TW201418459A - 芽孢桿菌屬所屬之菌株、微生物製劑及植物的栽培方法 - Google Patents

Abstract

本發明是關於從自然界單離的芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)的AT-332菌株(日本之寄存號碼為NITE BP-1095，台灣之寄存號碼為BCRC 910571)及AT-79菌株(日本之寄存號碼為NITE BP-1094，台灣之寄存號碼為BCRC 910570)，以及含有該等菌株做為有效菌的植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑。芽孢桿菌屬品種之AT-332菌株及AT-79菌株是藉由使含有其二次代謝物的培養物或其培養分離生菌體存在於植物體上或其栽培土壤中，而對廣範圍的各種植物病害與線蟲害雙方的防除為有效，並且可促進有用植物的成長。

Description

芽孢桿菌屬所屬之菌株、微生物製劑及植物的栽培方法

本發明是關於對植物病害防除、線蟲防除及植物成長促進為有用的新穎微生物。更詳細而言，是關於相較於文獻所揭示的近親的液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)所屬的微生物，而顯示更格外優異的植物病害防除作用、線蟲防除作用及/或植物成長促進作用的效果的新穎微生物的芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-332菌株及芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-79菌株，以及使用此等微生物之菌體及培養物的植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑。

主要的植物病害及線蟲的防除方法是使用化學農藥的方法，到現在為止，化學農藥使作物的安定生產成為可能。但是，近年來，因化學農藥的連續使用而有對環境造成影響及使抗藥性菌出現等之情形，現有的化學農藥難以做充分的防除，細菌性病害等難防除病害的問題逐漸變大。於是，關於化學農藥以外的防除方法，係以使用從自然界分離之微生物的生物性防除技術受到注意，已有幾種微生物農藥被製品化。但是，現有的微生物農藥在 與化學農藥相比較時，有效果不安定、或適用病害少的缺點。基於這種狀況，而期望開發出具有新的適用病害且顯示安定的防除效果的新穎微生物農藥。

就使用微生物的植物病害防除劑而言，已有大孢青黴菌(Talaromyces flavus)劑、螢光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)劑、非病原性軟腐病菌(Erwinia carotovora)劑、深綠木黴菌(Trichoderma atroviride)劑、簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)劑、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)劑等被註冊為微生物農藥而被使用。

就使用微生物的線蟲防除劑而言，已有穿刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria penetrans)劑、瘤捕單頂孢菌(Monacrosporium phymatophagum)劑被註冊為微生物農藥而被使用。

日本專利第2955655號說明書(專利文獻1)中，已揭示使用液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)所屬細菌的植物病害防除劑。此植物病害防除劑的有效成分是微生物的生產物，細菌本身則並未被當做農藥使用。又，其防除對象是由絲狀真菌所引起的病害，而沒有記載對由細菌所引起的病害的防除。又，日本特開2009-247302號公報(專利文獻2)中，雖揭示可將絲狀真菌性病害與細菌性病害同時防除且生菌體本體為有效的微生物農藥，但並未記載關於線蟲的防除。

日本專利第3471815號說明書(專利文獻3，WO98/050422)中，雖揭示使用可利用於廣範圍的植物病害且對玉米根蟲(corn rootworm)為有效的芽孢桿菌屬細菌之植物病害防除劑，但並未記載關於線蟲的防除。又，日本專利第4071036號說明書(專利文獻4，US2004/265292)中，雖揭示可利用於植物病害防除與害蟲防除 的芽孢桿菌屬品種D747株，但並未記載關於線蟲的防除。

日本專利第3471811號說明書(專利文獻5，WO96/032840)中，已揭示使用芽孢桿菌屬細菌的線蟲防除劑。此線蟲防除劑的有效成分是具有抗線蟲活性的堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)株的細菌或孢子，但並未記載關於植物病害防除。又，日本專利第4359653號說明書(專利文獻6，WO1997/012980)中揭示以由蘇力菌(Bacillus thuringiensis)的新穎株所產生的抗線蟲性毒素而控制線蟲的方法，但並未記載關於植物病害防除。

另一方面，在農業上，化學肥料是對作物收量造成影響的重要的農業資材，但所使用的化學肥料成分有30至50%未被作物利用而擴散到環境中，成為河川的優養化、地下水的水質汚染等的原因。又，化學肥料的生產係使用多量的化石燃料，而與化石燃料的漲價互應，使化學肥料的成本也提高。再者，屬於氮肥料分解物的氮氧化物(NO_x)被認為有二氧化碳的約300倍的溫室效果，對地球溫暖化的顧慮也逐漸成為問題。又，預料今後會因世界性的人口増加而有糧食不足之情形，用於提高作物生產性的資材的使用是不可或缺的，故用以代替現有化學肥料且更環保的資材的必要性係提高。

對照這樣的狀況，利用土壤微生物而提高農作物收量的研究主要是針對根瘤菌屬細菌(根瘤菌)、假單孢菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌而在廣範圍進行，但因其效果低，故極少被實用化。

如以上所述，目前尚未發現對植物病害整體顯示效果，也可利用於線蟲防除，且具有植物成長促進效果的芽孢桿菌屬細菌。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1] 日本專利第2955655號說明書

[專利文獻2] 日本特開2009-247302號公報

[專利文獻3] 日本專利第3471815號說明書

[專利文獻4] 日本專利第4071036號說明書

[專利文獻5] 日本專利第3471811號說明書

[專利文獻6] 日本專利第4359653號說明書

本發明之目的是提供一種從自然界分離的新穎微生物，該微生物具有對多數種植物病害的發病抑制作用、線蟲防除作用、及/或植物的成長促進作用的效果。

本發明的其他目的是提供含有前述微生物做為有效菌，且可做為生物農藥(微生物製劑)而使用的植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑。

本發明者等有鑑於前述課題而精心反覆研究的結果，成功於從自然界分離一種芽孢桿菌屬所屬的新菌株，其具有多數種植物病害的發病抑制作用、線蟲防除作用及植物成長促進作用效果，而完成本發明。

本發明是關於下列1至4的菌株、5至8的微生物製劑及9的植物的栽培方法。

1.一種菌株，其特徵係具有序列號碼2或3的鹼基序列所示的16S rDNA。

2.如前述1所述之菌株，其菌株本體及/或菌株的培養物顯示植物病害防除作用、線蟲防除作用及/或植物成長促進作用的效果。

3.如前述1或2所述之芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-332菌株，係具有序列號碼2的鹼基序列所示的16S rDNA。

4.如前述1或2所述之芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-79菌株，係具有序列號碼3的鹼基序列所示的16S rDNA。

5.一種微生物製劑，係含有如前述1至4中任一項所述的菌株及/或菌株的培養物做為有效成分。

6.如前述5所述的微生物製劑，係植物病害防除劑。

7.如前述5所述的微生物製劑，係線蟲防除劑。

8.如前述5所述的微生物製劑，係植物成長促進劑。

9.一種植物之栽培方法，係以前述5至8中任一項所述的微生物製劑處理植物。

本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株是藉由使其培養物(包含生菌體)或其培養分離生菌體存在於根、莖、葉、種子、果實等植物體上或其栽培土壤中，而在極廣範圍抑制各種的植物病害的發生，且可防除線蟲，並且可促進有用植物的成長。

第1圖表示使用芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-332菌株及AT-79菌株的16S rDNA鹼基序列的分子系統樹。圖中，樹枝的分枝附近的數字是引導值(bootstrap)，左下的線表示標尺(scale bar)。

第2圖(a)係表示基礎試驗(無處理)中的AT-332菌株的植物成 長促進效果的照片。

第2圖(b)係表示基礎試驗(實施例12)中的AT-332菌株的植物成長促進效果的照片。

第2圖(c)係表示基礎試驗(比較例12)中的AT-332菌株的植物成長促進效果的照片。

第2圖(d)係表示基礎試驗(比較例13)中的AT-332菌株的植物成長促進效果的照片。

第3圖表示盆栽試驗(實施例13)中的AT-332及AT-79菌株對白菜的成長促進效果。

本發明者等，係以重新開發對各種植物病害具有非常廣大的抗菌譜且顯示抗線蟲活性且具有植物成長促進效果的安全性高又優異的微生物農藥及/或微生物肥料為目的，從各種植物、土壤等篩選微生物。結果，得到一種有用的知識，亦即從日本國茨城縣內採取的土壤所分離的菌株係對各種植物病害菌顯示廣幅度的抗菌活性，且對線蟲也顯示高的殺線蟲活性，並且具有植物成長促進效果。

由後述的細菌學性質可明白，如此新分離的兩菌株(AT-332菌株及AT-79菌株)係具有運動性的革蘭氏陽性桿菌，在嗜氧條件下生長並形成芽孢。又，過氧化氫酶反應及氧化酶反應都是陽性。再者，根據16S rDNA的5'末端側約1500bp的鹼基序列而鑑定的結果，認定該兩菌株係與液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)為近親的芽孢桿菌屬的新穎菌株。其表現「對廣幅度的植物病害顯示效果，且對線蟲也顯示高的防除效果，並且 有植物成長促進效果」的卓越特徴，故此AT-332菌株及AT-79菌株係被視為新穎菌株，並命名為與液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)為近親的芽孢桿菌屬品種：AT-332菌株及AT-79菌株。

本發明的新穎菌株AT-332菌株及AT-79菌株是對日本之受託機關：獨立行政法人 製品評價技術基盤機構 特許微生物寄託中心(地址為〒292-0818日本國千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8)以芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-332及AT-79進行寄存(原寄存日(受託日)：2011年5月2日，受託號碼：NITE BP-1095及NITE BP-1094)。並另於台灣申請生物材料寄存，且已進行試驗確認存活，而取得AT-332菌株及AT-79菌株之台灣寄存號碼各為BCRC 910571及BCRC 910570。

芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-332(日本之寄存號碼為NITE BP-1095，台灣之寄存號碼為BCRC 910571)的細菌學性質係如下述。在此，細菌學性質是參照下列文獻而決定。

PRIEST(F.G.), GOODFELLOW(M.), SHUTE(L.A.) and BERKELEY (R.C.W.)：Bacillus amyloliquefaciens sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Bacteriol., 1987, 37, 69-71.及Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition volume 3。

(1)形態學性質

形態：桿菌

大小：寬0.8至0.9μm，長1.5至2.0μm

運動性：+

鞭毛的附生狀態：周毛

孢子的有無：+(準端立)

(2)培養性質

培養基：營養洋菜(nutrient agar)培養基(30℃)

形狀：圓形

***狀態：扁平狀

周緣：全緣

表面的形狀：平滑

黏稠度：黏稠性

透明度：不透明

色調：奶油色

光澤：無光澤

色素產生：無產生

(3)生理學性質

革蘭氏染色性：+

硝酸鹽的還原：-

脫氮反應：-

MR測驗：-

VP測驗：+

吲哚的生成：-

硫化氫的生成：-

澱粉的水解：+

檸檬酸的利用：-(Koser)+(Christensen)

無機氮源的利用：-(硝酸鹽)

+(銨鹽)

脲酶：-

氧化酶：+

過氧化氫酶：+

生長的範圍pH5：+ pH8：+ pH9：+

生長的溫度37℃：+ 45℃：+ 50℃：+ 55℃：-

厭氣狀態的生長：-

OF測驗(氧化/發酵)：-/-

從糖類產生酸/產生氣體：

L-***糖：+/-

D-葡萄糖：+/-

D-果糖：+/-

麥芽糖：+/-

乳糖：-/-

D-山梨糖(sorbitose)：+/-

肌醇：+/-

D-木糖：+/-

D-甘露糖：+/-

D-半乳糖：-/-

蔗糖：+/-

海藻糖：+/-

D-甘露糖醇：+/-

甘油：+/-

β-半乳糖苷酶活性：-

精胺酸二水解酶活性：-

離胺酸去羧酶活性：-

色胺酸去胺酶活性：-

明膠酶活性：+

芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-79(日本之寄存號碼為NITE BP-1094，台灣之寄存號碼為BCRC 910570)的細菌學性質如下。

(1)形態學性質

形態：桿菌

大小：寬0.8至0.9μm，長1.5至2.0μm

運動性：+

鞭毛的附生狀態：周毛

孢子的有無：+(準端立)

(2)培養性質

培養基：營養洋菜(nutrient agar)培養基(30℃)

形狀：圓形

***狀態：扁平狀

周緣：全緣

表面的形狀：平滑

黏稠度：黏稠性

透明度：不透明

色調：奶油色

光澤：無光澤

色素產生：無產生

(3)生理學性質

革蘭氏染色性：+

硝酸鹽的還原：-

脫氮反應：-

MR測驗：-

VP測驗：+

吲哚的生成：-

硫化氫的生成：-

澱粉的水解：+

檸檬酸的利用：-(Koser)+(Christensen)

無機氮源的利用：-(硝酸鹽)+(銨鹽)

脲酶：-

氧化酶：+

過氧化氫酶：+

生長的範圍pH5：+ pH8：+ pH9：+

生長的溫度37℃：+

45℃：+

50℃：+

55℃：-

厭氣狀態的生長：-

OF測驗(氧化/發酵)：-/-

從糖類產生酸/產生氣體：

L-***糖：+/-

D-葡萄糖：+/-

D-果糖：+/-

麥芽糖：+/-

乳糖：-/-

D-山梨糖：+/-

肌醇：+/-

D-木糖：+/-

D-甘露糖：+/-

D-半乳糖：-/-

蔗糖：+/-

海藻糖：+/-

D-甘露糖醇：+/-

甘油：+/-

β-半乳糖苷酶活性：-

精胺酸二水解酶活性：-

離胺酸去羧酶活性：-

色胺酸去胺酶活性：-

明膠酶活性：+

本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株的5'末端側16S rDNA的鹼基序列係如序列號碼2所示，芽孢桿菌屬品種AT-79菌株的5'末端側16S rDNA的鹼基序列係如序列號碼3所示。

序列號碼2與3係只有鹼基編號444與1242的2處的鹼基為不同。編號444的鹼基是在序列號碼2是鳥嘌呤(g)，在序列號碼3是腺嘌呤(a)；編號1242的鹼基是在序列號碼2是腺嘌呤(a)，在序列號碼3是鳥嘌呤(g)。

因此，本發明的微生物是具有包含上述序列號碼2及序列號碼3之序列的序列號碼1的鹼基序列所示(亦即，編號444與1242的鹼基示為r)的5'末端側16S rDNA者，且可將此視為特徵。

在本發明中，16S rDNA鹼基序列的解析是以下述的方法進行。

DNA萃取是使用InstaGene Matrix(BIO RAD公司製，加州(CA)，美國)而實施，PCR是使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara bio公司製)而實施，循環定序(cycle sequencing)是使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司製，加州(CA)，美國)而實施。使用的引子(primer)(中川恭好等人：基因解析法16S rRNA基因的鹼基序列決定法，日本放射菌學會編，放射菌的分類與鑑定，88-117pp.日本學會事務中心，2001)是9F、339F、785F、1099F、536R、802R、1242R及1541R。定序是使用ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System(Applied Biosystems公司製，加州(CA)，美國)而實施。

使用BLAST(ALTSCHUL,(S.F.)et al.等：Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.Nucleic Acid Res.1997.25,3389-3402)對國際鹼基序列資料庫(GenBank/DDBJ/EMBL)搜尋同源性(homology)，結果，AT-332菌株及AT-79菌株的16S rDNA鹼基序列對源自芽孢桿菌屬的16S rDNA顯示高的同源性，對液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BCRC11601株的16S rDNA皆顯示同源率99.9%的最高同源性。另一方面，對國際鹼基序列資料庫(GenBank/DDBJ/EMBL)搜尋同源性，結果，AT-332菌株及AT-79菌株並未檢測出與源自芽孢桿菌屬的16S rDNA鹼基序列完全一致的16S rDNA鹼基序列。

在本發明中，分子系統解析是以下述的方法實施。

使用上述所得的16S rDNA的鹼基序列約1500bp，從國際鹼基序列資料庫(GenBank/DDBJ/EMBL)取得源自推定的近親菌群的基準株之16S rDNA，而實施分子系統樹解析。

用於推定分子系統樹的16S rDNA的來源菌株是如下述。

．枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)IAM12118T(AB042061)

．枯草芽孢桿菌亞種(Bacillus subtilis subsp.spi zizenii)NBRC101239T(AB325584)

．莫哈維芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)IFO15718 T(AB021191)

．死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)DSM11031 T(AB021198)

．液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BCRC11601 T(EE433406)

．萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)J CM9070 T(AB021181)

．嗜氧芽孢桿菌(Bacillus aerophilus)28K T(AJ831844)

．索諾拉沙漠芽孢桿菌(Bacillus sonorensis)BCRC17416 T(EF433411)

．地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)DSM13 T(AE017333)

．高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)41KF2b T(AJ831842)

．仙人掌桿菌(Bacillus cereus)ATCC14579 T(NC_004722)BSL2

株名末尾的T是表示該品種的基準株。BSL表示生物安全等級(biosafety level)(標記等級2以上者)。括弧內表示登錄號碼。

所得的分子系統樹係示於第1圖。

樹枝的分枝附近的數字為引導值(bootstrap)，左下的線表示標尺(scale bar)。

由於AT-332菌株及AT-79菌株係如前述般不具有還原硝酸鹽的性質，故其如伯吉氏手冊(Bergey's Manual)所記載的細菌學性質係與液化澱粉芽孢桿菌不完全一致。又，雖然從16S rDNA解析結果可認為AT-332菌株及AT-79菌株為液化澱粉芽孢桿菌的近親，但不能斷定為液化澱粉芽孢桿菌，故認定AT-332菌株及AT-79菌株為芽孢桿菌屬的新菌株。

本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株係可藉由在固形培養基上的靜置培養、液體培養等公知的手段而増殖，關於可利用的培養基的種類、培養條件等，只要是可使本細菌生存増殖者，則無特別的限制。例如，可列舉如肉萃取物培養基等一般性的培養基，除此之外亦可列舉如含有葡萄糖、蛋白腖(peptone)、酵母萃取物的培養基等。又，除了液體培養基以外， 亦可使用添加有洋菜的斜面培養基及平板培養基等固形培養基。

就培養基的碳源而言，可利用上述菌株能做為營養源的所有碳源。具體而言，可列舉如葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽萃取物、廢糖蜜、糖飴、澱粉水解物等糖之外，可列舉如AT-332菌株及AT-79菌株所能利用的各種合成或天然碳源。

就培養基的氮源而言，也是同樣地以蛋白腖、肉萃取物、酵母萃取物、大豆粉、玉米浸漬液(corn steep liquor)等含有有機氮之物質為首，而可利用該菌株所能利用的各種合成或天然物。

又，依照微生物培養的常法，可視必要而添加食鹽、磷酸鹽等無機鹽類，鈣、鎂、鐵等金屬的鹽類，維生素、胺基酸等微量營養源。

培養可在振盪培養、通氣培養等嗜氧的條件下實施。培養溫度是20至40℃，理想是25至35℃；pH是5至8，理想是6至7；培養期間是1至4日，理想是2至3日。

含有本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株的菌體之培養物具有抑制各種植物病害並防除線蟲且促進有用植物的成長的性質。

藉由使含有本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株的菌體的培養物、培養物與其他成分的混合物等處理物、將培養物離心分離處理後的菌體或其洗淨菌體等培養分離菌體、培養分離菌體與其他成分的混合物等處理物、以及經液體或固體稀釋該等物的稀釋物等存在於根、莖、葉、種子、果實等植物體上或其栽培土壤中，而可抑制各種植物病害，並防除線蟲。

關於本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株，只 要細菌能生存，不管是營養細胞的狀態也好，芽孢的狀態也好，或共存的狀態也好，都可做為植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑而利用。又，即使是在培養時而有培養基成分混在的狀態下、或是以蒸餾水等洗淨而除去細菌細胞以外的成分的狀態下，也可利用。

本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株係依據施用形態而可防除由卵菌類(Oomycetes)、子嚢菌類(Ascomycetes)、擔子菌類(Basidiomycetes)及不完全菌類(Deuteromycetes)所屬的菌類及細菌類所造成的植物的病害，以及莖線蟲(Ditylenchus dipsaci)、馬鈴薯腐敗線蟲(Ditylenchus destructor)、根腐線蟲屬(Pratylenchus sp.)、根瘤線蟲屬(Meloidogyne sp.)、包囊線蟲屬(Heterodera sp.)及黃金線蟲屬(Globodera spp.)等植物寄生性線蟲。又，同時可促進穀物、蔬菜、水果、花、豆類的生長。

本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株能防除的病害的病原菌，具體而言，可列舉如：水稻的稻熱病菌(Pyricularia oryzae)、芝麻葉枯病菌(Cochliobolus miyabeanus)、紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻徒長病菌(Gibberella fujikuroi)；麥類的白粉病菌(大麥白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.hordei)、小麥白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.Tritici))、銹病菌(條銹菌(Puccinia striiformis)、稈銹菌(Puccinia graminis)、葉銹菌(Puccinia recondita f.sp.tritici)、柄銹菌(Puccinia hordei))、赤霉病菌(Gibberella zeae)、網斑病菌(Pyrenophora teres)、雪腐病菌(肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)、雪腐病核瑚菌(Typhula ishikariensis)、北方貝核盤霉菌(Sclerotini aborealis)、雪腐鎌孢菌(Micronectriella nivalis))、裸黑穂 病菌(Ustilago nuda)、腥黑穂病菌(小麥網腥黑穗病菌(Tilletia caries)、小麥光腥黑穗病菌(Tilletia foetida))、眼紋病菌(Tapesia yallundae)、雲形病菌(Rhynchosporium secalis f.sp.hordei)、葉枯病菌(Septoria tritici)、穎枯病菌(Leptosphaeria nodorum)；柑橘的黑點病菌(Diaporthe citri)、瘡痂病菌(Elsinoe fawcettii)、褐色腐敗病菌(Phytophthora citrophthora)、綠霉病菌(Penicillium digitatum)、青霉病菌(Penicillium italicum)；蘋果的褐腐病菌(Monilinia mali)、腐爛病菌(Valsa ceratosperma)、白粉病菌(Podosphaera leucotricha)、斑點落葉病菌(Alternaria alternata apple pathotype)、黑星病菌(Venturia inaequalis)、赤星病菌(Gymnosporangium yamadae)、輪紋病菌(Botryophaeria berengeriana f.sp.piricola)、煤點病菌(Zygophiala jamaicensis)、煤斑病菌(Gloeodes pomigena)、黑點病菌(Mycosphaerella pomi)、炭疽病菌(Glomerella cingulata)、褐斑病菌(Diplocarpon mali)；梨的黑星病菌(Venturia nashicola)、黑斑病菌(Alternaria alternata japanese pear pathotype)、輪紋病菌(Physalospora piricola)、赤星病菌(Gymnosporangium asiaticum)；桃的灰星病菌(Monilinia fructicola)、黑星病菌(Cladosporium carpophilum)、果腐病菌(Phomopsis sp.)；葡萄的褐斑病菌(Pseudocercospora vitis)、輪紋病菌(Marssonina viticola)、黑痘病菌(Elsinoe ampelina)、晚腐病菌(Glomerella cingulata)、白粉病菌(Uncinula necator)、銹病菌(Phakopsora ampelopsidis)、枝膨病菌(Phomopsis sp.)；柿的白粉病菌(Phyllactinia kakicola)、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、角斑落葉病菌(Cercospora kaki)、圓星落葉病菌(Mycosphaerella nawae)；梅的黑星病菌(Cladosporium carpophilum)；櫻桃的灰星病 菌(Monilinia fructicola)；瓜類的白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)、蔓枯病菌(Didymella bryoniae)、炭疽病菌(Colletotorichum lagenarium)；番茄的輪紋病菌(Alternaria solani)、葉霉病菌(Cladosporium fulvum)；茄子的褐紋病菌(Phomopsis vexans)、白粉病菌(Erysiphe cichoracearum)；油菜科蔬菜的黑斑病菌(日本鏈格孢菌(Alternaria japonica)、芸薹鏈格孢菌(Alternaria brassicae)、甘藍鏈格孢菌(Alternaria brassicicola))、白斑病菌(Cercosporella brassicae)；蔥的銹病菌(Puccinia allii)；薑的根莖腐敗病菌(Pythium ultimum、Pythium zingiberis)；草莓的白粉病菌(Sphaerotheca humuli)、炭疽病菌(Glomerella cingulata)；大豆的紫斑病菌(Cercospora kikuchii)、黑痘病菌(Elsinoe glycines)、黑點病菌(Diaporthe phaseolorum var.sojae)；紅豆的褐斑病菌(Cercospora canescens)、銹病菌(Uromyces phaseoli var.azukicola)；菜豆的炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianum)；落花生的黑澀病菌(Cercosporidium personatum)、褐斑病菌(Cercospora arachidicola)、瘡痂病菌(Sphaceloma arachidis)；豌豆的白粉病菌(Erysiphe pisi)；馬鈴薯的夏疫病菌(Alternaria solani)；茶的網餅病菌(Exobasidium reticulatum)、白星病菌(Elsinoe leucospila)、輪斑病菌(Pestalotiopsis theae、Pestalotiopsis longiseta)；菸草的赤星病菌(Alternaria longipes)、白粉病菌(Erysiphe cichoracearum)、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)；甜菜的褐斑病菌(Cercospora beticola)；草皮的葉枯病菌(Curvularia geniculata)、疑似葉枯病菌(Ceratobasidium spp.)；玫瑰的黑星病菌(Diplocarpon rosae)、白粉病菌(Sphaerotheca pannosa)；菊的褐斑病菌(Septoria obesa)、白銹病 菌(Puccinia horiana)；各種作物的灰色霉病菌(Botrytis cinerea)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等；但並不限定於此等。

在本發明的植物病害防除劑中，也包含用以防止收穫後的所保存的農作物腐敗，特別是用以防止果實等的腐敗之收穫後病害防除劑。本發明的收穫後病害防止劑所適用的農作物的種類並無任何的限定，可舉例如：草莓、葡萄、無花果、柑橘類、桃、哈密瓜、西瓜、蘋果、梨、香蕉、鳳梨等水果，黃瓜、番茄、白菜、高麗菜、蔥、洋蔥、紅蘿蔔、白蘿蔔、生薑、青椒、茄子、南瓜、豆芽菜等蔬菜。會引起收穫後病害的霉菌的種類並無任何限制，可舉例如灰霉菌(Botrytis cinerea)、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、鏈格孢菌(Alternaria alternata)等。

就本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株能防除的線蟲而言，特別可列舉如植物寄生性線蟲，例如：根瘤線蟲類的北方根瘤線蟲(Meloidogyne hapla)、南方根瘤線蟲(Meloidogyne incognita)、爪哇根瘤線蟲(Meloidogyne javanica)及其他的根瘤線蟲屬(Meloidogyne)品種；形成有包囊之線蟲類的馬鈴薯黃金線蟲(Globodera rostochiensis)及其他的黃金線蟲屬(Globodera)品種；禾谷包囊線蟲(Heterodera avenae)、大豆包囊線蟲(Heterodera glycines)、甘藍包囊線蟲(Heterodera schachtii)、三葉草包囊線蟲(Heterodera trifolii)及其他的包囊線蟲屬(Heterodera)品種；種子腫瘤線蟲類的腫癭線蟲屬(Anguina)品種；莖及葉線蟲類的葉芽線蟲屬(Aphelenchoides)品種；刺線蟲類的長尾刺線蟲(Belonolaimus longicaudatus)及其他的刺線蟲屬(Belonolaimus)品種；松線蟲類的松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)及其他的松線蟲屬 (Bursaphelenchus)品種；輪狀線蟲類的環線蟲(Criconema)種、小環線蟲(Criconemella)種、輪線蟲(Criconemoides)種、中環線蟲(Mesocriconema)種；莖及鱗莖線蟲類的馬鈴薯腐敗線蟲(Ditylenchus destructor)、莖線蟲(Ditylenchus dipsaci)及其他的莖線蟲屬(Ditylenchus)品種；突錐線蟲類(awl nematodes)類的錐線蟲屬(Dolichodorus)品種；螺旋線蟲類的多帶螺旋線蟲(Helicotylenchus multicinctus)及其他的螺旋線蟲屬(Helicotylenchus)品種；鞘及似鞘線蟲類(sheath and sheathoid nematodes)的鞘線蟲屬(Hemicycliophora)品種及似鞘線蟲屬(Hemicriconemoides)品種；穿根線蟲屬(Hirschmanniella)品種；矛線蟲類的紐帶線蟲屬(Hoplolaimus)品種；假根瘤線蟲類的假根瘤線蟲屬(Nacobbus)品種；針線蟲類的延伸長針線蟲(Longidorus elongatus)及其他的長針線蟲屬(Longidorus)品種；根腐線蟲類的落選短體線蟲(Pratylenchus neglectus)、北方根腐線蟲(Pratylenchus penetrans)、南方根腐線蟲(Pratylenchus curvitatus)、全體短體線蟲(Pratylenchus goodeyi)、及其他的根腐線蟲屬(Pratylenchus)品種；穿孔線蟲類的似穿孔線蟲(Radopholus similis)及其他的穿孔線蟲屬(Radopholus)品種；旋形線蟲類的粗壯旋形線蟲(Rotylenchus robustus)及其他的旋形線蟲屬(Rotylenchus)品種；盾狀線蟲屬(Scutellonema)品種；殘根線蟲類(stubby root nematodes)的原始毛刺線蟲(Trichodorus primitivus)及其他的毛刺線蟲屬(Trichodorus)品種；似毛刺線蟲屬(Paratrichodorus)品種；萎縮線蟲類的矮化線蟲(Tylenchorhynchus claytoni)、順逆矮化線蟲(Tylenchorhynchus dubius)、及其他的矮化線蟲屬(Tylenchorhynchus)品種；柑橘線蟲類的柑橘線蟲屬 (Tylenchulus)品種；劍線蟲類的劍線蟲屬(Xiphinema)品種等；但並不限定於此等。

本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株係格外有用於防除根瘤線蟲屬(Meloidogyne)品種、黃金線蟲屬(Globodera)品種、包囊線蟲屬(Heterodera)品種、根腐線蟲屬(Pratylenchus)品種、穿孔線蟲屬(Radopholus)品種、旋形線蟲屬(Rotylenchus)品種及柑橘線蟲屬(Tylenchulus)品種，特別適用於驅除根瘤線蟲屬(Meloidogyne)品種、根腐線蟲屬(Pratylenchus)品種、黃金線蟲屬(Globodera)品種及包囊線蟲屬(Heterodera)品種。

就本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株可促進成長的作物而言，可列舉如：穀物，例如水稻、小麥、玉米；蔬菜類，例如紅蘿蔔、黃瓜、白蘿蔔、南瓜、萵苣、茄子、番茄、高麗菜、馬鈴薯、白菜、茼蒿、小松菜、青椒、蔥、洋蔥、薑、大蒜、草莓；菇類，例如香菇；果樹類，例如柿、梨、柑橘、葡萄、蘋果、桃；花卉類，例如菊、鬱金香、玫瑰；豆類，例如大豆、芝麻、花生等。

本發明的植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑，係含有如上述般可防除植物病害及線蟲且具有植物成長促進效果的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株做為有效菌。

本發明的植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑中，AT-332菌株或AT-79菌株可以單體使用，也可將兩菌株併用。又，也可使用各自的變異體。變異體係指具有上述AT-332菌株及AT-79菌株的細菌學特性並具有植物病害防除作用、線蟲防除作用及植物成長促進作用者，可利用自然突變株、由紫外線或化學

變異劑所致的突變株、或細胞融合株及基因重組株等。

本發明的植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑中，在使用AT-332菌株及AT-79菌株的生菌時，係以10⁵至10¹⁰個/ml的濃度添加於植物體為理想。

又，在使用AT-332菌株及/或AT-79菌株的培養物時，其適用量可遵照上述生菌時的情況而適宜地決定。

本發明的微生物製劑(植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑)可單獨使用AT-332菌株及AT-79菌株的菌體及/或培養物，此外，亦可經惰性的液體或固體的載體稀釋並視需要而添加界面活性劑、分散劑、其他佐劑以做成藥劑來使用。具體的製劑例可列舉如粒劑、粉劑、水和劑(wettable powder)、懸浮製劑、乳劑等劑型等。

就載體而言，例如可列舉如滑石、皂土、高嶺土、黏土、矽藻土、白碳、蛭石、消石灰、硫酸銨、矽砂、尿素、多孔質的固體載體、水、異丙醇、甲基萘、二甲苯、環己酮、烷二醇(alkylene glycol)等液體載體等。就界面活性劑及分散劑而言，例如可列舉如二萘基甲烷磺酸鹽、醇硫酸酯鹽、木質素磺酸鹽、烷基芳基磺酸鹽、聚氧乙二醇醚、聚氧伸乙基去水山梨醇單烷化物(polyoxyethylene sorbitan alkylate)、聚氧伸乙基烷基芳基醚等。佐劑可列舉如羧甲基纖維素、聚乙二醇、丙二醇、***樹膠、黃原膠(xanthan gum)等，保護劑可列舉如脫脂奶粉、pH緩衝劑等。此時，AT-332菌株的生菌體的量及/或其培養物之量、以及適用時期及適用量可遵照上述生菌的情況而適宜地決定。

本發明的微生物製劑(植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成 長促進劑)可視需要而含有本發明的有效成分以外的有效成分，例如殺蟲劑、其他的殺菌劑、除草劑、植物生長調節劑、肥料等。又，本發明的植物病害防除劑及線蟲防除劑可在含有AT-332菌株及/或AT-79菌株之同時，亦含有其他種類的菌株。

就殺菌劑成分而言，例如可列舉如：比多農(Bitertanol)、溴克座(Bromuconazole)、環克座(Cyproconazole)、待克利(Difenoconazole)、達克利(Diniconazole)、抑霉唑(Enilconazole)、依普座(Epoxiconazole)、氟喹唑(Fluquinconazole)、芬克座(Fenbuconazole)、護矽得(Flusilazole)、護汰芬(Flutriafol)、菲克利(Hexaconazole)、易胺座(Imibenconazole)、種菌唑(Ipconazole)、滅特座(Metconazole)、邁克尼(Myclobutanil)、平克座(Penconazole)、普克利(Propiconazole)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、矽氟唑(simeconazole)、三泰芬(Triadimefon)、三泰隆(Triadimenol)、得克利(Tebuconazole)、四克利(Tetraconazole)、滅菌唑(Triticonazole)、撲克拉(Prochloraz)、披扶座(Pefurazoate)、依滅列(Imazalil)、賽福座(Triflumizole)、賽座滅(Cyazofamid)、免賴得(Benomyl)、貝芬替(Carbendazim)、腐絕(Thiabendazole)、麥穗寧(fuberidazole)、噻唑菌胺(ethaboxam)、依得利(Etridiazole)、富馬酸惡咪唑(oxpoconazole fumarate)、殺紋寧(Hymexazol)、亞托敏(Azoxystrobin)、醚菌胺(dimoxystrobin)、烯肟菌酯(enestroburin)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、克收欣(Kresoxim-methyl)、苯氧菌胺(metominostrobin)、肟醚菌胺(orysastrobin)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、百克敏(Pyraclostrobin)、三氟敏(Trifloxystrobin)、萎鏽靈(carboxin)、本達樂(Benalaxyl)、白克列(Boscalid)、聯苯吡菌胺(bixafen)、環醯菌胺(fenhexamid)、福 多寧(flutolanil)、福拉比(furametpyr)、滅普寧(mepronil)、滅達樂(metalaxyl)、右滅達樂(mefenoxam)、呋醯胺(ofurace)、毆殺斯(oxadixyl)、嘉保信(Oxycarboxin)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、賽氟滅(thifluzamide)、噻醯菌胺(tiadinil)、達滅芬(Dimethomorph)、氟嗎啉(flumorph)、氟醯菌胺(flumetover)、氟比來(fluopicolide)、加普胺(Carpropamid)、雙氯氰菌胺(diclocymet)、曼普胺(mandipropamid)、扶吉胺(Fluazinam)、比芬諾(Pyrifenox)、布瑞莫(bupirimate)、賽普洛(Cyprodinil)、芬瑞莫(Fenarimol)、富米綜(ferimzone)、滅派林(Mepanipyrim)、尼瑞莫(Nuarimol)、派美尼(Pyrimethanil)、賽福寧(Triforine)、拌種咯(fenpiclonil)、護汰寧(Fludioxonil)、殺螟丹(Aldimorph)、十二環嗎啉(dodemorph)、芬普福(Fenpropimorph)、三得芬(Tridemorph)、苯銹啶(Fenpropidin)、依普同(Iprodione)、撲滅寧(Procymidone)、免克寧(Vinclozolin)、凡殺同(Famoxadone)、咪唑菌酮(Fenamidone)、辛噻酮(octhilinone)、撲殺熱(Probenazole)、敵菌靈(anilazine)、達滅淨(diclomezine)、百快隆(Pyroquilon)、丙氧喹啉(proquinazid)、三賽唑(Tricyclazole)、四氯丹(captafol)、蓋普丹(Captan)、邁隆(Dazomet)、福爾培(Folpet)、氰菌胺(fenoxanil)、快諾芬(Quinoxyfen)、安美速(Amisulbrom)、鋅錳乃浦(Manzeb)、錳乃浦(maneb)、威百畝(metam)、免得爛(Metiram)、富爾邦(Ferbam)、甲基鋅乃浦(Propineb)、秋蘭姆(thiuram)、鋅乃浦(Zineb)、福美鋅(Ziram)、乙霉威(Diethofencarb)、纈霉威(Iprovalicarb)、苯噻菌胺(Benthiavalicarb-isopropyl)、普拔克鹽酸鹽(Propamocarb hydrochloride)、甲基多保淨(Thiophanate methyl)、吡本卡布(pyribencarb)、波爾多液(Bordeaux mixture)、鹼性氯化銅、鹼性硫 酸銅、氫氧化銅、8-羥喹啉銅、多寧(Dodine)、克熱淨烷苯磺酸鹽(iminoctadine albesilate)、克熱淨醋酸鹽(iminoctadine triacetate)、雙胍辛胺(Guazatine)、嘉賜黴素(Kasugamycin)、鏈黴素(streptomycin)、保粒黴素(Polyoxin)、土黴素(Oxytetracycline)、維利黴素(validamycin A)、百蟎克(Binapacryl)、白粉克(dinocap)、大脫蟎(Dinobuton)、腈硫醌(Dithianon)、亞賜圃(Isoprothiolane)、護粒松(Edifenphos)、丙基喜樂松(Iprobenfos)、福賽得(Fosetyl)、福賽得鋁(fosetyl-aluminium)、白粉松(Pyrazophos)、脫克松(Tolclofos-Methyl)、四氯異苯腈(Chlorothalonil)、益發靈(Dichlofluanid)、氟硫滅(Flusulfamide)、六氯苯(hexachlorobenzene)、熱必斯(fthalide)、賓克隆(Pencycuron)、五氯硝苯(Quintozene)、賽芬胺(cyflufenamid)、克絕(Cymoxanil)、二甲嘧酚(dimethirimol)、依瑞莫(Ethirimol)、霜靈(furalaxyl)、滅芬農(Metrafenone)、葚孢菌素(Spiroxamine)、銨乃浦(Amobam)、硫黃、石灰硫黃合劑、氯唑靈(echlomezole)、碳酸氫鉀、碳酸氫鈣、噻二嗪(thiadiazine)、克枯爛(tecloftalam)、三嗪(triazine)、壬基酚磺酸銅、羥基異噁唑(hydroxyisoxazole)、氟菌安(fluoromide)、代森福美鋅(polycarbamate)、滅速克(methasulfocarb)、EDDP、IBP、唑蟲醯胺(Tolfenpyrad)、氟吡菌醯胺(fluopyram)、亞汰尼(isotianil)、及吡唑萘菌胺(Isopyrazam)，但不限定於此等。

就殺蟲劑成分而言，例如可列舉如：亞滅培(Acetamiprid)、派滅淨(Pymetrozine)、撲滅松(Fenitrothion)、歐殺松(Acephate)、加保利(Carbaryl)、納乃得(Methomyl)、培丹(Cartap)、氯氟氰菊酯(cyhalothrin)、依芬寧(Ethofenprox)、得福隆(Teflubenzuron)、氟蟲 醯胺(flubendiamide)、氟芬隆(Flufenoxuron)、得芬諾(Tebufenozide)、芬普蟎(Fenpyroximate)、畢達本(Pyridaben)、益達胺(Imidacloprid)、布芬淨(Buprofezin)、BPMC、MIPC、馬拉松(Malathion)、滅大松(Methidathion)、芬殺松(Fenthion)、大利松(Diazinon)、異亞碸磷(oxydeprofos)、繁米松(vamidothion)、愛芬克(Ethiofencarb)、比加普(Pirimicarb)、百滅寧(Permethrin)、賽滅寧(Cypermethrin)、畢芬寧(Bifenthrin)、合芬寧(Halfenprox)、矽護芬(Silafluofen)、烯啶蟲胺(nitenpyram)、克福隆(Chlorfluazuron)、滅芬諾(Methoxyfenozide)、得芬瑞(Tebufenpyrad)、畢汰芬(Pyrimidifen)、大克滿(Kelthane)、毆蟎多(Propargite)、合賽多(Hexythiazox)、克芬蟎(Clofentezine)、賜諾殺(Spinosad)、密滅汀(Milbemectin)、BT(蘇力菌，Bacillus thuringiensis)、因得克(Indoxacarb)、美氟綜(metaflumizone)、克凡派(chlorfenapyr)、芬普尼(Fipronil)、依殺蟎(Etoxazole)、亞醌蟎(Acequinocyl)、亞特松(pirimiphos-methyl)、阿納寧(Acrinathrin)、蟎離丹(chinomethionat)、陶斯松(chlorpyrifos)、阿巴汀(Abamectin)、因滅汀(Emamectin benzoate)、芬佈賜(Fenbutatin oxide)、托福松(Terbufos)、普伏松(Ethoprophos)、硫線磷(Cadusafos)、芬滅松(Phenamiphos)、繁福松(Fensulfothion)、DSP、除線磷(dichlofenthion)、福賽絕(Fosthiazate)、毆殺滅(Oxamyl)、依殺米(isamidofos)、吉福松(fosthietan)、依殺松(Isazofos)、蟲線磷(thionazin)、免扶克(Benfuracarb)、賜派芬(Spirodiclofen)、愛芬克(ethiofencarb)、谷速松(Azinphos-methyl)、二硫松(Disulfoton)、滅賜克(Methiocarb)、滅多松(Oxydemeton methyl)、巴拉松(Parathion)、賽扶寧(Cyfluthrin)、貝他賽扶寧(beta-Cyfluthrin)、丁基嘧啶磷 (tebupirimfos)、螺蟲酯(spiromesifen)、安殺番(Endosulfan)、雙甲脒(Amitraz)、特多寧(Tralomethrin)、乙醯蟲腈(acetoprole)、益斯普(Ethiprole)、愛殺松(Ethion)、三氯松(Trichlorfon)、達馬松(Methamidophos)、二氯松(Dichlorvos)、美文松(Mevinphos)、亞素靈(Monocrotophos)、大滅松(Dimethoate)、覆滅蟎(Formetanate)、福木松(Formothion)、滅加松(Mecarbam)、硫滅松(Thiometon)、二硫松(Disulfoton)、乃力松(Naled)、甲基巴拉松(Parathion-methyl)、氰乃松(Cyanophos)、除線特(Diamidafos)、阿苯達唑(albendazole)、奧苯達唑(oxibendazole)、芬苯達唑(fenbendazole)、奧芬達唑(Oxfendazole)、加護松(Propaphos)、硫丙磷(Sulprofos)、普硫松(prothiofos)、佈飛松(Profenofos)、亞芬松(Isofenphos)、亞培松(Temephos)、賽達松(Phenthoate)、甲基毒蟲畏(dimethylvinphos)、氯芬松(Chlorfenvinphos)、殺蟲畏(Tetrachlorovinphos)、巴賽松(Phoxim)、加福松(Isoxathion)、白克松(Pyraclofos)、陶斯松(chlorpyrifos)、必芬松(Pyridaphenthion)、裕必松(Phosalone)、益滅松(Phosmet)、殺力松(dioxabenzofos)、喹硫磷(quinalphos)、除蟲菊精(Pyrethrins)、亞烈寧(Allethrin)、普亞列寧(Prallethrin)、列滅寧(Resmethrin)、百滅寧(Permethrin)、七氟菊酯(Tefluthrin)、芬普寧(Fenpropathrin)、亞滅寧(α-Cypermethrin)、賽洛寧(lambda-Cyhalothrin)、第滅寧(Deltamethrin)、芬化利(Fenvalerate)、益化利(Esfenvalerate)、護賽寧(Flucythrinate)、福化利(Fluvalinate)、乙氰菊酯(cycloprothrin)、硫敵克(Thiodicarb)、得滅克(Aldicarb)、棉鈴威(alanycarb)、治滅蝨(Metolcarb)、滅爾蝨(Xylylcarb)、安丹(Propoxur)、芬諾克(Fenoxycarb)、芬硫克(Fenothiocarb)、必芬蟎 (bifenazate)、加保扶(Carbofuran)、丁基加保扶(Carbosulfan)、硫黃、匹福齊(Pyrifluquinazon)、呋線威(furathiocarb)、汰芬隆(Diafenthiuron)、二福隆(Diflubenzuron)、六伏隆(Hexaflumuron)、諾伐隆(Novaluron)、祿芬隆(Lufenuron)、克福隆(Chlorfluazuron)、氫氧化三環己基錫、油酸鈉、油酸鉀、美賜平(methoprene)、烯蟲乙酯(hydroprene)、百蟎克(Binapacryl)、雙甲脒(amitraz)、克氯苯(Chlorobenzilate)、新殺蟎(bromopropylate)、得脫蟎(Tetradifon)、免速達(Bensultap)、苯蟎特(benzomate)、可芬諾(Chromafenozide)、氯蟲醯肼(halofenozide)、安殺番(Endosulfan)、苯蟲醚(Diofenolan)、脫芬瑞(Tolfenpyrad)、唑蚜威(triazamate)、菸鹼硫酸鹽(nicotine sulfate)、賽果培(Thiacloprid)、賽速安(Thiamethoxam)、可尼丁(Clothianidin)、達特南(Dinotefuran)、扶吉胺(Fluazinam)、百利普芬(Pyriproxyfen)、嘧蟎酯(fluacrypyrim)、愛美松(Hydramethylnon)、賽滅淨(Cyromazine)、TPIC、硫賜安(Thiocyclam)、芬殺蟎(Fenazaquin)、瀏陽霉素(Polynactin)複合物、印楝素(Azadirachtin)、魚藤酮(Rotenone)、羥丙基澱粉(Hydroxypropyl Starch)、倍硫磷亞碸(Mesulfenfos)、磷蟲威(phosphocarb)、依索米(isoamidofos)、涕滅碸威(aldoxycarb)、斯美地(metam-sodium)、摩朗得酒石酸鹽(Morantel tartrate)、邁隆(Dazomet)、鹽酸左美素(Levamisole hydrochloride)、水楊菌胺(trichlamide)、脫芬瑞(tolfenpyrad)、啶蟲丙醚(pyridalyl)、剋安勃(chlorantraniliprole)、腈吡蟎酯(cyenopyrafen)、及賽芬蟎(cyflumetofen)，但不限定於此等。

本發明的植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑是，可以原本狀態直接施用、或以水等稀釋而施用。植物病害防 除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑的施用方法沒有特別的限定，例如可列舉如：直接對植物或害蟲灑佈的方法、灑佈在土壤的方法、在植物或土壤添加的水或肥料中添加的方法、以及覆蓋於種子的方法等。此外，由於製劑的施用量會隨對象病害、對象害蟲、對象作物、施用方法、發生傾向、被害的程度、環境條件、使用的劑型等而變動，故以適宜地調整為理想。

如上所述，本發明的芽孢桿菌屬品種AT-332菌株及AT-79菌株具有廣大的病害及線蟲防除譜，可防除數種植物病害及線蟲，並且可促進有用植物的成長。含有此等菌株的本發明的植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑係對環境的安全性高，且對數種病害及線蟲具有防除效果，故即使不使用其他的併用手段也可廣泛地防止病害及線蟲，並且可促進有用植物的生長，而可做為生物農藥及/或生物肥料使用。

[實施例]

依據下述製造例、製劑例、實施例及比較例而具體說明本發明，但本發明並不受此等例所限定。

[AT-332菌株及AT-79菌株的培養]

從含有植物根的土壤分離出AT-332菌株及AT-79菌株。

詳細而言，在2009年8月採取日本國茨城縣守谷市的土壤，將經熱處理(80℃，10分鐘)而得的乾燥土壤1g以滅菌水懸浮。將該懸浮液稀釋10²至10⁴倍，以普通肉湯培養基(榮研化學股份有限公司)培養(28℃，3日)分離培養，將形成的菌落分離。將分離的菌落，在馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基上，找出對各種植物病原菌有效果的菌株。再以馬鈴薯葡萄糖液體培養基進行振盪培養，分離 出對甘薯根瘤線蟲2期幼蟲顯示活性的菌株，其為芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-332菌株及AT-79菌株。

各菌株的鑑定方法、各種解析的方法及其結果及細菌學性質係如[實施方式]所記載。

製造例1：AT-332菌株的培養及調製

就前培養而言，係將本發明的細菌(AT-332菌株)的保存菌的一白金環予以植菌在每燒瓶含有60ml的普通肉湯培養基(榮研化學股份有限公司)的附有擋板(baffle)的500ml三角燒瓶後，用迴轉振盪機以迴轉數180rpm於28℃培養1日。

將由上述前培養所得的培養物60ml予以植菌於含有2000ml的LB培養基(蛋白腖20g、酵母萃取物10g、氯化鈉20g，其餘是水)的5000ml發酵槽(jar fermentor)後，就主培養而言，以迴轉數500rpm並以1L/h在35℃培養3日。

由上述主培養，得到約1800g的培養物。其菌體濃度是約8.0×10⁹CFU/ml。

將所得的培養物約1800g以-80℃冷凍後，在減壓下進行冷凍乾燥並粉碎，而得到約140g的乾燥粉末。其菌體濃度是約1.0×10¹¹CFU/g。

製造例2：AT-79菌株的培養及調製

就前培養而言，係將本發明的細菌(AT-79菌株)的保存菌的一白金環予以植菌於每燒瓶含有60ml的普通肉湯培養基(榮研化學股份有限公司)的附有擋板的500ml三角燒瓶後，用迴轉振盪機以迴轉數180rpm於28℃培養1日。

將由上述前培養所得的培養物60ml予以植菌在含有2000ml 的LB培養基(胰腖20g、酵母萃取物10g、氯化鈉20g，其餘是水)的5000ml發酵槽後，就主培養而言，以迴轉數500rpm並以1L/h在35℃培養3日。

由上述主培養，得到約1700g的培養物。其菌體濃度是約9.0×10⁹CFU/ml。

將所得的培養物約1700g以-80℃冷凍後，在減壓下進行冷凍乾燥並粉碎，而得到約130g的乾燥粉末。其菌體濃度是約1.1×10¹¹CFU/g。

其次，記載製劑例。又，「份」是表示質量份。

製劑例1：水和劑

將製造例1所得的乾燥粉末60份、矽藻土25份、白碳5份、木質素磺酸鈉8份、及烷基萘磺酸鈉2份混合粉碎，而得到水和劑。

製劑例2：粒劑

將製造例1所得的乾燥粉末5份、皂土25份、滑石66份、十二烷苯磺酸鈉2份、及木質素磺酸鈉2份混合並粉碎，添加水約20份，以捏揉機捏揉後，通過造粒機而造粒，繼而進行乾燥整粒，而得到粒劑。

製劑例3：水和劑

將製造例2所得的乾燥粉末60份、矽藻土25份、白碳5份、木質素磺酸鈉8份、及烷基萘磺酸鈉2份混合粉碎，而得到水和劑。

製劑例4：粒劑

將製造例2所得的乾燥粉末5份、皂土25份、滑石66份、 十二烷苯磺酸鈉2份、及木質素磺酸鈉2份混合並粉碎，添加水約20份，以捏揉機捏揉後，通過造粒機而造粒，繼而進行乾燥整粒，而得到粒劑。

其次，記載將本發明的植物病害防除劑、線蟲防除劑及植物成長促進劑的效果予以試驗的實施例及比較例。

實施例1及比較例1：對水稻稻熱病的效果試驗

在溫室內，對在直徑6cm的塑膠盆中已生長到3葉期的水稻(品種：越光(koshihikari)，種植15株)，將製劑例1及製劑例3的水和劑的250倍稀釋液以噴灑槍灑佈充分量。將Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)稀釋250倍者做為比較劑，以同樣方式供試。翌日，將水稻稻熱病菌(Pyricularia oryzae)孢子懸浮液予以噴霧接種。將盆栽在22℃濕室內保持24小時後，在溫室內放置7日，調査接種葉的病斑數，而求出防除價。防除價(%)是以無處理區的病斑數為基準而算出。結果如表1所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使水稻稻熱病的發病率比無處理區顯著減少，得到極高的防除效果。

實施例2及比較例2：對黃瓜炭疽病的效果試驗

在溫室內，對在直徑6cm的塑膠盆中生長的3葉期的黃瓜(品種：常盤(Tokiwa)光3號P型)的第1葉與第2葉，將製劑例1及 製劑例3的水和劑的250倍稀釋液以噴灑槍灑佈充分量。將Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)稀釋250倍者做為比較劑，以同樣方式供試。翌日，將黃瓜炭疽病菌(Colletorichum lagenarium)孢子懸浮液予以噴霧接種。將盆栽在22℃濕室內保持24小時後，在溫室內放置7日，以肉眼調査第1葉及第2葉的發病面積率，求出防除價。防除價(%)是以無處理區的發病面積率為基準而算出。結果如表2所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使黃瓜炭疽病的發病率比無處理區顯著減少，得到極高的防除效果。

實施例3及比較例3：對番茄疫病的效果試驗

在溫室內，對在直徑6cm的塑膠盆中生長的5葉期的番茄(品種：Sugar Lamp)，將製劑例1及製劑例3的水和劑的250倍稀釋液以噴灑槍灑佈充分量。將Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)稀釋250倍者做為比較劑，以同樣方式供試。翌日，將番茄疫病菌(Phytophthora infestans)的遊走孢子(zoospore)的懸浮液予以噴霧接種。將盆栽在22℃濕室內保持16小時後，在溫室內放置3日，以肉眼調査第三、四及五本葉的發病面積率，求出防除價。防除價(%)是以無處理區的發病面積率做為基準而算出。結果如表3所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使番茄 疫病的發病率比無處理區顯著減少，得到極高的防除效果。

實施例4及比較例4：對黃瓜露菌病的效果試驗

在溫室內，對在直徑6cm的塑膠盆生長的3葉期的黃瓜(品種：光3號P型)，將製劑例1及製劑例3的水和劑的250倍稀釋液以噴灑槍灑佈充分量。將Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)稀釋250倍者做為比較劑，以同樣方式供試。翌日，將黃瓜露菌病(Pseudoperonospora cubensis)的遊走孢子懸浮液予以噴霧接種。將盆栽在22℃濕室內保持18小時後，在溫室內放置3日，以肉眼調査第一及二本葉的發病面積率，求出防除價。防除價(%)是以無處理區的發病面積率做為基準而算出。結果如表4所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使黃瓜露菌病的發病率比無處理區顯著減少，得到極高的防除效果。

實施例5及比較例5：對蘋果斑點落葉病的效果試驗

採取蘋果(王林)的葉，在葉背面將製劑例1及製劑例3的水 和劑的250倍稀釋液以噴灑槍灑佈充分量。將Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)稀釋250倍者做為比較劑，以同樣方式供試。灑佈後，將葉風乾，將蘋果斑點落葉病菌(Altenaria Alternaria mali)的孢子懸浮液予以噴霧接種。於20℃、多濕下放置4日後，以肉眼調査發病面積率，求出防除價。防除價(%)是以無處理區的發病面積率做為基準而算出。結果如表5所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使蘋果斑點落葉病的發病率比無處理區顯著減少，得到極高的防除效果。

實施例6及比較例6：對黃瓜白粉病的效果試驗(田間試驗)

在本申請人公司所保有之溫室內，使用黃瓜進行試驗(試驗區：4m²/區，10株/區，3重複)。發病是任其自然發生。將製劑例1及製劑例3的水和劑稀釋500倍、稀釋1000倍、稀釋2000倍，並以7日為間隔而灑佈4次，由葉的發病面積率算出防除價。比較劑是使用Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)500倍及1000倍稀釋液、Botokiller水和劑(出光興產股份有限公司)1000倍稀釋液、Botopika水和劑(出光興產股份有限公司)2000倍稀釋液、Ecoshot顆粒水和劑(Kumiai化學工業股份有限公司)1000倍稀釋液、Morestan水和劑(Agro-kanesho股份有限公司)3000倍稀釋液。此外，無處理區的發病度為47.4%。防除價(%)是以無處理區 的發病度率做為基準而算出。結果如表6所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使黃瓜白粉病的發病率比無處理區顯著減少，得到極高防除效果。又，在田間也確認到，相較於做為比較劑而使用的現有商品的枯草芽孢桿菌劑(Impression水和劑(專利文獻3)、Botokiller水和劑、Botopika水和劑、Ecoshot顆粒水和劑(專利文獻4))，本發明的微生物製劑有顯著高的效果。又，在稀釋500倍時，顯現與化學劑的Morestan水和劑同等程度的非常高的防除效果。

實施例7及比較例7：對茄子灰色霉病的效果試驗(田間試驗)

在本申請人公司所保有之溫室內，使用茄子進行試驗(試驗區：5.6m²/區，7株/區，3重複)。發病是任其自然發生。將製劑例1及製劑例3的水和劑稀釋500倍、1000倍，並以7日為間隔而灑佈4次，由果實的發病果率算出防除價。比較劑是使用 Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)500倍稀釋液、Botokiller水和劑(出光興產股份有限公司)1000倍稀釋液、Botopika水和劑(出光興產股份有限公司)2000倍稀釋液、Ecoshot顆粒水和劑(Kumiai化學工業股份有限公司)1000倍稀釋液、Savier Flowable 20(Syngenta Japan股份有限公司)1500倍稀釋液。此外，無處理區的發病果率為15%。防除價(%)是根據無處理區的發病果率而算出。結果如表7所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使茄子灰色霉病的發病率比無處理區顯著減少，得到極高防除效果。又，在田間也確認到，相較於做為比較劑而使用的現有商品的枯草芽孢桿菌劑(Impression水和劑、Botokiller水和劑、Botopika水和劑、Ecoshot顆粒水和劑)，本發明的微生物製劑有顯著高的效果。又，在500倍稀釋時，顯現與化學劑的Savier Flowable 20同等程度的非常高的防除效果。

實施例8及比較例8：水稻苗立枯細菌病之防除效果試驗

在以PD液體培養基於27℃振盪培養52小時而得的水稻苗立 枯細菌病菌(Burkholderia plantarii)懸浮液(1×10⁸CFU/ml)中，將水稻稻種(品種：越光(koshihikari))在減壓條件下浸漬接種1小時，做成水稻之苗立枯細菌病感染稻種。在製劑例1及製劑例3的水和劑的100倍稀釋液中，將上述水稻苗立枯細菌病感染稻種浸漬24小時後，捨棄浸漬處理液，在32℃的濕室內保持1日而催芽。將Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)稀釋100倍者做為比較劑，並以同樣方式供試。在已填入育苗培土的直徑6cm的塑膠杯中播種催芽種子，播種3日後，保持在30℃育苗庫內，再在25℃的濕室內管理15日後，調查全苗有無發病，求出發病苗率。防除價(%)是根據無處理區的發病苗率而算出。每1杯的播種量是乾稻種3g(90至110粒)。結果如表8所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使水稻苗立枯細菌病的發病率比無處理區顯著減少，得到極高的防除效果。

實施例9及比較例9：對黃瓜苗立枯病的效果試驗

將苗立枯病菌的麩培養物3g與滅菌土壤500ml混合後填入塑膠盆中，將製劑例2及製劑例4的粒劑1g與土壤混合處理。將Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)84mg做為比較劑，以同樣方式供試。播種黃瓜(相模半白)，在23℃栽培1週後，調査發芽率。防除效力(防除價%)是根據無處理區的發芽率而算出。 結果如表9所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使黃瓜苗立枯病的發病率比無處理區顯著減少，得到極高的防除效果。

實施例10及比較例10：對甘薯根瘤線蟲2期幼蟲的活性

對由茄子(十兩)的根採集的卵嚢在24小時以內孵化的甘薯根瘤線蟲2期幼蟲，測試殺線蟲活性。對24孔的微盤添加製劑例1及製劑例3的100倍稀釋液(tween20 5000倍稀釋溶液)及當量的根瘤線蟲2期幼蟲懸浮液(約50條)。將Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)稀釋100倍者做為比較劑，以同樣方式供試。將盤密封，配置在28℃且相對濕度約50%的孵育器內。72小時後，在立體顯微鏡下觀察而調查死亡率。此時，將不動的線蟲視為死亡。殺線蟲率是由下列的式算出。結果如表10所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而得到對甘薯根瘤線蟲2期幼蟲之極高殺線蟲活性。

[數1]殺線蟲率=(死亡線蟲數÷供試線蟲數)×100

實施例11及比較例11：對甘薯根瘤線蟲的防除效果試驗

在1/10000a瓦式盆(Wagner pot)中，以40kg/10a的比率將製劑例2及製劑例4的粒劑均勻混合至甘薯根瘤線蟲汚染土壤，定植迷你番茄(品種：Sugar Lamp)。將Impression水和劑(S.D.S Biotech股份有限公司)以3.3kg/10a的比率做為比較劑，以同樣方式供試。定植1個月後，將根的被害度(根瘤程度)以下述基準進行類別評估，並以下列式求出根瘤指數，算出防除價。結果如表11所示，藉由以本發明的微生物製劑進行處理，而使甘薯根瘤線蟲所致的根部被害比無處理區顯著減少，得到極高的防除效果。

被害度0：完全沒有看到瘤

1：乍看之下並不顯眼，但可看到有少數瘤

2：散見有少數瘤

3：看到有中程度的瘤

4：在根圈整體看到有多數瘤

實施例12及比較例12至13：AT-332的植物成長促進效果(基礎試驗)

以***芥(Arabidopsis thaliana)為對象，進行基礎培養皿試驗，測定AT-332的植物成長促進效果。將***芥種子浸漬在1%次亞氯酸鈉液20分鐘後，在70%乙醇浸漬2分鐘，進行種子表面的殺菌。之後，以滅菌蒸餾水清洗，使用於實驗。在分割成兩部分的滅菌培養皿中注入含有0.8%洋菜的Murashige and Skoog salt培養基(pH5.7)，冷卻後，使用於實驗。

將AT-332(實施例12)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)GB03(比較例12)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MBI600(比較例13)接種於放置在上述培養皿的分割的一邊之滅菌紙圓盤，並在分割的剩餘部分接種***芥發芽種子。接種有菌與***芥的盤係在22℃(照光12小時/遮光12小時)下保溫10日，觀察植物的生長狀況。將結果與未接種菌的對照組(第2圖(a))的結果一起示於第2圖(a)至(d)的照片。即使是相較於美國實際販賣使用的枯草芽孢桿菌GB03(比較例12；(c))、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MBI600(比較例13；(d))，AT-332(實施例12；(b))也可看到顯著的植物成長促進效果。

實施例13：AT-332及AT-79菌株的植物成長促進效果(盆栽試驗)

以白菜幼苗為對象，進行盆栽試驗，測定AT-332及AT-79菌株的植物成長促進效果。首先，將AT-332及AT-79菌株以液體LB培養基培養24小時後，將菌體離心收集。將回收的菌體以滅菌的0.85%氯化鈉水溶液懸浮成1×10⁹CFU/ml，在預先滅菌的培養土中以每1kg混合40ml的比率混合，而製成處理土壤。另一方面，在預先滅菌的培養土中，只將滅菌的0.85%氯化鈉水溶液以每1kg混合40ml的比率混合，而製成無處理土壤。將處理土壤及無處理土壤各100g裝入塑膠製盆(口徑70mm×高度68mm)中，並於其播種白菜(品種：野崎白菜二號)的種子。之後，放置於設定22℃的溫室內，30日後測定生長的白菜的生重量。結果示於第3圖。可看到AT-332及AT-79菌株對作物有明顯的成長促進效果。

<110> SDS生技股份有限公司

<120> 芽孢桿菌屬所屬之菌株、微生物製劑及植物的栽培方法

<130> BOF-7708PCT

<150> PCT/JP2011/062109

<151> 2011-05-26

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1472

<212> DNA

<213> Bacillus sp.AT-332/AT-79

<400> 1

<210> 2

<211> 1472

<212> DNA

<213> Bacillus sp.AT-332

<400> 2

<210> 3

<211> 1472

<212> DNA

<213> Bacillus sp.AT-79

<400> 3

該代表圖無元件符號及其代表之意義。

Claims (9)

1. 一種菌株，其特徴係具有序列號碼2或3的鹼基序列所示的16S rDNA。
2. 如申請專利範圍第1項所述之菌株，其菌株本體及/或菌株的培養物顯示植物病害防除作用、線蟲防除作用及/或植物成長促進作用的效果。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-332菌株，係具有序列號碼2的鹼基序列所示的16S rDNA。
4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之芽孢桿菌屬品種(Bacillus sp.)AT-79菌株，係具有序列號碼3的鹼基序列所示的16S rDNA。
5. 一種微生物製劑，係含有申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之菌株及/或菌株的培養物做為有效成分。
6. 如申請專利範圍第5項所述之微生物製劑，係植物病害防除劑。
7. 如申請專利範圍第5項所述之微生物製劑，係線蟲防除劑。
8. 如申請專利範圍第5項所述之微生物製劑，係植物成長促進劑。
9. 一種植物栽培方法，係以申請專利範圍第5項至第8項中任一項所述之微生物製劑處理植物。