JP6504508B2 - 活性エステル基を含む繊維製造用組成物及びその繊維を用いた細胞培養足場材料 - Google Patents
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Description
このうち、電界紡糸法(エレクトロスピニング)と呼ばれる高電圧をかけながら繊維を吹き付ける方法によって、ナノレベルの繊維径を持つナノ繊維(ナノファイバー)で構成された構造体が細胞培養足場材料として注目を浴びている。そのナノ繊維上で細胞医療や再生医療に使用する機能細胞や多能性幹細胞の未分化性を保持したまま培養する試みが多数なされている(非特許文献1〜非特許文献3参照)。しかしながら、このような合成高分子由来の繊維は細胞接着性や増殖性を付与することが難しく、生体内の環境を模倣しているとは言えない。
また本発明者らは、上記繊維製造用組成物の紡糸は、活性エステル基とヒドロキシ基を側鎖に有する高分子化合物を架橋剤及び酸化合物とともに紡糸することから、高分子化合物に含まれるヒドロキシ基同士が架橋剤を介して架橋反応することにより、高分子化合物同士が架橋する結果、有機溶剤耐性、液体培地耐性を有する繊維が得られることを見出した。
また、本発明者らは、本発明の繊維製造用組成物を紡糸して製造した繊維は、加熱処理を施すことにより、より優れた有機溶剤耐性、液体培地耐性を発現することを見出した。
これらの知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。
(B)架橋剤、
(C)酸化合物、及び
(D)溶剤
を含有する繊維製造用組成物。
R1は、水素原子又はメチル基を示し、
Q1は、エステル結合又はアミド結合を示し、
R2は、少なくとも1個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数1〜10のアルキル基又は炭素原子数6〜10の芳香族炭化水素基を示す。〕
R3は、水素原子又はメチル基を示し、
Q2は、活性エステル基を示す。〕
[2] 上記Q2が、一般式(5)で表される、上記[1]に記載の組成物。
[3] 上記高分子化合物の重量平均分子量が、1,000〜1,000,000である、上記[1]又は[2]に記載の組成物。
[4] 上記溶剤が、極性溶剤である、上記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の組成物。
[5] 上記[1]〜[4]のいずれか1つに記載の組成物を紡糸する工程を含む、繊維の製造方法。
[6] 上記紡糸が、電界紡糸である、上記[5]記載の方法。
[7] 紡糸した繊維を、70〜300℃の範囲で加熱する工程を含む、上記[5]又は[6]記載の方法。
[8] さらに細胞接着物質を固定化する工程を含む、上記[5]〜[7]のいずれか1つに記載の方法。
[9] 上記[5]〜[8]のいずれか1つに記載の方法で製造される繊維。
[10] 上記[9]記載の繊維を含む、細胞培養足場材料。
本発明の繊維製造用組成物(以下、「本発明の組成物」とも称する)は、(A)一般式(1)で表される単位構造及び一般式(2)で表される単位構造を含む高分子化合物、(B)架橋剤、(C)酸化合物、及び(D)溶剤を含有することを、主たる特徴とする。
本発明の組成物は成分Aとして、一般式(1)で表される単位構造及び一般式(2)で表される単位構造を含む高分子化合物(以下、「成分Aの高分子化合物」又は単に「成分A」とも称する)を含有する。成分Aに含まれる一般式(1)で表される単位構造は、側鎖にヒドロキシ基を有するため、成分Aを架橋剤及び酸化合物とともに紡糸することにより、ヒドロキシ基同士が架橋剤を介して架橋反応することにより高分子化合物同士が架橋し、有機溶剤耐性を有する繊維が得られる。また、成分Aに含まれる一般式(2)で表される単位構造は、側鎖に活性エステル基を有するため、任意のアミン(タンパク質、ペプチド、有機アミンなど)との求核付加反応によって、細胞の接着・増殖・分化などに有効な物質(細胞接着物質)を固定化することができる。一般式(2)で表される単位構造の活性エステル基と任意のアミンとの反応は、繊維製造用組成物の調製時に行うことが可能であり、さらに繊維製造用組成物を紡糸後、加熱処理後でも行うことが可能である。
R1は、水素原子又はメチル基を示し、
Q1は、エステル結合又はアミド結合を示し、
R2は、少なくとも1個のヒドロキシ基で置換されている炭素原子数1〜10のアルキル基又は炭素原子数6〜10の芳香族炭化水素基を示す。〕
R3は、水素原子又はメチル基を示し、
Q2は、活性エステル基を示す。〕
また、R2における少なくとも1個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数6〜10の芳香族炭化水素基の「炭素原子数6〜10の芳香族炭化水素基」としては、例えば、フェニル基、1−ナフチル基、2−ナフチル基等が挙げられる。
R2は、繊維製造時における架橋反応効率や、製造された繊維の細胞親和性の観点から、好ましくは、少なくとも1個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数1〜10(より好ましくは1〜6、特に好ましくは1〜4)のアルキル基又は少なくとも1個の水素原子がヒドロキシ基で置換されているフェニル基である。
成分Aの高分子化合物は、本発明の目的を損なわない限り、一般式(1)で表される単位構造及び一般式(2)で表される単位構造以外の単位構造を含んでもよいが、成分Aの高分子化合物の重合性の観点から、成分Aの高分子化合物の全単位構造に対する一般式(1)で表される単位構造の割合(モル%)は、35〜95モル%が好ましく、一般式(2)で表される単位構造の割合(モル%)は、5〜65モル%が好ましい。また成分Aの高分子化合物の全単位構造に対する一般式(1)で表される単位構造の割合と一般式(2)で表される単位構造の割合との合計(モル%)は、成分Aの高分子化合物の重合性の観点から、90モル%を超えることが好ましく、95モル%以上がより好ましく、100モル%が特に好ましい。成分Aの高分子化合物の全単位構造に対する各単位構造の割合は、13C−NMRにより測定される各単位構造の組成比から算出できる。
なお、本発明において「(メタ)アクリレート化合物」とは、アクリレート化合物とメタクリレート化合物の両方をいう。例えば、(メタ)アクリル酸は、アクリル酸とメタクリル酸の両方をいう。
本発明の組成物は成分Bとして、架橋剤(以下、「成分Bの架橋剤」又は単に「成分B」とも称する)を含有する。成分Bは、後述の成分Cと併用することにより、成分Aのヒドロキシ基同士を、成分B自身を介して架橋させることで、繊維に有機溶剤耐性を付与することができる。
本発明の組成物は成分Cとして、酸化合物(以下、「成分Cの酸化合物」又は単に「成分C」とも称する)を含有する。当該酸化合物は塩の態様であってもよく、即ち、本発明における「酸化合物」なる用語は、塩をも包含する概念である。成分Cは、成分Bと併用することにより、成分Aのヒドロキシ基同士が成分Bを介して架橋反応する際にその架橋反応を促進させることができる。
本発明の組成物は成分Dとして、溶剤(以下、「成分Dの溶剤」又は単に「成分D」とも称する)を含有する。
当該極性溶剤としては、例えば、水、メタノール、エタノール、2−プロパノール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドン等が挙げられ、組成物の紡糸し易さのため、好ましくはアセトンとジメチルアセトアミドの混合溶媒であり、その好ましい混合比率(重量%)は、アセトン/ジメチルアセトアミド=(90重量%〜60重量%)/(10重量%〜40重量%)である。
本発明の繊維の製造方法(以下、「本発明の方法」とも称する)は、本発明の組成物を紡糸する工程を含むことを、主たる特徴とする。
活性エステル基は、中性の条件で遊離一級アミノ基と反応する。一級アミンの塩基性は、芳香族アミンよりアルキルアミンが強く、アルキルアミンは活性エステルとの反応により適している。蛋白質及びペプチドを、それらのアミノ基を介して共有結合的に繊維に付加させる場合には、水系での反応が必須であり、反応溶液のpHが中性から弱アルカリ性領域にある場合や、反応温度が氷冷下から37℃程度である場合に、短時間に反応が進む。水溶性の低い一級アミンの場合には、エタノールやジメチルスルホキシド等のような有機溶剤に溶解して反応させることが好ましい。
好ましい反応条件は0℃〜37℃で1〜48時間、さらに好ましくは0℃〜37℃で1〜24時間である。
前記生理活性物質としては、例えば、D−グルコサミン、D−ガラクトサミン、ノイラミン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン等の糖類、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、3−(3,4−ジクロロフェニル)−1,1−ジメチルウレア(DCMU)、アトラジン、リニュロン及びシマジン等が挙げられる。
前記化合物としては、例えば、アンジオテンシンI乃至IV、ブラジキニン、フィブリノペプチド、ナトリウム利尿ペプチド、ウロディラチン、グアニリン、エンドセリン1乃至3、サリューシン、ウロテンシン、オキシトシン、ニューロフィジン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、エンドルフィン、リポトロピン、ウロコルチン1乃至3、黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、コルチスタチン、プロラクチン放出ペプチド、メタスチン、タキキニン、サブスタンスP、ニューロキニン、エンドキニン、ニューロテンシン、ニューロメジン、ゼニン、グレリン、オベスタチン、メラニン凝集ホルモン、オレキシン、ニューロペプチド、ダイノルフィン、ネオエンドルフィン、エンドモルフィン、ノシセプチン、ピログルタミル化RF アミドペプチド、ガラニン、ガストリン、コレシストキニン、セクレチン、リラキシン、グルカゴン、グリセンチン、アドレノメデュリン、アミリン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ディフェンシン、チモシン、YIGSRペプチド等のペプチド;アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ジヒドロキシフェニルアラニン、チロキシン、フォスフォセリン、デスモシン、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γ−アミノ酪酸、テアニン、カイニン酸、ドウモイ酸、イボテン酸等のアミノ酸;2−ジメチルアミノエチルアミン(CAS番号:108−00−9の化合物)、N−(2−ヒドロキシエチル)エチレンジアミン(CAS番号:111−41−1の化合物)、N−(2−アミノエチル)ピペラジン(CAS番号:140−31−8の化合物)、4−(2−アミノエチル)モルホリン(CAS番号:2038−03−1の化合物)、1−(2−アミノエチル)−2−イミダゾリドン(CAS番号:6281−42−1の化合物)、トリプトアミン(CAS番号:61−54−1の化合物)、ヒスタミン二塩酸塩(CAS番号:56−92−8の化合物)、チラミン(CAS番号:51−67−2の化合物)、ドーパミン(CAS番号:51−61−6の化合物)等の一級アミン;エチレンジアミン二塩酸塩(CAS番号:333−18−6の化合物)、1,6−ジアミノヘキサン(CAS番号:124−09−4の化合物)、N,N’−ビス(アミノプロピル)ピペラジン(CAS番号:7209−38−3の化合物)の一級ジアミン等が挙げられる。
この中で特に好ましい細胞接着物質は、ラミニン511、ラミニン521又はYIGSRペプチドである。
本発明の細胞培養足場材料は、本発明の繊維を含むことを、主たる特徴とする。本発明において「細胞培養足場材料」とは、細胞に対して悪影響を及ぼさず、細胞培養が可能な材料をいう。
下記の高分子化合物1〜6の重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)により測定した。測定に用いた装置、測定条件は次の通りである。
装置:TOSOH HLC−8320GPC system
カラム:Shodex(登録商標)KF−803L、KF−802及びKF−801
カラム温度:40℃
溶離液:DMF
流量:0.6ml/分
検出器:RI
標準試料:ポリスチレン
下記成分Aの高分子化合物の単位構造の組成比は、13C−NMRにより測定した。測定及び解析に用いた装置、条件は次の通りである。
装置:日本電子株式会社 JNM−ECA500、Delta V5.0
測定核:13Cゲートデカップリング
積算回数:18000
測定温度:室温
検出ピーク:69〜71ppm(HPMA由来)、
25〜27ppm(NSuMA由来)
測定溶剤:重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO−d6)、750uL
サンプル量:0.1g
緩和試薬:クロム(III)アセチルアセトナート、4mg
(合成例1:高分子化合物1)
2−ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA;東京化成工業株式会社製)10.5g、N−スクシンイミジルメタクリレート(NSuMA;東京化成工業株式会社製)1.5g、及び2,2’−アゾビス(イソ酪酸)ジメチル(MAIB;和光純薬工業株式会社製)0.01gをアセトニトリル28.3gに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル20.2g中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、17時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物1を7.71g得た。当該高分子化合物1の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で217,000であった。13C−NMRにて測定した組成比は、HPMA/NSuMA=91モル%/9モル%であった。
2−ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA;東京化成工業株式会社製)10.6g、N−スクシンイミジルメタクリレート(NSuMA;東京化成工業株式会社製)1.5g、及び2,2’−アゾビス(イソ酪酸)ジメチル(MAIB;和光純薬工業株式会社製)0.72gをアセトニトリル30.0gに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル21.4g中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、17時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物2を12.0g得た。当該高分子化合物2の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で13,000であった。13C−NMRにて測定した組成比は、HPMA/NSuMA=92モル%/8モル%であった。
2−ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA;東京化成工業株式会社製)33.0g、N−スクシンイミジルメタクリレート(NSuMA;東京化成工業株式会社製)18.0g、及び2,2’−アゾビス(イソ酪酸)ジメチル(MAIB;和光純薬工業株式会社製)0.05gをアセトニトリル119.2gに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル85.2g中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、17時間反応させた。その後、この反応混合液を100ml程度の量まで濃縮し、ジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物3を36.0g得た。当該高分子化合物3の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で182,000であった。13C−NMRにて測定した組成比は、HPMA/NSuMA=62モル%/38モル%であった。
2−ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA;東京化成工業株式会社製)8.3g、N−スクシンイミジルメタクリレート(NSuMA;東京化成工業株式会社製)7.0g、及び2,2’−アゾビス(イソ酪酸)ジメチル(MAIB;和光純薬工業株式会社製)0.01gをアセトニトリル35.7gに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル25.5g中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、17時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物4を11.0g得た。当該高分子化合物4の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で265,000であった。13C−NMRにて測定した組成比は、HPMA/NSuMA=50モル%/50モル%であった。
2−ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA;東京化成工業株式会社製)5.5g、N−スクシンイミジルメタクリレート(NSuMA;東京化成工業株式会社製)7.0g、及び2,2’−アゾビス(イソ酪酸)ジメチル(MAIB;和光純薬工業株式会社製)0.01gをアセトニトリル29.2gに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル20.9g中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、17時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物5を8.9g得た。当該高分子化合物5の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で113,000であった。13C−NMRにて測定した組成比は、HPMA/NSuMA=37モル%/63モル%であった。
メチルメタクリレート(MMA;東京化成工業株式会社製)10.0g、及び2,2’−アゾビス(イソ酪酸)ジメチル(MAIB;和光純薬工業株式会社製)0.01gをアセトニトリル23.4gに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル16.7g中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、17時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物6を5.3g得た。当該高分子化合物6の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で230,000であった。
(実施例1)
高分子化合物1;0.50g、1,3,4,6−テトラキス(メトキシメチル)グリコールウリル0.03g、ピリジニウム−p−トルエンスルホナート0.005g、ジメチルアセトアミド0.49g、及びアセトン1.48gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、実施例1の繊維製造用組成物を得た。実施例1の繊維製造用組成物における高分子化合物1の含有割合は、約20重量%である。
高分子化合物2;0.70g、1,3,4,6−テトラキス(メトキシメチル)グリコールウリル0.04g、ピリジニウム−p−トルエンスルホナート0.007g、ジメチルアセトアミド0.31g、及びアセトン0.94gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、実施例1の繊維製造用組成物を得た。実施例2の繊維製造用組成物における高分子化合物2の含有割合は、約35重量%である。
高分子化合物3;0.23g、1,3,4,6−テトラキス(メトキシメチル)グリコールウリル0.01g、ピリジニウム−p−トルエンスルホナート0.002g、ジメチルアセトアミド0.50g、及びアセトン1.52gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、実施例3の繊維製造用組成物を得た。実施例3の繊維製造用組成物における高分子化合物3の含有割合は、約10重量%である。
高分子化合物3;0.60g、1,3,4,6−テトラキス(メトキシメチル)グリコールウリル0.03g、ピリジニウム−p−トルエンスルホナート0.006g、ジメチルアセトアミド0.59g、及びアセトン1.77gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、実施例4の繊維製造用組成物を得た。実施例4の繊維製造用組成物における高分子化合物3の含有割合は、約20重量%である。
高分子化合物3;0.40g、1,3,4,6−テトラキス(メトキシメチル)グリコールウリル0.06g、ピリジニウム−p−トルエンスルホナート0.004g、ジメチルアセトアミド0.38g、及びアセトン1.15gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、実施例5の繊維製造用組成物を得た。実施例5の繊維製造用組成物における高分子化合物3の含有割合は、約20重量%である。
高分子化合物4;0.50g、1,3,4,6−テトラキス(メトキシメチル)グリコールウリル0.03g、ピリジニウム−p−トルエンスルホナート0.005g、ジメチルアセトアミド0.49g、及びアセトン1.48gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、実施例6の繊維製造用組成物を得た。実施例6の繊維製造用組成物における高分子化合物4の含有割合は、約20重量%である。
高分子化合物5;0.50g、1,3,4,6−テトラキス(メトキシメチル)グリコールウリル0.03g、ピリジニウム−p−トルエンスルホナート0.005g、ジメチルアセトアミド0.49g、及びアセトン1.48gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、実施例7の繊維製造用組成物を得た。実施例7の繊維製造用組成物における高分子化合物5の含有割合は、約20重量%である。
高分子化合物3;0.70g、ピリジニウム−p−トルエンスルホナート0.007g、ジメチルアセトアミド0.70g、及びアセトン2.09gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、比較例1の繊維製造用組成物を得た。比較例1の繊維製造用組成物における高分子化合物3の含有割合は、約20重量%である。
高分子化合物3;0.70g、1,3,4,6−テトラキス(メトキシメチル)グリコールウリル0.035g、ジメチルアセトアミド0.69g、及びアセトン2.07gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、比較例2の繊維製造用組成物を得た。比較例2の繊維製造用組成物における高分子化合物3の含有割合は、約20重量%である。
高分子化合物3;0.70g、ジメチルアセトアミド0.70g、及びアセトン2.10gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、比較例3の繊維製造用組成物を得た。比較例3の繊維製造用組成物における高分子化合物3の含有割合は、約20重量%である。
高分子化合物6;0.26g、ピリジニウム−p−トルエンスルホナート0.003g、ジメチルアセトアミド1.70g、及びアセトン0.96gを混合した後、ミックスローターVMR−5(アズワン株式会社製)にて溶解するまで100rpmで攪拌し、比較例4の繊維製造用組成物を得た。比較例4の繊維製造用組成物における高分子化合物6の含有割合は、約8.9重量%である。
下記の試験例1〜4において、電界紡糸法による繊維の製造は、エスプレイヤーES−2000(株式会社フューエンス製)を用いて実施した。繊維製造用組成物は、1mlのロック式ガラス注射筒(アズワン株式会社製)に注入し、針長13mmのロック式金属製ニードル24G(武蔵エンジニアリング株式会社製)を取り付けた。ニードル先端から繊維を受け取る基板までの距離(吐出距離)は20cmとした。印加電圧は25kVとし、吐出速度は10μl/minとした。
下記の試験例1〜4において、繊維形状の確認は、イオンスパッター(E−1030、株式会社日立ハイテクノロジーズ製)にてPt−Pdを繊維に1分間蒸着した後、走査型電子顕微鏡(SEM)(S−4800、株式会社日立ハイテクノロジーズ製)を使用して、拡大倍率10,000倍で観察することにより行った。
繊維形状が維持されている場合は「良好」とし、繊維形状が維持されない場合は「不良」とした。
下記の試験例1〜4において、繊維径(繊維の太さ)の測定は、走査型電子顕微鏡(SEM)(S−4800、株式会社日立ハイテクノロジーズ製)を使用して、拡大倍率10,000倍の画像を撮影及び保存した後、付属の測長ツールにより行った。
実施例1〜7及び比較例1〜4の繊維製造用組成物を、調製後すぐに、電界紡糸法によりアルミ箔上に紡糸した後、得られた繊維に、表3に示す条件で加熱処理を施し、加熱処理後の繊維形状を確認した。結果を表3に示す。
実施例1〜7及び比較例1〜4の繊維製造用組成物を、調製後すぐに、電界紡糸法によりアルミ箔上に紡糸した後、表4に示す条件で加熱処理を施した繊維をエタノールに10秒間浸漬した後、再び繊維形状を確認し、繊維径を測定した。結果を表4に示す。
実施例4及び比較例1〜3の繊維製造用組成物を、調製後すぐに、電界紡糸法によりアルミ箔上に紡糸した後、表5に示す条件で加熱処理を施した繊維を液体培地であるISCOVE’S MODIFIED DULBECCO’S MEDIUM(シグマ社製)に7日間浸漬した後、水洗及びエタノール洗浄を経て、再び繊維形状を確認し、繊維径を測定した。結果を表5に示す。
表4の結果より、実施例1〜7の繊維製造用組成物を用いて製造した繊維は、加熱処理後、さらにエタノールに10秒間浸漬後においても良好な形状を示した。実施例7においては、良好な繊維形状を示したが、広範囲の繊維径が観察された。さらに実施例4及び実施例5の結果より、加熱処理における加熱温度が80℃であっても、良好な繊維形状を示した。
表5の結果より、実施例4の繊維製造用組成物を用いて製造した繊維は、細胞培養用液体培地に7日間浸漬後であっても、良好な繊維形状を示した。
つまり、本発明の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を製造する場合、良好な繊維形状を示し、且つ有機溶剤耐性及び培地耐性に優れた繊維とするためには、80℃以上で加熱処理することが望ましい。
また、上記条件にて電界紡糸を行なった場合、製造される繊維の繊維径は、成分Aの高分子化合物の重量平均分子量と、繊維製造用組成物における成分Aの高分子化合物の含有割合とに依存することが示唆された。従って、成分Aの高分子化合物の重量平均分子量、及び繊維製造用組成物における成分Aの高分子化合物の含有割合を調整することで、所望の繊維径の繊維を得ることが可能である。
実施例1及び比較例4の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸した後、得られた繊維上にて細胞培養評価を行った。なお、以下において、CO2インキュベーターにおけるCO2の濃度(%)は、雰囲気中のCO2の体積%で示した。
実施例1の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、ガラス基板上に20分間吹付けた後、180℃30分間加熱処理した。ガラス基板には、マイクロカバーガラス(マツナミガラス株式会社製)(Φ32mm、厚さ約0.5mm)を使用した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡(SEM)で確認した。実施例1の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約430nmであった。
尚、以下において、実施例1の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したガラス基板を、便宜上「実施例1の繊維基板」と称する。
比較例4の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、ガラス基板上に20分間吹付けた後、180℃10分間加熱処理した。ガラス基板には、マイクロカバーガラス(マツナミガラス株式会社製)(Φ32mm、厚さ約0.5mm)を使用した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡(SEM)で確認した。比較例4の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約440nmであった。
尚、以下において、比較例4の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したガラス基板を、便宜上「比較例4の繊維基板」と称する。
細胞は、ヒト胎児腎細胞株HEK293(DSファーマバイオメディカル株式会社製)を用いた。細胞の培養に用いた培地は、10%(v/v)FBS及び1%(v/v)NEAA(Non−Essential Amino Acids)(GIBCO社製)を含むEMEM(Eagle’s Minimum Essential Medium)培地(和光純薬工業株式会社製)を用いた。細胞は、37℃CO2インキュベーター内にて5%二酸化炭素濃度を保った状態で、直径10cmシャーレ(培地10mL)を用いて2日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をPBS10mLで洗浄した後、トリプシン−EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(和光純薬工業株式会社製)1mLを添加して細胞を剥がし、上記の培地10mLにて懸濁した。本懸濁液を遠心分離(株式会社トミー精工製、LC−200、1000rpm/3分、室温)後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。なお、PBSはリン酸緩衝生理食塩水(シグマアルドリッチジャパン社製)を意味し、FBSは牛胎児血清(Biological Industries社製)を意味する。
6穴平底マイクロプレート(アズワン株式会社製)に、実施例1の繊維基板、比較例4の繊維基板、及び対照として未処理のガラス基板を配置し、70%エタノール2mLを添加し、室温で5分間浸漬した後、風乾した。
6穴平底マイクロプレートに、実施例1の繊維基板を配置し、70%エタノール2mLを添加し、室温で5分間浸漬した。この溶液を除いて風乾した後、ラミニン521(BioLamina株式会社製)/PBS溶液(20μg/mL)を1ウェルあたり2mL添加した。37℃インキュベーターにて2時間静置しラミニンを固定化した後に溶液を除き、1ウェルあたり2mLのPBSで2回洗浄した。
6穴平底マイクロプレートに、滅菌した実施例1の繊維基板、比較例4の繊維基板、未処理のガラス基板、及びラミニン521を固定化した実施例1の繊維基板を配置し、培地2mLで2回洗浄した。その後、2.0×105cells/wellに調製したHEK293(ヒト胎児腎細胞)の細胞懸濁液を各2mL加えた後、5%二酸化炭素濃度を保った状態で、37℃で24時間CO2インキュベーター内にて静置した。
24時間の細胞培養の後、各繊維基板、及び未処理のガラス基板(対照)の上清を除き、PBS2mLで洗浄した。PBSを除いた後、10%(v/v)FBS及び1%(v/v)NEAA(GIBCO社製)を含むEMEM培地を1mL添加し、さらに100μLのWST−8試薬(キシダ化学株式会社製)を添加した。37℃で100分CO2インキュベーター内にて静置した後、反応溶液100μLを96穴平底マイクロプレートに移し、吸光度計(モレキュラーデバイス社製、SpectraMax)にて450nmの吸光度を測定した。
実施例5の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸した後、得られた繊維上にて細胞培養評価を行った。なお、細胞培養方法は、試験例2に準じて行った。
実施例5の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、Φ30mmポリスチレン(PS)基板上に20分間吹付けた後、80℃24時間加熱処理した。Φ30mmPS基板は、アクリサンデー株式会社製「プラバン」(商品名;厚さ0.2mm)から自作した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡(SEM)で確認した。実施例5の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約470nmであった。
尚、以下において、実施例5の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したPS基板を、便宜上「実施例5の繊維基板」と称する。
6穴平底マイクロプレートに、実施例5の繊維基板を配置し、YIGSRペプチド(株式会社ベックス社製)/PBS溶液(0.05重量%)を1ウェルあたり2mL添加した。室温24時間静置してペプチドを固定化した後に溶液を除き、1ウェルあたり2mLのPBSで2回洗浄した。
6穴平底マイクロプレート(アズワン株式会社製)に、実施例5の繊維基板、ペプチドを固定化した実施例5の繊維基板、及び対照として未処理のPS基板を配置し、70%エタノール2mLを添加し、室温で5分間浸漬した後、風乾した。
6穴平底マイクロプレートに、滅菌した実施例5の繊維基板、ペプチドを固定化した実施例5の繊維基板、及び対照として未処理のPS基板を配置し、培地2mLで2回洗浄した。その後、2.0×105cells/wellに調製したHEK293(ヒト胎児腎細胞)の細胞懸濁液を各2mL加えた後、5%二酸化炭素濃度を保った状態で、37℃で24時間CO2インキュベーター内にて静置した。
24時間の細胞培養の後、細胞培養を行った実施例5の繊維基板、ペプチドを固定化した実施例5の繊維基板、及び未処理のPS基板(対照)の上清を除き、PBS2mLで洗浄した。PBSを除いた後、10%(v/v)FBS及び1%(v/v)NEAA(GIBCO社製)を含むEMEM培地を1mL添加し、さらに100μLのWST−8試薬(キシダ化学株式会社製)を添加した。37℃で100分CO2インキュベーター内にて静置した後、反応溶液100μLを96穴平底マイクロプレートに移し、吸光度計(モレキュラーデバイス社製、SpectraMax)にて450nmの吸光度を測定した。
実施例4及び比較例4の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸した後、得られた繊維上にて細胞培養評価を行った。なお、以下において、CO2インキュベーターにおけるCO2の濃度(%)は、雰囲気中のCO2の体積%で示した。
実施例4の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、ガラス基板上に20分間吹付けた後、180℃30分間加熱処理した。ガラス基板には、マイクロカバーガラス(マツナミガラス株式会社製)(Φ32mm、厚さ約0.5mm)を使用した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡(SEM)で確認した。実施例4の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約450nmであった。
尚、以下において、実施例4の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したガラス基板を、便宜上「実施例4の繊維基板」と称する。
比較例4の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、ガラス基板上に20分間吹付けた後、180℃10分間加熱処理した。ガラス基板には、マイクロカバーガラス(マツナミガラス株式会社製)(Φ32mm、厚さ約0.5mm)を使用した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡(SEM)で確認した。比較例4の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約440nmであった。
尚、以下において、比較例4の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したガラス基板を、便宜上「比較例4の繊維基板」と称する。
マウス繊維芽細胞(MEF;日本SLC社製E12.5 ICRマウスから採取・調整)またはマトリゲル ヒトESC−qualified matrix(Corning製)上で培養したヒトES細胞(H9株)またはヒトiPS細胞(253G1株)をD−PBS(−)(Life technologies製)にて2回洗浄した後、TrypLE Express 1mLを加えて37℃で5分間静置した。TrypLE Expressを吸引除去した後、最終濃度10μMのY−27632(和光純薬株式会社製)を含むmTeSR1(株式会社ベリタス製)(以下、mTeSR1/10μM Y27632)培地で細胞を回収した。細胞懸濁液をピペッティングにてシングルセルにした後、回転数1000rpm/3分間、室温で遠心分離を行った。上清を除去した後、細胞ペレットをmTeSR1/10μM Y27632培地に再度懸濁し、NucleoCounter NC−200(以下、NC−200;ChemoMetecAS製)にて細胞数を計測した。
6穴平底マイクロプレート(BD Bioscience社製)に、実施例4の繊維基板、及び比較例4の繊維基板を配置し、100%エタノール1mLにて3回洗浄した後、風乾した。その後、Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F−12(DMEM/F−12;Sigma Aldrich製)溶液1mLにて3回洗浄した。
6穴平底マイクロプレート(BD Bioscience社製)に、実施例4の繊維基板、及び未処理のガラス基板を配置し、100%エタノール1mLにて3回洗浄し、風乾後、D−PBS(−)またはDMEM/F−12溶液1mLにて3回洗浄した。実施例4の繊維基板には、D−PBS(−)によって最終濃度100μg/10mLに調製したラミニン511(BioLamina製)溶液を1mL添加し、37℃2時間または4℃一晩静置後、DMEM/F−12溶液1mLにて1回洗浄した。ガラス基板には、DMEM/F−12にて75倍で希釈したマトリゲル溶液を1mL添加し、37℃2時間または4℃一晩静置後、DMEM/F−12溶液1mLにて1回洗浄した。
6穴平底マイクロプレート(BD Bioscience社製)に、滅菌した実施例4の繊維基板、滅菌した比較例4の繊維基板、ラミニン511を固定化した実施例4の繊維基板、及びマトリゲル(コーニング社製)をコートしたガラス基板を配置した後、ヒトES細胞またはヒトiPS細胞の懸濁液を1.5〜2.0×105cells/wellとなるように添加した。37℃24時間後(培養1日目)、mTeSR1/10μM Y27632培地1.5mLにて培地交換を行った。培養2日目から培養4日目は、mTeSR1培地1.5mLにて培地交換を行った。培養期間中は、5%二酸化炭素濃度を保った状態で、37℃でCO2インキュベーター内にて静置した。
培養4日後、培地を除去し、D−PBS(−)で細胞層を洗浄した。その後、TrypLE Express 0.5mLを添加し、37℃1分間または3分間静置した。細胞を回収した後、回転数1000rpm/3分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットをDMEM/F−12溶液にて再度懸濁した後、NC−200にて細胞数と生存率を計測した。細胞増殖効率は、培養4日目の細胞数/播種した細胞数より算出した。
さらに、表9のヒトiPS細胞生存率の結果から、ラミニン511を固定化した実施例4の繊維基板、及び実施例4の繊維基板の細胞生存率は、マトリゲルをコートしたガラス基板より約20%高かった。この結果より、細胞培養には本発明の繊維が有効であることがわかった。
Claims (10)
- (A)一般式(1)で表される単位構造及び一般式(2)で表される単位構造を含む高分子化合物、
(B)架橋剤、
(C)酸化合物、及び
(D)溶剤
を含有する繊維製造用組成物。
R1は、水素原子又はメチル基を示し、
Q1は、エステル結合又はアミド結合を示し、
R2は、少なくとも1個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数1〜10のアルキル基又は炭素原子数6〜10の芳香族炭化水素基を示す。〕
R3は、水素原子又はメチル基を示し、
Q2は、活性エステル基を示す。〕 - 上記Q2が、一般式(5)で表される、請求項1に記載の組成物。
- 上記高分子化合物の重量平均分子量が、1,000〜1,000,000である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 上記溶剤が、極性溶剤である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物を紡糸する工程を含む、繊維の製造方法。
- 上記紡糸が、電界紡糸である、請求項5記載の方法。
- 紡糸した繊維を、70〜300℃の範囲で加熱する工程を含む、請求項5又は6記載の方法。
- さらに細胞接着物質を固定化する工程を含む、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法で製造される繊維。
- 請求項9記載の繊維を含む、細胞培養足場材料。
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