KR101820010B1 - 살선충 효능을 갖는 신규 엔테로박터 속 hk169균주 및 그의 배양물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 살선충 효능을 갖는 신규 엔테로박터 속 HK169균주 및 그의 배양물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제제에 관한 것으로, 본 발명의 엔테로박터속 HK169 균주는 뿌리혹선충에 대해 높은 살선충력 가지며, 상기 균주의 배양액은 토마토뿌리혹선충병에 대해 방제효과가 있으므로 HK169균주 및 그의 배양물은 살선충 활성을 통한 식물병 방제제로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

살선충 효능을 갖는 신규 엔테로박터 속 HK169균주 및 그의 배양물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제제{Enterobacter sp. HK169 having nematicidal effect and uses thereof}

본 발명은 살선충 효능을 갖는 신규 엔테로박터 속 HK169균주 및 그의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 뿌리혹선충에 대한 살선충 활성을 가지는 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) HK169 균주 또는 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 선충병 방제제 및 상기 균주를 이용해 뿌리혹선충병을 방제하는 방법에 관한 것이다.

식물에 기생하는 토양선충에 기인하는 작물손실은 전 세계적으로 연 1000 억달러를 초과하는 것으로 추정된다. 토양선충은 선형동물에 속하는 동물 중 토양에서 자유생활을 하면서 식물에 기생하는 선충으로써, 선충강에 속하는 0.2 ~ 0.5mm 크기의 매우 작은 생물로 육안으로 확인하기가 어려우며, 현미경으로 관찰이 가능하다. 대부분의 선충 형태는 실 모양으로 가늘거나 방주형으로 좌우대칭형이며, 몸에는 마디가 없고 체표에 주름을 가지고 있다. 식물에 기생하는 토양선충으로 수백 종이 알려져 있으며 농작물에 기생할 경우, 토마토, 당근, 고구마, 담배, 사과나무 등의 뿌리를 혹투성이로 만들고 무, 우엉, 감자, 국화, 복숭아나무 등의 뿌리를 썩게 한다.

특별히, 식물기생성 토양선충에 속하는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 식물 뿌리에 기생하며 중요한 농작물에 심각한 피해를 준다. 뿌리혹선충은 작물의 뿌리 생장점 부근으로 침입하여 식물의 뿌리내에서 양분을 흡즙하면서 성장하는데 이 과정에서 선충이 분비하는 호르몬의 작용으로 작물의 뿌리가 혹 모양으로 변하게 된다. 이러한 기생으로 인해 다른 병원성 미생물에 감염되거나 뿌리 생육을 방해하여 작물의 정상적인 생육을 방해하여 결국엔 작물이 고사하게 되며 국내의 경우 경북 성주군의 시설재배지대의 약 54%의 포장이 뿌리혹선충에 감염되어 있다고 확인된 바 있다. 전 세계적으로 토양선충에 의한 식용작물의 손실은 매년 약 11 %로 추정되고, 이외에 주요 채소, 과일 등의 주요 경제작물에 일으키는 손실은 매년 약 14 %에 이르러 세계적으로 매년 800억 달러 이상의 손실을 가져오는 것으로 보고되었다.

농업에서 중요한 선충은 고구마 뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근 뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바 뿌리혹선충(Meloidogyne javanica) 및 땅콩 뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 등이 알려져 있으며, 주로 참외, 오이, 토마토, 딸기, 고추 등의 과채류와 인삼 등에 피해를 준다. 특히 국내 시설재배지에서 문제가 되고 있는 뿌리혹선충으로 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita) 및 멜로이도기네 아레나리아(Meloidogyne arenaria)가 있으며 뿌리혹선충의 방제를 위한 방법으로써, 메틸 브로마이드(methyl bromide) 등의 훈증제와 포스티아제이트(fosthiazate) 및 카바메이트(carbamates) 등의 살선충제가 주로 이용되어 왔다.

하지만, 이들 화학적 방제는 인축에 대한 위험성과 잔류독성, 환경오염 등과 같은 문제점을 야기한다.

식물 병원성을 가진 토양선충은 두꺼운, 불침투성 큐티클, 또는 외피로 덮혀 있고, 극소량의 감각 신경 세포를 가지기 때문에 식물 병원성 선충을 방제하기가 특히 어렵다. 많은 해충 방제 화합물이 신경독으로서 작용할 수 있으나, 식물 병원성 선충에서 노출되는 소수의 신경 세포는 살선충 화합물의 유효 표적 면적을 감소시키므로 극도로 높은 신경독성을 갖는 살선충 화합물의 끊임없는 개발이 요구된다. 또한, 식물 병원성 토양선충들은 토양 또는 식물 뿌리에서 주로 발견되기 때문에, 상기 토양선충이 방제제(control agent)에 노출되는 것이 상대적으로 어렵고, 이러한 유독성 화합물이 지하로 스며들면서 지하수가 오염될 우려가 있으므로, 신경독에 기반한 살선충제의 사용은 토양과 지표수 모두를 오염시킬 수 있다.

또한, 가장 많이 사용되는 방법 중 하나인 훈증제를 사용한 소독방법에서도 주로 사용되는 메틸 브로마이드(methyl bromide)가 높은 인체 유독성을 갖고 성층권(stratospheric)오존층에 해로운 영향을 미치는 것으로 알려져 최근 몬트리올 의정서(Montreal Protocol)를 통해 2015년부터 사용을 금지하고 있으며, 나아가, 토양 훈증 소독은 토양에 있는 유기체 및 유익한 미생물까지 무분별하게 죽일 수 있는 위험성이 있다.

또한, 가장 효과적인 비-훈증(non-fumigant) 살선충제로 알려진 카바메이트(carbamates)는 독성이 높은 것으로 유명하며, 2010년 8월부터, 카바메이트의 생산 회사인, Bayer는, 미국 내에서 감자 및 감귤류 과일(citrus)에 모든 생산 등록을 취소하는 것에 대해 합의하였고, 이 회사가 생산하는 카바메이트는 2018년 8월을 끝으로 완전히 생산이 종결된다.

아울러, 물리적 방제 방식도 매 3 년마다 방제를 해야하는 번거로움과 고비용이 소요되는 단점이 있다.

이러한 상기의 제한들을 고려할 때, 환경적으로 안전한 생태 친화적인 방법의 이용에 대한 요구가 절실하다.

식물기생성 선충을 방제할 수 있는 환경 친화적인 방제법 가운데 미생물을 이용하는 방법이 있다. 미생물은 생장하면서 다양한 2차 대사산물을 생산하거나 선충을 직접 가해함으로써 다양한 살선충 활성을 갖는다는 연구 보고가 있다(Zhao 등, 2014). 따라서, 우수한 살선충 활성을 갖는 균주를 선발하고 이를 이용하여 뿌리혹선충병을 방제할 수 있는 균주를 개발하는 연구가 요구된다.

한편, 대한민국공개특허 2009-0111514호에서는 '항균력, 살선충 및 식물 생장 촉진 효과를 갖는 페니바실러스 폴리믹사 GBR508 균주 및 이를 이용한 식물의 복합병 방제 및 식물 생장 촉진 방법'이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 2015-00159360호에서는 '신규한 미생물 균주 및 친환경 비료용 미생물제제'가 개시되어 있으나, 본 발명의 뿌리혹선충에 대한 살선충 활성을 가지는 엔테로박터 속 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은 뿌리혹선충병에 대해 상업적 생물농약으로서의 효용가치가 있는 생물 소재를 찾고자 연구를 수행하던 중, 토마토 뿌리로부터 분리한 엔테로박터 속 HK169 균주가 높은 뿌리혹선충에 대해 높은 살선충력을 갖는 것을 확인하였고, 상기 균주의 배양액이 토마토뿌리혹선충병에 대해 방제효과가 있는 것을 확인함으로써, HK169균주가 살선충 활성을 통한 선충 방제용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 살선충 효능을 갖는 신규 엔테로박터 속 HK169균주 및 그의 배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KACC81020BP로 기탁된 신규한 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) HK169 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 선충 방제용 조성물을 작물, 작물의 종자 또는 재배지로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는 선충 방제 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 엔테로박터 속 HK169 균주의 배양방법을 제공한다:

1) 제 1항의 균주를 멸균된 배지에 접종하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 균주를 진탕 배양하는 단계.

본 발명의 엔테로박터속 HK169 균주는 뿌리혹선충에 대해 높은 살선충력 가지며, 상기 균주의 배양액은 토마토뿌리혹선충병에 대해 방제효과가 있으므로 HK169균주 및 그의 배양물은 살선충 활성을 통한 식물병 방제제로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 엔테로박터 속 HK169 균주의 콜로니 모양(A)과 주사전자현미경 사진(B)을 나타낸 도이다.
도 2는 엔테로박터 속 HK169 균주의 16S rRNA의 염기 서열(A) 및 gyrB 염기서열(B)을 기초로 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 도이다.
도 3은 엔테로박터 속 HK169 균주 배양액의 뿌리혹선충에 대한 in ivtro 살선충 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 엔테로박터 속 HK169 균주의 배양액의 뿌리혹선충 방제효과를 나타낸 도이다.
도 5는 엔테로박터 속 HK169 균주의 배양액 처리구의 방제효과 사진을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KACC81020BP로 기탁된 신규한 엔테로박터 속 (Enterobacter sp.) HK169 균주를 제공한다.

상기 균주는 서열번호 5의 16s rRNA의 염기서열 또는 서열번호 6의 gyrB 유전자의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 균주는 살선충효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 실시예 및 실험예에서, 토마토 뿌리로부터 신규한 엔테로박터 속 HK169 균주를 분리하여, 배지상에서 흰색의 콜로니 및 0.4 ~ 1.2 ㎛ 크기의 포자를 형성하는 것을 확인하였고(도 1 참조), 균주의 염기서열분석을 통해 엔테로박터 속 균주임을 확인하였으며(도 2), 이의 HK169 균주 배양액 또는 배양여액이 토마토 뿌리혹선충 2령 유충에 대해 높은 살선충 활성 및 방제활성을 보임을 확인하였다(도 3 참조)

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.

상기 선충은 상기 뿌리혹선충은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 또는 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기의 선충 방제용 조성물을 작물, 작물의 종자 또는 재배지로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는 선충 방제 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실험예에서, 뿌리혹 선충에 감염된 토마토에 상기HK169 균주의 배양 원액을 처리하였을 때 토마토 뿌리의 뿌리혹선충이 현저히 감소함을 뿌리혹지수 평가방법 및 실제 육안으로 최종 확인하였다(도 4 및 5 참조).

따라서 HK169균주 및 그의 배양물은 살선충 활성을 통한 식물병 방제제로 유용하게 활용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 엔테로박터 속 HK169 균주 배양방법을 제공한다:

1) 제 1항의 균주를 멸균된 배지에 접종하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 균주를 진탕 배양하는 단계.

본 발명에 따른 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) HK169 균주는 우리나라에서 자생하는 미생물로서, 뿌리혹선충병에 대한 살선충 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게, 생물농약으로서의 효용가치가 있는 생물 소재를 찾고자 연구를 수행하던 중, 한국화학연구원 온실에서 뿌리혹선충 증식을 위해 재배중인 토마토의 뿌리로부터 세균을 분리하였다. 분리한 세균의 배양액은 살선충력 및 식물생장촉진 효과가 있었으며, 이에 본 발명자들은 상기 균주를 HK169로 명명하고 동정한 결과 엔테로박터 속(Enterobacter sp.)임을 알 수 있었다. 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) HK169 균주(이하, HK169 균주로 기재함)를 2016년 05월 02일자로 국제기탁기관(농촌진흥청, 농업유전자원센터)에 기탁하였다(기탁번호: KACC 81020BP).

HK169 균주는 트립틱 소이 한천 배지(tryptic soy agar medium), 영양 한천 배지(nutrient agar medium), 루리아-버타니 한천배지(Luria-Bertani agar) 등 세균 생장을 위한 일반적인 배지에서 잘 자라며, 15 내지 35의 온도, 바람직하게는, 25 내지 30의 온도에서 잘 생장하며 약 30가 생장 최적 온도이다.

HK169 균주는 뿌리혹선충 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita)에 대해 다양한 농도의 배양액을 처리하였을 때, 실험실 조건뿐만 아니라 온실실험에서 농도 의존적인 살선충 활성을 보였다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따른 상기 뿌리혹선충은 고구마 뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근 뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바 뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩 뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 및 토마토 뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 작물은 바람직하게는 토마토일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

HK169 균주는 벼, 토마토, 밀, 오이, 보리, 고추 등 작물에 대하여 전혀 병원성을 나타내지 않으므로 생물적 방제제로 이용이 가능하며, 토양에 처리 시 작물의 생육을 촉진하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 생장 촉진용 미생물 제제 및 생물비료를 제공한다. 본 발명의 미생물 제제 및 생물비료를 적용할 수 있는 식물로는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 토마토이다.

본 발명에 따른 HK169 균주 자체, 이의 배양물 또는 배양물의 추출물을 포함하는 조성물을 식물이 생장하고 있는 환경(예: 토양, 물)에 관주 처리함으로써 뿌리혹선충병을 방제할 수 있다. 필요에 따라, 작물보호제 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하고 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 선충병 방제용 조성물로서 사용할 수 있다. 상기 담체로는 물, 화이트 카본, 카올린 등을 사용할 수 있으며, 상기 배양물은 약체 배양물 또는 고체 배양물일 수 있다.

본 발명 조성물은 배양된 균체의 배양액, 동결건조 균체과 전분, 조단백질 및 암석분 등을 포함 하도록 분말, 펠렛 또는 과립, 마이크로캡슐 등으로 제형화하여 그대로 사용할 수 있다. 상기 조성물은 표면 활성화제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급 촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, U.V. 보호제, 완충제 등 목적 선충 및 작물에 따라 적용하기 용이한 다른 성분을 부가함으로 수득할 수 있다. 본 발명의 조성물은 적용하기 전에 적당한 양의 물 또는 다른 희석제로 희석을 하여 직접 적용하기에 적합한 형태 또는 농축액 또는 1차 조성물일 수 있다. 살선충성 농도는 특히 농축 또는 직접 사용하거나 하는 것은 특정 제제의 성질, 적용 식물의 종류, 재배지역의 토양 및 기후 등에 따라 다양하게 적용될 수 있다.

본 발명에서, 엔테로박터 속 HK169균주 및 그의 배양물을 사용하여 제제를 제조하는 경우, 경우에 따라 각종 보조제를 이용할 수 있다. 여기서 이용할 수 있는 보조제로서는, 해당 기술 분야에서 이용되는 것이면 어느 것이라도 좋고, 예를 들면 계면활성제, 결합제, 식물유, 광물유, 침강 방지제, 증점제, 소포제, 동결 방지제, 방부제 등을 들 수 있다.

이러한 제제의 제조는 해당 분야에서의 통상의 방법에 준하여 행할 수 있고, 이 방법에 의해 제조되는 제제로서는, 예를 들어 유화가능한 농축물, 분진, 습윤 가능한 분말, 가용성 농축물, 과립, 물로 희석했을 때 활성 성분을 수중에 고상 입자로서 침전시키는 농축 조성물 형태의 제제, 오일계 현탁 농축물 또는 수성 현탁 농축물을 들 수 있다. 이러한 제제 중 바람직한 것은 물로 희석 했을 때 활성 성분을 수중에 고상 입자로서 침전시키는 농축 조성물 형태의 제제, 오일계 현탁 농축물 또는 수성 현탁 농축물이다.

상기 담체는 고상 담체와 액상 담체로 나뉜다. 고상 담체는 예를 들어 전분, 당류, 락토오스, 셀룰로오스 분말,시클로덱스트린, 활성 탄소, 대두 분말, 밀가루 또는 우유 분말인 동물성 또는 식물성 분말; 또는 예를 들어 활석, 고령 토, 벤토나이트, 유기 벤토나이트, 탄산칼슘, 황산칼슘, 중탄산나트륨, 제올라 이트, 규조토, 화이트 카본(white carbon), 점토, 알루미나 또는 실리카인 광물 성 분말일 수 있다. 액상 담체는 예를 들어 물; 알코올, 예컨대 에틸 알코올 또는 에틸렌 글리콜; 케톤, 예컨대 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤 또는 이소포론; 에테르, 예컨대 디옥산 또는 테트라히드로푸란; 지방족 탄화 수소, 예컨대 케로센, 석유 또는 액상 파라핀; 식물유, 예컨대 옥수수유, 대두유, 아마인유, 해바라기유, 면실유, 평지유, 에스테르화 평지유, 예컨대 페이즈(Phase) II, 상품명 (러브랜드 인더스트리즈(Loveland INDUSTRIES LTD.)사 제조), 메틸화 식물유, 예컨대 메틸화 평지유, 올리브유, 피마자유, 팜유 또는 아보카도유; 동물유, 예컨대 우지 또는 고래 기름; 광물유, 예컨대 기계 오일, 중유, 실리콘유, 나프텐용매, 메틸나프탈렌 또는 1-페닐-1-크실릴에탄; 방향족 탄화수소, 예컨대 크실렌, 트리메틸벤젠, 테트라메틸벤젠, 시클로헥산 또는 용매 나프타; 친수성 유기 용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 디메틸술폭시드, 시클로헥사논, γ-부티로락톤, N-메틸-2-피롤리돈, N-옥틸-2-피롤리돈, N-도데실-2-피롤리돈, 테트라히드록시푸르푸릴 알코올 또는 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르; 에스테르, 예컨대 지방산의 에틸 아세테이트 또는 글리세롤 에스테르; 또는 니트릴, 예컨대 아세토니트릴일 수 있다.

본 발명의 선충 방제제 조성물이, 물로 희석했을 때 활성 성분을 수중에 고상 입자로서 침전시키는 농축 조성물 형태로 제형되는 경우, 담체로서 친수성 유기 용매를 사용한다. 친수성 유기 용매는 바람직하게는 N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 시클로헥사논, γ-부티로락톤 또는 N-메틸-2-피롤리돈이다. 안트라닐아미드 화합물 또는 그의 염과, 친수성 유기 용매의 적절한 배합비는 중량비로 보통 1:500 내지 2:1, 바람직하게는 1:50 내지 1:1이다.

본 발명의 선충 방제제 조성물이 오일계 현탁 농축물 형태로 제형되는 경우, 식물유, 광물유 및 동물유로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1종 이상의 오일계 액상 담체를 사용한다. 안트라닐아미드 화합물 또는 그의 염과, 오일계 액상 담체의 적절한 배합비는 중량비로 보통 1:500 내지 1:4, 바람직하게는 1:50 내지 1:10이다.

본 발명의 선충 방제제 조성물이 수성 현탁 농축물 형태로 제형되는 경우, 안트라닐아미드 화합물 또는 그의 염과, 물의 적절한 배합비는 중량비로 보통 1:500 내지 2:1, 바람직하게는 1:50 내지 1:1이다.

본 발명에서는, 필요에 따라서 다른 농약, 예를 들면 살충제, 살진드기제, 살선충제, 토양살충제 또는 살균제를 혼용, 병용할 수 있고, 이 경우에는 한층 우수한 효과를 나타내는 경우도 있다.

상기 다른 농약 중 살충제, 살진드기제, 살선충제 또는 토양살충제와 같은 활성 화합물로서는 예를 들어 하기의 것(일반명; 이들 중 일부는 신청 중임)을 들 수 있다: 프로페노포스(profenofos), 디클로르보스(dichlorvos), 페나미포스 (fenamiphos), 페니트로티온(fenitrothion), EPN, 디아지논 (diazinon), 클로르피리포스-메틸(chlorpyrifos-methyl), 아세페이트(acephate), 프로티오포스(prothiofos), 포스티아제이트(fosthiazate), 포스포카르브 (phosphocarb), 카두사포스(cadusafos), 디슬루포톤(dislufoton), 클로르 피리포스(chlorpyrifos),데메톤-S-메틸(demeton-S-methyl), 디메토에이트 (dimethoate), 메타미도포스(methamidophos), 이미시아포스(imicyafos), 이속사티온(isoxathion), 이소펜포스(isofenphos), 에티온(ethion), 에트림포스 (etrimfos), 퀴날포스(quinalphos), 디메틸빈포스(dimethylvinphos), 술프로포스 (sulprofos), 티오메톤(thiometon), 바미도티온(vamidothion), 피라클로포스 (pyraclofos), 피리다펜티온(pyridaphenthion), 피리미포스-메틸 (pirimiphosmethyl) 프로파포스(propaphos), 포살론(phosalone), 포르모티온 (formothion), 말라티온(malathion), 테트라클로빈포스 (tetrachlovinphos), 클로르펜빈포스(chlorfenvinphos), 시아노포스(cyanophos), 트리클로르폰 (trichlorfon), 메티다티온(methidathion), 펜토에이트 (phenthoate), ESP, 아진포스-메틸(azinphos-methyl),펜티온(fenthion), 헵테노포스(heptenophos), 메톡시클로르(methoxychlor), 파라티온(paration), 모노크로토포스 (monocrotophos), 파라티온-메틸(parathion-methyl), 테르부포스 (terbufos), 포스파미돈(phospamidon), 포스메트(phosmet), 포레이트(phorate)와 같은 유기 포스페이트 화합물;

카르바릴(carbaryl), 프로폭수르(propoxur), 알디카르브(aldicarb), 카르보푸란(carbofuran), 티오디카르브(thiodicarb), 메토밀(methomyl), 옥사밀(oxamyl), 에티오펜카르브(ethiofencarb), 피리미카르브(pirimicarb),

페노부카르브(fenobucarb), 카르보술판(carbosulfan), 벤푸라카르브 (benfuracarb), 벤디오카르브(bendiocarb), 푸라티오카르브(furathiocab), 이소프로카르브(isoprocarb), 메톨카르브(metolcarb), 크실릴카르브

(xylylcarb), XMC, 페노티오카르브(fenothiocarb)와 같은 카르바메이트 화합물;

카르탑(cartap), 티오시클람(thiocyclam), 벤술탑(bensultap), 티오술탑-나트륨 (thiosultap-sodium)과 같은 네레이스톡신 유도체;디코폴(dicofol), 테트라디폰 (tetradifon), 엔도술판(endosulfan), 디에노클로르(dienochlor), 디엘드린(dieldrin)과 같은 유기 염소 화합물;

펜부타틴 옥사이드(fenbutatin oxide), 시헥사틴(cyhexatin)과 같은 유기 금속 화합물;

펜발레레이트(fenvalerate), 페르메트린(permethrin), 시페르메트린 (cypermethrin), 델타메트린(deltamethrin), 시할로트린(cyhalothrin), 테플루트린(tefluthrin), 에토펜프록스(ethofenprox), 플루펜프록스 (flufenprox), 펜프로파트린(fenpropathrin), 비펜트린(bifenthrin), 이미데이트 (imidate), 시플루트린(cyfluthrin), 플루시트리네이트 (flucythrinate), 플루발리네이트(fluvalinate), 시클로프로트린(cycloprothrin), 람다-시할로트린(lambda-cyhalothrin), 피레트린스 (pyrethrins), 에스펜발레레이트 (esfenvalerate), 테트라메트린(tetramethrin), 레스메트린(resmethrin), 프로트리펜부트(protrifenbute), 제타-시페르메트린(zeta-cypermethrin), 아크리나트린(acrinathrin), 알파-시페르메트린(alpha-cypermethrin), 알레트린(allethrin), 감마-시할로트린 (gamma-cyhalothrin), 세타-시페르메트린(theta-cypermethrin), 타우-플루발리네이트(tau-fluvalinate), 트랄로메트린(tralomethrin), 프로플루트린 (profluthrin), 베타-시페르메트린(beta-cypermethrin), 베타-시플루트린(beta-cyfluthrin), 메토플루트린(metofluthrin), 페노트린(phenothrin)과 같은 피레트로이드 화합물;

디플루벤주론(diflubenzuron), 클로르플루아주론(chlorfluazuron), 테플루벤주론 (teflubenzuron), 플루페녹수론(flufenoxuron), 루페누론(lufenuron), 노발루론 (novaluron), 트리플루무론(triflumuron), 헥사플루무론(hexaflumuron), 비스트리플루론 (bistrifluron), 노비플루무론(noviflumuron), 플루아주론 (fluazuron)과 같은 벤조일우레아 화합물;

메토프렌(methoprene), 피리프록시펜(pyriproxyfen), 페녹시카르브 (fenoxycarb), 디오페놀란([0061] diofenolan)과 같은 유충 호르몬 모양 화합물;

피리다벤(pyridaben)과 같은 피리다지논 화합물;

펜피록시메이트(fenpyroximate), 피프로닐(fipronil), 테부펜피라드 (tebufenpyrad), 에티프롤(ethiprole), 톨펜피라드(tolfenpyrad), 아세토프롤 (acetoprole), 피라플루프롤(pyrafluprole), 피리프롤(pyriprole)과 같은 피라졸 화합물;

이미다클로프리드(imidacloprid), 니텐피람(nitenpyram), 아세타미프리드 (acetamiprid), 티아클로프리드(thiacloprid), 티아메톡삼 (thiamethoxam), 클로티아니딘(clothianidin), 니디노테푸란(nidinotefuran), 디노테푸란 (dinotefuran) 등의 네오니코티노이드;

테부페노지드(tebufenozide), 메톡시페노지드(methoxyfenozide), 크로마페노지드(chromafenozide), 할로페노지드(halofenozide) 등의 히드라진 화합물;

피리다릴(pyridaryl), 플로나카미드(flonicamid) 등과 같은 피리딘 화합물;

스피로디클로펜(spirodiclofen) 등과 같은 테트론산 화합물;

플루아크리피린(fluacrypyrin) 등과 같은 스트로빌루린 화합물;

플루페네림(flufenerim) 등과 같은 피리딘아민 화합물;

디니트로 화합물; 유기 황 화합물; 우레아 화합물; 트리아진 화합물; 히드라존 화합물; 또한 그 밖의 화합물로서, 부프로페진(buprofezin), 헥시티아족스 (hexythiazox), 아미트라즈(amitraz), 클로르디메포름 (chlordimeform), 실라플루오펜(silafluofen), 트리아자메이트(triazamate), 피메트로진 (pymetrozine), 피리미디펜(pyrimidifen), 클로르페나피르 (chlorfenapyr), 인독사카르브(indoxacarb), 아세퀴노실(acequinocyl), 에톡사졸(etoxazole), 시로마진(cyromazine), 1,3-디클로로프로펜(1,3-dichloropropene), 디아펜티우론(diafenthiuron), 벤클로티아즈(benclothiaz), 플루펜림(flufenerim), 비페나제이트(bifenazate), 스피로테트라매트 (spirotetramat), 프로파르깃트 (propargite), 베르부틴(verbutin), 스피로메시펜(spiromesifen), 티아졸릴신나노니트릴(thiazolylcinnanonitrile), 아미도플루메트(amidoflumet), 플루벤디아미드(flubendiamide), 클로펜테진 (clofentezine), 메타플루미존 (metaflumizone), 클로르안트라닐리프롤 (chlorantraniliprole), 시플루메토펜(cyflumetofen), 시에노피라펜 (cyenopyrafen), 피리플루퀴나존 (pyrifluquinazone), 페나자퀸(fenazaquin), 피리다벤(pyridaben), 클로로벤조에이트(chlorobenzoate), 술플루라미드 (sulfluramid), 히드라메틸논(hydramethylnon), 메트알데히드(metaldehyde), 리아노딘(ryanodine), HGW 86, IKA-2000. 또한, 바실루스 투린기엔세스 아이자와이(Bacillus thuringienses aizawai), 바실루스 투린기엔세스 쿠르스타키(Bacillus thuringienses kurstaki), 바실루스 투린기엔세스 이스라엘렌시스(Bacillus thuringienses israelensis), 바실루스 투린기엔세스 자포넨시스(Bacillus thuringienses japonensis), 바실루스 투린기엔세스 테네브리오니스(Bacillus thuringienses tenebrionis) 또는 바실루스 투린기엔세스(Bacillus thuringienses)가 생성하는 결정단백질 독소, 곤충 병원 바이러스, 곤충 병원 사상균, 선충 병원 사상균 등과 같은 미생물 농약, 아베르멕틴(avermectin), 밀베멕틴(milbemectin), 밀베마이신 (milbemycin), 스피노사드(spinosad),에마멕틴-벤조에이트(emamectin-benzoate), 이베르멕틴 (ivermectin), 레피멕틴(lepimectin), 스피네토람 (spinetoram), 아바멕틴(abamectin), 에마멕틴(emamectin)과 같은 항생 물질; 아자디라크틴(azadirachtin), 로테논(rotenone)과 같은 천연물; 디이트(deet)와 같은 기피제 등을 들 수 있다.

상기 다른 농약 중의, 살균 활성 화합물로서는 예를 들어 하기의 것 (일반명; 이들 중 일부는 신청 중이거나, 일본 식품의약품 안전평가원의 테스트 코드 중임)을 들 수 있다: 메파니피림(mepanipyrim), 피리메타닐 (pyrimethanil), 시프로디닐(cyprodinil)과 같은 아닐리노피리미딘 화합물;

플루아지남(fluazinam)과 같은 피리딘아민 화합물;

트리아디메폰 (triadimefon), 비테르탄올(bitertanol), 트리플루미졸 (triflumizole), 에타코나졸 (etaconazole),프로피코나졸(propiconazole), 펜코나졸(penconazole), 플루실라졸(flusilazole), 마이클로부타닐 (myclobutanil), 시프로코나졸 (cyproconazole), 테부코나졸(tebuconazole), 헥사코나졸 (hexaconazole), 푸르코나졸-시스(furconazole-cis), 프로클로라즈 (prochloraz), 메트코나졸 (metconazole), 에폭시코나졸(epoxiconazole), 테트라코나졸(tetraconazole), 옥스포코나졸-푸마르에이트(oxpoconazole fumarate), 시프코나졸(sipconazole), 프로티오코나졸(prothioconazole), 트리아디메놀(triadimenol), 플루트리아폴 (flutriafol), 디페노코나졸 (difenoconazole), 플루퀸코나졸 (fluquinconazole), 펜부코나졸 (fenbuconazole),브로무코나졸(bromuconazole), 디니코나졸(diniconazole), 트리시클라졸 (tricyclazole), 프로베나졸 (probenazole), 시메코나졸 (simeconazole), 페푸라조에이트(pefurazoate), 이프코나졸(ipconazole), 이미벤코나졸 (imibenconazole)과 같은 아졸 화합물;

퀴노메티오네이트(quinomethionate)[0075] 와 같은 퀴녹살린 화합물;

마네브(maneb), 지네브(zineb), 만코제브(mancozeb), 폴리카르바메이트 (polycarbamate), 메티람(metiram), 프로피네브(propineb), 티람(thiram)과 같은 디티오카르바메이트 화합물;

프탈라이드(fthalide), 클로로탈로닐(chlorothalonil), 퀸토젠 (quintozene)과 같은 유기 염소 화합물;

베노밀(benomyl), 티오파네이트-메틸(thiophanate-methyl), 카르벤다짐 (carbendazim), 티아벤다졸(thiabendazole), 푸베리아졸(fuberiazole), 시아조파미드(cyazofamid)와 같은 이미다졸 화합물;

시목사닐(cymoxanil)과 같은 시아노아세트아미드 화합물;

메탈락실(metalaxyl), 메탈락실-M(metalaxyl-M), 메페녹삼(mefenoxam), 옥사딕실(oxadixyl), 오푸레이스(ofurace), 베날락실(benalaxyl), 베날락실-M(benalaxyl-M, 별칭 키랄락실(kiralaxyl, chiralaxyl)), 푸랄락실(furalaxyl), 시프로푸람(cyprofuram)과 같은 페닐아미드 화합물;

디클로플루아니드(dichlofluanid)와 같은 술펜산 화합물;

수산화 제2 구리, 옥신동(oxine copper)와 같은 구리 화합물;

히멕사졸(hymexazol)과 같은 이속사졸 화합물;

포세틸-Al(fosetyl-Al), 톨코포스-메틸(tolcofos-methyl), S-벤질 O, O-디이소프로필포스포로티오에이트, O-에틸, S,S-디페닐포스포로디티오에이트, 알루미늄 에틸하이드로겐포스포네이트, 에디펜포스(edifenphos), 이프로벤포스(iprobenfos)와 같은 유기 인 화합물;

캅탄(captan), 캅타폴(captafol), 폴펫(folpet)과 같은 N-할로게노티오알킬 화합물;

프로시미돈(procymidone), 이프로디온(iprodione), 빈클로졸린 (vinclozolin)과 같은 디카르복시이미드 화합물;

플루톨라닐(flutolanil), 메프로닐(mepronil), 족사미드(zoxamide), 티아디닐(tiadinil)과 같은 벤즈아닐리드화합물;

카르복신(carboxin), 옥시카르복신(oxycarboxin), 티플루자미드 (thifluzamide), 펜티오피라드(penthiopyrad),보스칼리드(boscalid), 빅사펜 (bixafen), 플루오피람(fluopyram), 이소티아닐(isotianil)과 같은 아닐리드 화합물;

트리포린(triforine)과 같은 피페라진 화합물;

피리페녹스(pyrifenox)와 같은 피리딘 화합물;

페나리몰(fenarimol), 플루트리아폴(flutriafol)과 같은 카르비놀 화합물;

펜프로피딘(fenpropidine)과 같은 피페리딘 화합물;

펜프로피모르프(fenpropimorph), 스피록사민(spiroxamine), 트리데모르프 (tridemorph)와 같은 모르폴린 화합물;

펜틴 히드록시드(fentin hydroxide), 펜틴 아세테이트(fentin acetate)와 같은 유기 주석 화합물;

펜시큐론(pencycuron)과 같은 우레아 화합물;

디메토모르프(dimethomorph), 플루모르프(flumorph)와 같은 신남산 화합물;

디에토펜카르브(diethofencarb)와 같은 페닐카르바메이트 화합물:

플루디옥소닐(fludioxonil), 펜피클로닐(fenpiclonil)과 같은 시아노피롤 화합물;

아족시스트로빈(azoxystrobin), 크레속심-메틸(kresoxim-methyl), 메토미노펜(metominofen), 트리플록시스트로빈(trifloxystrobin, 피콕시스트로빈 (picoxystrobin), 오리자스트로빈(oryzastrobin), 디목시스트로빈 (dimoxystrobin), 피라클로스트로빈(pyraclostrobin), 플루옥사스트로빈 (fluoxastrobin), 플루아크리피림(fluacrypyrim)과 같은 스트로빌루린 화합물;

파목사돈(famoxadone)과 같은 옥사졸리디논 화합물;

에타복삼(ethaboxam)과 같은 티아졸카르복스아미드 화합물;

실티오팜(silthiopham)과 같은 실릴아미드 화합물;

이프로발리카르브(iprovalicarb), 벤티아발리카르브-이소프로필 (benthiavalicarb-isopropyl), 발리페날(valiphenal)과 같은 아미노산 아미드카르바메이트 화합물;

페나미돈(fenamidone)과 같은 이미다졸리딘 화합물;

펜헥사미드(fenhexamid)와 같은 히드록시아닐리드 화합물;

플루술파미드(flusulfamid)와 같은 벤젠술폰아미드 화합물;

시플루페나미드(cyflufenamid)와 같은 옥심 에테르 화합물;

페녹사닐(fenoxanil)과 같은 페녹시아미드 화합물;

안트라퀴논 화합물;

크로톤산 화합물;

발리다마이신(validamycin), 카스가마이신(kasugamycin), 폴리옥신 (polyoxins)과 같은 항생 물질;

이미녹타딘(iminoctadine)과 같은 구아니딘 화합물; 및

그 밖의 화합물로서, 피리벤카르브(pyribencarb), 이소프로티올란 (isoprothiolane), 피로퀼론(pyroquilon), 디클로메진(diclomezine), 퀴녹시펜(quinoxyfen), 프로파모카르브 히드로클로라이드(propamocarb hydrochloride), 클로로피크린(chloropicrin), 다조메트(dazomet), 메탐-나트륨(metam-sodium), 니코비펜(nicobifen), 메트라페논(metrafenone), UBF-307, 디클로시메트(diclocymet), 프로퀴나지드(proquinazid), 아미술브롬 (amisulbrom; 별칭: 아미브롬돌(amibromdol)), 만디프로파미드(mandipropamid), 플루오피콜리드(fluopicolide), 카르프로파미드(carpropamid), 멥틸디노캅 (meptyldinocap), BCF051, BCM061, BCM062, AF-0201.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 토마토 뿌리로부터 엔테로박터 속 H169 균주의 분리

식물내생세균은 한국화학연구원 온실에서 뿌리혹선충 증식을 위해 재배중인토마토의 뿌리로부터 분리하였다.

구체적으로, 토마토 뿌리를 물로 씻은 후 1 cm 크기로 잘라 분쇄기에 넣고 물을 토마토 뿌리가 잠길 정도로 넣은 다음 60초간 분쇄하였다. 분쇄한 시료는 25 ㎛ 체를 이용하여 찌꺼기를 거른 다음 현탁액 0.1 ㎖을 취하여 Luria-Bertani agar(LB: 10% NaCl, 5% yeast extract, 10% trypton) 배지에 도말한 후, 30 배양기에서 3일간 배양하였다. 분리한 세균은 3번의 계대배양을 통해 단일 콜로니를 획득하였으며, HK169 균주로 명명하였다. HK169 균주는 100 ㎖의 멸균된 LB 배지가 들어 있는 500 ㎖ 삼각플라스크에서 150 rpm, 30 조건에서 3일 동안 진탕 배양하였다.

< 실험예 1> HK169 균주의 동정

상기 <실시예 1>에서 분리한 HK169균주를 하기 <실험예 2>에서 토마토 뿌리혹선충에 대한 방제활성을 확인한 후, 형태학적 및 유전자 염기서열을 통해 다음과 같이 동정하였다.

<1-1> 형태적 특성

HK169 균주를 동정하기 위하여 형태적 특성을 관찰하였다.

구체적으로, 분리한 HK169 균주는 LB 한천배지를 이용하여 30 배양기에서 3일 동안 진탕배양하였다. 균주의 포자형태와 크기는 주사전자현미경(Scanning Electron Microphotograph, SEM, JSM-6700F, JEOL Ltd, Japan)을 통해 조사하였다. 관찰을 위한 HK169 균주 시료는 글루타르알데히드 용액(0.2 M sodium cacodylate buffer, 20% paraformaldehyde, 8% glutaraldehyde)으로 고정시킨 후, 0.05 M 카고딜산나트륨 완충액(sodium cacodylate buffer)을 이용하여 세척하였다. 그 후, 2% 사산화 오스뮴(osmium tetroxide)과 0.1 M 카고딜산 완충액(cacodylate buffer)을 1:1로 섞어 다시 한 번 고정시켜 준 후, 에탄올을 이용하여 탈수하였다. 탈수한 균체를 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라젠(1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane)에 담근 후, 후드에서 하루 동안 증발시킨 후, 금박을 입혀 전자현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 HK169 균주는 배지상에서 흰색의 콜로니를 형성하였으며(도 1의 A), 간상형 모양으로 0.4 ~ 1.2 ㎛ 크기의 포자를 형성하는 것을 확인하였다(도 1의 B).

<1-2> HK169 균주의 염기서열 분석

HK169 균주의 분자계통학적 분석은 16S rRNA 및 gyrB 염기서열 분석을 통해 이루어졌다.

구체적으로, 균주를 5 ㎖ LB 액체 배지에서 30, 150 rpm 조건으로 3일 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 4, 13,000 rpm 조건에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 얻었다. 침강된 균체로부터 Qiagen사의 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 DNA를 획득하였다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 위해, 16S rRNA 유전자는 유니버셜 프라이머 세트[27F; 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 1), 1492R; 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 2)]를 그리고 gyrB 유전자는 프라이머 세트[gyr-320; 5'-TAARTTYGAYGAYAACTCYTAYAAAGT-3'(서열번호 3), rgyr-1260; 5'-CMCCYTCCACCARGTAMAGTTC-3'(서열번호 4)]를 이용하였다. 두 염기서열은 NCBI의 BLAST 프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과, HK169 균주는 엔테로박터 속 균주로 확인되었다.

엔테로박터속으로 분류된, HK169 균주의 16S rRNA 및 gyrB 염기서열을 엔테로박터속 내의 종 및 그 외의 관련된 분류군과 비교하기 위해, CLUSTAL W 프로그램으로 염기서열 alignment를 실시하였다. 16S rRNA 및 gyrB의 유사도는 근린 결합법에 의거한 MEGA 4.0 program을 이용하여 계통도를 작성하였다(Saitou와 Nei, 1987). 분자계통도는 거리행렬법 중의 하나인 Neighbour-joining 방법을 사용하여 구성하였으며, Bootstrap 분석은 MEGA 프로그램의 알고리즘을 이용하여 수행하였다.

그 결과, 도 2와 같은 계통수를 수득하였는데, HK169 균주는 계통적으로 엔테로박터 속 내에 위치하고 있었고, 부트스트랩 수치가 이를 뒷받침하였다. 또한, HK169 균주의 16S rRNA는 엔테로박터 속(Enterobacter sp. MK33: 99.79%) 균주 및 엔테로박터 아스브리애(Enterbacter asburiae: 99.59%)와 높은 유사도를 나타내었다(도 2의 A). 반면, HK169 균주의 gyrB 유전자는 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae: 98.14%) 및 엔테로박터 아스브리애(Enterbacter asburiae: 97.90%)와 높은 유사도를 나타내었다(도 2의 B). 이에 상기에서 분리된 균주를 엔테로박터 속 (Enterobacter sp.) HK169 균주라 명명하였으며, 2016년 04월 29일자로 국제기탁기관에 기탁하여 기탁번호(KACC 81020BP)를 부여 받았다.

< 실험예 2> 뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충 활성

상기 <실시예 1>에서 분리한 HK169 균주 배양액을 이용하여 토마토 뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충 활성을 조사하였다.

구체적으로, 실험에 사용한 뿌리혹선충은 Hwang 등(2014)이 분리 및 동정한 종으로서 '서광'(몬산토코리아) 품종의 토마토를 이용하여 온실(25±5)에서 증식하여 실험에 사용하였다. 원예용 상토(쑥쑥이, 농우바이오)와 멸균한 모래를 동량으로 혼합한 토양을 직경 9.5 cm 플라스틱 포트에 넣고, 파종하여 3주 동안 재배한 토마토 유묘를 이식하였다. 일주일 동안 더 재배한 후 뿌리혹선충의 알을 주당 10,000개씩 접종하였으며, 45일 내지 60일 동안 재배하여 토마토 뿌리에 혹이 형성된 것을 접종원으로 사용하였다.

뿌리혹선충이 심하게 감염된 토마토 뿌리를 채취하고, 뿌리에 생긴 혹과 난낭으로부터 뿌리혹선충 유충을 분리하여 실험에 사용하였다. 뿌리혹선충 유충의 분리는, 뿌리혹선충에 감염된 토마토 뿌리를 물로 씻은 후 1 cm 크기로 잘라 분쇄기에 넣고 0.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 토마토 뿌리가 잠길 정도로 넣은 다음 60초간 분쇄하였다. 분쇄한 시료는 65 ㎛ 체를 이용하여 찌꺼기를 거른 다음 25 ㎛ 체에 알을 수집하였다. 25 ㎛ 체에 모인 선충 알은 멸균수로 3번 세척하여 남아있는 차아염소산나트륨용액을 제거한 후, 선충 유충을 획득하였다.

선충(J2 유충) 현탁액(약 70 마리/100 ㎕)을 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 넣은 다음 HK169 균주 배양액을 1.25, 2, 5, 10%를 처리하여 웰당 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 하였다. 대조구로 아바멕틴(abamectin)을 1 ㎍/㎖ 수준으로 사용하였고, 무처리 대조구는 메탄올 용액을 1% 수준으로 처리하였다. 시료 처리 후 96-웰 마이크로 플레이트는 시료가 균일하게 섞이도록 30초 동안 교반하였으며, 선충의 산소결핍과 건조를 방지하기 위하여 상대습도 100%의 플라스틱 통에 넣은 후 25 ~ 27 배양기에서 보관하였다. 실험은 3반복을 수행하였으며, 시료 처리 48시간과 72시간 후 광학도립현미경(Olympus CKX41, Tokyo, Japan)하에서 곧게 뻗어 움직임이 없는 선충을 죽은 선충으로, 유연한 곡선형으로 움직임이 있는 선충을 살아있는 선충으로 판단하여 하기의 Abbott's formula를 이용하여 살선충율을 조사하였다(Abbott, 1925):

살선충율(%)=[처리구의 치사율-무처리구의 치사율]/

(100-무처리구의 치사율)] ×100.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 HK169 균주 배양액 처리 후 48시간 배양 뒤, 10% 처리구에서는 71.3%의 활성을 나타내었고, 5% 처리구에서는 89.9%의 살선충율을 보였으며, 2.5% 처리구에서도 50.7%의 활성을 나타내었다(도 3). 또한, 시료 처리 72시간 후, 10% 처리구에서는 98.2%의 활성을 나타냈으며, 5% 처리구에서는 78.1%의 살선충 활성을 보여 처리시간이 경과함에 따라 더 높은 방제활성을 보였다(도 3).

또한, HK169 균주 배양여액을 이용한 실험에서도 배양액을 처리한 실험과 유사한 결과를 얻었다. 상기 결과는 HK169 균주의 살선충 활성은 배양여액의 살선충 활성 물질에 기인하거나 세균 자체가 선충에 대해 살선충력을 나타내는 것을 제시한다.

< 실험예 3> 엔테로박터속 ( Enterobacter sp .) HK169 균주의 배양액의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제 효과

엔테로박터 속 HK169 균주의 배양액이 토마토 뿌리혹선충병에 대해 방제효과가 있는지 확인하기 위해 하기의 in vivo 실험을 수행하였다.

뿌리혹선충 포트 실험은 한국화학연구원 5 연구동 내에 있는 유리온실(25±5)에서 실시하였다. 직경 9.5 cm 크기의 플라스틱 포트에 멸균한 모래 400 g을 담고 원예용 상토(부농사)에 파종하여 온실에서 2주 동안 재배한 서광 품종의 토마토(몬산토코리아)를 이식하였다. 뿌리혹선충에 감염된 토마토뿌리로부터 뿌리혹선충 알을 체취하기 위하여 뿌리혹선충이 심하게 감염된 토마토 뿌리를 채취하고, 뿌리에 생긴 혹과 난낭으로부터 뿌리혹선충 알을 분리하여 실험에 사용하였다. 뿌리혹선충 알의 분리는, 뿌리혹선충에 감염된 토마토 뿌리를 물로 씻은 후 1 cm 크기로 잘라 분쇄기에 넣고 0.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 토마토 뿌리가 잠길 정도로 넣은 다음 60초간 분쇄하였다. 분쇄한 시료는 65 ㎛ 체를 이용하여 찌꺼기를 거른 다음 25 ㎛ 체에 알을 수집하였다. 25 ㎛ 체에 모인 선충 알은 멸균수로 3번 세척하여 남아있는 차아염소산나트륨용액을 제거한 후, 선충 알을 획득하였다.

획득한 뿌리혹선충 알을 각 포트당 10,000개를 접종한 후 LB 배지에서 30, 150 rpm에서 3일 동안 진탕 배양한 원액과 1/3, 1/20배 희석액을 일주일 간격으로 2회 토양관주 처리하였다. 대조구로 선충탄(a.i. fosthiazate 5%) 2,000배 희석액을 1회 처리하였으며, 무처리구로 멸균수를 처리하였다. 실험은 각 실험구당 5개의 식물체를 사용하였으며, 3번 반복하여 수행하였다. 선충 알 접종 6주 후 식물체의 뿌리를 수돗물로 깨끗이 씻은 후 뿌리혹 지수를 조사하였다(Taylor 와 Sasser, 1978). 뿌리혹 지수는 0~4단계 (0은 0%, 1은 1~25%, 2는 25~50%, 3은 51~75%, 4는 76~100%)를 적용하여 조사하였다.

통계분석은 SAS(SAS Institute, Inc., 1989, Cary, NC) 프로그램을 이용 하여 일원배치(one-way analysis of variance) ANOVA 분석하였으며, Duncan's multiple range test(P = 0.05)를 이용하여 유의성 검정을 수행하였다.

그 결과, 도 4 및 5에 나타난 바와 같이 온실에서의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제활성은 HK169 배양액의 1/20배 희석액 처리시, 무처리구와 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 원액과 1/3배 희석액 처리구에서 각각 60, 25%의 방제활성을 보여 농도 의존적인 방제활성이 나타나는 것을 알 수 있었으며, 배양원액 처리시 대조구로 사용한 선충탄과 비슷한 방제효과를 보여 뿌리혹선충을 방제할 수 있는 미생물농약으로 이용할 수 있다고 보여진다(도 4 및 도 5).

농촌진흥청 농업유전자원센터 KACC81020BP 20160429

Claims (7)

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4. 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)에 대하여 살선충 효과를 갖는, KACC81020BP로 기탁된 신규한 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) HK169 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 방제용 조성물에 있어서,
   상기 배양액은 KACC81020BP로 기탁된 신규한 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) HK169 균주를 LB(Luria Bertani) 배지에서 3일 동안 진탕 배양한 배양액인 것을 특징으로 하는 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 방제용 조성물.
   
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6. 제 4항의 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 방제용 조성물을 작물, 작물의 종자 또는 재배지로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는 토마토뿌리혹선충 방제 방법.
   
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