TW201311886A - 聚合酶連鎖反應的溫度設定方法 - Google Patents

Abstract

一種聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，包含有一準備步驟、一加溫步驟以及一連鎖反應步驟，於準備步驟中，將一裝有反應樣品的反應試管設置於一加熱座上，並使該加熱座內之一主要加熱件對應於該反應試管的底部設置，而一輔助加熱件對應該反應試管的中間段。該加溫步驟則使該主要加熱件加熱至變性溫度並使該輔助加熱件加熱至一輔助加熱溫度後進行連鎖反應，其中該輔助加熱溫度小於該變性溫度。本發明利用該主要加熱件以及該輔助加熱件分別達到進行加熱以及穩定該反應試管各部位之溫度，而可增加連鎖反應的速度。

Description

聚合酶連鎖反應的溫度設定方法

    本發明係有關一種聚合酶連鎖反應，尤指一種聚合酶連鎖反應的溫度設定方法。

    以聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴增特定核酸序列為目前相當成熟的技術，其為醫學及生物技術之重要技術，其反應過程主要有三個階段：「變性反應（Denaturation）」、「引子黏和反應（Primer Annealing）」以及「延展反應（Extension）」，其中這三個階段所需要的反應溫度皆不相同。現今商業化之PCR設備，所需反應樣本包含欲擴增之模板DNA、與模板DNA各股上特定序列互補之寡核苷酸引子對、熱安定性DNA聚合酶、以及去氧核苷三磷酸(dNTP)。PCR設備藉由反覆加熱與冷卻反應樣本，使反應樣本在三種不同溫度間循環，藉以擴增模板DNA核酸序列之特定部分。

    PCR第一個步驟為變性反應，其為將反應樣本加熱至高溫，以讓雙股之模板DNA分離成為單股DNA，典型地變性反應之溫度為介於90℃至95℃之範圍。

    PCR第二個步驟為引子結合反應，其為先將分離成為單股DNA的反應樣本冷卻至較低溫度，以讓引子與第一個步驟形成之單股DNA結合，而形成DNA與引子之複合物，典型地引子結合反應之溫度係依據所用引子之解鏈溫度(melting temperature, Tm)而選擇，通常介於35℃至65℃之範圍。

    PCR第三個步驟為延展反應，其為將形成DNA與引子的複合物的反應樣本維持於適當溫度，藉由DNA聚合酶的作用，使引子得以延展，形成與模板DNA各股互補的新單股DNA，典型聚合反應之溫度為72℃。

    因此由上述三階段組成的每一次循環，可以複製兩倍的模板DNA，將包含變性反應、引子結合反應及延展反應等三個溫度各異之步驟的PCR循環重複約20至40次，可生產出數百萬個標的核酸序列之複製物。

    請參閱「圖1」與「圖2」所示，目前另一較省成本的技術為熱對流PCR(CPCR)，習用熱對流PCR的反應樣本為裝填入圓形的毛細管1中，複數個毛細管1整齊排列於一裝設有加熱器(圖未示)與冷卻裝置(圖未示)的試管座2上，其中由熱對流驅動之反應樣本，藉由加熱器與冷卻裝置的作用，於該毛細管1內形成循環流動。因此毛細管1各區域具不同的溫度，而當反應樣本在各區域間循環時，PCR的三個步驟可依序並重複地發生。但加熱器僅設置於該毛細管1之一端而進行加熱升溫，毛細管1的其他部位會因為空氣對流狀況的不同以及當時外在環境溫度的變化而無法有效控制溫度於引子結合反應及延展反應所需的溫度，造成聚合酶連鎖反應的速度無法有效提升的問題。

    本發明之主要目的，在於解決熱對流方式之PCR反應因毛細管各部位之溫度穩定性不足而使效率下降之問題。

    為達上述目的，本發明提供一種聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，包含有以下步驟：

    一準備步驟，將一反應樣品置入一反應試管，並該反應試管的一端固定於一加熱座上，而使該加熱座內之一主要加熱件之位置對應該反應試管的一底部，且將一輔助加熱件與該主要加熱件間隔一距離而對應至該反應試管的一中間段；

    一加溫步驟，提升該主要加熱件之溫度並加熱至一變性溫度，且使該輔助加熱件升溫至一輔助加熱溫度，該輔助加熱溫度小於該變性溫度；及

    一連鎖反應步驟，控制該主要加熱件維持於該變性溫度，以進行連鎖反應。

    由上述說明可知，本發明利用該加溫步驟分別對該主要加熱件以及該輔助加熱件加熱至變性溫度以及輔助加熱溫度，而可分別控制該反應試管之底部以及中間段之溫度，藉此使該反應試管內之反應樣品於穩定的溫度控制中進行變性反應、引子黏和反應以及延展反應，以增加聚合酶連鎖反應的速度。

    有關本發明之詳細說明及技術內容，現就配合圖式說明如下：

    請參閱「圖3」、「圖4」及「圖5」所示：本發明係為一種聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，但在說明本發明之設定方法之前，先行說明利用本發明之方法的機構，其包含有一底座10、一與該底座10連接的加熱座20、一與該加熱座20連接的輔助加熱件30、至少一反應試管40、一固定該反應試管40於該輔助加熱件30上的固定連接座50，以及一觀測模組60。該底座10包含有一光源11（於本實施例中為發光二極體），其用以照射容置於該反應試管40中的一含有螢光劑染料的反應樣品，並將螢光劑染料反應之光線送至該觀測模組60以進行後續分析。

    本發明之溫度設定方法包含有以下步驟：

    S1：一準備步驟，將該反應樣品置入該反應試管40，並該反應試管40的一端固定於該加熱座20上，而使該主要加熱件21之位置對應該反應試管40的一底部41，且將該輔助加熱件30與該主要加熱件21間隔一距離而對應至該反應試管40的一中間段42，該輔助加熱件30於本實施例中為鋁材質，可透過鋁擠形的方式製成，且透過一與該輔助加熱件30連接之溫度控制裝置70控制該輔助加熱件30之加熱溫度，其中該輔助加熱件30並未與該反應試管40連接，僅藉由控制該反應試管40週邊環境溫度的方式穩定該反應試管40之中間段42的溫度。而為了使該主要加熱件21之熱量能夠更準確的傳遞至該反應試管40，可將一高導熱件80圈繞於該反應試管40的底部41，而使該反應試管40透過該高導熱件80與該主要加熱件21接觸。

    而為了避免外界溫度的干擾，請配合參閱「圖6」所示，於準備步驟中更包含有一步驟S1A：將該反應試管40、該加熱座20以及該輔助加熱件30設置於一封閉殼體90內。

   S2：一反轉錄步驟，請配合參閱「圖7」所示，其分別顯示一主要加熱件溫度曲線101以及一輔助加熱件溫度曲線102，需說明的是，當該反應樣品為一核糖核酸（Ribonucleic Acid, RNA）樣品時才需要進行本步驟，若該反應樣品已經為去氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA）樣品，則可跳過本步驟進行下一階段。本步驟為使該主要加熱件21於一反轉錄階段t1維持在一起始溫度，並使該核糖核酸樣品轉換為去氧核糖核酸樣品，該起始溫度介於45℃至55℃之間。

    S3：一加溫步驟，於一加溫階段t2時，提升該主要加熱件21之溫度並加熱至一變性溫度，如「圖7」中之主要加熱件溫度曲線101，且使該輔助加熱件30升溫至一輔助加熱溫度，如「圖7」中之輔助加熱件溫度曲線102，該輔助加熱溫度小於該變性溫度，更精確的說，該變性溫度介於90℃～98℃之間，該輔助加熱溫度介於40℃～50℃之間。

    S4：一連鎖反應步驟，於連鎖反應階段t3時，控制該主要加熱件21維持於該變性溫度，以利進行連鎖反應，而該輔助加熱件30則維持在該輔助加熱溫度，而可得到較好的反應效果，亦即，該輔助加熱件30於步驟S3中有升溫的動作，而於進行連鎖反應時，則維持溫度不變，以利連鎖反應的進行。另一方面，請配合參閱「圖8」所顯示之主要加熱件溫度曲線101以及輔助加熱件溫度曲線102，由於該輔助加熱件30於步驟S3之加溫步驟時，已高於較佳之溫度範圍（40℃～50℃），因而可利用風扇進行降溫動作，將該輔助加熱件30之溫度控制於40℃～50℃之間，以避免反應速率的降低。輔助加熱溫度

    綜上所述，由於本發明利用該加溫步驟分別對該主要加熱件21以及該輔助加熱件30加熱至變性溫度以及輔助加熱溫度，而可分別控制該反應試管40之底部41以及中間段42之溫度，藉此使該反應試管40內之反應樣品於穩定的溫度控制中進行變性反應、引子黏和反應以及延展反應，以增加聚合酶連鎖反應的速度。因此本發明極具進步性及符合申請發明專利之要件，爰依法提出申請，祈 鈞局早日賜准專利，實感德便。

    以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者，僅爲本發明之一較佳實施例而已，當不能限定本發明實施之範圍。即凡依本發明申請範圍所作之均等變化與修飾等，皆應仍屬本發明之專利涵蓋範圍內。

習知技術：

1．．．毛細管

2．．．試管座

本發明

10．．．底座

11．．．光源

20．．．加熱座

21．．．主要加熱件

30．．．輔助加熱件

40．．．反應試管

41．．．底部

42．．．中間段

50．．．固定連接座

60．．．觀測模組

70．．．溫度控制裝置

80．．．高導熱件

90．．．封閉殼體

101．．．主要加熱件溫度曲線

102．．．輔助加熱件溫度曲線

t1．．．反轉錄階段

t2．．．加溫階段

t3．．．連鎖反應階段

圖1，係習知技術之毛細管示意圖。

圖2，係習知技術之毛細管加熱置放示意圖。

圖3，係本發明一較佳實施例之立體結構示意圖。

圖4，係本發明一較佳實施例之部分立體分解示意圖。

圖5，係本發明一較佳實施例之局部剖面示意圖。

圖6，係本發明一較佳實施例之殼體裝設示意圖。

圖7，係本發明第一實施例之溫度控制示意圖。

圖8，係本發明第二實施例之溫度控制示意圖。

10．．．底座

20．．．加熱座

30．．．輔助加熱件

40．．．反應試管

50．．．固定連接座

60．．．觀測模組

70．．．溫度控制裝置

Claims (7)

1. 一種聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，包含有以下步驟：
   一準備步驟，將一反應樣品置入一反應試管，並該反應試管的一端固定於一加熱座上，而使該加熱座內之一主要加熱件之位置對應該反應試管的一底部，且將一輔助加熱件與該主要加熱件間隔一距離而對應至該反應試管的一中間段；
   一加溫步驟，提升該主要加熱件之溫度並加熱至一變性溫度，且使該輔助加熱件升溫至一輔助加熱溫度，該輔助加熱溫度小於該變性溫度；及
   一連鎖反應步驟，控制該主要加熱件維持於該變性溫度，以進行連鎖反應。
2. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，其中該反應樣品為一核糖核酸樣品，且於該準備步驟及該加溫步驟之間更具有一反轉錄步驟：使該主要加熱件維持在一起始溫度，並使該核糖核酸樣品轉換為一去氧核糖核酸樣品。
3. 如申請專利範圍第2項所述之聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，其中該起始溫度介於45℃至55℃之間。
4. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，其中於準備步驟中，將一高導熱件圈繞於該反應試管的底部，而使該反應試管透過該高導熱件與該主要加熱件接觸。
5. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，其中於準備步驟中更包含有一步驟：將該反應試管、該加熱座以及該輔助加熱件設置於一封閉殼體內。
6. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，其中該輔助加熱溫度介於40℃～50℃之間。
7. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應的溫度設定方法，其中該變性溫度介於90℃～98℃之間。