TW201542222A - 一種預防/治療腦損傷之藥物組成物及其製備 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了治療腦損傷和腦中風患者用途的組合物,該組合物包括有效劑量的黃耆萃取物和藥學可接受的載體,賦形劑或鹽,該腦損傷包括創傷性腦損傷(TBI)和後天性腦損傷(ABI)。腦中風包括腦缺血性腦中風和出血性腦中風。
Description
本發明提供一種製備黃耆多醣萃取物用於腦損傷與腦中風預防、治療及預後之用途。腦損傷包含創傷性腦損傷和後天性腦損傷。腦中風包含缺血性腦中風或出血性腦中風。
腦部為人類身體最重要的部分之一,並同樣為各種認知、情感以及活動的中心,然而不論外力或非外力對腦部所造成的傷害,通常都將帶給人類腦部重大的影響或難以恢復的傷害。
腦損傷的發生是由於一個非常廣泛的條件下,如:疾病、傷害、或應為一廣泛的腦損傷醫源性疾病可能的原因,其包括出生缺氧、長時間缺氧(氧氣不足)、致畸胎物(teratogens)之毒害(包括酒精)、感染和神經疾病。化學治療可導致腦損傷對其神經幹細胞和和突膠質細胞,使其產生髓磷脂。造成局部病灶腦損傷的常見原因是物理創傷,例如:
創傷性腦損傷、中風、動脈瘤、手術、其他神經疾病,以及重金屬中毒包括汞和鉛及其化合物。腦損傷(BI)是腦細胞被破壞或退化,腦損傷係可分為非外力和外力因素所造成,絕大部分創傷性腦損傷(TBI)係從外部物理所造成之頭部損傷,而後天性腦損傷(ABI)係指由疾病或出生後因疾病產生造成的腦損傷。
中風,也被稱為腦血管意外(CVA),腦血管損傷(CVI),或腦中風,是指由於腦部供血受阻而使的腦細胞死亡。中風分為兩種類型:一種是由血栓或栓塞所造成的缺血(缺乏血液供應),稱為缺血性腦中風;一種是由出血所造成的,稱為出血性腦中風。約87%的中風是缺血性腦中風,其餘屬於出血性腦中風。有些腦內出血之病患會併發缺血性中風,此狀況被稱為“出血性轉化”,然目前尚無法釐清有多少出血性中風為缺血性中風所造成。中風導致大腦失去部分正常功能,其症狀包括肢體一側麻木偏癱、理解力喪失、講話困難、暈眩、或視野缺損等等,而這些急性症狀通常於短時間內可察覺,如果症狀持續不到一兩個小時,它被稱為一個短暫性腦缺血發作(TIA)。出血性中風也與造成劇烈頭痛有關。中風的症狀可能是永久性的,長期併發症可包括肺部疾病或喪失控制膀胱的能力。
中風之預後可以單獨或合併地影響人的生理、精神、情感層面。且依據中風病灶的大小和位置不同所造成的後遺
症具有很大差異,而其失能區對應到已被損壞的腦部區域。
中風所造成的生理失能包括肌肉無力、麻木、壓瘡(褥瘡)、肺炎、尿失禁、失用症(大腦認知障礙,無法執行先前所學過的技巧)、處理日常行為具有困難、食慾減退、言語喪失、視力減退和疼痛,如果中風嚴重的話或發生在特定的位置(如部分腦幹),將會導致昏迷或死亡。
腦出血是屬於顱內出血的一種亞型,其出血位置好發於腦組織。顱內出血(ICH)係由腦損傷引起的,或由自發性腦出血中風所導致。非創傷性顱內出血是一種腦部自發出血並進入腦組織,其發生與異常腦壓(如:張力或壓力)的增加有關。ICH佔所有中風入院治療的10-30%,並導致重大的殘疾、發病率和30-50%的6個月死亡率,其長期預後不佳,只有20%的患者於6個月後能重新恢復日常生活功能獨立。雖然目前對動脈瘤的蜘蛛網膜下腔出血和腦梗塞的治療已經有進展,但腦出血治療方式仍然有限。根據腦內出血的原因,腦出血可區分為原發性或繼發性。原發性腦出血是由慢性高血壓或澱粉樣變性血管病損壞小動脈或小動脈自發破裂發起,繼發性腦出血是由外傷、動脈瘤破裂、血管畸形、凝血功能障礙、或其他原因出血的結果。
腦缺血係指大腦中血流量無法滿足代謝需求,導致腦部供氧不足或腦缺氧,進而使腦組織死亡或腦梗塞/缺血性中風。它是伴隨蜘蛛網膜下腔出血和腦出血的中風亞型。腦缺
血改變腦的生理代謝,代謝率的降低和能量攝取不足。目前可分為兩種類型:局部性腦缺血(這僅限於腦的特定區域)和區域性腦缺血(其中涵蓋腦組織的大部分區域)。
缺血性中風是由於腦部供血不足,導致腦組織功能障礙及壞死,有四個原因可導致缺血性中風:(1)血栓(血塊自血管壁脫落形成栓子,阻塞血管)、(2)栓塞(身體其他部位形成之血塊,阻塞血管),(3)系統性供血不足(一般性系統性供血不足,如休克)和(4)靜脈血栓。
目前急性缺血性中風的治療主要採用靜脈血栓溶解劑(rt-PA)來治療。rt-PA於急性缺血性中風症狀出現後3小時內使用可改善10%之重殘程度,但無法改善死亡率;且愈早使用,治療效果愈好。然於症狀出現後3~4.5小時內使用rt-PA的療效尚不清楚。文獻指出使用rt-PA治療缺血性中風於3-6個月後改善5%重殘度,但增加2%死亡機率。且於症狀出現4.5小時後使用此血栓溶解劑,預後不佳。目前尚無可靠的方式可以評估rt-PA治療後是否造成顱內出血。美國心臟協會(AHA)和美國神經醫學會(AAN)建議應該在症狀出現後3小時內使用,並且沒有其他使用禁忌(如異常實驗室檢測值,高血壓或最近手術等)才有最佳的效果。臨床研究證實病人發病3個小時內使用rt-PA,可降低中風後殘障等級,但不改變缺血性中風死亡率。同時結果顯示,6.4%使用rt-PA的中風病人有引發大量腦出血併發症的可能,增加死亡率。
此外,美國急診醫學學會(AAEM)認為,對於rt-PA應用於急性缺血性中風的療效、安全性和適用性的客觀證據不足以將其列入治療標準。
中草藥方面已有文獻揭露含黃耆的中藥複方具有治療腦中風之功效,例如:補陽還五湯(含黃耆120克、當歸尾6克、赤芍5克、地龍3克、川芎3克、桃仁3克、以及紅花3克)。然而,未有文獻揭露中藥單方或其萃取物可有效治療腦中風。事實上,依據中草藥複方「君、臣、佐、使」的觀念,其複方中所含的中藥材並無法單獨對一病症有所治療效果,故含黃耆的中藥複方並無法直接說明單獨使用黃耆便能夠對腦中風有治療效果。
因此,臨床上仍極需一種安全、低副作用、無使用時間限制的治療藥物。
為解決上述問題,本發明透過新製程的製備方法,使含黃耆多醣萃取物有效的可用於腦損傷與腦中風預防、治療及預後之用途。而且還可以作為腦損傷後遺症的治療和增進病患的復原速度。
本發明提供一種用於製備治療腦損傷之黃耆萃取物的組合物之應用,其中該組合物包含一黃耆萃取物。本發明所萃取的黃耆萃取物總醣類含量為60%-120%,其主要構型為α-1,4醣苷鍵連接或α-1,6醣苷鍵連接,其中***糖連結於碳
端的C3和C5位置,葡聚糖連結於碳端的C4和C6位置,半乳糖連結於碳端的C3和C6位置,半乳糖醛酸連結於碳端的C4位置,以及鼠李糖連結於C2位置。
臨床上適用的範圍為腦損傷包含創傷性腦損傷和後天性腦損傷的預防、治療及預後。並且進一步可以應用於腦損傷後遺症的治療和增進病患的復原速度
在一實施例中,該黃耆萃取物的有效劑量為每日125mg~2000mg。
本發明提供一種用於製備治療腦中風之黃耆萃取物的組合物之應用,其中該組合物包含一黃耆萃取物。本發明所萃取的黃耆萃取物總糖類含量為60%-120%,其主要構型為α-1,4醣苷鍵連接或α-1,6醣苷鍵連接,其中***糖連結於碳端的C3和C5位置,葡聚糖連結於碳端的C4和C6位置,半乳糖連結於碳端的C3和C6位置,半乳糖醛酸連結於碳端的C4位置,以及鼠李糖連結於C2位置。
臨床上適用的範圍為腦中風包含缺血性腦中風或出血性腦中風的預防、治療及預後。並且進一步可以應用於腦中風後遺症的治療和增進病患的復原速度
在一實施例中,該黃耆萃取物的有效劑量為每日125mg~2000mg。
本發明提供一種黃耆萃取物的製備方法,包含:(1)將黃耆清洗乾淨後,將黃耆處理為飲片或粉末;(2)將該黃耆飲
片或粉末,置入80-100℃的溫度下的含水萃取溶劑2~3小時,取得一第一萃取溶液,將該第一萃取溶液再置入80-100℃的溫度下的含水萃取溶劑1.5~3小時,重複操作2次,取得一第二萃取溶液;(3)將該第二萃取溶液進行一濃縮步驟,將濃縮後的萃取液在低溫環境中加入乙醇或低鏈烷醇類進行一沉澱步驟取得一粗萃取物;以及(4)進行一純化步驟,將該粗萃取物再經由離心、過濾和/或離子交換層析法,進一步再通過超微過濾膜,取得黃耆萃取物。
第1圖為黃耆萃取物的NMR分析結果。
第2圖為腦中風病人使用格拉斯哥預後量表(GOS)評估,顯示使用黃耆萃取物治療與對照組的病人在中風後第84天有明顯的差異。
第3圖為腦中風病人使用mRS量表評估,顯示使用黃耆萃取物治療與對照組的病人在中風後第84天有明顯的差異。
第4圖為在OGD誘發神經毒性的條件下使用各種劑量黃耆萃取物治療來測試初代皮質細胞的乳酸脫氫酶(LDH)活性。
第5A圖和第5B圖為黃耆萃取物治療缺血性腦中風模式下的大鼠腦梗塞體積明顯縮小。
第5C圖為核磁共振成像之影像,顯示使用50mg/kg黃耆萃取物治療的缺血性腦中風模式下大鼠腦梗塞體積相較於對照組明
顯變小。
第5D圖和第5E圖為核磁共振成像之影像定量結果顯示使用50mg/kg黃耆萃取物治療的缺血性腦中風模式下大鼠腦梗塞體積和最大梗塞切片的面積相較於對照組顯著減少。
第6A圖為黃耆萃取物治療缺血性腦中風模式下大鼠身體擺動不平衡測試結果相較於對照組顯著減少。
第6B圖、第6C圖和第6D圖為黃耆萃取物治療缺血性腦中風模式下大鼠活動能力測試(如垂直活性,垂直移動,移動次數)結果相較於對照組顯著增加。
第6E圖為黃耆萃取物治療缺血性腦中風模式下大鼠前肢握力測試結果相較於對照組顯著增加。
實施例1:製備黃耆萃取物
黃耆萃取、分離和純化步驟分別如下,黃耆萃取最佳來源是來自於兩年生的黃耆根部,黃耆的品種可取自蒙古黃耆(A.membranaceus Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或莢膜黃耆(A.membranaceus(Fisch.)Bge)或黃耆生長於中華人民共和國之內蒙古或山西省
該黃耆萃取物一般是來自於滅菌處理飲片或切片的乾燥根,所述調配包括修剪乾燥根,以超濾(UF)水洗滌它們,並以消毒溶液清洗它們,如70%至75%的酒精,該根被切成薄片並在滅菌條件下產生乾燥“飲片”,在本文中也稱
為“清潔飲片”。
該萃取物包含多醣體係產自該潔淨飲片或微粉末,使用至少80-100℃的溫度下的含水萃取溶劑所分離出。該萃取溶劑可為水,且可選擇性地包括共萃取物,如鹼土金屬鹽或鹼金屬鹽類。該鹼金屬鹽類包括如氧化鈣、二氫磷酸鉀或二氫磷酸鈉,該共萃取物可為如緩衝液0.5M KH2PO4,pH為4.5。
該萃取溶劑係於特定溫度下施加至飲片上一段時間,以及萃取該根所需之多次萃取循環步驟,典型之流程包括三個萃取循環,在某些實施例中為將飲片或微粉末分離出萃取物需將萃取溶劑施加到飲片或微粉末的時間、溫度以及多次萃取循環,典型的流程包括三個萃取循環,每一循環持續大約1.5小時至3小時,並施加溫度約80-100℃之萃取溶液,在某些實施例中該飲片一開始係以熱鹽水溶液清洗,如0.5M KH2PO4,pH為4.5,溫度為約90度至100度,清洗約30分鐘,在某些實施例中,所有製備飲片或微粉末之步驟皆於滅菌狀態下進行,包括使用滅菌裝備與試劑。
然後將該萃取溶劑濃縮,且此流程能在真空下約60度至約70度的溫度下進行,使每1公斤的飲片或微粉末達到約0.8公升至1.1公升的濃度,該濃縮也可以用超微過濾法製備,如使用具100千道耳頓排除過濾器之超微過濾。
之後該濃縮溶液係使用低鏈烷醇類自該濃縮萃取溶劑中沈澱出,取得一沉澱產物。該低鏈烷醇類可為如乙醇。
在某些實施例中,該乙醇可加至該溶液中而成濃度約70%之乙醇,於室溫下產生沈澱。在某些實施例中,該沈澱物首先係使用較低濃度約35%至40%的乙醇於第一沉澱步驟中,之後使用較高濃度約65%至80%之乙醇於第二沉澱步驟中,用於沈澱步驟中之低鏈烷醇類濃度範圍可為20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%,或其中之任一濃度。
該醇類清洗步驟可重複以更進一步純化。例如該沈澱物可以更多低鏈烷醇類清洗,其中典型之清洗包括如以95%乙醇或99%乙醇清洗三次或四次,之後將該沈澱物懸浮於水中,其濃度適用於下一步處理,如約18%至20%重量/體積,可再次加入溶於水中之低鏈烷醇類沈澱,以移除非水溶性之其他材料,上清液可經較高濃度之低鏈烷醇沈澱出,該較高濃度之低鏈烷醇可為如40%至80%的乙醇,且在某些實施例中,60%至70%的乙醇,以產生包含***糖半乳聚糖蛋白質和相關之多糖粗萃取沈澱物。
該粗萃取物再次溶於水中並乾燥。適當之乾燥過程可包括此技術領域者所熟知之步驟,其可預防過度加熱,可包括如噴霧乾燥、真空乾燥、冷凍乾燥、臨界點乾燥、溶劑交換,以及類似方法。該粗萃取物亦可再溶於水或水性溶液中,其中該粗萃取物進行適當超微過濾來濃縮。在某些實施例中,該適當之超微過濾液濃度為約2%至5%,之後將該粗萃取
物經超微過濾,以進一步移除低分子量之物質和減少溶液體積,其中該超微過濾系統可具有5千至6千道耳頓分子量排除值。
在某些實施例中,該粗萃取物可為白色至灰白色粉末,或淡黃色粉末,並可溶於水中成至少約100毫克/毫升。在某些實施例中,該粉末為可溶於水中,至少約200毫克/毫升。該粉末顯示出乾燥時重量損失小於約15%,具有內毒素含量小於約0.5EU/mg,以及在某些實施例中,具有內毒素含量小於約0.3EU/mg。
該粗萃取物可經大孔吸附層析法或離子交換層析法更進一步純化,該組成物再溶於水溶液中,並進行適當之超微過濾濃縮,一般濃度為約0.5%至2%。再溶解之組成物之後進行超微過濾,以進一步移除低分子量之物質和降低溶液體積,可使用上述之5千道耳頓分子量移除超微過濾系統,超微過濾之滯留物係經陽離子交換管柱沖提,如SP Sepharose陽離子交換管柱,平衡於20mM醋酸鈉緩衝液,pH 5.20中,該陽離子交換管柱之沖提物再經陰離子交換管柱沖提,如Q Sepharose陰離子交換管柱,平衡於相同之醋酸鈉緩衝液中。
該陰離子交換管柱之沖提物可是(1)直接使用於其他形式萃取物之製備中;(2)經濃縮並乾燥,以形成粗萃取物,可做為製備純化萃取物之中間物;(3)直接用於純化萃取物的製備。
其純化步驟,係將該粗萃取物經微過濾,使用適當之除菌過濾器,如0.1微米過濾器,以去除溶液中之鹽類和再次減少其體積,在某些實施例中可使用8千道耳頓分子量移除超微過濾。超微過濾中之滯留液為濃縮液,百分比濃度可使用折射計測量,在某些實施例中,該滯留液係濃縮至濃度約20%至26%在50度至60度。該經濃縮滯留液之後經低鏈烷醇類沈澱。在某些實施例中,該低鏈烷醇類可為乙醇,其加入至濃度為約80%至90%,沈澱物可經更進一步清洗,其中該典型之清洗包括以無水乙醇清洗沈澱物三次,之後將該沈澱物乾燥,得到經純化的萃取物。在某些實施例中,該沈澱物之乾燥可使用如真空烘箱或噴霧乾燥法,溫度為約60度至70度。
實施例2:使用核磁共振光譜測定被純化的萃取物
使用核磁共振光譜儀(NMR)來測定被純化萃取物的組成。1H NMR光譜係使用光譜儀記錄的探測的溫度,樣品使用99.9atom%D2O以中間凍乾交換兩次,最後溶解於D2O之中。1H的化學位移以內部參照組丙酮為基準且以ppm表示,並使用1D300-MHz的1H NMR光譜記錄。甲基化分析也用於醣苷鍵。於此過程之中,分子可以被完全O-甲基化。該產品可以通過連續水解被轉化為得到的部分O-甲基化的單位,這是使用NaBH4來還原,接著經乙醯化以提供部分O-甲基化的單位,這是在GC-MS,具有典型的保留時間及電子衝擊光譜,此多糖萃取物從連續的純化步驟包括L-鼠李糖,L-***糖,D-
葡萄糖和D-半乳糖與主鏈為1,6-和1,2,6-吡喃半乳糖基和1,5-和1,3,5-***呋喃糖基,以及次要鏈為1,4-和1,4,6-吡喃葡萄糖基和1,2-和1,2,4-鼠李吡喃糖基顯示出與下述的體內/體外神經保護相關的生物學功能。(圖1)
顯然該黃耆萃取物是一具有複雜的多醣異構結構所組成,使用系統地來分析黃耆萃取物,可以得出結論,在樣品中有兩種類型的多醣:一種α-1,4-鍵結和一種α-1,6-鍵結的形式,由1H NMR光譜測定(α-1,4:α-1,6)的碳水化合物部分的相對組成為4:1至8:1。
實施例3:中風量表的臨床說明和使用
1.格拉斯哥預後量表(GOS):格拉斯哥預後量表被開發來廣泛定義因頭部外傷或非外傷性腦損傷造成的嚴重腦損傷結果分類,此量表反映了殘疾和障礙,而不是損傷,也就是說,它的重點是在損傷如何影響到正常生活的主要領域,而不是傷害造成特定缺陷和症狀,它不適合在提供關於個別病人的困難的詳細狀況,主要是提供整體結果的一般指標,該格拉斯哥預後量表是一項5等評級(死亡,植物人,重度殘疾,中度殘疾,和恢復良好)
2.雷氏修正量表(mRS):雷氏修正量表是一種常用的量表來評估腦中風或神經殘疾患者等原因造成的日常生活活動依賴狀況,它已成為最廣泛使用在中風臨床試驗的臨床測量結果。
3.巴氏量表(BI):巴氏量表是一種日常生活功能評估量表,每個項目被評為該級別分配給每個級或等級給定的分數,採用10個評估變項說明日常生活功能和移動力。評估分數越高,表示出院後於家裡的生活獨立性程度高。各項目之給分是依據該項目活動障礙需要多少時間、物理協助而定。
4.功能獨立量表(FIM):功能獨立量表(FIM)是一個評估工具,目的是在中風,腦外傷,脊髓損傷或癌症整個康復過程評估患者的功能狀態。它的使用範圍包括嚴重,亞急性和康復護理的技術護理機構和醫院。它作為一個用於比較連續健康照護康復成果一致性的數據收集工具。
實施例4:使用黃耆萃取物治療出血性中風患者的有利臨床結果
1.實驗設計
該試驗納入經臨床診斷為急性出血性腦出血病人,包含男性和女性患者,平均年齡42-70歲,總共有47名患者(實驗組22例,對照組25例)。
每一組除了常規治療,治療方式如下:1)對照組接受安慰劑(生理鹽水溶液);2)實驗組接受黃耆萃取物,從住院第二天起每週三次,連續2週。
實驗組使用本發明的黃耆萃取物的組合物(包含22例),對照組使用生理鹽水溶液(包含25例)。
比較於實驗組和對照組其中風後格拉斯哥預後量表
(GOS)分數(4-5)(4-5:中度殘疾至恢復良好(後遺症程度低者);0-3:死亡至嚴重殘疾)的人數比例。結果顯示使用本發明組成物治療組於中風後3個月期間,不論是治療期間(中風後第7天)或治療後(中風後第28及84天)的GOS分數(4-5)的人數比例皆高於安慰劑對照組(如圖2所示),於中風後84天觀察,差異達30%,且隨時間增加人數比例的幅度較安慰劑對照組更趨明顯,顯示本發明組成物具可治療腦中風後遺症,加速病患復原之療效(如圖2所示),在第84天的功能結果測量,安慰劑對照組的GOS分數(4-5)人數比例為56%,而實驗組的GOS分數(4-5)人數比例為86.4%。
2.改良雷氏修正量表(mRS)測試
比較於實驗組和對照組其中風後發生mRS分數(0-2)(0-2:無殘疾至輕度殘疾(後遺症程度低者);3-5:中度至嚴重殘疾)的人數比例。結果顯示使用本發明組成物治療組的mRS分數(0-2)的人數比例皆高於安慰劑對照組(如圖3所示),中風後第84天觀察的mRS分數(0-2)的人數比例高於安慰劑治療組,差異達26%,顯示本發明組成物具可治療腦中風後遺症,加速病患復原之療效如圖3所示,在中風後第84天,安慰劑組的mRS分數(0-2)人數比例為56%,而治療組的mRS分數(0-2)人數比例為81.8%。
3.腫瘤壞死因子(TNF)量測
實驗組使用本發明的黃耆萃取物的組合物(包含22
例),對照組使用生理鹽水溶液(包含25患者)。相對於ICH發生的第一天,治療組的腫瘤壞死因子(TNF)在第7天和第14天數值顯著比安慰劑組降低,TNF在中風進展扮演一關鍵角色,在本研究中,結果表明本發明的黃耆萃取物可治腦中風的後遺症,提高患者的恢復(表1)。
4.腫瘤壞死因子(TNF)和中風預後指數(GOS and mRS)的相關性
根據該實驗結果,腫瘤壞死因子(TNF)數值和GOS評分值的分析呈負相關,但TNF數值和mRS分數為直接相關(表2)。人們已經知道了在急性中風患者血漿中腫瘤壞死因子(TNF)提升,這些結果表明,本發明的黃耆萃取物可以治療腦中風的後遺症,並增加患者的恢復。
表2. 腫瘤壞死因子(TNF)和中風預後指數(GOS and mRS)的關係
實施例5
1.黃耆萃取物治療腦部缺血性中風的體外模型
在體外的初代皮質細胞(Primary cortical cells,PCC)治療模型中,初代皮質細胞是從懷孕第17天的Sprague-Dawley
大鼠胚胎的大腦皮層所製備,如先前描述修正。分離後四天,使用MEM培養基(MEM,GIBCO-BRL)再加入0.5g/L的牛血清白蛋白、2%B27補充劑、0.5mM的丙酮酸和抗生素於MEM培養基中。最後,該培養基在第七天被改為無牛血清的Neurobasal培養基,此培養基包含有1mM丙酮酸、1mM的谷氨酸、0.5g/L的牛血清白蛋白和2%B27添加劑和抗生素。針對缺氧缺糖模型(OGD)治療,細胞培養在無葡萄糖的Earle’s balanced鹽溶液,並培養於37℃低氧室中6-8小時(Bug Box,Ruskinn Technology),培養環境持續提供95%N2和5%CO2並保持氣相中的氧分壓小於1毫米汞柱(使用OM-14的氧監測系統,SensorMedics公司)。在同一期間對照組細胞培養在無葡萄糖的Earle’s balanced鹽溶液,並在含氧量正常的培養箱做培養。
2.乳酸脫氫酶(LDH)的測試方法
為了證明本發明黃耆萃取物具有神經保護能力,先將初代皮質細胞先培養在24孔盤,並且預先加入各種濃度的黃耆萃取物(濃度分別為0.1μM、1μM和10μM),黃耆萃取物預處理的20分鐘後,初代皮質細胞經受OGD在低氧室中培養6-8小時,然後如所述的培養基中收集乳酸脫氫酶(LDH)活性測定(J Neurosci Methods 1987;20:83-90).
評估黃耆萃取物在體外的神經保護作用結果,在OGD誘發神經毒性的條件下使用各種劑量黃耆萃取物進行治療(0.1μM,1μM和10μM),測試初代皮質細胞的乳酸脫氫酶
(LDH)活性(如圖4所示)。結果顯示10μM的黃耆萃取物治療組相較於對照組顯著降低乳酸脫氫酶(LDH)活性。(如第4圖所示)。
3.黃耆萃取物治療腦缺血中風的腦缺血動物模型
體內腦缺血動物模型測試步驟如下,使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠(體重250-300克),將大鼠先用水合氯醛(0.4克/公斤,IP)麻醉,並進行結紮右大腦中動脈(MCA)和夾緊雙側頸總動脈(CCA)如期刊所述(Stroke 1986;17:738-743),以及使用非創傷性動脈修剪來夾緊雙側頸總動脈(CCA)。使用一顯微鏡手術,在觀骨融合鱗骨之處鑽探一2×2公厘的開顱手術,然後將右大腦中動脈(MCA)用10-0尼龍縫線結紮,使用激光多普勒流量計(PF-5010,Periflux system,Perimed AB,Stockholm,Sweden)連續測量被麻醉動物的大腦皮層血流量。
光電檢測器的探針(直徑0.45毫米)立體定位放置在通過顱骨鑽的孔洞(直徑1毫米)在額頂葉皮質(1.3毫米後部,2.8毫米外側到前囟門,和硬腦膜以下1.0毫米)。然後,再使用26號注射器***實驗大鼠右股靜脈注射,右大腦中動脈(MCA)結紮30分鐘後,將實驗大鼠靜脈注射不同濃度黃耆萃取物(在生理食鹽水中1、10、25和50毫克/公斤的濃度)或僅模擬操作無治療連續三天。在局部缺血中風90分鐘後,移除右大腦中動脈(MCA)的10-0縫合線和在雙側頸總動脈
(CCA)的動脈夾以允許再灌注。在麻醉恢復期間進一步使用熱燈來維持37℃的體溫。
4.神經行為的測量
在腦缺血之前3天和之後72小時進行評估,該測試測量身體不對稱性和活動能力如前所述(Stroke 2003;34:558-564),進一步用握力計(TSE-Systems)來分析抓握力量,如先前描述修正(NeurosciLett 1998;246:1-4)。改善抓握力量比例的量測,是先單獨的對於每個前肢做測試,再計算每個同側的和對側的拉力相對於腦缺血的一邊,平均大於20拉力的比例。此外,治療後及基底值的抓握力量的比例及相對於基底值變化的百分比也會被計算。
5.氯化三苯基(TTC)染色
腦缺血手術後三天,將動物進行心內灌注生理食鹽水,再移除腦部組織,將其浸入冷生理鹽水5分鐘,並切成2毫米厚的切片(每隻大鼠7片),將腦部切片培養在20克/升的TTC(Research Organics Inc),溶解在食鹽水中設定溫度為37度進行30分鐘,然後再放至5%的甲醛溶液來固定腦部切片,使用電子顯微鏡測定每個切片的梗塞面積,如先前期刊所描述方法(J Neurosci 1997;17:4341-4348)。切片體積的大小數據量測方法,先將腦部組織進行切片,平均的切片厚度為2毫米再量測各切片的梗塞面積。為了減少人為因素的誤判,梗塞的面積的計算方式也使用先前所述的方法(Stroke
1993;24:117-121)。為了測量右大腦皮層的梗塞面積,我們從左半球的總大腦皮質面積減去在右大腦皮質的非梗塞區域。
6.使用磁共振成像(MRI)來測量腦梗塞體積
磁共振成像(MRI)使用3.0 T的美國通用電氣的影像系統(GE,R4).大鼠掃描的腦組織約6至8張冠狀圖像切片,每個切片為連續式的2毫米切片,取得T2-weighted imaging(T2WI)脈衝序列與使用自旋回波技術(spin-echo technique)(重複時間:4000毫秒;回波時間:105毫秒),取得每隻動物在腦缺血後14天被拍攝記錄。為了測量在右大腦皮質的腦梗塞面積,我們在從大腦左半球的總皮質區域中減去右大腦皮質非梗塞面積,腦梗塞的面積被人工繪製從切片到切片,然後體積透過內部體積分析軟件(Voxtool,General Electric)來計算。
參考所有在說明書中的實施例,所有結果顯示改良製程後生產出的黃耆萃取物效果大於一般生產製備的黃耆萃取物
根據此機制,我們提出了外源性的黃耆萃取物可當作治療方法促進中風後的功能恢復。為選擇黃耆萃取物的最有效的治療劑量,使用氯化三苯基(TTC)染色檢測分別經1、10、25和50毫克/公斤的黃耆萃取物處理的大鼠來測定腦缺血梗塞。在腦缺血後3天,給予50毫克/公斤黃耆萃取物的大鼠腦梗塞體積遠遠小於在其他劑量組(圖5A~圖5B)。在腦缺血後7
天,使用核磁共振成像來評估腦梗塞體積和最大梗塞切片的面積,50毫克/公斤的黃耆萃取物治療大鼠與對照組的大鼠相比是顯著減少,(圖5C~圖5E)。接著評估黃耆萃取物治療組或生理食鹽水處理的對照組之神經功能缺損的恢復,包含身體不對稱、活動能力測試及握力測量,黃耆萃取物治療的大鼠表現在身體擺動測試比生理食鹽水處理的對照組更好的恢復能力(圖6A),在大鼠腦缺血後接受黃耆萃取物與對照組相比,前者運動活動能力是大大改善(圖6B~圖6D),此外,比較腦缺血前及缺血後28天前肢握力結果顯示黃耆萃取物的治療組比對照組有一個更好的握力(圖6E)。
雖然本發明已經在具體的示例性實施方案和例子進行了說明,但是應該理解的是,本文所揭露的實施例僅用於說明的目的,可由本領域技術人員在不脫離本發明的精神和範圍如在下面權利進行各種變形和變更。
最重要的是發現黃耆萃取物在動物和人體的研究能有效地減少腦損傷和提高功能效果,綜上所述,本發明所製造的黃耆萃取物是一種極好的候選藥物來預防和治療腦損傷。
Claims (13)
- 一種用於製備治療腦損傷之黃耆萃取物的組合物之應用,其中該組合物包含一黃耆萃取物。
- 如申請專利範圍第1項之應用,其中該黃耆萃取物包含:總醣類含量為60%-120%,其主要構型為α-1,4醣苷鍵連接或α-1,6醣苷鍵連接;***糖連結於碳端的C3和C5位置;葡聚糖連結於碳端的C4和C6位置;半乳糖連結於碳端的C3和C6位置;半乳糖醛酸連結於碳端的C4位置;以及鼠李糖連結於C2位置。
- 如申請專利範圍第1項之應用,其中該腦損傷包含外傷性腦損傷和後天性腦損傷。
- 如申請專利範圍第1項之應用,其中應用的範圍包含預防、治療及預後。
- 如申請專利範圍第1項之應用,其中該黃耆萃取物的有效劑量為每日125mg~2000mg。
- 如申請專利範圍第1項之應用,其中該黃耆萃取物的應用包含腦損傷後遺症的治療和增進病患的復原。
- 一種用於製備治療腦中風之黃耆萃取物的組合物之應用,其中該組合物包含一黃耆萃取物和藥物可接受之載體、賦形劑或鹽。
- 如申請專利範圍第7項之應用,其中該黃耆萃取物包含:總醣類含量為60%-120%,其主要構型為α-1,4糖苷鍵連接或α-1,6糖苷鍵連接;***糖連結於碳端的C3和C5位置;葡聚糖連結於碳端的C4和C6位置;半乳糖連結於碳端的C3和C6位置;半乳糖醛酸連結於碳端的C4位置;以及 鼠李糖連結於C2位置。
- 如申請專利範圍第7項之應用,其中該腦中風包含缺血性腦中風或出血性腦中風。
- 如申請專利範圍第7項之應用,其中應用的範圍包含預防、治療及預後。
- 如申請專利範圍第7項之應用,其中該黃耆萃取物的有效劑量為每日125mg~2000mg。
- 如申請專利範圍第7項之應用,其中該黃耆萃取物的應用包含腦中風後遺症的治療和增進病患的復原。
- 一種黃耆萃取物的製備方法,(1)將黃耆清洗乾淨後,將黃耆處理為飲片或粉末;(2)將該黃耆飲片或粉末,置入80-100℃的溫度下的含水萃取溶劑2~3小時,取得一第一萃取溶液,將該第一萃取溶液再置入80-100℃的溫度下的含水萃取溶劑1.5~3小時,重複操作2次,取得一第二萃取溶液;(3)將該第二萃取溶液進行一濃縮步驟,將濃縮後的萃取液在低溫環境中加入乙醇或低鏈烷醇類進行一沉澱步驟取得一粗萃取物;以及(4)進行一純化步驟,將該粗萃取物再經由離心、過濾和/或離子交換層析法,進一步再通過超微過濾膜,取得黃耆萃取物。
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