TW201546146A - 含活性酯基之纖維製造用組合物及使用其纖維之細胞培養支架材料 - Google Patents
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Abstract
本發明之目的在於提供一種適於將對細胞之黏著、增生、分化等有效之物質固定化,進而保持有機溶劑耐受性之用於纖維製造之纖維製造用組合物、將該組合物紡絲而獲得之纖維、及使用該纖維之細胞培養支架材料。
本發明係關於一種纖維製造用組合物,其含有:(A)含有通式(1)所表示之單元結構及通式(2)所表示之單元結構之高分子化合物、(B)交聯劑、(C)酸化合物、及(D)溶劑。
□□[式(1)及(2)中之各符號係如說明書中所記載]
Description
本發明係關於一種含有於側鏈具有活性酯基與羥基之高分子化合物、交聯劑、酸化合物、及溶劑之纖維製造用組合物、將該組合物紡絲(較佳為進而進行加熱)而獲得之有機溶劑耐受性優異之纖維、以及使用該纖維之細胞培養支架材料。
於活體內之骨髓或基底膜中,細胞於含有膠原蛋白等奈米等級之纖維狀結構之細胞外基質中生長、增生。因此,為了提供細胞醫療或再生醫療所必需之細胞,而謀求於活體外高效率地培養細胞之細胞培養用之支架材料。此種細胞培養支架材料較佳為儘可能地模仿包圍細胞之活體內環境。
於在活體外培養細胞之情形時,先前一直進行將自活體提取之膠原蛋白等基質構成物質加工為凝膠或海綿狀結構體,將其作為培養用之支架之研究(參照專利文獻1)。然而,關於主要包含蛋白質之該等源自活體之物質,有無法耐受高壓釜或γ射線等滅菌處理之情況、或有對於使用之前之長期保存之穩定性之問題、及力學強度或形狀穩定性等問題。又,該等膠原蛋白等源自活體之物質由於通常自牛或豬等動物提取,故而有自該等動物混入感染性物質之危險性。
因此,最近亦不斷推進將合成高分子用作材料代替自活體提取之物質,製作發泡體、凝膠、纖維等結構體,將其作為培養支架之研
究(參照專利文獻2~專利文獻5)。尤其揭示有將包含N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)丙烯酸酯單體、親水性單體、及交聯劑之合成聚合物應用於細胞培養基材表面(參照專利文獻6)。
其中,藉由稱為電場紡絲法(Electrospinning)之一面施加高電壓一面吹送纖維之方法獲得的含有具有奈米等級之纖維徑之奈米纖維(Nanofiber)之結構體作為細胞培養支架材料而備受關注。多次嘗試於該奈米纖維上保持用於細胞醫療或再生醫療之功能細胞或多能性幹細胞之未分化性而直接進行培養(參照非專利文獻1~非專利文獻3)。然而,此種源自合成高分子之纖維難以賦予細胞黏著性或增生性,難言模仿活體內之環境。
為了改善此方面,亦研究有將含有RGD(Arg-Gly-Asp,精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸)之細胞黏著性肽固定化而得之奈米纖維(參照非專利文獻4)。於此情形時,雖將細胞黏著性肽固定化於含有如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯之活性酯基之合成高分子,但為了使高分子不溶解於水,而使用考慮親‧疏水性之共聚物來進行研究。藉此,NHS之導入量受到限制,可固定化之細胞黏著物質之量亦受到限制,結果為細胞培養支架材料之細胞黏著性亦受到限制。
[專利文獻1]日本專利特開昭62-502936號公報
[專利文獻2]日本專利特開昭62-122586號公報
[專利文獻3]日本專利特開2003-265593號公報
[專利文獻4]日本專利特開2005-60570號公報
[專利文獻5]日本專利特開2007-325543號公報
[專利文獻6]美國專利第8362144號說明書
[非專利文獻1]Biomaterials 26 p5158(2005)
[非專利文獻2]Tissue Eng.11 p1149(2005)
[非專利文獻3]Cytotechnology 64 p701(2012)
[非專利文獻4]Journal of Biomedical Materials Research A 100A p794(2012)
本發明之目的在於提供一種可將對細胞之黏著、增生、分化等有效之物質固定化,進而保持有機溶劑耐受性、液體培養基耐受性之用於纖維製造之纖維製造用組合物、將該組合物紡絲而獲得之纖維、及使用該纖維之細胞培養支架材料。
本發明者等人進行努力研究,結果發現,將含有於側鏈具有活性酯基與羥基之高分子化合物、交聯劑、酸化合物、及溶劑之纖維製造用組合物紡絲而製造之纖維可將對細胞之黏著、增生、分化等有效之物質固定化,又,具有充分之有機溶劑耐受性,進而具有優異之作為細胞培養支架材料之功能。
又,本發明者等人發現,上述纖維製造用組合物之紡絲由於係將於側鏈具有活性酯基與羥基之高分子化合物與交聯劑及酸化合物一併進行紡絲,故而使高分子化合物所含有之羥基彼此經由交聯劑進行交聯反應,藉此使高分子化合物彼此交聯,結果可獲得具有有機溶劑耐受性、液體培養基耐受性之纖維。
又,本發明者等人發現,將本發明之纖維製造用組合物紡絲而製造之纖維藉由施加加熱處理,而顯現更優異之有機溶劑耐受性、液體培養基耐受性。
本發明者等人係基於該等見解而完成了本發明。
即,本發明係如下所述。
[1]一種纖維製造用組合物,其含有:(A)含有通式(1)所表示之單元結構及通式(2)所表示之單元結構之高分子化合物、(B)交聯劑、(C)酸化合物、及(D)溶劑,
[式中,R1表示氫原子或甲基,Q1表示酯鍵或醯胺鍵,R2表示至少1個氫原子被羥基取代之碳原子數1~10之烷基或碳原子數6~10之芳香族烴基]
[式中,R3表示氫原子或甲基,Q2表示活性酯基]。
[2]如上述[1]記載之組合物,其中上述Q2係以通式(5)表示,
[式中,Q3表示N-琥珀醯亞胺基、對硝基苯基或五氟苯基]。
[3]如上述[1]或[2]記載之組合物,其中上述高分子化合物之重量平均分子量為1,000~1,000,000。
[4]如上述[1]至[3]中任一項記載之組合物,其中上述溶劑為極性溶劑。
[5]一種纖維之製造方法,其包含將如上述[1]至[4]中任一項記載之組合物紡絲之步驟。
[6]如上述[5]記載之方法,其中上述紡絲為電場紡絲。
[7]如上述[5]或[6]記載之方法,其包含將紡絲而得之纖維於70~300℃之範圍內進行加熱之步驟。
[8]如上述[5]至[7]中任一項記載之方法,其進而包含將細胞黏著物質固定化之步驟。
[9]一種纖維,其係利用如上述[5]至[8]中任一項記載之方法製造。
[10]一種細胞培養支架材料,其含有如上述[9]記載之纖維。
根據本發明,可提供一種可將對細胞之黏著、增生、分化等有效之物質固定化,進而保持有機溶劑耐受性、液體培養基耐受性之用於纖維製造之纖維製造用組合物、將該組合物紡絲而獲得之纖維、及使用該纖維之細胞培養支架材料。該纖維藉由將對細胞之黏著、增生、分化等有效之物質固定化,而表現出作為細胞培養支架材料之更優異之功能。
圖1係將利用電場紡絲法由實施例1之纖維製造用組合物獲得之纖維於180℃下加熱處理10分鐘後之SEM照片。
圖2係將利用電場紡絲法由實施例4之纖維製造用組合物獲得之纖維於80℃下加熱處理24小時後之SEM照片。
圖3係將利用電場紡絲法由實施例4之纖維製造用組合物獲得之纖維於180℃下加熱處理30分鐘後之SEM照片。
圖4係將利用電場紡絲法由實施例1之纖維製造用組合物獲得之纖維於180℃下加熱處理10分鐘後,於乙醇中浸漬處理10秒鐘後之SEM照片。
圖5係將利用電場紡絲法由實施例4之纖維製造用組合物獲得之纖維於80℃下加熱處理24小時後,於乙醇中浸漬處理10秒鐘後之SEM照片。
圖6係將利用電場紡絲法由實施例4之纖維製造用組合物獲得之纖維於180℃下加熱處理30分鐘後,於乙醇中浸漬處理10秒鐘後之SEM照片。
圖7係將利用電場紡絲法由實施例5之纖維製造用組合物獲得之纖維於80℃下加熱處理24小時後,於乙醇中浸漬處理10秒鐘後之SEM照片。
圖8係將利用電場紡絲法由比較例2之纖維製造用組合物獲得之
纖維於80℃下加熱處理24小時後,於乙醇中浸漬處理10秒鐘後之SEM照片。
圖9係將利用電場紡絲法由比較例4之纖維製造用組合物獲得之纖維於180℃下加熱處理10分鐘後,於乙醇中浸漬處理10秒鐘後之SEM照片。
圖10係將利用電場紡絲法由實施例4之纖維製造用組合物獲得之纖維於180℃下加熱處理30分鐘後,於液體培養基中浸漬處理7天後之SEM照片。
圖11係將利用電場紡絲法由比較例1之纖維製造用組合物獲得之纖維於180℃下加熱處理10分鐘後,於液體培養基中浸漬處理7天後之SEM照片。
本發明之纖維製造用組合物(以下,亦稱為「本發明之組合物」)之主要特徵在於含有:(A)含有通式(1)所表示之單元結構及通式(2)所表示之單元結構之高分子化合物、(B)交聯劑、(C)酸化合物、及(D)溶劑。
本發明之組合物含有作為成分A之含有通式(1)所表示之單元結構及通式(2)所表示之單元結構之高分子化合物(以下,亦稱為「成分A之高分子化合物」或簡稱為「成分A」)。成分A所含有之通式(1)所表示之單元結構於側鏈具有羥基,故而藉由將成分A與交聯劑及酸化合物一併進行紡絲,而使羥基彼此經由交聯劑進行交聯反應,藉此使高分子化合物彼此交聯,獲得具有有機溶劑耐受性之纖維。又,成分A所含有之通式(2)所表示之單元結構於側鏈具有活性酯基,故而藉由與任意之胺(蛋白質、肽、有機胺等)之親核加成反應,而可將對細胞
之黏著、增生、分化等有效之物質(細胞黏著物質)固定化。通式(2)所表示之單元結構之活性酯基與任意之胺之反應可於纖維製造用組合物之製備時進行,進而亦可於將纖維製造用組合物紡絲後進行加熱處理後進行。
[式中,R1表示氫原子或甲基,Q1表示酯鍵或醯胺鍵,R2表示至少經1個羥基取代之碳原子數1~10之烷基或碳原子數6~10之芳香族烴基]
[式中,R3表示氫原子或甲基,
Q2表示活性酯基]。
以下,對通式(1)及通式(2)中之各基之定義進行詳細敍述。
R1表示氫原子或甲基。
Q1表示酯鍵或醯胺鍵,就成分A之高分子化合物之對於溶劑之溶解性之觀點而言,較佳為酯鍵。
Q2表示活性酯基。於本發明中,所謂「活性酯基」,係指藉由於酯基之一側具有拉電子性之取代基而使羰基活化(易受到親核攻擊)之酯基,具體而言,係通式(5)所表示之酯基。
式中,Q3表示形成活性酯基之1價有機基(拉電子基),作為其具體例,可列舉N-琥珀醯亞胺基、對硝基苯基及五氟苯基,就細胞親和性之觀點而言,較佳為N-琥珀醯亞胺基。
R2表示至少1個氫原子被羥基取代之碳原子數1~10之烷基或碳原子數6~10之芳香族烴基。該碳原子數1~10之烷基為直鏈狀或支鏈狀均可,作為其具體例,可列舉:甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、1-乙基丙基、己基、異己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、辛基、壬基、癸基等。該烷基之碳原子數較佳為1~6,更佳為1~4。
又,作為R2中之至少1個氫原子被羥基取代之碳原子數6~10之芳香族烴基之「碳原子數6~10之芳香族烴基」,例如可列舉苯基、1-萘
基、2-萘基等。
就纖維製造時之交聯反應效率、或所製造之纖維之細胞親和性之觀點而言,R2較佳為至少1個氫原子被羥基取代之碳原子數1~10(更佳為1~6、尤佳為1~4)之烷基或至少1個氫原子被羥基取代之苯基。
R3表示氫原子或甲基。
通式(1)所表示之單元結構較佳為R1為氫原子或甲基、Q1為酯鍵、R2為至少1個氫原子被羥基取代之碳原子數1~10(更佳為1~6、尤佳為1~4)之烷基或至少1個氫原子被羥基取代之苯基。
通式(1)所表示之單元結構較佳為通式(3)所表示之單元結構。
[式中,R4與上述R1同義,R5與上述R2同義]
通式(2)所表示之單元結構較佳為通式(4)所表示之單元結構。
[化8]
[式中,R6為氫原子或甲基]
於成分A之高分子化合物中,就合成之容易性、對於溶劑之溶解性、纖維形成之容易性、將任意之胺固定化時之效果之觀點而言,通式(1)所表示之單元結構之組成比與通式(2)所表示之單元結構之組成比較佳為(通式(1)所表示之單元結構)/(通式(2)所表示之單元結構)=(35~95莫耳%)/(5~65莫耳%)。該等單元結構之組成比係藉由13C-NMR而測定。
成分A之高分子化合物只要不損害本發明之目的,則亦可含有除通式(1)所表示之單元結構及通式(2)所表示之單元結構以外之單元結構,就成分A之高分子化合物之聚合性之觀點而言,相對於成分A之高分子化合物之全部單元結構,通式(1)所表示之單元結構之比率(莫耳%)較佳為35~95莫耳%,通式(2)所表示之單元結構之比率(莫耳%)較佳為5~65莫耳%。又,就成分A之高分子化合物之聚合性之觀點而言,相對於成分A之高分子化合物之全部單元結構,通式(1)所表示之單元結構之比率與通式(2)所表示之單元結構之比率之合計(莫耳%)較佳為超過90莫耳%,更佳為95莫耳%以上,尤佳為100莫耳%。各單元結構相對於成分A之高分子化合物之全部單元結構之比率可根據藉由13C-NMR測定之各單元結構之組成比算出。
就使用上述組合物之纖維之有機溶劑耐受性之觀點而言,成分A之重量平均分子量較佳為1,000~1,000,000之範圍,更佳為5,000~500,000之範圍,尤佳為10,000~300,000之範圍。於本發明中,所謂「重量平均分子量」,係指利用凝膠滲透層析法(GPC)測定之聚苯乙烯換算之分子量。
成分A可利用本身公知之方法或基於其之方法而製造。例如,可藉由使用適當之聚合起始劑(例如2,2'-偶氮雙(異丁酸)二甲酯等)使與通式(1)所表示之單元結構對應之單體及與通式(2)所表示之單元結構對應之單體於適當之溶劑(例如乙腈等)中進行聚合等而製造,但並不限定於此。亦可使用市售品。
作為與通式(1)所表示之單元結構對應之單體,例如可列舉:(甲基)丙烯酸2-羥基乙酯(例如CAS編號:868-77-9之化合物)、(甲基)丙烯酸2-羥基丙酯(例如CAS編號:923-26-2之化合物)、(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯(例如CAS編號:2478-10-6之化合物)、N-羥基甲基(甲基)丙烯醯胺(例如CAS編號:923-02-4之化合物)、N-(2-羥基乙基)(甲基)丙烯醯胺(例如CAS編號:5238-56-2之化合物)、N-(2-羥基丙基)(甲基)丙烯醯胺(例如CAS編號:26099-09-2之化合物)、對羥基(甲基)丙烯醯苯胺(例如CAS編號:19243-95-9之化合物)等,較佳為(甲基)丙烯酸2-羥基乙酯或(甲基)丙烯酸2-羥基丙酯,最佳為(甲基)丙烯酸2-羥基丙酯。
再者,於本發明中,所謂「(甲基)丙烯酸酯化合物」,係指丙烯酸酯化合物與甲基丙烯酸酯化合物兩者。例如,(甲基)丙烯酸係指丙烯酸與甲基丙烯酸兩者。
作為與通式(2)所表示之單元結構對應之單體,較佳為(甲基)丙烯酸對硝基苯酯(例如CAS編號:16522-41-1之化合物)、(甲基)丙烯酸五氟苯酯(例如CAS編號:13642-97-2之化合物)、N-丙烯醯氧基琥珀醯
亞胺(CAS編號:38862-24-7之化合物)、甲基丙烯酸N-琥珀醯亞胺酯(CAS編號:38862-25-8之化合物),最佳為甲基丙烯酸N-琥珀醯亞胺酯。
就製造具有適度之粗度之纖維之觀點而言,本發明之組合物中之成分A之含有比率較佳為5~50重量%,更佳為10~40重量%。
本發明之組合物含有作為成分B之交聯劑(以下,亦稱為「成分B之交聯劑」或簡稱為「成分B」)。成分B藉由與下述成分C併用而使成分A之羥基彼此經由成分B本身交聯,藉此可對纖維賦予有機溶劑耐受性。
作為成分B之交聯劑,例如可列舉:1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、1,3,4,6-四(丁氧基甲基)甘脲等胺基塑膠交聯劑;2,2-雙(4-羥基-3,5-二羥基甲基苯基)丙烷等酚醛塑膠交聯劑;六亞甲基二異氰酸酯等異氰酸酯交聯劑;1,4-雙(乙烯氧基)丁烷等乙烯醚交聯劑等。
成分B較佳為胺基塑膠交聯劑,較佳為1,3,4,6-四(羥基甲基)甘脲(CAS編號:5395-50-6)、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲(CAS編號:17464-88-9)、1,3,4,6-四(乙氧基甲基)甘脲(CAS編號:65952-06-9)、1,3,4,6-四(1-甲基乙氧基)甘脲(CAS編號:508220-69-7)、1,3,4,6-四(1,1-二甲基乙氧基)甘脲(CAS編號:547744-08-1)或1,3,4,6-四(丁氧基甲基)甘脲(CAS編號:15968-37-3),更佳為1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲。
成分B可單獨使用,亦可將2種以上併用。
成分B之交聯劑可藉由本身公知之方法或基於其之方法而製造。又,亦可使用市售品。
就與成分A之反應效率之觀點而言,本發明之組合物中之成分B之含有比率較佳為0.1~5重量%,更佳為0.2~3重量%。
就纖維製造時之反應效率之觀點而言,本發明之組合物所含有之成分A與成分B之重量比(成分A之重量/成分B之重量)較佳為5~65,更佳為5~25。
本發明之組合物含有作為成分C之酸化合物(以下,亦稱為「成分C之酸化合物」或簡稱為「成分C」)。該酸化合物可為鹽之態樣,即,本發明中之「酸化合物」這一用語係亦包含鹽之概念。成分C藉由與成分B併用,而可於使成分A之羥基彼此經由成分B進行交聯反應時促進該交聯反應。
作為成分C之酸化合物,例如可列舉磺酸化合物、羧酸化合物等有機酸化合物;鹽酸、磷酸、硫酸、硝酸、氫溴酸等無機酸化合物等。
成分C較佳為有機酸化合物,更佳為磺酸化合物。作為磺酸化合物,例如可列舉對甲苯磺酸、對甲苯磺酸吡啶鎓、三氟甲磺酸等,較佳為對甲苯磺酸吡啶鎓。
成分C可單獨使用,亦可將2種以上併用。
成分C之酸化合物可藉由本身公知之方法或基於其之方法而製造。又,亦可使用市售品。
就交聯反應速度、交聯反應效率之觀點而言,本發明之組合物中之成分C之含有比率較佳為0.01~1.0重量%,更佳為0.05~0.5重量%,尤佳為0.07~0.4重量%。
就交聯反應速度、交聯反應效率之觀點而言,本發明之組合物所含有之成分A與成分C之重量比(成分A之重量/成分C之重量)較佳為20~120,更佳為80~115。
本發明之組合物含有作為成分D之溶劑(以下,亦稱為「成分D之
溶劑」或簡稱為「成分D」)。
成分D之溶劑只要為可使至少上述成分A~C均勻地溶解或分散且不與各成分反應者,則無特別限制,就成分A~C之溶解性之觀點而言,較佳為極性溶劑。
作為該極性溶劑,例如可列舉:水、甲醇、乙醇、2-丙醇、丙二醇單甲醚、丙酮、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮等,為了組合物之紡絲容易性,較佳為丙酮與二甲基乙醯胺之混合溶劑,其較佳之混合比率(重量%)為丙酮/二甲基乙醯胺=(90重量%~60重量%)/(10重量%~40重量%)。
成分D可單獨使用,亦可將2種以上併用。
本發明之組合物只要不顯著損害本發明之目的,則除成分A~D以外,視需要亦可含有纖維製造用組合物通常所使用之添加劑。作為該添加劑,例如可列舉界面活性劑、流變調整劑、藥劑、微粒子等。
本發明之組合物可藉由將上述成分A~D、或將成分A~D及上述添加劑加以混合而製備。混合方法並無特別限制,只要藉由本身公知之方法或基於其之方法混合即可。
本發明之組合物可用於纖維製造。使用本發明之組合物製造之纖維之種類並無特別限制,例如於用於生物相容性材料(例如細胞培養支架材料等)等之情形時,較佳為奈米纖維、微米纖維等,更佳為奈米纖維。於本發明中,所謂「奈米纖維」,係指具有奈米級(例如1~1000nm)之直徑之纖維,又,所謂「微米纖維」,係指具有微米級(例如1~1000μm)之直徑之纖維。
使用本發明之組合物而形成之纖維之直徑只要根據纖維之用途等適當調整即可,就本發明之組合物之濃度、及紡絲之容易性之觀點而言,較佳為1~1000nm,更佳為10~1000nm。於本發明中,纖維之直徑係利用掃描式電子顯微鏡(SEM)而測定。
本發明之纖維之製造方法(以下,亦稱為「本發明之方法」)之主要特徵在於:包含將本發明之組合物紡絲之步驟。
本發明之組合物之紡絲方法只要為可形成纖維之方法,則無特別限制,例如可列舉熔噴法、複合熔融紡絲法、電場紡絲法等,就纖維形成能力之觀點而言,較佳為電場紡絲法。
電場紡絲法為公知之紡絲方法,可使用公知之電場紡絲裝置而進行。將本發明之組合物自噴嘴(例如針等)之前端噴出之速度(噴出速度)、施加電壓、自噴出本發明之組合物之噴嘴之前端至接收該組合物之基板之距離(噴出距離)等各種條件可根據所製造之纖維之直徑等而適當設定。噴出速度通常為0.1~100μl/min,較佳為0.5~50μl/min,更佳為1~20μl/min。施加電壓通常為0.5~80kV,較佳為1~60kV,更佳為3~40kV。噴出距離通常為1~60cm,較佳為2~40cm,更佳為3~30cm。
本發明之方法較佳為進而包含於將本發明之組合物紡絲後,將該紡絲而得之纖維以特定之溫度進行加熱之步驟。藉由將紡絲而得之纖維以特定之溫度進行加熱,而可表現出更優異之有機溶劑耐受性。
加熱紡絲而得之纖維之溫度通常為70~300℃之範圍,就成分B之交聯劑之反應性、及成分A之高分子化合物之耐熱性之觀點而言,較佳為80~250℃,更佳為90~200℃。若該溫度未達70℃,則有成分A彼此之交聯反應不充分,所製造之纖維之有機溶劑耐受性變低之傾向,若超過300℃,則會引起成分A之高分子化合物本身因熱而產生之分解或溶解等而無法形成纖維。
紡絲而得之纖維之加熱方法只要為可以上述加熱溫度加熱之方法,則無特別限制,可利用本身公知之方法或基於其之方法進行適當加熱。作為該加熱方法之具體例,可列舉於大氣下使用加熱板或烘箱
等之方法等。
加熱紡絲而得之纖維之時間可根據加熱溫度等而適當設定,就交聯反應速度、生產效率之觀點而言,較佳為1分鐘~48小時,更佳為5分鐘~36小時,尤佳為10分鐘~24小時。
利用本發明之方法製造之纖維(以下,亦稱為「本發明之纖維」)之種類並無特別限制,例如於用於生物相容性材料(例如細胞培養支架材料等)等之情形時,較佳為奈米纖維、微米纖維等,更佳為奈米纖維。
本發明之纖維之直徑只要根據纖維之用途等而適當調整即可,例如於用作細胞培養支架材料之情形時,就細胞培養效率之觀點而言,較佳為1~1000nm,更佳為10~1000nm。
本發明之纖維之用途並無特別限制,如下述實施例所示,本發明之纖維具有優異之有機溶劑耐受性,具有充分之作為細胞培養支架之功能,故而適於細胞培養支架材料。
對細胞之黏著、增生、分化等有效之擔載物質(細胞黏著物質)藉由存在於本發明之纖維之活性酯基與細胞黏著物質之反應而可固定化於上述纖維。
活性酯基係於中性條件下與游離一級胺基反應。一級胺之鹼性係烷基胺強於芳香族胺,烷基胺更適於與活性酯之反應。於使蛋白質及肽經由該等胺基以共價鍵結之形式與纖維加成之情形時,必須於水系中進行反應,於反應溶液之pH值處於中性至弱鹼性區域之情形、或反應溫度為冰浴冷卻下至37℃左右之情形時,於短時間內進行反應。於為水溶性較低之一級胺之情形時,較佳為溶解於如乙醇或二甲基亞碸等有機溶劑中而反應。
較佳之反應條件為0℃~37℃下1~48小時,進而較佳為0℃~37℃下1~24小時。
作為可固定化於本發明之纖維之物質(細胞黏著物質),例如可列舉蛋白質、生理活性物質及化合物等。作為上述蛋白質,例如可列舉:癌胚抗原、鱗狀細胞癌相關抗原、細胞角蛋白19片段、唾液酸化醣類抗原KL-6、鈉利尿肽、肌鈣蛋白、肌血球素等疾病標記、介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)、介白素-7(IL-7)、介白素-8(IL-8)、介白素-9(IL-9)、介白素-10(IL-10)、介白素-11(IL-11)、介白素-12(IL-12)、介白素-13(IL-13)、介白素-14(IL-14)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、粒細胞菌落刺激因子(G-CSF)、單核細胞菌落刺激因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、flk2/flt3配體(FL)、白血病細胞抑制因子(LIF)、腫瘤抑制素M(OM)、紅血球生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、轉化生長因子-α(TGF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、巨噬細胞炎症蛋白質-1α(MIP-1α)、上皮細胞增生因子(EGF)、纖維母細胞增生因子-1、2、3、4、5、6、7、8、或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神經細胞增生因子(NGF)、肝細胞增生因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶結合蛋白I、蛋白酶結合蛋白II、血小板源性生長因子(PDGF)、膽鹼能分化因子(CDF)、趨化細胞素、Notch配體(Delta1等)、Wnt蛋白質、血管生成素樣蛋白質2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、類胰島素生長因子(IGF)、類胰島素生長因子結合蛋白質(IGFBP)、多效蛋白(Pleiotrophin)、胰島素、生長激素等細胞增生因子、及膠原蛋白I至XIX、纖維黏連蛋白、玻璃黏連蛋白、層黏連蛋白-1至12、層黏連蛋白511、層黏連蛋白521、Nitogen、腱生蛋白、血小板反應蛋白(thrombospondin)、馮威里氏病(von Willebrand)因子、骨調素、血纖維蛋白原、各種彈力蛋白、各種蛋白多糖、各種鈣黏附蛋
白、橋粒芯黏附蛋白(desmocollins)、橋粒芯糖蛋白(desmogleins)、各種整合素、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、免疫球蛋白超家族、基質膠(matrigel)、聚-D-離胺酸、聚-L-離胺酸等細胞黏著因子、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等各種抗體等。
作為上述生理活性物質,例如可列舉:D-葡糖胺、D-半乳胺糖、神經胺糖酸、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸乙醯肝素、肝素等糖類、血清素、去甲腎上腺素、腎上腺素、3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(DCMU)、草脫淨、利谷隆(linuron)及西瑪津等。
作為上述化合物,例如可列舉:血管收縮素I至IV、緩激肽、血纖維蛋白肽(fibrinopeptide)、鈉利尿肽、尿舒張肽(urodilatin)、鳥苷蛋白、內皮素1至3、心血管調節肽(Salusin)、尿加壓素、催產素、神經垂體素、血管加壓素、腎上腺皮質刺激激素、黑色素細胞刺激激素、內啡、脂促素、尿皮質素1至3、黃體形成激素釋出激素、生長激素釋出激素、生長抑素、皮質抑素、促乳素釋出肽、轉移抑素(metastin)、速激肽、P物質、神經激肽、Endokinin、神經調壓素、神經介素、類爪蟾肽(Xenin)、胃內激素、肥胖抑制素、黑色素凝集激素、食慾素、神經肽、強啡肽、新內啡肽、內嗎啡肽、痛敏肽(nociceptin)、焦谷胺酸化RF醯胺肽、甘丙胺素、胃泌素、膽囊收縮素、胰泌素、鬆弛素、胰高血糖素、腸高血糖素、腎上腺髓素、澱粉素、抑鈣素、副甲狀腺激素、防禦素、胸腺素、YIGSR肽等肽;丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、***酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、胱胺酸、羥基脯胺酸、羥基離胺酸、二羥基***酸、甲狀腺素、磷絲胺酸、鎖鏈素、β-丙胺酸、肌胺酸、鳥胺酸、肌酸、γ-胺基丁酸、茶胺酸、紅藻胺酸、軟骨藻酸、鵝膏蕈胺酸等胺基酸;2-二甲胺基乙基胺(CAS編
號:108-00-9之化合物)、N-(2-羥基乙基)乙二胺(CAS編號:111-41-1之化合物)、N-(2-胺基乙基)哌(CAS編號:140-31-8之化合物)、4-(2-胺基乙基)啉(CAS編號:2038-03-1之化合物)、1-(2-胺基乙基)-2-咪唑酮(CAS編號:6281-42-1之化合物)、色胺(CAS編號:61-54-1之化合物)、組織胺二鹽酸鹽(CAS編號:56-92-8之化合物)、酪胺(CAS編號:51-67-2之化合物)、多巴胺(CAS編號:51-61-6之化合物)等一級胺;乙二胺二鹽酸鹽(CAS編號:333-18-6之化合物)、1,6-二胺基己烷(CAS編號:124-09-4之化合物)、N,N'-雙(胺基丙基)哌(CAS編號:7209-38-3之化合物)等一級二胺等。
其中,尤佳之細胞黏著物質為層黏連蛋白511、層黏連蛋白521或VIGSR肽。
本發明之細胞培養支架材料之主要特徵在於含有本發明之纖維。於本發明中,所謂「細胞培養支架材料」,係指對細胞不產生不良影響,可進行細胞培養之材料。
本發明之細胞培養支架材料例如可列舉:對玻璃、金屬、及如聚苯乙烯之塑膠上吹送本發明之纖維而成之細胞培養基材(例如6孔平底微量盤等)、導入有本發明之纖維之培養袋等。進而,可藉由經由活性酯基固定化之物質(細胞黏著物質)而促進細胞增生、分化誘導細胞等。
關於使用本發明之細胞培養支架材料而培養之細胞並無特別限制,例如可列舉:纖維母細胞、骨髓細胞、B淋巴球、T淋巴球、嗜中性球、紅血球、血小板、巨噬細胞、單核細胞、骨細胞、骨髓細胞、外被細胞、樹枝狀細胞、角質形成細胞、脂肪細胞、間質細胞、上皮細胞、表皮細胞、內皮細胞、血管內皮細胞、肝實質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神經系細胞、神經膠細胞、神經元、寡樹突膠細
胞、微神經膠、星狀膠細胞、心肌細胞、食道細胞、肌肉細胞(例如平滑肌細胞或骨骼肌細胞)、胰臟β細胞、黑色素細胞、造血前驅細胞、單核細胞、胚胎幹細胞(ES細胞)、胚胎腫瘤細胞、胚胎生殖幹細胞、人工多能幹細胞(iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間質系幹細胞、肝幹細胞、胰臟幹細胞、肌肉幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞、及各種細胞株(例如HCT116、Huh7、HEK293(人胚胎腎細胞)、HeLa(人宮頸癌細胞株)、HepG2(人肝癌細胞株)、UT7/TPO(人白血病細胞株)、CHO(中國倉鼠卵巢細胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five、Vero)等。
本發明之細胞培養支架材料可將本發明之纖維用作原材料之一,藉由本身公知之方法或基於其之方法而製造。
以下,對本發明之具體例進行說明,但本發明並不因此而受任何限定。
下述高分子化合物1~6之重量平均分子量係藉由凝膠滲透層析法(GPC)而測定。用於測定之裝置、測定條件係如下所述。
裝置:TOSOH HLC-8320GPC system
管柱:Shodex(註冊商標)KF-803L、KF-802及KF-801
管柱溫度:40℃
溶離液:DMF(Dimethylformamide,二甲基甲醯胺)
流量:0.6ml/min
檢測器:RI(Refractive Index detector,折射率檢測器)
標準試樣:聚苯乙烯
下述成分A之高分子化合物之單元結構之組成比係藉由13C-NMR而測定。用於測定及解析之裝置、條件係如下所述。
裝置:日本電子股份有限公司JNM-ECA500、Delta V5.0
測定核:13C門控去偶
累計次數:18000
測定溫度:室溫
檢測峰值:69~71ppm(源自HPMA)、25~27ppm(源自NSuMA)
測定溶劑:氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)、750uL
樣本量:0.1g
鬆弛試劑:乙醯丙酮鉻(III)、4mg
使甲基丙烯酸2-羥基丙酯(HPMA;東京化成工業股份有限公司製造)10.5g、甲基丙烯酸N-琥珀醯亞胺酯(NSuMA;東京化成工業股份有限公司製造)1.5g、及2,2'-偶氮雙(異丁酸)二甲酯(MAIB;和光純藥工業股份有限公司製造)0.01g溶解於乙腈28.3g中,將其在氮氣氛圍下滴加至經加熱回流之乙腈20.2g中。滴加結束後,一面保持加熱回流一面反應17小時。其後,於該反應混合液中加入二***使聚合物析出。濾取聚合物後,於減壓下進行乾燥,藉此獲得7.71g高分子化合物1。該高分子化合物1之重量平均分子量以聚苯乙烯換算為217,000。利用13C-NMR測定出之組成比為HPMA/NSuMA=91莫耳%/9莫耳%。
使甲基丙烯酸2-羥基丙酯(HPMA;東京化成工業股份有限公司製造)10.6g、甲基丙烯酸N-琥珀醯亞胺酯(NSuMA;東京化成工業股份
有限公司製造)1.5g、及2,2'-偶氮雙(異丁酸)二甲酯(MAIB;和光純藥工業股份有限公司製造)0.72g溶解於乙腈30.0g中,將其在氮氣氛圍下滴加至經加熱回流之乙腈21.4g中。滴加結束後,一面保持加熱回流一面反應17小時。其後,於該反應混合液中加入二***使聚合物析出。濾取聚合物後,於減壓下進行乾燥,藉此獲得12.0g高分子化合物2。該高分子化合物2之重量平均分子量以聚苯乙烯換算為13,000。利用13C-NMR測定出之組成比為HPMA/NSuMA=92莫耳%/8莫耳%。
使甲基丙烯酸2-羥基丙酯(HPMA;東京化成工業股份有限公司製造)33.0g、甲基丙烯酸N-琥珀醯亞胺酯(NSuMA;東京化成工業股份有限公司製造)18.0g、及2,2'-偶氮雙(異丁酸)二甲酯(MAIB;和光純藥工業股份有限公司製造)0.05g溶解於乙腈119.2g中,將其在氮氣氛圍下滴加至經加熱回流之乙腈85.2g中。滴加結束後,一面保持加熱回流一面反應17小時。其後,將該反應混合液濃縮至100ml左右之量,加入二***使聚合物析出。濾取聚合物後,於減壓下進行乾燥,藉此獲得36.0g高分子化合物3。該高分子化合物3之重量平均分子量以聚苯乙烯換算為182,000。利用13C-NMR測定出之組成比為HPMA/NSuMA=62莫耳%/38莫耳%。
使甲基丙烯酸2-羥基丙酯(HPMA;東京化成工業股份有限公司製造)8.3g、甲基丙烯酸N-琥珀醯亞胺酯(NSuMA;東京化成工業股份有限公司製造)7.0g、及2,2'-偶氮雙(異丁酸)二甲酯(MAIB;和光純藥工業股份有限公司製造)0.01g溶解於乙腈35.7g中,將其在氮氣氛圍下滴加至經加熱回流之乙腈25.5g中。滴加結束後,一面保持加熱回流一面反應17小時。其後,於該反應混合液中加入二***使聚合物析出。濾取聚合物後,於減壓下進行乾燥,藉此獲得11.0g高分子化合
物4。該高分子化合物4之重量平均分子量以聚苯乙烯換算為265,000。利用13C-NMR測定出之組成比為HPMA/NSuMA=50莫耳%/50莫耳%。
使甲基丙烯酸2-羥基丙酯(HPMA;東京化成工業股份有限公司製造)5.5g、甲基丙烯酸N-琥珀醯亞胺酯(NSuMA;東京化成工業股份有限公司製造)7.0g、及2,2'-偶氮雙(異丁酸)二甲酯(MAIB;和光純藥工業股份有限公司製造)0.01g溶解於乙腈29.2g中,將其在氮氣氛圍下滴加至經加熱回流之乙腈20.9g中。滴加結束後,一面保持加熱回流一面反應17小時。其後,於該反應混合液中加入二***使聚合物析出。濾取聚合物後,於減壓下進行乾燥,藉此獲得8.9g高分子化合物5。該高分子化合物5之重量平均分子量以聚苯乙烯換算為113,000。利用13C-NMR測定出之組成比為HPMA/NSuMA=37莫耳%/63莫耳%。
使甲基丙烯酸甲酯(MMA;東京化成工業股份有限公司製造)10.0g、及2,2'-偶氮雙(異丁酸)二甲酯(MAIB;和光純藥工業股份有限公司製造)0.01g溶解於乙腈23.4g中,將其在氮氣氛圍下滴加至經加熱回流之乙腈16.7g中。滴加結束後,一面保持加熱回流一面反應17小時。其後,於該反應混合液中加入二***使聚合物析出。濾取聚合物後,於減壓下進行乾燥,藉此獲得5.3g高分子化合物6。該高分子化合物6之重量平均分子量以聚苯乙烯換算為230,000。
於上述高分子化合物1~5中,將於聚合反應後成為均勻之高分子溶液之情形設為「良好」,將無法獲得均勻之高分子溶液之情形設為「不良」,歸納示於表1。
[表1]
將高分子化合物1:0.50g、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲0.03g、對甲苯磺酸吡啶鎓0.005g、二甲基乙醯胺0.49g及丙酮1.48g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得實施例1之纖維製造用組合物。實施例1之纖維製造用組合物中之高分子化合物1之含有比率約為20重量%。
將高分子化合物2:0.70g、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲0.04g、對甲苯磺酸吡啶鎓0.007g、二甲基乙醯胺0.31g、及丙酮0.94g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得實施例1之纖維製造用組合物。實施例2之纖維製造用組合物中之高分子化合物2之含有比率約為35重量%。
將高分子化合物3:0.23g、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲0.01g、
對甲苯磺酸吡啶鎓0.002g、二甲基乙醯胺0.50g、及丙酮1.52g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得實施例3之纖維製造用組合物。實施例3之纖維製造用組合物中之高分子化合物3之含有比率約為10重量%。
將高分子化合物3:0.60g、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲0.03g、對甲苯磺酸吡啶鎓0.006g、二甲基乙醯胺0.59g、及丙酮1.77g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得實施例4之纖維製造用組合物。實施例4之纖維製造用組合物中之高分子化合物3之含有比率約為20重量%。
將高分子化合物3:0.40g、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲0.06g、對甲苯磺酸吡啶鎓0.004g、二甲基乙醯胺0.38g、及丙酮1.15g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得實施例5之纖維製造用組合物。實施例5之纖維製造用組合物中之高分子化合物3之含有比率約為20重量%。
將高分子化合物4:0.50g、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲0.03g、對甲苯磺酸吡啶鎓0.005g、二甲基乙醯胺0.49g、及丙酮1.48g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得實施例6之纖維製造用組合物。實施例6之纖維製造用組合物中之高分子化合物4之含有比率約為20重量%。
將高分子化合物5:0.50g、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲0.03g、對甲苯磺酸吡啶鎓0.005g、二甲基乙醯胺0.49g、及丙酮1.48g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100
rpm攪拌直至溶解,獲得實施例7之纖維製造用組合物。實施例7之纖維製造用組合物中之高分子化合物5之含有比率約為20重量%。
將高分子化合物3:0.70g、對甲苯磺酸吡啶鎓0.007g、二甲基乙醯胺0.70g、及丙酮2.09g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得比較例1之纖維製造用組合物。比較例1之纖維製造用組合物中之高分子化合物3之含有比率約為20重量%。
將高分子化合物3:0.70g、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲0.035g、二甲基乙醯胺0.69g、及丙酮2.07g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得比較例2之纖維製造用組合物。比較例2之纖維製造用組合物中之高分子化合物3之含有比率約為20重量%。
將高分子化合物3:0.70g、二甲基乙醯胺0.70g、及丙酮2.10g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得比較例3之纖維製造用組合物。比較例3之纖維製造用組合物中之高分子化合物3之含有比率約為20重量%。
將高分子化合物6:0.26g、對甲苯磺酸吡啶鎓0.003g、二甲基乙醯胺1.70g、及丙酮0.96g加以混合後,利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm攪拌直至溶解,獲得比較例4之纖維製造用組合物。比較例4之纖維製造用組合物中之高分子化合物6之含有比率約為8.9重量%。
將實施例1~7、比較例1~4之纖維製造用組合物之構成示於表2-
1及2-2。
註)PL-LI:1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、PyPTS:對甲苯磺酸吡啶鎓、DMAc:二甲基乙醯胺
於下述試驗例1~4中,利用電場紡絲法之纖維之製造係使用Esprayer ES-2000(Fuence股份有限公司製造)來實施。將纖維製造用組合物注入至1ml之鎖式玻璃注射筒(AS ONE股份有限公司製造),並安裝針長13mm之鎖式金屬製針24G(武蔵高科技股份有限公司製造)。將自針前端至接收纖維之基板之距離(噴出距離)設為20cm。將施加電壓設為25kV,將噴出速度設為10μl/min。
於下述試驗例1~4中,纖維形狀之確認係藉由如下方式而進行:利用離子濺射儀(ion sputter)(E-1030,日立高新技術股份有限公司製造)將Pt-Pd以1分鐘蒸鍍於纖維後,使用掃描式電子顯微鏡(SEM)(S-4800,日立高新技術股份有限公司製造),以放大倍率10,000倍進行觀察。
將維持纖維形狀之情形設為「良好」,將未維持纖維形狀之情形設為「不良」。
於下述試驗例1~4中,纖維徑(纖維之粗度)之測定係使用掃描式電子顯微鏡(SEM)(S-4800,日立高新技術股份有限公司製造),拍攝放大倍率10,000倍之圖像並保存後,藉由配套之測長工具而進行。
將實施例1~7及比較例1~4之纖維製造用組合物於製備後立即藉由電場紡絲法於鋁箔上紡絲,其後對所獲得之纖維以表3所示之條件進行加熱處理,確認加熱處理後之纖維形狀。將結果示於表3。
將實施例1~7及比較例1~4之纖維製造用組合物於製備後立即藉由電場紡絲法於鋁箔上紡絲,其後將以表4所示之條件進行加熱處理後之纖維於乙醇中浸漬10秒鐘後,再次確認纖維形狀,測定纖維徑。將結果示於表4。
將實施例4及比較例1~3之纖維製造用組合物於製備後立即藉由電場紡絲法於鋁箔上紡絲,其後將以表5所示之條件進行加熱處理後之纖維於作為液體培養基之ISCOVE'S MODIFIED DULBECCO'S MEDIUM(SIGMA公司製造)中浸漬7天後,經由水洗及乙醇洗淨,再次確認纖維形狀,測定纖維徑。將結果示於表5。
[表3]
[表5]
根據表3之結果,使用實施例1~7及比較例1~4之纖維製造用組合物,利用電場紡絲法製造之纖維於僅進行加熱處理之情形時,不論NSuMA/HPMA組成比、高分子化合物之分子量及高分子化合物之含量、及交聯劑之含量為多少均為良好之形狀。
根據表4之結果,使用實施例1~7之纖維製造用組合物製造之纖維即便於加熱處理後,進而於乙醇中浸漬10秒鐘後亦顯示良好之形狀。於實施例7中,顯示良好之纖維形狀,觀察到較廣範圍之纖維徑。進而,根據實施例4及實施例5之結果,即便加熱處理之加熱溫度為80℃,亦顯示良好之纖維形狀。
根據表5之結果,使用實施例4之纖維製造用組合物製造之纖維即便於細胞培養用液體培養基中浸漬7天後,亦顯示良好之纖維形狀。
即,於將本發明之纖維製造用組合物紡絲而製造纖維之情形時,為了製成顯示良好之纖維形狀,且有機溶劑耐受性及培養基耐受性優異之纖維,較理想為以80℃以上進行加熱處理。
又,提示於在上述條件下進行電場紡絲之情形時,所製造之纖維之纖維徑取決於成分A之高分子化合物之重量平均分子量、與纖維製造用組合物中之成分A之高分子化合物之含有比率。因此,藉由調
整成分A之高分子化合物之重量平均分子量、及纖維製造用組合物中之成分A之高分子化合物之含有比率,而可獲得所需之纖維徑之纖維。
於將實施例1及比較例4之纖維製造用組合物藉由電場紡絲法紡絲後,於所獲得之纖維上培養細胞,對此進行評價。再者,以下,CO2培養箱中之CO2之濃度(%)係以氣體氛圍中之CO2之體積%表示。
將實施例1之纖維製造用組合物藉由電場紡絲法紡絲,對玻璃基板上吹送20分鐘後,於180℃下進行30分鐘加熱處理。玻璃基板係使用微型蓋玻片(Matsunami Glass股份有限公司製造)(Φ32mm,厚度約0.5mm)。將所獲得之纖維以乙醇洗淨並風乾後,利用掃描式電子顯微鏡(SEM)確認纖維形狀。由實施例1之纖維製造用組合物獲得之纖維之纖維徑約為430nm。
再者,以下,方便起見,將紡絲實施例1之纖維製造用組合物而形成纖維之玻璃基板稱為「實施例1之纖維基板」。
將比較例4之纖維製造用組合物藉由電場紡絲法紡絲,對玻璃基板上吹送20分鐘後,於180℃下進行10分鐘加熱處理。玻璃基板係使用微型蓋玻片(Matsunami Glass股份有限公司製造)(Φ32mm,厚度約0.5mm)。將所獲得之纖維以乙醇洗淨並風乾後,利用掃描式電子顯微鏡(SEM)確認纖維形狀。由比較例4之纖維製造用組合物獲得之纖維之纖維徑約為440nm。
再者,以下,方便起見,將紡絲比較例4之纖維製造用組合物而形成纖維之玻璃基板稱為「比較例4之纖維基板」。
細胞係使用人胚胎腎細胞株HEK293(DS Pharma Biomedical股份有限公司製造)。用於細胞之培養之培養基係使用含有10%(v/v)FBS及1%(v/v)NEAA(Non-Essential Amino Acids,非必需胺基酸)(GIBCO公司製造)之EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium,伊格爾氏最低必需培養基)培養基(和光純藥工業股份有限公司製造)。細胞係於在37℃之CO2培養箱內保持5%二氧化碳濃度之狀態下,使用直徑10cm之培養皿(培養基10mL)靜置培養2天以上。繼而,將該細胞以PBS10mL洗淨後,添加胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(和光純藥工業股份有限公司製造)1mL使細胞剝離,懸浮於上述培養基10mL中。將該懸浮液離心分離(TOMY股份有限公司製造,LC-200,1000rpm/3min,室溫)後,去除上清液,添加上述培養基製備細胞懸浮液。再者,PBS意指磷酸鹽緩衝液(Sigma-Aldrich Japan公司製造),FBS意指胎牛血清(Biological Industries公司製造)。
於6孔平底微量盤(AS ONE股份有限公司製造)配置實施例1之纖維基板、比較例4之纖維基板、及作為對照之未處理之玻璃基板,添加70%乙醇2mL,於室溫下浸漬5分鐘後風乾。
於6孔平底微量盤配置實施例1之纖維基板,添加70%乙醇2mL,於室溫下浸漬5分鐘。去除該溶液而風乾後,每孔添加2mL層黏連蛋白521(BioLamina股份有限公司製造)/PBS溶液(20μg/mL)。於37℃之培養箱內靜置2小時使層黏連蛋白固定化後,去除溶液,以每孔2mL之PBS洗淨2次。
於6孔平底微量盤配置滅菌之實施例1之纖維基板、比較例4之纖維基板、未處理之玻璃基板、及固定化有層黏連蛋白521之實施例1之
纖維基板,以培養基2mL洗淨2次。其後,各添加2mL製備為2.0×105cells/well之HEK293(人胚胎腎細胞)之細胞懸浮液後,於保持5%二氧化碳濃度之狀態下,於37℃下在CO2培養箱內靜置24小時。
於24小時之細胞培養之後,去除各纖維基板、及未處理之玻璃基板(對照)之上清液,以PBS 2mL洗淨。去除PBS後,添加1mL含有10%(v/v)FBS及1%(v/v)NEAA(GIBCO公司製造)之EMEM培養基,進而添加100μL之WST-8試劑(岸田化學股份有限公司製造)。於37℃下在CO2培養箱內靜置100分鐘後,將反應溶液100μL移至96孔平底微量盤,利用吸光度計(Molecular Devices公司製造,SpectraMax)測定450nm之吸光度。
將各細胞數計測之結果(n=2之平均值)示於表6。
根據表6之結果,可知於以180℃加熱之實施例1之纖維基板上HEK293細胞增生,顯示使用實施例1之纖維製造用組合物製造之纖維對活體無害。又,於固定化有層黏連蛋白521之實施例1之纖維基板上,細胞增生率提昇了約2倍。由此可知,藉由將對細胞培養有效之物質固定化於本發明之纖維,而可提昇細胞增生性。
將實施例5之纖維製造用組合物藉由電場紡絲法紡絲後,於所獲
得之纖維上培養細胞,對此進行評價。再者,細胞培養方法係按照試驗例2進行。
將實施例5之纖維製造用組合物藉由電場紡絲法紡絲,對Φ30mm聚苯乙烯(PS)基板上吹送20分鐘後,於80℃下進行24小時加熱處理。Φ30mmPS基板係由ACRYSUNDAY股份有限公司製造之「Plaban」(商品名;厚度0.2mm)自製而成。將所獲得之纖維以乙醇洗淨並風乾後,利用掃描式電子顯微鏡(SEM)確認纖維形狀。由實施例5之纖維製造用組合物獲得之纖維之纖維徑約為470nm。
再者,以下,方便起見,將紡絲實施例5之纖維製造用組合物形成有纖維之PS基板稱為「實施例5之纖維基板」。
於6孔平底微量盤配置實施例5之纖維基板,每孔添加2mL之YIGSR肽(BEX股份有限公司製造)/PBS溶液(0.05重量%)。於室溫下靜置24小時使肽固定化後去除溶液,以每孔2mL之PBS洗淨2次。
於6孔平底微量盤(AS ONE股份有限公司製造)配置實施例5之纖維基板、固定化有肽之實施例5之纖維基板、及作為對照之未處理之PS基板,添加70%乙醇2mL,於室溫下浸漬5分鐘後風乾。
於6孔平底微量盤配置經滅菌之實施例5之纖維基板、固定化有肽之實施例5之纖維基板、及作為對照之未處理之PS基板,以培養基2mL洗淨2次。其後,各添加2mL製備為2.0×105cells/well之HEK293(人胚胎腎細胞)之細胞懸浮液加後,於保持5%二氧化碳濃度之狀態下,於37℃下在CO2培養箱內靜置24小時。
於24小時之細胞培養之後,去除進行了細胞培養之實施例5之纖維基板、固定化有肽之實施例5之纖維基板、及未處理之PS基板(對照)之上清液,以PBS2 mL洗淨。去除PBS後,添加1mL含有10%(v/v)FBS及1%(v/v)NEAA(GIBCO公司製造)之EMEM培養基,進而添加100μL之WST-8試劑(岸田化學股份有限公司製造)。於37℃下在CO2培養箱內靜置100分鐘後,將反應溶液100μL移至96孔平底微量盤,利用吸光度計(Molecular Devices公司製造,SpectraMax)測定450nm之吸光度。
將各細胞數計測之結果(n=2之平均值)示於表7。
根據表7之結果,與未處理之PS基板上相比,於實施例5之纖維基板上,Hek293細胞增生2.5倍之多。進而,於固定化有肽之實施例5之纖維基板上增生4.0倍之多。由此可知,本發明之纖維具有細胞增生性,及藉由將對細胞培養有效之物質固定化於本發明之纖維,而可提昇細胞增生性。
將實施例4及比較例4之纖維製造用組合物藉由電場紡絲法紡絲後,於所獲得之纖維上培養細胞,對此進行評價。再者,以下,CO2培養箱中之CO2之濃度(%)係以氣體氛圍中之CO2之體積%表示。
將實施例4之纖維製造用組合物藉由電場紡絲法紡絲,對玻璃基板上吹送20分鐘後,於180℃下進行30分鐘加熱處理。玻璃基板係使用微型蓋玻片(Matsunami Glass股份有限公司製造)(Φ32mm,厚度約0.5mm)。將所獲得之纖維以乙醇洗淨並風乾後,利用掃描式電子顯微鏡(SEM)確認纖維形狀。由實施例4之纖維製造用組合物獲得之纖維之纖維徑約為450nm。
再者,以下,方便起見,將紡絲實施例4之纖維製造用組合物而形成有纖維之玻璃基板稱為「實施例4之纖維基板」。
將比較例4之纖維製造用組合物藉由電場紡絲法紡絲,對玻璃基板上吹送20分鐘後,於180℃下進行10分鐘加熱處理。玻璃基板係使用微型蓋玻片(Matsunami Glass股份有限公司製造)(Φ32mm,厚度約0.5mm)。將所獲得之纖維以乙醇洗淨並風乾後,利用掃描式電子顯微鏡(SEM)確認纖維形狀。由比較例4之纖維製造用組合物獲得之纖維之纖維徑約為440nm。
再者,以下,方便起見,將紡絲比較例4之纖維製造用組合物而形成有纖維之玻璃基板稱為「比較例4之纖維基板」。
將於小鼠纖維母細胞(MEF;自日本SLC公司製造之E12.5 ICR小鼠採集、調整)或基質膠人類ESC-無血清培養基質(qualified matrix)(Corning製造)上培養之人類ES細胞(H9株)或人類iPS細胞(253G1株)利用D-PBS(-)(Life technologies製造)洗淨2次後,添加1mL之TrypLE Express,並於37℃下靜置5分鐘。抽吸去除TrypLE Express後,以最終濃度10μM之含有Y-27632(和光純藥股份有限公司製造)之mTeSR1(VERITAS股份有限公司製造)(以下稱為mTeSR1/10μM Y27632)培養基回收細胞。利用移液使細胞懸浮液成為單細胞後,以
轉數1000rpm/3min於室溫下進行離心分離。去除上清液後,使細胞顆粒再次懸浮於mTeSR1/10μM Y27632培養基,利用NucleoCounter NC-200(以下稱為NC-200;ChemoMetecAS製造)計測細胞數。
於6孔平底微量盤(BD Bioscience公司製造)配置實施例4之纖維基板、及比較例4之纖維基板,利用100%乙醇1mL洗淨3次後風乾。其後,利用達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium):Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12;Sigma Aldrich製造)溶液1mL洗淨3次。
於6孔平底微量盤(BD Bioscience公司製造)配置實施例4之纖維基板、及未處理之玻璃基板,利用100%乙醇1mL洗淨3次並風乾後,利用D-PBS(-)或DMEM/F-12溶液1mL洗淨3次。對實施例4之纖維基板添加1mL藉由D-PBS(-)而製備為最終濃度100μg/10mL之層黏連蛋白511(BioLamina製造)溶液,於37℃下靜置2小時或於4℃下靜置一晚後,利用DMEM/F-12溶液1mL洗淨1次。對玻璃基板添加1mL利用DMEM/F-12稀釋為75倍之基質膠溶液,於37℃下靜置2小時或於4℃下靜置一晚後,利用DMEM/F-12溶液1mL洗淨1次。
於6孔平底微量盤(BD Bioscience公司製造)配置經滅菌之實施例4之纖維基板、經滅菌之比較例4之纖維基板、固定化有層黏連蛋白511之實施例4之纖維基板、及塗佈有基質膠(Corning公司製造)之玻璃基板後,以成為1.5~2.0×105cells/well之方式添加人類ES細胞或人類iPS細胞之懸浮液。於37℃下24小時後(培養第1天),利用mTeSR1/10μM Y27632培養基1.5mL進行培養基交換。自培養第2天至培養第4天,利用mTeSR1培養基1.5mL進行培養基交換。在培養期間,於保
持5%二氧化碳濃度之狀態下,於37℃下靜置於CO2培養箱內。
於培養4天後,去除培養基,以D-PBS(-)洗淨細胞層。其後,添加0.5mL之TrypLE Express,於37℃下靜置1分鐘或3分鐘。回收細胞後,以轉數1000rpm/3min進行離心分離,去除上清液。利用DMEM/F-12溶液使細胞顆粒再次懸浮後,利用NC-200計測細胞數與存活率。細胞增生效率係根據培養第4天之細胞數/播種後之細胞數而算出。
將各細胞之增生效率之結果(n=2之平均值)示於表8(人類ES細胞)及表9(人類iPS細胞)。
根據表8及表9之結果,可知實施例4之纖維基板較比較例4之纖
維基板對人類ES細胞及人類iPS細胞之培養有效。又,可知固定化有層黏連蛋白511之實施例4之纖維基板中之細胞增生率與塗佈有基質膠之玻璃基板中之細胞增生率為相同程度,可知將細胞黏著物質固定化於纖維基板對細胞培養有效。
進而,根據表9之人類iPS細胞存活率之結果,可知固定化有層黏連蛋白511之實施例4之纖維基板、及實施例4之纖維基板之細胞存活率較塗佈有基質膠之玻璃基板高約20%。根據該結果,可知本發明之纖維對細胞培養有效。
根據本發明,可提供一種適於將對細胞之黏著、增生、分化等有效之物質固定化,進而保持有機溶劑耐受性之用於纖維製造之纖維製造用組合物、將該組合物紡絲而獲得之纖維、及使用該纖維之細胞培養支架材料。該纖維係藉由將對細胞之黏著、增生、分化等有效之物質固定化,而表現出作為細胞培養支架材料之更優異之功能。
本申請案係以於日本提出申請之日本專利特願2014-027044(申請日:2014年2月14日)為基礎,且其內容全部包含於本說明書中。
Claims (10)
- 一種纖維製造用組合物,其含有:(A)含有通式(1)所表示之單元結構及通式(2)所表示之單元結構之高分子化合物、(B)交聯劑、(C)酸化合物、及(D)溶劑,
- 如請求項1之組合物,其中上述Q2係以通式(5)表示,
- 如請求項1或2之組合物,其中上述高分子化合物之重量平均分子量為1,000~1,000,000。
- 如請求項1至3中任一項之組合物,其中上述溶劑為極性溶劑。
- 一種纖維之製造方法,其包含將如請求項1至4中任一項之組合物紡絲之步驟。
- 如請求項5之方法,其中上述紡絲為電場紡絲。
- 如請求項5或6之方法,其包含將紡絲而得之纖維於70~300℃之範圍內進行加熱之步驟。
- 如請求項5至7中任一項之方法,其進而包含將細胞黏著物質固定化之步驟。
- 一種纖維,其係利用如請求項5至8中任一項之方法製造。
- 一種細胞培養支架材料,其含有如請求項9之纖維。
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