料亦提供使用腫瘤內免疫細胞浸潤物作為生物標記指導劑量排程之原理。
除非另有定義，否則本文中所用技術及科學術語具有與熟習本揭示所屬領域之專家通常所理解相同之含義。
除非另有指示，否則可實施且已以本身已知之方式實施未詳細具體闡述之所有方法、步驟、技術及操作，如熟習此項技術者將明瞭。例如，再次參照標準手冊及本文所提及之一般背景技術及其中引用之其他參考文獻。除非另有指示，否則本文引用之每一參考文獻係全文以引用方式併入。
本發明之申請專利範圍係非限制性且提供於下文中。
儘管已在本文中詳細揭示具體態樣及申請專利範圍，但此已僅出於說明目的藉助實例來揭示，且不欲限制隨附申請專利範圍之範圍或未來任何相應申請案之申請專利範圍之標的物之範圍。具體而言，本發明者預期，可在不背離如申請專利範圍所定義之本揭示之精神及範圍之情況下對本揭示做出各種取代、改變及修改。認為核酸起始材料、所關注純系或庫 類型之選擇係瞭解本文所述態樣之熟習此項技術者之常規事務。其他態樣、優點及修改被視為在下文申請專利範圍之範圍內。所屬領域技術人員僅使用常規實驗即將認識到或能確定本文所述本發明之具體態樣之多種等效形式。該等等效形式皆欲涵蓋於下文申請專利範圍中。在將來申請之相應申請案中可由於不同國家專利法之限制改寫申請專利範圍，且不應理解為放棄該等申請專利範圍之標的物。
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 627
<210> 628
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 628
<210> 629
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 629
<210> 630
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 630
<210> 631
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 631
<210> 632
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 632
<210> 633
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 633
<210> 634
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多肽
<400> 634
<210> 635
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多核苷酸
<400> 635
<210> 636
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多肽
<400> 636
<210> 637
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多核苷酸
<400> 637
<210> 638
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 638
<210> 639
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 639
<210> 640
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 640
<210> 641
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 641
<210> 642
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 642
<210> 643
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 643
<210> 644
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 644
<210> 645
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 645
<210> 646
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 646
<210> 647
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多肽
<400> 647
<210> 648
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多核苷酸
<400> 648
<210> 649
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多肽
<400> 649
<210> 650
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多核苷酸
<400> 650
<210> 651
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 651
<210> 652
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 652
<210> 653
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 653
<210> 654
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 654
<210> 655
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 655
<210> 656
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 656
<210> 657
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 657
<210> 658
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 658
<210> 659
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 659
<210> 660
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多肽
<400> 660
<210> 661
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多核苷酸
<400> 661
<210> 662
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多肽
<400> 662
<210> 663
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多核苷酸
<400> 663
<210> 664
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 664
<210> 665
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 665
<210> 666
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 666
<210> 667
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 667
<210> 668
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 668
<210> 669
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 669
<210> 670
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 670
<210> 671
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 671
<210> 672
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<400> 672
<210> 673
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多肽
<400> 673
<210> 674
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多核苷酸
<400> 674
<210> 675
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多肽
<400> 675
<210> 676
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成多核苷酸
<400> 676
<210> 677
<211> 317
<212> PRT
<213> 智人
<400> 677
<210> 678
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人
<400> 678
<210> 679
<211> 291
<212> PRT
<213> 智人
<400> 679
<210> 680
<211> 180
<212> PRT
<213> 智人
<400> 680
<210> 681
<211> 185
<212> PRT
<213> 智人
<400> 681
<210> 682
<211> 175
<212> PRT
<213> 智人
<400> 682
<210> 683
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Glu或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Tyr、Phe、Ala或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Tyr或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Phe或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Tyr或Phe
<400> 683
<210> 684
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成6xHis標籤
<400> 684
<210> 685
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 685
<210> 686
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 686
<210> 687
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 687

Claims (67)

  1. 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區CDR1：SEQ ID NQ：1、4、7、53、56、59、105、108、111、157、160、163、209、212、215、261、264、267、313、316、319、365、368、371、417、420、423、469、472、475、521、524、527、547、550、553、573、576、579、625、628及631；(b)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：2、5、8、54、57、60、106、109、112、158、161、164、210、213、216、262、265、268、314、317、320、366、369、372、418、421；424、470、473、476、522、525、528、548、551、554、574、577、580、626、629及632；(c)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區CDR3：SEQ ID NO：3、6、9、55、58、61、107、110、113、159、162、165、211、214、217、263、266、269、315、318、321、367、370、373、419、422、425、471、474、477、523、526、529、549、552、555、575、578、581、627、630及633；(d)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區CDR1：SEQ ID NO：14、17、20、66、69、72、118、121、124、170、173、176、222、225、228、274、277、280、326、329、332、378、381、384、430、433、436、482、485、488、534、537、540、560、563、566、586、589、592、638、641、644； (e)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：15、18、21、67、70、73、119、122、125、171、174、177、223、226、229、275、278、281、327、330、333、379、382、385、431、434、437、483、486、489、535、538、541、561、564、567、587、590、593、639、642及645；及(f)包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區CDR3：SEQ ID NO：16、19、22、68、71、74、120、123、126、172、175、178、224、227、230、276、279、282、328、331、334、380、383、386、432、435、438、484、487、490、536、539、542、562、565、568、588、591、594、640、643及646；其中該抗體選擇性結合人類CD32b。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈可變區：SEQ ID NO：10、62、114、166、218、270、322、374、426、478、530、556、582及634；及包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈可變區：SEQ ID NO：23、75、127、179、231、283、335、387、439、491、543、569、595及647。
  3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈：SEQ ID NO：12、64、116、168、220、272、324、376、428、480、584及636；及包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈：SEQ ID NO：25、77、129、181、233、285、337、389、441、493、597及649。
  4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：包含選自以下中之任一者胺基酸序列之重鏈：SEQ ID NO：38、90、142、194、246、298、350、402、454、506、532、558、610及662；及包含選自以下中之任一者胺基酸序列之輕鏈：SEQ ID NO：51、103、155、207、259、311、363、415、467、519、545、571、623及675。
  5. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：(a)分別SEQ ID NO：1、2及3之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：14、15及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(b)分別SEQ ID NO：4、5及6之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：17、18及19之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(c)分別SEQ ID NO：7、8及9之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：20、21及22之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(d)分別SEQ ID NO：53、54及55之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：66、67及68之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(e)分別SEQ ID NO：56、57及58之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：69、70及71之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(f)分別SEQ ID NO：59、60及61之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：72、73及74之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(g)分別SEQ ID NO：105、106及107之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：118、119、120之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列； (h)分別SEQ ID NO：108、109及110之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：121、122、123之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(i)分別SEQ ID NO：111、112及113之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：124、125、126之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(j)分別SEQ ID NO：157、158及159之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：170、171、172之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(k)分別SEQ ID NO：160、161及162之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：173、174、175之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(l)分別SEQ ID NQ：163、164及165之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：176、177、178之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(m)分別SEQ ID NO：209、210及211之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：222、223及224之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(n)分別SEQ ID NO：212、213及214之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：225、226及227之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(o)分別SEQ ID NO：215、216及217之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：228、229及230之LCDR1、LCDR2及 LCDR3序列；(p)分別SEQ ID NO：261、262及263之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：274、275及276之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(q)分別SEQ ID NO：264、265及266之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：277、278及279之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(r)分別SEQ ID NO：267、268及269之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：280、281及282之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(s)分別SEQ ID NO：313、314及315之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：326、327及328之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(t)分別SEQ ID NO：316、317及318之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：329、330及331之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(u)分別SEQ ID NO：319、320及321之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：332、333及334之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(v)分別SEQ ID NO：365、366及367之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：378、379及380之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(w)分別SEQ ID NO：368、369及370之HCDR1、HCDR2及 HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：381、382及383之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(x)分別SEQ ID NO：371、372及373之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：384、385及386之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(y)分別SEQ ID NO：417、418及419之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：430、431及432之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(z)分別SEQ ID NO：420、421及422之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：433、434及435之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(aa)分別SEQ ID NO：423、424及425之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：436、437及438之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(bb)分別SEQ ID NO：469、470及471之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：482、483及484之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(cc)分別SEQ ID NO：472、473及474之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：485、486及487之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(dd)分別SEQ ID NO：475、476及477之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：488、489及490之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列； (ee)分別SEQ ID NO：521、522及523之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：534、535及536之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(ff)分別SEQ ID NO：524、525及526之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：537、538及539之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(gg)分別SEQ ID NO：527、528及529之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：540、541及542之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(hh)分別SEQ ID NO：547、548及549之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：560、561及562之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(ii)分別SEQ ID NO：550、551及552之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：563、564及565之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(jj)分別SEQ ID NO：553、554及555之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：566、567及568之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(kk)分別SEQ ID NO：573、574及575之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：586、587及588之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(ll)分別SEQ ID NO：576、577及578之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：589、590及591之LCDR1、LCDR2及 LCDR3序列；(mm)分別SEQ ID NO：579、580及581之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：592、593及594之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(nn)分別SEQ ID NO：625、626及627之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：638、639及640之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(oo)分別SEQ ID NO：628、629及630之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：641、642及643之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或(pp)分別SEQ ID NO：631、632及633之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：644、645及646之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
  6. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：10之VH序列及SEQ ID NO：23之VL序列；(b)SEQ ID NO：62之VH序列及SEQ ID NO：75之VL序列；(c)SEQ ID NO：114之VH序列及SEQ ID NO：127之VL序列；(d)SEQ ID NO：166之VH序列及SEQ ID NO：179之VL序列；(e)SEQ ID NO：218之VH序列及SEQ ID NO：231之VL序列；(f)SEQ ID NO：270之VH序列及SEQ ID NO：283之VL序列；(g)SEQ ID NO：322之VH序列及SEQ ID NO：335之VL序列；(h)SEQ ID NO：374之VH序列及SEQ ID NO：387之VL序列； (i)SEQ ID NO：426之VH序列及SEQ ID NO：439之VL序列；(j)SEQ ID NO：478之VH序列及SEQ ID NO：491之VL序列；(k)SEQ ID NO：530之VH序列及SEQ ID NO：543之VL序列；(l)SEQ ID NO：556之VH序列及SEQ ID NO：569之VL序列；(m)SEQ ID NO：582之VH序列及SEQ ID NQ：595之VL序列；或(n)SEQ ID NO：634之VH序列及SEQ ID NO：647之VL序列。
  7. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：12之重鏈序列；及SEQ ID NO；25之輕鏈序列；(b)SEQ ID NO：64之重鏈序列；及SEQ ID NO：77之輕鏈序列；(c)SEQ ID NO：116之重鏈序列；及SEQ ID NO：129之輕鏈序列；(d)SEQ ID NO：168之重鏈序列；及SEQ ID NO：181之輕鏈序列；(e)SEQ ID NO：220之重鏈序列；及SEQ ID NO：233之輕鏈序列；(f)SEQ ID NO：272之重鏈序列；及SEQ ID NO：285之輕鏈序列；(g)SEQ ID NO：324之重鏈序列；及SEQ ID NO：337之輕鏈序列；(h)SEQ ID NO：376之重鏈序列；及SEQ ID NO：389之輕鏈序列；(i)SEQ ID NO：428之重鏈序列；及SEQ ID NO：441之輕鏈序 列；(j)SEQ ID NO：480之重鏈序列；及SEQ ID NO：493之輕鏈序列；(k)SEQ ID NO：584之重鏈序列；及SEQ ID NO：597之輕鏈序列；或(l)SEQ ID NO：636之重鏈序列；及SEQ ID NO：649之輕鏈序列。
  8. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：38之重鏈序列；及SEQ ID NO：51之輕鏈序列；(b)SEQ ID NO：90之重鏈序列；及SEQ ID NO：103之輕鏈序列；(c)SEQ ID NO：142之重鏈序列；及SEQ ID NO：155之輕鏈序列；(d)SEQ ID NO：194之重鏈序列；及SEQ ID NO：207之輕鏈序列；(e)SEQ ID NO：246之重鏈序列；及SEQ ID NO：259之輕鏈序列；(f)SEQ ID NO：298之重鏈序列；及SEQ ID NO：311之輕鏈序列；(g)SEQ ID NO：350之重鏈序列；及SEQ ID NO：363之輕鏈序列；(h)SEQ ID NO：402之重鏈序列；及SEQ ID NO：415之輕鏈序列； (i)SEQ ID NO：454之重鏈序列；及SEQ ID NO：467之輕鏈序列；(j)SEQ ID NO：506之重鏈序列；及SEQ ID NO：519之輕鏈序列；(k)SEQ ID NO：532之重鏈序列；及SEQ ID NO：545之輕鏈序列；(l)SEQ ID NO：558之重鏈序列；及SEQ ID NO：571之輕鏈序列；(m)SEQ ID NO：610之重鏈序列；及SEQ ID NO：623之輕鏈序列；或(n)SEQ ID NO：662之重鏈序列；及SEQ ID NO：675之輕鏈序列。
  9. 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：157、160或163之胺基酸序列之HCDR1；(b)包含選自SEQ ID NQ：158、161或164之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含選自SEQ ID NO：159、315、367、419、471、523、549、575或627之胺基酸序列之HCDR3；(d)包含選自SEQ ID NO：170、173或176之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：171、174或177之胺基酸序列之 LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列之LCDR3。
  10. 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：157、160或163之胺基酸序列之HCDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：158、161或164之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含胺基酸序列EQX1 PX2 X3 GX4 GGX5 PX6 EAMDV之HCDR3，其中X1 係D或S，X2 係E或S，X3 係Y、F、A或S；X4 係Y或F；X5 係F或Y，且X6 係Y或F；(d)包含選自SEQ ID NO：170、173或176之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：171、174或177之胺基酸序列之LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列之LCDR3。
  11. 如請求項10之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：157、160或163之胺基酸序列之HCDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：158、161或164之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含SEQ ID NO：159、315、367或419之胺基酸序列之 HCDR3；(d)包含選自SEQ ID NO：170、173或176之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：171、174或177之胺基酸序列之LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列之LCDR3。
  12. 如請求項10之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：417之胺基酸序列之HCDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：418之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含SEQ ID NO：419之胺基酸序列之HCDR3；(d)包含選自SEQ ID NO：430之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：431之胺基酸序列之LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：432之胺基酸序列之LCDR3。
  13. 一種無岩藻糖基化抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：417之胺基酸序列之HCDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：418之胺基酸序列之HCDR2；(c)包含SEQ ID NO：419之胺基酸序列之HCDR3；(d)包含選自SEQ ID NO：430之胺基酸序列之LCDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：431之胺基酸序列之LCDR2；及(f)包含SEQ ID NO：432之胺基酸序列之LCDR3。
  14. 如請求項13之無岩藻糖基化抗體或其抗原結合片段，其包含包含SEQ ID NO：426之胺基酸序列之可變重鏈區及包含SEQ ID NO：441之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  15. 如請求項13之無岩藻糖基化抗體或其抗原結合片段，其包含包含SEQ ID NO：428之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：441之胺基酸序列之輕鏈。
  16. 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，其包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：10、62、114、166、218、270、322、374、426、478、530、556、582及634；及輕鏈可變區，其包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：23、75、127、179、231、283、335、387、439、491、543、569、595及647；其中該抗體特異性結合至人類CD32b蛋白。
  17. 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈，其包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：12、38、64、90、116、142、168、194、220、246、272、298、324、350、376、402、428、454、480、506、532、558、584、610、636及662；及輕鏈，其包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：25、51、77、103、129、155、181、207、233、259、285、311、337、363、389、415、 441、467、493、519、545、571、597、623、649及675；其中該抗體特異性結合至人類CD32b蛋白。
  18. 2、3、5、6、7、9、10、11或12中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體經無岩藻糖基化。
  19. 2、3、5、6、8、9、10、11或12中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之Fc部分經修飾以增強ADCC活性。
  20. 如請求項1至17中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選擇性結合人類CD32b在人類CD32a以上。
  21. 如請求項1至17中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群之IgG：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
  22. 如請求項1至17中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該經分離抗體或抗原結合片段選自由以下組成之群：單株抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab及scFv。
  23. 如請求項1至17中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係嵌合、人類化或完全人類抗體。
  24. 如請求項1至17中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該經分離抗體或抗原結合片段抑制人類CD32b與免疫球蛋白Fc結構域之結合。
  25. 如請求項1至17中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該經分離抗體或其抗原結合片段係免疫偶聯物之組份。
  26. 一種多價抗體，其中該抗體之一個臂包含如請求項1至24中任一項之經分離抗體或抗原結合片段中之任一者。
  27. 如請求項26之多價抗體，其中該抗體係雙特異性抗體。
  28. 如請求項26或27之多價抗體，其用於治療有需要之個體之CD32b相關病況。
  29. 如請求項26或27之多價抗體，其用於治療會抵抗以結合至在細胞上與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體之治療或該治療難治之患者，該治療包含共投與該抗體與該等抗CD32b抗體或其抗原結合片段。
  30. 一種組合物，其包含如請求項1至25中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段或如請求項26或27之多價抗體，併與一或多種結合在細胞上與CD32b共表現之細胞表面抗原之額外抗體之組合。
  31. 如請求項30之組合物，其中該細胞表面抗原及CD32b在B細胞上共表 現。
  32. 如請求項30之組合物，其中該細胞表面抗原選自由以下組成之群：CD20、CD38、CD52、CS1/SLAMF7、CD56、CD138、KiR、CD19、CD40、Thy-1、Ly-6、CD49、Fas、Cd95、APO-1、EGFR、HER2、CXCR4、HLA分子、GM1、CD22、CD23、CD80、CD74或DRD。
  33. 如請求項30之組合物，其中該細胞表面抗原選自由以下組成之群：CD20、CD38、CS1/SLAMF7及CD52。
  34. 如請求項30之組合物，其中該額外抗體選自由以下組成之群：利妥昔單抗(rituximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、達雷木單抗(daratumumab)及阿倫單抗(alemtuzumab)。
  35. 如請求項30之組合物，其進一步包含額外治療性化合物。
  36. 一種組合物，其包含如請求項1至25中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段或如請求項26或27之多價抗體，併與額外治療性化合物之組合。
  37. 如請求項35或36之組合物，其中該額外治療性化合物係免疫調節劑。
  38. 如請求項37之組合物，其中該免疫調節劑係IL15或該免疫調節劑係選自以下之共刺激分子之激動劑：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、CD83配體及STING。
  39. 如請求項37之組合物，其中該免疫調節劑係選自以下之標靶之抑制劑分子：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFR β及IDO。
  40. 如請求項36之組合物，其中該額外治療性化合物選自奧法木單抗、依魯替尼(ibrutinib)、貝林司他(belinostat)、羅米地辛(romidepsin)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、奧妥珠單抗、普拉曲沙(pralatrexate)、噴司他汀(pentostatin)、***(dexamethasone)、艾代拉裡斯(idelalisib)、阿西咗脒(ixazomib)、脂質體多柔比星(liposomal doxyrubicin)、泊馬竇邁(pomalidomide)、帕比司他(panobinostat)、埃羅妥珠單抗、達雷木單抗、阿倫單抗、沙利竇邁(thalidomide)及雷利竇邁(lenalidomide)。
  41. 如請求項35之組合物，其中該額外治療性化合物選自依魯替尼、貝林司他、羅米地辛、貝倫妥單抗維多汀、普拉曲沙、噴司他汀、地塞米 松、艾代拉裡斯、阿西咗脒、脂質體多柔比星、泊馬竇邁、帕比司他、沙利竇邁及雷利竇邁。
  42. 如請求項30至41之組合物，其用於治療有需要之個體中CD32b相關病況。
  43. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至25中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段、或如請求項26或27之多價抗體、或如請求項30至41之組合物及醫藥上可接受之載劑。
  44. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至25中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段、或如請求項26或27之多價抗體及醫藥上可接受之載劑。
  45. 如請求項1至17中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於治療有需要之個體中CD32b相關病況。
  46. 一種如請求項1至25中任一項之抗體或其抗原結合片段、或如請求項26或27之多價抗體或如請求項30至41之組合物之用途，其用於製造用於治療有需要之個體中CD32b相關病況之藥劑。
  47. 如請求項46之用途，其中該CD32b相關病況選自B細胞惡性病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、急性淋巴球性白血病、慢性淋巴球性白血病、小 淋巴球性淋巴瘤、瀰漫性小裂細胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或全身性輕鏈類澱粉變性。
  48. 一種核酸，其編碼如請求項1至25之抗體或其抗原結合片段。
  49. 一種載體，其包含如請求項48之核酸。
  50. 一種宿主細胞，其包含如請求項48之核酸或如請求項49之載體。
  51. 一種產生如請求項1至25之抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含：培養表現編碼該抗體之核酸之宿主細胞；及自該培養收集該抗體。
  52. 一種經分離多核苷酸，其編碼選擇性結合包含表1中所列示CDR之人類CD32b抗體之抗體或其抗原結合片段。
  53. 一種如請求項1至25之經分離抗CD32b抗體或其抗原結合片段或如請求項26或27之多價抗體中任一者之用途，其用於製造用於治療會抵抗以結合至在細胞上與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體之治療或該治療難治之患者之藥劑。
  54. 如請求項1至17之經分離抗CD32b抗體或其抗原結合片段，其用於治療會抵抗以結合至在細胞上與CD32b共表現之細胞表面抗原之抗體之治療或該治療難治之患者，該治療包含共投與該抗體與該等抗CD32b抗體或其 抗原結合片段。
  55. 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其在CD32b之Fc結合結構域內特異性結合至CD32b。
  56. 如請求項55之經分離抗體或抗原結合片段，其中該抗體結合在CD32b之胺基酸殘基107-123(VLRCHSWKDKPLVKVTF)內。
  57. 如請求項55之經分離抗體或抗原結合片段，其中該抗體防止或減少CD32b與第二抗體之免疫球蛋白Fc結構域之結合，該第二抗體結合至在B細胞上與CD32b共表現之腫瘤抗原。
  58. 如請求項57之經分離抗體或抗原結合片段，其中該第二抗體結合至選自由以下組成之群之腫瘤抗原：CD20、CD38、CD52、CS1/SLAMF7、CD56、CD138、KiR、CD19、CD40、Thy-1、Ly-6、CD49、Fas、Cd95、APO-1、EGFR、HER2、CXCR4、HLA分子、GM1、CD22、CD23、CD80、CD74或DRD。
  59. 如請求項57之經分離抗體或抗原結合片段，其中該第二抗體結合至選自由以下組成之群之腫瘤抗原：CD20、CD38、CS1/SLAMF7及CD52。
  60. 如請求項57之經分離抗體或抗原結合片段，其中該第二抗體選自由 以下組成之群：利妥昔單抗、埃羅妥珠單抗、奧法木單抗、奧妥珠單抗、達雷木單抗及阿倫單抗。
  61. 如請求項55至60中任一項之經分離抗體或抗原結合片段，其包含如請求項1至25中任一項之抗體。
  62. 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合至CD32b且抑制或減少第二抗體介導之CD32b免疫受體酪胺酸基抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif；ITIM)信號傳導，該第二抗體結合至在B細胞上與CD32b共表現之腫瘤抗原。
  63. 一種特異性結合至CD32b之Fc結合結構域之經分離抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用於抑制或減少因投與結合至在B細胞上與CD32b共表現之腫瘤抗原之治療性抗體誘導之CD32b ITIM信號傳導之藥劑。
  64. 如請求項63之用途，其中該經分離抗體或其抗原結合片段不刺激ITIM信號傳導。
  65. 如請求項63之用途，其中該治療性抗體結合至選自由以下組成之群之腫瘤抗原：CD20、CD38、CD52、CS1/SLAMF7、CD56、CD138、KiR、CD19、CD40、Thy-1、Ly-6、CD49、Fas、Cd95、APO-1、EGFR、HER2、CXCR4、HLA分子、GM1、CD22、CD23、CD80、 CD74或DRD。
  66. 如請求項63之用途，其中該治療性抗體結合至選自由以下組成之群之腫瘤抗原：CD20、CD38、CS1/SLAMF7及CD52。
  67. 如請求項63之用途，其中該治療性抗體選自由以下組成之群：利妥昔單抗、埃羅妥珠單抗、奧法木單抗、奧妥珠單抗、達雷木單抗及阿倫單抗。
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