TW201602086A - 作為抗癌藥物之芳基胺取代的喹喔啉 - Google Patents

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Abstract

本發明提供式I及II的新穎化合物，該化合物具有蛋白質磷酸酶2A(PP2A)的促進劑、癌蛋白CIP2A抑制劑及癌蛋白SET拮抗劑之功效。本發明並提供使用該式I及II之化合物的治療方法。

Description

作為抗癌藥物之芳基胺取代的喹喔啉
本發明係關於一種經芳基胺取代的喹喔啉(quinoxaline)的新穎化合物，以及該化合物的用途。
在大部分的人類癌細胞中可發現抑制蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A)過度表現，包含白血病、***癌、非小細胞肺癌、胃癌、頭頸部癌、結腸癌及乳癌，因此CIP2A已發現於臨床上侵略性腫瘤及促進癌細胞生長有密切的關聯性。CIP2A直接與轉錄因子c-Myc相互作用並抑制c-Myc的蛋白質磷酸酶2A(PP2A)去磷酸化，因而使致癌的c-Myc更穩定免於降解。
蛋白質磷酸酶2A(PP2A)係藉由在絲氨酸或蘇胺酸殘基蛋白質激酶的去磷酸化為細胞增殖的關鍵調節劑，PP2A係由三個調節受體專一性的次單元所組成；例如，PP2A使p-Akt在絲胺酸473去磷酸化並減少細胞生長。因此，CIP2A-PP2A-Akt信號級聯放大(signaling cascade)被認為是癌症種藥的生存調節劑；此外，SET另一個被發現的PP2A的抑制劑，已發現SET在許多不同腫瘤組織均有過度表現，且SET的表現量與癌細胞的生長速率呈正相關。
因此，若開發以拮抗SET或是CIP2A對於PP2A的抑制，來在癌細胞中重新活化PP2A，繼而抑制p-Akt等促癌訊息的傳遞，進而誘發癌細胞凋亡的化合物可成為抗癌的新的治療策略。
本發明提供新設計的化合物具有阻礙PP2A與SET結合的能力，同時能有效抑制具有抑制蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)及p-Akt表現，其可作為具有蛋白質磷酸酶2A(PP2A)的促進劑及癌蛋白SET 拮抗劑，且能有效治療癌症。
本發明之一目的在提供一種可經芳基胺取代的喹喔啉，係具有如式I(a)或式I(b)之結構：
其中R1、R2及R3係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團、雜環芳香基，且該可經取代的苯基包含
本發明另提供一種可經芳基胺取代的喹喔啉，係具有如式I(c)化學結構之：
其中R4及R5係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團、雜環芳香基，且該可經取代的苯基包含 或，以及其中X係為鹵素、鹵代烷基、甲氧基、硝基、胺基、羧基、酸基、苯酮基或甲氧羰基。
本發明另提供一種可經芳基胺取代的喹喔啉，係具有式I(d)化學結構之：
其中R6及R7係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團、雜環芳香基，且該可經取代的苯基包含
本發明另提供一種化合物，係具有如下式II之結構：
其中R8及R9係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團，且該可經取代的苯基包含、 、或，以及其中Y為CO或(CH2)n，n=1-3；Z=COOR10，或具有取代官能基之苯環，R10為芳香基或烷基取代基。
本發明之另一目的係提供一種醫藥組合物，包含上述所定義之化合物，以及一藥理上可接受的載體。
本發明之又一目的係提供一種用於活化蛋白質磷酸酶2A(PP2A)在細胞內表現、作為癌蛋白SET拮抗劑、蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)拮抗劑或干擾癌蛋白(SET)與蛋白質磷酸酶2A(PP2A)結合的醫藥組合物，包含上述所定義的化合物，以及一藥理上可接受的載體。
本發明之再一目的係提供一種用於治療以蛋白質磷酸酶2A(PP2A)不活化以、癌蛋白SET表現量增加或蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表現量增加為特徵之疾病或病症的醫藥組合物，包含在上述所定義的化合物，以及一藥理上可接受的載體。
在本發明之一實施例中，其中該醫藥組合物進一步包含一抗癌藥物，且該抗癌藥物係為索拉非尼(Sorafenib)或紫杉醇(Paclitaxel)。
本發明之另一目的係提供一種上述所定義之化合物用於製 造以治療蛋白質磷酸酶2A(PP2A)不活化、癌蛋白SET表現量增加、蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表現量增加為特徵之疾病或病症之醫藥組合物的用途。
在本發明之一實施例中，其中該以蛋白質磷酸酶2A(PP2A)不活化、癌蛋白SET表現量增加或蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表現量增加為特徵之疾病或病症為肝癌、肺癌、白血病、乳癌、腎癌、甲狀腺癌、結腸癌、頭部或頸部癌症。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第一圖A至G係表示本發明之埃羅替尼(Erlotinib)衍生物TD-52對比埃羅替尼對HCC細胞有較佳的細胞凋亡效果。第一圖A係為以MTT分析在HCC細胞中，TD-52及埃羅替尼的細胞凋亡效果，顯示在不同細胞株中TD-52的IC50，點代表平均值；條帶代表標準差(n=3)；第一圖B係為以流式細胞儀檢測在劑量依賴下TD-52及埃羅替尼的HCC細胞凋亡效果，點代表平均值；條帶代表標準差(n=3)；第一圖C係以膜聯蛋白-V/PI雙重染色法分析細胞凋亡及細胞壞死的比例；第一圖D係以西方墨點分析法分析胱氨酸蛋白酶-9、半胱氨酸蛋白酶-3及過氧化物酶體增殖物啟動受體(PAPP)的表現；第一圖E係為以TD-52處理後DNA片段化檢測(n=6)；第一圖F係表示經由TD-52與z-VAD-fmk共處理處理會減少誘發細胞凋亡，上圖為以西方墨點分析法分析，下圖係為以流式細胞儀分析；第一圖G係經由西方墨點分析法確認TD-52對比埃羅替尼不具有抑制的上皮細胞成長因子接受體(EGFR)磷酸化活性。
第二圖A至H係顯示HCC細胞經由抑制蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)使p-Akt向下調節以確認本發明之埃羅替尼衍生物TD-52的抗癌效果。第二圖A係為HCC細胞中以不同TD-52濃度處理24小時會向下調節CIP2A蛋白質表現，收集細胞裂解物以西方墨點分析法分 析CIP2A、p-Akt、Akt蛋白質表現量；第二圖B係為HCC細胞中在不同時間下1μM TD-52處理會向下調節CIP2A蛋白質表現，收集細胞裂解物以西方墨點分析法分析CIP2A、p-Akt、Akt蛋白質表現量；第二圖C係表示HCC細胞以TD-52處理後PP2A活性提升，經由細胞裂解物量測PP2A磷酸酶活性，柱代表平均值，誤差線代表標準差(n=3)；第二圖D係TD-52對PP2A各次單位蛋白質表現量的影響，以西方墨點分析法確認PP2A次單元的表現量；第二圖E係為myc-標記CIP2A異位過量表現的PLC5細胞影響TD-52在PLC5細胞凋亡的效果，分別以流式細胞儀(右圖)及西方墨點分析法分析(左圖)，柱代表平均值，誤差線代表標準差(n=3)；第二圖F以PP2A抑制劑、黑海棉酸(OA)共處理會影響TD-52細胞凋亡的效果，分別以流式細胞儀(右圖)及西方墨點分析法分析(左圖)，柱代表平均值，誤差線代表標準差(n=3)；第二圖G係經由siRNA剔除PP2A催化區(PP2Ac)表現影響TD-52在PLC5細胞凋亡之效果，分別以流式細胞儀(右圖)分析細胞凋亡及西方墨點分析法分析p-Akt、PP2Ac及PARP的表現量(左圖)，柱代表平均值；誤差線代表標準差(n=3)；第二圖H係為myc-標記Akt1異位過量表現減少TD-52在PLC5細胞凋亡的效果，分別以流式細胞儀(右圖)及西方墨點分析法分析(左圖)，柱代表平均值，誤差線代表標準差(n=3)。
第三圖A至D係表示TD-52經由干擾Elk-1功能向下調節CIP2A的轉錄作用。第三圖A係為在劑量依賴方式及時間依賴方式以TD-52處理PLC5細胞會影響CIP2A的轉錄，不同的TD-52劑量處理(左上圖)及TD-52處理時間不同(左下圖)，利用RT-PCR定量CIP2A mRNA，柱代表平均值，誤差線代表標準差(n=3)，右圖係為西方墨點分析法檢測以蛋白質合成抑制劑放線菌酮(cycloheximide)及有(右下圖)或無(右上圖)TD-52處理的CIP2A蛋白質表現量；第三圖B係表示TD-52會影響CIP2A近端啟動子區域(n=3，*P<0.05，柱代表平均值，誤差線代表標準差，NS代表非顯著性)；第三圖C表示在PLC5細胞中TD-52會經由抑制Elk-1轉錄因子在細胞核的表現量，進而抑制CIP2A蛋白在細胞質隻表現量，核質分離後之細胞裂解物，以西方墨點分析法分析Elk-1及CIP2A蛋白質表現量，核層蛋白B(lamin B)及微管蛋白(tubulin)為對照組；第三圖D表示在PLC5細胞中TD-52會抑 制Elk-1結合至CIP2A的啟動子，利用染色質免疫沈澱技術(ChIP)確認在CIP2A啟動子結合位置Elk-1的結合能力，以電泳圖分析PCR產物(左圖)，在PLC5細胞中異位過量表現Elk-1會減少TD-52誘導癌細胞凋亡的效果(右上及右下)，柱代表平均值，誤差線代表標準差(n=3)。
第四圖A至D係以活體內PLC5小鼠模型及臨床上肝癌樣本證實CIP2A-PP2A-p-Akt信號路徑。第四圖A係為PLC5的異體移植小鼠模型分別給予索拉非尼、TD-52或二甲基亞(DMSO)(作為控制組)後的腫瘤生長曲線，*P<0.05，點代表平均值，條帶代表標準差(n=6)；第四圖B係以西方墨點分析法分析在PLC5異體移植腫瘤中CIP2A、p-Akt及Akt1的表現量；第四圖C係為分別以TD-52或DMSO(作為控制組)處理的PLC5異體移植腫瘤中PP2A活性分析，*P<0.05，柱代表平均值，誤差線代表標準差(n=3)；第四圖D係表示在PLC5細胞中以劑量依賴方式索拉非尼及TD-52對細胞活性的影響，柱代表平均值，誤差線代表標準差(n=3)；第四圖E係為信號路徑的示意圖說明在HCC細胞中TD-52對促進細胞凋亡的影響。第四圖F係為臨床肝癌腫瘤樣本p-Akt細胞核表現及CIP2A細胞質表現的免疫組織化學染色法影像圖。
第五圖A至F表示在肝癌患者腫瘤組織中SET過度表現。第五圖A係表示在成對的肝癌腫瘤組織及鄰近的正常組織中SET的免疫組織化學染色法影像圖；第五圖B在臨床上樣本中腫瘤組織及非腫瘤組織的平均SET表現量，柱代表平均值，誤差線代表標準差(n=294)；第五圖C表示相對於成對腫瘤組織對比非腫瘤組織表現量的比值，點代表每個患者的表現量的比質(n=147)，橫線代表所有病人平均比率；第五圖D上圖表示不同患者的SET及p-Akt的免疫組織化學染色法影像圖，下圖表示肝癌患者手術後經由SET及p-Akt共表現確認無復發存活率(recurrence-free survival)；第五圖E表示有及無剔除SET的PLC5細胞的細胞群形成影像及數目分析(n=6)，右下方以西方墨點分析法確認基因剔除的效果；第五圖F表示有及無剔除SET的Hep3B細胞的肝癌細胞微球(hepatosphere)形成影像及數目分析(n=6)。
第六圖A至F係以本發明之埃羅替尼衍生物(EMQA)作為 SET拮抗劑誘發肝癌細胞凋亡。第六圖A係為經由MTT分析EMQA抑制肝癌細胞的存活率，點代表平均值，條帶代表標準差(n=3)；第六圖B係以流式細胞儀分析經由EMQA劑量依賴處理的肝癌細胞凋亡，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)；第六圖C係以DNA片段化分析經由EMQA劑量依賴處理的肝癌細胞凋亡，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)；第六圖D以流式細胞儀(上圖)及西方墨點分析法(下圖)分析在時間依賴方式EMQA誘發p-Akt致癌蛋白表現量減少與肝癌細胞凋亡，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)，CF係代表切割型式；第六圖E係表示在EMQA及控制組治療的PLC5異體移植腫瘤小鼠的腫瘤生長曲線，點代表平均值，條帶代表標準差(n=10)；第六圖F係以西方墨點分析法分析PLC5異體移植腫瘤小鼠的腫瘤裂解物的p-Akt及Akt1(左圖)及PP2A活性(右圖)的表現量，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=10)。
第七圖A至E係說明EMQA以SET為標的強化PP2A-調節p-Akt向下調節的功能之抗癌幾轉。第七圖A以流式細胞儀及西方墨點分析法分析EMQA對具有myc-標記Akt異位表現的PLC5細胞的細胞凋亡效果，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)；第七圖B以流式細胞儀及西方墨點分析法分析EMQA對PP2A抑制劑、黑海棉酸(OA)共處理的PLC5細胞凋亡的效果減少，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)；第七圖C以流式細胞儀及西方墨點分析法分析EMQA對經由siRNA剔除PP2Ac的PLC5細胞的細胞凋亡效果減少，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)；第七圖D以西方墨點分析法分析EMQA向下調節p-Akt表現而不影響PI3K、PTEN及PDK1的表現；第七圖E以流式細胞儀及西方墨點分析法分析EMQA對myc-標記SET異位表現的Hep3B細胞凋亡效果減少，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)；第七圖F係以表面等離子共振(SPR左圖)與共免疫沉澱法(co-IP右圖)分析具有全長SET、N-末端片段(SETNTF，a.a.1-227)及C-末段片段(SETCTF，a.a.76-277)之重組蛋白與基因載體轉殖的Sk-Hep1細胞以確定EMQA作為SET拮抗劑的影響(左圖)，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)；以西方墨點分析法顯示EMQA顯著減少全長SET及SETCTF對PP2Ac的結合，不會影響SETNTF的結合(右圖)。
第八圖A至E係顯示在活體外(in vitro)及活體內(in vivo)EMQA與索拉非尼的組合對抗作用具有協同效果(synergism)。第八圖A係CalcuSyn分析軟體(Biosoft，劍橋，英國)分析EMQA與索拉非尼的組合在不同肝癌細胞以MTT測試細胞凋亡實驗結果，確認EMQA與索拉非尼的協同效果；第八圖B係以流式細胞儀及西方墨點分析法分析在肝癌細胞中EMQA顯著改善索拉非尼促進細胞凋亡的效果；第八圖C係為EMQA與索拉非尼的組合顯著抑制肝癌腫瘤生長的腫瘤生長曲線圖，點代表平均值(n=10)，*P<0.05；第八圖D係為以EMQA與索拉非尼的組合顯著抑制肝癌腫瘤生長的腫瘤重量數據圖，柱代表平均值，條帶代表標準差，*P<0.05；第八圖E係為分別分析以控制組及EMQA與索拉非尼的組合治療PLC5異體移植腫瘤小鼠的腫瘤的PP2A活性，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=10)(上圖)；以西方墨點分析法分析PLC5異體移植腫瘤小鼠的腫瘤的p-Akt、Akt1及SET的表現(下圖)。
第九圖A至D係為EMQA及紫杉醇(paclitaxel)結合可向下調節p-Akt。第九圖A係利用西方墨點分析法分析三種不同非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株以EMQA及/或紫杉醇向下調節p-Akt；第九圖B係在以時間依賴的方式EMQA及紫杉醇結合處理A549細胞株的p-Akt及聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)的表現量；第九圖C係在以劑量依賴的方式下EMQA及紫杉醇結合處理A549細胞株的p-Akt及PARP的表現量；第九圖D以流式細胞儀及西方墨點分析法分析EMQA對具有myc-標記Akt過量異位表現的A549細胞的細胞凋亡效果，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)。
第十圖A至E顯示在活體內(in vivo)EMQA與紫杉醇的組合對抗作用的效果。第十圖A係為利用控制組、紫杉醇及/或EMQA治療A549異體移植腫瘤小鼠的腫瘤生長曲線，點代表平均值，*P<0.05(每組治療n=10)；第十圖B係為利用控制組、紫杉醇及/或EMQA治療A549異體移植腫瘤小鼠的平均腫瘤重量，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=10)；第十圖像C係為PP2A活性分析圖，柱代表平均值，條帶代表標準差(n=3)；第十圖D係以西方墨點分析法分析A549異體移植腫瘤小鼠的腫瘤裂解物的 p-Akt及Akt表現量；第十圖E表示受治療的小鼠的體重改變，點代表平均值。
除非另有定義，本文所用之所有技術及科學術語與本發明所屬技術領域之技術人員通常理解的含義相同。本文所提及之所有出版物皆以引用方式併入本文，以揭露及描述與該被引用之出版物有關的方法及/或材料。
如本文所使用，單數形式「一」(a、an)和「該」(the)包括複數對象，除非該內文清楚地另有規定。因此，例如，參照「一樣品」包括複數個此類樣品以及本領域之技術人員已知的等同物。
本文所使用的「EMQA」代表本發明所述之埃羅替尼(Erlotinib)衍生物，其包含TD-52至TD-95、ITRI TD-627、ITRI TD-602至ITRI TD-605、ITRI TD-607、ITRI TD-608、ITRI TD-612至ITRI TD-626、ITRI TD-628至ITRI TD-631以及TD-632化合物。
「羧基」一詞係指基團-C(O)OR，其中R係為如本文定義之氫、低碳烷基、經取代的低碳烷基、芳基、經取代的芳基，及其類似物。
「鹵代烷基」一詞係指烷基基團被一個或多個鹵素原子所取代，這樣的實例包含，但並不限於，三氟甲基。
「鹵素」一詞係指氟、氯、溴、碘及鈪。
在本發明中研究埃羅替尼的結構與其生物活性之間的關係，並修改了埃羅替尼的結構。本發明據此開發了一些具有SET拮抗劑功能的埃羅替尼衍生物，並且意外地發現，相較於癌症常用藥物埃羅替尼(Erlotinib)、索拉非尼(Sorafenib)及紫杉醇(Paclitaxel)，這些化合物在某些疾病中，如癌症，具有良好的治療效果。根據本發明，本發明新設計之化合物作用為SET拮抗劑，且能有效治療以抑制SET的表現量為特徵之疾病或病症，如肝癌、白血病、肺癌、乳癌、腎癌、甲狀腺癌、頭部及頸部癌症。本發明之化合物以干擾SET-PP2A結合為目標進而活化PP2A達到使癌細胞凋亡的效果，因此，本發明之化合物透過一種新的標靶機制，提供替代的治療選擇，該選擇可能在對傳統醫藥治療具有抗性之癌症的治療上是極有 幫助的。
在本發明之一目的，提供一種可經芳基胺取代的喹喔啉，係具有如式I(a)或式I(b)之結構：
其中R1、R2及R3係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團、雜環芳香基，且該可經取代的苯基包含
在本發明之一實施例中，該式I(a)化合物如表一所列之化合物TD-52至TD-69以及ITRI TD-627，但不限於此。
在本發明之一實施例中，該式I(b)化合物如表二所列之化合物TD-70至TD-82，但不限於此。
在本發明之另一目的，提供可經芳基胺取代的喹喔啉，係具有式I(c)化學結構：
其中R4及R5係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團、雜環芳香基，且該可經取代的苯基包含 或，以及其中X係為鹵素、鹵代烷基、甲氧基、硝基、胺基、羧基、酸基、苯酮基或甲氧羰基。
在本發明之一實施例中，該式I(c)化合物如表三所列之化合物TD-83至TD-95、ITRI TD-602至ITRI TD-604、ITRI TD-607、ITRI TD-608、ITRI TD-613至ITRI TD-618、ITRI TD-620至ITRI TD-624及ITRI TD-629，但不限於此。
在本發明之另一目的，提供一種可經芳基胺取代的喹喔啉，係具有如式I(d)之結構：
其中R6及R7係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團、雜環芳香基，且該可經取代的苯基包含
在本發明之一實施例中，該式I(d)化合物如表四所列之化合物ITRI TD-605、ITRI TD-612、ITRI TD-619、ITRI TD-625、ITRI TD-626、ITRI TD-628、ITRI TD-630、ITRI TD-631，但不限於此。
在本發明之另一目的，提供一種化合物，係具有如下式II 之結構：
其中R8及R9係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團，且該可經取代的苯基包含、 、或，以及其中Y為CO或(CH2)n，n=1-3；Z=COOR10，或具有取代官能基之苯環，R10為芳香基或烷基取代基。
在本發明之一實施例中，該式II化合物如
本發明之化合物經合成後可以色層分析法或結晶法或本領域中已知的任何其他適當的方法進一步純化。
本發明提供一種醫藥組合物，包含一或多個上述之化合物以及一醫藥上可接受的載劑。本發明之醫藥組合物可用於阻礙蛋白質磷酸酶2A(PP2A)與癌蛋白SET的結合，以增加PP2A在細胞內的生物活性，或用於治療以PP2A的不活化或癌蛋白CIP2A與SET過度表現為特徵之疾病或病症。此外，將任何上述之化合物用於增加PP2A在細胞內的表現量或癌蛋白SET拮抗劑，或用於治療如本文所述之以PP2A的表現量減少或SET過度表現為特徵之疾病或病症的用途，以及用於治療該等疾病的藥劑的製造也包含在本發明的範圍之內。
本發明並提供一種增加PP2A或減少癌蛋白SET在細胞內的表現量或生物活性的方法，包含將該細胞與一有效量的本文所述之化合物或醫藥組合物接觸。本發明並進一步提供一種在需要PP2A的個體中治療以PP2A的不活化或SET過度表現為特徵之疾病或病症的方法，包含將本文所述之化合物或醫藥組合物以有效量投予至該個體。
本發明之化合物可以被用於治療以PP2A的不活化或癌蛋白SET過度表現為特徵之疾病或病症。本發明之化合物可以單獨或以醫藥組合物的形式投予人類病患一劑量，該醫藥組合物係與適當的載劑或賦形劑混合，以治療或改善各種以PP2A的表現量減少或癌蛋白SET過度表現為特徵之病症。一因子(例如PP2A)的表現量或生物活性的增加或減少可以藉由該因子的基因產物如蛋白質或RNA而容易地偵測到，在來自於一個體的檢體(例如自血液或活體組織而來)中使用本領域已知的檢測方法如酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、西方墨點分析法以及北方墨點分析法進行體外分析其RNA含量、表現蛋白及其類似物的結構及/或活性。根據本發明，以PP2A的不活化或癌蛋白SET及CIP2A過度表現為特徵之疾病或病症的具體實例包括，但不限於，癌症(例如肝癌、白血病、肺癌、乳癌、腎癌)及骨質疏鬆症。
「治療」一詞包括該特定失調或病症的預防，或與一特定失調或病症有關的症狀的減輕及/或該症狀的預防或消除。
具體而言，一「個體」係為一動物，如人類，但也可以是一寵物(例如，狗、貓及其類似物)、經濟動物(例如，牛、羊、豬、馬及其類 似物)或實驗用動物(例如，大鼠、小鼠、天竺鼠及其類似物)，該動物係需要如本文所述之治療。
本文所述之「有效量」係指在一個體上達到治療效果所需要的活性劑的量，不論是單獨或與一種或多種其他活性劑組合使用。根據給藥途徑、賦形劑的使用，以及與其他活性劑共同使用等不同情況，在由本領域技術人員確認下，有效量各不相同。
適合的給藥途徑可能包括如口服、直腸給藥、黏膜給藥、或腸道給藥；非經口傳輸，包括肌內、皮下、髓內注射，以及鞘內、直接心室內、靜脈、腹膜、鼻內或眼內注射，並可為補充或緩釋劑型。
本發明之醫藥組合物可以本領域已知之方式製造，例如，透過習用的混合、溶解、乳化、包埋、包封、或凍乾過程製造。因此，根據本發明所提供使用之醫藥組合物係可以常規的方式配製，使用一個或多個生理上可接受的載劑，包含賦形劑及/或助劑，以助於活性化合物的加工而形成醫藥上可使用的製劑。如本文所用，「可接受」係指該載劑必須與該組合物的活性成分相容(且較佳地，能夠穩定該活性成分)，且不會對受治療的個體有害。適當的劑型係取決於所選擇的給藥途徑。
具體而言，針對注射給藥，本發明之化合物可以被配製於例如生理上相容的緩衝液內，如漢克緩衝液、林格氏緩衝液或生理食鹽緩衝液。針對口服給藥，本發明之化合物的配製可經由將該活性化合物與本領域已知的醫藥上可接受之載劑結合，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，及/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP，polyvinylpyrrolidone)，以使本發明之化合物可以配製為片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液及其類似物。針對吸入法給藥，本發明之化合物可被配製為自加壓容器或噴霧器噴出之氣霧噴霧，並搭配使用適當的推進劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。
實施例1 化學合成
具體而言，在以下所示的反應式提供了本發明某些化合物的合成方案I至V。
1.1 合成方案I
本發明的化合物可以通過上述合成方案I製備得到，具體合成方案見實施例描述。在合成方案1中，先將1當量的2,3-二氯喹喔啉(2,3-dichloroquinoxaline)及2.3當量的苯胺類似物加入至3至5mL的異丙醇(isopropy alcohol)中，隨後加入2滴濃HCl。然後將混合物加熱至60℃隔夜且產生白色或黃色固體。反應完成後，該反應的混合物以異丙醇沖洗，得到二個取代基的喹喔啉衍生物，該產物進一步使用乙酸乙酯/己烷經由正相色譜法進行純化，以得到TD-52至TD-69及ITRI TD-627等化合物。
1.1.1 N 2 ,N 3 -雙(3-乙炔基苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(3-ethynylphenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-52)
1H NMR(400MHz,MeOH-d 4 )δ 3.47(s,1H)7.16(d,J=7.6Hz,1H),7.29-7.33(m,2H),7.56(dd,J=3.4,6.4Hz,1H),7.84(dd,J=8.0,1.2Hz,1H),7.96(s,1H)。
1.1.2 N 2 ,N 3 -雙(4-苯氧基苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(4-phenoxyphenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-53)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 7.02(d,J=7.6Hz,2H),7.08-7.13(m,3H),7.32(s,1H),7.38(t,J=7.2Hz,2H),7.53(s,1H),7.92(d,J=8.4Hz,2H)。
1.1.3 N 2 ,N 3 -二苄基喹喔啉-2,3-二胺(TD-54)(N 2 ,N 3 -dibenzylquinoxaline-2,3-diamine)(TD-54)
1H NMR(400MHz,MeOH-d 4 )δ 4.72(s,2H),7.18-7.24(m,2H),7.29(t,J=7.2Hz,2H),7.38(d,J=7.2Hz,2H),7.52(dd,J=3.4,6.4Hz,1H)。
1.1.4 N 2 ,N 3 -聯苯喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -diphenylquinoxaline-2,3-diamine)(TD-55)
1H NMR(400MHz,MeOH-d 4 )δ 7.10(t,J=7.6Hz,1H),7.34(dd,J=3.4,6.4Hz,1H),7.39(t,J=7.6Hz,2H),7.58(dd,J=3.4,6.4Hz,1H),7.83(d,J=8.0Hz,2H)。
1.1.5 N 2 ,N 3 -雙(3-氯苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(3-chlorophenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-56)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 7.14(d,J=8.0Hz,1H),7.38-7.43(m,2H),7.60(dd,J=3.2,6.0Hz,1H),8.02(d,J=8.4Hz,1H),8.24(s,1H)。
1.1.6 N 2 ,N 3 -雙(2-氟-5-甲基苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(2-fluoro-5-methylphenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-58)
1H NMR(400MHz,MeOH-d 4 )δ 2.42(s,3H),7.23(s,1H),7.25(d,J=1.2Hz,1H),7.43(dd,J=3.4,6.4Hz,1H),7.51(d,J=7.2Hz,1H),7.61(dd,J=3.4,6.4Hz,1H)。
1.1.7 N 2 ,N 3 -雙(3-苯***)喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(3-ethylphenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-59)
1H NMR(400MHz,MeOH-d 4 )δ 1.23(t,J=7.6Hz,3H),2.61(q,J=7.6Hz,2H),6.86(d,J=7.6Hz,1H),7.21(t,J=7.6Hz,1H),7.26(s,1H),7.54-7.56(m,2H),7.62(d,J=7.6Hz,1H)。
1.1.8 N 2 ,N 3 -雙(3-(三氟甲基)苯基)喹喔啉-2,3二胺(N 2 ,N 3 -bis(3-(trifluoromethyl)phenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-60)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 7.40(t,J=8.0Hz,2H),7.58(dd,J=3.6,5.6Hz,1H),7.62(t,J=8.0Hz,1H),8.19(d,J=8.0Hz,1H),8.34(s,1H),9.33(s,1H)。
1.1.9 2,2'-((喹喔啉-2,3-亞基雙(脲二基))雙(4,1-苯二胺；))乙腈(2,2'-((quinoxaline-2,3-diylbis(azanediyl))bis(4,1-phenylene))diacetonitrile)(TD-62)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 4.03(s,2H),7.35-7.39(m,3H),7.58(dd,J=3.4,6.4Hz,1H),7.99(d,J=8.8Hz,2H)。
1.1.10 N 2 ,N 3 -雙(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-63)
1H NMR(400MHz,MeOH-d 4 )δ 7.28(dd,J=3.6,6.0Hz,1H),7.45(d,J=8.8Hz,1H),7.48(dd,J=3.4,6.4Hz,1H),8.03(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),8.34(d,J=2.4Hz,1H)。
1.1.11 N 2 ,N 3 -雙(4-(三氟甲氧基)苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(4-(trifluoromethoxy)phenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-65)
1H NMR(400MHz,MeOH-d 4 )δ 7.26(d,J=8.4Hz,2H),7.32(dd,J=3.2,6.0Hz,1H),7.57(dd,J=3.2,6.0Hz,1H),7.90(d,J=9.2Hz,2H)。
1.1.12 5,5'-(喹喔啉-2,3-亞基雙(脲二基)雙(2-甲基苯酚)(5,5'-(quinoxaline-2,3-diylbis(azanediyl))bis(2-methylphenol))(TD-66)
1H NMR(400MHz,MeOH-d 4 )δ 2.24(s,3H),7.03(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.21(d,J=8.0Hz,1H),7.26(s,1H),7.44(dd,J=3.4,6.0Hz,1H),7.67(dd,J=3.4,6.0Hz,1H)。
1.1.13 N 2 ,N 3 -雙(4-(五氟硫基)苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(4-(Pentafluorothio)phenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-68)
1H NMR(400MHz,MeOH-d 4 )δ 7.41(dd,J=3.6,6.0Hz,1H),7.67(dd,J=3.4,6.4Hz,1H),7.79(d,J=9.2Hz,2H),8.03(d,J=8.8Hz,2H)。
1.2 合成方案II
本發明的化合物可以通過上述合成方案II製備得到，具體合成方案見實施例描述。在合成方案II中，先將1當量的2,3-二氯喹喔啉(2,3-dichloroquinoxaline)及1當量的苯胺類似物加入至3至5mL的異丙醇中，隨後加入1滴濃HCl。然後將混合物經由微波爐加熱至150℃ 30分鐘。反應完成後，將該反應混合物以異丙醇(IPA)過濾以產生白色固體，該反應的混合物以異丙醇沖洗，該產物使用醚或乙酸乙酯烷沖洗以得單一取代的喹喔啉衍生物，其係為TD-70至TD-82等化合物。
1.2.1 3-氯-N-(3,5-二氯苯基)喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(3,5-dichlorophenyl)quinoxalin-2-amine)(TD-78)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 7.20-7.28(m,4H),7.52(d,J=8.0Hz,1H),8.35(s,2H),9.82(s,1H)。
1.2.2 3-氯-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)quinoxalin-2-amine)(TD-79)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 7.21-7.26(m,3H),7.47(d,J=8.0Hz,1H),7.64(d,J=8.8Hz,1H),8.47(d,J=8.8Hz,1H),8.89(s,1H),9.97(s,1H)。
1.2.3 3-氯-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(4-(trifluoromethoxy)phenyl)quinoxalin-2-amine)(TD-80)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 7.19-7.20(m,3H),7.34(d,J=8.4Hz,2H),7.50(d,J=7.6Hz,1H),8.28(d,J=8.4Hz,2H),9.65(s,1H)。
1.2.4 3-氯-N-(4-(五氟硫基)苯基)喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(4-(Pentafluorothio)phenyl)quinoxalin-2-amine)(TD-81)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 7.22-7.27(m,3H),7.54(d,J=7.6Hz,1H),7.84(d,J=8.4Hz,2H),8.38(d,J=8.8Hz,2H),9.90(s,1H)。
1.3 合成方案III
本發明的化合物可以通過上述合成方案III製備得到，具體合成方案見實施例描述。在合成方案III中，先將4個位置有修飾的苯二胺a溶解在2mL的濃HCl並加熱至180℃隔夜，該混合物以水過濾並乾燥後獲得沉澱的中間產物b。然後將該中間產物b溶解至POCl3並加熱至110℃ 3小時。反應混合物降溫至室溫之後，將其倒入冰水中產生沉澱物，將該沉澱物以烤箱烘乾以獲得中間產物c。將苯胺及中間產物c溶解在IPA中，隨後加入2滴濃HCl，然後將混合物加熱至60℃隔夜。將該混合物以IPA過濾以產生沉澱物，將該沉澱物進一步使用色譜法進行純化，以得到TD-83至TD-95、ITRI TD-602至ITRI TD-604、ITRI TD-607、ITRI TD-608、ITRI TD-613至ITRI TD-618、ITRI TD-620至ITRI TD-624、ITRI TD-629等化合物。
1.3.1 甲基2,3-雙((4-(三氟甲氧基)苯基)胺基)喹喔啉-6-羧酸(methyl 2,3-bis((4-(trifluoromethoxy)phenyl)amino)quinoxaline-6-carboxylate)(TD-94)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 3.84(s,3H),7.38(dd,J=4.4,8.0Hz,4H),7.56(d,J=8.4Hz,1H),7.83(dd,J=8.6,1.6Hz,1H),8.10(d,J=1.2Hz,1H),8.18(t,J=8.8Hz,4H)。
1.3.2 N 2 ,N 3 -雙(4-甲氧苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-602)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.79(s,6H),7.00(dd,4H),7.56(d,1H),7.89(dd,4H),8.03(d,1H),8.23(s,1H),10.0(b,2H)。
1.3.3 N 2 ,N 3 -bis(3-乙炔基苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(3-ethynylphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-604)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 4.19(s,1H),4.20(s,1H)7.23(dd,2H),7.42(m,3H),7.64(d,1H),8.11(b,4H),8.23(s,1H),10.1(b,2H)。
1.3.4 N 2 ,N 3 -雙(4-三氟甲基)苯基)喹喔啉-2,3,6-三胺 (N 2 ,N 3 -bis(4-(trifluoromethyl)phenyl)quinoxaline-2,3,6-triamine)(ITRI TD-607)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 7.71(d,1H),7.77(m,H),8.1(m,5H),9.66(s,1H),9.80(s,1H)。
1.3.5 N 2 ,N 3 -雙(3-甲氧苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(3-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-608)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.98(s,3H),3.97(s,3H),6.68(dd,2H),7.27(t,2H),7.43(d,1H),7.44(d,1H),7.61(s,1H),7.62(m,2H),8.05(d,1H),8.25(s,1H),9.28(s,1H),9.35,(s,1H)。
1.3.6 3-(2-(3-氫氧苯胺)-6-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(3-(2-(3-hydroxyphenylamino)-6-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)(ITRI TD-613)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 6.68(dd,2H),7.09(m,2H),7.18(m,2H),7.58(d,1H),7.61(d,1H),7.70(d,1H),8.10(d,1H),8.31(s,1H),9.60-10.1,(b,4H)。
1.3.7 N 2 ,N 3 -雙(3-溴苯)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺 (N 2 ,N 3 -bis(3-bromophenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-618)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 7.00(dd,1H),7.19(m,2H),7.30(m,1H),7.58(d,1H),7.39(dd,2H),7.62(d,1H),8.05(m,3H),8.38(s,1H),10.2-10.6,(b,2H)。
1.3.8 N 2 ,N 3 -雙(4-氟苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(4-fluorophenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-620)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 7.25(m,4H),7.59(d,1H),7.88(m,4H),8.06(d,1H),8.26(s,1H),9.34(s,1H),9.51(s,1H)。
1.3.9 N 2 ,N 3 -雙(4-氯-3-氟苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺N 2 ,N 3 -bis(4-chloro-3-fluorophenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine(ITRI TD-624)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 7.41(dd,2H),7.68(m,3H),7.95(s,1H),8.08(s,1H),8.10(d,1H),8.30(s,1H),10.0(b,2H)。
1.3.10 N 2 ,N 3 -雙(4-苯磺醯胺)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N 2 ,N 3 -bis(4-phenylsulfonamide)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(IT RI TD-629)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 7.29(b,4H),7.74(d,1H),7.88(d,4H),8.20(m,5H),8.42(s,1H),10.14(s,1H),10.30(b,1H)。
1.4 合成方案IV
本發明的化合物可以通過上述合成方案IV製備得到，具體合成方案見實施例描述。在合成方案IV先分別將1當量的4-(2-氯-7-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(4-(2-chloro-7-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)、3-氯-N-(4-甲氧苯基)-6-硝基喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxalin-2-amine)、4-(2-氯-7-硝基喹喔啉-3-基胺基)-3-甲基苯酚(4-(2-chloro-7-nitroquinoxalin-3-ylamino)-3-methylphenol)或3-氯-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-6-硝基喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)-6-nitroquinoxalin-2-amine)與1.2當量的苯胺化合物加入3至5mL的DMF，隨後加熱至110℃ 3小時。反應完成後，將該反應混合物加水並以乙酸乙脂萃取，將乙酸乙脂經水洗、乾燥後減壓抽乾，得到粗產物。將粗產物進一步使用乙酸乙酯/己烷經由正相色譜法進行純化可分別得到ITRI TD-605、ITRI TD-612、ITRI TD-619、ITRI TD-625、ITRI TD-626、ITRI TD-628、ITRI TD-630、ITRI TD-631等化合物。
1.4.1 N 3 -(3-乙炔基苯基)-N 2 -(4-甲氧基苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N 3 -(3-ethynylphenyl)-N 2 -(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TR-605)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.78(s,3H),4.21(s,1H), 7.00(d,2H),7.21(d,1H),7.42(t,1H),7.59(d,1H),8.01(dd,2H),8.02(d,2H),8.07(d,1H),8.26(s,1H),9.34(s,1H),9.41(s,1H)。
1.4.2 3-(2-(4-甲氧基苯基胺)-6-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(3-(2-(4-methoxyphenylamino)-6-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)(ITRI TD-612)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.78(s,3H),6.51(d,1H),7.02(dd,2H),7.17(t,1H),7.24(d,1H),7.56(d,1H),7.68(s,1H),7.77(dd,2H),8.06(d,1H),8.30(s,1H),9.16(s,1H),9.45(s,1H),9.47(s,1H)。
1.4.3 4-(2-(3-乙炔基苯基胺)-7-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(4-(2-(3-ethynylphenylamino)-7-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)(ITRI TD-619)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 4.19(s,1H),6.81(dd,2H),7.20(d,1H),7.22(t,1H),7.54(d,1H),7.60(dd,2H),8.00(d,2H),8.05(d,1H),8.23(s,1H),9.31(b,2H),9.39(b,1H)。
1.4.4 4-(2-(3-乙炔苯基胺)-7-硝基喹喔啉-3-基胺基)-3-甲基苯酚(4-(2-(3-ethynylphenylamino)-7-nitroquinoxalin-3-ylamino)-3-methylphenol)(ITRI TD-625)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 2.05(s,3H),4.21(s,1H),6.65(d,1H),6.67(s,1H),7.13(d,1H),7.21(d,1H),7.42(m,2H),8.05(d,1H),8.05(m,2H),8.26(s,1H),9.10(s,1H),9.25(s,1H),9.39(s,1H)。
1.4.5 N 3 -(4-(三氟甲基)苯基)-N 2 -(4-甲氧基苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N 3 -(4-(trifluoromethyl)phenyl)-N 2 -(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-626)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.89(s,3H),7.00(d,2H),7.59(d,1H),7.77(m,4H),8.11(d,1H),8.17(d,2H),8.36(s,1H),9.47(s,1H),9.56(s,1H)。
1.4.6 4-(2-(5-甲基-1H-吡唑-3-基胺基)-6-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(4-(2-(5-methyl-1H-pyrazol-3-ylamino)-6-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)(ITRI TD-628)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 2.28(s,3H),6.80(d,2H),6.88(s,1H),7.64(d,1H),7.65(d,2H),8.03(d,1H),8.21(s,1H),9.28(s,1H),9.30(s,1H),10.2(s,1H)。
1.4.7 N 3 -(4-氟苯基)-N 2 -(4-甲氧基苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N 3 -(4-fluorophenyl)-N 2 -(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-631)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.78(s,3H),7.00(d,2H), 7.26(t,2H),7.57(d,1H),7.93(d,2H),7.92(dd,2H),8.07(d,1H),8.25(s,1H),9.31(s,1H),9.40(s,1H)。
1.5 合成分案V
本發明的化合物可以通過上述合成方案V製備得到，在合成方案V中；先將1當量的(2,3-二氯喹喔啉-6-基)(苯基)甲酮((2,3-dichloroquinoxalin-6-yl)(phenyl)methanone)與1.2當量的3-乙炔基苯胺(3-ethynylbenzenamine)於IPA中加熱迴流5小時後冷卻，將析出的固體再以IPA洗滌，所得固體經烘乾可得到產物TD-632(式II)。
1.5.1 2,3-雙(3-乙炔苯基胺)喹喔啉-6-基)(苯基)甲酮(2,3-bis(3-ethynylphenylamino)quinoxalin-6-yl)(phenyl)methanone)(TD-632)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )4.2(s,1H),4.1(s,1H).7.24(d,1H),7.25(d,1H),7.56(d,2H),7.40(m,2H),7.6(m,3H),7.64(m 3H),7.79(m 2H)7.82(s 1H),8.15(b,2H),9.25(b,2H)。
實施例2 生物活性檢測 2.1 材料與方法 2.1.1 試劑與抗體
索拉非尼(Sorafenib)(蕾莎瓦膜衣錠)、埃羅替尼(Erlotinib)(得舒緩膜衣錠)紫杉醇(Paclitaxel)係分別由由拜耳製藥公司(Bayer Pharmaceuticals)(西哈芬，康乃迪克州)及羅氏大藥廠(Roche Pharmaceuticals)(巴賽爾，瑞士)提供。黑海棉酸(okadaic acid，OA)購自開曼化學公司(Cayman Chemical)(安娜堡，密西根州)以及z-VAD-fmk購自西格瑪(Sigma)(聖路易、蜜蘇里州)。關於活體外(in vitro)實驗，各種藥物皆溶解 於二甲基亞碸(DMSO)中，並細胞培養在含有5%胎牛血清(FBS)的DMEM杜氏改良Eagle培養基(dulbecco's modified eagle's medium)或RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培養基中。
關於活體內(in vitro)實驗，加入至培養基後最後DMSO的濃度係為0.1%。免疫墨點分析所用的抗體，如抗-CIP2A、抗-Akt1、抗-PAPP、anti-PP2A-C、抗-PP2A-A、抗-PP2A-B55及抗-Elk-1均購自聖克魯斯生物技術公司(Santa Cruz Biotechnology)(聖地牙哥，加州)。其他抗體，如抗-半胱氨酸蛋白酶-3(anti-caspase-3)及抗-P-Akt(Ser473)均來自細胞信號轉導公司(Cell Signaling)(丹弗斯，麻州)。
2.1.2 細胞培養
Sk-Hep1、PLC/PRF/5(PLC)及Hep3B細胞株則獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(馬那薩斯，維吉尼亞州)。Huh-7肝癌細胞株係獲自健康科學研究資源庫(Health Science Research Resources Bank)(大阪，日本；JCRB0403)。上述細胞維持在含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，置於37℃含有5%二氧化碳的加濕培養箱中。其他的細胞株，包括非小細胞肺癌細胞株H358、H460及A549以及人類鱗癌細胞NCI-1703、H2170、H520、SW900及NCI-H226均獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(馬那薩斯，維吉尼亞州)等亦提供給如下所述細胞檢測使用。
2.1.3 細胞凋亡分析
在以DMSO、索拉非尼、本發明之埃羅替尼衍生物處理後，使用流式細胞儀(sub-G1)對凋亡的細胞進行計量。使用膜聯蛋白-V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙重染色法檢測細胞凋亡及壞死的數量。上述兩種分析方式，本發明之埃羅替尼衍生物處理後將HCC細胞收成，在與PI單獨培養以作為sub-G1分析使用，以及與膜聯蛋白-V-FITC組合培養。以流式細胞儀進行細胞組合物的分析；經由半胱氨酸蛋白酶以及剪切的PAPP以西方墨點分析評估本發明之埃羅替尼衍生物誘導細胞死亡效果；以細胞質組蛋白相關的DNA片段化的酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)檢測細胞死亡(羅氏，印第安納波利斯，印第安納州)。經由西方墨點分析及流式細胞 儀評估以本發明之埃羅替尼衍生物及z-VAD-fmk、半胱氨酸蛋白酶共處理的效果。
2.1.4 西方墨點分析法
細胞與半胱氨酸蛋白酶-3、PAPP、P-Akt、Akt、CIP2A等處理一段時間後細胞裂解物以西方墨點分析法分析。
2.1.5 使用siRNA進行基因剔除
Smart-pool siRNA，包括對照組(D-001810-10)以及PP2A-C(L-001810-10)，均購自Dharmacon公司(芝加哥，伊利諾州)。11121-11133)。依據製造商的操作手冊，在六孔盤內使用Dharma-FECT4轉染液(Dharmacon公司)以siRNA(最後濃度100nM)進行細胞第一次轉染48小時，之後替換為培養液，再將細胞以本發明之埃羅替尼衍生物(2μM，48小時)，然後收成細胞以進行西方墨點分析法及流式細胞儀的細胞凋亡分析。
2.1.6 過渡性轉染(Transient transfection)
CIP2A cDNA(KIAA1524)及Elk-1 cDNA購自Origene公司(RC219918及RG208921；羅克維爾，馬利蘭州)。進行轉染48小時之後，細胞以本發明之埃羅替尼衍生物處理一段時間後接者收成以進一步分析。
2.1.7 PP2A磷酸酶活性
使用孔雀石綠磷酸鹽複合物分析(malachite green-phosphate complex assay)(upstate生物科技公司，普萊西德湖，紐約州)量測從蘇胺酸磷酸肽產生游離的磷酸鹽以確定在每一個細胞裂解物的蛋白磷酸酶活性。先在低洗滌劑裂解緩衝液(low-detergent lysis buffer)中製備HCC細胞裂解液，在含有750μM磷酸肽受質的PP2A-特定反應緩衝液(密理博公司，比爾里卡，麻州)中進行磷酸酶分析。在30℃培養10分鐘後，加入孔雀石染劑且在650nm下經由光密度量測游離的磷酸鹽。為避免樣本之間免疫沉澱蛋白質數量的差異而導致差異，磷酸酶活性以每個處理群組皆經過免疫印跡檢測及定量的PP2A免疫沉澱數量標準化。
2.1.8 建構螢光酶報導子分析CIP2A啟動子及5’端檢測
依據上述研究的PLC5細胞的基因組DNA含有外顯子1(-2000bp至-1bp)的CIP2A啟動子上游區域以PCR進行擴增，以及選殖至 報導子載體，Friefly載體(pGL4.17)經由KpnI及Bg/II限制酶切割，PCR擴增的引子區域-1000/-1、-400-/-1、-300/-1、-150/-1、-110/-1選殖至pGL4載體KpnI及Bg/II限制酶切割位置，經由定序確認選殖的核苷酸序列。
2.1.9 染色質免疫沈澱技術(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)分析
Chip試劑組購買自Novus生物公司(NBP1-71709，利特爾頓，科羅拉多州)。以1×107個PLC5細胞數進行ChIP，該細胞以本發明之埃羅替尼衍生物處理16小時，以37%甲醛v/v(Sigma公司，F1635)在1%最終濃度達到1%，在室溫下DNA結合蛋白與DNA交聯10分鐘。交聯後，該細胞以含有蛋白酶抑制劑混合物(Cocktail)的1倍冰PBS清洗兩次，收集細胞以800×g離心5分鐘，以400μl含有蛋白酶抑制劑混合物(Cocktail)的裂解緩衝液再懸浮。然後該細胞以六次脈衝超聲波處理，每個脈衝50%輸出15秒，每個脈衝之間休息60秒。在4℃下將細胞裂解物以12500×g離心5分鐘，加入Elk1或兔子IgG抗體最為陰性對照組進行免疫沉澱，在4℃下該免疫複合物以25μl蛋白質A/G磁珠處理進行沉澱反應1小時。使用400μl洗脫緩衝液將蛋白質-DNA複合物從磁珠沖洗出來，在95℃下蛋白質-DNA的交聯經由8μl 5M的NaCl去交聯15分鐘。利用自旋管柱(spin column)純化DNA，取2μl DNA進行半定量PCR反應擴增CIP2A啟動子區域(-139/-16bp)。
2.1.10 異體移植(xenograft)腫瘤的生長
雄性NCr無胸腺裸鼠(5-7週齡)係自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)(台北，台灣)而來。所有使用這些小鼠進行的實驗程序，皆按照國立臺灣大學批准的實驗操作程序。當1×106個PLC5或A549細胞數懸浮在含有Matrigel(基底膜基質，BD生物科技，貝德福爾，馬薩諸塞州)不含血清的培養基中。當小鼠腫瘤達到100-150mm3，對小鼠進行口服灌胃給予實驗預定之治療，如每天每公斤10mg索拉非尼、本發明之埃羅替尼衍生物或控制組4周。
2.1.11 免疫組織化學染色法
石蠟包埋的HCC組織切片(4mm)在聚-1-賴氨酸包被玻 片(poly-1-lysine-coated slides)上去包埋，以10mM Tris-HCl(pH7.4)及150mM氯化鈉沖洗，過氧化氫酶以甲醇及3%過氧化氫抑制(quenched)，然後在100℃下加壓加熱室內將玻片放置於10mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)20分鐘。以1：200稀釋的p-Akt1/2/3(Thr 308)-抗體(ab8805，abcam公司，劍橋)以及以1：100稀釋的CIP2A抗體(ab84547，abcam公司，劍橋)在室溫下處理1小時，玻片以PBD完全地清洗三次。使用EnVision過氧化氫酶檢測系統/DAB兔子/小鼠試劑組(Dako公司，格洛斯楚普)檢測已結合的抗體，然後該玻片以蘇木精(hematoxylin)反染色。小鼠石蠟包埋切片腎組織和人類結腸癌分別作為p-Akt1/2/3及CIP-2A的陽性對照組。陰性對照組以PBS取代初級抗體。經由認證的病理學家基於半定量的染色強度評估p-Akt1/2/3及CIP-2A的表現，染色強度的評分為負、弱、中等及強。
2.2.12 表面等離子共振(Surface plasmon resonance)
本發明分析全長SET及截斷SET結合至PP2Ac(PP2A的催化區)的結合親和力以及本發明之埃羅替尼衍生物干擾SET及PP2Ac的效果。PP2Ac-GST重組蛋白結合至具有GST捕捉抗體的CM5晶片，經由注射不同濃度本發明之埃羅替尼衍生物與固定濃度的SET組合蛋白質，或在固定劑量本發明之埃羅替尼衍生物不同濃度的截斷SET蛋白質所產生的傳感圖(sensergram)。PP2Ac-GST重組蛋白購自亞諾法生技公司(H00005515，Abnova公司，台灣)以及SET-His重組蛋白購自Genway公司(GWB-ATG319)。
2.2.13 統計分析
腫瘤生長數據為平均腫瘤體積±S.E.並與獨立樣本t-檢驗進行比較，臨床樣本以X 2 -檢驗進行比較。在雙尾檢驗P值<0.05視為顯著意義。所有統計分析採用在支援Windows軟體的SPSS軟體計算(第17.0版，SPSS公司，芝加哥，伊利諾州)。
2.1 結果 2.2.1 本發明之埃羅替尼(erlotinib)衍生物增加HCC細胞凋亡
本發明以埃羅替尼衍生物TD-52及埃羅替尼進行在HCC細胞中抗癌活性之比較。本發明使用MTT分析以證實HCC細胞暴露 於TD-52及埃羅替尼48小時之後的細胞活性，並以DMSO處理做為對照組，其結果如第一圖A所式，在HCC細胞株(包含HA22T、Hep3B、PLC5及Hep3B)測試中TD-52對癌細胞活性的減少優於埃羅替尼，其中包含HA22T(IC50=0.9μmol/l)、Hep3B(IC50=0.9μmol/l)、PLC5(IC50=0.8μmol/l)及Sk-Hep1(IC50=1.2μmol/l)。為進一步確認細胞凋亡的程度，將四個細胞株分別以TD-52及埃羅替尼處理24小時後，以流式細胞儀確認sub-G1細胞的比例，如第一圖B所示，在劑量依賴下sub-G1分析反映出與MTT分析中一樣的結果，也就是TD-52比埃羅替尼更具有抗癌的效果。
為更確認TD-52抗癌的特性，本發明進行膜聯蛋白-V/PI雙重染色法、西方墨點分析、細胞週期分析及DNA片段化分析(第一圖C至第一圖E)。在劑量逐漸增加下，以膜聯蛋白-V/PI雙重染色法分析細胞凋亡及細胞壞死的比例，其結果發現以2μM TD-52及更高劑量處理四個細胞株中48小時之後，癌細胞死亡的程度(包含細胞凋亡及壞死)為50%或更高(第一圖C)，且Hep3B細胞對於TD-52誘導壞死細胞死亡較為敏感，而相同劑量下在HA22T、PLC5及Sk-Hep1細胞中大部分為誘導細胞凋亡死亡。而西方墨點分析結果中，以TD-52處理的細胞會誘發半胱氨酸蛋白酶-9、半胱氨酸蛋白酶-3的活性及聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)產生裂解物(第一圖D)。再者，TD-52(2μM)與z-VAD-fmk、pan-半胱氨酸蛋白酶抑制劑共處理48小時後，會減少TD-52誘發細胞凋亡的結果(第一圖F)。同時，在較低濃度TD-52處理(1μmol/l，24小時)會誘發癌細胞DNA片段化(第一圖E)。但TD-52並不具有與埃羅替尼相同抑制上皮細胞成長因子接受體(EGFR)激酶抑制劑的效果(第一圖G)。因此，本發明之埃羅替尼衍生物的抗癌活性之效果優於埃羅替尼，且該活性係經由異於上皮細胞成長因子接受體(EGFR)激酶抑制的機轉。
此外，本發明之各個埃羅替尼衍生物亦分別以1μM及10μM處理人類鱗癌細胞NCI-1703、H2170、H520、SW900及NCI-H226、非小細胞肺癌A549、H358細胞株進行細胞活性及IC50檢測，其結果陳列於表五，證實本發明之埃羅替尼衍生物能有效促進癌細胞死亡。
2.2.2 本發明之埃羅替尼衍生物可經由抑制CIP2A強化PP2A活性
本發明進一步探討本發明之埃羅替尼衍生物TD-52的作用機制，特別注重於蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)-蛋白質磷酸酶2A(PP2A)-p-Akt信號路徑。如第二圖A及B所示，在劑量及時間依賴的方式下TD-52向下調節CIP2A及p-Akt的表現。再者，HCC細胞經由1μM TD-52的處理24小時後可提升PP2A的活性(第二圖C)，而與PP2A相關的次單元(subunit)、PP2A-A、PP2A-B5及PP2A-C次單元的表現量不受影響。依據上述結果，TD-52處理係經由抑制CIP2A表現而提升PP2A活性，進而向下調節p-Akt及導致HCC細胞凋亡(第二圖D)。
為確認經由TD-52誘發細胞凋亡CIP2A-PP2A-p-Akt信號路徑扮演的角色，本發明以過渡型轉染(Transient transfection)具有myc-標記CIP2A異位表現的PLC5細胞48小時(第二圖E)，再以2μM TD-52處理24小時後，相較於野生型細胞在CIP2A-過度表現細胞中p-Akt的表現量被向上調節。甚至，本發明利用sub-G1分析發現TD-52的凋亡影響係顯著在該些CIP2A-過度表現細胞中減少。接者，本發明利用兩個方法確認PP2A在TD-52處理的HCC細胞中扮演的角色，經由沉默RNA(siRNA)剔除PP2A基因，並與PP2A抑制劑、黑海棉酸(OA)共處理(第二圖F及G)。當PLC5細胞以100nM OA處理時，p-Akt的表現量會提升，並減少TD-52-誘發HCC腫瘤細胞凋亡(第二圖F)。同樣的，當PP2A被經由siRNA剔除時，p-Akt的表現量會增加且TD-52的抗癌效果減少。本發明經由過渡型轉染產生Akt-過度表現PLC5細胞，並發現HCC細胞TD-52誘發細胞凋亡顯著減少(第二圖H)，該些結果證實CIP2A-PP2A-p-Akt信號路徑在調節HCC細胞TD-52抗癌效果中扮演關鍵性的角色。
2.2.3 本發明之埃羅替尼衍生物誘發細胞凋亡在CIP2A-PP2A-p-Akt信號路徑的分子機制
為進一步確認TD-52如何影響CIP2A-PP2A-p-Akt信號路徑，本發明確認當蛋白質合成抑制劑放線菌酮(cycloheximide)阻礙轉譯作用時，TD-52是否會影響CIP2A蛋白質的降解(degradation)，並以DMSO處理做為對照組，其結果如第三圖A所示，CIP2A蛋白質的降解所需的時間不會因有或沒有TD-52而受影響，但經由RT-PCR的檢測結果發現其 mRNA表現是因TD-52處理而被抑制。該結果顯示TD-52可抑制CIP2A的轉錄作用。本發明進一步確認CIP2A啟動子的作用機制，當CIP2A基因啟動子與螢光素酶(luciferase)報導子連接時，發現在劑量依賴的方式下TD-52會抑制螢光素酶的活性(第三圖B上圖)。本發明建構一系列pGL4螢光素載體缺失選植株以確認CIP2A基因啟動子區域中的序列對TD-52的影響是關鍵性的，如第三圖B所示，再具有-110/-1載體的細胞中TD-52處理不會影響螢光素酶活性，此結果說明再PLC5細胞中-110及-150之間還有CIP2A表現的結合位置。在先前文獻中提及Elk-1會結合至該位置上，在子宮頸癌及子宮內膜癌中Elk-1會與另一個轉錄因子Ets-1一起調節CIP2A的表現。因此，本發明經由西方墨點分析法確認經TD-52處理的PLC5細胞檢測Elk-1及CIP2A的表現，已確認Elk-1在調節CIP2A-PP2A-p-Akt信號路徑扮演的角色，其結果發現在肝癌細胞中Elk-1轉錄因子會透過在細胞核中表現進而調控CIP2A基因的轉錄，但在經TD-52處理後的PLC5細胞，CIP2A及Elk-1表現是顯著被抑制的(第三圖C)。本發明以染色質免疫沈澱技術(ChIP)及定量PCR確認Elk-1與CIP2A啟動子基因之間的關係(第三圖D)，在未處理的細胞中，以交聯蛋白質-DNA複合物檢測Elk-1表現可證實Elk-1結合至CIP2A基因的啟動子區域，再者，當細胞暴露於TD-52時，在劑量依賴方式下Elk-1的表現是減少的。因此，此結果表示TD-52經由干擾Elk-1與CIP2A啟動子之間的結合進而導致CIP2A轉錄減少向下調節CIP2A。當CIP2A受抑制時，PP2A活化導致Akt去磷酸化使癌細胞凋亡。再者，Elk-1過度表現會減少TD-52誘導CIP2A向下調節作用及癌細胞凋亡(第三圖D，右欄)。
2.2.4 本發明之埃羅替尼衍生物對帶有PLC5的異體移植的體內作用
本發明裡用PLC5的異體移植小鼠模型評估TD-52在活體內(in vivo)的影響。本發明使用目前臨床上的抗癌藥物索拉非尼(10/mg/kg)、TD-52(10/mg/kg)或DMSO(作為控制組)，給予四周後，接受索拉非尼及TD-52的小鼠的腫瘤尺寸小於控制組。再者，相較於索拉非尼，TD-52顯示對活體外腫瘤生長及活體內的細胞活性更有抑制能力(P<0.05； 第四圖A及D)。本發明進一步檢測給予TD-52及控制組小鼠的異體移植腫瘤組織的蛋白質表現，如第四圖B及C所示，在活體腫瘤樣本中TD-52提升PP2A活性且向下調節CIP2A及p-Akt的表現量。因此，TD-52顯示出經由干擾Elk-1與CIP2A啟動子之間的結合進而導致CIP2A轉錄減少向下調節CIP2A的轉錄及增加PP2A的活性。當TD-52增加PP2A活性時，Akt會去磷酸化促進HCC細胞凋亡。
2.2.5 肝癌患者腫瘤組織的檢測
為確認p-Akt及CIP2A的臨床意義，更進一步分析147個肝癌患者的腫瘤樣本及臨床特性，在第四圖F中，55.5%的腫瘤樣本CIP2A高度表現，再者，p-Akt免疫組織化學染色法顯示細胞核p-Akt表現強度與細胞核質CIP2A有顯著相關。
2.2.6 癌蛋白SET在腫瘤組織中過度表現
本發明進一步驗證在肝癌腫瘤組織中SET過度表現及SET及p-Akt共表現可預測手術後肝腫瘤患者再復發的風險。本發明收集147肝癌患者腫瘤組織及其鄰近正常組織檢測SET癌症蛋白質的異常表現(第五圖A至C)，在腫瘤組織中SET的表達顯著高於其他正常組織，在294樣本中(每個患者有一對樣本)SET表現在腫瘤組織的平均H分數是170.8，在非腫瘤組織的分數是86.7(p=86.8)(第五圖B)，當腫瘤中的SET的表現量相較於成對的正常組織時顯示出腫瘤組織SET專一性的表現。如第五圖C所示，幾乎每個患者皆具有明顯更高SET表現，腫瘤對非腫瘤SET表現的平均比例為2.2。甚至，SET的高表現量與較差的臨床特性可顯著關聯性。因SET係為一癌症抑制劑磷酸酶PP2A的抑制劑，本發明進行檢測腫瘤細胞中SET的異常表現與PP2A功能障礙礙有關，發現SET的高表現量與Akt信號的活性有顯著關聯性，經由PP2A調節重要的腫瘤信號路徑(第五圖D)，且肝癌患者手術後SET與p-Akt共表現量高可預測再復發的高風險(第五圖D，下圖)。進一步確認在肝腫瘤細胞中SET致癌的特性，以特定的shRNS在細胞生長中使SET沉默的效果，如第五圖E所示，以抗SET的shRNA轉殖至PLC5細胞相較於以shRNA轉殖的陰性對照組的生長率，其結果與先前一致，SET沉默會導致Hep3B細胞自我分化成為肝癌細胞微球 (hepatosphere)的能力減少((第五圖F)。因此，該發現顯示SET的異常表現會促進肝腫瘤的發生。同時，本發明亦經由非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞株及非小細胞肺癌患者組織證實SET在肺癌細胞中扮演關鍵性致癌的角色，以及肝癌細胞中SET與PP2Ac(PP2A催化區域(catalytic domain))結合會導致PP2A的活性增加(結果未顯示)。
2.2.7 PP2A會促進Akt向下調節及肝癌細胞凋亡
本發明進一步證實SET-PP2A是否可為抗癌策略的新目標。首先本發明將肝癌細胞暴露於相同劑量的本發明之埃羅替尼衍生物(EMQA)48小時以MTT分析檢測以確定細胞活性，如第六圖A所示，EMQA會造成肝癌細胞活性顯著的減少，包含四種肝癌細胞PLC5、HuH7、Hep3B及Sk-Hep1細胞株。檢測以EMQA處理後促進細胞凋亡的效果，四種肝癌細胞暴露於相同濃度的EMQA下24小時，再以流式細胞儀、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)及西方墨點分析法分析細胞死亡，並以DMSO最為對照組。經由流式細胞儀檢測相對於EMQA高劑量或長時間處理的sub-G1細胞的比例(第六圖B及D，上圖)，經由ELISA分析顯示DNA片段化程度隨者EMQA處理的劑量增加而增加(第六圖C)。在劑量依賴及時間依賴的方式下EMQA-誘發-肝細胞凋亡會向下調節p-Akt信號(第六圖D)。再者，本發明以PLC5異體移植腫瘤小鼠模型以評估活體內EMQA對抗肝癌的影響，相較於接受控制組的小鼠，以EMQA治療(10mg/kg/day)的帶腫瘤小鼠顯著減少腫瘤生長(第六圖E)。為確認腫瘤組織發生的分子機制，以西方墨點分析法分析及PP2A活性分析檢測接受EMQA及控制組的異體移植腫瘤小鼠的腫瘤組織，其與在活體外檢測的結果一致，接受EMQA治療的異體移植腫瘤小鼠的腫瘤組織比控制組p-Akt表現更低且PP2A的活性更高(第六圖F)。
2.2.8 以SET/PP2A/p-Akt信號的抑制確認本發明之埃羅替尼衍生物的促細胞凋亡的效果
本發明確認Akt是否為調節EMQA對抗HCC效果的關鍵。經由過渡性轉染(Transient transfection)產生具有myc-標記Akt異位表現的PLC5細胞並以5μM EMQA處理24小時後，如第七圖A所示，相較於 野生型，以EMQA處理後sub-G1細胞及PARP切割形式的比例在過度表現Akt的PLC5細胞中顯著地減少，其表示Akt決定EMQA促進細胞凋亡的效果。接者，本發明以三個不同的策略證實EMQA-調節Akt向下調節PP2A的角色，首先，使用PP2A抑制劑、黑海棉酸(OA)以抑制PP2A的活性，如第七圖B所示，經由EMQA處理誘發後向下調節p-Akt的表現及促進細胞凋亡的效果會再經由5μM EMQA及100nM OA共處理後得到相反的結果；接者，本發明以siRNA專一性的剔除PP2Ac，相較於野生型的PLC5細胞，當以siRNA剔除PP2Ac時p-Akt的表現增強(如第七圖C)；再者，MQA-誘發細胞凋亡的比例在PP2Ac-剔除-PLC5細胞中明顯減少，除了PP2A外，其他蛋白質激酶，包含PI3K、PTEM及PDK1已知與調節Akt信號活性有關，本發明在EMQA-處理肝癌細胞裂解物中確認該些蛋白質的表現，如第七圖D所示，以EMQA能顯著抑制p-Akt的表現，但不會影響PI3K、PTEM及PDK1的表現，該些結果證實PP2A在PP2A在調節EMQA-誘發Akt向下調節過程中扮演重要的角色。
因EMQA經由打斷SET-PP2Ac結合再活化PP2A，本發明為證實SET的角色，經由過渡性轉染產生具有myc-標記SET異位表現的Hep3B細胞，並在SET過度表現的細胞中，經由EMQA處理誘發後向下調節p-Akt的表現及細胞凋亡的效果皆減少(第七圖E)。本發明以兩種截斷的SET蛋白質確認EMQA的目標位置，其分別為N-末端片段(SETNTF，a.a.1-227)及C-末段片段(SETCTF，a.a.76-277)，並以活體外SPR系統檢測(第七圖F，左圖)以及細胞系統(cell-based system，第七圖F，右圖)。隨者PP2Ac塗覆固定於CM晶片的量，本發明測試在SPR系統中固定劑量的EMQA會干擾不同比例全長及截斷型式的SET蛋白質，如第七圖F所示，EMQA的干擾效果不因SETNTF的比例增加而受到影響，相反地，含有SETNTF及全長的SET蛋白質複合體對PP2Ac的結合親和力隨SETNTF比例增加而增加。本發明亦經由過渡性轉染產生具有兩個截斷型式的Flag-標記SET蛋白質的異位表現的細胞，與SPR的結果一致，EMQA會減少全長SET及SETCTF對PP2Ac的結合，不會影響SETNTF的結合(第七圖F，右圖)，同時本發明亦在肺癌細胞A549中得到相同的結果(結果未示)，此結果證實EMQA專一 性目標SET蛋白的C-末端。
2.2.9 本發明之埃羅替尼衍生物在活體外及活體內改善索拉非尼對HCC細胞的敏感性強化PP2A的功能
目前，索拉非尼為治療肝癌患者合格的標靶藥物，其具有有限的無惡化存活(progression-free survival)及較高的治療相關毒性程度，因此有必要改善索拉非尼對肝癌患者的藥物敏感性，本發明測試再活化PP2A是否能改善索拉非尼的效果，本發明先以MTT測試EMQA組合索拉非尼的效果，在四個不同的肝癌細胞株中，當EMQA組合索拉非尼的比值為1：5時可顯著改善抗癌效果，經由MTT的結果確認所有的肝癌細胞株的組合比值，其表示有協同效果(synergism)(第八圖A)。進一步以sub-G1分析及西方墨點分析法確認該組合處理的促進細胞凋亡的結果，相較於單獨以索拉非尼處理，當在Hep3B及PLC5細胞中EMQA加入至索拉非尼時，經由流式細胞儀檢測sub-G1的比例以及PARP的切割型式皆顯著的增加(第八圖B)。目前索拉非尼僅適合用於晚期的肝癌治療，其腫瘤通常是巨大的且無法以其他的方式處理，為模擬次這種臨床症狀，本發明以具有PLC5異體移植腫瘤的小鼠測試索拉非尼及EMQA結合的治療效果，如第八圖C，相較於單獨接受EMQA或索拉非尼的小鼠，索拉非尼及EMQA結合能顯著抑制腫瘤生長的速率，且在接受治療的末期腫瘤的平均重量明顯較低(第八圖D)，甚至，在腫瘤中該組合治療亦可強化PP2A的活性(第八圖E，上圖)及抑制p-Akt表現。
2.2.10 本發明之埃羅替尼衍生物與紫杉醇(paclitaxel)會向下調節p-Akt並促進非小細胞肺癌細胞凋亡
本發明利用西方墨點分析法以紫杉醇及/或EMQA處理的細胞裂解物，如第九圖A所示，在以紫杉醇及EMQA處理的肺癌細胞p-Akt表現量顯著減少。再者，在劑量依賴及時間依賴的方式下共處理會誘發p-Akt向下調節(第九圖B及C)，更重要的是，PARP信號的活性與p-Akt向下調節的結果一致。本發明經由過渡性轉染產生具有myc-標記Akt異位表現的A549細胞並以5μM EMQA及10nM紫杉醇處理24小時後，如第 九圖D所示，共處理可顯著減少Akt過度表現細胞，因此經由抑制Akt信號可確認在非小細胞肺癌細胞中EMQA及紫杉醇的協同效果。
2.2.11 在活體內(in vivo)本發明之埃羅替尼衍生物與紫杉醇對抗癌的協同效果
本發明在活體內測試EMQA與紫杉醇結合的抗癌效果，本發明產生A549異體移植腫瘤的小鼠並以控制組、紫杉醇及/或EMQA治療小鼠，相較於單獨接受EMQA或紫杉醇的小鼠，接受EMQA與紫杉醇結合治療的小鼠的腫瘤生長速率明顯減少(第十圖A)，且平均腫瘤種量亦顯著較低(第十圖B)，值得注意的是，給予不同治療的小鼠的體重沒有明顯差異(第十圖E)。本發明經由西方墨點分析法及PP2A活性分析腫瘤裂解物，其結果與先前相同，接受EMQA與紫杉醇結合治療的小鼠腫瘤的PP2A活性明顯高於接受控制治療(第十圖C)，且p-Akt的表現亦向下調節；本發明亦以西方墨點分析法分析A549異體移植腫瘤小鼠的腫瘤裂解物p-Akt及Akt表現量有減少的趨勢(第十圖D)。
因此，本發明之埃羅替尼衍生物在腫瘤細胞表現新的治療機制，經由抑制CIP2A進而提升PP2A表現且向下調節p-Akt，顯示出本發明之埃羅替尼衍生物可作為用以增強PP2A活性的癌症治療方法。同時，本發明亦證實SET的高度表現與患者腫瘤較嚴重及預後較差有關，因此，本發明以干擾SET-PP2A的結合作為治療癌症的新策略，並以本發明之埃羅替尼衍生物與索拉非尼或紫杉醇結合以強化索拉非尼的治療效果，可有效抑制腫瘤的生長。本發明提供一種癌症治療的替代選擇，該選擇可能在對傳統醫藥治療具有抗性之癌症的治療上是極有幫助的。

Claims (22)

  1. 一種可經芳基胺取代的喹喔啉，係具有如式I(a)或式I(b)之結構： 其中R1、R2及R3係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團、雜環芳香基，且該可經取代的苯基包含
  2. 一種可經芳基胺取代的喹喔啉，係具有如式I(c)化學結構之： 其中R4及R5係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團、雜環芳香基，且該可經取代的苯基包含 或，以及其中X係為鹵素、鹵代烷基、甲氧基、硝基、胺基、羧基、酸基、苯酮基或甲氧羰基。
  3. 一種可經芳基胺取代的喹喔啉，係具有式I(d)化學結構之： 其中R6及R7係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其他官能基之原子或基團、雜環芳香基，且該可經取代的苯基包含
  4. 一種化合物，係具有如下式II之結構： 其中R8及R9係為相同或不同各自獨立為可經取代的苯基和苯上有其 他官能基之原子或基團，且該可經取代的苯基包含、 、或，以及其中Y為CO或(CH2)n，n=1-3；Z=COOR10，或具有取代官能基之苯環，R10為芳香基或烷基取代基。
  5. 一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義之化合物，以及一藥理上可接受的載體。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之醫藥組合物進一步包含一抗癌藥物。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之醫藥組合物，其中該抗癌藥物係為索拉非尼(Sorafenib)或紫杉醇(Paclitaxel)。
  8. 一種用於活化蛋白質磷酸酶2A(PP2A)在細胞內表現的醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義的化合物，以及一藥理上可接受的載體。
  9. 一種用於治療以蛋白質磷酸酶2A(PP2A)不活化為特徵之疾病或病症的醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義的化合物，以及一藥理上可接受的載體。
  10. 一種用於作為癌蛋白SET拮抗劑的醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義的化合物，以及一藥理上可接受的載體。
  11. 一種用於治療以癌蛋白SET表現量增加為特徵之疾病或病症的醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義的化合物，以及一藥理上可接受的載體。
  12. 一種用於作為蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)拮抗劑的醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義的化合物，以及一藥理上可接受的載體。
  13. 一種用於治療以蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表現量增加為特徵之疾病或病症的醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義的化合物，以及一藥理上可接受的載體。
  14. 一種用於干擾癌蛋白SET與蛋白質磷酸酶2A(PP2A)結合的醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義的化合物，以及一藥理上可接受的載體。
  15. 如申請專利範圍第8項至第14項任一項所述之醫藥組合物進一步包含一抗癌藥物。
  16. 如申請專利範圍第15項至所述之醫藥組合物，其中該抗癌藥物係為索拉非尼(Sorafenib)或紫杉醇(Paclitaxel)。
  17. 一種如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義之化合物用於製造以治療蛋白質磷酸酶2A(PP2A)不活化為特徵之疾病或病症之醫藥組合物的用途。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該以蛋白質磷酸酶2A(PP2A)不活化為特徵之疾病或病症為肝癌、肺癌、白血病、乳癌、腎癌、甲狀腺癌、結腸癌、頭部或頸部癌症。
  19. 一種如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義之化合物用於製造以治療癌蛋白SET表現量增加為特徵之疾病或病症之醫藥組合物的用途。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之用途，其中該以癌蛋白SET表現量增加為特徵之疾病或病症為肝癌、肺癌、白血病、乳癌、腎癌、甲狀腺癌、結腸癌、頭部或頸部癌症。
  21. 一種如申請專利範圍第1項至第4項之任一項中所定義之化合物用於製造以治療蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表現量增加為特徵之疾病或病症之醫藥組合物的用途。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之用途，其中該以蛋白質磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表現量增加為特徵之疾病或病症為肝癌、肺癌、白血病、乳癌、腎癌、甲狀腺癌、結腸癌、頭部或頸部癌症。
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