TW201331225A - 針對表皮生長因子受體３（ｈｅｒ３）之域ｉｉｉ及域ｉｖ之ｈｅｒ３抗體 - Google Patents

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Heather Huet
Christian Carsten Silvester Kunz
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Abstract

本發明係關於抗體或其片段，其結合於HER3受體之域3內之非線性抗原決定基且抑制配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。本發明亦關於抗體或其片段，其結合於HER3之域3-4內之胺基酸殘基且抑制配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導；及該等抗體或其片段之組合物及使用方法。

Description

針對表皮生長因子受體3(HER3)之域III及域IV之HER3抗體
本發明係關於抗體或其片段，其結合於HER3受體之域3內之非線性抗原決定基且抑制配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。本發明亦關於抗體或其片段，其結合於HER3之域3-4內之胺基酸殘基且抑制配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導；及該等抗體或其片段之組合物及使用方法。
本申請案主張於2011年12月5日申請之美國臨時申請案第61/566,912號的優先權，該臨時申請案之內容以全文引用的方式併入本文中。
人類表皮生長因子受體3(ErbB3，亦稱HER3)為一種受體蛋白酪胺酸激酶且屬於受體蛋白酪胺酸激酶之表皮生長因子受體(EGFR)子族，該子族亦包括EGFR(HER1、ErbB1)、HER2(ErbB2、Neu)及HER4(ErbB4)(Plowman等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：4905-4909；Kraus等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：9193-9197；及Kraus等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：2900-2904)。類似於原型表皮生長因子受體，跨膜受體HER3由細胞外配位體結合域(ECD)、ECD內之二聚化域、跨膜域、細胞內蛋白酪胺酸激酶樣域(TKD)及C端磷酸化域組成。不同於其他HER家族成員，HER3之激酶域顯示極低的固有激酶活性。
配位體神經調節蛋白1(NRG)或神經調節蛋白2結合於HER3之細胞外域，且藉由促進與諸如HER2之其他二聚化搭配物的二聚化來活化受體介導之信號傳導路徑。雜二聚化引起HER3之細胞內域活化及轉磷酸化，且為一種不僅使信號多樣化，而且亦放大信號之方式。另外，HER3雜二聚化亦可在缺乏活化配位體下發生，且此通常稱為非配位體依賴性HER3活化。舉例而言，當HER2由於基因擴增而高量表現(例如乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌中)時，可形成自發的HER2/HER3二聚體。在此情況下，認為HER2/HER3為最具活性的ErbB信號傳導二聚體，因此高度轉換。
已在若干類型癌症，諸如乳癌、肺癌、腸胃癌及胰臟癌中發現HER3增加。有趣地，已顯示HER2/HER3表現與自非侵襲期進展至侵襲期之間具有相關性(Alimandi等人，(1995)Oncogene 10：1813-1821；DeFazio等人，(2000)Cancer 87：487-498；Naidu等人，(1988)Br.J.Cancer 78：1385-1390)。因此，需要干擾HER3介導之信號傳導的藥劑。
本發明係基於意外地發現結合於包含HER3之域3內之胺基酸殘基的HER3受體之非線性抗原決定基且阻斷配位體依賴性(例如神經調節蛋白)與非配位體依賴性HER3信號傳導路徑的抗體或其片段。本發明亦基於發現結合於HER3之域3-4內之胺基酸殘基且阻斷配位體依賴性(例如神經調 節蛋白)與非配位體依賴性HER3信號傳導路徑的抗體或其片段。
因此，在一個態樣中，本發明係關於一種識別HER3受體之非線性抗原決定基的分離之抗體或其片段，其中該非線性抗原決定基包含HER3受體之域3內之胺基酸殘基，其中該抗體或其片段結合於結合表面B，且其中抗體或其片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
在一個實施例中，結合表面B包含至少一個選自由胺基酸殘基335-342、398、400、424-428、431、433-434及455組成之群之胺基酸殘基。在另一個實施例中，抗體或其片段進一步結合於結合表面A。在一個實施例中，結合表面A包含至少一個選自由胺基酸殘基362-376組成之群之胺基酸殘基。
在另一個態樣中，本發明係關於一種識別HER3受體之非線性抗原決定基的分離之抗體或其片段，其中該非線性抗原決定基包含HER3受體之域3內之胺基酸殘基，其中該抗體或其片段結合於包含至少一個選自結合表面A之胺基酸殘基及至少一個選自結合表面B之胺基酸殘基的結合表面，且其中抗體或其片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
在一個實施例中，抗體或其片段阻斷HER3受體上之HER3配位體結合。在一個實施例中，HER3配位體係選自由神經調節蛋白1(NRG)、神經調節蛋白2、β細胞素、肝素結合之表皮生長因子及表皮調節素組成之群。在一個實 施例中，抗體或其片段具有選自由以下組成之群之任一特徵：結合於HER3受體之不活化狀態；因抗體或其片段與HER3之域之間的位阻而阻止HER3採用活化構形；藉由降低域3中之可撓度來阻止HER3採用活化構形；誘發域3殘基371-377進行阻止HER3採用活化構形之構形變化；將HER3去穩定化，使得其易於降解；促進細胞表面HER3下調；及產生易進行蛋白降解或無法與其他受體酪胺酸激酶二聚化之非天然HER3二聚體。在一個實施例中，結合表面A包含胺基酸殘基362-376。在一個實施例中，結合表面B包含胺基酸殘基335-342、398、400、424-428、431、433-434及455。
在一個實施例中，非線性抗原決定基包含胺基酸殘基335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集。在一個實施例中，抗體或其片段之VH結合於至少一個以下HER3殘基：Ile365、Thr366、Asn369、Gly370、Asp371、Pro372、Trp373、His374、Lys375、Gln400及Lys434。在一個實施例中，抗體或其片段之VL結合於至少一個以下HER3殘基：Gly335、Ser336、Gly337、Ser338、Phe340、Gln341、Asp362、Leu364、Ile365、Thr366、His374、Ile376、Asn398、Gln400、Tyr424、Asn425、Arg426、Phe428、Leu431、Met433、Lys434、Tyr455。在一個實施例中，在表現HER2及HER3之細胞中在缺乏HER3配位體下抗體或其片段結合於HER3受體減少HER2-HER3蛋白複合物之非配位體 依賴性形成。在一個實施例中，如藉由HER3非配位體依賴性磷酸化分析所評估，抗體或其片段抑制HER3磷酸化。在一個實施例中，HER3非配位體依賴性磷酸化分析使用HER2擴增細胞，其中該等HER2擴增細胞為SK-Br-3細胞及BT-474。在一個實施例中，在表現HER2及HER3之細胞中在存在HER3配位體下抗體或其片段結合於HER3受體減少HER2-HER3蛋白複合物之配位體依賴性形成。在一個實施例中，如HER3配位體依賴性磷酸化分析所評估，抗體或其片段抑制HER3磷酸化。在一個實施例中，HER3配位體依賴性磷酸化分析使用在神經調節蛋白(NRG)存在下經刺激之MCF7細胞。在一個實施例中，抗體係選自由單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體及合成抗體組成之群。
在另一個態樣中，本發明係關於識別HER3受體之抗原決定基的分離之抗體或其片段，其中該抗原決定基包含HER3受體之域3-4內之胺基酸殘基，且其中抗體或其片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
在一個實施例中，抗原決定基包含至少一個選自由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基329-498(域3)組成之群之胺基酸殘基及至少一個選自由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基499-642(域4)組成之群之胺基酸殘基。在一個實施例中，包含域3-4內之胺基酸殘基的抗原決定基係選自由線性抗原決定基、非線性抗原決定基及構形抗原決定基組成之群。在一個實施例中，在表現HER2及HER3之細胞中在缺乏HER3配 位體下抗體或其片段結合於HER3受體減少HER2-HER3蛋白複合物之非配位體依賴性形成。在一個實施例中，如HER3非配位體依賴性磷酸化分析所評估，抗體或其片段抑制HER3磷酸化。在一個實施例中，HER3非配位體依賴性磷酸化分析使用HER2擴增細胞，其中該等HER2擴增細胞為SK-Br-3細胞及BT-474。在一個實施例中，在表現HER2及HER3之細胞中在存在HER3配位體下抗體或其片段結合於HER3受體減少HER2-HER3蛋白複合物之配位體依賴性形成。在一個實施例中，如HER3配位體依賴性磷酸化分析所評估，抗體或其片段抑制HER3磷酸化。在一個實施例中，HER3配位體依賴性磷酸化分析使用在神經調節蛋白(NRG)存在下經刺激之MCF7細胞。
在另一個態樣中，本發明係關於一種針對HER3受體之分離之抗體或其片段，其具有至少1×107 M-1、108 M-1、109 M-1、1010 M-1、1011 M-1、1012 M-1、1013 M-1之解離(KD)，其中該抗體或其片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。在一個實施例中，如選自由磷酸化HER3及磷酸化Akt組成之群之活體外磷酸化分析所量測，抗體或其片段抑制HER3磷酸化。
在另一個態樣中，本發明係關於一種分離之抗體或其片段，其結合於HER3之域3內與表1中描述之抗體相同的非線性抗原決定基。
在另一個態樣中，本發明係關於一種分離之抗體或其片段，其結合於HER3之域3-4內與表2中描述之抗體相同的 胺基酸殘基。
在另一個態樣中，本發明係關於結合於HER3之抗體之片段，其選自由Fab、F(ab2)'、F(ab)2'、scFv、VHH、VH、VL、dAb組成之群，其中該抗體之該片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
在另一個態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含抗體或其片段及醫藥學上可接受之載劑。在一個實施例中，該醫藥組合物進一步包含另一治療劑。在一個實施例中，該另一治療劑係選自由HER1抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、mTOR抑制劑及PI3激酶抑制劑組成之群。在一個實施例中，該另一治療劑為：HER1抑制劑，其選自由馬妥珠單抗(Matuzumab)(EMD72000)、Erbitux®/西妥昔單抗(Cetuximab)、Vectibix®/帕尼單抗(Panitumumab)、mAb 806、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)、Iressa®/吉非替尼(Gefitinib)、CI-1033(PD183805)、拉帕替尼(Lapatinib)(GW-572016)、Tykerb®/二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、Tarceva®/鹽酸厄羅替尼(Erlotinib HCL)(OSI-774)、PKI-166及Tovok®組成之群；HER2抑制劑，其選自由帕妥珠單抗(Pertuzumab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、MM-111、來那替尼(neratinib)、拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼/Tykerb®組成之群；HER3抑制劑，其選自由MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)及抑制 HER3之小分子組成之群；及HER4抑制劑。在一個實施例中，另一治療劑為HER3抑制劑，其中HER3抑制劑為MOR10703。在一個實施例中，另一治療劑為選自由西羅莫司(Temsirolimus)/Torisel®、雷達莫司(ridaforolimus)/德佛莫司(Deforolimus)、AP23573、MK8669、依維莫司(everolimus)/Affinitor®組成之群之mTOR抑制劑。在一個實施例中，另一治療劑為選自由GDC 0941、BEZ235、BKM120及BYL719組成之群之PI3激酶抑制劑。
在一個態樣中，本發明係關於一種治療癌症之方法，其包含選擇患有表現HER3之癌症的個體，向該個體投與有效量之包含表1或表2中揭示之抗體或其片段的組合物。在一個實施例中，個體為人類且癌症係選自由以下組成之群：乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌、周圍神經鞘腫瘤、神經鞘瘤、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、巴雷特氏食道癌(Barretts esophageal cancer)、神經膠母細胞瘤、軟組織之透明細胞肉瘤、惡性間皮瘤、神經纖維瘤、腎癌及黑色素瘤、***癌、良性***增生(BPH)、男子女乳症及子宮內膜異位。在一個實施例中，癌症為乳癌。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其片段之用途，其係用作藥劑。在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其片段之用途，其係用於治療由HER3配位體依賴性信號傳導或非配位體依賴性信號傳導路徑介導之癌症。在 一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其片段之用途，其係用於製造供治療由HER3配位體依賴性信號傳導或非配位體依賴性信號傳導路徑介導之癌症的藥劑，該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰臟癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌、周圍神經鞘腫瘤、神經鞘瘤、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、巴雷特氏食道癌、神經膠母細胞瘤、軟組織之透明細胞肉瘤、惡性間皮瘤、神經纖維瘤、腎癌、黑色素瘤、***癌、良性***增生(BPH)、男子女乳症及子宮內膜異位。
定義
為更容易地瞭解本發明，首先定義某些術語。另外的定義在實施方式通篇闡明。
如本文所用之短語「信號傳導」或「信號傳導活性」係指一般由蛋白質-蛋白質相互作用(諸如生長因子結合於受體)起始，引起信號自細胞之一部分傳遞至細胞之另一部分的生物化學因果關係。對於HER3，傳遞包含引起信號傳導之一系列反應中一或多種蛋白質上之一或多個酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基的特異性磷酸化。次末過程通常包括核事件，引起基因表現變化。
如本文所用之術語「HER3」或「HER3受體」(亦稱「ErbB3」)係指哺乳動物HER3蛋白，且「her3」或「erbB3」係指哺乳動物her3基因。較佳HER3蛋白為存在 於細胞之細胞膜中的人類HER3蛋白。人類her3基因描述於美國專利第5,480,968號及Plowman等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：4905-4909中。
人類HER3如寄存編號NP_001973(人類)中定義，且以下表示為SEQ ID NO：1。所有命名均針對全長不成熟HER3(胺基酸1-1342)。不成熟HER3在位置19與20之間裂解，得到成熟HER3蛋白(20-1342胺基酸)。
mrandalqvl gllfslargs evgnsqavcp gtlnglsvtg daenqyqtly klyercevvm gnleivltgh nadlsflqwi revtgyvlva mnefstlplp nlrvvrgtqv ydgkfaifvm lnyntnssha lrqlrltqlt eilsggvyie kndklchmdt idwrdivrdr daeivvkdng rscppchevc kgrcwgpgse dcqtltktic apqcnghcfg pnpnqcchde caggcsgpqd tdcfacrhfn dsgacvprcp qplvynkltf qlepnphtky qyggvcvasc phnfvvdqts cvracppdkm evdknglkmc epcgglcpka cegtgsgsrf qtvdssnidg fvnctkilgn ldflitglng dpwhkipald peklnvfrtv reitgylniq swpphmhnfs vfsnlttigg rslynrgfsl limknlnvts lgfrslkeis agriyisanr qlcyhhslnw tkvlrgptee rldikhnrpr rdcvaegkvc dplcssggcw gpgpgqclsc mysrggvcv thcnflngep refaheaecf schpecqpme gtatcngsgs dtcaqcahfr dgphcvsscp hgvlgakgpi ykypdvqnec rpchenctqg ckgpelqdcl gqtlvligkt hltmaltvia glvvifmmlg gtflywrgrr iqnkramrry lergesiepl dpsekankvl arifketelr klkvlgsgvf gtvhkgvwip egesikipvc ikviedksgr qsfqavtdhm laigsldhah ivrllglcpg sslqlvtqyl plgslldhvr qhrgalgpql llnwgvqiak gmyyleehgm vhmlaamv llkspsqvqv adfgvadllp pddkqllyse aktpikwmal esihfgkyth qsdvwsygvt vwelmtfgae pyaglrlaev pdllekgerl aqpqictidv ymvmvkcwmi denirptfke laneftrmar dpprylvikr esgpgiapgp ephgltnkkl eevelepeld ldldleaeed nlatttlgsa lslpvgtlnr prgsqsllsp ssgympmnqg nlgescqesa vsgssercpr pvslhpmprg clasessegh vtgseaelqe kvsmcrsrsr srsprprgds ayhsqrhsll tpvtplsppg leeedvngyv mpdthlkgtp ssregtlssv glssvlgtee ededeeyeym nrrrrhspph pprpssleel gyeymdvgsd lsaslgstqs cplhpvpimp tagttpdedy eymnrqrdgg gpggdyaamg acpaseqgye emrafqgpgh qaphvhyarl ktlrsleatd safdnpdywh srlfpkanaq rt(SEQ ID NO：1)
如本文所用之術語「HER3配位體」係指結合及活化HER3之多肽。HER3配位體之實例包括(但不限於)神經調節蛋白1(NRG)及神經調節蛋白2、β細胞素、肝素結合之表皮生長因子及表皮調節素。該術語包括天然存在之多肽的生物活性片段及/或變異體。
「HER2-HER3蛋白複合物」為含有HER2受體及HER3受體之非共價締合寡聚物。此複合物可在表現此等受體中之兩者的細胞暴露於HER3配位體(例如NRG)時或在HER2為活性/過度表現時形成。
如本文所用之短語「HER3活性」或「HER3活化」係指寡聚(例如含有HER3之複合物增加)、HER3磷酸化、構形重排(例如由配位體誘發之構形重排)及HER3介導之下游信號傳導增加。
在HER3背景下使用之術語「穩定」或「穩定化」係指抗體或其片段在不阻斷配位體結合於HER3下直接維持(鎖定、繫栓、保持、優先結合、偏好)HER3之不活化狀態或構形，使得配位體結合不再能夠活化HER3。
如本文所用之術語「配位體依賴性信號傳導」係指 HER3經由配位體活化。HER3活化藉由雜二聚化及/或HER3磷酸化增加，使得下游信號傳導路徑(例如PI3K)活化證實。如使用實例中描述之分析所量測，相對於未處理(對照)細胞，在暴露於抗體或其片段之刺激細胞中抗體或其片段可統計上顯著減少磷酸化HER3之量。表現HER3之細胞可為天然存在之細胞株(例如MCF7)或可藉由將編碼HER3蛋白之核酸引入宿主細胞中來重組產生。細胞刺激可經由外部添加活化HER3配位體或藉由內在表現活化配位體發生。
「減少細胞中神經調節蛋白誘發之HER3活化」的抗體或其片段為如使用實例中描述之分析所量測，相對於未處理(對照)細胞，統計上顯著減少HER3酪胺酸磷酸化的抗體或其片段。此可基於HER3暴露於NRG及相關抗體後之HER3磷酸化酪胺酸含量來確定。表現HER3蛋白之細胞可為天然存在之細胞或細胞株(例如MCF7)或可重組產生。
如本文所用之術語「非配位體依賴性信號傳導」係指在缺乏配位體結合必要條件下的細胞HER3活性(例如磷酸化)。舉例而言，非配位體依賴性HER3活化可為諸如EGFR及HER2之HER3雜二聚體搭配物中HER2過度表現或活化突變之結果。相對於未處理(對照)細胞，在暴露於抗體或其片段之細胞中，抗體或其片段可統計上顯著減少磷酸化HER3之量。表現HER3之細胞可為天然存在之細胞株(例如SK-Br-3)或可藉由將編碼HER3蛋白之核酸引入宿主細胞中來重組產生。
如本文所用之術語「阻斷」係指停止或阻止相互作用或過程，例如停止配位體依賴性或非配位體依賴性信號傳導。
如本文所用之術語「識別」係指抗體或其片段發現其在HER3之域3、HER3之域4或HER3之域3與域4中的抗原決定基且與其相互作用(例如結合)。抗原決定基可為線性、非線性或構形抗原決定基。舉例而言，抗體或其片段與HER3之胺基酸殘基335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集相互作用。在另一個實例中，抗體或其片段與至少一個選自胺基酸殘基329-498(域3)或其子集之胺基酸殘基相互作用。在另一個實例中，抗體或其片段與至少一個選自胺基酸殘基499-642(域4)或其子集之胺基酸殘基相互作用。在另一個實例中，抗體或其片段與至少一個選自HER3之域3(SEQ ID NO：1之胺基酸殘基329-498)之胺基酸殘基及至少一個選自域4(SEQ ID NO：1之胺基酸殘基499-642)之胺基酸殘基或其子集相互作用。
如本文所用之短語「同時結合」係指HER3配位體可與HER3抗體或其片段一起結合於HER3受體上之配位體結合位點。此意謂抗體與配位體可一起結合於HER3受體。僅僅為了說明，HER3配位體NRG可與HER3抗體一起結合於HER3受體。量測配位體與抗體之同時結合的分析描述於實例部分中。
如本文所用之術語「不能」係指抗體或其片段未做特定 事件。舉例而言，「不能活化信號傳導」之抗體或其片段為未引發信號傳導之抗體或其片段。
如本文所用之術語「抗體」係指與HER3抗原決定基相互作用(例如藉由結合、位阻、穩定化/去穩定化、空間分佈)且抑制信號傳導之全抗體。天然存在之「抗體」為包含至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈藉由二硫鍵相互連接之醣蛋白。每一重鏈均包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域CH1、CH2及CH3。每一輕鏈均包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有更保守區域，稱為構架區(FR)。每一VH及VL均包含三個CDR及四個FR，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白結合於宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。術語「抗體」包括例如單株抗體、人類抗體、人類化抗體、駱駝化抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)、二硫化物連接之Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段及抗個體基因型(抗-Id)抗體(包括例如針對本發明抗體之抗-Id抗體)及以上任一者之抗原決定基結合片段。抗體可具有任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。
輕鏈與重鏈均分成具有結構及功能同源性之區域。術語「恆定」與「可變」在功能上使用。在此方面，應瞭解輕鏈(VL)與重鏈(VH)部分之可變域決定抗原識別及特異性。相反，輕鏈(CL)及重鏈(CH1、CH2或CH3)之恆定域賦予重要的生物性質，諸如分泌、經胎盤移動性、Fc受體結合、補體結合及其類似性質。按照慣例，恆定區域之編號隨著其愈來愈遠離抗原結合位點或抗體之胺基端而增加。N端為可變區且C端為恆定區；CH3及CL域事實上分別包含重鏈及輕鏈之羧基端。
如本文所用之短語「抗體片段」係指保留與HER3抗原決定基特異性相互作用(例如藉由結合、位阻、穩定化/去穩定化、空間分佈)之能力且抑制信號傳導的抗體之一或多個部分。結合片段之實例包括(但不限於)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2片段，包含兩個Fab片段在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接之二價片段；Fd片段，由VH及CH1域組成；Fv片段，由抗體單臂之VL及VH域組成；dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH域組成；及分離之互補決定區(CDR)。
此外，雖然Fv片段之兩個域VL及VH藉由各別基因編碼，但其可使用重組方法，藉由能夠使其製成其中VL與VH區配對形成單價分子之單一蛋白質鏈的合成連接子接合(稱為單鏈Fv(scFv)，參見例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426；及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語「抗體片 段」內。此等抗體片段使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且該等片段用與完整抗體相同之方式篩選供應用。
抗體片段亦可併入單域抗體、最大抗體、微型抗體、內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv(參見例如Hollinger及Hudson,(2005)Nature Biotechnology 23：1126-1136)。抗體片段可移植於基於多肽(諸如III型纖維結合蛋白(Fn3))(參見美國專利第6,703,199號，其描述纖維結合蛋白多肽單功能抗體)之骨架中。
抗體片段可併入包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)，與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區之單鏈分子(Zapata等人，(1995)Protein Eng.8：1057-1062；及美國專利第5,641,870號)。
術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合於免疫球蛋白或以其他方式與分子相互作用之任何蛋白質決定子。抗原決定子一般由諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈之分子的化學活性表面分組組成，且可具有特定三維結構特徵以及荷質比特徵。抗原決定基可為「線性」、「非線性」或「構形」。
術語「線性抗原決定基」係指蛋白質與相互作用分子(諸如抗體)之間的相互作用所有點沿蛋白質之一級胺基酸序列線性存在(連續)的抗原決定基。一旦確定抗原上之所需抗原決定基，則可例如使用本發明中描述之技術產生針 對該抗原決定基之抗體。或者，在發現過程期間，抗體之產生及表徵可闡明有關所需抗原決定基之資訊。由此資訊，接著可競爭性篩選結合於相同抗原決定基之抗體。一種實現此之方法為進行交叉競爭研究以發現彼此競爭性結合之抗體，例如競爭結合於抗原之抗體。基於交叉競爭將抗體「劃分」之高通量製程描述於國際專利申請案第WO 2003/48731號中。如熟習此項技術者所瞭解，實際上抗體可特異性結合之任何東西可為抗原決定基。抗原決定基可包含抗體結合之彼等殘基。
術語「非線性抗原決定基」係指特定域內(例如域1內、域2內、域3內或域4內)具有形成三維結構之非鄰接胺基酸的抗原決定基。在一個實施例中，非線性抗原決定基在域2內。非線性抗原決定基亦可存在於兩個或兩個以上域之間(例如域3-4之間的界面)。非線性抗原決定基亦指作為特定域內三維結構之結果的非鄰接胺基酸。
術語「構形抗原決定基」係指其中不連續胺基酸以三維構形聚集之抗原決定基。在構形抗原決定基中，相互作用點橫穿蛋白質上序列彼此分離之胺基酸殘基存在。如熟習此項技術者所瞭解，由形成分子形狀之殘基或側鏈佔據的空間有助於確定抗原決定基為何者。
在一個實施例中，抗原決定基在HER3之域3內。在一個實施例中，抗原決定基為包含HER3之域3內之胺基酸殘基的非線性抗原決定基。在一個實施例中，非線性抗原決定基包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基335-342、362-376、 398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集。
在另一個實施例中，抗原決定基在HER3之域4內。在一個實施例中，抗原決定基包含至少一個選自域4(SEQ ID NO：1之胺基酸殘基499-642)之胺基酸殘基或其子集。在一個實施例中，抗原決定基為HER3之域4內的線性抗原決定基。在一個實施例中，抗原決定基為HER3之域4內的非線性抗原決定基。在另一個實施例中，抗原決定基為HER3之域4內的構形抗原決定基。
在另一個實施例中，抗原決定基在HER3之域3-4內。在一個實施例中，抗原決定基包含至少一個選自域3(SEQ ID NO：1之胺基酸殘基329-498)之胺基酸殘基或其子集。在一個實施例中，抗原決定基包含至少一個選自域4(SEQ ID NO：1之胺基酸殘基499-642)之胺基酸殘基或其子集。在一個實施例中，抗原決定基包含至少一個選自域3(SEQ ID NO：1之胺基酸殘基329-498)之胺基酸殘基及至少一個選自域4(SEQ ID NO：1之胺基酸殘基499-642)之胺基酸殘基或其子集。在一個實施例中，抗原決定基為線性抗原決定基。在一個實施例中，抗原決定基為非線性抗原決定基。在另一個實施例中，抗原決定基為構形抗原決定基。
一般而言，對特定標靶抗原具有特異性之抗體將優先識別蛋白質及/或大分子之複雜混合物中標靶抗原上之抗原決定基。
包括抗原決定基之既定多肽區域可使用此項技術中熟知 之許多抗原決定基定位技術鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編.，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。舉例而言，線性抗原決定基可藉由例如在固體支撐物上同時合成大量肽(該等肽與蛋白質分子之部分相對應)且使肽與抗體反應，同時肽仍附著於支撐物來確定。該等技術在此項技術中已知且描述於例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：3998-4002；Geysen等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：78-182；Geysen等人，(1986)Mol.Immunol.23：709-715中。類似地，非線性及構形抗原決定基容易藉由諸如利用例如氫/重氫交換、x射線晶體學及二維核磁共振確定胺基酸之空間構形來鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols，上述。蛋白質之抗原區域亦可使用標準抗原性及親水性圖，諸如使用例如可自the Oxford Molecular Group獲得之Omiga 1.0版軟體程式計算之抗原性及親水性圖圖鑑別。此電腦程式採用霍普/伍茲方法(Hopp/Woods method)(Hopp等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：3824-3828)來確定抗原性型態，且採用凱替-多利特技術(Kyte-Doolittle technique)(Kyte等人，(1982)J.MoI.Biol.157：105-132)用於親水性圖。
如本文所用之術語「結合表面」係指HER3(例如HER3之域3)上呈三維組態之多個鄰接或非鄰接表面。此等表面形成抗原決定基之一部分且與抗體或其片段相互作用。舉 例而言，結合表面可包含至少2個表面(例如表面A及表面B，參見圖4D)、至少3個表面(例如表面A、表面B及表面C)、至少4個表面(例如表面A、表面B、表面C及表面D)、至少5個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D及表面E)、至少6個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E及表面F)、至少7個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E、表面F及表面G)、至少8個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E、表面F、表面G及表面H)、至少9個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E、表面F、表面G、表面H及表面I)或至少10個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E、表面F、表面G、表面H、表面I及表面J)。
如本文所用之術語「結合表面A」係指HER3之域3上包含至少一個選自由胺基酸殘基362-376組成之群之胺基酸殘基的表面。
如本文所用之術語「結合表面B」係指HER3之域3上包含至少一個選自由胺基酸殘基335-342、398、400、424-428、431、433-434及455組成之群之胺基酸殘基的表面。
如本文所用之短語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指包括抗體、抗體片段、雙特異性抗體等，具有實質上一致之胺基酸序列或來源於相同遺傳來源的多肽。此術語亦包括具有單分子組成之抗體分子製劑。單株抗體組合物顯示對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。
如本文所用之短語「人類抗體」包括具有其中構架區與 CDR區均來源於人類起源序列之可變區之抗體。此外，若抗體含有恆定區，則恆定區亦來源於該等人類序列，例如人類生殖系序列，或人類生殖系序列之突變型式，或含有來源於人類構架序列分析之共同構架序列的抗體，例如如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296：57-86中所描述。免疫球蛋白可變域(例如CDR)之結構及位置可使用熟知之編號方案(例如Kabat編號方案、Chothia編號方案或Kabat與Chothia之組合)界定(參見例如Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services(1991),Kabat等人編；Lazikani等人，(1997)J.Mol.Bio.273：927-948)；Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案第91-3242號U.S.Department of Health and Human Services；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；及Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273：927-948)。
本發明之人類抗體可包括未由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變所引入之突變，或促進穩定性或製造之保守取代)。
如本文所用之短語「人類單株抗體」係指具有其中構架區與CDR區均來源於人類序列之可變區之顯示單一結合特異性的抗體。在一個實施例中，人類單株抗體藉由融合瘤產生，該融合瘤包括自轉殖基因非人類動物(例如轉殖基 因小鼠)獲得之具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組的B細胞融合於永生化細胞。
如本文所用之短語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如自針對人類免疫球蛋白基因轉殖基因或轉染色體之動物(例如小鼠)或由此製備之融合瘤分離的抗體，自經轉型以表現人類抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離之抗體，自重組之組合人類抗體文庫分離之抗體及藉由包含所有或一部分人類免疫球蛋白基因剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。該等重組人類抗體具有其中構架區及CDR區來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。在某些實施例中，然而，該等重組人類抗體可經受活體外突變誘發(或當使用針對人類Ig序列轉殖基因之動物時，經受活體內體細胞突變誘發)，因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然來源於人類生殖系VH及VL序列且與其相關，但可不天然存在於活體內人類抗體生殖系譜系內的序列。
兩個實體之間的特異性結合意謂平衡常數(KA)(kon/koff)為至少102 M-1、至少5×102 M-1、至少103 M-1、至少5×103 M-1、至少104 M-1、至少5×104 M-1、至少105 M-1、至少5×105 M-1、至少106 M-1、至少5×106 M-1、至少107 M-1、至少5×107 M-1、至少108 M-1、至少5×108 M-1、至少109 M-1、至少5×109 M-1、至少1010 M-1、至少5×1010 M-1、至少1011 M-1、至少5×1011 M-1、至少1012 M-1、至少5×1012 M-1、至少1013 M-1、至少5×1013 M-1、至少1014 M-1、至少5×1014 M-1、至少1015 M-1或至少5×1015 M-1之結合。
短語「特異性(或選擇性)結合」係指蛋白質及其他生物製品之異源群體中HER3結合抗體與HER3受體之結合反應。除上述平衡常數(KA)之外，本發明之HER3結合抗體通常亦具有小於5×10-2 M、小於10-2 M、小於5×10-3 M、小於10-3 M、小於5×10-4 M、小於10-4 M、小於5×10-5 M、小於10-5 M、小於5×10-6 M、小於10-6 M、小於5×10-7 M、小於10-7 M、小於5×10-8 M、小於10-8 M、小於5×10-9 M、小於10-9 M、小於5×10-10 M、小於10-10 M、小於5×10-11 M、小於10-11 M、小於5×10-12 M、小於10-12 M、小於5×10-13 M、小於10-13 M、小於5×10-14 M、小於10-14 M、小於5×10-15 M或小於10-15 M或更低之解離速率常數(KD)(koff/kon)，且以其對結合於非特異性抗原(例如HSA)之親和力至少兩倍的親和力結合於HER3。
在一個實施例中，如使用本文中描述或熟習此項技術者已知之方法(例如BIAcore分析、ELISA、FACS、SET)(Biacore International AB,Uppsala,Sweden)所評估，抗體或其片段具有小於3000 pM、小於2500 pM、小於2000 pM、小於1500 pM、小於1000 pM、小於750 pM、小於500 pM、小於250 pM、小於200 pM、小於150 pM、小於100 pM、小於75 pM、小於10 pM、小於1 pM之解離常數(Kd)。
如本文所用之術語「K締合」或「Ka」係指特定抗體-抗 原相互作用之締合速率，而如本文所用之術語「K解離」或「Kd」係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文所用之術語「KD」係指解離常數，其自Kd與Ka之比率(亦即Kd/Ka)獲得且表示為莫耳濃度(M)。抗體之KD值可使用此項技術中沿用已久之方法確定。用於確定抗體KD之方法為使用表面電漿共振或使用生物感測器系統，諸如Biacore®系統。
如本文所用之術語「親和力」係指抗體與抗原之間在單一抗原位點的相互作用強度。在每一抗原位點內，抗體「臂」之可變區與抗原在許多位點經由弱的非共價力相互作用；相互作用愈多，親和力愈強。
如本文所用之術語「親合力」係指抗體-抗原複合物之總穩定性或強度的資訊性量度。其由三個主要因素控制；抗體抗原決定基親和力；抗原與抗體之價數；及相互作用部分之結構排列。最終此等因素確定抗體之特異性，亦即特定抗體結合於準確抗原決定基之可能性。
如本文所用之術語「價數」係指多肽中潛在標靶結合位點之數目。每一標靶結合位點特異性結合標靶分子上之一個標靶分子或特異性位點(亦即抗原決定基)。當多肽包含超過一個標靶結合位點時，每一標靶結合位點可特異性結合相同或不同分子(例如可結合於不同分子，例如不同抗原或同一分子上之不同抗原決定基)。
如本文所用之短語「抑制抗體」係指與HER3結合且抑制HER3信號傳導之生物活性，例如在磷酸化HER3或磷酸 化Akt分析中例如減少、降低及/或抑制HER3誘發之信號傳導活性的抗體。分析之實例在以下實例中更詳細地描述。因此，應瞭解如根據此項技術已知且本文中描述之方法所測定，「抑制」此等HER3功能性(例如生物化學、免疫化學、細胞、生理或其他生物活性或其類似性質)中之一或多者的抗體係指相對於缺乏抗體下(例如或當不相干特異性之對照抗體存在時)所見，特定活性在統計上顯著降低。抑制HER3活性之抗體實現所量測之參數在統計上顯著降低至少10%，至少50%、80%或90%，且在某些實施例中，如細胞HER3磷酸化程度降低所證實，本發明之抗體可抑制超過95%、98%或99% HER3功能活性。
短語「分離之抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合HER3之分離之抗體實質上不含特異性結合除HER3以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合HER3之分離之抗體可具有與其他抗原之交叉反應性。此外，分離之抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
短語「保守修飾之變異體」適用於胺基酸與核酸序列。關於特定核酸序列，保守修飾之變異體係指編碼相同或基本上相同胺基酸序列之彼等核酸，或在核酸不編碼胺基酸序列之情況下，係指基本上相同序列。因為遺傳密碼簡併，所以很多功能相同之核酸編碼任何既定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸用密碼子說明之每個位置，密碼子可 改變成在未改變編碼多肽下所描述之任何相應密碼子。該等核酸變異為「沉默變異」，其為保守修飾之變異之一種。本文中編碼多肽之每個核酸序列亦描述核酸之每個可能沉默變異。熟習此項技術者將認識到，核酸中之每一密碼子(除了通常為甲硫胺酸之唯一密碼子的AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子的TGG)均可經修飾以產生功能相同分子。因此，編碼多肽之核酸的每一沉默變異隱含於每一所述序列中。
對於多肽序列，「保守修飾之變異體」包括引起胺基酸經化學上類似之胺基酸取代的多肽序列之個別取代、缺失或添加。提供功能類似胺基酸之保守取代表為此項技術中所熟知。該等保守修飾之變異體除此之外不排除本發明之多態變異體、種間同源物及對偶基因。以下八組含有作為彼此保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)***酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如Creighton,Proteins(1984))。在一些實施例中，術語「保守序列修飾」用以指不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體之結合特徵的胺基酸修飾。
術語「交叉競爭(cross-compete)」與「交叉競爭(cross-competing)」在本文中可互換使用，意謂在標準競爭結合分析中抗體或其片段干擾其他抗體或其片段結合於HER3 之能力。
可使用標準競爭結合分析確定抗體或其片段能夠干擾另一抗體或其片段結合於HER3之能力或程度，因此可確定是否可根據本發明說成交叉競爭。一種適合分析包含使用Biacore技術(例如藉由使用BIAcore 3000儀器(Biacore,Uppsala,Sweden))，其可使用表面電漿共振技術，量測相互作用程度。用於量測交叉競爭之另一分析使用基於ELISA之方法。
如本文所用之術語「最佳化」係指核苷酸序列經改變以使用在產生細胞或生物體，一般真核細胞(例如畢赤酵母(Pichia)細胞、木黴(Trichoderma)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中較佳之密碼子編碼胺基酸序列。最佳化核苷酸序列經工程改造以完全或儘可能多地保留最初由起始核苷酸序列編碼之胺基酸序列(亦稱「親本」序列)。
評估抗體對各種物種之HER3之結合能力的標準分析為此項技術中已知，包括例如ELISA、西方墨點法及RIA。適合分析詳細描述於實例中。抗體之結合動力學(例如結合親和力)亦可藉由此項技術中已知之標準分析，諸如藉由Biacore分析或FACS相對親和力(Scatchard)評估。評估抗體對HER3功能性之作用的分析(例如受體結合分析，調節Her3信號傳導路徑)更詳細地描述於實例中。
在兩種或兩種以上核酸或多肽序列之情況下，短語「一致百分比」或「一致性百分比」係指相同的兩種或兩種以 上序列或子序列。當如使用一種以下序列比較演算法或藉由人工比對及目測檢查所量測，在比較窗口或指定區域上針對最大對應性進行比較及比對時，若兩個序列具有指定百分比之胺基酸殘基或核苷酸相同(亦即在指定區域上，或當未指定時，整個序列上60%一致性，視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性)，則兩個序列「實質上一致」。視情況，一致性在長至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域上存在，或更佳在長為100至500或1000個或1000個以上核苷酸(或20、50、200個或200個以上胺基酸)之區域上存在。
為進行序列比較，通常一種序列用作參考序列，測試序列與其進行比較。當使用序列比較演算法時，測試及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。接著基於程式參數，序列比較演算法計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
如本文所用之「比較窗口」包括提及具有選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成之群之任一數目鄰接位置的區段，其中在序列與具有相同數目之鄰接位置之參考序列最佳比對後兩個序列可比較。用於比較之序列比對方法為此項技術中所熟知。用於比較之最佳序列比對可例如藉由Smith及Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源性演算法、藉由Needleman及Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48：443之同源性比對演算 法、藉由Pearson及Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444之相似性搜索方法、藉由此等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics套裝軟體中GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)，或藉由人工比對及目測檢查(參見例如Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology)進行。
適於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法的兩個實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402；及Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用於執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(the National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此演算法包含首先藉由鑑別查詢序列中長度W之短字來鑑別高評分序列對(HSP)，該等短字在與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或者滿足一些正值閾值分數T。T稱為鄰近字分數閾值(Altschul等人，上述)。此等初始鄰近字命中充當用於開始尋找含有其之較長HSP之搜索的種子。該等字命中以沿每一序列之兩個方向延伸，直至可增加累積比對分數。對於核苷酸序列，累積分數使用參數M(一對匹配殘基之獎勵分數；總是>0)及N(錯配殘基之處罰分數；總是<0)來計算。對於胺基酸序列，評分矩陣用以計算累積分數。每一方向上字命中之延伸在以下情況時停止：累積比對分數自其最大實現值減少數量X；由於一或 多個負評分殘基比對之累積而使得累積評分達至零或零以下；或者達到每一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X確定比對之靈敏性及速度。BLASTN程序(對於核苷酸序列)使用11之字長(W)、10之期望值(E)、M=5、N=-4及兩股比較作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用3之字長及10之期望值(E)，以及50之BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比對(B)、10之期望值(E)、M=5、N=-4及兩股比較作為預設值。
BLAST演算法亦執行兩個序列之間的相似性統計分析(參見例如Karlin及Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST演算法提供之一種相似性量度為最小和機率(P(N))，其指示兩個核苷酸或胺基酸序列之間的匹配碰巧存在之機率。舉例而言，若核酸與參考序列比較時最小和機率小於約0.2，更佳小於約0.01且最佳小於約0.001，則認為測試核酸類似於參考核酸。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller((1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)之演算法確定，該演算法已併入ALIGN程式(2.0版)中，使用PAM120權數殘基表、12之間隙長度罰分及4之間隙罰分。另外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)演算法確定，該演算法已併入GCG套裝軟體(在www.gcg.com可得)中之GAP程式中，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩 陣，以及16、14、12、10、8、6或4之間隙權數，及1、2、3、4、5或6之長度權數。
除上述序列一致性百分比以外，兩個核酸序列或多肽實質上一致之另一指示為藉由第一核酸編碼之多肽與針對藉由第二核酸編碼之多肽之抗體免疫交叉反應，如下所述。因此，多肽通常實質上與第二多肽一致，例如其中兩個肽僅僅因保守取代而不同。兩個核酸序列實質上一致之另一指示為兩個分子或其補體在嚴格條件下彼此雜交，如下所述。兩個核酸序列實質上一致之又一指示為相同引物可用於擴增序列。
短語「核酸」在本文中可與術語「聚核苷酸」互換使用且係指呈單股或雙股形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語包含含有已知之核苷酸類似物或經修飾之主鏈殘基或鍵的核酸，其為合成、天然存在及非天然存在的，具有與參考核酸類似之結合性質，且以類似於參考核苷酸之方式代謝。該等類似物之實例包括(不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指明，否則特定核酸序列亦暗中包含其保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)及互補序列以及明確指示之序列。特定言之，如下所詳述，簡併密碼子取代可藉由產生其中一或多個所選(或所有)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧肌核苷殘基取代的序列實現(Batzer等人，(1991)Nucleic Acid Res.19：5081；Ohtsuka等人，(1985)J. Biol.Chem.260：2605-2608；及Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes 8：91-98)。
短語「可操作地連接」係指兩個或兩個以上聚核苷酸(例如DNA)區段之間的功能關係。通常，其係指轉錄調節序列與轉錄序列之功能關係。舉例而言，若啟動子或強化子序列刺激或調節適當宿主細胞或其他表現系統中編碼序列之轉錄，則其可操作地連接於編碼序列。一般而言，可操作地連接於轉錄序列之啟動子轉錄調節序列實體鄰接轉錄序列，亦即其順式作用。然而，諸如強化子之一些轉錄調節序列無需實體鄰接或親密接近轉錄為其所強化之編碼序列。
術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，係指胺基酸殘基之聚合物。該術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。除非另外指明，否則特定多肽序列亦暗中包含其保守修飾之變異體。
如本文所用之術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、母牛、小雞、兩棲動物及爬蟲。除非闡述，否則術語「患者」或「個體」在本文中可互換使用。
如本文所用之術語「抗癌劑」係指可用於治療細胞增生性病症(諸如癌症)之任何藥劑，包括細胞毒性劑、化學治 療劑、放射療法及放射治療劑、靶向抗癌劑及免疫治療劑。
如本文所用之術語「腫瘤」係指贅生性細胞生長及增殖，無論惡性還是良性，以及所有癌前及癌細胞及組織。
如本文所用之術語「抗腫瘤活性」係指腫瘤細胞增殖速率、活力或轉移活性降低。顯示抗腫瘤活性之一種可能方式為顯示在療法期間產生之異常細胞的生長速率下降或腫瘤尺寸穩定或減小。該活性可使用公認之活體外或活體內腫瘤模型，包括(但不限於)異種移植模型、同種異體移植模型、MMTV模型及此項技術中已知研究抗腫瘤活性之其他已知模型來評估。
如本文所用之術語「惡性疾病」係指非良性腫瘤或癌症。
如本文所用之術語「癌症」係指特徵為不受調節或不受控制之細胞生長的惡性疾病。例示性癌症包括癌瘤、肉瘤、白血病及淋巴瘤。術語「癌症」包括原發性惡性腫瘤(例如細胞尚未遷移至個體體內除原始腫瘤位點以外之位點的腫瘤)及繼發性惡性腫瘤(例如由轉移(腫瘤細胞遷移至不同於原始腫瘤位點之第二位點)所產生的腫瘤)。
本發明之各種態樣進一步詳細地描述於以下部分及分部中。
HER受體之結構及活化機制
所有四種HER受體均具有細胞外配位體結合域、單一跨膜域及細胞質含酪胺酸激酶域。HER受體之細胞內酪胺酸 激酶域高度保守，不過HER3之激酶域含有關鍵胺基酸之取代，因此激酶活性不足(Guy等人，(1994)：PNAS 91,8132-8136)。配位體誘發之HER受體二聚化誘發激酶活化，C端尾中酪胺酸殘基上受體轉磷酸化，接著募集及活化細胞內信號傳導效應子(Yarden及Sliwkowski,(2001)Nature Rev 2,127-137；Jorissen等人，(2003)Exp Cell Res 284,31-53)。
HER之細胞外域之晶體結構已提供一些對配位體誘發之受體活化過程的瞭解(Schlessinger,(2002)Cell 110,669-672)。每一HER受體之細胞外域由四個子域組成：子域I與III合作形成配位體結合位點，而子域II(或許以及子域IV)經由直接受體-受體相互作用參與受體二聚化。在配位體結合之HER1的結構中，子域II中之β髮夾(稱為二聚化環)與搭配物受體之二聚化環相互作用，介導受體二聚化(Garrett等人，(2002)Cell 110,763-773；Ogiso等人，(2002)Cell 110,775-787)。相比之下，在不活化HER1、HER3及HER4之結構中，二聚化環與子域IV進行分子內相互作用，此阻止在缺乏配位體下進行受體二聚化(Cho及Leahy,(2002)Science 297,1330-1333；Ferguson等人，(2003)Mol Cell 12,541-552；Bouyan等人，(2005)PNAS102,15024-15029)。HER2之結構在HER中為獨特的。在缺乏配位體下，HER2之構形類似於具有突出之二聚化環的HER1之配位體活化狀態，可與其他HER受體相互作用(Cho等人，(2003)Nature 421,756-760；Garrett等人，(2003)Mol Cell 11,495-505)。此可說明HER2增強之雜二聚化能力。
雖然HER受體晶體結構提供HER受體均二聚化及雜二聚化之模型，但一些HER均二聚體及雜二聚體優於別者之背景(Franklin等人，(2004)Cancer Cell 5,317-328)以及每一域在受體二聚化及自抑制中之作用(Burgess等人，(2003)Mol Cell 12,541-552；Mattoon等人，(2004)PNAS101,923-928)仍然有些不清楚。
HER3結構及抗原決定基
抗-HER3抗體結合之構形抗原決定基先前已描述於均於2011年8月22日申請且以全文引用的方式併入本文中之PCT/EP2011/064407及USSN：61/375,408中。與HER3抗體片段複合之HER3之截短形式的三維結構顯示包含HER3之域2及域4之構形抗原決定基。
本發明提供另外一類抗體或其片段，其結合HER3之域3內之非線性抗原決定基。此等抗體或其片段與HER3結合，抑制配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
本發明進一步提供一類抗體或其片段，其在HER3之域3-4內結合，抑制配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。在一個實施例中，該類抗體或其片段結合於HER3之域3或域4，抑制配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。在另一個實施例中，該類抗體或其片段結合於HER3之域3及域4，抑制配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
本發明之實例呈現結合於MOR12604之Fab片段的HER3 之晶體結構，其在3.38Å解析度下測定。
已顯示與抗體複合之HER3之細胞外域的截短形式(殘基20-640)之三維結構。HER3-MOR12604 Fab複合物在3.38Å解析度下測定，且展示於圖4中。
雖然不束縛於提供理論，但作用機制之一種可能模型為HER3通常以不活化(閉合、繫栓)或活化(開放)狀態存在。配位體結合誘發構形變化，使得HER3以能夠結合雜二聚體搭配物，引起下游信號傳導活化之活化(開放)狀態存在。諸如MOR12604之抗體結合HER3之不活化(繫栓)狀態，且似乎阻斷配位體結合位點。
MOR12604在域3內結合表明MOR12604可能藉由選自由以下組成之群之機制起作用：阻斷配位體結合所需之HER3殘基；因抗體與HER3之域之間的位阻而阻止HER3採用活化構形；藉由降低HER3鉸鏈區(例如域3)中之可撓度來阻止HER3採用活化構形；誘發域3環371-377進行阻止HER3轉變成開放構形之構形變化；將HER3去穩定化，使得其易於降解；充當部分促效劑，以促進HER3下調；及藉由MOR12604之每一臂結合HER3分子，使得抗體產生易進行蛋白降解或無法與其他受體酪胺酸激酶二聚化之非天然HER3二聚體。
為檢查抗體或其片段結合之HER3之域3的晶體結構，HER3之晶體藉由在適合宿主細胞中表現編碼HER3或其變異體之核苷酸序列，接著在相關HER3靶向Fab存在下使純化之蛋白質結晶來製備。較佳地，HER3多肽含有細胞外 域(人類多肽(SEQ ID NO：1)之胺基酸20至640或其截短型式，較佳包含胺基酸20-640)，但缺乏跨膜域及細胞內域。
HER3多肽亦可作為融合蛋白產生，例如有助於提取及純化。融合蛋白搭配物之實例包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、組胺酸(HIS)、六聚組胺酸(6HIS)、GAL4(DNA結合及/或轉錄活化域)及β-半乳糖苷酶。此外，在融合蛋白搭配物與相關蛋白序列之間宜包括蛋白質裂解位點，以允許移除融合蛋白序列。
表現後，蛋白質可例如藉由固定化金屬親和層析、離子交換層析及/或凝膠過濾來純化及/或濃縮。
蛋白質可使用本文中描述之技術結晶。通常，在結晶製程中，含有蛋白質溶液之液滴與結晶緩衝液混合且使其在密封容器中平衡。平衡可藉由已知之技術，諸如「懸滴」或「沉滴」法實現。在此等方法中，液滴懸於大得多之結晶緩衝液儲集器上方或沉於其旁邊，且經由蒸氣擴散達到平衡。或者，平衡可藉由其他方法，例如在油下、經由半透膜或藉由自由界面擴散發生(參見例如Chayen等人，(2008)Nature Methods 5,147-153)。
一旦獲得晶體，即可藉由已知之X射線繞射技術求解結構。許多技術使用化學修飾之晶體，諸如藉由重原子衍生至近似相而修飾之晶體。實際上，晶體浸入含有重金屬原子鹽或有機金屬化合物(例如氯化鉛、硫代蘋果酸金、硫柳汞或醋酸氧鈾)之溶液中，該溶液可擴散穿過晶體且結合於蛋白質表面。接著結合之重金屬原子之位置可藉由浸 泡晶體之X射線繞射分析來確定。X射線之單色束藉由晶體原子(散射中心)繞射後所獲得之圖案可藉由數學方程式求解，得到數學座標。繞射資料用以計算晶體重複單元之電子密度圖。另一個獲得相位資訊之方法為使用稱為分子置換之技術。在此方法中，轉動及平移演算法應用於來源於相關結構之搜索模型，產生相關蛋白質之近似取向(參見Rossmann,(1990)Acta Crystals A 46,73-82)。電子密度圖用以建立晶體之單位晶胞內個別原子之位置(Blundel等人，(1976)Protein Crystallography,Academic Press)。
本發明描述HER3之三維結構及抗HER3抗體之Fab。HER3之細胞外域之近似域邊界如下：域1：胺基酸20-207；域2：胺基酸208-328；域3：胺基酸329-498；及域4：胺基酸499-642。HER3之三維結構及抗體允許鑑別潛在HER3調節劑之標靶結合位點。較佳標靶結合位點為參與HER3活化之位點。在一個實施例中，標靶結合位點位於HER3之域3內。因此，結合於域3之抗體或其片段可例如藉由改變域相對於自身或其他HER3域之相對位置來調節HER3活化。因此，抗體或其片段結合於域3內之胺基酸殘基可使蛋白質採用防止活化之組態。
在一些實施例中，抗體或其片段結合於HER3之結合表面。此結合表面包含呈三維組態之多個鄰接或非鄰接表面，該等表面形成與抗體或其片段相互作用之抗原決定基之一部分。舉例而言，結合表面可包含至少2個表面(例如表面A及表面B，參見圖4D)、至少3個表面(例如表面A、 表面B及表面C)、至少4個表面(例如表面A、表面B、表面C及表面D)、至少5個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D及表面E)、至少6個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E及表面F)、至少7個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E、表面F及表面G)、至少8個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E、表面F、表面G及表面H)、至少9個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E、表面F、表面G、表面H及表面I)或至少10個表面(例如表面A、表面B、表面C、表面D、表面E、表面F、表面G、表面H、表面I及表面J)。
在一個實施例中，抗體或其片段結合於結合表面A。在一個實施例中，抗體或其片段結合於結合表面B。在另一個實施例中，抗體或其片段結合於結合表面A與結合表面B。在一個實施例中，結合表面A包含至少一個選自胺基酸殘基362-376之胺基酸殘基。在一個實施例中，結合表面B包含至少一個選自胺基酸殘基335-342、398、400、424-428、431、433-434及455之胺基酸殘基。在另一個實施例中，抗體或其片段結合於結合表面A，其中至少一個胺基酸殘基選自胺基酸殘基362-376；且結合於結合表面B，其中至少一個胺基酸殘基選自胺基酸殘基335-342、398、400、424-428、431、433-434及455。
在一些實施例中，抗體或其片段結合於具有包含SEQ ID NO：1之HER3胺基酸殘基335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集之非線性 抗原決定基的人類HER3蛋白。在一些實施例中，抗體或其片段結合於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集內或與其重疊的胺基酸。在一些實施例中，抗體或其片段結合於SEQ ID NO：1之胺基酸335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集內的胺基酸(及/或由其組成之胺基酸序列)。
在一些實施例中，抗體或其片段結合於具有包含SEQ ID NO：1之HER3胺基酸殘基499-642(域4)或其子集之抗原決定基(線性、非線性、構形)的人類HER3蛋白。在一些實施例中，抗體或其片段結合於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基499-642(域4)或其子集內或與其重疊的胺基酸。在一些實施例中，抗體或其片段結合於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基499-642(域4)或其子集內的胺基酸(及/或由其組成之胺基酸序列)。
在一些實施例中，抗體或其片段結合於具有包含SEQ ID NO：1之HER3胺基酸殘基335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集之非線性抗原決定基及包含SEQ ID NO：1之HER3胺基酸殘基499-642(域4)或其子集之抗原決定基(線性、非線性、構形)的人類HER3蛋白。在一些實施例中，抗體或其片段結合於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集內或與其重疊的胺基酸及包含SEQ ID NO：1之HER3胺基酸殘 基499-642(域4)或其子集之抗原決定基(線性、非線性、構形)。在一些實施例中，抗體或其片段結合於SEQ ID NO：1之胺基酸335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集內的胺基酸(及/或由其組成之胺基酸序列)及包含SEQ ID NO：1之HER3胺基酸殘基499-642(域4)或其子集之抗原決定基(線性、非線性、構形)。
在一些實施例中，抗體或其片段結合於具有包含SEQ ID NO：1之域3內之HER3胺基酸殘基或其子集的抗原決定基(線性、非線性、構形)及包含SEQ ID NO：1之域4內之HER3胺基酸殘基或其子集的抗原決定基(線性、非線性、構形)之人類HER3蛋白。在一些實施例中，抗體或其片段結合於SEQ ID NO：1之域3之胺基酸殘基及SEQ ID NO：1之域4之胺基酸或其子集內或與其重疊的胺基酸。
在一些實施例中，抗體或其片段結合於HER3受體之不活化狀態，從而阻止HER3採用活化構形。在一些實施例中，抗體或其片段因抗體或其片段與HER3之域之間的位阻(例如在MOR12604下，與HER3之域1的位阻影響)而阻止HER3採用活化構形。在一些實施例中，抗體或其片段藉由降低域3中之可撓度來阻止HER3採用活化構形。在一些實施例中，抗體或其片段誘發SEQ ID NO：1之域3環371-377進行阻止HER3採用活化構形之構形變化。在一些實施例中，抗體或其片段將HER3去穩定化，使得其易於降解。在一些實施例中，抗體或其片段促進細胞表面HER3 下調。在一些實施例中，抗體或其片段產生易進行蛋白降解或無法與其他受體酪胺酸激酶二聚化之非天然HER3二聚體。
在一些實施例中，抗體或其片段可結合於HER3之活化或不活化狀態。在一些實施例中，抗體或其片段將HER3受體穩定化於不活化狀態，使得HER3受體不能與共受體二聚化，形成受體-受體複合物。不能形成受體-受體複合物可阻止配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導之活化。
在一些實施例中，抗體或其片段誘發HER3與HER3二聚化，形成不活化受體-受體複合物。不活化受體-受體複合物之形成阻止HER3介導之信號傳導的活化，因為HER3鉗合於不活化受體-受體複合物中。
所描繪結構亦允許鑑別抗體或其片段(例如MOR12604)與HER3之相互作用界面的特定核心HER3胺基酸殘基。此定義為在MOR12604蛋白VH鏈之5Å內的殘基。殘基如下：Ile365、Thr366、Asn369、Gly370、Asp371、Pro372、Trp373、His374、Lys375、Gln400及Lys434。所描繪結構亦允許鑑別抗體或其片段(例如MOR12604)與HER3之相互作用界面的特定核心HER3胺基酸殘基。此定義為在MOR12604蛋白VL鏈之5Å內的殘基。殘基如下：Gly335、Ser336、Gly337、Ser338、Phe340、Gln341、Asp362、Leu364、Ile365、Thr366、His374、Ile376、Asn398、Gln400、Tyr424、Asn425、Arg426、Phe428、Leu431、 Met433、Lys434、Tyr455。如分別表5及6中可見(MOR12604)，輕鏈與重鏈參與抗原結合蛋白結合於抗原決定基之域3內之胺基酸殘基。
同樣，熟習此項技術者考慮到本發明之教示，可預測抗原結合蛋白之哪些殘基及區域可變化而不過度干擾抗原結合蛋白結合於HER3之域3及4之能力。
核心相互作用界面胺基酸確定為至少一個原子距離HER3搭配物蛋白質小於或等於5Å的所有胺基酸殘基。挑選5Å作為核心區截止距離，以考慮到凡得瓦爾半徑(van der Waals radius)加可能的水介導之氫鍵內之原子。
在一些實施例中，結合於、覆蓋或阻止MOR12604與任何上述殘基相互作用之任何抗原結合蛋白可用於結合於或中和HER3。在一些實施例中，抗體或其片段結合於以下HER3殘基(SEQ ID NO：1)中之至少一者或與其相互作用：Ile365、Thr366、Asn369、Gly370、Asp371、Pr0372、Trp373、His374、Lys375、Gln400及Lys434。在一些實施例中，抗體及其片段結合於以下HER3殘基(SEQ ID NO：1)中之至少一者或與其相互作用：Gly335、Ser336、Gly337、Ser338、Phe340、Gln341、Asp362、Leu364、Ile365、Thr366、His374、Ile376、Asn398、Gln400、Tyr424、Asn425、Arg426、Phe428、Leu431、Met433、Lys434、Tyr455。在一些實施例中，抗體或其片段結合於以下HER3殘基(SEQ ID NO：1)中之至少一者或與其相互作用：Ile365、Thr366、Asn369、Gly370、Asp371、 Pro372、Trp373、His374、Lys375、Gln400、Lys434、Gly335、Ser336、Gly337、Ser338、Phe340、Gln341、Asp362、Leu364、Ile365、Thr366、His374、Ile376、Asn398、Gln400、Tyr424、Asn425、Arg426、Phe428、Leu431、Met433、Lys434、Tyr455。在一些實施例中，抗體或其片段結合於以下HER3殘基(SEQ ID NO：1)之組合或與其相互作用：Ile365、Thr366、Asn369、Gly370、Asp371、Pro372、Trp373、His374、Lys375、Gln400、Lys434、Gly335、Ser336、Gly337、Ser338、Phe340、Gln341、Asp362、Leu364、Ile365、Thr366、His374、Ile376、Asn398、Gln400、Tyr424、Asn425、Arg426、Phe428、Leu431、Met433、Lys434、Tyr455。在一些實施例中，抗體或其片段結合於所有以下HER3殘基(SEQ ID NO：1)或與其相互作用：Ile365、Thr366、Asn369、Gly370、Asp371、Pro372、Trp373、His374、Lys375、Gln400、Lys434、Gly335、Ser336、Gly337、Ser338、Phe340、Gln341、Asp362、Leu364、Ile365、Thr366、His374、Ile376、Asn398、Gln400、Tyr424、Asn425、Arg426、Phe428、Leu431、Met433、Lys434、Tyr455。在一些實施例中，抗體或其片段在上述殘基中之一或多者的5埃(angstrom)內。在一些實施例中，抗體或其片段距離一或多個上述殘基5至8埃。在一些實施例中，抗體或其片段與上述殘基中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、28、30、35、40、45或50個相 互作用、阻斷其或在其8埃內。
HER3及HER3：MOR12604複合物之三維結構的可用性例如提供更詳細地探測其他HER3抗體之構架。HER3之三維結構允許定位單株抗體之抗原決定基及推斷其作用模式，因為一些抑制，一些刺激，且其他對細胞生長無影響。MOR12604之非線性抗原決定基位於HER3之域3。此受體之三維結構之可用性將有助於確定此等抑制劑之準確作用機制及設計干擾HER3受體功能之新方法。在一個實施例中，本發明之抗體結合於與MOR12604相同之非線性抗原決定基。
在一些實施例中，表1中列出之任何抗體結合的非線性抗原決定基尤其適用。在某些實施例中，HER3非線性抗原決定基可用於分離結合於HER3之抗體或其片段。在某些實施例中，HER3非線性抗原決定基可用於產生結合於HER3之抗體或其片段。在某些實施例中，HER3非線性抗原決定基可用作產生結合於HER3非線性抗原決定基之抗體或其片段的免疫原。在某些實施例中，HER3非線性抗原決定基可投與動物，且結合於HER3之抗體隨後可自該動物獲得。
本發明亦提供一類抗體，其結合於HER3之域3-4內之抗原決定基(線性、非線性或構形)。該等在域3-4內結合之抗體或其片段之實例展示於表2中。以上方法及以下實例部分中描述之方法亦可用以產生與HER3複合之域3-4抗體或其片段。
在一些實施例中，含有與抗體接觸或由抗體掩蔽之殘基的域/區域可藉由使HER3(例如野生型抗原)中之特定殘基突變且確定抗體或其片段是否可結合該突變或變異HER3蛋白或量測自野生型之親和力變化來鑑別。藉由進行大量個別突變，可鑑別在結合於抗體中起直接作用或與抗體足夠接近，使得突變可影響抗體與抗原之間的結合之殘基。自對此等胺基酸之認識，可闡明含有與抗體接觸或由抗體遮蔽之殘基的抗原(HER3)域或區域。使用已知之技術(諸如丙胺酸掃描)之突變誘發可幫助確定功能上相關之抗原決定基。亦可採用利用精胺酸/麩胺酸掃描方案之突變誘發(參見例如Nanevicz等人，(1995),J.Biol.Chem.270(37)：21619-21625及Zupnick等人，(2006),J.Biol.Chem.281(29)：20464-20473)。一般而言，精胺酸及麩胺酸取代(通常個別)野生型多肽中之胺基酸，因為此等胺基酸帶電且體積大，因此能夠在引入突變之抗原附近破壞抗原結合蛋白與抗原之間的結合。存在於野生型抗原中之精胺酸經麩胺酸置換。可獲得多種該等個別突變體且分析收集之結合結果，以確定哪些殘基影響結合。可產生一系列突變HER3抗原，其中每一突變抗原具有單一突變。可量測每一突變HER3抗原與各種HER3抗體或其片段之結合且比較所選抗體或其片段結合野生型HER3(SEQ ID NO：1)之能力。
如本文所用之抗體或其片段與突變或變異HER3之間的結合之改變(例如減少或增加)意謂結合親和力(例如如藉由 已知之方法，諸如下文在實例中描述之Biacore測試或基於珠粒之分析量測)EC50之變化及/或抗原結合蛋白之總結合能力(例如如藉由在抗原結合蛋白濃度對比抗原濃度之圖中Bmax下降所證明)的變化(例如降低)。結合之明顯改變指示突變殘基參與結合於抗體或其片段。
在一些實施例中，結合明顯減少意謂抗體或其片段與突變HER3抗原之間的結合親和力EC50及/或結合能力相對於抗體或其片段與野生型HER3(例如SEQ ID NO：1)之間的結合減少超過10%、超過20%、超過40%、超過50%、超過55%、超過60%、超過65%、超過70%、超過75%、超過80%、超過85%、超過90%或超過95%。
在一些實施例中，與野生型HER3蛋白(例如SEQ ID NO：1)相比，抗體或其片段對具有一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上)突變之突變HER3蛋白的結合顯著減少或增加。
雖然變異形式相對於SEQ ID NO：1中所示之野生型序列提及，但應瞭解在HER3之對偶基因或剪接變異體中胺基酸可不同。亦涵蓋顯示對HER3之該等對偶基因形式之結合顯著改變(例如結合降低或升高)的抗體或其片段。
除抗體之一般結構態樣之外，互補位(paratope)與抗原決定基之間更特異之相互作用可經由結構方法檢查。在一個實施例中，CDRs之結構構成互補位，抗體經由該互補位能夠結合於抗原決定基。此互補位之形狀可用許多方式測定。可使用傳統結構檢查方法，諸如NMR或x射線晶體 學。此等方法可檢查單獨互補位之形狀，或互補位結合於抗原決定基時之形狀。或者，分子模型可在電腦中(in silico)產生。結構可經由商業套件(諸如Accelrys(San Diego,Calif.)之InsightII模擬套件)輔助之同源模擬(homology modeling)產生。簡言之，可使用欲檢查抗體之序列對於已知結構之蛋白質的資料庫(諸如蛋白質資料庫(Protein Data Bank))搜索。在鑑別具有已知結構之同源蛋白質後，使用此等同源蛋白質作為模擬模板。可比對每一可能模板，因此在模板中產生基於結構之序列比對。接著未知結構之抗體之序列可與此等模板比對，以產生未知結構之抗體的分子模型。如熟習此項技術者所瞭解，有許多在電腦中產生該等結構的替代方法，可使用任一者。舉例而言，可使用一種類似於頒予Hardman等人之美國專利第5,958,708號中描述之方法，採用QUANTA(Polygen Corp.,Waltham,Mass.)及CHARM(Brooks等人，(1983),J.Comp.Chem.4：187)(以全文引用的方式併入本文中)。
不僅互補位之形狀對確定一個可能之互補位是否結合於抗原決定基以及程度如何為重要的，而且抗原決定基與互補位之間的相互作用本身亦為設計變異抗體時重要資訊之來源。如熟習此項技術者所瞭解，有多種可研究此相互作用之方式。一種方式為使用或許如上所述產生之結構模型，接著使用程式，諸如InsightII(Accelrys,San Diego,Calif.)，其具有一種對接模組，能夠對互補位與其抗原決定基之間的構形及定向空間執行蒙特卡洛搜索(Monte Carlo search)。該結果能夠估計抗原決定基與互補位在何處及如何相互作用。在一個實施例中，僅抗原決定基之一個片段或變異體用以幫助確定相關相互作用。在一個實施例中，整個抗原決定基用於模擬互補位與抗原決定基之間的相互作用。
經由使用此等模型化結構，能夠預測哪些殘基在抗原決定基與互補位之間的相互作用中最重要。因此，在一個實施例中，能夠容易選擇改變哪些殘基以改變抗體之結合特徵。舉例而言，自對接模型可顯而易見，互補位中某些殘基之側鏈可在空間上阻礙抗原決定基之結合，因此將此等殘基改變為具有較小側鏈之殘基可為有益的。可用許多方式確定此。舉例而言，可簡單查看兩個模型且基於官能基及接近度估計相互作用。或者，可執行重複的如上所述之抗原決定基與互補位配對，以獲得更有利的能量相互作用。亦可確定多種抗體變異體之此等相互作用以確定抗體可結合於抗原決定基之替代方式。亦可組合各種模型以確定應該如何改變抗體之結構以獲得具有所需特定特徵之抗體。
以上確定之模型可經由各種技術測試。舉例而言，相互作用能可用以上討論之程式確定，以確定哪一個變異體待進一步檢查。此外，庫侖(coulumbic)與凡得瓦爾相互作用用以確定抗原決定基與變異互補位之相互作用能。此外，定點突變誘發用以查看抗體結構之預定改變事實上是否引起結合特徵之所需變化。或者，可對抗原決定基進行改變 以驗證模型為正確的或確定可發生在互補位與抗原決定基之間的一般結合主題。
如熟習此項技術者所瞭解，雖然此等模型提供製造本發明實施例之抗體及其變異體所需之指導，但仍然可能需要或許經由活體外研究，執行計算機模型之例行測試。另外，如熟習此項技術者顯而易見，任何修飾亦可能對抗體之活性具有另外副作用。舉例而言，雖然預測引起更大結合之任何改變可誘發更大結合，但其亦可能引起可能降低或改變抗體活性之其他結構變化。確定是否確有其事為此項技術中所常見，且可用許多方式實現。舉例而言，活性可經由ELISA測試來測試。或者，樣品可經由使用表面電漿共振裝置測試。
HER3抗體
本發明提供如表1中所示之一類抗體，其識別HER3之域3內的非線性抗原決定基，且抑制配位體依賴性與非配位體依賴性HER3信號傳導路徑。本發明亦提供如表2中所示之一類抗體，其識別HER3之域3-4內的抗原決定基(線性、非線性、構形)，抑制配位體依賴性與非配位體依賴性HER3信號傳導路徑。
在一個態樣中，本發明提供特異性結合於HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)之域3的抗體，該等抗體包含具有SEQ ID NO：14、34、54、74、94、114、134、154及174之胺基酸序列的VH域。在另一個態樣中，本發明提供特異性結合於HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)之域3的抗體，該等抗體包含具有SEQ ID NO：15、35、55、 75、95、115、135、155及175之胺基酸序列的VL域。
在一個態樣中，本發明提供特異性結合於HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)之域3-4的抗體，該等抗體包含具有SEQ ID NO：194、214、234、254、274、294、314、334、354、374、394、414、434、454、474、494、514、534、554、574、594、614、634、654、674及694之胺基酸序列的VH域。在另一個態樣中，本發明提供特異性結合於HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)之域3的抗體，該等抗體包含具有SEQ ID NO：195、215、235、255、275、295、315、335、355、375、395、415、435、455、475、495、515、535、555、575、595、615、635、655、675及695之胺基酸序列的VL域。
因為每一此等抗體或其片段均可結合於HER3，所以VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼胺基酸序列之核苷酸序列)可「混合及搭配」以產生本發明之其他HER3抗體。該等「混合及搭配」HER3抗體可使用此項技術中已知之結合分析(例如ELISA及實例部分中描述之其他分析)測試。當此等鏈混合及搭配時，來自特定VH/VL對之VH序列應經結構類似之VH序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長重鏈序列應經結構類似之全長重鏈序列置換。同樣，來自特定VH/VL對之VL序列應經結構類似之VL序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長輕鏈序列應經結構類似之全長輕鏈序列置換。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種分離之單株抗體或其片段，其具有：包含選自由SEQ ID NO：14、34、54、74、94、114、134、154及174組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含選自由SEQ ID NO：15、35、55、75、95、115、135、155及175組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區；其中該抗體特異性結合於HER3(例如人類及/或食蟹獼猴)之域3。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種分離之單株抗體或其片段，其具有：包含選自由SEQ ID NO：194、214、234、254、274、294、314、334、354、374、394、414、434、454、474、494、514、534、554、574、594、614、634、654、674及694組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含選自由SEQ ID NO：195、215、235、255、275、295、315、335、355、375、395、415、435、455、475、495、515、535、555、575、595、615、635、655、675及695組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區；其中該抗體特異性結合於HER3(例如人類及/或食蟹獼猴)之域3。
在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：14之VH及SEQ ID NO：15之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：34之VH及SEQ ID NO：35之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：54之VH及SEQ ID NO：55之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：75之VL。在一特定實施例 中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：94之VH及SEQ ID NO：95之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：114之VH及SEQ ID NO：115之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：134之VH及SEQ ID NO：135之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：154之VH及SEQ ID NO：155之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：174之VH及SEQ ID NO：175之VL。
在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：194之VH及SEQ ID NO：195之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：214之VH及SEQ ID NO：215之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：234之VH及SEQ ID NO：235之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：254及SEQ ID NO：255之VL。
在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：274之VH及SEQ ID NO：275之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：294之VH及SEQ ID NO：295之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：314之VH及SEQ ID NO：315之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：334之VH及SEQ ID NO：335之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含 SEQ ID NO：354之VH及SEQ ID NO：355之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：374之VH及SEQ ID NO：375之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：394之VH及SEQ ID NO：395之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：414之VH及SEQ ID NO：415之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：434之VH及SEQ ID NO：435之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：454之VH及SEQ ID NO：255之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：474之VH及SEQ ID NO：475之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：494之VH及SEQ ID NO：495之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：514之VH及SEQ ID NO：515之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：534之VH及SEQ ID NO：535之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：554之VH及SEQ ID NO：555之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：574之VH及SEQ ID NO：575之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：594之VH及SEQ ID NO：595之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：614之VH及SEQ ID NO：615之VL。在一特定實施例中，結 合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：634之VH及SEQ ID NO：635之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：654之VH及SEQ ID NO：655之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：674之VH及SEQ ID NO：675之VL。在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：694之VH及SEQ ID NO：695之VL。
在另一個態樣中，本發明提供包含如表1中所描述之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或其組合的結合於域3之HER3抗體。抗體之VH CDR1之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142及162中。抗體之VH CDR2之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：3、23、43、63、83、103、123、143及163中。抗體之VH CDR3之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144及164中。抗體之VL CDR1之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148及168中。抗體之VL CDR2之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149及169中。抗體之VLCDR3之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150及170中。CDR區使用Kabat系統描繪(Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342： 877-883；及Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273,927-948)。
在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：142之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：143之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：144之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：148之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：149之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：150之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，結合於HER3之域3之抗體包含SEQ ID NO：162之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：163之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：164之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：168之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：169之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：170之輕鏈可變區CDR3。
在另一個態樣中，本發明提供包含如圖2中所描述之重鏈及輕鏈CDR2、CDR2及CDR3或其組合的結合於域3-4之HER3抗體。抗體之VH CDR1之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502、522、542、562、582、602、622、642、662及682中。抗體之VH CDR2之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503、523、543、563、583、603、623、643、663及683中。抗體之VH CDR3之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504、 524、544、564、584、604、624、644、664及684中。抗體之VL CDR1之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508、528、548、568、588、608、628、648、668及688中。抗體之VL CDR2之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509、529、549、569、589、609、629、649、669及689中。抗體之VL CDR3之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510、530、550、570、590、610、630、650、670及690中。CDR區使用Kabat系統描繪(Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；及Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273,927-948)。
在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：662之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：663之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：664之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：668之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：669之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：670之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，結合於HER3之域3-4之抗體包含SEQ ID NO：682之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：683之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：684之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：688之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：689之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：690之輕鏈可變區CDR3。
本發明之其他抗體包括已突變，但CDR區與表1或表2中描述之序列中所描繪的CDR區仍具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸。在一些實施例中，其包括與表1或表2描述之序列中所描繪的CDR區相比，CDR區中至多1個、2個、3個、4個或5個胺基酸突變，同時仍維持其對原始抗體之抗原決定基之特異性的突變胺基酸序列。
本發明之其他抗體包括已突變，但構架區與表1或表2中描述之序列中所描繪的構架區仍具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸。在一些實施例中，其包括與表1或表2描述之序列中所描繪的構架區相比，構架區中至多1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個胺基酸突變，同時仍維持其對原始抗體之抗原決定基之特異性的突變胺基酸序列。本發明亦提供編碼特異性結合於HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)之抗體之VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈的核酸序列。
本發明之其他抗體包括其中胺基酸或編碼胺基酸之核酸 已突變，但與表1或表2中描述之序列仍具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的抗體。在一些實施例中，其包括與表1或表2中描述之序列中所描繪的可變區相比，可變區中至多1個、2個、3個、4個或5個胺基酸突變，同時保留實質上相同之治療活性的突變胺基酸序列。
如本文所用，若人類抗體之可變區或全長鏈獲自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統，則該抗體包含特定生殖系序列「之產物」或「來源」的重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈。該等系統包括用相關抗原免疫攜帶人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠或用相關抗原篩選在噬菌體上呈現之人類免疫球蛋白基因庫。人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」或「來源」的人類抗體可同樣藉由比較人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列及選擇序列最接近(亦即最大一致性%)人類抗體序列之人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。特定人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」或「來源」的人類抗體可含有與生殖系序列相比之胺基酸差異，例如因天然存在之體細胞突變或有意引入之定點突變。然而，在VH或VL構架區中，所選人類抗體之胺基酸序列與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列典型至少90%一致，且含有在與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類生殖系序列)比較時鑑別該人類抗體為人類的胺基酸殘基。在某些情況下，人類抗體之胺基酸序列與由生殖系免疫球蛋白基因編 碼之胺基酸序列至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。通常，重組人類抗體將顯示與人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列在VH或VL構架區中至多10個胺基酸差異。在某些情況下，人類抗體可顯示與生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至多5個或甚至至多4個、3個、2個或1個胺基酸差異。
本文中揭示之抗體可為單鏈抗體、雙功能抗體(diabodies)、域抗體、奈米抗體及單抗體(unibodies)之衍生物。「單鏈抗體」(scFv)由包含VL域連接於VH域之單一多肽鏈組成，其中VL域與VH域配對形成單價分子。單鏈抗體可根據此項技術中已知之方法製備(參見例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。「雙功能抗體(disbud)」由兩個鏈組成，每一鏈包含重鏈可變區連接於藉由短肽連接子連接之相同多肽鏈上的輕鏈可變區，其中同一鏈上之兩個區不彼此配對，而是與另一鏈上互補域配對，形成雙特異性分子。製備雙功能抗體之方法在此項技術中已知(參見例如Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448及Poljak等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。域抗體(dAb)為抗體之小功能結合單元，對應於抗體之重鏈或輕鏈之可變區。域抗體在細菌、酵母及哺乳動物細胞系統中良好表現。域抗體及其產生方式之更多細節在此項技術中已知(參見例如美國專利第6,291,158號；第6,582,915號；第6,593,081號；第6,172,197號；第 6,696,245號；歐洲專利0368684及0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019及WO03/002609)。奈米抗體來源於抗體之重鏈。奈米抗體通常包含單一可變域及兩個恆定域(CH2及CH3)且保留原始抗體之抗原結合能力。奈米抗體可藉由此項技術中已知之方法製備(參見例如美國專利第6,765,087號、美國專利第6,838,254號、WO 06/079372)。單抗體由IgG4抗體之一個輕鏈及一個重鏈組成。單抗體可藉由移除IgG4抗體之鉸鏈區製得。單抗體及其製備方法之更多細節可見於WO2007/059782中。
同源抗體
在又一個實施例中，本發明提供一種包含與表1或表2中描述之序列同源之胺基酸序列的抗體或其片段，且該抗體結合於HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)並保留表1或表2中描述之彼等抗體之所需功能性。
舉例而言，本發明提供一種分離之單株抗體(或其功能性片段)，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：14、34、54、74、94、114、134、154及174組成之群之胺基酸序列至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；該輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：15、35、55、75、95、115、135、155及175組成之群之胺基酸序列至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；其中該抗體結合於HER3(例如人類及/或食蟹獼猴 HER3)之域3且抑制HER3之信號傳導活性，可在磷酸化分析或HER信號傳導之其他量測方法(例如如實例中所描述之磷酸化HER3分析、磷酸化Akt分析、細胞增殖及配位體阻斷分析)中量測。本發明之範疇亦包括可變重鏈及輕鏈親本核苷酸序列；及為在哺乳動物細胞中表現而最佳化之全長重鏈及輕鏈序列。本發明之其他抗體包括已突變，但與上述序列仍具有至少60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%一致性百分比之胺基酸或核酸。在一些實施例中，其包括與上述序列中所描繪的可變區相比，可變區中至多1個、2個、3個、4個或5個胺基酸藉由胺基酸缺失、***或取代而突變的突變胺基酸序列。
舉例而言，本發明提供一種分離之單株抗體(或其功能性片段)，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：194、214、234、254、274、294、314、334、354、374、394、414、434、454、474、494、514、534、554、574、594、614、634、654、674及694組成之群之胺基酸序列至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；該輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：195、215、235、255、275、295、315、335、355、375、395、415、435、455、475、495、515、535、555、575、595、615、635、655、675及695組成之群之胺基酸序列至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；其中該抗體結合於HER3(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)之域3-4且抑制HER3 之信號傳導活性，可在磷酸化分析或HER信號傳導之其他量測方法(例如如實例中所描述之磷酸化HER3分析、磷酸化Akt分析、細胞增殖及配位體阻斷分析)中量測。本發明之範疇亦包括可變重鏈及輕鏈親本核苷酸序列；及為在哺乳動物細胞中表現而最佳化之全長重鏈及輕鏈序列。本發明之其他抗體包括已突變，但與上述序列仍具有至少60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%一致性百分比之胺基酸或核酸。在一些實施例中，其包括與上述序列中所描繪的可變區相比，可變區中至多1個、2個、3個、4個或5個胺基酸藉由胺基酸缺失、***或取代而突變的突變胺基酸序列。
在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可與表1或表2中闡述之序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可除至多1個、2個、3個、4個或5個胺基酸位置中胺基酸取代外均一致。VH及VL區與表1或表2中描述之抗體之VH及VL區具有高(亦即80%或80%以上)一致性的抗體可藉由突變誘發(例如定點或PCR介導之突變誘發)獲得，接著使用本文中描述之功能分析測試所編碼之改變抗體的保留功能。
在其他實施例中，重鏈及/或輕鏈核苷酸序列之可變區可與以上闡述之序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
如本文所用，兩個序列之間的「一致性百分比」為該等 序列所共享之一致位置之數目的函數(亦即一致性%等於一致位置之數目/位置總數目×100)，其考慮到間隙數目及每一間隙長度，需要引入間隙以對該兩個序列進行最佳比對。兩個序列之間的序列比較及一致性百分比之確定可如以下非限制性實例中所描述，使用數學演算法實現。
或者或另外，本發明之蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以對公共資料庫進行搜索，從而例如鑑別相關序列。舉例而言，該等搜索可使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之BLAST程式(2.0版)執行。
保守修飾之抗體
在某些實施例中，本發明之抗體具有包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中此等CDR序列中之一或多者具有基於本文中描述之抗體的指定胺基酸序列或其保守修飾，且其中該等抗體保留本發明之HER3抗體的所需功能性。
因此，本發明提供一種結合於HER3之域3的分離之HER3單株抗體或其片段，其由包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區組成，其中：重鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142及162及其保守修飾組成之群；重鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：3、23、43、63、83、103、123、143及163及其保守修飾組成之群；重鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、 124、144及164及其保守修飾組成之群；輕鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148及168及其保守修飾組成之群；輕鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149及169及其保守修飾組成之群；輕鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150及170及其保守修飾組成之群；抗體或其片段特異性結合於HER3，且藉由抑制HER3信號傳導路徑來抑制HER3活性，可在磷酸化分析或HER信號傳導之其他量測方法(例如如實例中所描述之磷酸化HER3分析、磷酸化Akt分析、細胞增殖及配位體阻斷分析)中量測。
因此，本發明提供一種結合於HER3之域3-4的分離之HER3單株抗體或其片段，其由包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區組成，其中：重鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502、522、542、562、582、602、622、642、662及682及其保守修飾組成之群；重鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503、523、543、563、583、603、623、643、663及683及其保守修飾組成之群；重鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由 SEQ ID NO：184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504、524、544、564、584、604、624、644、664及684及其保守修飾組成之群；輕鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508、528、548、568、588、608、628、648、668及688及其保守修飾組成之群；輕鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509、529、549、569、589、609、629、649、669及689及其保守修飾組成之群；輕鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510、530、550、570、590、610、630、650、670及690及其保守修飾組成之群；該抗體或其片段特異性結合於HER3，且藉由抑制HER信號傳導路徑來抑制HER3活性，可在磷酸化分析或HER信號傳導之其他量測方法(例如如實例中所描述之磷酸化HER3分析、磷酸化Akt分析、細胞增殖及配位體阻斷分析)中量測。
結合於相同抗原決定基之抗體
本發明提供相互作用(例如結合、位阻、穩定化/去穩定化、空間分佈)之抗原決定基與表1或表2中描述之HER3抗體相互作用(例如結合、位阻、穩定化/去穩定化、空間分 佈)之抗原決定基相同的抗體。因此，其他抗體可基於在HER3結合分析中其與本發明之其他抗體交叉競爭(例如以統計上顯著方式競爭性抑制本發明之其他抗體之結合)之能力來鑑別。測試抗體抑制本發明抗體結合於HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)之能力說明測試抗體可與該抗體競爭結合於HER3；根據非限制性理論，此類抗體可結合於HER3蛋白上與其競爭之抗體相同或相關(例如結構類似或空間鄰近)的抗原決定基。在某一實施例中，結合於HER3上與本發明抗體相同之抗原決定基的抗體為人類單株抗體。該等人類單株抗體可如本文中描述來製備及分離。
在一個實施例中，抗體或其片段結合於HER3之域3，且抑制配位體依賴性與非配位體依賴性HER3信號傳導。在一個實施例中，抗體或其片段結合於HER3之域3-4，且抑制配位體依賴性與非配位體依賴性HER3信號傳導。
本發明之抗體或其片段在不阻止配位體結合下抑制配位體依賴性與非依賴性HER3活化。由於以下原因，認為此為有利的：
(i)與靶向HER3活化之單一機制(亦即配位體依賴性或非配位體依賴性)之抗體相比，該治療抗體將臨床應用於許多腫瘤，因為不同腫瘤類型由各自機制驅動。
(ii)該治療抗體在HER3活化之兩種機制同時涉及之腫瘤類型中有效。靶向HER3活化之單一機制(亦即配位體依賴性或非配位體依賴性)之抗體在此等腫瘤類型中幾乎未顯 示功效。
(iii)在不阻止配位體結合下抑制配位體依賴性HER3活化之抗體的功效不太可能受配位體濃度增加不利地影響。此將轉化為在藉由很高濃度HER3配位體驅動之腫瘤類型中的功效增加，或在抗性由HER3配位體上調介導之情況下藥物抗性傾向減小。
(iv)藉由穩定化不活化形式來抑制HER3活化之抗體將不太會有HER3活化之替代機制所驅動之藥物抗性傾向。
因此，本發明之抗體可用於治療已存在之治療抗體在臨床上無效的病狀。
工程改造及修飾之抗體
本發明之抗體進一步可使用具有本文中顯示之VH及/或VL序列中之一或多者的抗體作為起始物質工程改造經修飾之抗體來製備，該經修飾之抗體可具有自起始抗體改變之性質。抗體可藉由修飾一或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內，例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內之一或多個殘基而工程改造。或者或另外，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基，例如改變抗體之效應功能而工程改造。
可執行之一種類型可變區工程改造為CDR移植。抗體與標靶抗原主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中之胺基酸殘基相互作用。為此，在個別抗體之間，CDR內之胺基酸序列比CDR外之序列變化多。因為CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，所以藉由構築包括來自特定天然存在之抗體之CDR序列移植於來自具有不同性質之 不同抗體之構架序列上的表現載體，可表現模擬特定天然存在之抗體之性質的重組抗體(參見例如Riechmann等人，(1998)Nature 332：323-327；Jones等人，(1986)Nature 321：522-525；Queen等人，(1989)Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86：10029-10033；Winter之美國專利第5,225,539號，及Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
因此，本發明之另一個實施例係關於一種結合於HER3之域3的分離之HER3單株抗體或其片段，其含有包含CDR1序列、CDR2序列及CDR3序列之重鏈可變區及具有CDR1序列、CDR2序列及CDR3序列之輕鏈可變區，分別地，該重鏈可變區之CDR1序列具有選自由SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142及162組成之群之胺基酸序列；CDR2序列具有選自由SEQ ID NO：33、23、43、63、83、103、123、143及163組成之群之胺基酸序列；CDR3序列具有選自由SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144及164組成之群之胺基酸序列；且分別地，該輕鏈可變區之CDR1序列具有選自由SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148及168組成之群之胺基酸序列；CDR2序列具有選自由SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149及169組成之群之胺基酸序列；且CDR3序列由選自由SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150及170組成之群之胺基酸序列組成。
因此，本發明之另一個實施例係關於一種結合於HER3 之域3-4的分離之HER3單株抗體或其片段，其含有包含CDR1序列、CDR2序列及CDR3序列之重鏈可變區及具有CDR1序列、CDR2序列及CDR3序列之輕鏈可變區，分別地，該重鏈可變區之CDR1序列具有選自由SEQ ID NO：182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502、522、542、562、582、602、622、642、662及682組成之群之胺基酸序列；CDR2序列具有選自由SEQ ID NO：183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503、523、543、563、583、603、623、643、663及683組成之群之胺基酸序列；CDR3序列具有選自由SEQ ID NO：184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504、524、544、564、584、604、624、644、664及684組成之群之胺基酸序列；且分別地，該輕鏈可變區之CDR1序列具有選自由SEQ ID NO：188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508、528、548、568、588、608、628、648、668及688組成之群之胺基酸序列；CDR2序列具有選自由SEQ ID NO：189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509、529、549、569、589、609、629、649、669及689組成之群之胺基酸序列；且CDR3序列由選自由SEQ ID NO：190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、 430、450、470、490、510、530、550、570、590、610、630、650、670及690組成之群之胺基酸序列組成。
雖然該等抗體含有單株抗體之VH及VL CDR序列，但仍可含有來自此等抗體之不同構架序列。該等構架序列可自包括生殖系抗體基因序列之公共DNA資料庫或公開參考文獻獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「Vbase」人類生殖系序列資料庫(在網際網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上可得)以及Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；及Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273：927-948；Tomlinson等人，(1992)J.fol.Biol.227：776-798；及Cox等人，(1994)Eur.J Immunol.24：827-836中；每一者之內容均以引用的方式明確併入本文中。
用於本發明抗體之構架序列之一實例為結構類似於藉由所選本發明抗體使用之構架序列者，例如藉由本發明之單株抗體使用之共同序列及/或構架序列。VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可移植於具有與在構架序列來源之生殖系免疫球蛋白基因中所發現一致之序列的構架區上，或CDR序列可移植於與生殖系序列相比含有一或多個突變之構架區上。舉例而言，已發現在某些情況下，使構架區內之殘基突變以維持或增強抗體之抗原結合能力為有 益的(參見例如Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
另一個類型可變區修飾為使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基突變，從而改良相關抗體之一或多種結合性質(例如親和力)，稱為「親和力成熟」。可執行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變，且可在如本文中描述及實例中提供之活體外或活體內分析中評估對抗體結合或其他相關功能性的作用。可引入保守修飾(如以上討論)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。此外，通常CDR區內至多一個、兩個、三個、四個或五個殘基改變。
因此，在另一個實施例中，本發明提供結合於HER3之域3的分離之HER3單株抗體或其片段，其由具有以下之重鏈可變區組成：VH CDR1區，其由選自具有SEQ ID NO：22、22、42、62、82、102、122、142及162之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142及162相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列組成；VH CDR2區，其具有選自由SEQ ID NO：3、23、43、63、83、103、123、143及163組成之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：3、23、43、63、83、103、123、143及163相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VH CDR3區，其具有選自由SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144及164組成之群之胺基酸序 列，或與SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144及164及370相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VL CDR1區，其具有選自由SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148及168組成之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148及168相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VL CDR2區，其具有選自由SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149及169組成之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149及169相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；及VL CDR3區，其具有選自由SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150及170及373組成之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150及170相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。
因此，在另一個實施例中，本發明提供結合於HER3之域3-4的分離之HER3單株抗體或其片段，其由具有以下之重鏈可變區組成：VH CDR1區，其由選自具有SEQ ID NO：182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502、522、542、562、582、602、622、642、662及682之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：182、202、222、242、262、282、302、 322、342、362、382、402、422、442、462、482、502、522、542、562、582、602、622、642、662及682相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列組成；VH CDR2區，其具有選自由SEQ ID NO：183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503、523、543、563、583、603、623、643、663及683組成之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503、523、543、563、583、603、623、643、663及683相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VH CDR3區，其具有選自由SEQ ID NO：184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504、524、544、564、584、604、624、644、664及684組成之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504、524、544、564、584、604、624、644、664及684相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VL CDR1區，其具有選自由SEQ ID NO：188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508、528、548、568、588、608、628、648、668及688組成之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：188、208、 228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508、528、548、568、588、608、628、648、668及688相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VL CDR2區，其具有選自由SEQ ID NO：189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509、529、549、569、589、609、629、649、669及689組成之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509、529、549、569、589、609、629、649、669及689相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；及VL CDR3區，其具有選自由SEQ ID NO：190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510、530、550、570、590、610、630、650、670及690組成之群之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510、530、550、570、590、610、630、650、670及690相比，具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。
抗體片段移植至替代構架或骨架中
可採用多種抗體/免疫球蛋白構架或骨架，只要所得多肽包括至少一個特異性結合於HER3之結合區即可。該等 構架或骨架包括人類免疫球蛋白之5個主要個體基因型或其片段，且包括其他動物物種之免疫球蛋白，較佳具有人類化態樣。新穎構架、骨架及片段由熟習此項技術者繼續發現及發展。
在一個態樣中，本發明係關於使用本發明之CDR可移植至之非免疫球蛋白骨架產生基於非免疫球蛋白之抗體。可採用已知或將來非免疫球蛋白構架及骨架，只要其包含對標靶HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)具有特異性之結合區。已知之非免疫球蛋白構架或骨架包括(但不限於)纖維結合蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,MA)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗體(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模塊免疫藥劑(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、最大抗體(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、蛋白A(Affibody AG,Sweden)及親和配體分子(affilin)(γ-晶狀體球蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。
纖維結合蛋白骨架係基於纖維結合蛋白III型域(例如纖維結合蛋白III型之第十模組(10 Fn3域))。纖維結合蛋白III型域具有7或8個β股，該等股分佈在兩個β片之間，該等β片自身相對於彼此壓緊，形成蛋白質之核心，且進一步含有將該等β股彼此連接且暴露於溶劑之環(類似於CDR)。在β片夾層每一邊緣存在至少三個該等環，其中邊緣為垂直 於β股方向之蛋白質邊界(參見US6,818,418)。此等基於纖維結合蛋白之骨架並非免疫球蛋白，不過總體摺疊與包含駱駝及美洲駝IgG中整個抗原識別單元之最小功能抗體片段重鏈可變區之摺疊密切相關。因為此結構，所以非免疫球蛋白抗體模擬性質及親和力類似於抗體之抗原結合性質。此等骨架可用於類似於活體內抗體親和力成熟過程之活體外環隨機化及改組策略。此等基於纖維結合蛋白之分子可用作骨架，其中分子之環區可使用標準選殖技術經本發明之CDR置換。
錨蛋白技術係基於使用具有錨蛋白衍生之重複模組作為承載可用於結合於不同標靶之可變區之骨架的蛋白質。錨蛋白重複模組為由兩個反平行α-螺旋及β-轉角組成之33胺基酸多肽。可變區之結合主要藉由使用核糖體呈現最佳化。
高親和性多聚體來源於含有天然A-域之蛋白質，諸如HER3。此等域天生用於蛋白質-蛋白質相互作用，且在人類中，超過250種蛋白質在結構上基於A-域。高親和性多聚體由大量不同的「A-域」單體(2-10)經由胺基酸連接子連接組成。可使用例如美國專利申請公開案第20040175756號、第20050053973號、第20050048512號及第20060008844號中描述之方法產生可結合於標靶抗原之高親和性多聚體。
親和抗體親和力配位體為小的簡單蛋白質，其由三個螺旋束基於蛋白A之IgG結合域之一的骨架構成。蛋白A為來 自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之表面蛋白質。此骨架域由58個胺基酸組成，其中13個隨機化，產生具有許多配位體變異體之親和抗體文庫(參見例如US 5,831,012)。親和抗體分子模擬抗體，與150 kDa之抗體分子量比較，其具有6 kDa之分子量。儘管其尺寸小，但親和抗體分子之結合位點類似於抗體。
抗轉運蛋白為Pieris ProteoLab AG公司研發之產品。其衍生自脂質運載蛋白，脂質運載蛋白為一組分佈廣泛之小而穩固的蛋白質，通常參與化學敏感或不溶化合物之生理運輸或儲存。若干天然脂質運載蛋白存在於人類組織或體液中。蛋白質構造使人想起免疫球蛋白，其中高變環在剛性構架之上。然而，與抗體或其重組片段形成對比，脂質運載蛋白由具有160至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈構成，僅僅在邊緣比單一免疫球蛋白域大。構成結合袋之四環組顯示顯著的結構可塑性且耐受多種側鏈。因此結合位點可在專用過程中重塑，以識別具有高親和力及特異性之不同形狀之規定標靶分子。脂質運載蛋白家族之一種蛋白質大菜粉蛾(Pieris Brassicae)之膽汁三烯結合蛋白(BBP)已用以藉由誘變四環組來發展抗轉運蛋白。描述抗轉運蛋白之專利申請案之一個實例在PCT公開案第WO 199916873號中。
親和配體分子為小的非免疫球蛋白，其設計成對蛋白質及小分子具有特定親和力。新的親和配體分子可非常快速地選自兩個文庫，每一文庫係基於不同的人類來源骨架蛋 白。親和配體分子未顯示與免疫球蛋白之任何結構同源性。目前，採用兩種親和配體分子骨架，其中一者為γ晶體(一種人類結構眼晶狀體蛋白)且另一者為「泛素」超家族蛋白。兩種人類骨架非常小，顯示高溫穩定性，且對pH變化及變性劑之抗性近似。此高穩定性主要歸因於蛋白質展開之β片結構。γ晶體衍生蛋白之實例描述於WO200104144中且「泛素樣」蛋白之實例描述於WO2004106368中。
蛋白抗原決定基模擬物(PEM)為中等尺寸之環狀肽樣分子(MW 1-2 kDa)，其模擬蛋白質之β-髮夾二級結構(參與蛋白質-蛋白質相互作用之主要二級結構)。
在一些實施例中，Fab藉由變化Fc區而轉變成沉默IgG1格式。舉例而言，表1或表2中之抗體可轉變成IgG格式。
人類或人類化抗體
本發明提供特異性結合於HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴/小鼠/大鼠HER3)之完全人類抗體。與嵌合或人類化抗體比較，人類HER3抗體或其片段在投與人類個體時具有進一步降低之抗原性。
人類HER3抗體或其片段可使用此項技術中已知之方法產生。舉例而言，人類工程改造技術用以將非人類抗體轉變成經工程改造之人類抗體。美國專利公開案第20050008625號描述一種活體內方法，該方法將抗體中非人類抗體可變區用人類可變區置換，同時維持與非人類抗體相同之結合特徵或提供比非人類抗體更佳之結合特徵。 該方法依賴於抗原決定基指導之完全人類抗體置換非人類參考抗體之可變區。所得人類抗體一般在結構上與參考非人類抗體無關，但結合於與參考抗體相同之抗原上的相同抗原決定基。簡言之，該連續抗原決定基指導之互補置換方法藉由在細胞中在對測試抗體結合於抗原起反應之報導系統存在下在「競爭者」與參考抗體(「測試抗體」)各種雜合物之文庫之間建立對有限量之抗原的競爭來啟動。競爭者可為參考抗體或其衍生物，諸如單鏈Fv片段。競爭者亦可為天然或人工抗原配位體，其結合於與參考抗體相同之抗原決定基。競爭者之唯一必要條件為其結合於與參考抗體相同之抗原決定基，且其與參考抗體競爭結合抗原。測試抗體具有一個來自非人類參考抗體之共有抗原結合V-區，且另一個V-區隨機選自各種來源，諸如人類抗體之全部文庫。來自參考抗體之共有V-區充當向導，將測試抗體置於抗原之相同抗原決定基上且置於相同取向上，以便選擇對參考抗體之最高抗原結合保真度。
許多類型報導系統可用於偵測測試抗體與抗原之間的所需相互作用。舉例而言，互補報導片段可分別連接於抗原及測試抗體，以便藉由片段互補之報導體活化僅在測試抗體結合於抗原時發生。當測試抗體-報導片段及抗原-報導片段融合物與競爭者共表現時，報導體活化視測試抗體與競爭者競爭之能力而定，該能力與測試抗體對抗原之親和力成比例。可使用之其他報導系統包括如美國專利申請案第10/208,730號(公開案第20030198971號)中揭示之自體抑 制報導再活化系統之再活化劑(RAIR)，或美國專利申請案第10/076,845號(公開案第20030157579號)中揭示之競爭活化系統。
在連續抗原決定基指導之互補置換系統下，選擇鑑別表現單一測試抗體以及競爭者、抗原及報導組分之細胞。在此等細胞中，每一測試抗體一對一地與競爭者競爭結合於有限量之抗原。報導體之活性與結合於測試抗體之抗原之量成比例，該抗原之量又與測試抗體對抗原之親和力及測試抗體之穩定性成比例。測試抗體最初基於其在表現為測試抗體時相對於參考抗體之活性選擇。第一輪選擇之結果為一組「雜合」抗體，其每一者均包含來自參考抗體之相同非人類V-區及來自文庫之人類V-區，且每一者均結合於抗原上與參考抗體相同之抗原決定基。在第一輪中選擇之一或多種雜合抗體將具有與參考抗體可比或高於參考抗體之親和力。
在第二V-區置換步驟中，第一步驟中選擇之人類V-區用作選擇用同源人類V-區之各種文庫對剩餘非人類參考抗體V-區進行人類置換的指導。第一輪中選擇之雜合抗體亦可用作第二輪選擇之競爭者。第二輪選擇之結果為一組完全人類抗體，其在結構上不同於參考抗體，但與參考抗體競爭結合於相同抗原。一些所選人類抗體結合於與參考抗體相同之抗原上的相同抗原決定基。在此等所選人類抗體中，一或多者以可與參考抗體相比或高於參考抗體之親和力結合於相同抗原決定基。
使用上述小鼠或嵌合HER3抗體或其片段之一者作為參考抗體，此方法可容易用以產生以相同結合特異性及相同或更佳結合親和力結合於人類HER3之人類抗體。另外，該等人類HER3抗體或其片段亦可自通常製造人類抗體之公司(例如KaloBios,Inc.(Mountain View,CA))購得。
駱駝科抗體
自駱駝及單峰駱駝(雙峰駝(Camelus bactrianus)及單峰駝(Calelus dromaderius))家族成員(包括新世界成員，諸如美洲駝物種(羊駝(Lama paccos)、大羊駝(Lama glama)及瘦駝(Lama vicugna)))獲得之抗體蛋白已關於尺寸、結構複雜性及對人類個體之抗原性進行表徵。發現來自哺乳動物此家族之某些IgG抗體實際上缺乏輕鏈，因此在結構上與來自其他動物之抗體的具有兩個重鏈及兩個輕鏈之典型四鏈四級結構不同。參見PCT/EP93/02214(WO 94/04678，1994年3月3日公開)。
作為鑑別為VHH之小單可變域的駱駝科抗體區可藉由遺傳工程改造獲得，得到對標靶具有高親和力之小蛋白質，產生稱為「駱駝科奈米抗體」之低分子量抗體衍生蛋白。參見1998年6月2日頒予之美國專利第5,759,808號；亦參見Stijlemans等人，(2004)J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin等人，(2003)Nature 424：783-788；Pleschberger等人，(2003)Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo等人，(2002)Int J Cancer 89：456-62；及Lauwereys等人，(1998)EMBO J 17：3512-3520。駱駝科抗 體及抗體片段之工程改造之文庫可購自例如Ablynx(Ghent,Belgium)(例如US20060115470)、Domantis(US20070065440、US20090148434)。如同其他非人類來源抗體一樣，駱駝科抗體之胺基酸序列可重組改變，獲得與人類序列更類似之序列，亦即奈米抗體可「人類化」。因此，駱駝科抗體對人類之天然低抗原性可進一步降低。
駱駝科奈米抗體之分子量約為人類IgG分子之十分之一，且該蛋白質具有僅幾奈米之物理直徑。小尺寸之一個結果為駱駝科奈米抗體能夠結合於較大抗體蛋白在功能上看不見之抗原位點，亦即駱駝科奈米抗體適用作偵測使用經典免疫技術以其他方式隱藏之抗原的試劑及用作可能治療劑。因此，小尺寸之又一個結果為駱駝科奈米抗體可因結合於標靶蛋白質之凹槽或狹窄裂縫中之特異性位點而抑制，由此可提供比經典抗體更類似於經典低分子量藥物之功能的能力。
低分子量及緊湊尺寸進一步使駱駝科奈米抗體極其熱穩定，對極度pH值及蛋白水解消化穩定，且抗原性低。另一個結果為駱駝科奈米抗體容易自循環系統移入組織中，且甚至穿過血腦障壁且可治療影響神經組織之病症。奈米抗體可進一步促進藥物運輸穿過血腦障壁。參見2004年8月19日公開之美國專利申請案20040161738。此等特徵與對人類之低抗原性組合指示巨大的治療潛能。此外，此等分子可在諸如大腸桿菌之原核細胞中完全表現，且使用噬菌體表現為融合蛋白並具有功能性。
因此，本發明之一特徵為對HER3具有高親和力之駱駝科抗體或奈米抗體。在本文中之某些實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體在駱駝科動物中天然產生，亦即使用本文中關於其他抗體所述之技術，藉由駱駝科在用HER3或其肽片段免疫接種後產生。或者，HER3結合駱駝科奈米抗體進行工程改造，亦即如本文中之實例中所描述，藉由使用淘選程序，以HER3為標靶，例如自噬菌體呈現適當誘變之駱駝科奈米抗體蛋白質的文庫選擇而產生。工程改造之奈米抗體可進一步藉由遺傳工程改造來定製，以在接受個體中具有45分鐘至2週之半衰期。在一特定實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體藉由將本發明之人類抗體之重鏈或輕鏈的CDR序列移植至奈米抗體或單域抗體構架序列中，如例如PCT/EP93/02214中所述來獲得。在一個實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體至少結合於HER3之域3中選自胺基酸殘基335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集之胺基酸殘基。在一個實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體至少結合於HER3之域3中選自胺基酸殘基571、582-584、596-597、600-602、609-615(域4)或其子集之胺基酸殘基。
雙特異性分子及多價抗體
在另一個態樣中，本發明係關於包含結合於HER3之域3內之非線性或構形抗原決定基的抗體或其片段之雙互補位、雙特異性或多特異性分子。在另一個態樣中，該等雙互補位、雙特異性或多特異性分子包含結合於HER3之域4 內之抗原決定基的抗體或其片段。該抗體或其片段可衍生化或連接於另一官能分子，例如另一肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配位體)，產生結合於至少兩個不同結合位點或標靶分子之雙特異性分子。抗體或其片段事實上可衍生化或連接於一個以上其他官能分子，產生結合於兩個以上不同結合位點及/或標靶分子之雙互補位或多特異性分子；該等雙互補位或多特異性分子。為產生雙特異性分子，抗體或其片段可在功能上連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式)於一或多種其他結合分子，諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，從而得到雙特異性分子。
其他臨床益處可藉由在一個抗體內結合兩個或兩個以上抗原來提供(Coloma等人，(1997)；Merchant等人，(1998)；Alt等人，(1999)；Zuo等人，(2000)；Lu等人，(2004)；Lu等人，(2005)；Marvin等人，(2005)；Marvin等人，(2006)；Shen等人，(2007)；Wu等人，(2007)；Dimasi等人，(2009)；Michaelson等人，(2009))。(Morrison等人，(1997)Nature Biotech.15：159-163；Alt等人(1999)FEBS Letters 454：90-94；Zuo等人，(2000)Protein Engineering 13：361-367；Lu等人，(2004)JBC 279：2856-2865；Lu等人，(2005)JBC 280：19665-19672；Marvin等人，(2005)Acta Pharmacologica Sinica 26：649-658；Marvin等人，(2006)Curr Opin Drug Disc Develop 9：184-193；Shen等人，(2007)J Immun Methods 218：65-74；Wu等人，(2007)Nat Biotechnol.11：1290-1297；Dimasi等人，(2009)J Mol Biol.393：672-692；及Michaelson等人，(2009)mAbs 1：128-141)。
雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法結合成分結合特異性來製備。舉例而言，雙特異性分子之每一結合特異性可分別產生，接著彼此結合，例如可使用多種偶合或交聯劑進行共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及磺酸基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺酸基-SMCC)(參見例如Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括以下中描述者：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78：118-132；Brennan等人，(1985)Science 229：81-83；及Glennie等人，(1987)J.Immunol.139：2367-2375。結合劑為SATA及磺酸基-SMCC，兩者均可自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)獲得。
在抗體下，其可藉由兩個重鏈之C端鉸鏈區進行硫氫基鍵結來結合。在一特定實施例中，鉸鏈區經修飾，以在結合前含有奇數個硫氫基殘基，例如一個。
或者，兩種結合特異性可編碼於相同載體中且在相同宿主細胞中表現及組裝。此方法尤其適用於雙特異性分子為 mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配位體×Fab融合蛋白之情況。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及結合決定子之單鏈分子或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法例如描述於以下中：美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號。
雙特異性分子結合於其特定標靶可藉由例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(REA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析來確認。此等分析每一者一般藉由採用對特別相關之蛋白質-抗體複合物具有特異性之標記試劑(例如抗體)偵測相關複合物之存在。
在另一個態樣中，本發明提供包含結合於HER3之抗體之至少兩個一致或不同片段的多價化合物。抗體片段可經由蛋白質融合或共價或非共價連接來連接在一起。四價化合物可例如藉由將本發明之抗體與結合於本發明抗體之恆定區(例如Fc或鉸鏈區)之抗體交聯來獲得。三聚化域描述於例如Borean專利EP 1012280B1中。五聚化模組描述於例如PCT/EP97/05897中。
在一個實施例中，雙互補位/雙特異性抗體至少結合於HER3之域3中選自胺基酸殘基335-342、362-376、398、 400、424-428、431、433-434及455(域3內)或其子集之胺基酸殘基。在一個實施例中，雙互補位/雙特異性抗體至少結合於HER3之域3中選自胺基酸殘基571、582-584、596-597、600-602、609-615(域4)或其子集之胺基酸殘基。
在另一個實施例中，本發明係關於雙重功能抗體，其中單一單株抗體經修飾，使得抗原結合位點結合於一種以上抗原，諸如結合HER3與另一抗原(例如HER1、HER2及HER4)之雙重功能抗體。在另一個實施例中，本發明係關於靶向具有相同構形之抗原，例如具有處於「閉合」或「不活化」狀態之HER3之相同構形的抗原之雙重功能抗體具有處於「閉合」或「不活化」狀態之HER3之相同構形的抗原之實例包括(但不限於)HER1及HER4。因此，雙重功能抗體可結合於HER3與HER1，HER3與HER4，或HER1與HER4。雙重功能抗體之雙重結合特異性可進一步轉化為雙重活性或活性抑制(參見例如Jenny Bostrom等人，(2009)Science：323；1610-1614)。
半衰期延長之抗體
本發明提供活體內半衰期延長的特異性結合於HER3之域3內之非線性或構形抗原決定基的抗體或其片段。本發明亦提供活體內半衰期延長的特異性結合於HER3之域4內之抗原決定基的抗體或其片段。
許多因素可影響蛋白質之活體內半衰期。例如腎過濾、肝中代謝、蛋白水解酶(蛋白酶)降解及免疫原反應(例如藉 由抗體中和蛋白質及藉由巨噬細胞及樹突狀細胞吸收)。多種策略可用於延長本發明抗體之半衰期。舉例而言，藉由化學連接於聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗體骨架、聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合配位體及碳水化合物遮罩；藉由基因融合於結合於血清蛋白之蛋白，諸如白蛋白、IgG、FcRn，及轉移；藉由偶合(基因上或化學上)於結合於血清蛋白之其他結合部分，諸如奈米抗體、Fab、DARPin、高親和性多聚體、親和抗體及抗轉運蛋白；藉由基因融合於rPEG、白蛋白、白蛋白域、白蛋白結合蛋白及Fc；或藉由併入奈米運載體、緩釋調配物或醫學裝置。
為延長活體內抗體之血清循環，諸如高分子量PEG之惰性聚合物分子可在有或無多功能連接子下經由PEG位點特異性結合於抗體之N端或C端或者經由離胺酸殘基上存在之ε-胺基來連接於抗體或其片段。為將抗體聚乙二醇化，抗體或其片段通常與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使一或多個PEG基團連接於抗體或抗體片段之條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用以衍生其他蛋白質之任何形式PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為非糖基化抗體。將使用線性或分支聚合物衍生，其使生物活性損失最小。結合度可藉由 SDS-PAGE及質譜分析密切監測，以確保PEG分子恰當地結合於抗體。未反應之PEG可藉由尺寸排除或藉由離子交換層析與抗體-PEG結合物分離。可使用熟習此項技術者熟知之方法，例如藉由本文中描述之免疫分析，測試PEG衍生之抗體的結合活性以及活體內功效。用於聚乙二醇化蛋白質之方法為此項技術中已知且可應用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人EP 0 401 384。
其他修飾之聚乙二醇化技術包括重構化學正交定向工程改造技術(ReCODE PEG)，其經由包括tRNA合成酶及tRNA之重構系統將化學指定側鏈併入生物合成蛋白中。此技術能夠在大腸桿菌、酵母及哺乳動物細胞中將超過30種新胺基酸併入生物合成蛋白中。tRNA將外來胺基酸併入琥珀密碼子所位於之任何地方，將來自終止密碼子之琥珀轉變成示意化學指定胺基酸併入之密碼子。
重組聚乙二醇化技術(rPEG)亦可用於延長血清半衰期。此技術包含將300-600胺基酸未結構化蛋白質尾基因稠合於已存在之醫藥蛋白質。因為此類未結構化蛋白質鏈之表觀分子量約為其實際分子量的15倍，所以該蛋白質之血清半衰期大大增加。與需要化學結合及再純化之傳統聚乙二醇化相比，該製造過程大大簡化且產物均一。
聚唾液酸化為另一技術，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)來延長有效壽命且提高治療肽及蛋白質之穩定性。PSA為唾液酸(一種糖)之聚合物。當用於蛋白質及治療肽 藥物遞送時，聚唾液酸提供對結合之保護微環境。此增加治療蛋白質在循環中之有效壽命，且阻止其被免疫系統識別。PSA聚合物在人體中天然發現。其為進化數百萬年以上之某些細菌所採用，用其來塗佈其壁。此等天然聚唾液酸化細菌接著能夠依靠分子模擬來擋開身體的防禦系統。PSA為天然的最終隱形技術，可容易由大量且具有預定物理性質之該等細菌產生。即使與蛋白質偶合時，細菌PSA亦完全無免疫原性，因為其與人體中之PSA化學一致。
另一技術包括使用連接於抗體之羥乙基澱粉(「HES」)衍生物。HES為來源於糯玉米澱粉之經修飾天然聚合物且可藉由身體酶代謝。通常投與HES溶液以取代不足血容量且提高血液之流變性質。抗體羥乙基澱粉化能夠藉由提高分子穩定性以及藉由降低腎清除率來延長循環半衰期，從而提高生物活性。藉由改變不同參數，諸如HES之分子量，可定製各類HES抗體結合物。
活體內半衰期增加之抗體亦可藉由將一或多個胺基酸修飾(亦即取代、***或缺失)引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈Fc域片段)中產生。參見例如國際公開案第WO 98/23289號；國際公開案第WO 97/34631號；及美國專利第6,277,375號。
此外，抗體可結合於白蛋白，以製造在活體內更穩定或在活體內具有更長半衰期之抗體或抗體片段。該等技術為此項技術中熟知，參見例如國際公開案第WO 93/15199號、第WO 93/15200號及第WO 01/77137號；及歐洲專利 第EP 413,622號。
HER3抗體或其片段亦可稠合於一或多種人類血清白蛋白(HSA)多肽或其一部分。HSA為一種呈其成熟形式之具有585個胺基酸之蛋白質，負責較大比例之血清滲透壓以及用作內源性及外源性配位體之運載體。白蛋白作為運載分子之作用及其惰性為用作活體內多肽之運載體及轉運體所需的性質。白蛋白用作作為各種蛋白質之運載體之白蛋白融合蛋白的組分已在WO 93/15199、WO 93/15200及EP 413 622中提出。亦已提出使用HSA之N端片段與多肽融合(EP 399 666)。因此，藉由抗體或其片段在基因或化學上稠合或結合於白蛋白，可穩定或延長存放期，及/或保留分子在溶液中、活體外及/或活體內活性更長時間。
白蛋白融合於另一蛋白質可藉由基因操作來實現，使得編碼HSA或其片段之DNA接合於編碼蛋白質之DNA。接著適合宿主用稠合之核苷酸序列轉型或轉染，所以排列在適合質體上以表現融合多肽。表現可自例如原核或真核細胞活體外實現，或例如自轉殖基因生物體活體內實現。關於HSA融合之其他方法可見於例如WO 2001077137及WO 200306007(以引用的方式併入本文中)中。在一特定實施例中，融合蛋白質之表現在例如CHO細胞株之哺乳動物細胞株中進行。在低或高pH下抗體與受體改變之差分結合亦涵蓋於本發明範疇內。舉例而言，抗體之親和力可藉由修飾抗體以在抗體之CDR中包括其他胺基酸(諸如組胺酸)來修飾，使得其在低pH(例如溶酶體內之低pH)下仍結合於其受 體(參見例如Tomoyuki Igawa等人(2010)Nature Biotechnology；28,1203-1207)。
抗體結合物
本發明提供特異性結合於HER3之抗體或其片段，其重組稠合或化學結合(包括共價與非共價結合)於異源蛋白或多肽(或其片段，較佳為具有至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸之多肽)，產生融合蛋白。詳言之，本發明提供包含本文所述之抗體片段(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)與異源蛋白、多肽或肽之融合蛋白。用於將蛋白質、多肽或肽稠合或結合於抗體或抗體片段之方法為此項技術中已知。參見例如美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號及第5,112,946號；歐洲專利第EP 307,434號及第EP 367,166號；國際公開案第WO 96/04388號及第WO 91/06570號；Ashkenazi等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539；Zheng等人，(1995)J.Immunol.154：5590-5600；及Vil等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341。
其他融合蛋白可經由基因改組、基元改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統一稱為「DNA改組」)之技術產生。DNA改組可用以改變本發明抗體或其片段(例如具有較高親和力及較低解離速率之抗體或其片段)之活性。一般參 見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，(1997)Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama,(1998)Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，(1999)J.Mol.Biol.287：265-76；及Lorenzo及Blasco,(1998)Biotechniques 24(2)：308-313(此等專利及公開案每一者均以全文引用的方式併入本文中)。抗體或其片段或編碼抗體或其片段可藉由在重組前用易錯PCR隨機突變誘發、隨機核苷酸***或其他方法來改變。編碼特異性結合於HER3蛋白之抗體或其片段的聚核苷酸可與一或多種異源分子之一或多種組分、基元、區域、部分、域、片段等重組。
此外，抗體或其片段可稠合於標記物序列，諸如肽，以促進純化。在較佳實施例中，標記物胺基酸序列尤其為六組胺酸肽，諸如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)中提供之標籤，其中多者可購得。如Gentz等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如六組胺酸便利融合蛋白之純化。適用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)血球凝集素(「HA」)標籤，其對應於來源於流感血球凝集素蛋白之抗原決定基(Wilson等人(1984)Cell 37：767)；及「flag」標籤。
在其他實施例中，本發明之抗體或其片段結合於診斷或可偵測試劑。該等抗體可用於監測或預測疾病或病症之發作、發展、進展及/或嚴重程度作為臨床測試程序(諸如測 定特定療法之功效)之一部分。該診斷及偵測可藉由抗體偶合於可偵測物質來實現，該等可偵測物質包括(但不限於)各種酶，諸如(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素/生物素及親和素/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質，諸如(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光物質，諸如(但不限於)螢光素酶、螢蟲素及水母發光蛋白；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In及111In)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；及使用各種正電子發射斷層攝影法之正電子發射金屬及非放射性順磁性金屬離子。
本發明進一步涵蓋抗體或其片段結合於治療部分之用途。抗體或其片段可結合於治療部分，諸如細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α-發射體)。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害之任何藥劑。
此外，抗體或其片段可結合於修飾既定生物反應之治療 部分或藥物部分。不認為治療部分或藥物部分限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白質、肽或多肽。該等蛋白質可包括例如毒素，諸如相思子毒素、篦麻毒素A、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織血纖維蛋白溶酶原活化劑、細胞凋亡劑、抗血管生成劑；或生物反應調節物，諸如淋巴因子。在一個實施例中，HER3抗體或其片段結合於治療部分，諸如細胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素。該等結合物在本文中稱為「免疫結合物」。包括一或多種細胞毒素之免疫結合物稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如殺死細胞)之任何藥劑。實例包括坦克松(taxon)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(t.colchicin)、小紅黴(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoid)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol) 及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。治療劑亦包括例如抗代謝物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、燒蝕劑(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chloraxnbucil)、美法侖(meiphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)及洛莫司汀(lomustine，CCNU))、環磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)及順式-二氯二胺鉑(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)、順鉑(cisplatin)、蒽環黴素(anthracycline)(例如道諾黴素(以前為柔紅黴素(daunomycin))及小紅黴)、抗生素(例如放線菌素D(dactinomycin)(以前為放線菌素(actinomycin)))、博來黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)及安麯黴素(anthramycin，AMC))及抗有絲***劑(例如長春新鹼及長春花鹼)。(參見例如Seattle Genetics US20090304721)。
可結合於本發明抗體或其片段之治療細胞毒素之其他實例包括倍癌黴素(duocarmycin)、加里刹黴素(calicheamicin)、美登素(maytansine)及奧瑞斯汀(auristatin)及其衍生物。加里刹黴素抗體結合物之一實例可購得(MylotargTm；Wyeth-Ayerst)。
細胞毒素可使用此項技術中可用之連接子技術結合於本發明之抗體或其片段。已用以將細胞毒素結合於抗體之連 接子類型的實例包括(但不限於)含有腙、硫醚、酯、二硫化物及肽之連接子。可選擇例如易藉由溶酶體分隔內低pH值裂解或易藉由蛋白酶(優先在腫瘤組織中表現之蛋白酶，諸如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D))裂解之連接子。
關於細胞毒素類型、連接子及治療劑結合於抗體之方法的進一步討論，亦參見Saito等人，(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail等人，(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne,(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan及Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter及Springer,(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本發明之抗體或其片段亦可結合於放射性同位素，產生細胞毒性放射性藥物，亦稱為放射性免疫結合物。可結合於抗體用於診斷或治療用途之放射性同位素的實例包括(但不限於)碘131、銦111、釔90及鑥177。此項技術中已建立製備放射性免疫結合物之方法。放射性免疫結合物之實例可購得，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)及BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，且類似方法可用於使用本發明之抗體製備放射性免疫結合物。在某些實施例中，大環螯合劑為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接分子附接於抗體。該等連接分子通常在此項技術中已知且描述於以下中：Denardo等人， (1998)Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人，(1999)Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；及Zimmerman等人，(1999)Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，各以全文引用的方式併入本文中。
用於將治療部分結合於抗體之技術為大家所熟知，參見例如Arnon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies And Cancer TherapyReisfeld等人(編輯)，第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編輯)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編輯)，第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編輯)，第303-16頁(Academic Press 1985)及Thorpe等人，(1982)Immunol.Rev.62：119-58。
抗體亦可附接於固體支撐物，其尤其適用於免疫分析或純化標靶抗原。該等固體支撐物包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸(nylon)、聚苯乙烯、聚氯乙烯或 聚丙烯。
抗體組合
在另一個態樣中，本發明係關於本發明之HER3抗體或其片段，其與諸如其他抗體、小分子抑制劑、mTOR抑制劑或PI3激酶抑制劑之其他治療劑一起使用。實例包括(但不限於)以下：HER1抑制劑：HER3抗體或其片段可與HER1抑制劑一起使用，包括(但不限於)馬妥珠單抗(EMD72000)、Erbitux®/西妥昔單抗(Imclone)、Vectibix®/帕尼單抗(Amgen)、mAb 806及尼妥珠單抗(TheraCIM)、Iressa®/吉非替尼(Astrazeneca)；CI-1033(PD183805)(Pfizer)、拉帕替尼(GW-572016)(GlaxoSmithKline)、Tykerb®/二甲苯磺酸拉帕替尼(SmithKlineBeecham)、Tarceva®/鹽酸厄羅替尼(OSI-774)(OSI Pharma))及PKI-166(Novartis)及N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-[[(3"S")-四氫-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基胺基)-2-丁烯醯胺(在商標名Tovok®下由Boehringer Ingelheim出售)。
HER2抑制劑：HER3抗體或其片段可與HER2抑制劑一起使用，包括(但不限於)帕妥珠單抗(在商標Omnitarg®下由Genentech出售)、曲妥珠單抗(在商標Herceptin®下由Genentech/Roche出售)、MM-111、來那替尼(亦稱HKI-272，(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]胺基]-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯胺，且描述於PCT公開案第WO 05/028443號中)、拉帕替尼或 二甲苯磺酸拉帕替尼(在商標Tykerb®下由GlaxoSmithKline出售)。
HER3抑制劑：HER3抗體或其片段可與HER3抑制劑一起使用，包括(但不限於)MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)及抑制HER3之小分子。
HER4抑制劑：HER3抗體或其片段可與HER4抑制劑一起使用。
PI3K抑制劑：HER3抗體或其片段可與PI3激酶抑制劑一起使用，包括(但不限於)4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺醯基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]嗎啉(亦稱GDC 0941且描述於PCT公開案第WO 09/036082號及第WO 09/055730號)、2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(亦稱BEZ 235或NVP-BEZ 235且描述於PCT公開案第WO 06/122806號)、BKM120及BYL719。
mTOR抑制劑：HER3抗體或其片段可與mTOR抑制劑一起使用，包括(但不限於)西羅莫司(在商標名Torisel®下由Pfizer出售)、雷達莫司(以前稱為德福莫司(deferolimus)，二甲基亞膦酸(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己酯，亦稱德佛莫司、 莫司、AP23573及MK8669(Ariad Pharm.)，且描述於PCT公開案第WO 03/064383號)、依維莫司(RAD001)(在商標名Afinitor®下由Novartis出售)，一或多種治療劑可與本發明之HER3抗體或其片段同時或在其之前或之後投與。
產生本發明抗體之方法 (i)編碼抗體之核酸
本發明提供實質上純化之核酸分子，其編碼包含上述HER3抗體鏈之區段或域的多肽。一些本發明之核酸包含編碼HER3抗體重鏈可變區之核苷酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核苷酸序列。在一特定實施例中，核酸分子為表1或表2中鑑別之核酸分子。本發明之一些其他核酸分子包含與表1或表2中鑑別之核酸分子之核苷酸序列實質上一致(例如至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的核苷酸序列。當自適當表現載體表現時，藉由此等聚核苷酸編碼之多肽能夠顯示HER3抗原結合能力。
本發明亦提供編碼來自以上闡明之抗體或其片段之重鏈或輕鏈的至少一個CDR區且通常所有三個CDR區之聚核苷酸。一些其他聚核苷酸編碼以上闡明之抗體或其片段之重鏈及/或輕鏈的所有或實質上所有可變區序列。因為編碼簡併，所以多種核酸序列將編碼每一免疫球蛋白胺基酸序列。
本發明之核酸分子可編碼抗體之可變區與恆定區。一些本發明之核酸序列包含編碼與表1或表2中闡明之HER3抗體之成熟重鏈可變區序列實質上一致(例如至少80%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%)的成熟重鏈可變區序列之核苷酸。一些其他核酸序列包含編碼與表1或表2中闡明之HER3抗體之成熟輕鏈可變區序列實質上一致(例如至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的成熟輕鏈可變區序列之核苷酸。
聚核苷酸序列可藉由重新固相DNA合成或對編碼抗體或其片段之已存在序列進行PCR突變誘發來產生。核酸之直接化學合成可藉由此項技術中已知之方法實現，諸如Narang等人，(1979)Meth.Enzymol.68：90之磷酸三酯法；Brown等人，(1979)Meth.Enzymol.68：109之磷酸二酯法；Beaucage等人，(1981)Tetra.Lett.,22：1859之二乙基胺基磷酸酯法；及美國專利第4,458,066號之固體支撐物法。突變藉由PCR引入聚核苷酸序列中可如例如以下中所述進行：PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編輯)，Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編輯)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：967；及Eckert等人，(1991)PCR Methods and Applications 1：17。
本發明亦提供用於產生抗體或其片段之表現載體及宿主細胞。各種表現載體可用以表現編碼HER3抗體鏈或其片段之聚核苷酸。基於病毒與非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包括質 體、游離型載體(通常具有用於表現蛋白質或RNA之表現卡匣)及人類人工染色體(參見例如Harrington等人，(1997)Nat Genet 15：345)。舉例而言，適用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現HER3聚核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及此項技術中已知用於表現其他蛋白質之許多其他載體。適用病毒性載體包括基於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體、基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP艾勃斯坦因-巴爾病毒(HBP Epstein Barr virus)之載體、牛痘病毒載體及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)載體。參見Brent等人，(1995)，上述；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807；及Rosenfeld等人，(1992)Cell 68：143。
表現載體之選擇視待表現載體之所欲宿主細胞而定。通常，表現載體含有啟動子及可操作地連接於編碼抗體鏈或其片段之聚核苷酸的其他調節序列(例如強化子)。在一些實施例中，誘導性啟動子用以阻止***序列表現，除非在誘導條件下。誘導性啟動子包括例如***糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子。轉型生物體之培養物可在非誘導性條件下擴展，不使群體偏向於表現產物為宿主細胞更好地耐受之編碼序列。除啟動子之外，為有效表現抗體鏈或其片段，亦可需要或渴望其他調節元件。此等元件通常包括ATG起始密碼子及鄰近核糖體結合位點或其他序列。另外，表現功效可藉由包含適合於所用細胞系統之 強化子而增強(參見例如Scharf等人，(1994)Results Probl.Cell Differ.20：125；及Bittner等人，(1987)Meth.Enzymol.,153：516)。舉例而言，SV40強化子或CMV強化子可用於增加哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供一個分泌信號序列位置以與藉由***之抗體或其片段之序列編碼的多肽形成融合蛋白。更通常，在包含於載體中之前，***之抗體或其片段之序列連接於信號序列。待用於接收編碼抗體或其片段之輕鏈及重鏈可變域之序列的載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體允許該等可變區與恆定區表現為融合蛋白，從而產生完整抗體或其片段。通常，該等恆定區為人類的。
用於具有及表現抗體或其片段之鏈之宿主細胞可為原核或真核。大腸桿菌為適用於選殖及表現本發明之聚核苷酸的一種原核宿主。其他適用微生物宿主包括桿菌(諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis))及其他腸內菌科(諸如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)及各種假單胞菌(Pseudomonas)物種)。在此等原核宿主中，亦可製造表現載體，其通常含有與宿主細胞(例如複製起點)相容之表現控制序列。另外，將存在多種熟知之啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子通常視情況與操縱序列一起控制表現，且具有核糖體結合位點序列及其類似物以起始及完成轉錄及轉譯。其他微生物，諸如酵母，亦可用以表現抗體或其片段。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病 毒載體組合。
在一些較佳實施例中，哺乳動物宿主細胞用以表現及產生抗體或其片段。舉例而言，其可為表現內源性免疫球蛋白基因之融合瘤細胞株或者具有外源性表現載體之哺乳動物細胞株。此等細胞包括任何正常短命或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已發展能夠分泌完整免疫球蛋白之大量適合宿主細胞株，包括CHO細胞株、各種Cos細胞株、海拉細胞(HeLa cell)、骨髓瘤細胞株、經轉型B細胞及融合瘤。哺乳動物組織細胞培養物用以表現多肽一般討論於例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子及強化子(參見例如Queen等人，(1986)Immunol.Rev.89：49-68)，及必要加工資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點及轉錄終止序列。此等表現載體通常含有來源於哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒之啟動子。適合啟動子可為組成性、細胞類型特異性、階段特異性及/或可調控或可調節之啟動子。適用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成性腺病毒主要晚期啟動子、***誘導性MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成性MPSV啟動子、四環素誘導性CMV啟動子(諸如人類即刻早期CMV啟動子)、組成性CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子-強化子組合。
用於引入含有相關聚核苷酸序列之表現載體之方法視細 胞宿主類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。(一般參見Sambrook等人，上述)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉型、注射及顯微注射、衝擊法、病毒體、免疫脂質體、聚陽離子：核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子、與疱疹病毒結構蛋白質VP22之融合物(Elliot及O'Hare,(1997)Cell 88：223)、藥劑增強之DNA吸收及離體傳導。對於長期、高產率產生重組蛋白質而言，時常需要穩定表現。舉例而言，穩定表現抗體鏈或片段之細胞株可使用含有病毒性複製起點或內源性表現元件及可選標記物基因之本發明表現載體製備。在引入載體後，可允許細胞在富集培養基中生長1-2天，接著轉至選擇培養基中。可選擇標記物之目的為賦予選擇抗性，且其存在允許成功表現所引入序列之細胞在選擇培養基中生長。抗性、穩定轉染之細胞可使用適合於細胞類型之組織培養技術增殖。
(ii)產生本發明之單株抗體
單株抗體(mAb)可藉由多種技術產生，包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,(1975)Nature 256：495之標準體細胞雜交技術。可採用用於產生單株抗體之許多技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉型。
用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統。小鼠中產生融合瘤為沿用已久之程序。用於分離供融合用之免疫接種脾細胞的免疫接種方案及技術為此項技術中已知。亦已知融 合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。
本發明之嵌合或人類化抗體可基於如上所述製備之鼠類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可自相關鼠類融合瘤獲得且使用標準分子生物學技術進行工程改造，以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，鼠類可變區可使用此項技術中已知之方法連接於人類恆定區(參見例如Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，鼠類CDR區可使用此項技術中已知之方法***人類構架中。參見例如Winter之美國專利第5225539號，及Queen等人之美國專利第5530101號、第5585089號、第5693762號及第6180370號。
在某一實施例中，本發明之抗體為人類單株抗體。該等針對HER3之人類單株抗體可使用攜帶人類免疫系統而非小鼠系統之一部分的轉殖基因或轉染色體小鼠產生。此等轉殖基因及轉染色體小鼠包括本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠之小鼠，且本文中統一稱為「人類Ig小鼠」。
HuMAb mouse®(Medarex,Inc.)含有編碼未重排之人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)以及不活化內源性μ及κ鏈基因座之靶向突變(參見例如Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠顯示小鼠IgM或κ之表現降低，且回應於免疫接種，引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因進行類別轉換及體細胞突變，產生高親和力人類IgGκ單株抗體 (Lonberg等人，(1994)上述；Lonberg,(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101中評述；Lonberg及Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding及Lonberg,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠之製備及使用及該等小鼠攜帶之基因組修飾進一步描述於以下中：Taylor等人，(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen等人，(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen等人，(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor等人，(1994)International Immunology 579-591；及Fishwild等人，(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有文獻之內容均以全文引用的方式特定併入本文中。進一步參見美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號，均頒予Lonberg及Kay；Surani等人之美國專利第5,545,807號；PCT公開案第WO 92103918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97113852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號，均頒予Lonberg及Kay；及Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在另一個實施例中，本發明之人類抗體可使用在轉殖基 因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠(諸如攜帶人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)產生。本文中稱為「KM小鼠」之該等小鼠詳細描述於Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
更進一步地，此項技術中可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系統且可用於產生本發明之HER3抗體。舉例而言，可使用稱為Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代轉殖基因系統。該等小鼠描述於例如Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號中。
此外，此項技術中可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代轉染色體動物系統且可用於產生本發明之HER3抗體。舉例而言，可使用稱為「TC小鼠」之攜帶人類重鏈轉染色體與人類輕鏈轉染色體之小鼠；該等小鼠描述於Tomizuka等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，已在此項技術中描述攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之母牛(Kuroiwa等人，(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，且可用於產生本發明之HER3抗體。
本發明之人類單株抗體亦可使用噬菌體呈現方法篩選人類免疫球蛋白基因文庫來製備。該等用於分離人類抗體之噬菌體呈現方法在此項技術中沿用已久或描述於以下實例。參見例如Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利 第5,969,108號及第6,172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。
本發明之人類單株抗體亦可使用SCID小鼠製備，在SCID小鼠中重構人類免疫細胞，使得可在免疫接種後產生人類抗體反應。該等小鼠描述於例如Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
(iii)構架或Fc工程改造
本發明之工程改造抗體包括對VH及/或VL內之構架殘基進行修飾，例如以提高抗體性質之抗體。通常進行該等構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為將一或多個構架殘基「回復突變」為相應生殖系序列。更確切言之，進行體細胞突變之抗體可含有不同於抗體來源於之生殖系序列的構架殘基。該等殘基可藉由將抗體構架序列與抗體來源於之生殖系序列比較來鑑別。為將構架區序列回復至其生殖系組態，體細胞突變可藉由例如定點突變誘發「回復突變」成生殖系序列。該等「回復突變」抗體亦意欲涵蓋於本發明中。
另一類型構架修飾包含使構架區內，或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞-抗原決定基，從而降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」且進一步詳細地描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
除構架或CDR區內進行之修飾外或作為替代，本發明之 抗體可經工程改造以包括Fc區內之修飾，通常改變抗體之一或多個功能性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體可在化學上修飾(例如一或多個化學部分可附接於抗體)或經修飾以改變其糖基化，再改變抗體之一或多個功能性。此等實施例每一者進一步詳細地描述於下文中。Fc區中殘基編號為Kabat之EU索引之編號。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾，使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基數目改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。改變CH1之鉸鏈區中半胱胺酸殘基數目，例如促進輕鏈及重鏈之組裝或提高或降低抗體之穩定性。
在另一個實施例中，使抗體之Fc鉸鏈區突變，以縮短抗體之生物半衰期。更確切言之，一或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區中，使得抗體相對於原生Fc-鉸鏈域葡萄球菌蛋白A(SpA)結合，具有削弱之SpA結合。此方法進一步詳細地描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。舉例而言，一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，使得抗體對效應配位體具有改變之親和力，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配位體可例如為Fc受體或C1互補組分。此方法進一步詳細地描述於均屬Winter等人之 美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一個實施例中，選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，使得抗體具有改變之C1q結合及/或減小或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細地描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一個實施例中，一或多個胺基酸殘基改變，從而改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在又一個實施例中，Fc區藉由修飾一或多個胺基酸而修飾，以提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或提供抗體對Fcγ受體之親和力。此方法進一步描述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，人類IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點已定位且已描述具有改良結合之變異體(參見Shields等人，(2001)J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在又一個實施例中，本發明之糖基化經修飾。舉例而言，可產生非糖基化抗體(亦即抗體缺乏糖基化)。糖基化可改變，以例如提高抗體對「抗原」之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內糖基化之一或多個位點來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，消除一或多個可變區構架糖基化位點，從而消除該位點上之糖基化。該非糖基化可提高抗體對抗原之親和力。此類方法進一步詳細地描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及 第6,350,861號中。
或者或另外，可製備具有改變類型之糖基化的抗體，諸如具有減少量之岩藻糖醯基殘基之低岩藻糖酸化抗體或具有增加之二等分GlcNac結構之抗體。該等改變之糖基化模式已顯示提高抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由例如在具有改變糖基化機制之宿主細胞中表現抗體來實現。具有改變糖基化機制之細胞已在此項技術中描述且可用作表現本發明之重組抗體的宿主細胞，從而產生具有改變糖基化之抗體。舉例而言，Hang等人之EP 1,176,195描述具有功能破壞之編碼岩藻糖醯基轉移酶之FUT8基因的細胞株，使得在此類細胞株中表現之抗體顯示低岩藻糖酸化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述一種變異CHO細胞株Lec13細胞，其具有降低之將岩藻糖附接於Asn(297)連接之碳水化合物的能力，亦引起在該宿主細胞中表現之抗體低岩藻糖酸化(亦參見Shields等人，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現醣蛋白修飾之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))的細胞株，使得在該等工程改造之細胞株中表現之抗體顯示增加之二等分GlcNac結構，從而提高抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。
在另一個實施例中，抗體經修飾，以延長其生物半衰期。各種方法均為可能的。舉例而言，可引入以下突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如Ward之美國專利 第6,277,375號中所描述。或者，為延長生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變，以含有獲自IgG Fc區之CH2域之兩個環的救助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所描述。
(iv)工程改造改變之抗體之方法
本文中顯示之具有VH及VL序列或全長重鏈及輕鏈序列之本發明HER3抗體或其片段可用於藉由修飾全長重鏈及/或輕鏈序列、VH及/或VL序列或附接於其之恆定區來產生新的HER3抗體。因此，在本發明之另一個態樣中，HER3抗體或其片段之結構特徵用以產生結構相關之HER3抗體，其保留本發明抗體之至少一個功能性質，諸如結合於人類HER3以及抑制HER3之一或多個功能性。舉例而言，如以上所討論，本發明抗體之一或多個CDR區或其突變可與已知之構架區及/或其他CDR重組組合，產生其他的經重組工程改造之HER3抗體。其他類型修飾包括先前部分中描述之修飾。工程改造方法之起始物質為本文中提供之VH及/或VL序列中之一或多者或其一或多個CDR區。為產生工程改造之抗體，實際上無需製備(亦即表現為蛋白質)具有本文中提供之一或多個VH及/或VL序列或其一或多個CDR區的抗體。更確切地，序列中含有之資訊用作起始物質以產生來源於原始序列之「第二代」序列，接著「第二代」序列製備且表現為蛋白質。
因此，在另一個實施例中，本發明提供一種製備結合於HER3之域3之抗體的方法，該抗體由以下組成：重鏈可變 區抗體序列，其具有選自由SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142及162組成之群之CDR1序列；選自由SEQ ID NO：3、23、43、63、83、103、123、143及163組成之群之CDR2序列；及/或選自由SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144及164組成之群之CDR3序列；及輕鏈可變區抗體序列，其具有選自由SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148及168組成之群之CDR1序列；選自由SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149及169組成之群之CDR2序列；及/或選自由SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150及170組成之群之CDR3序列；改變重鏈可變區抗體序列及/或輕鏈可變區抗體序列內之至少一個胺基酸殘基，以產生至少一個改變之抗體序列；及表現改變之抗體序列為蛋白質。改變之抗體序列亦可藉由篩選具有固定CDR3序列或如US20050255552中所描述之最小基本結合決定子及CDR1及CDR2序列上之多樣性的抗體文庫來製備。篩選可根據適合於自抗體文庫篩選抗體之任何篩選技術，諸如噬菌體呈現技術進行。
因此，在另一個實施例中，本發明提供一種製備結合於HER3之域3-4之抗體的方法，該抗體由以下組成：重鏈可變區抗體序列，其具有選自由SEQ ID NO：182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502、522、542、562、582、602、622、642、662及682組成之群之CDR1序列；選自由SEQ ID NO：183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503、523、543、563、583、603、623、643、663及683組成之群之CDR2序列；及/或選自由SEQ ID NO：184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504、524、544、564、584、604、624、644、664及684組成之群之CDR3序列；及輕鏈可變區抗體序列，其具有選自由SEQ ID NO：188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508、528、548、568、588、608、628、648、668及688組成之群之CDR1序列；選自由SEQ ID NO：189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509、529、549、569、589、609、629、649、669及689組成之群之CDR2序列；及/或選自由SEQ ID NO：190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510、530、550、570、590、610、630、650、670及690組成之群之CDR3序列；改變重鏈可變區抗體序列及/或輕鏈可變區抗體序列內之至少一個胺基酸殘基，以產生至少一個改變之抗體序列；及表現改變之抗體序列為蛋白質。改變之抗體序列亦可藉由篩選具有固定CDR3序列或如US20050255552中所描述之最小基本結合決定子及CDR1及CDR2序列上之多樣性的抗體文庫來製備。篩選可根據適合於自抗體文庫篩選抗體之任何篩選技術，諸如噬菌體 呈現技術進行。
標準分子生物技術可用於製備及表現改變之抗體序列。由改變之抗體序列編碼的抗體為保留本文中描述之抗體或其片段之一種、一些或全部功能性的抗體，該等功能性包括(但不限於)特異性結合於人類及/或食蟹獼猴HER3；抗體結合於HER3且藉由在磷酸化HER分析中抑制HER信號傳導活性來抑制HER3生物活性。
改變之抗體之功能性可使用此項技術中可用及/或本文中所述之標準分析，諸如實例中闡明之分析(例如ELISA)來評估。
在工程改造本發明抗體之方法的某些實施例中，突變可隨機或選擇性地沿抗體或其片段編碼序列整體或一部分引入，且可針對結合活性及/或如本文中描述之其他功能性，篩選所得經修飾之HER3抗體。此項技術中已描述突變方法。舉例而言，Short之PCT公開案WO 02/092780描述用於使用飽和突變誘發、合成連接組裝或其組合產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用計算篩選法最佳化抗體之生理化學性質的方法。
本發明抗體之表徵
本發明之抗體可藉由各種功能分析表徵。舉例而言，其可藉由其在如本文中描述之磷酸化HER分析中藉由抑制HER信號傳導來抑制生物活性之能力、其對HER3蛋白(例如人類及/或食蟹獼猴HER3)之親和力、抗原決定基劃分、 其對蛋白水解之抗性及其阻斷HER3下游信號傳導之能力表徵。各種方法可用於量測HER3介導之信號傳導。舉例而言，HER信號傳導路徑可藉由以下來監測：(i)量測磷酸化HER3；(ii)量測HER3或其他下游信號傳導蛋白(例如Akt)之磷酸化；(iii)如本文中描述之配位體阻斷分析；(iv)雜二聚體形成；(v)HER3依賴性基因表現標記；(vi)受體內在化；及(vii)HER3驅使之細胞表現型(例如增殖)。
抗體結合於HER3之能力可藉由直接標記相關抗體來偵測，或抗體可未標記且使用此項技術中已知之各種夾心分析格式間接偵測結合。
在一些實施例中，HER3抗體阻斷參考HER3抗體結合於HER3或與其競爭。此等可為上述完全人類HER3抗體。其亦可為結合於與參考抗體相同之抗原決定基的其他小鼠、嵌合或人類化HER3抗體。阻斷參考抗體結合或與其競爭之能力指示測試之HER3抗體結合於與由參考抗體界定之抗原決定基相同或類似的抗原決定基，或結合於足夠鄰近參考HER3抗體所結合之抗原決定基的抗原決定基。該等抗體尤其可分享針對參考抗體所鑑別之有利性質。阻斷參考抗體或與其競爭之能力可藉由例如競爭結合分析測定。使用競爭結合分析，檢查測試之抗體抑制參考抗體與諸如HER3多肽或蛋白質之共同抗原特異性結合的能力。若過量測試抗體實質上抑制參考抗體之結合，則測試抗體與參考抗體競爭特異性結合於抗原。實質上抑制意謂測試抗體減少參考抗體之特異性結合通常至少10%、25%、50%、 75%或90%。
存在許多已知可用於評估HER3抗體與參考HER3抗體競爭結合於HER3之競爭結合分析。此等分析包括例如固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見Kirkland等人，(1986)J.Immunol.137：3614-3619)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow及Lane，上述)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel等人，(1988)Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(Cheung等人，(1990)Virology 176：546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，此類分析包含使用經純化之抗原結合於具有此等未標記之測試HER3結合抗體及標記參考抗體中任一者的固體表面或細胞。競爭性抑制藉由測定在測試抗體存在下結合於固體表面或細胞之標記之量來量測。通常測試抗體過量存在。藉由競爭分析(競爭抗體)鑑別之抗體包括結合於與參考抗體相同之抗原決定基的抗體及結合於與參考抗體所結合之抗原決定基足夠接近以出現位阻之鄰近抗原決定基的抗體。
為確定是否所選HER3單株抗體結合於獨特的抗原決定基，每一抗體可使用市售試劑(例如來自Pierce(Rockford,IL)之試劑)進行生物素標記。使用未標記單株抗體及生物素標記單株抗體之競爭研究可使用HER3多肽塗佈之ELISA 盤進行。生物素標記MAb結合可用抗生蛋白鏈菌素-鹼性磷酸酶探針偵測。為確定經純化HER3結合抗體之同型，可進行同型ELISA。舉例而言，微量滴定盤之孔可在4℃下用1 μg/ml抗人類IgG塗佈隔夜。用1% BSA阻斷後，盤與1 μg/ml或少於1 μg/ml之單株HER3抗體或經純化同型對照在周圍溫度下反應1至2小時。該等孔接著可與人類IgG1或人類IgM特異性鹼性磷酸酶結合之探針反應。接著盤發展並分析，以便確定經純化抗體之同型。
為證明單株HER3抗體結合於表現HER3多肽之活細胞，可使用流動式細胞測量術。簡言之，表現HER3之細胞株(在標準生長條件下生長)可與各種濃度之HER3結合抗體混合於含有0.1% BSA及10%胎牛血清之PBS中，且在4℃下培育1小時。洗滌後，細胞與螢光素標記之抗人類IgG抗體在與初級抗體著色相同之條件下反應。樣品可藉由FACScan儀器使用光及側向散射性質對單細胞閘控來分析。除流動式細胞測量分析之外或代替流動式細胞測量分析，可使用利用螢光顯微術之替代性分析。細胞可完全如上所述染色且藉由螢光顯微術檢查。此方法允許目測個別細胞，但視抗原密度而定，可能靈敏度降低。
可藉由西方點墨法進一步測試本發明之抗體或其片段與HER3多肽或抗原片段的反應性。簡言之，可製備經純化HER3多肽或融合蛋白或來自表現HER3之細胞之細胞提取物且經受十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳後，分離之抗原轉移至硝化纖維膜，用10%胎牛血清阻斷，且 用待測試之單株抗體探測。人類IgG結合可使用抗人類IgG鹼性磷酸酶偵測且用BCIP/NBT受質錠劑(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)發展。
在配位體誘發之雜二聚體形成之基於細胞的分析中許多讀數可用於評估HER3抗體之功效及特異性。活性可藉由以下一或多者評估：
(i)抑制標靶細胞株(例如MCF-7乳癌細胞)中配位體誘發之HER2與其他EGF家族成員的雜二聚化。可用受體特異性抗體進行HER2複合物自細胞溶解產物之免疫沈澱，且根據電泳/西方轉移，藉由用針對其他EGF受體之抗體探測來分析複合物內其他EGF受體及其生物相關配位體之缺乏/存在。
(ii)抑制配位體活化之雜二聚體活化信號傳導路徑。與HER3締合似乎對EGF受體家族之其他成員在配位體結合後引起最大細胞反應而言為關鍵的。在激酶缺乏之HER3情況下，HER2提供功能性酪胺酸激酶域以使信號傳導在生長因子配位體結合後能夠發生。因此，共表現HER2及HER3之細胞可在抑制劑缺乏及存在下用配位體(例如調蛋白)處理，且對HER3酪胺酸磷酸化之作用可藉由許多方式監測，該等方式包括HER3自經處理之細胞溶解產物免疫沈澱且隨後使用抗磷酸化酪胺酸抗體進行西方點墨法(詳情參見Agus op.cit.)。或者，高通量分析可藉由HER3自溶解之溶解產物截留至用抗-HER3受體抗體塗佈之96孔盤之孔上來發展，且酪胺酸磷酸化程度使用例如銪標記之抗磷 酸化酪胺酸抗體來量測，如Waddleton等人，(2002)Anal.Biochem.309：150-157所體現。
在此方法之更廣延伸中，已知在活化受體雜二聚體之下游活化之效應分子(諸如有絲***原活化蛋白激酶(MAPK)及Akt)可直接藉由自經處理之溶解產物免疫沈澱且用偵測此等蛋白質之活化形式的抗體點墨，或者藉由分析此等蛋白質修飾/活化特定受質之能力來分析。
(iii)抑制配位體誘發之細胞增殖。已知多種細胞株共表現ErbB受體之組合，例如許多乳癌及***癌細胞株。分析可以24/48/96孔格式，用基於DNA合成(氚化胸腺嘧啶併入)之讀數、細胞數目之增加(結晶紫染色)等執行。
在非配位體依賴性均二聚體及雜二聚體形成之基於細胞的分析中許多讀數可用於評估HER3抗體之功效及特異性。舉例而言，HER2過度表現由於自發二聚體形成而引起激酶域之非配位體依賴性活化。過度表現之HER2與其他HER分子(諸如HER1、HER3及HER4)產生均二聚體或雜二聚體。
抗體或其片段能夠阻斷已知致瘤表現型至少部分依賴於HER3雜二聚體細胞信號傳導之配位體活化的人類腫瘤細胞株(例如BxPC3胰臟癌細胞等)之腫瘤異種移植物在活體內生長。此可在免疫功能降低小鼠中，單獨或與適於所討論細胞株之細胞毒性劑組合來評估。功能分析之實例亦在以下實例部分中描述。
預防及治療用途
本發明提供治療與HER3信號傳導路徑相關之疾病或病症的方法，其係藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體或其片段。在一特定實施例中，本發明提供一種治療或預防癌症(例如乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰臟癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌、周圍神經鞘腫瘤、神經鞘瘤、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、巴雷特氏食道癌、神經膠母細胞瘤、軟組織之透明細胞肉瘤、惡性間皮瘤、神經纖維瘤、腎癌、黑色素瘤、***癌、良性***增生(BPH)、男子女乳症及子宮內膜異位)之方法，其係藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體或其片段。在一些實施例中，本發明提供治療或預防與HER3信號傳導路徑相關之癌症的方法，其係藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體。
在一特定實施例中，本發明提供治療與HER3信號傳導路徑相關之癌症，包括(但不限於)乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰臟癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌、周圍神經鞘腫瘤、神經鞘瘤、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、巴雷特氏食道癌、神經膠母細胞瘤、軟組織之透明細胞肉瘤、惡性間皮瘤、神經纖維瘤、腎癌、黑色素瘤、***癌、良性***增生(BPH)、男子女乳症及子宮內膜異位。
本發明之抗體或其片段亦可用以治療或預防與異常或缺 陷HER信號傳導相關之其他病症，包括(但不限於)呼吸疾病、骨質疏鬆症、骨關節炎、多囊性腎病、糖尿病、精神***症、血管病、心臟病、非致癌性增生性疾病、纖維化及神經退化性疾病，諸如阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease)。
適於與HER3抗體組合治療之藥劑包括此項技術中已知能夠調節ErbB信號傳導路徑之標準治療劑。HER2標準治療劑之適合實例包括(但不限於)Herceptin及Tykerb。EGFR標準治療劑之適合實例包括(但不限於)如上所述之Iressa、Tarceva、Erbitux及Vectibix。可適於與HER3抗體組合治療之其他藥劑包括(但不限於)調節受體酪胺酸激酶、G蛋白偶合受體、發育/存活信號傳導路徑、核激素受體、細胞凋亡路徑、細胞週期及血管生成之藥劑。
診斷用途
在一個態樣中，本發明涵蓋用於在生物樣品(例如血液、血清、細胞、組織)之背景下或自罹患癌症或處於發展癌症風險中之個體，測定HER3及/或核酸表現以及HER3蛋白功能的診斷分析。
諸如競爭分析之診斷分析依賴於標記類似物(「示蹤劑」)與測試樣品分析物競爭共同結合搭配物上之有限數目結合位點的能力。結合搭配物一般在競爭之前或之後不溶，接著結合於結合搭配物之示蹤劑及分析物與未結合之示蹤劑及分析物分離。此分離藉由傾析(在結合搭配物預先不溶之情況下)或藉由離心(在結合搭配物在競爭反應後 沈澱之情況下)實現。測試樣品分析物之量與如藉由標記物物質之量所量測之結合示蹤劑之量成反比。制定使用已知量之分析物的劑量反應曲線且與測試結果比較，以定量測定測試樣品中存在之分析物之量。當酶用作可偵測標記物時，此等分析稱為ELISA系統。在此形式之分析中，抗體與HER3抗體之間的競爭性結合使結合之HER3、較佳本發明之HER3抗原決定基成為血清樣品中抗體、最尤其抑制血清樣品中之抗體的量度。
該分析之重要優勢在於量測直接由抑制抗體(亦即干擾HER3、特別是抗原決定基之結合的抗體)構成。尤其呈ELISA測試形式之此類分析在臨床環境及常規血液篩選中具有相當多的應用。
本發明之另一個態樣提供用於測定個體中HER3核酸表現或HER3活性之方法，從而選擇適於該個體之治療劑或預防劑(本文中稱為「藥物基因組學」)。藥物基因組學考慮到基於個體基因型(例如進行檢查以測定個體對特定藥劑起反應之能力之個體基因型)來選擇個體之治療性或預防性治療的藥劑(例如藥物)。
本發明之又一個態樣係關於監測藥劑(例如藥物)對臨床試驗中之HER3之表現或活性的影響。
醫藥組合物
為製備包括抗體或其片段之醫藥或無菌組合物，抗體或其片段與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合。該等組合物可另外含有一或多種適於治療或預防癌症(乳癌、結腸 直腸癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰臟癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌、周圍神經鞘腫瘤、神經鞘瘤、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、軟組織之透明細胞肉瘤、惡性間皮瘤、神經纖維瘤、腎癌及黑色素瘤、巴雷特氏食道癌、***癌、良性***增生(BPH)、男子女乳症及子宮內膜異位)之其他治療劑。
治療及診斷劑之調配物可藉由與生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合，呈例如凍乾粉末、漿狀物、水溶液、洗劑或懸浮液之形式製備(參見例如Hardman等人，(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.；Avis等人(編輯)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。
選擇治療劑之投與方案視若干因素而定，包括實體之血清或組織轉換率、症狀程度、實體之免疫原性及生物基質中標靶細胞之可及性。在某些實施例中，投與方案在符合 可接受之副作用程度下最大化治療劑遞送至患者之量。因此生物遞送之量部分依賴於特定實體及所治療病狀之嚴重程度。可使用選擇抗體、細胞因子及小分子之適當劑量的指導(參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(編輯)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Bach(編輯)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Baert等人，(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人，(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人，(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人，(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人，(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人，(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
臨床醫師例如使用此項技術中已知或懷疑影響治療或預計會影響治療之參數或因素來確定適當劑量。一般而言，劑量自略微小於最佳劑量之量開始且此後其以小的增量增加，直至相對於任何不良副作用，實現所需或最佳作用。重要的診斷量度包括彼等例如發炎之症狀或所產生發炎細胞因子之含量的量度。
本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量可變化，以獲得針對特定患者、組合物及投與模式有效實現所需治療反應且對患者無毒性之活性成分之量。所選劑量將視多種 藥物動力學因素而定，包括所採用之本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所採用特定化合物之***速率、治療持續時間、與所採用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、整體健康及先前病史以及醫學技術中已知之類似因素。
包含本發明之抗體或其片段的組合物可藉由連續輸注，或藉由以例如一天、一週或每週1-7次之時間間隔給藥來提供。可靜脈內、皮下、局部、經口、經鼻、經直腸、肌肉內、腦內或藉由吸入來給藥。特定給藥方案為包含避免顯著不良副作用之最大劑量或給藥頻率的方案。總週劑量可為至少每公斤體重0.05 μg、至少0.2 μg/kg、至少0.5 μg/kg、至少1 μg/kg、至少10 μg/kg、至少100 μg/kg、至少0.2 mg/kg、至少1.0 mg/kg、至少2.0 mg/kg、至少10 mg/kg、至少25 mg/kg或至少50 mg/kg(參見例如Yang等人，(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人，(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人，(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等人，(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144)。抗體或其片段之所需劑量與抗體或多肽近似相同，以每公斤體重之莫耳數計。抗體或其片段之所需血漿濃度近似以每公斤體重之莫耳數計。劑量可為至少15 μg、至少20 μg、至少25 μg、至少30 μg、至少35 μg、至少40 μg、至少45 μg、至少50 μg、至少55 μg、至少60 μg、至少65 μg、至少70 μg、至少75 μg、至少80 μg、至少85 μg、至少90 μg、至少95 μg或至少100 μg。投與個體之劑量數目可為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多。
對於本發明之抗體或其片段，投與患者之劑量可為每公斤患者體重0.0001 mg至100 mg。劑量可為每公斤患者體重0.0001 mg至20 mg、0.0001 mg至10 mg、0.0001 mg至5 mg、0.0001至2 mg、0.0001至1 mg、0.0001 mg至0.75 mg、0.0001 mg至0.5 mg、0.0001 mg至0.25 mg、0.0001至0.15 mg、0.0001至0.10 mg、0.001至0.5 mg、0.01至0.25 mg或0.01至0.10 mg。
本發明之抗體或其片段之劑量可使用患者體重(公斤(kg))乘以待投與之劑量(mg/kg)來計算。本發明之抗體或其片段之劑量可為每公斤患者體重150 μg或低於150 μg、125 μg或低於125 μg、100 μg或低於100 μg、95 μg或低於95 μg、90 μg或低於90 μg、85 μg或低於85 μg、80 μg或低於80 μg、75 μg或低於75 μg、70 μg或低於70 μg、65 μg或低於65 μg、60 μg或低於60 μg、55 μg或低於55 μg、50 μg或低於50 μg、45 μg或低於45 μg、40 μg或低於40 μg、35 μg或低於35 μg、30 μg或低於30 μg、25 μg或低於25 μg、20 μg或低於20 μg、15 μg或低於15 μg、10 μg或低於10 μg、5 μg或低於5 μg、2.5 μg或低於2.5 μg、2 μg或低於2 μg、1.5 μg或低於1.5 μg、1 μg或低於1 μg、0.5 μg或低於0.5 μg或0.5 μg或低於0.5 μg。
本發明之抗體或其片段之單位劑量可為0.1 mg至20 mg、0.1 mg至15 mg、0.1 mg至12 mg、0.1 mg至10 mg、0.1 mg至8 mg、0.1 mg至7 mg、0.1 mg至5 mg、0.1至2.5 mg、0.25 mg至20 mg、0.25至15 mg、0.25至12 mg、0.25至10 mg、0.25至8 mg、0.25 mg至7 mg、0.25 mg至5 mg、0.5 mg至2.5 mg、1 mg至20 mg、1 mg至15 mg、1 mg至12 mg、1 mg至10 mg、1 mg至8 mg、1 mg至7 mg、1 mg至5 mg或1 mg至2.5 mg。
本發明之抗體或其片段之劑量可在個體中實現至少0.1 μg/ml、至少0.5 μg/ml、至少1 μg/ml、至少2 μg/ml、至少5 μg/ml、至少6 μg/ml、至少10 μg/ml、至少15 μg/ml、至少20 μg/ml、至少25 μg/ml、至少50 μg/ml、至少100 μg/ml、至少125 μg/ml、至少150 μg/ml、至少175 μg/ml、至少200 μg/ml、至少225 μg/ml、至少250 μg/ml、至少275 μg/ml、至少300 μg/ml、至少325 μg/ml、至少350 μg/ml、至少375 μg/ml或至少400 μg/ml之血清效價。或者，本發明之抗體或其片段之劑量可在個體中實現至少0.1 μg/ml、至少0.5 μg/ml、至少1 μg/ml、至少2 μg/ml、至少5 μg/ml、至少6 μg/ml、至少10 μg/ml、至少15 μg/ml、至少20 μg/ml、至少25 μg/ml、至少50 μg/ml、至少100 μg/ml、至少125 μg/ml、至少150 μg/ml、至少175 μg/ml、至少200 μg/ml、至少225 μg/ml、至少250 μg/ml、至少275 μg/ml、至少300 μg/ml、至少325 μg/ml、至少350 μg/ml、至少375 μg/ml或至少400 μg/ml之血清效價。
本發明之抗體或其片段之給藥可重複且投藥可相隔至少 1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。
針對特定患者之有效量可視諸如待治療病狀、患者總體健康、投藥方法、途徑及劑量以及副作用嚴重程度之因素而變化(參見例如Maynard等人，(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK)。
投藥途徑可藉由例如靜脈內、腹膜內、腦內、肌肉內、眼內、動脈內、腦脊髓內、損害內局部或皮膚塗敷、注射或輸注，或藉由持續釋放系統或植入物(參見例如Sidman等人，(1983)Biopolymers 22：547-556；Langer等人，(1981)J.Biomed.Mater.Res.15：167-277；Langer(1982)Chem.Tech.12：98-105；Epstein等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692；Hwang等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4034；美國專利第6,350,466號及第6,316,024號)。必要時，組合物亦可包括增溶劑及在注射部位鎮痛之局部麻醉劑，諸如利多卡因。另外，亦可例如藉由使用吸入器或噴霧器且與氣溶膠化劑調配，進行肺部投藥。參見例如美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，每一者均以 全文引用的方式併入本文中。
本發明之組合物亦可使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者，經由一或多種投藥途徑投與。如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或模式將視所需結果而變化。本發明之抗體或其片段的選擇投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊柱或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。非經腸投與可代表除經腸及局部投藥以外通常藉由注射的投藥模式，且包括(不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、包囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。或者，本發明之組合物可經由非經腸途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經***、經直腸、舌下或局部。在一個實施例中，本發明之抗體或其片段藉由輸注投與。在另一個實施例中，本發明之多特異性抗原決定基結合蛋白皮下投與。
若本發明之抗體或其片段在控制釋放或持續釋放系統中投與，則可使用泵來實現控制或持續釋放(參見Langer，上述；Sefton,(1987)CRC Crit.Ref Biomed.Eng.14：20；Buchwald等人，(1980),Surgery 88：507；Saudek等人，(1989)N.Engl.J.Med.321：574)。聚合物質可用於實現本發明之療法的控制或持續釋放(參見例如Medical Applications of Controlled Release,Langer及Wise(編輯)，CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen及Ball(編輯)，Wiley,New York(1984)；Ranger及Peppas,(1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；亦參見Levy等人，(1985)Science 228：190；During等人，(1989)Ann.Neurol.25：351；Howard等人，(1989)J.Neurosurg.7 1：105)；美國專利第5,679,377號；美國專利第5,916,597號；美國專利第5,912,015號；美國專利第5,989,463號；美國專利第5,128,326號；PCT公開案第WO 99/15154號；及PCT公開案第WO 99/20253號。用於持續釋放調配物中之聚合物的實例包括(但不限於)聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一個實施例中，在持續釋放調配物中使用之聚合物為惰性，不含可浸出雜質，儲存穩定，無菌且生物可降解。控制或持續釋放系統可接近預防或治療標靶置放，因此僅僅需要一小部分全身性劑量(參見例如Goodson,Medical Applications of Controlled Release，上述，第2卷，第115-138頁(1984))。
控制釋放系統在Langer,(1990),Science 249：1527-1533之評論中討論。熟習此項技術者已知之任何技術均可用於產生包含一或多種本發明之抗體或其片段的持續釋放調配物。參見例如美國專利第4,526,938號；PCT公開案WO 91/05548；PCT公開案WO 96/20698；Ning等人，(1996),Radiotherapy & Oncology 39：179-189；Song等人，(1995)PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397；Cleek等人，(1997)Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；及Lam等人，(1997)Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，每一者均以全文引用的方式併入本文中。
若本發明之抗體或其片段局部投與，則其可呈軟膏、乳膏、經皮貼片、洗劑、凝膠、洗髮劑、噴霧、氣溶膠、溶液、乳液或熟習此項技術者熟知之其他形式的形式調配。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。對於非噴霧型局部劑型，通常採用包含與局部施用相容之載劑或一或多種賦形劑且具有在一些情況下大於水之動態黏度之黏性至半固體或固體形式。適合調配物包括(不限於)溶液、懸浮液、乳液、乳膏、軟膏、散劑、擦劑、油膏及其類似物，其在必要時殺菌或與助劑(例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑、緩衝劑或鹽)混合以影響各種性質，諸如滲透壓。其他適合局部劑型包括可噴霧氣溶膠，其中活性成分在一些情況下與固體或液體惰性載體組合，包裝在與密封揮發性物質(例如氣體推進劑，諸如氟氯烷(freon))之混合物中或塑料擠瓶中。必要時，潤濕劑或保濕劑亦可添加至醫藥組合物及劑型中。該等其他成分之實例為此項技術中所熟知。
若包含抗體或其片段之組合物鼻內投與，則其可調配為氣溶膠形式、噴霧、煙霧狀物或為液滴形式。詳言之，根據本發明使用之預防或治療劑宜呈氣溶膠噴霧之形式自密封包裝或噴霧器，藉助於適合推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合氣體)遞送。在密封氣溶膠之情況下，劑量單元可藉由提供遞送計量之量的閥來測定。用於吸入器或吹入器之膠囊及藥筒(由例如明膠構成)可經調配，含有化合物與適合粉末基質(諸如乳糖或澱粉)之粉末混合物。
與第二治療劑(例如細胞因子、類固醇、化學治療劑、抗生素或放射療法)共投與或治療之方法為此項技術中已知(參見例如Hardman等人，(編輯)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole及Peterson(編輯)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner及Longo(編輯)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量之治療劑可使症狀減少至少10%、至少20%、至少約30%、至少40%或至少50%。
可與本發明之抗體或其片段組合投與之其他療法(例如預防或治療劑)可與本發明之抗體或其片段相隔不足5分鐘、相隔不足30分鐘、相隔1小時、相隔約1小時、相隔約1至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4 小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔約12小時至18小時、相隔18小時至24小時、相隔24小時至36小時、相隔36小時至48小時、相隔48小時至52小時、相隔52小時至60小時、相隔60小時至72小時、相隔72小時至84小時、相隔84小時至96小時或相隔96小時至120小時投與。兩種或兩種以上療法可在同一次患者就診內投與。
本發明之抗體或其片段與其他療法可循環投與。循環療法包含投與第一療法(例如第一預防或治療劑)一段時間，接著投與第二療法(例如第二預防或治療劑)一段時間，視情況接著投與第三療法(例如預防或治療劑)一段時間等，且重複此順序投藥，亦即循環，以減少發展對該等療法之一的抗性，避免或減少該等療法之一的副作用，及/或提高該等療法之功效。
在某些實施例中，本發明之抗體或其片段可經調配以確保在活體內適當分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除許多高親水性化合物。為確保本發明之治療化合物橫跨BBB(必要時)，其可調配於例如脂質體中。關於製造脂質體之方法，參見例如美國專利第4,522,811號、第5,374,548號及第5,399,331號。脂質體可包含一或多個選擇性地運輸至特定細胞或器官中，因此增強靶向藥物遞送之部分(參見例如Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。例示性 靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如Low等人之美國專利第5,416,016號)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(Bloeman等人，(1995)FEBS Lett.357：140；Owais等人，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；界面活性蛋白A受體(Briscoe等人，(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p 120(Schreier等人，(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本發明提供用於向有需要之個體投與包含單獨或與其他療法組合之本發明抗體或其片段的醫藥組合物之方案。本發明之組合療法的療法(例如預防或治療劑)可同時或連續投與個體。本發明之組合療法的療法(例如預防或治療劑)亦可循環投與。循環療法包含投與第一療法(例如第一預防或治療劑)一段時間，接著投與第二療法(例如第二預防或治療劑)一段時間，且重複此順序投藥，亦即循環，以減少發展對該等療法(例如藥劑)之一的抗性，避免或減少該等療法(例如藥劑)之一的副作用，及/或提高該等療法之功效。
本發明之組合療法的療法(例如預防或治療劑)可同時投與個體。術語「同時」不限於療法(例如預防或治療劑)完全同時投與，而是意謂包含本發明之抗體或其片段的醫藥組合物以使本發明之抗體可與另一(其他)療法一起作用， 得到比另外投與時增加之益處的順序及時間間隔投與個體。舉例而言，每一療法可同時或在不同時間點以任一次序連續投與個體；然而，若未同時投與，其應足夠時間接近地投與，以提供所需治療或預防作用。每一療法可以任何適當形式及藉由任何適合途徑分別投與個體。在多個實施例中，療法(例如預防或治療劑)相隔不足15分鐘、不足30分鐘、相隔不足1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小、時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔24小時、相隔48小時、相隔72小時或1週投與個體。在其他實施例中，兩種或兩種以上療法(例如預防或治療劑)在同一次患者就診內投與。
組合療法之預防或治療劑可於同一醫藥組合物中投與個體。或者，組合療法之預防或治療劑可於各別醫藥組合物中同時投與個體。預防或治療劑可藉由相同或不同投藥途徑投與個體。
已充分描述本發明，其藉由以下實例及申請專利範圍進一步說明，實例及申請專利範圍為例示性的且不意謂進一步限制。
實例 實例1：方法、材料及抗體篩選 (i)細胞株
SK-Br-3、BT-474及MCF-7細胞株購自ATCC且通常維持於補充有10%胎牛血清(FBS)之生長培養基中。
(ii)產生重組人類、食蟹獼猴、小鼠及大鼠HER3載體
鼠類HER3細胞外域自小鼠腦cDNA(Clontech)進行PCR擴增，且藉由與Refseq NM_010153比較來驗證序列。大鼠HER3 ECD自大鼠-2細胞mRNA反轉錄，且藉由與NM_017218比較來驗證序列。食蟹獼猴HER3 cDNA模板使用來自各種食蟹獼猴組織之RNA(Zyagen Laboratories)產生，且RT PCR產物選殖至pCR®-TOPO-XL(Invitrogen)中，接著對兩股測序。人類HER3來源於人類胎腦cDNA文庫(Source)且藉由與NM_001982比較來驗證序列。
為產生經標記之重組蛋白，人類、小鼠、大鼠及食蟹獼猴HER3使用Pwo Taq聚合酶(Roche Diagnostics)進行PCR擴增。擴增之PCR產物經凝膠純化，且選殖至pDonR201(Invitrogen)通路入口載體，該載體預先經修飾，以包括同框N端CD33前導序列及C端標籤，例如FLAG標籤。標籤允許經由抗標籤單株抗體純化單體蛋白。標靶基因側接AttB1及AttB2，允許使用Gateway®選殖技術(Invitrogen)重組於Gateway改造之專用目的載體(例如pcDNA3.1)中。重組反應使用與含有CMV啟動子之專用目的載體之Gateway LR反應執行，產生標籤表現載體，不過可使用任何市售載體。
產生其他重組HER3蛋白，其在C端因子X裂解位點及人 類IgG鉸鏈及Fc域之上游稠合HER3 ECD，產生Fc標記之蛋白質。為實現此，各種HER3 ECD經PCR擴增及選殖至經修飾以含有因子X位點-鉸鏈-hFc之同框C端融合物的載體(例如pcDNA3.1)中。所產生之開放閱讀框架側接AttB1及AttB2位點，以用Gateway®重組選殖技術(Invitrogen)進一步選殖。LR Gateway反應用以將HER3-Fc轉移至含有CMV啟動子之目的表現構築體中。HER3點突變表現構築體使用標準定點突變誘發方案產生且驗證所得載體序列。
(iii)表現重組HER3蛋白
所需HER3重組蛋白在HEK293來源細胞株中表現，該等細胞株預先適應於懸浮培養且在Novartis專用無血清培養基中生長。小規模表現驗證在短暫6孔盤轉染分析中，基 於脂質轉染進行。大規模蛋白質產生經由短暫轉染進行，且在WaveTM生物反應器系統(Wave Biotech)中以10-20 L規模進行。DNA聚乙烯亞胺(Polysciences)用作質體載劑，比率為1：3(w：w)。細胞培養上清液在轉染後7-10天收穫，且藉由橫流式過濾及透濾來濃縮，接著純化。
(iv)經標記之蛋白質純化
重組標記HER3蛋白(例如標籤-HER3)藉由收集細胞培養上清液且藉由用10 kDa截止過濾器(Fresenius)進行橫流式過濾濃縮10倍來純化。抗標籤管柱藉由以每毫升樹脂10 mg抗體之最終比率將抗標籤單株抗體偶合於CNBr活化之瓊脂糖凝膠4B來製備。濃縮上清液以1-2毫升/分鐘之流速施加於35 ml抗標籤管柱。用PBS基線洗滌後，結合物質用100 mM甘胺酸(pH 2.7)溶離，中和且無菌過濾。蛋白質濃度藉由量測280 nm下吸光率且使用0.66 AU/mg之理論係數轉換來確定。經純化之蛋白質最後藉由SDS-PAGE、N端測序及LC-MS表徵。
(v)Fc標籤純化
濃縮細胞培養上清液以1毫升/分鐘之流速施加於50 ml蛋白A瓊脂糖凝膠快速流動管柱(Protein A Sepharose Fast Flow column)。用PBS基線洗滌後，管柱用10管柱體積10 mM NaH2PO4/30%(v/v)異丙醇(pH 7.3)，接著5管柱體積PBS洗滌。最後，結合物質用50 mM檸檬酸鹽/140 mM NaCl(pH 2.7)溶離，中和且無菌過濾。
(vi)HuCAL GOLD®或PLATINUM ® 淘選
為選擇識別人類HER3之抗體，採用多重淘選策略。針對人類HER3蛋白之治療抗體藉由選擇具有高結合親和力之純系，使用市售噬菌體呈現文庫MorphoSys HuCAL GOLD®或Platinum®文庫作為抗體變異蛋白質之來源產生。噬菌體文庫係基於HuCAL®概念(Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296：57-86)，且採用CysDisplay®技術在噬菌體表面上呈現Fab(Lohning之WO01/05950)。
為分離抗-HER3抗體，使用固相、溶液、全細胞及差分全細胞淘選方法，執行標準以及RapMAT淘選策略。
(vii)固相淘選
為鑑別抗-HER3抗體，使用不同重組HER3蛋白，執行多種固相淘選策略。為執行每一輪固相淘選，Maxisorp盤(Nunc)用HER3蛋白塗佈。標記之蛋白質使用預先用抗-Fc(山羊或小鼠抗人類IgG，Jackson Immuno Research)、抗標籤抗體塗佈之盤捕捉，或經由被動吸附捕捉。經塗佈之盤用PBS洗滌且阻斷。經塗佈之盤再次用PBS洗滌，接著在室溫下添加HuCAL GOLD®或Platinum®噬菌體-抗體於震盪器上2小時。結合噬菌體溶離，添加至大腸桿菌TG-1中，且培育用於噬菌體感染。
隨後感染細菌分離且塗鋪在瓊脂盤上。群落自盤刮去且援救噬菌體並擴增。每一HER3淘選策略包含個別輪淘選且含有獨特的抗原、抗原濃度及洗滌嚴格性。
(viii)溶液相淘選
每一輪溶液相淘選使用各種生物素標記之重組HER3蛋 白，在神經調節蛋白1-β1(R&D Systems)存在或缺乏下執行。蛋白質使用EZ-link磺酸基-NHS-LC生物素標記套組(Pierce)，根據製造商之說明書進行生物素標記。800 μl抗生蛋白鏈菌素連接之磁性珠粒(Dynabeads,Dynal)用PBS洗滌一次且用Chemiblocker(Chemicon)阻斷隔夜。HuCAL GOLD®或Platinum®噬菌體-抗體及適當生物素標記HER3在反應管中培育。抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒經20分鐘添加且用磁性粒子分離器(Dynal)收集。結合噬菌體藉由添加含有DTT之緩衝液至每一管自Dynabead溶離，且添加至大腸桿菌TG-1中。噬菌體感染以與固相淘選中描述一致之方式執行。每一HER3淘選策略包含個別輪淘選且含有獨特的抗原、抗原濃度及洗滌嚴格性。為分離靶向特定抗原決定基之抗體，進行競爭淘選。在此等淘選策略中，HER3與參考抗體一起培育及預先阻斷，接著添加HuCAL GOLD®或Platinum®噬菌體-抗體。作為一替代策略，參考抗體用以特定溶離與HER3複合之噬菌體-抗體。
(ix)基於細胞之淘選
對於細胞淘選，HuCAL GOLD®或Platinum®噬菌體-抗體與約107個細胞一起在旋轉器上在室溫下培育2小時，接著離心。細胞集結粒分離，噬菌體自細胞溶離。收集上清液且添加至大腸桿菌TG-1培養物中，藉由上述過程繼續。兩個基於細胞之策略用以鑑別抗-HER3抗體：
a)全細胞淘選：在此策略中，多種完整細胞株用作抗原。
b)差分全細胞淘選：在此策略中，抗原連續由細胞及重組HER3蛋白組成。基於細胞之淘選如上所述執行，同時當利用重組蛋白作為抗原時採用固相淘選方案。洗滌使用PBS(2-3次)及PBST(2-3次)進行。
(x)RapMAT TM 文庫產生及淘洗
為提高抗體結合親和力，同時維持文庫多樣性，溶液與固相淘選之第二輪產出物進入RapMATTM製程，同時全細胞及差分全細胞淘選策略之第三輪產出物進入(Prassler等人，(2009)Immunotherapy；1：571-583)。RapMATTM文庫藉由將經由淘選選擇之噬菌體的Fab編碼***物次選殖至呈現載體pMORPH®25_bla_LHC中產生，且藉由使用特定限制酶進一步消化，產生H-CDR2 RapMATTM文庫及L-CDR3 RapMATTM文庫。根據池組合物，針對H-CDR2或L-CDR3，***物經TRIM成熟卡匣置換(Virnekas等人，(1994)Nucleic Acids Research 22：5600-5607)。文庫尺寸估計介於8×106-1×108個純系之間。產生RapMAT抗體-噬菌體且使用先前描述之實驗方法，經受另外兩輪溶液、固相或基於細胞之淘選。
包含對文庫設計之迭代細化的此廣泛淘選策略特別發展，藉由在淘選中直接包括配位體阻斷抗體，使篩選不偏向純配位體競爭抗體。其次，FAB至IgG之轉化過程經改適以最佳化候選純系之恢復且確保所有選擇性結合劑在功能分析中進行型態分析。自44次初始淘選，產生約28個特異性Her3結合抗體家族，僅僅3個抗體家族呈現阻斷配位 體依賴性與非配位體依賴性信號傳導之所需性質。家族A結合Her3之分離之域1-2及2。家族B結合分離之域3-4，而非單獨4；且家族C結合域3。
實例2：抗-HER3 IgG之短暫表現
懸浮適應之HEK293-6E細胞在BioWave20中培養。該等細胞用相關無菌DNA：PEI混合物短暫轉染且進一步培養。轉染後，細胞藉由使用Fresenius過濾器橫流式過濾來移除。無細胞物質藉由使用截止過濾器(Fresenius)橫流式過濾來濃縮，且濃縮物經由stericup過濾器無菌過濾。無菌上清液儲存在4℃下。
實例3：純化抗-HER3 IgG
在冷卻櫃中之ÄKTA 100 explorer Air層析系統上，使用XK16/20管柱，利用25 mL自填充MabSelect SuRe樹脂(均來自GE Healthcare)，純化IgG。除負載外，所有流速均為3.5 mL/min，在5巴(bar)之壓力極限下。管柱用3管柱體積PBS平衡，接著負載過濾之醱酵上清液。管柱用PBS洗滌。IgG用始於檸檬酸鹽/NaCl(pH 4.5)，線性降至檸檬酸鹽/NaCl(pH 2.5)，接著相同pH 2.5緩衝液之恆定步驟的pH梯度溶離。含有IgG之溶離份彙集且立刻中和及無菌過濾(Millipore Steriflip，0.22 μm)。量測OD280且蛋白質濃度基於序列資料計算。分別測試該等池的聚集(SEC-MALS)及純度(SDS-PAGE及MS)。
實例4：大腸桿菌中HuCAL®-Fab抗體之表現及純化
在使用補充有氯胺苯醇(chloramphenicol)之YT培養基的 搖瓶培養物中進行TG-1細胞中pMORPH®X9_Fab_MH編碼之Fab片段之表現。培養物震盪，直至OD600nm達到0.5。藉由添加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘發表現。細胞使用溶菌酶破碎。經由IMAC(Bio-Rad)分離His6標記之Fab片段。使用PD10管柱，緩衝液交換為1x杜爾貝科(Dulbecco)之PBS(pH 7.2)。樣品無菌過濾。蛋白質濃度藉由紫外線分光光度法測定。樣品之純度在變性、還原15% SDS-PAGE中分析。Fab製劑之均一性在天然狀態下藉由尺寸排阻層析(HP-SEC)，使用校準用標準來測定。
實例5：藉由溶液平衡滴定(SET)量測HER3抗體親和力(K D )
溶液中親和力測定基本上如先前描述進行(Friguet等人，(1985)J Immunol Methods 77：305-19)。為提高SET方法之靈敏度及精確性，其自經典ELISA轉換成基於ECL之技術(Haenel等人，(2005)Anal biochem 339：182-84)。
先前描述之未標記HER3-標籤(人類、大鼠、小鼠或食蟹獼猴)藉由SET測定親和力。
數據用XLfit軟體(ID Business Solutions)，應用定製之擬合模型評估。對於每一IgG之KD測定，使用以下模型(根據Piehler等人(Piehler等人，(1997)J Immunol Methods 201：189-206)修飾)。
[IgG]：應用之總IgG濃度
x：應用之總可溶性抗原濃度(結合位點)
Bmax：無抗原下IgG之最大信號
KD：親和力
實例6：藉由FACS測定抗體細胞結合
藉由FACS評估抗體對在人類癌細胞上表現之內源性人類抗原的結合。為測定抗體EC50值，用accutase收穫SK-Br-3細胞，且在FACS緩衝液(PBS/3% FBS/0.2% NaN3)中稀釋至1×106個細胞/毫升。1×105個細胞/孔添加至96孔盤(Nunc)之每一孔，且在4℃下在210 g下離心5分鐘，接著移除上清液。測試抗體之連續稀釋液(用FACS緩衝液以1：4稀釋級稀釋)添加至粒化細胞中且在冰上培育1小時。細胞用100 μL FACS緩衝液洗滌且粒化3次。用FACS緩衝液1/200稀釋之PE結合之山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch)添加至細胞中且在冰上培育1小時。其他洗滌步驟用100 μL FACS緩衝液進行3次，接著在4℃下在210 g下進行離心步驟5分鐘。最後，細胞再懸浮於200 μL FACS緩衝液中且用FACSArray(BD Biosciences)量測螢光值。細胞表面結合之抗-HER3抗體之量藉由量測平均通道螢光來評估。
實例7：HER3域結合
96孔Maxisorp盤(Nunc)用200 ng適當重組人類蛋白質(HER3-標籤、D1-2-標籤、D2-標籤、D3-4-標籤、D4-標籤及標記之不相關對照蛋白)塗佈隔夜。所有孔接著用PBS/0.1% Tween-20洗滌，用PBS/1% BSA/0.1% Tween-20阻斷且用PBS/0.1% Tween-20洗滌。抗-HER3抗體添加至相關孔中，達10 μg/mL之最終濃度且在室溫下培育。盤用PBS/0.1% Tween-20洗滌，接著添加在PBS/1% BSA/0.1% Tween-20中1/10000稀釋之適當過氧化酶連接之偵測抗體。所用偵測抗體為山羊抗小鼠(Pierce，31432)、兔抗山羊(Pierce，31402)及山羊抗人類(Pierce，31412)。盤在室溫下培育，接著用PBS/0.1% Tween-20洗滌。100 μl TMB(3,3',5,5'四甲基聯苯胺)受質溶液(BioFx)添加至所有孔中，接著用50 μl 2.5% H2SO4停止反應。藉由使用SpectraMax盤式讀數器(Molecular Devices)量測OD450來確定HER3抗體結合於每一重組蛋白質之程度。適當時，使用Graphpad Prism分析劑量反應曲線。
實例8：人類HER3/MOR12604 Fab複合物之X射線晶體結構測定
本實例呈現結合於MOR12604之Fab片段之HER3的晶體結構，在3.38Å解析度下測定。標記之人類HER3細胞外域在於PBS(pH 7.3)中平衡之HiLoad 26/60 Superdex 200 PrepGrade管柱(GE Healthcare)上進一步純化。MOR12604 Fab在大腸桿菌中表現且如前所述純化。HER3/MOR12604-Fab複合物藉由將過量MOR12604 Fab與標記HER3以2：1之 莫耳比混合(濃度藉由LCUV法來估算)且在於25 mM Tris(pH 7.5)、150 mM NaCl中平衡之Superdex 200 10/300管柱(GE Healthcare)上純化複合物來製備。峰溶離份藉由SDS-PAGE及LCMS分析。含有近似等莫耳比率之HER3與Fab的溶離份彙集且濃縮至10 mg/ml。HER3/MOR12604晶體在293K下，藉由自含有150 nl HER3/MOR12604複合物及150 nl儲集溶液(200 mM磷酸氫二鉀及20% PEG 3350)之液滴沉滴蒸氣擴散而生長。晶體轉移至200 mM磷酸氫二鉀、25% PEG 3350及15%甘油中且在液氮中急驟冷卻。
數據在Advanced Photon Source(Argonne National Laboratory)於束線17-ID下收集。HER3/MOR12604 Fab複合物數據使用autoPROC(Global Phasing,LTD)，在空間群P212121中，晶胞尺寸為a=56.15 Å，b=174.71 Å，c=186.64 Å下，使用優良統計法，在3.38Å下加工及換算。HER3/MOR12604 Fab結構藉由分子置換，使用相位器(Phaser)(McCoy等人，(2007)J.Appl.Cryst.40：658-674)，以公開ER3 ECD結構1mb6及專用Fab為搜索模型來解析。最終模型每一不對稱單元含有1分子HER3/MOR12604 Fab複合物，在COOT(Emsley & Cowtan(2004)Acta Cryst.60：2126-2132)中建立，且鍵長及鍵角分別使用0.008 Å及1.19°之rmsd，使用BUSTER(Global Phasing,LTD)，細化至分別19.9%及23.3%之R及Rfree值。如PyMOL(Schrödinger,LLC)中所鑑別，含有在MOR12604 Fab中任一原子之5Å內之原子的HER3殘基在表5及6中列出。
實例9：磷酸化HER3之活體外細胞分析
MCF-7細胞通常維持於DMEM/F12、15 mM HEPES、L-麩醯胺酸、10% FCS中，BT474維持於DMEM、10% FBS中且SK-Br-3維持於McCoy's 5a、10% FBS、1.5 mM L-麩醯胺酸中。未匯合細胞以胰蛋白酶處理，用PBS洗滌且稀釋至5×105個細胞/毫升。100 μL細胞懸浮液接著添加至96孔平底盤(Nunc)之每一孔中，得到5×104個細胞/孔之最終密度。使MCF7細胞附著約3小時，接著培養基交換為含有0.5% FBS之饑餓培養基。所有盤接著在37℃下培育隔夜，接著在37℃下用適當濃度之HER3抗體處理80分鐘。MCF7細胞用50 ng/mL NRG1處理最後20分鐘，以刺激HER3及AKT磷酸化，而BT474/SK-Br-3細胞不需要額外刺激。全部培養基輕輕吸出且細胞用含有1 mM CaCl2及0.5 mM MgCl2之冰冷PBS(Gibco)洗滌。細胞藉由添加50 μL冰***解緩衝液(20 mM Tris(pH 8.0)/137 mM NaCl/10%甘油/2 mM EDTA/1% NP-40/1 mM原釩酸鈉/1x磷酸化中止劑/1x Complete mini蛋白酶抑制劑(Roche)/0.1 mM PMSF)溶解且在冰上在震盪下培育30分鐘。接著收集溶解產物且在4℃下在1800 g下離心15分鐘以移除細胞碎片。
HER3捕捉盤使用碳盤(Mesoscale Discovery)，在4℃用在PBS中稀釋之20 μL 4 μg/mL MAB3481捕捉抗體(R&D Systems)塗佈隔夜產生，隨後用含3%牛血清白蛋白之1x Tris緩衝液(Mesoscale Discovery)/0.1% Tween-20阻斷。HER3藉由添加適當量之溶解產物，且在室溫下在震盪下 培育盤1小時來捕捉，接著吸出溶解產物且孔用1x Tris緩衝液(Mesoscale Discovery)/0.1% Tween-20洗滌。磷酸化HER3使用在3%牛奶/1x Tris/0.1% Tween-20中製備之1：8000抗-pY1197抗體(Cell Signaling)，藉由在室溫下在震盪下培育1小時來偵測。該等孔用1x Tris/0.1% Tween-20洗滌4次，且磷酸化蛋白質藉由與在3%阻斷緩衝液中稀釋之S-Tag標記之山羊抗兔抗體(#R32AB)一起在室溫下培育1小時來偵測。每一孔吸出且用1x Tris/0.1% Tween-20洗滌4次，接著添加20 μL具有界面活性劑之讀取緩衝液T(Mesoscale Discovery)且使用Mesoscale Sector成像器定量信號。
實例10：磷酸化Akt(S473)之活體外細胞分析
未匯合MCF7、SK-Br-3及BT-474細胞在完全培養基中生長，用accutase(PAA Laboratories)收穫且再懸浮於適當生長培養基中，最終濃度為5×105個細胞/毫升。100 μL細胞懸浮液接著添加至96孔平底盤(Nunc)之每一孔中，得到5×104個細胞/孔之最終密度。使MCF7細胞附著約3小時，接著培養基交換為含有0.5% FBS之饑餓培養基。所有盤接著在37℃下培育隔夜，接著在37℃下用適當濃度之HER3抗體處理80分鐘。MCF7細胞用50 ng/mL NRG1處理最後20分鐘，以刺激HER3及AKT磷酸化，而SK-Br-3細胞無需額外刺激。全部培養基輕輕吸出且細胞用含有1 mM CaCl2及0.5 mM MgCl2之冰冷PBS(Gibco)洗滌。細胞藉由添加50 μL冰***解緩衝液(20 mM Tris(pH 8.0)/137 mM NaCl/10% 甘油/2 mM EDTA/1% NP-40/1 mM原釩酸鈉/抑蛋白酶肽(10 μg/mL)/抗纖維蛋白溶酶肽(10 μg/mL))溶解且在冰上在震盪下培育30分鐘。接著收集溶解產物且在4℃下在1800 g下離心15分鐘以移除細胞碎片。20 μL溶解產物添加至多點384孔磷酸化Akt碳盤(Mesoscale Discovery)中，該碳盤已預先用3% BSA/1x Tris/0.1% Tween-20阻斷。盤在室溫下在震盪下培育2小時，接著吸出溶解產物且孔用1x Tris緩衝液(Mesoscale Discovery)/0.1% Tween-20洗滌4次。磷酸化Akt使用20 μL在1% BSA/1x Tris/0.1% Tween-20中稀釋50倍之SULFO-TAG抗磷酸化Akt(S473)抗體(Mesoscale Discovery)，藉由在室溫下在震盪下培育2小時來偵測。該等孔用1x Tris/0.1% Tween-20洗滌4次，接著添加20 μL具有界面活性劑之讀取緩衝液T(Mesoscale Discovery)且使用Mesoscale Sector成像器定量信號。
實例11：細胞株增殖分析
SK-Br-3細胞通常培養在經改良之補充有10%胎牛血清的McCoy's 5A培養基中且BT-474細胞培養在補充有10% FBS之DMEM中。未匯合細胞以胰蛋白酶處理，用PBS洗滌，用生長培養基稀釋至5×104個細胞/毫升且以5000個細胞/孔之密度塗鋪在96孔透明底黑色盤(Costar 3904)中。細胞在37℃下培育隔夜，接著添加適當濃度之HER3抗體(典型最終濃度為10或1 μg/mL)。盤回至培育箱中6天，接著使用CellTiter-Glo(Promega)評估細胞活力。100 μL CellTiter-Glo溶液添加至每一孔中且在室溫下在輕輕震盪下培育10 分鐘。使用SpectraMax盤式讀數器(Molecular Devices)確定發光之量。由每一抗體得到之生長抑制程度藉由將由每一HER3抗體得到之發光值與標準同型對照抗體比較來計算。
對於增殖分析，MCF-7細胞通常培養在含有4 mM L-麩醯胺酸/15 mM HEPES/10% FBS之DMEM/F12(1：1)中。未匯合細胞以胰蛋白酶處理，用PBS洗滌，且用含有4 mM L-麩醯胺酸/15 mM HEPES/10 μg/mL人類轉鐵蛋白/0.2% BSA之DMEM/F12(1：1)稀釋至1×105個細胞/毫升。細胞以5000個細胞/孔之密度塗鋪在96孔透明底黑色盤(Costar)。接著添加適當濃度之HER3抗體(典型最終濃度為10或1 μg/mL)。10 ng/mL NRG1-β1 EGF域(R&D Systems)亦添加至適當孔中，以刺激細胞生長。盤回至培育箱中6天，接著使用CellTiter-Glo(Promega)評估細胞活力。由每一抗體得到之生長抑制程度藉由減去背景(無神經調節蛋白)發光值且將由每一抗-HER3抗體得到之所得值與標準同型對照抗體比較來計算。
實例12：活體內BxPC3功效研究
BxPC3細胞在含有10%熱滅活胎牛血清且不含抗生素之RPMI-1640培養基中培養，直至植入時間。
雖性無胸腺nu/nu Balb/C小鼠(Harlan Laboratories)皮下植入含10×106個細胞之50%磷酸鹽緩衝鹽水與50%基質膠之混合物。含有細胞於懸浮液中之總注射體積為200 μL。一旦腫瘤尺寸達到約200 mm3，動物即入選功效研究。一 般而言，每組共10隻動物入選研究。若動物在入選之前顯示異常的腫瘤生長特徵，則其不入選。
動物經由側面尾靜脈注射，靜脈內給藥。動物處於每週兩次20 mg/kg之時程，歷時整個研究時間。腫瘤體積及T/C值如關於BT-474研究所詳述來計算。
實例13：活體內BT-474功效研究
BT-474細胞在含有10%熱滅活胎牛血清且不含抗生素之DMEM中培養，直至植入時間。
細胞接種前一天，雌性無胸腺nu/nu Balb/C小鼠(Harlan Laboratories)皮下植入持續釋放之17β-***集結粒(Innovative Research of America)以維持血清***含量。植入17β-***集結粒後一天，5×106個細胞於含有50%無酚紅基質膠(BD Biosciences)於漢克平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution)中之懸浮液中正位注射至第4乳腺脂肪墊中。含有細胞於懸浮液中之總注射體積為200 μL。細胞植入後20天，腫瘤體積為約200 mm3之動物入選功效研究。一般而言，每組共10隻動物入選功效研究。
對於單一藥劑研究，動物經由側面尾靜脈注射，靜脈內給與對照IgG或MOR12606或MOR13655。動物處於每週兩次20 mg/kg之時程，歷時整個研究時間。對於組合研究，動物每週給與20 mg/kg MOR10703與MOR12606兩次。對於整個研究時間，腫瘤體積藉由每週測徑規量測2次來量測。使用下式計算處理/對照百分比(T/C)值：% T/C=100×△T/△C(△T>0時)
其中：T=研究最後一天經藥物處理之組的平均腫瘤體積；△T=研究最後一天經藥物處理之組的平均腫瘤體積-給藥起始之日經藥物處理之組的平均腫瘤體積；C=研究最後一天對照組的平均腫瘤體積；且△C=研究最後一天對照組的平均腫瘤體積-給藥起始之日對照組的平均腫瘤體積。
體重每週量測兩次且劑量根據體重調整。體重變化%計算為(BW目前-BW起始)/(BW起始)×100。數據呈現為自處理開始之日起的體重變化百分比。
所有數據均表示為平均值±平均值標準誤差(SEM)。△腫瘤體積及體重用於統計分析。使用單因子ANOVA，接著事後杜凱氏(post hoc Tukey)進行組間比較。對於所有統計學評價，顯著性水準定在p<0.05。報導與媒劑對照組相比之顯著性。
結果與討論
總而言之，此等結果表明一類抗體結合於域3或4內的胺基酸殘基。此等抗體之結合抑制配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
(i)親和力測定
抗體親和力藉由如上所述之溶液平衡滴定(SET)測定。結果概述於表3中且MOR12615及MOR12604之實例滴定曲線含於圖1中。資料指示鑑別出許多緊密結合人類HER3之抗體。
(ii)SK-Br-3細胞EC 50 測定
所鑑別之抗體結合表現HER3之細胞的能力藉由計算其結合於HER2擴增細胞株SK-Br-3之EC50值(參見圖2，表4)來確定。
(iii)HER3域結合
在ELISA分析中對抗-HER3抗體子集結合人類HER3之各種細胞外域之能力進行表徵。為實現此，HER3之細胞外域分成其4個組成性域，且此等域之各種組合如上所述選殖、表現及純化為獨立蛋白質。使用此策略，以下域成功產生為可溶性蛋白質：域1及2(D1-2)、域2(D2)、域3及4(D3-4)以及域(D4)。使用一組內部產生之抗體作為陽性對照預先證實每一分離之域之完整性。
如圖3中所示，觀測到MOR12615及MOR12604成功結合HER3細胞外域及分離之D3-4蛋白。未觀測到與D1-2或D2蛋白結合。此結合資料表明此等抗體識別主要含於域3或4內之抗原決定基。有趣地，MOR12604可結合分離之D3蛋白，表明其抗原決定基可進一步細化至域3內之殘基。因為基於hCDR3序列，MOR12615及MOR12604為抗-HER3抗體之兩個不同家族之代表性成員，所以抗體MOR12514、MOR12515、MOR12516、MOR12615、MOR12920、MOR12921、MOR12922、MOR13654、MOR13655、MOR13656、MOR13657、MOR13658、MOR13659、MOR13660、MOR13661、MOR13662、MOR13663、MOR13664、MOR13665、MOR13666、MOR13667、 MOR13668、MOR13669、MOR13670、MOR14537及MOR14538可分類為D3-4結合劑。抗體MOR12603、MOR12604、MOR12605、MOR12606、MOR14533及MOR14534可分類為D3結合劑。
(iv)HER3/MOR12604晶體結構
對結合於HER3細胞外域之MOR12604 Fab片段的3.38Å解析度x射線晶體結構進行解析，以進一步確定由此相關抗體家族識別之HER3抗原決定基(參見圖4)。MOR12604/HER3晶體結構與公開HER3晶體結構之重疊表明MOR12604結合之HER3處於繫栓(不活化)構形(參見圖4B)。此構形特徵為域2與4之間藉由域2中之β-髮夾二聚化環介導的顯著相互作用。所觀測到之HER3構形類似於Cho等人先前所描述之構形(Cho及Leahy,(2002),Science 297：1330-1333)，Cho等人公開在缺乏神經調節蛋白下HER3細胞外域之晶體結構。因為神經調節蛋白可活化HER3，所以HER3之繫栓構形假定為不活化。在相關EGFR家族成員HER4(Bouyain等人，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102：15024-15029)及HER1(Ferguson等人，(2003)Molec.Cell 11：507-517)結晶時，亦觀測到類似繫栓構形。
呈不活化(繫栓)狀態之HER3之域1至4之間的空間關係明顯不同於延伸(活化)狀態。此發現係基於相關EGFR家族成員HER2及配位體結合HER1之晶體結構(Cho等人，(2003)Nature 421：756-760；Ogiso等人，(2002)Cell 110：775- 787；Garrett等人，(2002)Cell 110：763-773)，兩者均處於延伸(活化)狀態。在延伸狀態中，域2之β-髮夾二聚化環自其與4之抑制相互作用釋放，因此能夠自由與其二聚化搭配物蛋白質相互作用。因此，域2之β-髮夾二聚化環在功能上對維持繫栓(不活化)狀態及介導處於延伸狀態之EGF受體之二聚化而言為重要的，引起細胞內激酶域活化。
在晶體結構中，MOR12604 Fab、HER3域3、HER3域4及包括β-髮夾二聚化環之域2部分(殘基261-278)的電子密度均界限分明。對位於域1及域2中之HER3殘基20-260及279-303觀測到弱電子密度或無電子密度，表明當HER3由MOR12604結合時，其保留一定可撓度。此發現與單獨及結合於各種Fab片段之HER3的其他晶體結構之比較一致，該比較顯示繫栓狀態內相對域定位存在輕微差異。
晶體結構亦顯示由MOR12604識別之HER3抗原決定基為包括來自域3之殘基的非線性抗原決定基(參見圖4，表5及6)。由此高度相關抗體家族識別之HER3抗原決定基因此可界定為：域3：殘基335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455。
MOR12604結合表面可進一步再分成兩個表面，在圖4D中以實線圓及虛線圓突出顯示：
表面A：殘基362-376
表面B：殘基335-342、398、400、424-428、431、433-434及455
表面A或表面B提供約相同表面積給總HER3/12604界面(表面A-640 Å2，表面B-546 Å2)。
有趣地，MOR12604結合於域3引起由HER3殘基371-377界定之環顯著構形變化。此環之此構形不同於其他公開HER3結構，因此表明其由MOR12604結合誘發。由晶體結構確定之MOR12604抗原決定基與確定MOR12604結合分離之D3蛋白之ELISA域結合資料一致。此外，MOR12604抗原決定基與由TGFα接觸之EGFR殘基之比較突出顯示高度重疊(Garrett等人，(2002)Cell 110：763-773)。因為認為神經調節蛋白以類似於TGFα/EGFR之方式與HER3相互作用，所以很可能MOR12604將阻止配位體結合，因此阻斷神經調節蛋白誘發之HER3活化。
MOR12604在域3內結合將表明MOR12604可藉由任何(或組合)以下機制起作用：
-阻斷配位體結合所需之HER3殘基
-因抗體與HER3域之間的位阻而阻止HER3採用活化構形
-藉由降低HER3鉸鏈區(例如域3)中之可撓度來阻止HER3採用活化構形
-誘發域3環371-377進行阻止HER3轉變成開放構形之構形變化
-將HER3去穩定化，使得其易於降解
-充當部分促效劑，以促進HER3下調
-抑制與結合搭配物之二聚化
-MOR12604之每一臂結合HER3之分子，使得抗體產生 易進行蛋白降解或無法與其他受體酪胺酸激酶二聚化之非天然HER3二聚體
(v)抑制細胞信號傳導
為確定抗-HER3抗體對配位體依賴性HER3活性之作用，MCF7細胞與IgG一起培育，接著用神經調節蛋白刺激。實例抑制曲線展示於圖5中且概述於表7中。亦使用HER2擴增細胞株SK-Br-3及BT474，研究抗-HER3抗體對HER2介導之HER3活化的作用(圖6、圖7及表7)。
為確定HER3活性之抑制是否影響下游細胞信號傳導，在NRG刺激之MCF7細胞及HER2擴增之SK-Br-3/BT474細胞中，用抗-HER3抗體處理後量測Akt磷酸化(參見圖5、圖6及表8)。
總之，MOR12514、MOR12515、MOR12516、MOR12615、MOR12920、MOR12921、MOR12922、MOR13654、MOR13655、MOR13656、MOR13657、MOR13658、MOR13659、MOR13660、MOR13661、MOR13662、MOR13663、MOR13664、MOR13665、MOR13666、MOR13667、MOR13668、MOR13669、MOR13670、MOR14537、MOR14538、MOR12603、MOR12604、MOR12605、MOR12606、MOR14533及MOR14534每一者能夠以配位體依賴性與非配位體依賴性方式抑制細胞HER3活性及下游信號傳導。
(vi)抑制增殖
因為MOR12514、MOR12515、MOR12516、MOR12615、MOR12920、MOR12921、MOR12922、MOR13654、MOR13655、MOR13656、MOR13657、MOR13658、MOR13659、MOR13660、MOR13661、MOR13662、MOR13663、MOR13664、MOR13665、MOR13666、MOR13667、MOR13668、MOR13669、MOR13670、MOR14537、MOR14538、MOR12603、MOR12604、MOR12605、MOR12606、MOR14533及MOR14534能夠抑制HER3活性，所以測試子集阻斷配位體 依賴性及非配位體依賴性活體外細胞生長之能力(實例資料展示於圖8、圖9、圖10中且概述於表9中)。測試之抗-HER3抗體均為細胞增殖之有效抑制劑，因此證實結合D3或D3-4之抗體能夠抑制HER3驅動之表型。
(vii)活體內腫瘤生長抑制
為確定所述抗-HER3抗體之活體內活性，在BxPC3與BT-474腫瘤模型中測試MOR12606及MOR13655之抗腫瘤活性。使用MOR12606或MOR13655重複給與BxPC3模型分別得到25%消退及5% T/C(圖11A)。
用MOR12606或MOR13655單一藥劑處理HER2驅動之BT474模型分別得到53%或46% T/C(圖11B)。
亦研究結合兩個不同不重疊抗原決定基之兩個HER3靶向抗體組合的作用。用MOR10703與MOR12606之組合重複給與BT474模型得到7%T/C(圖12)。
以引用的方式併入本文中
本文中引用之所有參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書及其類似物以及其中引用之參考文獻在其尚未引用的程度上以全文引用的方式併入本文中。
同等物
認為前述書面說明書足以使熟習此項技術者能夠實施本發明。以上描述及實例詳述本發明之某些較佳實施例且描述本發明者所預期之最佳模式。然而，應瞭解，不管如何詳述以上內容出現在本文中，本發明均可用許多方式實施且本發明應根據隨附申請專利範圍及其任何同等物解釋。
圖1：用人類HER3獲得之代表性MOR12615 SET曲線；圖2：藉由FACS滴定測定SK-Br-3細胞結合；圖3：HER3域結合ELISA； 圖4：(A)HER3/MOR12604 x射線晶體結構之表面圖。HER3(藉由域D2、D3及D4標記)呈閉合構形，且MOR12604結合於域3。藉由域3比對，來自HER3/MOR12064結構(深灰色)與未結合HER3結構(淡灰色；Cho等人，(2003)Nature 421：756-760)之HER3 Cα-重疊。(C)由12604識別之域3抗原決定基之圖。在x射線晶體結構中突出顯示之HER3殘基在MOR12604之5Å內。(D)域3/MOR12604相互作用之圖。MOR12604結合表面以深灰色突出顯示，其中指示表面A(實線)及表面B(虛線)；圖5：MCF7細胞中抑制配位體誘發之(A)HER3及(B)Akt磷酸化；圖6：在HER2擴增SKBr3細胞中抑制非配位體依賴性(A)HER3及(B)Akt磷酸化；圖7：在HER2擴增BT474細胞中抑制非配位體依賴性(A)HER3及(B)Akt磷酸化；圖8：抑制配位體刺激之MCF7細胞增殖；圖9：抑制非配位體依賴性之SKBr3細胞增殖；圖10：抑制非配位體依賴性之BT474細胞增殖；圖11：顯示使用MOR12606及MOR13655抑制BxPC3(A)及BT474(B)中活體內腫瘤生長之資料；及圖12：顯示使用MOR12606(DIII結合劑)與MOR10703(DII+IV結合劑)之組合抑制BxPC3中活體內腫瘤生長之資料。

Claims (47)

  1. 一種識別HER3受體之非線性抗原決定基的分離之抗體或其片段，其中該非線性抗原決定基包含該HER3受體之域3內之胺基酸殘基，其中該抗體或其片段結合於包含至少一個選自結合表面B之胺基酸殘基之結合表面，且其中該抗體或其片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
  2. 如請求項1之分離之抗體或其片段，其中結合表面B包含至少一個選自胺基酸殘基335-342、398、400、424-428、431、433-434及455之胺基酸殘基。
  3. 如請求項1之分離之抗體或其片段，其中該抗體或片段進一步結合於結合表面A。
  4. 如請求項3之分離之抗體或其片段，其中結合表面A包含至少一個選自由胺基酸殘基362-376組成之群之胺基酸殘基。
  5. 一種識別HER3受體之非線性抗原決定基的分離之抗體或其片段，其中該非線性抗原決定基包含該HER3受體之域3內之胺基酸殘基，其中該抗體或其片段結合於包含至少一個選自結合表面A之胺基酸殘基及至少一個選自結合表面B之胺基酸殘基的結合表面，且其中該抗體或其片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
  6. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中該抗體或其片段阻斷HER3配位體結合於該HER3受體上。
  7. 如請求項6之分離之抗體或其片段，其中該HER3配位體 係選自由神經調節蛋白1(NRG)、神經調節蛋白2、β細胞素、肝素結合之表皮生長因子，及表皮調節素(epiregulin)組成之群。
  8. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中該抗體或其片段具有選自由以下組成之群之任一特徵：結合於不活化狀態之HER3受體；因該抗體或其片段與HER3域之間的位阻而阻止HER3採用活化構形；藉由降低域3中之可撓度而阻止HER3採用活化構形；誘發域3殘基371-377之構形變化而阻止HER3採用活化構形；使HER3去穩定化，使其易於降解；促進細胞表面HER3下調；及產生非天然HER3二聚體，其易進行蛋白溶解降解或不能與其他受體酪胺酸激酶二聚化。
  9. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中該結合表面A包含胺基酸殘基362-376。
  10. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中該結合表面B包含胺基酸殘基335-342、398、400、424-428、431、433-434及455。
  11. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中該非線性抗原決定基包含胺基酸殘基335-342、362-376、398、400、424-428、431、433-434及455(在域3內)，或其子集(subset)。
  12. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中該抗體或其片段之VH結合於至少一個以下HER3殘基：Ile365、Thr366、Asn369、Gly370、Asp371、Pr0372、Trp373、 His374、Lys375、Gln400及Lys434。
  13. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中該抗體或其片段之VL結合於至少一個以下HER3殘基：Gly335、Ser336、Gly337、Ser338、Phe340、Gln341、Asp362、Leu364、Ile365、Thr366、His374、Ile376、Asn398、Gln400、Tyr424、Asn425、Arg426、Phe428、Leu431、Met433、Lys434、Tyr455。
  14. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中在表現HER2及HER3之細胞中在缺乏HER3配位體下該抗體或其片段結合於該HER3受體減少非配位體依賴性HER2-HER3蛋白複合物之形成。
  15. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中如非HER3配位體依賴性磷酸化分析所評估，該抗體或其片段抑制HER3磷酸化。
  16. 如請求項15之分離之抗體或其片段，其中該非HER3配位體依賴性磷酸化分析使用HER2擴增細胞，其中該等HER2擴增細胞為SK-Br-3細胞及BT-474。
  17. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中在表現HER2及HER3之細胞中在HER3配位體存在下該抗體或其片段結合於該HER3受體減少配位體依賴性HER2-HER3蛋白複合物之形成。
  18. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中如HER3配位體依賴性磷酸化分析所評估，該抗體或其片段抑制HER3磷酸化。
  19. 如請求項18之分離之抗體或其片段，其中該HER3配位體依賴性磷酸化分析使用在神經調節蛋白(NRG)存在下經刺激之MCF7細胞。
  20. 如請求項5之分離之抗體或其片段，其中該抗體係選自由單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體及合成抗體組成之群。
  21. 一種識別HER3受體之抗原決定基的分離之抗體或其片段，其中該抗原決定基包含該HER3受體之域3-4內之胺基酸殘基，且其中該抗體或其片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
  22. 如請求項21之分離之抗體或其片段，其中該抗原決定基包含至少一個選自由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基329-498(域3)組成之群之胺基酸殘基及至少一個選自由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基499-642(域4)組成之群之胺基酸殘基。
  23. 如請求項21之分離之抗體或其片段，其中包含域3-4內之胺基酸殘基的抗原決定基係選自由線性抗原決定基、非線性抗原決定基及構形抗原決定基組成之群。
  24. 如請求項21之分離之抗體或其片段，其中在表現HER2及HER3之細胞中在缺乏HER3配位體下該抗體或其片段結合於該HER3受體減少非配位體依賴性HER2-HER3蛋白複合物之形成。
  25. 如請求項21之分離之抗體或其片段，其中如非HER3配位體依賴性磷酸化分析所評估，該抗體或其片段抑制HER3 磷酸化。
  26. 如請求項25之分離之抗體或其片段，其中該非HER3配位體依賴性磷酸化分析使用HER2擴增細胞，其中該等HER2擴增細胞為SK-Br-3細胞及BT-474。
  27. 如請求項21之分離之抗體或其片段，其中在表現HER2及HER3之細胞中在HER3配位體存在下該抗體或其片段結合於該HER3受體減少配位體依賴性HER2-HER3蛋白複合物之形成。
  28. 如請求項21之分離之抗體或其片段，其中如HER3配位體依賴性磷酸化分析所評估，該抗體或其片段抑制HER3磷酸化。
  29. 如請求項28之分離之抗體或其片段，其中該HER3配位體依賴性磷酸化分析使用在神經調節蛋白(NRG)存在下經刺激之MCF7細胞。
  30. 一種針對HER3受體之分離之抗體或其片段，其具有至少1×107 M-1、108 M-1、109 M-1、1010 M-1、1011 M-1、1012 M-1、1013 M-1之解離(KD)，其中該抗體或其片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
  31. 如請求項30之分離之抗體或其片段，其中如選自由磷酸化HER3及磷酸化Akt組成之群之活體外磷酸化分析所測量，該抗體或其片段抑制HER3磷酸化。
  32. 一種分離之抗體或其片段，其與表1中所述抗體結合於HER3之域3內相同的非線性抗原決定基。
  33. 一種分離之抗體或其片段，其與表2中所述抗體結合於 HER3之域3-4內相同的胺基酸殘基。
  34. 一種結合於HER3之抗體之片段，其選自由Fab、F(ab2)'、F(ab)2'、scFv、VHH、VH、VL、dAbs組成之群，其中該抗體之片段阻斷配位體依賴性與非配位體依賴性信號傳導。
  35. 一種醫藥組合物，其包含抗體或其片段及醫藥學上可接受之載劑。
  36. 如請求項35之醫藥組合物，其進一步包含另一治療劑。
  37. 如請求項36之醫藥組合物，其中該另一治療劑係選自由HER1抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、mTOR抑制劑及PI3激酶抑制劑組成之群。
  38. 如請求項37之醫藥組合物，其中該另一治療劑為：HER1抑制劑，其選自由馬妥珠單抗(Matuzumab)(EMD 72000)、Erbitux®/西妥昔單抗(Cetuximab)、Vectibix®/帕尼單抗(Panitumumab)、mAb 806、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)、Iressa®/吉非替尼(Gefitinib)、CI-1033(PD183805)、拉帕替尼(Lapatinib)(GW-572016)、Tykerb®/二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、Tarceva®/鹽酸厄羅替尼(Erlotinib HCL)(OSI-774)、PKI-166及Tovok®組成之群；HER2抑制劑，其選自由帕妥珠單抗(Pertuzumab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、MM-111、來那替尼(neratinib)、拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼/Tykerb®組成之群；HER3抑制劑，其選自由MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、 AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)及抑制HER3之小分子組成之群；及HER4抑制劑。
  39. 如請求項37之醫藥組合物，其中該另一治療劑為HER3抑制劑，其中該HER3抑制劑為MOR10703。
  40. 如請求項37之醫藥組合物，其中該另一治療劑為mTOR抑制劑，選自由西羅莫司(Temsirolimus)/Torisel®、雷達莫司(ridaforolimus)/德佛莫司(Deforolimus)、AP23573、MK8669、依維莫司(everolimus)/Affinitor®組成之群。
  41. 如請求項37之醫藥組合物，其中該另一治療劑為PI3激酶抑制劑，選自由GDC 0941、BEZ235、BKM120及BYL719組成之群。
  42. 一種包含表1或表2中揭示之抗體或其片段之組合物的用途，其係用於製造供治療癌症之藥劑。
  43. 如請求項42之用途，其中個體為人類，且該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌、周圍神經鞘腫瘤、神經鞘瘤、頭頸癌、膀胱癌、食道癌、巴雷特氏食道癌(Barretts esophageal cancer)、神經膠母細胞瘤、軟組織之透明細胞肉瘤、惡性間皮瘤、神經纖維瘤、腎癌、黑色素瘤、***癌、良性***增生(BPH)、男子女乳症及子宮內膜異位。
  44. 如請求項43之用途，其中該癌症為乳癌。
  45. 如請求項1至34中任一項之抗體或其片段，其係用作藥劑。
  46. 如請求項1至34中任一項之抗體或其片段，其係用於治療由HER3配位體依賴性信號傳導或非配位體依賴性信號傳導路徑介導之癌症。
  47. 一種如請求項1至34中任一項之抗體或其片段之用途，其係用於製造供治療由HER3配位體依賴性信號傳導或非配位體依賴性信號傳導路徑介導之癌症的藥劑，該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰臟癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌、周圍神經鞘腫瘤、神經鞘瘤、頭頸癌、膀胱癌、食道癌、巴雷特氏食道癌、神經膠母細胞瘤、軟組織之透明細胞肉瘤、惡性間皮瘤、神經纖維瘤、腎癌、黑色素瘤、***癌、良性***增生(BPH)、男子女乳症及子宮內膜異位。
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