TW201431880A - 抗切口３（ａｎｔｉ－ｎｏｔｃｈ３）抗體及抗體－藥物共軛體 - Google Patents

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Kenneth G Geles
Yijie Gao
Puja Sapra
Lioudmila Gennadievna Tchistiakova
Bin-Bing Stephen Zhou
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Abstract

本發明提供抗切口3(anti-Notch 3)抗體、抗切口3抗體-藥物共軛體及用於製備及使用該相同物之方法。

Description

抗切口3(anti-notch3)抗體及抗體-藥物共軛體 相關申請案
本申請案主張於2012年11月7日提出之美國臨時申請案第61/723,772號及2013年10月11日提出之美國臨時申請案第61/889,744號之權益，各案以參照方式整體納入此處。
序列表
本申請案係經EFS-Web以電子方式提出，包括以.txt格式之電子形式檢送之序列表。該.txt檔案包含標題為PC071980A_Sequence_Listing.txt之序列表，建立日期2013年10月11日，檔案大小61KB。此.txt檔中包含之序列表係本說明書之一部分，以參照方式整體納入此處。
本發明關於抗切口3抗體及抗切口3抗體-藥物共軛體。本發明另關於使用該抗體及抗體-藥物共軛體於治療癌之方法。
切口傳訊係由細胞外受體與配體交互作用所引發。切口受體經由傳訊級聯控制多細胞生物體內之正常細胞增生、分化及死亡，該傳訊級聯係由受配體誘發之蛋白水解所引發。在弗林樣(furin-like)蛋白酶切割位點S1之後，成熟之切口異二聚體被轉位至細胞膜中，在該處該異二聚體藉由由三個Lin12/切口重複(LNR-A、B、C)與異二聚化(HD)結構域所組成之近膜負調節區(NRR)保持在自我抑制狀態。該HD結構域在位點S1切割之後被分成N端半段(HD1)及C端半段(HD2)。經由不確定之機轉，Delta/Serrate/Lag-2(DSL)家族之配體與細胞外EGF重複區之結合解除此抑制作用，另外誘發二個切割事件。首先，ADAM型金屬蛋白酶媒介靠近HD-2結構域之C端區域的位點S2之切割，藉以自細胞表面釋放細胞外結構域(ECD)，該ECD接著經反式內吞作用(trans-endocytosis)進入該配體表現細胞中。接著，γ分泌酶媒介在跨膜結構域內之位點S3的切割，自該膜釋放切口之細胞內結構域(切口-ICD)，允許切口-ICD轉位至細胞核，活化目標基因之轉錄(Bray,S.,Nature Reviews Molecular Cell Biology,2006,volume7,678-689)。
呈自我抑制構形之人切口2-NRR結構域的X光晶體結構顯示，NRR內之LNR重複與異二聚體結構域之間廣泛的交互作用隱藏該金屬蛋白酶S2位點，表示必須有顯著構形改變才能在配體活化時暴露出該位點(Gordon, W.R.,et.al,Nature Structural & Molecular Biology,2007,volume 14,295-300)。研究顯示穩定NRR內之交互作用可能防止配體誘發之切***化。切口自我抑制構形之結構資訊的可用性提供新治療劑的發展機會，特別是以切口傳訊為目標之抗體。(Li,K.,et.al,Journal of Biological Chemistry,2008,volume 283,8046-8054；Aste-Amezaga,M,et.al,PLOS ONE,2010,volume 5,e9094；Wu,Y.,et.al,Nature,2010,volume 464,1052-1057；)。
在哺乳動物細胞中，有四種已知之切口受體。切口1、切口2、切口3及切口4在胚胎及成體組織中具有廣泛、重疊之表現模式，並在造血幹細胞特化、T細胞發育、腸隱窩細胞特化及血管發育期間扮演非冗餘角色。切口3主要表現於血管平滑肌細胞(vSMC)、各種胸腺細胞亞群及發育中之神經系統。與其有限制的組織分布一致，靶向性刪除鼠切口3不會像切口1及切口2刪除導致胚胎死亡。相反地，切口3基因剔除鼠可以存活，但vSMC的成熟及分化有缺陷(Domenga,V.,et.al,Genes and Development,2004,volume 18,2730-2735)。
在許多情況中，切***化與致癌性有關；所有四種切口同系物的持續活化、細胞內形式在試管內及基因轉殖鼠模型中具有致癌基因之功能。最近的研究顯示，切口3在多種人實質腫瘤中通常被擴增及過度表現，而且人癌症之發展傳訊途徑如切口3之過度表現，顯示它們也是腫瘤發生之關鍵媒介子。目前有許多阻斷切口傳訊之策略被發展 以用於癌之治療目的；然而本領域仍需更強力、有效之抗切口靶向性治療以治療癌。
抗體-藥物共軛體(ADC)結合高親和性抗體之專一性及靶向性與治療劑之細胞毒性，如細胞毒性劑、生物反應調節劑、酶、細胞凋亡誘發劑及放射性同位素。欲使治療劑自抗體釋放，需要運送及定位該抗體-藥物共軛體至溶酶體，且切口3-ECD及切口3-ICD皆需被溶酶體降解，因此預期與切口3結合之抗體將移動至溶酶體(Jia L,et.al,International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2009,volume 41,2594-2598)。本發明提供新穎的抗切口3抗體及抗體-藥物共軛體，以符合在癌症治療的診斷及治療用途上未被符合之臨床需求。
發明概要
本發明提供抗切口3抗體及抗體-藥物共軛體(ADC)。本發明亦提供使用該抗切口3抗體及抗體-藥物共軛體於治療癌之方法。
在一實施態樣中，本發明提供與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其具有SEQ ID NO：13之CDR1、CDR2及CDR3及具有SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區。
在另一實施態樣中，本發明提供與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片 段：(a)經內化至細胞中，(b)不抑制切口3傳訊，或(c)不活化切口3傳訊。在另一實施態樣中，本發明提供與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段：(a)與切口3負調節區(NRR)之LNR-C及HD-1結構域結合，(b)不維持該切口3 NRR之自我抑制構形，或(c)不抑制S2切割。
在另一實施態樣中，本發明提供與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其具有：(a)包含SEQ ID NO：15或16之重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：19或20之重鏈CDR2；(c)包含SEQ ID NO：23之重鏈CDR3；(d)包含SEQ ID NO：27之輕鏈CDR1；(e)包含SEQ ID NO：29之輕鏈CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：31之輕鏈CDR3。
本發明亦提供與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：13具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列或與SEQ ID NO：25具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。
本發明亦提供與具有SEQ ID NO：13之重鏈可變區胺基酸序列之切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段及與具有SEQ ID NO：25之輕鏈可變區胺基酸序列之切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段。本發明亦提供具有與SEQ ID NO：33之重鏈胺基酸序列之切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段及與具有SEQ ID NO：35之輕鏈胺基酸序列之切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段。
在另一實施態樣中，本發明提供與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其具有包含SEQ ID NO：37之CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：49之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區。
在另一實施態樣中，本發明提供與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其具有：(a)包含SEQ ID NO：39或40之重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：43或44之重鏈CDR2；(c)包含SEQ ID NO：47之重鏈CDR3；(d)包含SEQ ID NO：51之輕鏈CDR1；(e)包含SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：55之輕鏈CDR3。
本發明亦提供與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：37具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列或與SEQ ID NO：49具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。
本發明亦提供與具有SEQ ID NO：37之重鏈可變區胺基酸序列之切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段及與具有SEQ ID NO：49之輕鏈可變區胺基酸序列之切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段。本發明亦提供與具有SEQ ID NO：57之重鏈胺基酸序列之切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段及與具有SEQ ID NO：59之輕鏈胺基酸序列之切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段。
本發明另提供與本發明之抗體或彼之抗原結合片段競爭與切口3之專一性結合之經分離之抗體。
本發明另提供抗體-藥物共軛體，其具有與本發明之任何抗體或彼之抗原結合片段共軛之細胞毒性劑。
在另一實施態樣中，本發明提供下式之抗體-藥物共軛體：Ab-(L-D)p，或彼之醫藥上可接受之鹽，其中：Ab係與切口3結合之抗體或彼之抗原結合片段；L-D係連接子-藥物基團，其中L係連接子，D係藥物；且p為1至約12之整數。
在另一實施態樣中，本發明提供下式之抗體-藥物共軛體：Ab-(L-D)p，或彼之醫藥上可接受之鹽，其中：Ab係本發明之任何抗體或彼之抗原結合片段；L-D係連接子-藥物基團，其中L係連接子，D係藥物；且p為1至約12之整數。
在另一實施態樣中，本發明提供抗體-藥物共軛體，其中L係選自vc、mc、me或MalPeg6C2。
在另一實施態樣中，本發明提供抗體-藥物共軛體，其中D係選自：(a)0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)，(b)6780(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)，(c)0131(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- 羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽)，(d)3377(N,2-二甲基丙胺醯基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧基丁基}-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽)，及(e)8261(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)。
本發明另提供抗體-藥物共軛體，其中L-D係選自：具有下式之vc0101： 及具有下式之vc6780：
在另一實施態樣中，本發明提供抗體-藥物共軛體， 其中Ab包含：(a)具有SEQ ID NO：13之CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區及(b)具有SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區。
本發明另提供抗體-藥物共軛體，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO：15之重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：19之重鏈CDR2；(c)包含SEQ ID NO：23之重鏈CDR3；(d)包含SEQ ID NO：27之輕鏈CDR1；(e)包含SEQ ID NO：29之輕鏈CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：31之輕鏈CDR3。
在另一實施態樣中，本發明提供抗體-藥物共軛體，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO：37之CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區；及(b)包含SEQ ID NO：49之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區。
本發明另提供抗體-藥物共軛體，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO：39之重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：43之重鏈CDR2；(c)包含SEQ ID NO：47之重鏈CDR3；(d)包含SEQ ID NO：51之輕鏈CDR1；(e)包含SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：55之輕鏈CDR3。
本發明另提供抗體-藥物共軛體，其中Ab包含選自下列之經建構之人IgG1重鏈恆定結構域(Cy)多肽：(a)如SEQ ID NO：61所示在位置L443具有一個胺基酸取代及(b)如SEQ ID NO：65所示在位置L443及K392具有二個胺基酸取代，該位置編號跟據卡巴(Kabat)之EU指數。
本發明另提供抗體-藥物共軛體，其中Ab包含經建構之人κ輕鏈恆定結構域(CK)多肽，其如SEQ ID NO：63 所示在位置κK183具有一個胺基酸取代，該位置編號跟據卡巴(Kabat)之EU指數。
本發明另提供一種醫藥組成物，其具有本發明之任何抗體或彼之抗原結合片段或本發明之任何抗體-藥物共軛體及醫藥上可接受之載劑。
另外，本發明提供一種於需要治療之病患治療與切口3表現有關之症狀之方法，該方法包含對該病患投予本發明之任何抗體-藥物共軛體或醫藥組成物。本發明亦提供治療癌之方法，其中該癌係實質腫瘤之癌。另外，本發明提供治療實質腫瘤之癌之方法，該癌包括但不限於肺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸癌、膀胱癌、肝癌、皮膚癌及肉瘤。本發明亦提供治療癌之方法，其中該癌係包括但不限於T細胞惡性病、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴胚細胞性白血病、多發性骨髓瘤、B細胞惡性病、骨髓性惡性病、急性骨髓性白血病及慢性骨髓性白血病之血癌。
本發明提供用於治療之本發明之任何抗體-藥物共軛體或醫藥組成物。本發明另提供治療用途，其中該癌係實質腫瘤之癌。本發明亦提供治療用途，其中該實質腫瘤之癌包括但不限於肺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸癌、膀胱癌、肝癌、皮膚癌及肉瘤。本發明亦提供治療用途，其中該癌係包括但不限於T細胞惡性病、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴胚細胞性白血病、多發性骨髓瘤、B細胞惡性病、骨髓性惡性 病、急性骨髓性白血病及慢性骨髓性白血病之血癌。本發明另提供本發明之任何抗體-藥物共軛體於製造供治療的藥物之用途。本發明另提供本發明之任何抗體-藥物共軛體之用途，其中該用途係供治療切口3表現性癌。
本發明另提供編碼本發明之切口3抗體或彼之抗原結合片段之核酸、包含該核酸之載體及包含該載體之宿主細胞。本發明亦提供一種用於產製本發明之切口3抗體之方法，其中該方法包含培養包含該上述之載體之宿主細胞及自該細胞培養回收該抗體。
在另一實施態樣中，本發明提供一種用於產製本發明之抗體-藥物共軛體之方法，該方法包含：連接L與D；使該L-D與自本發明之培養所回收之抗體共軛；及純化該抗體-藥物共軛體。
本發明另提供抗體-藥物共軛體，該抗體-藥物共軛體具有與切口3專一性結合之本發明之抗體或彼之抗原結合片段。
在另一實施態樣中，本發明提供一種用於預測罹癌個體是否對本發明之任何抗體-藥物共軛體有反應之方法，該方法藉由測定來自該個體之生物樣本是否表現切口3。
本發明另提供一種測定生物樣本中之切口3的量之方法，該方法包含下列步驟：使來自疑似罹癌之個體的樣本與本發明之任何抗體或彼之抗原結合片段接觸；測定該樣本中之細胞表面的切口3之量；及比較該細胞表面的切口3之量與參考個體或標準物之該量。
本發明之詳細說明
本發明提供用於治療癌之抗切口3抗體或彼之抗原結合片段及抗體-藥物共軛體(ADC)。為了更清楚地瞭解本發明，首先定義一些用語及常規技術。
本揭示內容中使用之所有胺基酸縮寫係該些於37 C.F.R.§ 1.822(d)(1)闡述之美國專利商標局接受之縮寫。
除非此處另外加以定義，關於本發明所使用之科學性及技術性用語應具有該領域之一般技藝人士所通常了解之意義。另外，除非內文另外要求，單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。一般來說，與此處所描述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、基因學以及蛋白質及核酸化學和雜交有關所使用之命名法及技術係該領域所廣為週知且經常使用者。
本發明之方法及技術通常根據該領域所廣為周知之習用方法進行，除非另外說明否則如同本說明書各處引述及討論之各種一般性及更具體之參考文獻所述。見例如Sambrook J.& Russell D.Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；and Coligan et al.,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John & Sons,Inc.(2003)。
「切口3」或「切口-3」係指人切口3蛋白之天然體、變異體、異構體及種同源體。舉例來說，天然人切口3蛋白係由前導肽、大型表皮生長因子(EGF)樣重複區、三個Lin12重複、N端異二聚結構域(HD-1)、C端異二聚結構域(HD-2)、跨膜(TM)序列及細胞內結構域(切口3ICD)組成。全長人切口3之NCBI/GenBank編號係NM_000435.2。
此處所使用之「切口3負調節區」或「切口3 NRR」除非另外說明，係指由三個Lin12結構域及位於該三個Lin12結構域之間的胺基酸序列，加上切口3之HD1及HD2結構域所組成之切口3的任何天然或合成之多肽區。在一實施態樣中，「切口3 NRR」包括三個Lin12結構域及二個異二聚體結構域HD-1及HD-2，其中切口3之HD-1及HD-2結構域係經共價鍵結且尚未經弗林樣蛋白酶切割(在S1切割之前)。在另一實施態樣中，「切口3 NRR」包括三個Lin12結構域及二個異二聚體結構域HD-1及HD-2，其中HD-1及HD-2結構域係非共價鍵結(在S1切割之後)。在此實施態樣之一態樣中，在HD-2結構域內之S2位點尚未被ADAM型之金屬蛋白酶切割。在此實施態樣之另一特定態樣中，在HD-2結構域內之S2位點係經或已被ADAM型之金屬蛋白酶切割。(Gordon, W.R.,et.al,Nature Structural & Molecular Biology,2007,volume 14,295-300)。
「抗體」或「Ab」係免疫球蛋白分子，其可透過位於該免疫球蛋白分子之可變區的至少一個抗原辨認區專一性地與目標(諸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等)結合。此處所使用之用語「抗體」不僅包含完整之多株或單株抗體，但亦包含維持與給定抗原(例如切口3)專一性結合之能力的完整抗體之任何抗原結合部分(例如「抗原結合片段」)或彼等之單鏈、包含抗體之融合蛋白、及包含抗原辨認區之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之構型，包括例如但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd片段、Fv片段、單結構域抗體(dAb)片段、經分離之互補決定區(CDR)、單鏈(scFv)及單結構域抗體(例如鯊魚及駱駝抗體)、大型抗體(maxibodies)、迷你抗體(minibodies)、細胞內抗體(intrabodies)、雙價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及bis-scFv(見例如Hollinger and Hudson,2005,Nature Biotechnology 23(9)：1126-1136)。抗體包括任何類型之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或彼等之亞型)，且該抗體不需要是任何特定類型。根據免疫球蛋白之重鏈的恆定區之抗體胺基酸序列，其可被分成不同類型。有五種主要的免疫球蛋白類型：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中某些類型可進一步分成亞型(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應不同類型之免疫球蛋白的重鏈(HC)恆定區 分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型之免疫球蛋白的次單位結構及三維構型係廣為週知。
「經分離之抗體」係指實質上不含其他具有不同抗原專一性之抗體的抗體(例如與切口3專一性結合之經分離之抗體實質上不含與切口3以外之抗原專一性結合之抗體)。然而，與切口3專一性結合之經分離之抗體可能具有對其他抗原(諸如其他物種之切口3分子)之交叉反應性。另外，經分離之抗體可能實質上不含其他細胞材料及/或化學物。
抗體之「可變區」係指抗體輕鏈(VL)之可變區或抗體重鏈(VH)之可變區(不論單獨或組合指稱)。如該領域所知，重鏈及輕鏈之可變區各由四個架構區(FR)及連接彼等之又稱超變異區之三個互補決定區(CDR1、CDR2、CDR3)組成，以形成該抗體之抗原結合部位。若主體可變區之變異體係為所欲，特別是具有CDR區以外(即架構區)之胺基酸殘基取代，適當之胺基酸取代(較佳地保守性胺基酸取代)可藉由比較該主體可變區與其他包含和該主體可變區相同之典範類型(canonical class)的CDR1及CDR2序列之抗體的可變區加以識別(Chothia and Lesk,J Mol Biol 196(4)：901-917,1987)。當選擇FR以於旁側連接主體CDR時，例如當人化或最佳化抗體時，源自包含該相同典範類型之CDR1及CDR2序列的抗體之FR係較佳。
可變結構域之「CDR」係位於可變區內之胺基酸殘 基，其界定係根據卡巴(Kabat)定義、柯西亞(Chothia)定義、卡巴及柯西亞之累積定義、AbM定義、接觸定義及/或構形定義，或該領域廣為周知之任何CDR界定方法。抗體CDR可能被界定為原本由卡巴等人所定義之超變異區。見例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C.。CDR之位置亦可能被界定為最先由柯西亞等人所描述之結構性圈環結構。見例如Chothia et al.,1989,Nature 342：877-883。其他界定CDR之方法包括「AbM定義」，其係卡巴法及柯西亞法之折衷，源自利用牛津分子(Oxford Molecular)之AbM抗體模型軟體(現為Accelrys®)，或如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262：732-745所述以觀察到之抗原接觸為基礎之CDR的「接觸定義」。在此處稱為CDR之「構形定義」之另一方法中，CDR之位置可能被界定為對抗原結合造成焓貢獻之殘基。見例如Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。其他CDR邊界定義可能仍不嚴格遵守上述方法中之一者，但將與至少部分之卡巴CDR重疊，不過它們可能根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗結果被縮短或延長。此處所使用之CDR可能指由該領域已知之任何方法(包括多種方法之組合)所定義之CDR。此處所使用之方法可利用根據這些方法中任一者所定義之CDR。以包含超過一種CDR之任何給定實施態樣而言， 該CDR可根據卡巴、柯西亞、延長、AbM、接觸及/或構形定義中任一者加以定義。
用語「IgG Fc區」、「Fc區」、「Fc結構域」及「Fc」在此處可交換使用，係指IgG分子之可藉由木瓜酶消化IgG分子所獲得之可結晶片段之部分。該Fc區係由IgG分子之二條重鏈的C端半組成，該等C端半由雙硫鍵連接。其不具抗原結合活性，但包含碳水化合物基團及補體及Fc受體包括FcRn受體之結合位點(見下)。該Fc片段包含完整的第二恆定結構域CH2(人IgG1之殘基231至340，根據卡巴系統)及第三恆定結構域CH3(殘基341至447)。
此處之用語「經建構之Fc多肽」、「經建構之Fc區」及「經建構之Fc」可交換使用，係指包含至少一個突變(例如胺基酸取代)以導入供共軛之位點之Fc多肽或彼之部分。較佳地，該突變導入半胱胺酸以取代該位置天然發生之胺基酸殘基，該突變在該處產生反應性位點(例如反應性氫硫基)以供基團與該Fc共軛。
用語「單株抗體」或「mAb」係指源自單一細胞或細胞株之抗體，包括例如任何真核、原核或噬菌體株，並不是指彼之產製方法。較佳地，本發明之單株抗體存在於均質或實質上均質之族群。
「人化」抗體係指非人(例如大鼠)抗體之形式，其為包含源自非人免疫球蛋白之最少序列之嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或彼等之片段(諸如Fv、Fab、Fab’、 F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列)。較佳地，人化抗體係其中源自接受者之互補決定區(CDR)的殘基被源自諸如具有該所欲特異性、親和性及能力之小鼠、大鼠或兔等非人物種(捐贈者抗體)之CDR的殘基所取代之人免疫球蛋白(接受者抗體)。
「人抗體或全人抗體」係指該些源自帶有人抗體基因之基因轉殖小鼠或源自人細胞之抗體。
用語「嵌合抗體」係用來指其中該可變區序列係源自一物種且該恆定區序列係源自另一物種之抗體，諸如其中該可變區序列係源自大鼠抗體且該恆定區序列係源自人抗體之抗體。
「治療劑」係指對癌細胞或活化免疫細胞具有細胞毒性、細胞靜止及/或免疫調節效應之劑。治療劑之實例包括細胞毒性劑、化學治療劑、細胞靜止劑及免疫調節劑。
「化學治療劑」係可用於治療癌之化學化合物。
「細胞毒性效應」係指除盡、消除及/或殺死標靶細胞。「細胞毒性劑」係指對細胞具有細胞毒性及/或細胞靜止效應之劑。
「細胞靜止效應」係指抑制細胞增生。「細胞靜止劑」係指對細胞具有細胞靜止效應之劑，藉以抑制特定細胞亞群之生長及/或擴張。
「抗體-藥物共軛體」或「ADC」係指與切口3結合且與細胞毒性劑、細胞靜止劑及/或治療劑共軛之抗體或彼之抗體片段包括抗體衍生物。
「抗切口3抗體-藥物共軛體」或「抗切口3 ADC」係指如此處所述之與藥物(D)經由連接子(L)連接之抗切口3抗體或彼之抗原結合片段。
「連接子(L)」描述該抗體與該藥物間之直接或間接鍵結。將連接子連接至抗體可經由許多方式達成，諸如經由表面離胺酸、還原偶合至經氧化之碳水化合物、及經由還原鏈間雙硫鍵所釋放之半胱胺酸殘基。多種抗體-藥物共軛體鍵接系統係該領域所知，包括以腙、雙硫及肽為基底之鍵接。
「藥物(D)」係具有生物活性或可偵測之活性之任何物質(例如治療劑、可偵測之標記、結合劑等)及在活體內被代謝成活性劑之前藥。用語藥物、載荷藥物及化合物可互相交換使用。
「L-D」係由藥物(D)與連接子(L)連接所導致之連接子-藥物部分。
用語「表位」係指能被抗體之一或多個抗原結合區所辨認及結合之分子的部位。表位通常由分子之化學活性表面基團組成，諸如胺基酸或糖側鏈，且具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。此處使用之用語「抗原性表位」係定義為可被抗體專一性結合之多肽的部分，該結合藉由該領域廣為周知之任何方法(例如習用之免疫測定法)測定。「非線性表位」或「構型表位」包含對該表位具專一性之抗體所結合之抗原性蛋白內之不連續多肽(或胺基酸)。一旦決定在抗原上之所欲表位，即可使用例如此處 所述之技術，針對該表位產製抗體。在發現過程中，抗體之產製及特徵化可闡釋有關所欲表位之資訊。有此資訊即有可能競爭性地篩選與該相同表位結合之抗體。一種達到此目的之方法係進行競爭及交叉競爭試驗以找到彼此競爭或交叉競爭之抗體，例如競爭與抗原結合之抗體。
此處所使用之用語「結合親和性(KD)」係意圖指稱特定抗原-抗體交互作用之解離速率。KD係解離速率(或稱為off-rate(kd))對結合速率(或on-rate(ka))之比。因此，KD等於kd/ka，並以莫耳濃度(M)表示。由此可知當KD越小時，該結合之親和性越強。因此，KD等於1μM表示相較於KD等於1nM具有微弱之結合親和性。抗體之KD值可利用該領域完整建立之方法測定。一種用於測定抗體之KD之方法係藉由利用表面電漿共振，通常使用諸如Biacore®系統之生物感測器系統。
與標靶(例如切口3蛋白)「優先結合」或「專一性結合」(在此處可互換使用)之抗體、抗體共軛物或多肽係該領域理解清楚之用語，測定該等專一性或優先結合之方法亦為該領域所廣為周知。若分子與特定細胞或物質之交互反應或相連相較於與其他細胞或物質之交互反應或相連係更頻繁、更快速、更長時間及/或更高親和性，該分子被稱為展現「專一性結合」或「優先結合」。若抗體與標靶之結合相較於與其他物質之結合具有更高親和性、親合力(avidity)、更快速及/或更長時間，則該抗體與標靶「專一性結合」或「優先結合」。舉例來說，與切口3表 位專一性或優先地結合之抗體係指相較於彼與其他切口3表位或非切口3表位結合時以更高之親和性、親合力、更快速及/或更長時間地與此表位結合之抗體。藉由閱讀此定義亦可了解，舉例來說，與第一標靶專一性或優先結合之抗體(或部分或表位)可能與第二標靶或不與第二標靶專一性或優先結合。因此，「專一性結合」或「優先結合」不一定需要(雖然可包括)排他性結合。一般來說(但不必然)，所謂的結合係指優先結合。「EC50」為結合能力之測量值，係定義為要產生介於基準值與最大值之間一半的反應所需之抗體或抗體-藥物共軛體之半數最高有效濃度。
此處所使用之「醫藥上可接受之鹽」係指分子或巨分子之醫藥上可接受之有機或無機鹽。
用語「效力」係生物活性之測量值，可以IC50表示，或分別如實施例9及12所描述之抑制50%之切口3依賴性報告基因活性或切口3陽性細胞系生長所需之抗切口3抗原之抗體或抗體-藥物共軛體之抑制濃度。
此處使用之用語「有效量」或「治療有效量」係指達到所欲治療結果所需之量(劑量及所需時間期間及投予裝置)。有效量係活性劑之至少最小量，但小於有毒量，該量為授予個體治療效益所需。
此處提及本發明之抗體的生活性所使用之用語「抑制」或「中和」係指該抗體實質上拮抗、抑制、預防、克制、延緩、擾亂、消除、停止、減少或逆轉例如該被抑制 者包括但不限於生物活性之進展或嚴重性之能力。
此處關於抗體所使用之用語「競爭」係指第一抗體或彼之抗原結合片段與表位結合之方式充份類似於第二抗體或彼之抗原結合片段之結合，使得第一抗體與彼之同源表位在第二抗體存在時之結合結果相較於第二抗體不存在時第一抗體之結合可偵測地降低。或者，該情況可為但不一定是該第二抗體與彼之表位之結合亦因第一抗體之存在而可偵測地降低。也就是說，第一抗體可抑制第二抗體與彼之表位之結合，但第二抗體不抑制該第一抗體與彼之個別表位之結合。然而，當各種抗體不論以相同、較高或較低程度可偵測地抑制另一抗體與彼之同源表位或配體結合時，該等抗體被稱為彼此「交叉競爭」與彼等個別表位之結合。本發明包含競爭抗體及交叉競爭抗體。不論該競爭或交叉競爭所藉以發生之機轉為何(例如空間位阻、構形變化或與共同表位或彼之片段結合)，技藝人士將了解根據此處所提供之揭示，本發明包含競爭及/或交叉競爭抗體且彼等可被用於此處所揭示之方法。
此處所使用之用語「多核苷酸」或「核酸分子」係意圖包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股，但較佳係雙股DNA。
編碼本發明之抗體之多核苷酸可能包括下列：僅該變異體之編碼序列、該變異體之編碼序列及額外之編碼序列諸如功能性多肽或信號或分泌性序列或原蛋白質序列、該抗體之編碼序列及非編碼序列諸如該抗體之編碼序列的內 含子或5’及/或3’非編碼序列。用語「編碼抗體之多核苷酸」包含包括額外之變異體的編碼序列之多核苷酸，但亦包含包括額外之編碼及/或非編碼序列之多核苷酸。該領域已知的是，對於特定宿主細胞/表現系統而言，最佳化之多核苷酸序列可輕易地得自該所欲蛋白質之胺基酸序列(見GENEART AG，德國雷根斯堡(Regensburg,Germany))。
「宿主細胞」包括可以或已經接受載體以導入多核苷酸***物之個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之後代，且該後代可能因為天然、意外或蓄意突變而不一定與原始親代細胞完全相同(在形態學或基因學DNA互補性上)。宿主細胞包括經本發明之多核苷酸在活體內轉染之細胞。
用語「載體」係指建構物，其能在宿主細胞中遞送及較佳地表現一或多種感興趣之基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒性載體、裸DNA或RNA表現載體、質體載體、黏質體載體、噬菌體載體、與陽離子縮合劑有關之DNA或RNA表現載體、包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞諸如生產細胞。
用語「表現控制序列」係引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子或增強子。表現控制序列係可操作地與所欲轉錄之核酸序列連接。
編碼本發明之抗體之多核苷酸通常將包括與該抗體編 碼序列可操作性連接之表現控制多核苷酸序列，包括該領域已知之天然相關性或異源性啟動子區域。較佳地，該表現控制序列將為能轉形或轉染真核宿主細胞之載體中的真核啟動子系統，但用於原核宿主之控制序列亦可被使用。一旦該載體被納入適當宿主細胞系之後，該宿主細胞在適合表現該核苷酸序列之條件下增殖，及如所欲之收集及純化該抗體。較佳之真核細胞系包括CHO細胞系、各種COS細胞系、海拉(HeLa)細胞、骨髓瘤細胞系、經轉形之B細胞、或人胚胎腎細胞系。最佳之宿主細胞係CHO細胞系。
抗體
本發明之抗體可利用該領域廣為周知之技術製備，例如重組技術、噬菌體展示技術、合成技術或該等技術之組合、或該領域已知之其他技術(見例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45：1628-50(1999)及Fe11ouse,F.A.,et al,J.MoI.Biol.,373(4)：924-40(2007))。
本發明之一實施態樣係一種抗體，該抗體與包含與SEQ ID NO：13具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之第一胺基酸序列及與SEQ ID NO：25具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之第二胺基酸序列之抗體所結合之相同的切口3表位專一性結合。
本發明之另一實施態樣係一種抗體，該抗體與包含與 SEQ ID NO：37具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之第一胺基酸序列及與SEQ ID NO：49具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之第二胺基酸序列之抗體所結合之相同的切口3表位專一性結合。
在一些實施態樣中，該抗體或彼之抗原結合片段與切口3專一性結合，且該抗體或彼之抗原結合片段與包含與SEQ ID NO：13具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之第一胺基酸序列及與SEQ ID NO：25具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之第二胺基酸序列之抗體競爭該結合。
在一些實施態樣中，該抗體或彼之抗原結合片段與切口3專一性結合，且該抗體或彼之抗原結合片段與包含與SEQ ID NO：37具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之第一胺基酸序列及與SEQ ID NO：49具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之第二胺基酸序列之抗體競爭該結合。
藥物與抗體之共軛
該藥物已經或係經修飾以包括與該抗體上之共軛點具反應性之基團。舉例來說，藥物可藉由烷化(例如該抗體之ε-胺基離胺酸或N端)、經氧化之碳水化合物的還原胺化、羥基與羧基之間的轉酯化、醯胺化胺基或羧基及與硫醇共軛加以連接。在一些實施態樣中，與每個抗體分子 共軛之藥物的數目p介於1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2之平均值。在一些實施態樣中，p介於2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、或2至3之平均值。在其他實施態樣中，p係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12之平均值。在一些實施態樣中，p介於約1至約12、約1至約11、約1至約10、約1至約9、約1至約8、約1至約7、約1至約6、約1至約5、約1至約4、約1至約3或約1至約2之平均值。在一些實施態樣中，p介於約2至約12、約2至約11、約2至約10、約2至約9、約2至約8、約2至約7、約2至約6、約2至約5、約2至約4或約2至約3。以可被用於共軛之化學為例，見例如Current Protocols in Protein Science(John Wiley & Sons,Inc.),Chapter 15(Chemical Modifications of Proteins)。
連接子
連接子係可被用於連接藥物及抗體以形成抗體藥物共軛體(ADC)之雙功能性化合物。該等共軛體可被用於例如形成針對腫瘤相關抗原之免疫共軛物。該等共軛體允許選擇性遞送細胞毒性藥物至腫瘤細胞。適當之連接子包括例如可切割及不可切割之連接子。可切割之連接子在細胞內之條件下通常易受切割。適當之可切割性連接子包括例如可被細胞內蛋白酶(諸如溶酶體蛋白酶或核內體蛋白酶) 切割之肽連接子。在示範性實施態樣中，該連接子可為雙肽連接子，諸如纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、***酸-離胺酸(phe-lys)連接子或順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-p-胺基苯甲氧基羰基(vc)連接子。另一連接子係磺基琥珀醯亞胺基-4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯(smcc)。磺基-smcc共軛經由順丁烯二醯亞胺基發生，該順丁烯二醯亞胺基與氫硫基(硫醇基，-SH)反應，同時彼之磺基-NHS酯係對一級胺有反應性(如在離胺酸及該蛋白質或肽N端中可見)。還有另一種連接子係順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。其他適當之連接子包括可在特定pH或pH範圍內被水解之連接子，諸如腙連接子。其他適當之可切割性連接子包括二硫化物連接子。該連接子可與該抗體共價連接，該共價連接之程度使得該抗體必須在細胞內被降解才能讓該藥物被釋放，例如mc連接子及該類似物。
本發明之連接子包括順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-p-胺基苯甲氧基羰基(vc)、順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)、me及MalPeg6C2。
經建構之Fc多肽
先前有報告指出，若干假定存在於抗體之重鏈的CH2或CH3結構域之表面上的殘基，或在該輕鏈之恆定結構域之上的殘基，或可以其他方式接近之殘基，適合用於以例如半胱胺酸取代天然發生之野生型胺基酸，因此可用於 建構能與各種劑共軛之位點，如國際專利號WO/2013/093809(其以參照方式納入本文)所述。
胺基酸修飾可藉由該領域已知之任何方法進行，許多該等方法為該領域之技藝人士所廣為周知及例行。例如(但無限制之意)，胺基酸取代、刪除及***可利用任何廣為周知之PCR基底技術完成。胺基酸取代可藉由定點突變作用進行(見例如Zoller and Smith,1982,Nucl.Acids Res.10：6487-6500；and Kunkel,1985,Proc.Natl.Acad.Sci USA 82：488)。
在一些實施態樣中，所揭示之該經建構之Fc多肽可被用於製備抗體或彼之抗原結合片段，以使得該抗體或其片段藉以包含該可被用於共軛之經建構之Fc區，其中該經建構之殘基(相較於野生型未經修飾之Fc為經取代之胺基酸)與廣泛種類之基團共軛。
在一些實施態樣中，所揭示之該經建構之κ輕鏈恆定多肽可被用於製備抗體或彼之抗原結合片段，以使得該抗體或其片段藉以包含可被用於共軛之包含胺基酸突變之經建構之CL區或其片段，其中該經建構之胺基酸殘基與廣泛種類之基團共軛。
應注意的是，在Fc多肽中之單一取代，例如半胱胺酸殘基，通常導致該形成之IgG抗體中展示二個對應殘基，這是因為IgG抗體分子之同型二聚體性質。因此，本發明所形成之經建構之IgG抗體可能展示至少1、2、3、4或更多個可供與藥物或化合物共軛之用的反應基。在一 實施態樣中，一或多個取代係半胱胺酸殘基之取代，所形成之經建構之抗體可能展示至少1、2、3、4或更多個可供與藥物或化合物共軛之用的硫醇基。
在一些實施態樣中，本發明之經建構之Fc多肽包含一或多個選自抗體之重鏈的位置443及392之取代，且其中恆定區之編號系統係如Kabat et al.(同上)所述之EU指數。
在一些實施態樣中，該經建構之Fc多肽包含如SEQ ID NO：61所提供之一個胺基酸取代(L443C)。在另一實施態樣中，該經建構之Fc多肽包含如SEQ ID NO：65所提供之二個胺基酸取代(L443C/K392C)。
經建構之Cκ多肽
本發明之抗切口3抗體可包含經建構之抗體輕鏈恆定區(LC)或其片段，其中該輕鏈恆定區之編號系統係如Kabat et al.(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)(以下簡稱「卡巴」)所述之卡巴編號系統，其中母代、天然或野生型抗體之抗體輕鏈的1、2或3個胺基酸係經另一胺基酸取代(包括天然及非天然/合成胺基酸)。
在其他實施態樣中，由於許多抗體之二聚體特性(例如IgG包含二條輕鏈及二條重鏈，各重鏈包含一Fc多肽)，本發明之抗體可包含至少一個經建構之Fc多肽，且可另包含至少一個經建構之輕鏈恆定多肽，藉以提供至 少二個定點共軛位點(一個在Fc多肽，另一個在CL多肽)。
在一些實施態樣中，本發明之該經建構之Cκ多肽在該抗體之輕鏈的位置183包含至少一個取代。在一些實施態樣中，該經建構之Cκ多肽包含如SEQ ID NO：63所提供之一個胺基酸取代(κK183C)。
癌治療
癌(包括但不限於腫瘤、轉移或其他以不受控制之細胞生長為特徵之疾病或病狀)可藉由投予本發明之抗體或彼之抗原結合片段或抗體-藥物共軛體(ADC)加以治療或預防。
例示性抗切口3抗體或彼之抗原結合片段及抗體-藥物共軛體可用於治療其中切口3相較於參考個體或標準物(例如非癌性或正常組織)係經表現或過度表現之癌。根據本文所述之方法，切口3表現癌之治療或預防可藉由對需要該治療之個體投予有效量之抗切口3抗體或彼之抗原結合片段及/或抗體-藥物共軛體達成。在一些實施態樣中，與細胞毒性劑共軛之抗切口3全長抗體或彼之抗原結合片段將被投予。在一些例示性實施態樣中，本發明之抗切口3抗體-藥物共軛體將(i)與切口3表現癌細胞結合，及(ii)展現細胞毒性或細胞靜止效果，以例如抑制該切口3表現癌細胞之增生，或殺滅切口3表現癌細胞。
在其他實施態樣中，該抗切口3抗體或彼之抗原結合 片段，及/或抗切口3抗體-藥物共軛體係與另一治療劑共投，或與另一治療劑依序投予。在一些實施態樣中，該抗切口3抗體或彼之抗原結合片段，及/或抗切口3抗體-藥物共軛體係與化學治療劑共投或依序投予，該化學治療劑包括照護標準化學治療劑。
在一些實施態樣中，該其他治療劑將為所欲治療之特定疾病的標準照護劑，或為所欲治療之特定疾病的救援療法之一部分。抗癌劑及化學治療療法包括例如抗癌抗體，包括例如抗CD52抗體(例如阿來組單抗(Alemtuzumab))、抗CD20抗體(例如利妥昔單抗(Rituximab))及抗CD40抗體(例如SGN40)；化學治療療法包括例如CHOP(環磷醯胺(cyclophosphamide)、多柔比星(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)及強體松(prednisone))；CVP(環磷醯胺、長春新鹼及強體松)；RCVP(利妥昔單抗+CVP)；RCHOP(利妥昔單抗+CHOP)；RICE(利妥昔單抗+異環磷醯胺(ifosamide)、卡鉑(carboplatin)、依扥泊苷(etoposide))；RDHAP(利妥昔單抗+***(dexamethasone)、阿糖胞苷(cytarabine)、順鉑(cisplatin))；RESHAP(利妥昔單抗+依扥泊苷、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)、阿糖胞苷、順鉑)；吉西他濱(gemcitabine)；長春新鹼、強體松與蒽環類(anthracycline)之組合療法，不論有無天冬醯胺酶；正定黴素(daunorubicin)、長春新鹼、強體松與天冬醯胺酶之組合療法；替尼泊苷(teniposide)與Ara-C(阿糖胞苷)之組 合療法；甲胺喋呤(methotrexate)與菊白葉酸之組合療法；博來黴素(bleomycin)、多柔比星、依扥泊苷、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、強體松、長春鹼(vinblastine)與長春新鹼之組合療法；小分子抑制劑；及蛋白體抑制劑包括例如硼替佐米(bortezomib)。
在一些實施態樣中，治療癌之方法包括對需要治療之病患投予有效量之抗切口3抗體或彼之抗原結合片段，及/或抗切口3抗體-藥物共軛體與放射治療及可任選地另一治療劑之組合。在一些實施態樣中，該抗切口3抗體或彼之抗原結合片段及/或抗切口3抗體-藥物共軛體係與抗癌劑(例如化學治療劑)及/或放射治療共同或依序投予。在一些實施態樣中，該化學治療劑或放射治療係於投予本發明之化合物之前或之後至少1小時、5小時、12小時、1天、1周、1月、數月(例如最長3個月)投予。
通常，在投予抗切口3抗體及/或抗切口3抗體-藥物共軛體時，初始候選劑量可為約2mg/kg。就本發明之目的而言，典型之每日劑量可根據上述因子介於自約3微克/公斤至30微克/公斤、至300微克/公斤、至3毫克/公斤、至30毫克/公斤、至100毫克/公斤或至100毫克/公斤以上之任何範圍內。舉例來說，可使用約1毫克/公斤、約2.5毫克/公斤、約5毫克/公斤、約10毫克/公斤及約25毫克/公斤之劑量。視狀況而在數天或更久期間內重複投予時，該治療係持續進行直到發生所欲之症狀抑制或達成足夠之治療量，例如抑制或延緩腫瘤生長/惡化或 癌細胞轉移。示範性給藥方案包含投予初始劑量約2毫克/公斤之抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛物，隨後投予每週約1毫克/公斤之維持劑量或隔週約1毫克/公斤之維持劑量。其他示範性給藥方案包含投予漸增之劑量(例如初始劑量1mg/kg，逐漸增加至每周或更長期間給予一或多個更高之劑量)。其他給藥方案亦可根據醫師所希望達成之藥物動力學衰減模式使用。舉例來說，在一些實施態樣中，每週投藥一至四次係經考慮。在其他實施態樣中，每月投藥一次或隔月或每三個月投藥一次係經考慮，也考慮每周、每二周及每三周投藥一次。此治療之進展可藉由習知技術及檢測加以輕易地監測。該給藥方案(包括所使用之抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體)可隨時間而異。
就本發明之目的而言，該抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體之適當劑量將依所採用之抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體(或彼等之組成物)、所欲治療之症狀的類型及嚴重性、該劑是否以治療性目的投予、先前治療、該病患之臨床病史及對該劑之反應、該病患清除該經投予之劑之速率及主治醫師之考量而定。醫師可能持續投予抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體直到達到可達成且超越所欲結果之劑量。劑量及/或頻率可依療程而異，但也可能維持固定。經驗性考量諸如半衰期通常將影響該劑量之決定。舉例來說，可相容於人免疫系統之抗體諸如人化抗體或全人抗體可被用以延長該抗體之半 衰期及防止該抗體被宿主之免疫系統攻擊。投予頻率可在療程當中決定及調整，通常但不一定根據症狀之治療及/或抑制及/或改善及/或延緩，例如腫瘤生長之抑制或延緩等。或者，抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體之持續性連續釋放調製劑可為適當。各種用於達成持續釋放之調製劑及裝置係該領域所知。
在一實施態樣中，在已經接受過一或多次抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體投予之個體中，該抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體之劑量可能憑經驗決定。個體係經給予漸增劑量之抗切口3抗體或切口3拮抗劑。為了評估療效可追蹤疾病之指標。
根據本發明之方法投予抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體可為連續性或間歇性，依例如接受者之生理狀況、該投藥之目的係治療性或預防性及該領域之技藝人士所知之其他因素而定。抗切口3抗體或抗切口3抗體-共軛體之投予可為實質上連續一段預先決定之時間，或可為一系列間隔劑量。
在一些實施態樣中，可能存在超過一種抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體。可能存在至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同或更多種抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體。通常，該等抗切口3抗體或抗切口3抗體-藥物共軛體可能具有不會互相不良影響之互補活性。例如，下列抗切口3抗體之一或多者可能被使用：針對切口3上之一表位的第一抗切口3抗 體及針對切口3上之不同表位的第二抗切口3抗體。
本發明之抗切口3抗體或彼之抗原結合片段及/或抗切口3抗體-藥物共軛體可為供投予之醫藥組成物之形式，其係經調製成適用於經選擇之投予模式，及醫藥上可接受之稀釋劑或賦形劑，諸如緩衝劑、界面活性劑、保存劑、助溶劑、等滲劑、穩定劑、載劑及該類似物。Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton Pa.,18th ed.,1995提供該領域通常熟知之調製技術的概要。
這些醫藥組成物可藉由該領域已知之可達成治療癌之一般性目的之任何方法投予。在一實施態樣中，該投予途徑係非經腸，在此處定義為包括但不限於靜脈內、肌肉內、腹腔內、皮下及關節內注射及輸注之投予模式。經投予之劑量將視接受者之年齡、健康及體重、併用治療之種類(若有的話)、治療頻率、及所欲效應之性質而定。
在本發明之範圍內的組成物包括其中抗切口3抗體或彼之抗原結合片段及/或抗切口3抗體-藥物共軛體係以能有效達成治療癌之所欲醫學效應的量存在之所有組成物。雖然個體需求可能因每位病患而異，決定該等所有成份之有效量的理想範圍係具有一般技藝之臨床醫師之能力範圍之內。
診斷
本發明之抗體或彼之抗原結合片段亦可被用於在活體 外或活體內檢測生物檢體之切口3。在一實施態樣中，本發明之抗切口3抗體或彼之抗原結合片段係用於測定組織或源自該組織的細胞中之切口3的量。在一實施態樣中，該組織係生病組織。在一些實施態樣中，該組織係腫瘤或彼之活體樣本。在一實施態樣中，病患組織或活體樣本中之切口3的量可於使用本發明之抗體或彼之抗原結合片段的免疫測試中測定。該組織或彼之活體樣本可自病患切除，且可經冷凍或固定。相同方法可被用於測定切口3蛋白之其他性質，例如彼之細胞表面表現量或細胞定位。
上述方法可被用於診斷已知或疑似罹癌個體之癌，其中在病患測得之切口3之量係與參考個體或標準物之該量比較。該方法接著可被用於測定腫瘤是否表現切口3，表現切口3表示該腫瘤可能對本發明之抗體-藥物共軛體之治療反應良好。在本發明之一實施態樣中，腫瘤係表現切口3之實質腫瘤癌，包括但不限於肺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸癌、膀胱癌、肝癌、皮膚癌及肉瘤，或表現切口3之血癌包括但不限於T細胞惡性病(T-cell malignancies)、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴胚細胞性白血病、多發性骨髓瘤、B細胞惡性病(B-cell malignancies)、骨髓性惡性並(myeloid malignancies)、急性骨髓性白血病及慢性骨髓性白血病，以及尚未測定其中是否主要表現切口3之其他癌。
本發明之一實施態樣為一種治療切口3表現癌之方法，該方法包含測定生物樣本中之切口3的量，該測定包 含下列步驟：使得自疑似罹癌之個體的樣本與抗切口3抗體或彼之抗原結合片段接觸；測定該樣本中之細胞表面的切口3之量；比較該細胞表面的切口3之量與參考個體或標準物之該量；及對該個體投予本發明之抗體-藥物共軛體。該方法可任意選擇地包含自疑似罹癌之個體取得樣本之步驟。
本發明之另一實施態樣為一種治療切口3表現癌之方法，該方法包含測定生物樣本中之切口3的量，該測定包含下列步驟：使得自疑似罹癌之個體的樣本進行原位雜交(ISH)；測定該樣本中切口3 mRNA之量；比較該切口3 mRNA之量與參考個體或標準物之該量；及對該個體投予本發明之抗體-藥物共軛體。該方法可任意選擇地包含自疑似罹癌之個體取得樣本之步驟。
本發明另提供經進一步標記以用於研究或診斷應用之單株抗體、人化抗體及彼之表位結合片段。在一些實施態樣中，該標記係放射性標記、螢光團、發色團、顯影劑或金屬離子。
本發明亦提供一種診斷方法，其中該經標記之抗體或彼之表位結合片段係經投予至疑似罹癌之個體，且該標記於該個體體內之分布係經測量或監測。
套組
本發明亦包括套組，例如包含所述之細胞毒性共軛體及使用該細胞毒性共軛體殺滅特定細胞類型之說明。該說 明可能包括於試管內、活體內或活體外使用該細胞毒性共軛體之指示。通常，套組將具有包含該細胞毒性共軛體之隔室。該細胞毒性共軛體可能呈冷凍乾燥形式、液體形式或可被修正以包含於套組中之其他形式。該套組亦可能包含實施該套組之說明中所述之方法所需之額外元件，如用於重構冷凍乾燥粉末之滅菌溶液、用於在投予至病患之前與該細胞毒性共軛體組合之其他劑，及協助投予該共軛體至病患之工具。
所有以上或下列實施例中引證之發表文獻及專利文件現以參照方式整體納入以符合所有目的，如同它們被各別納入。
本發明將參考下列實施例進一步說明，然而應了解本發明並不限於該等實施例。
下列實施本發明之特定態樣的實施例僅作為示範之用，無意在任何方面限制本發明之範圍。
圖1顯示具有Avi及His標籤之重組、經S1切割、異二聚體之切口3 NRR蛋白質免疫原之示意圖。
圖2顯示經純化之人及小鼠切口3 NRR重組蛋白之胺基酸及核苷酸序列。
圖3顯示r28及r75抗體可變區之胺基酸及核苷酸序列(CDR畫底線)。
圖4A至4C顯示[A]hu28 VH 1.0及CDR(卡巴及柯 西亞)、[B]hu28 VL 1.0及CDR(卡巴及柯西亞)和[C]hu28 HC 1.0及LC 1.0之胺基酸及核苷酸序列。
圖5A至5C顯示[A]hu75 VH 1.9及CDR(卡巴及柯西亞)、[B]hu75 VL 1.3及CDR(卡巴及柯西亞)和[C]hu75 HC 1.9及LC 1.3之胺基酸及核苷酸序列。
圖6顯示用於表位定位抗切口3抗體ch28及ch75之重組人切口1 NRR及切口3 NRR結構域交換嵌合性建構體。
圖7顯示利用D11B8抗體進行切口3陽性及陰性細胞系之西方墨點分析。
圖8A至8E顯示[A]在0小時MDA-MB-468乳癌細胞中抗切口3抗體hu75-Alexa 488之細胞膜定位及pHrodoTM紅色葡聚糖標示之酸性囊胞，[B]在5小時MDA-MB-468乳癌細胞中抗切口3抗體hu75-Alexa 488之細胞內運輸及與pHrodoTM紅色葡聚糖共位(箭頭)，[C]在0小時MDA-MB-468乳癌細胞中抗切口3抗體hu28-DyLight650之細胞膜定位及pHrodoTM紅色葡聚糖標示之酸性囊胞(細胞內斑點)，[D]在8小時MDA-MB-468乳癌細胞中抗切口3抗體hu28-DyLight650之細胞內運輸及與pHrodoTM紅色葡聚糖共位(箭頭)，及[E]皮爾森(Pearson)相關係數顯示hu28-DyLight650與pHrodoTM紅色葡聚糖螢光標記於MDA-MB-468細胞中隨時間變化之重疊或共位程度。
圖9顯示使用經抗切口3hu28及hu75處理之 HCC2429及MDA-MB-468細胞的S2切割試驗之西方墨點分析。M.W.=分子量。
圖10顯示抗切口3 hu28-vc0101處理OVCAR3卵巢癌細胞擾亂有絲***細胞中之微管(以抗α-微管蛋白抗體染色)，該有絲***細胞係以磷酸化組蛋白H3抗體染色識別。
圖11顯示自2至3隻小鼠(M)收集之異種移植的切口3-ECD之西方墨點分析。
圖12顯示劑量為3mg/kg之抗切口3 hu28-vc0101及hu75-vc0101與劑量為5mg/kg之順鉑(cisplatin)於37622A1 NSCLC病患衍生性異種移植模型中之療效比較。
圖13A及13B顯示[A]抗切口3 hu28-vc0101於MDA-MB-468乳癌模型之療效，以及[B]抗切口3 hu75-vc0101於MDA-MB-468乳癌模型之療效。
圖14A及14B顯示[A]抗切口3 hu28-vc6780於MDA-MB-468乳癌模型之療效，以及[B]抗切口3 hu75-vc6780於MDA-MB-468乳癌模型之療效。
圖15顯示抗切口3 hu28-vc0101於OVCAR3卵巢癌模型之療效。
圖16A至16E顯示[A]劑量5mg/kg之大鼠-人嵌合性抗切口3抗體-藥物共軛體於HCC2429肺癌異種移植中之療效；[B及C]劑量5mg/kg之大鼠-人嵌合性抗切口3抗體-藥物共軛體於MDA-MB-468乳癌異種移植中之療 效；[D及E]劑量5mg/kg之大鼠-人嵌合性抗切口3抗體-藥物共軛體於N87胃癌異種移植中之療效。
圖17A及17B顯示[A]半胱胺酸單突變體hu28 HC 1.0 L443C及hu28 LC 1.0 κK183C，與[B]半胱胺酸二突變體hu28 HC 1.0 L443C/K392C之胺基酸及核苷酸序列。
實施例1 產製重組切口3蛋白免疫原
編碼人切口3 NRR區域之cDNA建構體被選殖至表現載體pSMED2，該建構體之N端具有信號肽，C端具有Avi及His6標籤。這些建構體被過渡性轉染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，該經分泌至條件培養基中之蛋白質在SDS-PAGE上分析。在處理S1切割位點後，該切口3 NRR結構域之N端約26kDa之半(LNR-A、B、C及HD1)和C端約12kDa之半(HD2及Avi_His標籤)經由非共價交互作用維持相連以形成異二聚體複合物，如圖1所示。經測定在CHO細胞製備之樣本中，切口3 NRR之S1處理僅佔約50%或更少。為了增進S1切割位點之處理，將切口3 NRR表現建構體轉染至CHO-PACE細胞(Harrison et,al,Semin Hematol.1998 Apr；35(2 Suppl 2)：4-10)，並選擇具有最高表現及完全處理切口3 NRR之穩定細胞系。這些細胞系培養的規模被放大以收集可自其中純化切口3 NRR蛋白之條件培養基。
經純化之人及小鼠切口3 NRR_Avi_His標籤蛋白(以下稱為「切口3 NRR重組蛋白」)的胺基酸及核苷酸序列係提供於圖2。小寫字母代表Avi_His標籤。SDS-PAGE分析顯示>90%之經純化之蛋白係經正確切割為預測的切口3 NRR N-端及C-端肽大小(資料未顯示)。
實施例2 產製及選殖大鼠抗切口3抗體 A.免疫接種及雜交瘤產製
史道二氏(Sprague-Dawley)大鼠係經免疫接種，藉由皮下注射含有各20μg之人(SEQ ID NO.1)及小鼠(SEQ ID NO.3)切口3重組蛋白之混合物於完全弗氏(Freund’s)佐劑。免疫接種以2周間隔重複進行12周。第一次注射後之第0、35、49及63天所收集之血清樣本藉由如下述之酶連接免疫吸附測定(ELISA)檢測循環中之抗切口3抗體力價活性。當達到理想力價時，最終劑量之蛋白混合物經靜脈(尾靜脈)注射至該具有理想抗體力價之大鼠，在4天後犧牲該鼠以收集脾細胞。利用PEG 1500，使收集自該大鼠之全脾細胞(2×108)與小鼠骨髓瘤細胞系P3X63.Ag8.653(2.5×107)融合。經融合之細胞被接種於96孔盤(0.2mL/孔)，並進行HAT篩選(含有5×10-4M次黃嘌呤、1.6×10-5M胸苷、4×10-4M胺喋呤及20%熱失活之FCS的RPMI 1640)。
融合14天之後，收集雜交瘤上清液，測試是否存在 切口3結合活性。二個親代大鼠克隆28及75(以下分別稱為r28及r75)展現對人切口3 NRR重組蛋白之ELISA結合活性，另藉由細胞基底ELISA測定也展現對穩定過度表現人全長切口3之U-2 OS細胞之細胞表面的結合活性，其中O.D.450nM值為1或以上，抗體濃度為0.1-1nM。另外，r28(但非r75)展現對小鼠切口3 NRR重組蛋白之ELISA結合活性，另藉由細胞基底ELISA測定也展現對穩定過度表現小鼠全長切口3之U-2 OS細胞之細胞表面的結合活性，其中O.D.450nM值為1或以上，抗體濃度為0.1-1nM。
B.選殖及定序抗切口3抗體
r28及r75可變區係經次選殖以供進一步分析。自次選殖株萃取RNA，並經由RT-PCR選殖獲得該經表現之抗體的可變區DNA序列。一至五百萬個經次選殖之雜交瘤細胞係經均質化以利用凱杰(Qiagen)公司RNAeasy Mini套組進行總RNA分離。接著利用SuperScript III RT套組(Invitrogen)製備第一股cDNA。接著藉由下述之PCR條件，使用大鼠IgG重鏈(IgG1、2a、2b)及輕鏈(κ或λ)恆定區之引子產製及擴增抗切口3 IgG之可變區的雙股cDNA。PCR循環條件：1個95℃ 1分鐘循環；25個95℃ 1分鐘、63℃ 1分鐘循環，及72℃ 1分鐘。該形成之RT-PCR產物被選殖至TOPO-Blunt選殖載體(Invitrogen)，以習用方法定序。該r28及r75可變區之胺 基酸及核苷酸序列係提供於圖3。CDR以畫底線表示。
實施例3 產製及特徵化嵌合性抗切口3抗體
來自r28及r75之可變區cDNA經次選殖至哺乳動物表現載體，其中大鼠可變重鏈(VH)符合讀框地與人IgG1(hIgG1)融合，且大鼠可變輕鏈(VL)與人κ融合。大鼠-人嵌合抗體28及75(以下分別稱為ch28及ch75)係自過渡性轉染至HEK293細胞之這些建構體產製，並經進一步分析。
ch28及ch75係於重組蛋白ELISA中測試結合活性。經純化之人或小鼠切口3 NRR重組蛋白係包覆於CoStar高結合性96孔ELISA盤上，以1μg/ml之濃度於含鎂/鈣之100μl PBS中包覆隔夜。該盤以PBS-Mg/Ca清洗並以1% BSA於PBS-Mg/Ca中封閉1小時。將盤中之封閉溶液倒掉，加入1：3之抗體於封閉溶液中之連續稀釋液至該盤。在室溫中培養1小時後，再次以PBS-Mg/Ca清洗該盤，然後才加入於封閉緩衝液中稀釋(1：20,000)之經辣根過氧化酶(HRP)共軛之二級抗體。當該經測試之一級抗體係大鼠IgG時，該二級抗體係山羊抗大鼠IgG Fc(Bethyl Biotech)；當該一級抗體係人IgG時，該二級抗體係山羊抗人IgG Fc(Southern Biotech)。
在經二次抗體培養1小時之後，再次如上述清洗該盤，並添加TMB受質溶液。允許呈色反應進行10分鐘， 然後加入停止溶液0.18M H2SO4。測量在O.D.450nM之吸光度，對資料作圖並以微軟Excel及Graphpad-Prism軟體分析。ch28及ch75展現對人切口3 NRR重組蛋白之高度結合活性，EC50為1nM或更低，且ch28(但非ch75)亦展現對小鼠切口3 NRR重組蛋白之高度結合活性，EC50為1nM或更低。選擇ch28及ch75進行進一步以細胞為基底之ELISA，如下所述。
實施例4 人化
選擇r28及r75進行人化以供後續發展。人化係將CDR移植至人接受體架構上(重鏈為DP-54，輕鏈為DPK9)，然後在人接受體架構進行選擇性回復突變，以恢復親代大鼠抗體之完整功能。表1顯示不同變異體之人接受體架構中之選擇性回復突變。
由Genewiz合成具有選擇性回復突變之含有r28及r75之CDR捐贈者序列移植至人接受體架構DP-54及DPK9之cDNA。該合成之cDNA產物係經次選殖且分別在哺乳動物表現載體pSMED2及pSMEN3中符合讀框地與人IgG1重鏈恆定區及人κ融合以合成重鏈及輕鏈。
人化r28變異體VH1.0/VL1.0(以下稱為hu28)完全保留ch28之抗原結合表位及親和性，且缺乏在ch28觀察到之有效傳訊抑制活性。hu28之VH及VL區的CDR分別與r28之VH及VL區的CDR相同。人化r75變異體VH1.9/VL1.3(以下稱為hu75)完全保留ch75之抗原結合表位及親和性及在ch75觀察到之有效傳訊抑制活性。hu75之VH區的CDR2及CDR3分別與r75之VH區的CDR2及CDR3相同。hu75之VH區的CDR1包含一個回復突變V34M。hu75之VL區的CDR與r28之VL區的CDR相同。圖4A至4C提供hu28的胺基酸及核苷酸序列並載明CDR(卡巴及柯西亞)，圖5A至5C提供hu75的胺基酸及核苷酸序列並載明CDR(卡巴及柯西亞)。
r28與hu28以及r75與hu75的人接受體架構之VH及VL區的排比係顯示於表2。卡巴CDR係經畫底線表示。大鼠與人化序列之間的架構區之殘基差異係以小寫字母表示。接受r28及hu28可變區之人接受體架構之間的同源性為VH 73%及VL 76%。接受r75及hu75可變區之人接受體架構之間的同源性為VH 46%及VL 64%。卡巴CDR係經畫底線表示。
實施例5 hu28及hu75之特徵描述 A.以細胞為基底之ELISA
在以細胞為基底之ELISA中，篩選人化hu28及hu75以及大鼠-人嵌合性ch28及ch75抗切口3抗體與細胞表面切口3之結合力。在ELISA分析前一天，將細胞表面上穩定過度表現人或小鼠全長切口3蛋白(以下分別稱為U2OS/hNotch3及U2OS/mNotch3)之U-2 OS細胞以50,000細胞/孔接種於96孔盤(白色不透明，BD/VWR)。在ELISA當天，移除孔槽中之培養基，施加經連續 稀釋(1：3於封閉緩衝液中)之抗體溶液於孔盤。孔盤於室溫中培養2小時，之後以PBS-Mg/Ca清洗。經HRP共軛之二級抗體接著如上述用於重組蛋白ELISA中被施加及培養於細胞中1小時。孔盤先經PBS-Mg/Ca清洗，接著以Pico化學發光劑呈色套組(Thermal Scientific)呈色，按照廠商說明進行化學發光測量。資料作圖及分析係利用微軟Excel及Graphpad-Prism軟體進行。EC50(nM)值係自細胞表面切口3結合ELISA計算，並提供於表3。
資料顯示，hu28與表現於U2OS/hNotch3細胞之細胞表面上的全長人切口3結合之能力和ch28類似。另外，資料顯示hu28完全保留ch28與表現於U2OS/mNotch3細胞之細胞表面上的小鼠切口3之交叉反應性。資料亦顯示，hu75與表現於U2OS/hNotch3細胞之細胞表面上的全長人切口3結合之能力和ch75類似。另外，資料顯示hu75完全保留ch75對人切口3之專一性；但未觀察到與表現於U2OS/mNotch3細胞之細胞表面上的小鼠切口3之交叉反應性。N/B代表不結合。
B.競爭性ELISA
進行hu28與ch28以及hu75與ch75對細胞表面上表現之全長人切口3之競爭性ELISA。將U2OS/hNotch3細胞接種於96孔細胞培養板(Co-star)。含有0.8nM之ch28(生物素基化)或ch75(生物素基化)抗體之連續稀釋(1：3於封閉液)的抗體溶液被施加至孔盤。在培養2小時後，該孔盤如上述清洗，並加入以封閉液稀釋5000倍之經HRP共軛之鏈黴抗生物素蛋白(Southern Biotech)。與鏈黴抗生物素蛋白培養30分鐘之後，再次清洗孔盤，然後以TMB溶液發色10分鐘。發色反應以添加0.18M H2SO4停止，並測量450nM之吸光度。資料作圖及分析係利用微軟Excel及Graphpad-Prism軟體進行。
表4顯示競爭與表現於U2OS/hNotch3細胞之細胞表面上的全長人切口3結合之ELISA的EC50(nM)值。該資料顯示hu28與未經標記之r28具有類似EC50值，表示hu28類似未經標標記之ch28與生物素基化ch28競爭與表現於U2OS/hNotch3細胞之細胞表面上的全長人切口3之結合。該資料顯示hu28與ch28所結合至表現於U2OS/hNotch3細胞之細胞表面上的全長人切口3之相同表位或高度類似表位結合。
該資料另外顯示hu75與未經標記之ch75具有類似EC50值，表示hu75類似未經標記之ch75與生物素基化ch75競爭與表現於U2OS/hNotch3細胞之細胞表面上的全長人切口3之結合。該資料顯示hu75與ch75所結合至表現於U2OS/hNotch3細胞之細胞表面上的全長人切口3之 相同表位或高度類似表位結合。
C.與其他人切口同源物結合之專一性
其他切口受體家族之成員在生物程序扮演重要角色。舉例來說，切口1或切口2缺乏導致小鼠模型中之胚胎死亡。相對地，切口4缺乏在小鼠模型未導致可偵測之表型。切口3 NRR區之最近同源物係切口1及切口2(約50%同源性)，切口4係較遠之同源物(約30%同源性)。抗切口3抗體與切口家族之其他成員(特別是切口1及2)的交叉反應性可能在病患導致非所欲之效應。因此，應評估r28與hu28以及r75與hu75對其他切口家族成員之潛在交叉反應性。
編碼與人IgG1 Fc片段融合之人切口1及切口2 NRR區的表現建構體被穩定導入CHO-PACE細胞中。收集表現NRR-Fc融合物之細胞的條件培養基。人切口2 NRR-Fc及人切口1 NRR-Fc係藉由蛋白A親和性及大小排除層析(SEC)純化。經純化之製劑係經透析至含1mM CaCl2之TBS中，並於分析性SEC上分析得到>99%之純度。
如表5所示，r28及hu28以及r75及hu75皆缺乏與人切口2 NRR-Fc融合蛋白之可檢測結合。另外，hu28與 hu75亦缺乏與全長人切口1 NRR-Fc之可檢測結合。這表示hu28和hu75不會與切口1或切口2交叉反應。N/B代表不結合。
D.與人切口3 NRR之結合親和性
抗切口3 NRR交互作用之動力學常數係藉由表面電漿共振(Biacore® T100，Biacore公司，紐澤西州皮斯卡塔威(Piscataway,NJ))測定。CM5晶片之流動池係經大約10,000反應單位(RU)之抗人IgG-Fc(Biacore®)於10mM甘胺酸pH 5.0中以10微升/分鐘固定600秒。於含1mM CaCl2之TBS中稀釋之10微克/毫升之抗切口3抗體ch28和hu28以及ch75和hu75係以10微升/分鐘被捕捉。四種濃度(自3.7至100nM)之人切口3 NRR重組蛋白及零濃度(流動緩衝液)於100微升/分鐘之結合係於含1mM CaCl2之TBS中記錄3分鐘。複合物之解離係經測量10分鐘。晶片表面藉由以10微升/分鐘注射3M MgCl2與3mM EGTA達60秒以再生。在減去參考物及緩衝液信號後得到之曲線利用Biacore® T100評估軟體(Biacore®)帶入1：1蘭繆爾(Langmuir)結合模型。
Ka、Kd及KD係顯示於表6。動力學分析顯示ch28與hu28具有類似之ka(on)及kd(off)速率。另外，觀察到hu75相較於ch75具有較高之ka(on)及較低之kd(off)速率，導致hu75具有較低之KD值。
D.熱穩定性
蛋白或蛋白結構域之熱穩定性與該蛋白或蛋白結構域之整體穩定性具正向相關。較高熔點之蛋白或蛋白結構域通常提供較佳之可製造性及較長之貨架時間。使用示差掃描量熱儀(DSC)以分別檢測hu28及hu75相對於ch28及ch75之熱穩定性。蛋白樣本被稀釋於體積250微升之PBS中成為0.3毫克/毫升。該對應之調製空白緩衝液被用來作為參照樣本。二個樣本皆利用設定至8℃之MicroCal ThermoVac樣本脫氣恆溫機(Microcal,Inc.,Northampton,MA)徹底脫氣。樣本係經分注至MicroCal VP-DSC毛細池微量熱計(MicroCal,Inc.,Northampton,MA)之適當池中。樣本係於15℃平衡4分鐘，接著以每小時100℃之速率掃描至100℃。選擇20秒之過濾期。原始資料係經基準校正，該蛋白濃度係經正常化。Origin軟體(OriginLab Corporation,Northampton,MA)被用於適配該資料至具有適當數量之同類鹼基置換之MN2-State模型。
如下表7所示，hu28與hu75二者皆具有較高之熱穩定性，即彼等之Fab區相較於ch28與ch75分別顯示較高熔點(皆高於77℃)。
實施例6 結構域交換嵌合性建構體
如實施例3所述，hu28及hu75皆缺乏與切口1蛋白之交叉反應性。製備切口1及切口3 NRR之結構域交換嵌合性建構體，以進行抗切口3 ch28及ch75抗體之表位定位。編碼具有C端Fc融合(人IgG1 Fc片段)之人切口1-切口3(以下稱為切口1-3)NRR區結構域交換嵌合物的表現建構體係經個別轉染至CHO-PACE，並建立表現各種嵌合物之穩定庫。源自各穩定細胞庫之條件培養基被施用至蛋白A親和性層析，接著進行大小排除層析(SEC)以純化該嵌合性融合蛋白。經純化之製劑被透析至含1mM CaCl2之TBS中，並於分析性SEC上分析。圖6顯示，該重組NRR嵌合性蛋白係由與人Fc(未顯示)融合之各種切口1(以灰色顯示)及切口3(以黑色顯示)結構域組成。
ch28及ch75與切口1-3 NRR結構域交換嵌合物之相 對結合能力利用實施例3及5所述之ELISA測試。將該切口1-3 NRR結構域交換嵌合物以lug/ml包覆於ELISA板，然後以含0.9mM Mg2+及Ca2+之1% BSA於PBS中封閉。接著添加經封閉溶液稀釋為5ug/ml之ch28及ch75於該封閉板。培養1小時後，以含0.9mM Mg2+及Ca2+之PBS清洗該板，接著添加經HRP共軛之二次山羊抗人Fc抗體至該板並培養。再次清洗之後，添加TMB至該板發色，發色反應藉由加入0.18M H2SO4停止。O.D.450nM係於孔盤讀取儀上讀取，相對結合能力以O.D.值顯示。
如圖6所示，ch28及ch75與切口3 NRR之結構域的表位結合特性不同。更具體地，ch28與切口3 NRR之結合較依賴LNR-C及HD-1結構域，而ch75則較依賴LNR-A及HD-1和HD-2二個結構域。該觀察到之ch28和ch75的結合特性與抗體之傳訊抑制活性一致。特別是，ch28僅與切口3 NRR異二聚體之N端(HD-1)交互作用，其不會使該切口3 NRR區維持在抑制切口3傳訊活化所需之自我抑制構形。相對地，ch75與切口3 NRR異二聚體之HD-1及HD-2結構域二者交互作用，使該切口3 NRR區維持自我抑制構形，藉以抑制切口3傳訊活化。
實施例7 識別切口3表現性癌細胞系
切口3之表現係於一群癌細胞系中測定，該測定藉由西方墨點法識別切口3陽性細胞以用於進一步分析及測試 抗切口3抗體及抗切口3抗體-藥物共軛體。該群癌細胞系包括HCC2429肺癌細胞系、OVCAR3卵巢癌細胞系、MDA-MB-468乳癌細胞系、N87胃癌細胞系，以及經建構以過度表現人切口3之細胞系，包括U-2 OS及MDA-MB-468細胞(以下分別稱為U2OS/hNotch3及MDAMB468/hNotch3)。切口3係以兔抗切口3單株抗體D11B8(Cell Signaling Technologies)或小鼠單株抗體1G5(Abnova)，利用標準西方墨點法檢測。
D11B8抗切口3抗體與人切口3蛋白之C端尾內環繞Glu2312之表位結合，且識別未經切割之全長切口3(約270kDa)及包含切口3蛋白片段之經切割之C端結構域(約80-90kDa)。分子量約80-90kDa之切口3條帶代表跨膜及細胞內結構域(TMIC)及/或切口細胞外截短(NEXT)蛋白水解片段，如圖7所示。1G5抗體與切口3胞外域(ECD)之胺基酸47-156內之表位結合，且識別未經切割之全長切口3(約270kDa)及經切割之N端片段(約210kDa)(資料未顯示)。
切口3-ECD(資料未顯示)與包含切口3蛋白片段之C端結構域二者皆於HCC2429、OVCAR3、MDA-MB-468、N87、MDAMB468/hNotch3及U2OS/hNotch3檢測到，如圖7所示。另外，切口3並未在SW900肺癌細胞系中檢測到，因此代表切口3陰性對照細胞系。
實施例8 抗切口3抗體之內化及運輸
抗切口3抗體-藥物共軛體係由肽可切割之順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-p-胺基苯甲氧基羰基(vc)連接子或不可切割之以硫醚為基底之順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)連接子與一系列細胞毒性劑共軛組成。自該抗體釋放載荷藥物需要運送及定位該抗體-藥物共軛體至具有蛋白水解酶如組織蛋白酶B之溶酶體以切割該vc型連接子，或運送至末期溶酶體以完整分解代謝該抗體以釋放該mc連接之載荷藥物。抗切口3抗體之內化及細胞內運送至溶酶體囊胞係藉由間接及直接免疫螢光顯微鏡基底測定監測。為了直接看見抗切口3抗體之細胞內運送，該抗體係與螢光染料共軛，並於pHrodoTM紅色葡聚糖(Life Technologies)存在下與活細胞一起培養以染色酸性囊胞如溶酶體。進行活細胞顯影，以識別該螢光標記抗體與溶酶體及其他酸性囊胞之共位。另外，在細胞上進行間接免疫螢光顯微鏡基底測定以證實抗切口3抗體與LAMP1(一種溶酶體相關蛋白)之共位。
A.內化及溶酶體運輸
HCC2429或MDA-MB-468細胞係於Lab Tec II 4室蓋玻片含蓋#1.5硼矽酸無菌玻片(Thermo Fisher Scientific Inc.)中培養。第1天，添加pHrodoTM紅色葡聚糖(Life Technologies)10μg/ml濃度至該培養基，培養16小時以染色酸性囊胞如溶酶體。第2天，以HBSS++(Gibco Life Technologies)清洗細胞二次。抗切口3抗體hu75係與Alexa Fluor 488染料(Life Technologies蛋白標記套組)共軛(以下稱為「hu75-Alexa488」)，hu28係與DyLight650順丁烯二醯亞胺試劑(Thermo Scientific)根據製造商說明直接共軛(以下稱為「hu28-DyLight650」)。hu75-Alexa488或hu28-DyLight650標記抗體係以濃度5μg/ml於2%牛血清白蛋白(BSA)/HBSS++中添加至於濕冰上之細胞中25分鐘。細胞以在冰上之冰冷HBSS++清洗二次，被放入2% BSA/HBSS++中，在配有eXcelon Evolve 512相機(Photometrics)及溫度、濕度及5% CO2控制之XL S系列培養室(Zeiss)之轉盤CSU-X1M 5000顯微鏡(Yokogawa)上，自5分鐘至12-18小時成像。每5分鐘捕捉成像一次，利用Zen CZI檔案格式(Zeiss)組合。利用Volocity v6.3軟體(PerkinElmer)計算皮爾森(Pearson)相關係數，以測定hu28-DyLight650與pHrodoTM紅色葡聚糖之間的共位程度。
一旦細胞經製備以供活細胞成像，可被檢測的最早時間點為10分鐘，因為需要設定及最佳化用於取得影像之儀器設定。在細胞被放入潮濕、37℃、5% CO2之室內約10分鐘後，可在細胞表面以及細胞內的多個斑點樣結構觀察到hu75-Alexa488，如圖8A所示。此結果顯示抗切口3抗體hu75在與細胞膜之切口3受體結合後快速進行內化。在較早之時間點(10分鐘至約65分鐘)，細胞內 抗切口3抗體hu75-Alexa488與被pHrodoTM紅色葡聚糖染色之酸性囊胞看似不共位之分離斑點。從大約70分鐘以後，抗切口3抗體hu75及pHrodoTM紅色葡聚糖標記之囊胞共位至相同的分離點樣結構，如圖8B中之箭頭所示。此資料顯示抗切口3抗體hu75在切口3表現性HCC2429(資料未顯示)及MDA-MB-468細胞中被內化及運送至酸性囊胞如溶酶體，如圖8B所示。
在細胞被放入潮濕、37℃、5% CO2之室內約10分鐘後，可在細胞表面觀察到hu28-DyLight650，如圖8C所示。細胞內抗切口3抗體hu28-DyLight650和pHrodoTM紅色葡聚糖染色之酸性囊胞呈現分離斑點樣，隨時間逐漸共位，如圖8D中之箭頭所示。計算皮爾森相關係數(PCC)以決定hu28-DyLight650與pHrodoTM紅色葡聚糖螢光標記在MDA-MB-468細胞中隨時間變化之重疊或共位程度。PCC數值越高，hu28-DyLight650與pHrodoTM紅色葡聚糖螢光標記之間的共位程度越高。圖8E顯示hu28-DyLight650與pHrodoTM紅色葡聚糖之間的共位穩定增加至約360分鐘，最大共位發生在約420分鐘然後達到高原。此資料顯示抗切口3抗體hu28-DyLight650在切口3表現性MDA-MB-468細胞中被內化及運送至酸性囊胞如溶酶體。
B.與溶酶體相關性膜蛋白1(LAMP1)共位
HCC2429或MDA-MB-468細胞係於Lab Tec II 4室 蓋玻片含蓋#1.5硼矽酸無菌玻片(Thermo Fisher Scientific Inc.)中培養。要進行結合和內化試驗，細胞經HBSS++沖洗二次，然後加入濃度為10μg/ml之未經共軛之抗切口3抗體hu75及hu28(於2%牛血清白蛋白(BSA)/HBSS++中)，置於冰上25分鐘。要觀測在時間0分鐘之膜結合，對照細胞以冰冷HBSS++清洗，然後以4%多聚甲醛於PBS中固定10分鐘。以抗體內化作用而言，細胞經冰冷HBSS++清洗二次，加入預熱之完全培養基，然後放入潮濕37℃、5% CO2培養箱中。在5分鐘至18小時之間的多個時間點，將細胞自培養箱移出，如前述方法清洗及固定。接著以PBS清洗細胞3次，利用0.3%Triton X-100(於PBS中)通透化10分鐘。每次都用PBS清洗5分鐘三次，然後以3% BSA/PBS封閉1小時。添加1：100之抗LAMP-1小鼠單株抗體(H4A3,Abcam)(於2% BSA/PBS中)，於4℃培養隔夜。細胞用PBS清洗二次，每次各5分鐘，然後添加二次山羊抗人Alexa Fluor 488及山羊抗小鼠Alexa Fluor 555(Life technologies)，於暗室反應45分鐘。細胞以PBS清洗三次，在Zeiss LSM510共軛焦顯微鏡或CSU-X1M 5000(Yokogawa)轉盤式共軛焦顯微鏡上成像。
在對照組中，細胞與抗切口3抗體於冰上培養然後立即固定，hu28及hu75皆被定位於切口3表現性細胞之細胞表面，在細胞內未觀察到染色。在對照細胞中，溶酶體係經抗LAMP1抗體染色，呈現不與抗切口3抗體hu28及 hu75共位之在細胞內之分離斑點樣結構。在37℃培養90分鐘後，抗切口3抗體hu28及hu75被觀察到位於細胞內之斑點樣結構，其與抗LAMP1抗體共位。在37℃培養後，抗切口3抗體hu28及hu75之細胞膜染色減少，最終變成無法檢測。此資料顯示抗切口3抗體hu28及hu75在與細胞在冰上培養後與細胞表面結合，然後在37℃進行溫度依賴性內化。一經內化後，抗切口3抗體hu28及hu75與LAMP1蛋白共位，顯示它們被專一運送至溶酶體(資料未顯示)。
實施例9 抗切口3抗體在以細胞為基底之試驗中對切口3傳訊之影響
切口3傳訊係藉由配體誘導之蛋白水解開始。成熟的切口3異二聚體在弗林樣蛋白酶切割位點S1之後，由近膜負調節區(NRR)保持於自我抑制狀態。配體(如DLL4或Jagged1)與切口3-ECD之結合誘導在位點S2及S3之二個連續的額外切割，彼等分別由ADAM型金屬蛋白酶及γ分泌酶催化。後者之切割釋放切口3之細胞內結構域(NICD3)，允許其轉位至細胞核並活化含有CSL蛋白之一致DNA結合位點模體(motif)之目標基因的轉錄。
抗切口3嵌合抗體ch28-huIgG1及ch75-huIgG1和人化抗體hu28及hu75抑制切口3傳訊之能力係於切口3依賴性報告基因共培養測試中測定。抗切口3抗體係與切口3報告細胞預先培養，接著與DLL4-HEK293細胞共培養 以活化切口3傳訊或與親代HEK293細胞共培養以作為對照。
A.用於切口3報告基因共培養試驗之細胞系建構
為了產製切口3報告細胞系，在U-2 OS人骨肉瘤細胞系(美國菌種保存中心(ATCC)，Manassas,VA)連續實施三次穩定轉染。第一次轉染使用以pCMV6-Entry-Myc-Flag骨架(Origene)為基礎之表現全長人切口3之載體，其中切口3***物之正確DNA序列係經證實。在經TransIT-LT1轉染試劑(Mirus,Madison,WI)之轉染後，U-2 OS細胞係於G418中篩選並分離克隆株。第二，穩定表現切口3之U-2 OS克隆經pGL4.27[luc2P/minP/Hygro]載體(Promega,Madison,WI)之再轉染，該載體含有8份串聯之CSL增強子序列(CGTGGGAAAAT)，以潮黴素B加上G418篩選並分離克隆株。該8xCSL螢火蟲螢光素酶報告建構體對經活化之切口傳訊有反應(例如見Jeffries et al.,Mol.Cell.Biol.22(11)：3927-3941,2002)。第三，該人切口3 8xCSL螢火蟲螢光素酶U-2 OS細胞係經Cignal Lenti Renilla對照(luc)(Qiagen,CA)慢病毒顆粒轉導，以嘌呤黴素(puromycin)、潮黴素B及G418篩選並分離克隆株。該Cignal Lenti Renilla對照(luc)載體編碼水母冷光酶基因，該水母冷光酶基因係自CMV啟動子組成性表現並作為內部對照。該經三重穩定轉染之U-2 OS細胞系(以下稱為「切口3報告細胞」)被維持於含有10% FBS、 1X青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺酸(Gibco)、0.25mg/ml G418硫酸鹽、0.3mg/ml潮黴素B及0.001mg/ml嘌呤黴素之McCoy’s 5A培養基中(Gibco,Grand Island,NY)。
為了產製配體表現細胞，HEK293細胞(ATCC)係經表現人DLL4之載體轉染。該載體以pCMV6-AC-HA-His骨架為基礎(Origene,Rockville,MD)，該DLL4***物之正確DNA序列係經證實。在轉染後，HEK293細胞係於0.5mg/ml G418中篩選，克隆株係經分離、擴增及分析DLL4之表現。在U-2OS細胞中具有高度DLL4表現及高度誘導切口3報告活性之克隆被用來評估抗切口3抗體之抑制效應。
將源自螢火蟲螢光素酶之螢光讀數除以內部對照水母冷光酶之讀數以正常化該信號(以下稱為「F/R比」)。為了計算切口3傳訊之誘導倍數，自該DLL4-HEK293共培養報告試驗所產生之F/R比係除以源自親代HEK293共培養之F/R比，並稱為相對螢光素酶單位(RLU)或活性。
B.報告基因共培養測試
在培養板之人切口3報告細胞係經胰蛋白酶消化、收集及計數，其中測試培養基係由50%完全McCoy’s 5A培養基(含10% FBS及青黴素、鏈黴素之McCoy’s 5A培養基，Invitrogen)及50%之完全MEM培養基(含10% FBS及青黴素、鏈黴素之MEM，Invitrogen)組成。適當細胞稀釋液係以相同培養基製備，以允許在含有經連續稀釋 (1：3於完全McCoy’s 5A培養基中)之抗體溶液或雜交瘤培養上清液之96孔盤(白色不透明，BD/VWR)上，每孔45微升之總體積中有每孔10,000個細胞。該等細胞及抗體稀釋液之混合物係在孔盤上於室溫中之無菌通風櫃培養1小時，接著在各孔中添加每45微升30,000個人DLL4-HEK293細胞。在添加hDLL4-HEK293細胞後，該盤於培養箱中繼續培養20小時，按照廠商說明使用Dual-Glo螢光素酶測試系統(Promega)以測量螢火蟲螢光素酶及內部對照水母冷光酶活性。資料係利用微軟Excel及格飛派德軟體(Graphpad Prism)作圖及分析。
ch75-huIgG1及hu75於人切口3報告共培養測試中之力價顯示以劑量依賴性方式有效抑制切口3之傳訊。表8顯示ch75-huIgG1及hu75抗體在人切口3報告細胞中對切口3依賴性傳訊之抑制活性。ch75-huIgG1及hu75在人切口3依賴性傳訊報告試驗中顯示類似之中和活性。因此，hu75完全保留ch75-huIgG1之抑制活性。ch28-huIgG1及hu28二者皆微弱抑制切口3傳訊，程度類似對照ch2H6-huIgG1及huNeg8.8抗體。這表示ch28-huIgG1及hu28之抑制活性並不具專一性。另外，資料顯示抗切口3抗體ch28-huIgG1及hu28不抑制切口3傳訊，因此其功能與ch75-huIgG1及hu75不同。
ch75-huIgG1及hu75變異體之IC50(nM)值係自切口3報告基因共培養測試之切口3依賴性傳訊抑制計算。來自二或三個獨立試驗之IC50(nM)的資料係經平均，如表9所示。hu75及ch75-huIgG1皆具有低IC50值，表示它們是切口3傳訊之有效抑制劑。
C.抗切口3抗體對於金屬蛋白酶在位點2切割的影響
為了證實抗切口3抗體hu75(但非hu28)對切口3之NRR結構域的結合伴隨S2切割之減少，因此進行西方墨點分析。兔抗切口3單株抗體D11B8(Cell Signaling Technologies)辨識S1及S2蛋白水解切割事件之產物切口3C端片段。如NRR結構域交換試驗所示，抗切口3抗體hu75與LNR-A、HD-1及HD-2結構域同時結合，該等結 構域位於由三呋喃基二氫咪唑切割之位點1(S1)所分開之NRR的二個非共價連接區上。抗切口3抗體hu28與LNR-C及HD1結構域結合，該等結構域位於S1位點N端之NRR結構域的線性、共價連接區域。預期抑制抗體會降低S2切割之切口3的檢測，因為抑制抗體穩定NRR結構域於自我抑制構形，因此防止S2切割，非抑制抗體則不預期有對S2切割的這種效應。
切口3受體之位點2(S2)切割係由蛋白之西方墨點分析檢測，使用辨識在C端結構域之Glu2312周圍之表位的D11B8(Cell Signaling Technologies)抗體。HCC2429及MDA-MB-468乳癌細胞被用來檢測抑制性抗切口3抗體hu75及非抑制性抗切口3抗體hu28對S2切割之作用。以該測定而言，1-2.5×106細胞被接種於完全培養基。hu75、hu28及huNeg8.8對照抗體被添加於5μg/ml之濃度。細胞被培養於37℃之5% CO2培養箱中24小時，然後直接溶解於緩衝液。萃取物藉由變性7.5%聚丙醯胺膠體(Bio-Rad criterion gel)上之SDS-PAGE解出，並利用iBlot膠體轉移系統(Invitrogen)被轉印至硝化纖維素紙。切口3利用D11B8抗體檢測，抗GAPDH抗體(Sigma)利用標準西方墨點程序作為裝載對照。
圖9顯示該S2切割測試的西方墨點分析。在未處理及對照huNeg8.8處理之HCC2429及MDA-MB-468細胞24小時後，S1及S2切割之C端切口3蛋白片段皆可如預期般藉由西方墨點分析被D11B8抗體檢測。另外，在 經抑制性抗切口3抗體hu75處理之細胞中，S1切割之切口3C端片段可被檢測，但S2切割片段則未被檢測，顯示金屬蛋白酶切割被hu75阻斷。另外，在經非抑制性抗切口3抗體hu28處理之細胞中，S1及S2切割之切口3C端片段皆被檢測，顯示hu28不抑制該受體之蛋白水解。因此，hu28如實施例5所示以高親和性與該切口3 NRR結合，且對表現在細胞表面上之全長切口3具有高結合活性，但不抑制切口3傳訊，顯示其在功能上與抑制性抗切口3 NRR抗體(包括hu75)不同。
實施例10 化合物之合成
化合物0101、6780、0131、3377及8261係根據國際專利公開案WO/2013/072813所述之方法製備，該案以參照方式納入本文。
A.化合物0101(圖中之#54)之實驗數據
製備2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(#54)
步驟1：合成N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-羰基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(#53)。根據一般程序D(如下)，自#32(2.05g,2.83mmol,1eq.)(於二氯甲烷(20mL,0.1M)及N,N-二甲基甲醯胺(3mL)中)，與胺#19(2.5g,3.4mmol,1.2eq.)、HATU(1.29g,3.38mmol,1.2eq.)
及三甲胺(1.57mL,11.3mmol,4eq.)合成粗製之所欲物質，該粗製物質藉由矽膠層析純化(梯度：0%至55%丙酮於庚烷中)，產製固體狀之#53(2.42g,74%)。LC-MS：m/z 965.7[M+H+]，987.6[M+Na+]，滯留時間=1.04分鐘；HPLC(程序A)：m/z 965.4[M+H+]，滯留時間= 11.344分鐘(純度>97%)；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )假設為旋轉異構體之混合物的特徵信號：δ7.86-7.91(m,2H),[7.77(d,J=3.3Hz)and 7.79(d,J=3.2Hz),total 1H],7.67-7.74(m,2H),[7.63(d,J=3.2Hz)and 7.65(d,J=3.2Hz),total 1H],7.38-7.44(m,2H),7.30-7.36(m,2H),7.11-7.30(m,5H),[5.39(ddd,J=11.4,8.4,4.1Hz)and 5.52(ddd,J=11.7,8.8,4.2Hz),total 1H],[4.49(dd,J=8.6,7.6Hz)and 4.59(dd,J=8.6,6.8Hz),total 1H],3.13,3.17,3.18 and 3.24(4 s,total 6H),2.90 and 3.00(2 br s,total 3H),1.31 and 1.36(2 br s,total 6H),[1.05(d,J=6.7Hz)and 1.09(d,J=6.7Hz),total 3H]。
步驟2：合成2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-羰基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(#54)
根據一般程序A(如下)，自#53(701mg,0.726mmol)於二氯甲烷中(10mL,0.07M)合成該粗製之所欲物質，該粗製物質藉由矽膠層析純化(梯度：0%至10%甲醇於二氯甲烷中)。該殘餘物係經二乙基醚及庚烷稀釋，並於真空中濃縮以得到白色固體狀之#54(406mg,75%)。LC-MS：m/z 743.6[M+H+]，滯留時間=0.70分鐘；HPLC(程序A)：m/z 743.4[M+H+]，滯留時間=6.903分鐘(純度>97%)；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )假設為旋 轉異構體之混合物的特徵信號：δ[8.64(br d,J=8.5Hz)and 8.86(br d,J=8.7Hz),total 1H],[8.04(br d,J=9.3Hz)and 8.08(br d,J=9.3Hz),total 1H],[7.77(d,J=3.3Hz)and 7.80(d,J=3.2Hz),total 1H],[7.63(d,J=3.3Hz)and 7.66(d,J=3.2Hz),total 1H],7.13-7.31(m,5H),[5.39(ddd,J=11,8.5,4Hz)and 5.53(ddd,J=12,9,4Hz),total 1H],[4.49(dd,J=9,8Hz)and 4.60(dd,J=9,7Hz),total 1H],3.16,3.20,3.21 and 3.25(4 s,total 6H),2.93 and 3.02(2 br s,total 3H),1.21(s,3H),1.13 and 1.13(2 s,total 3H),[1.05(d,J=6.7Hz)and 1.10(d,J=6.7Hz),total 3H],0.73-0.80(m,3H)。
B.化合物6780(圖中之#112)之實驗數據
製備2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(#112)
步驟1：合成三級丁基(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-羧酸酯(#109)。在#11(2.00g,6.96mmol,1eq.)於二氯甲烷(21mL,0.3M)及N,N-二甲基甲醯胺(3mL)之溶液中，添加HATU(3270mg,8.35mmol,1.2eq.)。在二分鐘後，添加胺(1R,2S)-(+)-降麻黃鹼(1.07mg,6.96mmol,1eq.)及三乙胺(1.94mL,13.9mmol,2eq.)。在二小時後，該反應混合物以乙酸乙酯(100mL)稀釋，用1M氯化氫水性溶液及鹽水沖洗，以硫酸鈉乾燥，過濾，在真空中濃縮，並藉由矽膠層析純化(梯度：0%至60%乙酸乙酯於庚烷中)，以提供白色固體狀之#109(2.18g,74%)。LC-MS：m/z 321.3[(M-Boc)+H+]，滯留時間=3.14分鐘；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )假設為旋轉異構體之混合物的特徵信號：δ7.64(d,J=8.6Hz,1H),7.24-7.33(m, 4H),7.15-7.21(m,1H),5.35(br d,J=5Hz,1H),4.45(br dd,J=5,5Hz,1H),3.91-4.00(m,1H),3.30-3.39(m,1H),3.26(s,3H),2.94-3.07(m,1H),2.04-2.14(m,1H),1.46-1.78(m,4H),1.40(s,9H),0.97-1.04(m,6H)。
步驟2：合成(2R,3R)-N-[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯啶-2-基]丙醯胺，三氟乙酸鹽(#110)。根據一般程序C(如下)，在0℃自#109(414mg,0.984mmol,1eq.)、二噁烷(5mL,0.2M)及氯化氫於二噁烷之4M溶液(15mL,60mmol,60eq.)中合成粗製之所欲化合物，其藉由逆相層析(方法C)純化以產生成黏稠液體之#110(120mg,34%)。LC-MS：m/z 321.1[M+H+]，滯留時間=0.55分鐘；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )，特徵信號：δ7.90(d,J=8.6Hz,1H),7.28-7.36(m,4H),7.20-7.27(m,1H),4.46(d,J=6.2Hz,1H),3.48(dd,J=8.6,2.3Hz,1H),3.38(s,3H),2.92-3.16(m,3H),2.24-2.35(m,1H),1.49-1.88(m,4H),1.09(d,J=6.6Hz,3H),1.01(d,J=6.6Hz,3H)。
步驟3：合成N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(#111)。根據一般程序D(如下)，自#32(140mg,0.230mmol,1eq.)、
#110(110mg,0.253mmol,1.1eq.)、二氯甲烷(3mL,0.08M)、N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)、HATU(96.2mg,0.253mmol,1.1eq)及三乙胺(96μL,0.69mmol,3eq.)合成粗製之所欲產物，其藉由矽膠層析純化(梯度：0%至40%丙酮於庚烷中)以產製#111(220mg,95%)。LC-MS：m/z 912.4[M+H+],935.4[M+Na+]，滯留時間=2.15分鐘；HPLC(程序B)：m/z 912.5[M+H+]，934.5[M+Na+]，滯留時間=10.138分鐘(純度>94%)；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )假設為旋轉異構體之混合物的特徵信號：δ7.89(d,J=7.8Hz,2H),7.66-7.75(m,2H),7.41(dd,J=7.4,7.4Hz,2H),7.12-7.20(m,1H),[5.33(d,J=4.7Hz)and 5.38(d,J=4.7Hz),total 1H],3.15,3.18,3.22 and 3.23(4 s,total 6H),1.30,1.33,1.36 and 1.39(4 s,total 6H),0.95-1.06(m,6H)。
步驟4：合成2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(#112)。根據一般程序A(如下)，自#111(210mg,0.230mmol)於二氯甲烷(5mL,0.05M)及二乙胺(5mL)中合成該粗製之所欲物質，該粗製物質藉由矽膠層析純化(梯度：0%至10% 甲醇於二氯甲烷)以產生油及固體之混合物。添加二乙基醚及庚烷，該混合物於真空濃縮，產生白色固體之#112(81mg,51%)。LC-MS：m/z 690.4[M+H+]，滯留時間=1.10分鐘；HPLC(程序A)：m/z 690.5[M+H+]，712.4[M+Na+]，滯留時間=7.229分鐘(純度>90%)；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )假設為旋轉異構體之混合物的特徵信號：δ[7.62(br d,J=8Hz),7.88(br d,J=8Hz),8.07(br d,J=9Hz)and 8.11(br d,J=9Hz),total 2H],7.15-7.34(m,5H),[5.34(d,J=4Hz)and 5.41(d,J=5Hz),total 1H],3.18,3.21,3.23 and 3.25(4 s,total 6H),2.93 and 3.08(2 br s,total 3H),1.15,1.18,1.21 and 1.25(4 s,total 6H)。
C.一般程序
一般程序A：利用二乙胺或哌啶移除Fmoc。在含Fmoc化合物之二氯甲烷或N,N-二甲基甲醯胺(亦稱為DMF)之溶液中，添加等體積之二乙胺或哌啶。反應之進行係由LC-MS(或HPLC或TLC)監測。在真空中移除溶劑，在一些情況中該殘餘物用庚烷共沸一至四次。殘餘物通常用二氯甲烷及少量甲醇稀釋，然後被減量至矽並以矽膠層析純化，利用於二氯甲烷中之甲醇(或其他溶劑之適當混合物)洗脫以得到該所欲之物質(或使用得到之粗製物質)。
一般程序C：利用氯化氫於二噁烷中進行Boc移除或三級丁酯(亦稱為t-Bu酯)切割。在含Boc化合物之溶 液或含三級丁酯化合物於二噁烷之溶液(或在一些情況中無溶液或其他相關溶劑)添加4M氯化氫於二噁烷溶液中。反應之進行係由LC-MS(或HPLC或TLC)監測。該反應於真空中濃縮，在一些情況中以庚烷共沸一至四次。
一般程序D：與O-(7-吖苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)偶合。在胺(1.0eq.)及酸(1.0-2.0eq.)於二氯甲烷中、N,N-二甲基甲醯胺(亦稱為DMF)之攪拌溶液或二者之混合物中，添加HATU(1.0-2.0eq.)，然後再添加三乙胺(2.0-4.0eq.)或二異丙基乙胺(2.0-4.0eq.，又稱為Hunig鹼)。反應過程藉由LC-MS(或HPLC或TLC)監測；該反應通常在三小時內完成。在真空中移除溶劑。殘餘物藉由矽膠或逆相層析純化，或在一些情況中利用庚烷共沸三次，以少量乙酸乙酯稀釋，然後減量至矽或C18鍵結矽並經由矽膠或逆相層析純化。
D.其他化合物
其他用於本發明之化合物係描述於國際專利公開案WO/2013/072813並顯示於下。
本文所使用之化合物0131，或2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽(#118)具有下式：
本文所使用之化合物3377，或N,2-二甲基丙胺醯基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧基丁基}-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽(#115)具有下式：
本文所使用之化合物8261或2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(#69)具有下式：
實施例11 製備抗切口3抗體-藥物共軛體(ADC)
本發明之ADC的製備係利用具有用於與化學化合物結合之反應性位點之連接子的一部分，並導入具有用於連接抗體之反應性位點之連接子單位的另一部分。在一態樣中，該連接子單位具有一具有親電子基之反應性位點，該親電子基可與存在於抗體單位如抗體上之親核基反應。抗體上之可用親核基包括但不限於氫硫基、羥基及胺基。抗體之親核基的雜原子可與連接子單位上之親電子基反應，形成與連接子單位之共價鍵。連接子上之可用親電子基包括但不限於順丁烯二醯亞胺及鹵乙醯胺基。
該連接子單位具有一具有親核基之反應性位點，該親核基可與存在於抗體單位上之親電子基反應。在抗體上之親電子基提供用於連接連接子單位之方便位點。抗體上之可用親電子基包括但不限於醛及酮羰基。連接子單位之親核基的雜原子可與抗體上之親電子基反應，形成連接至該抗體之共價鍵。在連接子單位上可用之親核基包括但不限於醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡巴腙、羧酸肼及芳醯肼。
如本文中所使用，「mc-」亦稱為「MalC-」係指：
如本文中所使用，「vc-」亦稱為「mcValCitPABC-」或「MalCValCitPABC-」係指：
如本文中所使用，「me-」係指：
如本文中所使用，「MalPeg6C2-」係指如下所示之「MalPegXC2-」，其中X=6：
本發明之ADC之製備係藉由三(2-羧基乙基)膦(TCEP)部分還原該抗體，接著由經還原之半胱胺酸殘基與該所欲之順丁烯二醯亞胺端連接子-載荷藥物反應。特別是，該抗體經由添加約2.3至3.0倍莫耳過量之三(2-羧基乙基)膦(TCEP)於100mM HEPES(4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸緩衝液)pH 7.0及1mM二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)於37℃部分還原二小時。該所欲之連接子-載荷藥物接著被添加至該反應混合物，該連接子-載荷藥物/抗體之莫耳 比係約7至8，在15%體積比之二甲基乙醯胺(DMA)存在時於25℃再反應一小時。經1小時之培養期後，添加3倍過量之N-乙基順丁烯二醯亞胺以加蓋未反應之硫醇基，允許反應15分鐘，接著添加6倍過量之L-Cys以淬熄任何未反應之連接子-載荷藥物。該反應混合物係於磷酸緩衝鹽水(PBS)pH 7.4、4℃中隔夜透析，並經由SEC(AKTA explorer蛋白質純化儀，Superdex 200)純化。琥珀醯亞胺環之水解進一步經由在37℃培養該經純化之ADC於100mM硼酸鹽pH 9.2緩衝液中24至72小時達成。該環之打開經由液體層析電噴灑離子化串聯質譜分析(LC-ESI MS)監測，並經由大小排除層析(SEC)純化。該ADC接著利用SEC分析純度，以疏水交互作用層析(HIC)及液體層析電噴灑離子化串聯質譜(LC-ESI MS)計算藥物-抗體比(載荷量)。蛋白濃度係經由UV分光光度計測定。
vc0101(顯示經由半胱胺酸殘基與抗體X共軛)
vc6780(顯示經由半胱胺酸殘基與抗體X共軛)
人化抗切口抗體hu28及hu75，以及大鼠-人嵌合性抗切口抗體ch28及ch75係與表10提供之各種連接子-載荷藥物組合共軛。ADC及彼之元件係根據本發明之方法及根據國際專利公開號WO/2013/072813製備。
實施例12 抗切口3抗體及ADC之結合活性及專一性A.以細胞為基底之ELISA
在以細胞為基底之ELISA中，篩選未共軛之抗切口3 抗體、抗切口3 ADC及陰性對照抗體(huNeg8.8)對切口3表現性細胞系之細胞表面結合活性。過度表現切口3細胞系U2OS/hNotch3及內源性切口3表現性細胞系HCC2429及MDA-MB-468在ELISA試驗前一天分別以50,000、200,000及100,000細胞/孔被接種於96孔盤(白色不透明，BD/VWR)。在ELISA當天，移除孔槽中之培養基，施加經連續稀釋(1：3於含氯化鈣及氯化鎂(Ca/Mg)及1% BSA之DPBS中)之抗體及ADC溶液於孔盤。孔盤於室溫中培養2小時，之後以含Ca/Mg及1% BSA之DPBS清洗。經HRP共軛之二級抗體接著被施加及培養於細胞中1小時。孔盤先經含Ca/Mg及1% BSA之DPBS清洗，接著以Pico化學發光劑呈色套組(Thermal Scientific)呈色，按照廠商說明進行化學發光測量。資料作圖及分析係利用微軟Excel及Graphpad-Prism軟體進行。
表11顯示自二至四個細胞表面切口3結合ELISA獨立實驗所計算之EC50(nM)值及標準差(SD)，測試抗體包括未共軛之抗切口3抗體hu28及hu75和抗切口3 ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101及hu75-vc6780。該資料證實hu28-ADC及hu75-ADC在結合表現於U2OS/hNotch3、HCC2429及MDA-MB-468細胞之細胞表面上的全長人切口3方面，分別與未共軛之抗體hu28及hu75類似。另外，資料證實共軛各種連接子-載荷藥物至hu28及hu75抗體不會影響或改變其結合特徵。另外，資料證實hu28及hu28-vc0101和hu28-vc6780二者相較 於hu75及hu75-vc0101和hu75-vc6780對細胞表面切口3具有較高之結合能力，由彼等之較低EC50值可示。陰性對照(未共軛之huNeg8.8抗體)不與測試之任何細胞系結合。缺乏結合(LB)之對照抗體的EC50值如所示不會產生。(SD=標準差)
B.流式細胞分析
利用流式細胞分析檢測未共軛抗切口3抗體hu28及hu75與切口3表現性細胞系之細胞表面結合活性。螢光激活細胞分選(FACS)分析係根據標準程序進行。細胞以含有氯化鈣及氯化鎂之HBSS(以下稱為HBSS++)潤洗，利用不含EDTA之胰蛋白酶收集，並以含FBS之培養基中和。細胞與4μg/mL之抗切口3抗體hu28及hu75於含有3%熱失活小牛血清(HICS)之HBSS++中在冰上培養30分鐘。用冷的HBSS++、3% HICS緩衝液清洗細胞三次。細胞於10μg/mL之別藻藍蛋白共軛之AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fc片段二次抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)中，在暗室之冰上培養30分鐘。用冷的HBSS++/3% HICS緩衝液清洗細胞一次。將細胞重懸於HBSS++/3% HICS、25mM HEPES、1mM MgCl2及25μg/ml DNaseI中。添加7-胺基-放線菌素D(7-AAD)以排除非存活細胞。活細胞係於BD FACSCalibur流式細胞分析儀(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析。利用FlowJo流式細胞分析軟體(Ashland,OR)計算來自FL-4通道之平均螢光強度(MFI)。
表12顯示藉由FACS分析未共軛之抗切口3抗體hu28及hu75對一群切口3表現性細胞系之結合活性。U-2 OS細胞系被用來作為切口3陰性/低對照細胞系。hu28及hu75皆對U-2 OS具有低量結合，僅稍高於陰性對照huNeg8.8。另外，資料顯示hu28及hu75與切口3過度表現性細胞(U2OS/hNotch3及MDAMB468/hNotch3)及切口3內源性表現性細胞(MDA-MB-468、HCC2429及OVCAR3)專一性結合。另外，資料顯示hu28對所有切口3表現性細胞系的結合活性皆高於hu75，此結果類似在以細胞為基底之ELISA所觀察到之結合活性。
實施例13 試管內細胞毒性試驗
抗切口3 ADC之作用係於下列檢測：1)內源性表現切口3蛋白之細胞系：HCC2429(肺癌)、OVCAR3(卵巢癌)及MDA-MB-468(乳癌)，2)經建構以過度表現全長人切口3蛋白之細胞系：MDA-MB-468/hNotch3及U2OS/hNotch3，及3)陰性對照細胞系(SW900)，使用MTS細胞存活性試劑(Promega,Madison,WI)。這些細胞系與漸增濃度之包含與本發明之各種連接子-載荷藥物組合共軛之大鼠-人嵌合性抗切口3抗體(ch28及ch75)及人化抗切口3抗體(hu28及hu75)之抗切口3 ADC一起培養。作為抗切口3-ADC之專一性對照的非靶向性對照ADC(huNeg8.8-ADC或ch2H6-ADC)亦於該相同之細胞系上測試。經過四天後，檢測各培養之存活性。IC50值係藉由邏輯非線性回歸模式#203以XL fit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK)計算並以ng Ab/mL表示。也提供藥物抗體比率(DAR)。
表13顯示大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC處理之IC50(ng Ab/mL)值。對於分別重複2至4次之實驗，計算平均IC50值及該平均值之標準誤(S.E.M.)。資料顯示具有各種連接子-載荷藥物之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC在切口3表現性及過度表現性癌細胞系HCC2429、OVCAR3、MDA-MB-468、MDA-MB-468/hNotch3、U2OS/hNotch3中有活性且誘導細胞死亡。非靶向性對照ADC不是缺乏效 力(LP)因此如所示未提供IC50值，就是僅在測試最高劑量下具最小活性。具有與對照ADC之IC50值相等或較高之IC50值之抗切口3 ADC被視為在活體外缺乏效力並以LP表示。
表14顯示人化抗切口3 ADC處理之IC50(ng Ab/mL)值。HCC2429及MDA-MB-468/hNotch3細胞系具有二個個別重複。資料顯示具有各種連接子-載荷藥物之人化抗切口3 ADC在切口3表現性及過度表現性癌細胞系HCC2429、OVCAR3、MDA-MB-468、MDA-MB- 468/hNotch3、U2OS/hNotch3中有活性且誘導細胞死亡，但在缺乏切口3表現之陰性對照細胞系SW900則否。非靶向性對照ADC不是缺乏效力(LP)因此如所示未提供IC50值，就是僅在測試最高劑量下具最小活性。具有與對照ADC之IC50值相等或較高之IC50值之抗切口3 ADC被視為在活體外缺乏效力並以LP表示。未共軛之人化抗切口3抗體hu28及hu75不影響HCC2429或MDAMB468/hNotch3之存活性，顯示細胞毒性是因載荷藥物所致(資料未顯示)。
利用抑制切口3基因表現之siRNA來證實抗切口3 ADC之活體外細胞毒性依賴切口3蛋白之表現。siRNA轉染係利用ON-TARGET加SMART池人切口3(L-011093-00)、ON-TARGET加對照非靶向池(D-001810-10)(Thermo Scientific Dharmacon)及Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen)產製。2至2.5×106個HCC2429、OVCAR3及MDA-MB-468/hNotch3細胞在轉染前一天被接種於10cm培養皿中不含抗生素之生長培養基。隔天加入不含抗生素 之新鮮培養基。該siRNA及Lipofectamine RNAiMAX係經OPTI-MEM培養基稀釋，並按照廠商說明使用。各細胞系皆經對照及切口3 siRNA轉染。細胞與轉染混合物在潮濕、37℃、5% CO2培養箱中培養24小時。在24小時後，細胞經胰蛋白酶消化並接種以利用MTS細胞存活性試劑(Promega,Madison,WI)評估。
依細胞系而定，接著在處理前24小時以每孔2,500至5,000個細胞的密度接種細胞。細胞以3倍連續稀釋之人化抗切口3 ADC三重處理，共以10個濃度(範圍0-30μg Ab/ml)處理。相對細胞存活性係以未處理對照之百分比表示。IC50值係藉由邏輯非線性回歸模式#203以XL fit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK)計算並以ng Ab/mL表示。對於分別重複2次之實驗，計算平均IC50值及該平均值之標準誤(S.E.M.)。在自對照及切口3 siRNA處理之細胞製備之萃取物進行西方墨點分析，以證實抑制切口3基因表現發生於最多144小時(資料未顯示)。表現切口3(以下稱為對照siRNA)或在siRNA抑制基因表現之後減少切口3表現(以下稱為切口3 siRNA)之細胞系與漸增濃度之人化抗切口3 ADC一起培養。作為抗切口3 ADC之專一性對照的非靶向性對照ADC(huNeg8.8-ADC)亦於該相同之細胞系上測試。經過四天後，檢測各培養之存活性。IC50值係藉由邏輯非線性回歸模式#203以XL fit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK)計算並以ng Ab/mL表示。也提供藥物抗體比率(DAR)。
表15顯示人化抗切口3 ADC處理一群對照siRNA或切口3 siRNA處理之癌細胞系之IC50(ng Ab/mL)值。資料顯示具有各種連接子-載荷藥物之人化抗切口3 ADC對於切口3表現性癌細胞系(對照siRNA)具有活性且誘導細胞死亡。在siRNA抑制基因表現後減少切口3表現之細胞中(切口3 siRNA)的IC50值高於對照siRNA，顯示減少切口3之表現伴隨抗切口3 ADC之細胞毒性減少。對照ADC缺乏效力(LP)因此如所示未提供IC50值，或僅在測試最高劑量下具最小活性。資料另外顯示人化抗切口3 ADC專一性誘導切口3表現性及過度表現性癌細胞系之細胞死亡。該觀察到之細胞毒性依賴切口3之表現，因為在該相同細胞上以切口3 siRNA抑制基因表現，減少由抗切口3 ADC造成之細胞死亡。因此，人化抗切口3 ADC之活體外細胞毒性依賴切口3之表現。
實施例14 於活體外評估抗切口3 ADC之作用機轉 A.抗切口3 ADC之擾亂微管
在內化及在細胞內釋放該切口3-ADC之載荷藥物之後，假設該釋放之載荷藥物的作用機轉係擾亂細胞***所需之微管，藉以導致細胞週期停止、誘導細胞凋亡及細胞死亡。為了證實此作用機轉，OVCAR3卵巢癌細胞係經hu28-vc0101、huNeg8.8-vc0101(對照ADC)處理或未經處理，然後進行免疫螢光分析，藉由抗α-微管蛋白抗體染色以標示微管，以及磷酸化組蛋白H3抗體染色以識別進行細胞***或停止細胞***之細胞。
OVCAR3細胞係經接種於Lab Tec II 4室蓋玻片含蓋#1.5硼矽酸無菌玻片(Thermo Fisher Scientific Inc.)。隔天，細胞以1.0μg/ml之hu28-vc0101、對照huNeg8.8-vc0101處理或未經處理。經過48小時後，細胞以HBSS++清洗二次，並固定於4%多聚甲醛10分鐘。細胞以PBS清洗三次，並以0.5%氚核X-100進行通透化2分鐘。細胞經PBS清洗三次後，在室溫中以3% BSA/PBS固定30分鐘。細胞接著在室溫中以1：100之磷酸化組蛋白H3抗體(Ser10)(Cell Signaling)及2μg/ml之抗α-微管蛋白抗體(Millipore)於2%BSA/PBS中培養2小時。在2小時後，細胞以PBS清洗二次然後與1：500稀釋之山羊抗小鼠Alexa Fluor 488及山羊抗兔555抗體於室溫中培養45分鐘。細胞以PBS清洗二次，樣本在LSM710共軛焦顯微鏡(Zeiss)上成像。
如圖10所示，未經處理之OVCAR3細胞在細胞***之細胞週期中，會被磷酸化組蛋白H3抗體染色成陽性， 且包含由抗α-微管蛋白抗體染色所示之正常雙極性紡錘體。hu28-vc0101之處理(但非對照huNeg8.8-vc0101)會擾亂有絲***紡錘體之結構，如磷酸化組蛋白H3染色細胞中彼之異常形態學所示。該資料證實hu28-vc0101藉由在有絲***期間擾亂完整細胞***所需之微管以抑制細胞增生。
B.抗切口3 ADC誘導之細胞凋亡
胱冬酶3及胱冬酶7(胱冬酶3/7)蛋白酶是負責媒介哺乳動物細胞中之晚期細胞凋亡事件的計畫性細胞死亡程序之主要成員。胱冬酶3/7之活性係於以切口3 ADC處理之切口3表現性細胞系中測量。
OVCAR3、HCC2429及MDA-MB-468/hNotch3細胞被接種於白色不透明之組織培養板並培養隔夜。OVCAR3及HCC2429係以1.1μg/ml之hu28-vc0101及huNeg8.8-vc010(對照ADC)處理，MDA-MB-468/hNotch3細胞係以1μg/ml之hu28-vc0101及huNeg8.8-vc010(對照ADC)處理。在培養48小時後，細胞於室溫中以Caspase-Glo 3/7試劑(Promega #G8090)處理2小時。在冷光儀中測量發光，在減去背景值後，數值以相對發光單位報告。
表16顯示hu28-vc0101誘導切口3表現性細胞系MDA-MB-468/hNotch3、HCC2429及OVCAR3細胞中之胱冬酶3/7的活性，其活性為經對照Neg8.8-vc0101處理之 細胞的2至3倍。因此，hu28-vc0101藉由誘導細胞凋亡而抑制細胞生長。
實施例15 切口3免疫組織化學
抗切口3 ADC之作用係於臨床前模型評估，該模型於異種移植之人腫瘤細胞的細胞膜上具有可檢測之切口3的表現量。為了識別表現切口3之臨床前模型，在一群異種移植模型上進行使用抗切口3抗體之免疫組織化學分析(以下稱為「IHC」)，包括：37622A1 NSCLC(源自病患)、HCC2429肺癌、MDA-MB-468乳癌及N87胃癌異種移植模型。
源自各異種移植之組織片段係利用標準組織學程序經福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)。切出5微米之FFPE切片，進行脫蠟及蒸餾水水合。在壓力鍋、pH 8.0之EDTA緩衝液中修復抗原。內源性過氧化酶係利用3.0% H2O2封閉10分鐘。切片與DAKO蛋白質封片液培養20分鐘。1：2000稀釋之兔抗切口3(D11B8；Cell Signaling Technologies)在室溫中被施用於切片上1小時。Signalstain Boost抗兔IgG-HRP聚合物(Cell Signaling Technologies)於室溫中被施加於切片上30分鐘。DAB被用來顯色5分鐘。切片經Mayer’s蘇木精快速對比染色、脫水、清潔及蓋上蓋玻片。表17顯示以0至4之量表評分之染色強度及染色分布分級，0表示陰性，4表示最高強度。
如表18所示，切口3蛋白係於來自37622A1 NSCLC、HCC2429、MDA-MB-468及N87異種移植之細胞的細胞膜上(Mem)及細胞質中(Cyto)及/或細胞核中(Nuc)被檢測。該資料顯示HCC2429及N87兩種異種移植的切口3蛋白均勻分布於76至100%之細胞的細胞膜上。另外，該資料顯示37622A1 NSCLC及MDA-MB-468異種移植的切口3蛋白異質性地分布於51至75%之細胞的細胞膜上。另外，D11B8抗體在若干上皮腫瘤細胞之細胞核中檢測到切口3C端細胞內結構域，顯示這些細胞中的切口3傳訊活躍。
如圖11所示，西方墨點分析證實被用於活體內療效試驗之異種移植中的切口3表現量。胞外域之大約210kDa的切口3蛋白片段(以下稱為切口3-ECD)係於HCC2429、MDA-MB-468、N87及37622A1異種移植萃取物中利用小鼠單株抗切口3抗體1G5(Abnova)檢測。因此，使用抗切口3抗體D11B8之IHC的資料顯示切口3位於人上皮腫瘤細胞之細胞膜，使用抗切口3抗體1G5之西方墨點分析顯示包含NRR結構域(抗切口3 ADC之標靶)的切口3-ECD之表現。
實施例16 活體內腫瘤異種移植模型
人化抗切口3抗體(hu28及hu75)和大鼠-人嵌合性抗切口3抗體(ch28及ch75)係與各種連接子-載荷藥物組合共軛，並於37622A1非小細胞肺癌(NSCLC)、HCC2429肺癌、MDA-MB-468乳癌及N87胃癌異種移植模型中測試。在以下所述之每個模型中，第一劑皆於第0天給予。每周至少測量一次腫瘤，彼等之體積係以下式計 算：腫瘤體積(mm3)=0.5×(腫瘤寬度2)(腫瘤長度)。各治療組之平均腫瘤體積(±S.E.M.)係由包括最多10隻動物，最少6隻動物加以計算。
A.37622A1病患衍生性NSCLC異種移植
於免疫不全小鼠中檢測抗切口3 ADC對於人腫瘤異種移植之活體內生長之效應，該異種移植係自根據適當受試者同意程序(Asterand)獲得之新鮮切除之37622A1 NSCLC腫瘤之片段建立。該37622A1 NSCLC病患衍生性異種移植係於活體內皮下繼代，以片段形式於母裸鼠(Nu/Nu)間繼代。當腫瘤到達150至300mm3之體積時，它們被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。37622A1 NSCLC病患衍生性異種移植模型經靜脈投藥每四天四次(Q4dx4)，按表19提供之劑量投予PBS載劑、人化抗切口3 ADC、對照huNeg-8.8 ADC及順鉑(cisplatin)。圖12顯示表19之資料，具有vc0101連接子-載荷藥物之ADC以3mg/kg劑量投予與順鉑(5mg/kg)及PBS載體之比較。
順鉑係用於治療癌之以鉑為基底之抗癌劑，其被視為標準照顧療法。順鉑與DNA交聯，藉以誘發細胞凋亡及細胞生長抑制。該資料顯示抗切口3 ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101及hu75-vc6780抑制37622A1 NSCLC病患衍生性異種移植腫瘤之生長。3mg/kg劑量之hu28-vc0101為此試驗中測試之最有效的ADC，到第84 天，仍在試驗中的9隻動物中有4隻維持無腫瘤。另外，該資料顯示抗切口3 ADC相較於對照huNeg8.8-ADC更有效地抑制腫瘤生長。另外，資料顯示抗切口3 ADC相較於順鉑更有效地抑制腫瘤生長，表示相較於以鉑為基底之標準照顧化學治療藥物具有更高效力(圖12)。
B.HCC2429肺異種移植
類似之活體內實驗係如上述以HCC2429肺癌細胞系進行。為了產製異種移植物，母裸鼠(Nu/Nu)係經3.5×106 HCC2429細胞於50%基質膠(BD Biosciences)之皮下植入。當腫瘤到達200至400mm3之體積時，該腫瘤被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。HCC2429肺模型經靜脈投藥每四天四次(Q4dx4)，按表20及21所提供之劑量投予PBS載劑、人化抗切口3 ADC及對照huNeg-8.8 ADC。該資料顯示抗切口3 ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101及hu75-vc6780以劑量依賴性方式抑制HCC2429肺異種移植腫瘤之生長。另外，該資料顯示具有vc0101連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC在1及3mg/kg之劑量時以及具有vc6780連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC在3及10mg/kg之劑量時相較於對照huNeg8.8-ADC更有效地抑制腫瘤生長。另外，該資料顯示3mg/kg劑量之hu28-vc0101比10mg/kg劑量之hu28-vc6780更有效。
該HCC2429肺模型亦經靜脈投藥每四天四次，按圖16A所提供之5mg/kg劑量投予PBS載劑、大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC及對照huNeg-8.8 ADC。該資料顯示具有不可切割(mc)及可切割(vc)連接子與各種載荷藥物組合之抗切口3 ADC抑制HCC2429肺癌異種移植之生長。另外，該資料顯示大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC相較於對照huNeg8.8-ADC更有效地抑制腫瘤生長。另外，該資料顯 示具有vc0101連接子-載荷藥物之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC比其他測試之抗切口3 ADC更為有效。
其他活體內實驗利用HCC2429肺癌細胞系進行，使用未共軛之大鼠-人嵌合性抗切口3抗體ch75-hIgG1，以決定ch75-hIgG1之切口3傳訊抑制是否導致觀察到之抗切口3 hu75-ADC之效力。為了產製異種移植物，母裸鼠(Nu/Nu)係經3.5×106 HCC2429細胞於50%基質膠(BD Biosciences)之皮下植入。當腫瘤到達75至200mm3之體積時，該腫瘤被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。
該HCC2429肺癌模型係經靜脈投藥每四天四次，按表22所提供之劑量投予PBS載劑、大鼠-人嵌合性抗切口3抗體ch75-hIgG1及人化抗切口1抗體hu438 VH1.1/VL1.8。各處理組有8隻動物，平均腫瘤質量(±SEM)係經計算並與對照PBS載劑組比較。基於變異數分析(ANOVA)之P值係經計算，以決定觀察到之抗切口治療相較於對照PBS之生長抑制的統計顯著性，使用Excel內建之統計功能。藥物處理相較於載劑處理小鼠之生長抑制百分比(%)之值係自試驗最後一天的測量值計算，並以下式計算：100*{1-[(處理第14天-處理第0天)/(對照第14天-對照第0天)]}。
該資料顯示抗切口1人化抗體hu438 VH1.1/VL1.8抑制57%之腫瘤生長，未共軛之大鼠-人嵌合性抗切口3抗體ch75-hIgG1相較於PBS載劑處理腫瘤不抑制腫瘤生 長。另外，資料顯示表20、21及圖16A報告之由ch75抗體產製之切口3 ADC於HCC2429異種移植觀察到之腫瘤生長抑制不是因為傳訊抑制。
C.MDA-MB-468乳癌異種移植
類似之活體內實驗係如上述以MDA-MB-468乳癌細胞系進行。MDA-MB-468細胞被歸類為三陰性乳癌(TNBC)基底樣亞型，因為它們不表現***受體、助孕素受體及人表皮生長因子受體2(HER2)(Lehmann,BD,et al,J Clin Invest.2011；121(7)：2750-2767)。為了產製異種移植物，SCID無毛遠交系(SHO)母鼠於乳腺脂肪墊原位植入含50%基質膠(BD Biosciences)之10×106 MDA-MB-468細胞。當腫瘤到達250至450mm3之體積時，該腫瘤被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。該MDA-MB-468乳癌模型經靜脈投藥每四天四次，按表23及24所提供之劑量投予PBS載劑、人化抗切口3 ADC及對照huNeg-8.8 ADC。圖13A及13B顯示來自表23中具有vc0101連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC與對照 huNeg-8.8 ADC及PBS載劑之比較資料。圖14A及14B顯示來自表24中具有vc6780連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC與對照huNeg-8.8 ADC及PBS載劑之比較資料。
該資料顯示抗切口3 ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101及hu75-vc6780以劑量依賴性方式抑制MDA-MB-468乳癌異種移植腫瘤之生長。另外，該資料顯示具有vc0101連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC在1及3mg/kg之劑量時以及具有vc6780連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC在1、3及10mg/kg之劑量時相較於對照huNeg8.8-ADC更有效地抑制腫瘤生長。另外，該資料顯示1mg/kg劑量之具有vc0101連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC比3mg/kg劑量之具有vc6780連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC更有效。
該MDA-MB-468乳癌模型亦經靜脈投藥每四天四次，按圖16B及16C所提供之5mg/kg之劑量投予PBS載劑、大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC及對照huNeg-8.8 ADC。該資料顯示具有不可切割(mc)及可切割(vc)連接子與各種載荷藥物組合之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC抑制MDA-MB-468乳癌異種移植之生長。另外，該資料顯示大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC相較於對照huNeg8.8-ADC更有效地抑制腫瘤生長。另外，該資料顯示具有vc0101連接子-載荷藥物之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC比其他測試之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC更為有效。
該MDA-MB-468乳癌模型係用於檢測hu28-vc0101於活體內之作用機轉。hu28-vc0101之藥效動力學係於細胞層面藉由染色ADC處理之異種移植中之有絲***標記磷酸化組蛋白H3看見。在細胞週期之有絲***期間，染色質內之組蛋白H3的Ser-10殘基係經磷酸化(以下稱為「pHH3」)。
荷有MDA-MB-468乳癌異種移植之小鼠係經靜脈給予單一3mg/kg劑量之抗切口3 ADC hu28-vc0101、huNeg-8.8-vc0101(對照ADC)或PBS。三個異種移植係於6、24及96小時後收集，並經標準免疫組織化學處理。5微米厚之經福馬林固定、石蠟包埋之組織切片係於二甲苯替代劑中脫蠟，利用梯度醇復水化至蒸餾水。為了要暴露出抗原性部位，組織切片於壓力鍋(Retriever；Electron Microscopy Sciences)中之10mM檸檬酸鹽緩衝液 pH 6.0(Labvision)中加熱，冷卻至室溫。內源性過氧化酶活性係以3%過氧化氫失活15分鐘。非專一性蛋白交互反應藉由與UV阻斷劑(Labvision)培養10分鐘封閉。組織切片係與抗pHH3抗體培養1小時，利用Signalstain Boost試劑(8114,Cell Signaling Technologies)檢測30分鐘，並以DAB+(DAKO)發色5分鐘。所有切片皆以蘇木精QS(Vector Laboratories)對比染色，以自來水沖洗，用梯度醇脫水，於二甲苯替代劑中透明化，並以Permount封片膠(FisherChemicals,Fair Lawn,NJ)封片。
經免疫組織化學染色之切片藉由影像分析評估。切片係利用Hamamatsu NanoZoomer自動化切片掃描儀以20倍成像。一經數位化後，該虛擬切片利用Definiens Tissue Studio軟體分析。各異種移植切片按區分段，根據細胞性及形態學分類。各細胞核係於異種移植之存活區域內被識別，陽性係利用各細胞核之平均棕色色原體強度測定。資料以pHH3陽性百分比(%)呈現，利用下式計算：(pHH3陽性細胞核之數量(存活區域)/細胞核總數量(存活區域))*100。決定各治療組及時間點相對於PBS對照組於24小時時間點之統計顯著性，利用Graph Pad Prism使用雙尾T檢定測定。
利用微管抑制劑如hu28-vc0101產製之ADC被預期可使增生性細胞停止在染色質內之組蛋白H3的Ser-10殘基被磷酸化之細胞週期之有絲***期。在ADC處理之異種移植物中累積pHH3染色顯示癌細胞被停止於有絲分 裂。表25包含抗切口3 hu28-vc0101及huNeg-8.8-vc0101(對照ADC)處理之MDA-MB-468異種移植及未處理之MDA-MB-468異種移植中pHH3染色細胞之百分比。該資料顯示hu28-vc0101(但非對照huNeg8.8-vc0101)相較於PBS對照組，導致pHH3染色細胞核之百分比於處理後24及96小時之MDA-MD-468癌細胞中呈現統計顯著之2倍增加。該資料顯示抗切口3 hu28-vc0101抑制活體內腫瘤生長，至少部分是藉由使細胞停止於細胞週期之有絲***期，因而抑制增生。
D.N87胃癌異種移植
類似之活體內實驗係如上述以N87胃癌細胞系進行。為了產製異種移植物，母裸鼠(Nu/Nu)係經8×106 N87細胞於50%基質膠(BD Biosciences)之皮下植入。當腫瘤到達250至450mm3之體積時，該腫瘤被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。該N87胃癌模型經靜脈投藥每四天四次，按表26及27所提供之劑量投予PBS載劑、人化抗切口3 ADC、對照huNeg-8.8 ADC及順鉑(cisplatin)。該資料顯示抗切口3 ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101及hu75-vc6780以劑量依賴性 方式抑制N87胃癌異種移植腫瘤之生長。另外，該資料顯示具有vc0101連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC在1、3及5mg/kg之劑量時以及具有vc6780連接子-載荷藥物之抗切口3 ADC在3及10mg/kg之劑量時相較於對照huNeg8.8-ADC更有效地抑制腫瘤生長。到第133天，該hu28-vc0101之5mg/kg劑量組的9隻動物中有6隻無腫瘤，hu75-vc0101組的9隻動物中的4隻以及對照huNeg8-8-vc0101組的8隻動物中的1隻無腫瘤。另外，該資料顯示vc0101連接子-載荷藥物之ADC一般來說比順鉑標準照顧療法及vc6780連接子-載荷藥物之ADC更有效。
該N87胃癌模型亦經靜脈投藥每四天四次，按圖16D所提供之5mg/kg劑量投予PBS載劑、大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC及對照huNeg-8.8 ADC。該資料顯示具有不可切割(mc)及可切割(vc)連接子與各種載荷藥物組合之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC抑制N87胃癌異種移植之生長。另 外，該資料顯示大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC相較於對照huNeg8.8-ADC更有效地抑制腫瘤生長。另外，該資料顯示具有vc0101連接子-載荷藥物之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC比其他測試之抗切口3 ADC更為有效。
該N87胃癌模型亦經靜脈投藥每四天四次，按圖16E所提供之5mg/kg之劑量投予PBS載劑及大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC ch28-mc0131、ch75-mc0131、ch28-m(H2O)c-0131及ch75-m(H2O)c-0131。該資料顯示具有mc0131及m(H2O)c-0131連接子-載荷藥物之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC抑制N87胃癌異種移植之生長。另外，該資料顯示具有m(H2O)c-0131連接子-載荷藥物之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC比具有mc0131連接子-載荷藥物之大鼠-人嵌合性抗切口3 ADC更為有效。
E.OVCAR3卵巢異種移植
類似之活體內實驗係如上述以OVCAR3卵巢癌細胞系進行。為了產製異種移植物，SCID無毛遠交系(SHO)母鼠係經5×106 OVCAR3細胞於50%基質膠(BD Biosciences)之皮下植入。當腫瘤到達120至290mm3之體積時，該腫瘤被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。該OVCAR3模型係經靜脈投藥每四天四次，按表28所提供之劑量投予PBS載劑、人化抗切口3 ADC hu28-vc0101及對照ADC huNeg-8.8-vc0101；並經腹腔內投藥每七天四次投予太平洋紫杉醇(paclitaxel)(30 mg/kg一天二次)及每七天八次投予卡鉑(carboplatin)。圖15及表28顯示hu28-vc0101以劑量依賴方式抑制OVCAR3卵巢異種移植之生長。另外，該資料顯示hu28-vc0101相較於對照huNeg8.8-vc0101及卡鉑標準照顧化學療法更有效地抑制腫瘤生長。另外，該資料顯示以3mg/kg每四天四次投予之hu28-vc0101和以60mg/kg每七天四次投予(此為SHO小鼠之paclitaxel最大耐受劑量)之paclitaxel具有類似效力。
實施例17 產製半胱胺酸突變物以用於定點共軛
在先前實施例中描述之抗切口3 ADC係經由習用、非特定之連接子-載荷藥物與標靶抗體之半胱胺酸胺基酸殘基共軛產製。進行定點共軛連接子-載荷藥物至抗體可利於均質藥物載荷且避免可能改變抗原結合性或藥物動力學性質之ADC亞群，此可能見於若干由習用共軛方法產製之ADC。一項該種定點共軛策略係經設計以在該標靶抗體之胺基酸序列的特定位點導入半胱胺酸殘基。在重鏈恆定區及輕鏈恆定區的一些胺基酸位置係經識別(如國際公開號WO/2013/093809所述)，以半胱胺酸殘基取代hu28抗體中之特定胺基酸位置。
定點半胱胺酸取代係經建構至Fc多肽或人IgG1重鏈恆定結構域(Cy)之位置L443及K392(以下稱為L443C及K392C)。定點半胱胺酸取代係經建構至人kappa(κ)輕鏈恆定結構域(Cκ)多肽之位置K183(以下稱為κK183C)。半胱胺酸突變體之CDR維持與親代野生型hu28之CDR相同。圖17A及17B提供具有所述之定點半胱胺酸取代之hu28抗體的胺基酸及核苷酸序列。在該hu28抗體中之半胱胺酸取代導致產製下列抗體：hu28-(L443C)、hu28-(L443C/K392C)及hu28-(L443C/κK183C)。所有半胱胺酸突變係藉由定點突變形成建構，如國際專利公開號WO/2013/093809所述。這些突變抗體之表現建構體係於定點嵌入(SSI)表現載體(Lonza)中產製以於CHO細 胞穩定表現。建立表現該半胱胺酸突變抗體之經轉染之CHO細胞的穩定池，並產製條件培養基。採用標準蛋白A親和性純化然後進行大小排除層析，以自條件培養基純化抗切口3半胱胺酸突變抗體，如先前實施例所述。
實施例18 特徵化半胱胺酸突變體
在以細胞為基底之ELISA中，篩選未共軛之半胱胺酸突變人化抗切口3抗體與切口3表現性細胞系之細胞表面結合活性，如先前實施例所述。表29顯示自細胞表面切口3結合ELISA計算得到未共軛半胱胺酸突變體hu28-(L443C)、hu28-(L443/K382)及hu28-(L443/κK183C)之EC50(nM)值。該資料顯示半胱胺酸突變抗體在結合U2OS/hNotch3、HCC2429及OVCAR3細胞之細胞表面上所表現的全長人切口3方面，具有類似親代野生型hu28抗體之EC50值。另外，該資料顯示以半胱胺酸胺基酸取代至人化hu28抗體之重鏈或重鏈及輕鏈二者的恆定區不會影響或改變它們的結合特性。陰性對照之huNeg8.8抗體不與測試之任何細胞系結合。缺乏結合(LB)之對照抗體的EC50值如所示不會產生。
實施例19 半胱胺酸突變ADC之活體外細胞毒性試驗
順丁烯二醯亞胺官能化連接子-載荷藥物與該抗切口3hu28半胱胺酸突變抗體之共軛，係經由以100倍莫耳過量之三(2-羧基乙基)膦(TCEP)於100mM之4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸緩衝液(HEPES)pH 7.0及1mM二伸乙三胺五乙酸(DTPA)中於37℃完全還原抗體2小時，然後去鹽以除去多餘TCEP達成。該經還原之抗體於2mM去氫抗壞血酸(DHA)、100mM HEPES pH 7.0及1mM DTPA中於4℃培養16小時以重新形成鏈間雙硫鍵。在去鹽後，該vc0101連接子-載荷藥物被添加至該反應混合物，該連接子-載荷藥物/抗體之莫耳比約為7，在15%體積比之二甲基乙醯胺(DMA)存在時於25℃再反應1小時。經過1小時之培養期後，6倍過量之L-Cys被添加以淬熄任何未反應之連接子-載荷藥物。該反應混合物係於磷酸緩衝鹽水(PBS)pH 7.4、4℃中隔夜透析，並經由SEC(AKTA explorer蛋白質純化儀，Superdex 200)純化。該ADC接著利用SEC分析純度，以疏水交互作用層析(HIC)及液體 層析電噴灑離子化串聯質譜(LC-ESI MS)計算藥物-抗體比(載荷量)。蛋白濃度係經由UV分光光度計測定。其他共軛技術係於國際專利公開號WO/2013/093809中描述。
此過程產製抗切口3半胱胺酸突變ADC：hu28-(L443C)-vc0101及hu28-(L443C/κK183C)-vc0101。抗切口3半胱胺酸突變ADC之活性係於內源性表現切口3蛋白之細胞系：HCC2429(肺癌)及OVCAR3(卵巢癌)檢測，使用如前實施例所述之MTS細胞存活試劑
表30顯示抗切口3半胱胺酸突變ADC處理之IC50(ng Ab/mL)值。該資料顯示DAR=3.9之hu28-(L443C/κK183C)-vc0101具有活性，和DAR=3.9之野生型hu28-vc0101 ADC具有類似效力，且兩者皆能誘導切口3表現性癌細胞系HCC2429及OVCAR3之細胞死亡。該資料進一步顯示DAR=2之單一半胱胺酸突變hu28-(L443)-vc0101及DAR=4之非靶向性對照huNeg8.8 ADC在測試之最高劑量時僅具最小活性。
實施例20 半胱胺酸突變ADC之活體內療效
類似之活體內實驗系如前實施例所述以抗切口3半胱胺酸突變ADC使用OVCAR3卵巢細胞系進行。該OVCAR3模型係經靜脈投藥每四天四次，按表31所提供之劑量投予PBS載劑、hu28-vc0101、抗hu28-(L443C)-vc0101、hu28-(L443C/κK183C)-vc0101及對照huNeg-8.8 ADC。該資料顯示半胱胺酸二突變體hu28-(L443C/κK183C)-vc0101抑制OVCAR3卵巢異種移植之生長，該活性在3mg/kg劑量時類似野生型hu28-vc0101，但在1mg/kg劑量時則較低。該資料進一步顯示DAR=2之半胱胺酸單突變體hu28-(L443C)-vc0101在活體內有效，但1mg/kg及3mg/kg兩種劑量相較於野生型hu28-vc0101及hu28-(L443C/κK183C)-vc0101的效力皆較低。該資料顯示藉由定點共軛產製之抗切口3半胱胺酸突變ADC能有效抑制活體內腫瘤生長。
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<223> 合成肽序列
<400> 67
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 68

Claims (45)

  1. 一種與切口3(Notch3)結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：13之CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區。
  2. 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段：(a)經內化至細胞中，(b)不抑制切口3傳訊，或(c)不活化切口3傳訊。
  3. 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段：(a)與切口3負調節區(NRR)之LNR-C及HD-1結構域結合，(b)不維持該切口3 NRR之自我抑制構形，或(c)不抑制S2切割。
  4. 一種與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含：(a)包含SEQ ID NO：15或16之重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：19或20之重鏈CDR2；(c)包含SEQ ID NO：23之重鏈CDR3；(d)包含SEQ ID NO：27之輕鏈CDR1；(e)包含SEQ ID NO：29之輕鏈CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：31之輕鏈CDR3。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：13具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列或與SEQ ID NO：25具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第5項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：13之重鏈可變區胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第5或6項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：25之輕鏈可變區胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：33之重鏈胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：35之輕鏈胺基酸序列。
  10. 一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：37之CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：49之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區。
  11. 一種與切口3結合之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含：(a)包含SEQ ID NO：39或40之重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：43或44之重鏈CDR2； (c)包含SEQ ID NO：47之重鏈CDR3；(d)包含SEQ ID NO：51之輕鏈CDR1；(e)包含SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：55之輕鏈CDR3。
  12. 如申請專利範圍第10或11項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：37具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列或與SEQ ID NO：49具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。
  13. 如申請專利範圍第12項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：37之重鏈可變區胺基酸序列。
  14. 如申請專利範圍第12或13項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：49之輕鏈可變區胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第10至14項中任一項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：57之重鏈胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第10至15項中任一項之經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：59之輕鏈胺基酸序列。
  17. 一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其與如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體競爭與切口3之結合及/或與如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體所結合至切口3之相同表位結合。
  18. 一種抗體-藥物共軛體，其包含與如申請專利範圍第1至17項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段共軛之細胞毒性劑。
  19. 一種下式之抗體-藥物共軛體：Ab-(L-D)p或彼之醫藥上可接受之鹽，其中(a)Ab係與切口3結合之抗體或彼之抗原結合片段；(b)L-D係連接子-藥物基團，其中L係連接子，且D係藥物；且(c)p為1至約12的整數。
  20. 一種下式之抗體-藥物共軛體：Ab-(L-D)p或彼之醫藥上可接受之鹽，其中(a)Ab係如申請專利範圍第1至17項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段；(b)L-D係連接子-藥物基團，其中L係連接子，且D係藥物；且(c)p為1至約12的整數。
  21. 申請專利範圍第19或20項之抗體-藥物共軛體，其中L係選自vc、mc、me或MalPeg6C2。
  22. 如申請專利範圍第21項之抗體-藥物共軛體，其中D係選自：(a)0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯 基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)，(b)6780(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)，(c)0131(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽)，(d)3377(N,2-二甲基丙胺醯基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧基丁基}-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽)，及(e)8261(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)。
  23. 如申請專利範圍第22項之抗體-藥物共軛體，其中L-D係選自：具有下式之vc0101： 及具有下式之vc6780：
  24. 如申請專利範圍第19至23項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO：13之CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區；及(b)包含SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區。
  25. 如申請專利範圍第19至24項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO：15之重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：19之重鏈CDR2；(c)包含SEQ ID NO：23之重鏈CDR3；(d)包含SEQ ID NO：27之輕鏈CDR1；(e)包含SEQ ID NO：29之輕鏈CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：31之輕鏈CDR3。
  26. 如申請專利範圍第19至23項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO：37之CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區；及(b)包含SEQ ID NO：49之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區。
  27. 如申請專利範圍第19至23或26項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO：39之重鏈CDR1；(b)包含SEQ ID NO：43之重鏈CDR2；(c)包含SEQ ID NO：47之重鏈CDR3；(d)包含SEQ ID NO：51之輕鏈CDR1；(e)包含SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：55之輕鏈CDR3。
  28. 如申請專利範圍第19至25項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中Ab包含選自下列之經建構之人IgG1重鏈恆定結構域(Cy)多肽：(a)如SEQ ID NO：61所示在位置L443具有一個胺基酸取代及(b)如SEQ ID NO：65所示在位置L443及K392具有二個胺基酸取代，該位置編號跟據卡巴(Kabat)之EU指數。
  29. 如申請專利範圍第19至25項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中Ab包含經建構之人κ輕鏈恆定結構域(CK)多肽，其如SEQ ID NO：63所示在位置κK183具有一個胺基酸取代，該位置編號跟據卡巴(Kabat)之EU指數。
  30. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至17項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段或如申請專利範圍第18至29項中任一項之抗體-藥物共軛體及醫藥上可接受之載劑。
  31. 一種於需要治療之病患治療與切口3表現有關之症狀之方法，該方法包含對該病患投予如申請專利範圍第18至29項中任一項之抗體-藥物共軛體或如申請專利範 圍第30項之醫藥組成物。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該症狀係癌。
  33. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該癌係實質腫瘤之癌。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該實質腫瘤之癌係選自肺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸癌、膀胱癌、肝癌、皮膚癌及肉瘤。
  35. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該癌係選自T細胞惡性病(T-cell malignancies)、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴胚細胞性白血病、多發性骨髓瘤、B細胞惡性病(B-cell malignancies)、骨髓性惡性病(myeloid malignancies)、急性骨髓性白血病及慢性骨髓性白血病之血癌。
  36. 如申請專利範圍第18至29項中任一項之抗體-藥物共軛體或如申請專利範圍第28項之醫藥組成物，其係用於治療。
  37. 一種如申請專利範圍第18至29項中任一項之抗體-藥物共軛體於製造供治療的藥物之用途。
  38. 如申請專利範圍第36或37項之用途，其中該用途係供治療切口3表現性癌。
  39. 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1至17項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段。
  40. 一種載體，其包含如申請專利範圍第39項之核 酸。
  41. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第40項之載體。
  42. 一種用於產製抗體之方法，其包含培養如申請專利範圍第41項之宿主細胞及自該培養回收該抗體。
  43. 一種用於產製如申請專利範圍第19至29項中任一項之抗體-藥物共軛體之方法，該方法包含：(a)連接L與D；(b)使該L-D與自如申請專利範圍第42項之培養所回收之抗體共軛；及(c)純化該抗體-藥物共軛體。
  44. 一種用於預測罹癌個體是否對如申請專利範圍第18至29項中任一項之抗體-藥物共軛體有反應之方法，該方法包含測定來自該個體之生物樣本是否表現切口3。
  45. 一種測定生物樣本中之切口3的量之方法，該方法包含下列步驟：(a)使來自疑似罹癌之個體的樣本與如申請專利範圍第1至17項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段接觸；(b)測定該樣本中之細胞表面的切口3之量；及(c)比較該細胞表面的切口3之量與參考個體或標準物之該量。
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