KR102039785B1 - 핵산증폭 반응의 온도조절 방법 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 주기적인 온도 변화를 필요로 하는 핵산증폭반응과 같은 화학/생화학 반응을 위해 반응 용기 내의 시료를 빠르게 가열, 냉각하는 방법에 관한 것이다. 시료가 담긴 반응 용기를 일정 시간 동안 고온의 가열 블록과 접촉하여 시료를 가열하고, 곧바로 반응 용기를 이동하여 송풍 팬으로부터 나오는 바람과의 일정 시간 동안 접촉을 통해 시료를 냉각한다. 가열 또는 냉각 매체와의 접촉 시간을 조절하여 반응 용기의 시료 온도가 다양한 목표 온도에 빠르게 도달하도록 유도할 수 있다. 본원에 따른 방법을 통해 온도조절이 필요한 대표적인 화학/생화학 반응인 PCR (polymerase chan reaction, 중합효소연쇄반응)을 신속하게 수행하여 대량의 시료 처리가 가능하다.

Description

핵산증폭 반응의 온도조절 방법 및 그 용도 {Method of controlling reaction temperature in nucleic acid amplification reaction}
본 발명은 온도변화를 필요로 하는 화학/생화학 반응을 위해 반응 온도를 빠르게 가열, 냉각할 수 있는 기술에 관한 것이다.
세포 및 세포외에서 진행되는 화학/생화학 반응에서 목적하는 결과 수득에 영향을 미치는 결정적 요소 중의 하나는 온도이며, 구체적 반응의 종류에 따라 반복적 온도조절이 필요한 경우도 있다. 예를 들면 PCR (polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응)과 같은 대표적인 핵산증폭 방법은 생물학적 시료 등에서 특정 핵산을 선택적으로 증폭할 수 있는 기술로, 이 과정에서 시료를 포함하는 반응용액은 보통 수십 회의 반복적인 가열 및 냉각을 필요로 한다.
기존, 핵산증폭 반응에서 중요한 기술적 해결과제는 표적 검출의 특이성, 미량의 표적을 검출할 수 있는 민감도를 향상시키는 것이었다. 그러나 최근 핵산 증폭이 농업, 축산, 환경 및 의료 분야에서 대량의 샘플 처리에 사용되는 추세에 맞추어 핵산증폭의 전체 반응 시간의 단축이 중요한 해결과제로 등장하였다.
대표적인 핵산증폭 반응인 PCR은 통상 55~95℃의 온도구간에서 가열과 냉각을 약 25~40회 반복하여 표적 핵산을 증폭하게 되는데, 가열-냉각 사이클의 시간을 조절하면, 전체 반응시간을 조절할 수 있다.
종래, PCR에서 이러한 반복적인 가열/냉각을 위해, 현재 열전소자(peltier), 열풍/냉풍, 히터/송풍 등의 방법이 적용된 온도 조절 장치(PCR thermal cycler)가 이용되고 있다.
열전소자를 기반으로 한 온도 제어 기술은 현재 PCR 장치에 가장 일반적으로 사용되고 있는 기술이다. 이와 같은 장치는 반응 용기를 하나의 금속 블록에 장착/고정하고, 이 블록을 열전소자를 이용해서 반복적으로 가열 및 냉각하여 PCR 반응을 수행한다. 이 방법은 전체 구조가 복잡하지는 않지만, 정확한 온도 제어를 위해 복잡한 회로를 구성해야 하고, 하나의 블록을 반복적으로 가열 및 냉각하기 때문에, 가열/냉각원인 블록과 반응 용기 내의 시료 사이의 열교환이 일어나는 것과는 별도로, 블록이 설정된 가열/냉각 온도에 우선적으로 도달하는 시간이 반복적으로 필요하고, 이것 때문에 전체 반응의 시간이 길어지는 단점이 있다.
열풍/냉풍을 이용한 방법은 Roche사의 PCR 장비인 Lightcycler에 적용되었던 기술이다. 가열 코일을 통과하여 특정 온도에 도달한 바람이 반응 용기와 접촉하여 반응 용기 내의 시료의 온도 변화를 유도한다 (Wittwer et al., Anal Biochem. 186, 328-331, 1990; Wittwer et al., BioTechniques, 22, 176-181, 1997). 그러나, 열풍이 복수의 반응 용기와 균일하게 열교환이 일어나도록 조절하는 기술이 필요하고, 열전소자의 경우와 마찬가지로 가열원과 시료간의 열교환 시간 외에 가열 코일의 온도 변화 시간이 우선적으로 필요하여, 반응 시간 단축을 위한 빠른 온도 조절 기술과는 거리가 있다.
또 다른 방법으로, 저항 히터와 송풍을 이용한 열교환 방법이 보고된 바 있다. 이 방법은 반응 용기를 저항 히터에 밀착 고정한 상태에서 반응이 진행되는데, 히터의 온도를 올려 반응 용기 내의 시료를 가열하고, 히터 전원을 끈 상태에서 바람을 불어주어 반응 용기의 온도를 낮추는 과정을 반복한다 (,B2). 이 방법 역시 히터의 가열 시간이 반복적으로 필요하기 때문에 반응 시간 단축을 위한 빠른 온도 조절의 목적에 부합하지 않는다.
PCR 시간을 단축하는 것은 PCR 기반의 진단 방법을 현장에 적용할 수 있게 해 주어, 최근의 변종 바이러스 창궐 사태와 같은 급속히 전염되는 전염병 등에 대해 신속 대응을 가능케 하는 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 핵산증폭기술의 온도 변화 구간에서 시간 소모를 최소화하여 전체 PCR 시간을 단축할 수 있는 효과적인 온도 제어 방법 개발에 대한 요구가 높은 실정이다.
US 2002-0168299 (2002-11-14 공개) US 2003-0152492A1 (2003-08-14 공개)
본 발명의 기술적 과제는, 반복적 온도변화를 필요로 하는 핵산증폭 반응에서 반응 용기 내의 반응물을 빠르게 가열-냉각할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 제 1 온도에서 수행되는 변성 단계 및 제 2 온도에서 수행되는 교잡/신장 반응이 수 회 반복되는 핵산 증폭 반응에서 온도 조절 또는 제어방법으로, 상기 핵산 증폭 반응에 사용되는 용기를 상기 제 1 온도가 일정하게 유지되는 가열 블록과 소정의 시간 동안 접촉하여 상기 용기의 온도를 상기 제 1 온도로 가열하는 제 1 단계; 및 상기 용기와 상기 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기가 소정의 시간 동안 상온의 인위적 공기 흐름에 노출되도록 하여, 상기 용기를 제 2 온도로 냉각하는 제 2 단계를 포함하며, 상기 제 2 온도로 냉각된 용기에 대하여 상기 제 1 및 제 2 단계가 수회 반복된다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법의 상기 제 2 단계에서, 상기 가열 블록의 위치는 고정되고, 상기 용기가 상기 소정의 간격이 되도록 일정 위치까지 상기 가열 블록의 위 방향으로 이동하며, 이 경우, 상기 인위적 공기 흐름은 지속적으로 제공될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 따른 방법의 상기 제 2 단계에서 상기 용기의 위치는 고정되고, 상기 가열 블록이 상기 소정의 간격이 되도록 일정 위치까지 상기 용기의 아래 방향으로 이동하고, 이 경우, 상기 인위적 공기 흐름은 개폐장치 등을 통해 상기 가열 블록이 상기 용기로부터 소정의 간격으로 이격되었을 때만 제공될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 제 2 온도는 교잡과 신장이 중첩적으로 일어날 수 있는 온도로 특히 55도 내지 65도이다.
다른 양태에서 본원은 제1온도에서 수행되는 변성 단계, 제 2’온도에서 수행되는 교잡 단계, 및 제 2 온도에서 수행되는 신장 반응으로 구성되는 하나의 사이클이 수회 반복되는 핵산 증폭 반응에서 온도 조절방법으로,
상기 핵산 증폭 반응에 사용되는 용기를 상기 제 1 온도가 일정하게 유지되는 가열 블록과 소정의 시간 동안 접촉하여 상기 용기의 온도를 상기 제 1 온도로 가열하는 제 1 단계; 상기 용기와 상기 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기가 소정의 시간 동안 인위적 공기 흐름에 노출되도록 하여, 상기 용기를 제 2’온도로 냉각하는 제 2 단계; 및 상기 용기를 상기 가열 블록과 소정의 시간 동안 접촉하여 제 2 온도로 가열 후, 상기 가열 블록과 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기를 소정의 시간 동안 공기 중에 정치하는 제 3 단계를 포함한다.
일 구현예에서 상기 용기와 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리 되는 단계에서, 상기 가열 블록의 위치는 고정되고, 상기 용기가 상기 소정의 간격이 되도록 일정 위치까지 상기 가열 블록의 위 방향으로 이동하며, 이 경우 상기 인위적 공기 흐름은 지속적으로 제공될 수 있다.
다른 구현예에서 상기 용기와 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리되는 단계에서, 상기 용기의 위치는 고정되고, 상기 가열 블록이 상기 소정의 간격이 되도록 일정 위치까지 상기 용기의 아래 방향으로 이동하고, 이 경우, 상기 인위적 공기 흐름은 상기 가열 블록이 상기 용기로부터 소정의 간격으로 이격되었을 때만 제공될 수 있다.
상기 모든 방법에서, 상기 소정의 간격은 반응 용기가 가열블록으로부터 분리되어 충분히 냉각될 수 있는 거리로서, 냉각 장치와의 위치를 고려하여 결정될 수 있으며, 특히 0.5 내지 2cm이다.
본 발명에 따라서, 핵산증폭 반응에서 가열과 냉각을 별도의 장치를 이용하여 수행하여 반응물의 온도가 신속하게 조절될 수 있다. 즉, 반응물이 담긴 용기가 일정 온도로 유지되는 가열 블록과 접촉하여 신속히 가열되고, 소정의 온도로 가열이 충분히 이루어지면, 가열 블록에서 용기가 분리되고, 송풍 팬에서 생성된 냉각용 바람에 의해서 반응물이 신속히 냉각될 수 있다.
아울러, 사용자가 의도하는 바에 따라서 반응물의 가열 시간 및 냉각 시간을 조절하여 반응물의 온도가 다양한 목표 온도에 도달하고, 목표 온도 범위를 유지하도록 제어할 수 있다.
이에 따라서, 일정 주기로 가열과 냉각의 온도조절이 필요한 대표적인 화학/생화학 반응인 PCR(중합효소연쇄반응)을 신속하게 수행할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 장치의 예로서, 그 외관을 도식적으로 나타낸 것으로, 일 구현예에서 반응 용기(1), 가열 블록(2), 그리고 송풍 팬(3)으로 구성되며, 반응 용액이 담긴 반응 용기(1)가 가열 블록(2)과 송풍 팬(3)으로부터 발생한 바람(5)과 각각 접촉할 수 있도록 이동한다.
도 2a 및 도 2b는 본원에 따른 방법에서 가열과 냉각이 달성되는 가능한 방법을 도식적으로 나타낸 것으로, 왼쪽 도면에서 반응 용액이 담긴 반응 용기(1)는 가열 블록(2)으로 이동하고, 접촉하여 반응 용액을 가열하고, 이어서 반응 용기(1)는 송풍 팬(3) 앞으로 이동하고, 송풍 팬(3)으로부터 발생한 바람(5)과 접촉하여 반응 용액을 냉각하는 것을 나타낸다. 오른쪽 도면에서 가열은 송풍에 의해, 냉각은 블록에 의해서 달성되는 경우를 도시한 것이다.
도 3은 본원에 따른 방법을 수행하였을 때, 반응 용액의 온도 변화를 나타낸 것으로, 이러한 결과는 가열/냉각 매체와의 접촉 시간을 조절함으로써, 다양한 구간에서 온도 변화가 가능할 수 있음을 나타내는 결과이다.
도 4는 본원에 따른 방법에서 반응 용액의 온도 변화 구간이 약 65~90℃가 반복적으로 필요한 경우, 가열단계 8초, 곧바로 냉각과정 7초를 반복 수행하였을 때, 반응 용액의 온도 변화 결과를 나타낸다.
도 5는 본원에 따른 방법에서 세 종류의 온도변화가 필요한 경우 가열 단계 3초, 정치 단계 5초, 다시 가열 과정 10초 후, 냉각 과정 9초를 반복 수행하였을 때, 반응 용액의 91℃ -> 56℃ -> 72℃ -> 91℃의 온도변화를 나타낸다.
도 6은 본원에 따른 방법을 이용하여 Mycoplasma pneumonia cloned vector를 증폭한 후, 이를 melting curve 분석으로 확인한 결과로 다양한 농도의 핵산을 검출할 수 있음을 나타낸다.
도 7은 도 6에 따라 수행된 증폭 산물의 전기 영동 젤 사진으로, 목적하는 산물이 정확하게 증폭되었음을 나타낸다.
도 8은 본원에 따른 방법을 이용하여 HBV 환자 유래의 핵산 시료를 증폭한 후, 이를 melting curve 분석으로 확인한 결과로 다양한 농도의 HBV를 검출할 수 있음을 나타낸다.
도 9는 도 8에 따라 수행된 증폭 산물의 전기 영동 젤 사진으로, 목적하는 산물이 정확하게 증폭되었음을 나타낸다.
도 10은 PCR을 수행하는 두 가지 조건을 나타내는 그래프이다. (출처:. "The PCR Revolution: Basic technologies and applications" edited by Stephene A. Bustin, "Chapter 4: Rapid polymerase chain reaction and melting analysis"-Carl T. Wittwer, Randy P. Rasmussen, and Kirk M. Ririe").
본원에 따른 핵산 증폭 반응에서의 반응 용액의 온도 조절 방법은, 가열과 냉각이 별도의 수단을 이용하여 수행되는 것으로, 고온으로 유지된 가열 블록과 송풍 팬으로부터 발생한 바람 사이를 반응 용액이 담긴 반응 용기가 이동하여 가열 블록과 바람을 반복적으로 접촉하여 온도가 조절되는 것이다.
본원에 따른 방법은 주기적인 온도변화를 이용하여 목적하는 특정 부분의 핵산을 증폭하는 기술 예를 들면 PCR (Polymerase Chain Reaction)과 같은 반응에서 온도조절에 사용될 수 있다. 이러한 PCR은 일반적으로 3가지 반응 단계가 한 사이클을 구성하며, 수회, 최소 2회 이상, 최소 2회 이상 내지 50회, 최소 2회 이상 내지 최소 40회, 최소 2회 이상 내지 최소 30회를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. PCR은 미량으로 존재하는 표적을 검출 가능하도록 증폭하는 과정으로, 시료에 존재하는 표적의 양, 시료에 포함된 불순물의 정도, 검출 방법의 종류, 검출 목적에, PCR 반응에 사용되는 효소의 종류, PCR 반응 조건에 따라 다양할 수 있으며, 당업자라면, 이러한 조건을 고려하여 적절한 사이클의 횟수를 결정할 수 있을 것이다.
설명하면, 첫 번째인 변성(denaturation) 단계에서는 90℃ 이상으로 처리하여 이중가닥 형태의 핵산을 각각 단일 가닥으로 분리한다. 두 번째인 교잡(annealing) 단계는 보통 55~60℃에서 이루어지며, 이 때 두 종류의 프라이머(primer)가 상기 변성단계에서 단일가닥으로 분리된 각 핵산 가닥의 상보적인 부분에 각각 결합한다. 세 번째인 신장(extension) 단계에서는 DNA 중합효소(polymerase)가 단일가닥을 주형으로 해서 프라이머로부터 염기 단량체(dNTPs)를 사용하여 DNA를 합성하는 신장이 이루어지는데, 이 때 온도는 보통 65~75℃이다. 즉, PCR은 가열과 냉각의 온도변화를 반복하면서 통상적으로 55~95℃의 온도구간에 걸쳐 진행되며, 통상 이러한 가열-냉각 과정을 25~40회 반복하여 표적 핵산을 증폭한다. PCR 반응에서 교잡과 신장단계는 구체적 온도에 따라서 하나의 단계로 수행될 수도 있으며, 이 경우, 한 사이클은 변성 및 교잡/신장의 두 단계로 구성되며, 본원에 따른 방법은 이 모두에 적용될 수 있다.
상술한 바와 같은 PCR 방법은 온도의 상태에 따라 평형 및 동력 패러다임(kinetic paradigm) 측면에서 도 10에 기재된 바와 같은 두 가지 방식으로 나눌 수 있다. 전자는 기존에 주로 사용하던 방법으로 여기서 각 단계는 특정 온도에서 일정시간 유지되어 수행되며, 한 단계에서 다음 단계로의 전이에 따른 온도변화 구간은 반응에 고려되지 않는다. 반면 후자는 각 단계가 특정 온도에서 일정시간 유지되는 것이 아니라, 각 단계는 계속적으로 변화하는 온도에서 진행되어, 즉 각 단계의 반응은 특정 온도 범위에 걸쳐 일어나게 된다. 따라서 교잡, 신장, 변성과 같은 PCR의 각 단계의 반응 속도는 온도에 의존적일 뿐, 온도 변화 구간에서 특정 온도 한 순간에 동시에 하나 이상의 반응(변성, 교접, 신장)이 동시에 일어날 수 있다.
본원에 따른 방법은 특히 후자와 같은 방식의 PCR 반응에 최적화된 방법이다. 이러한 방법은 민감성 또는 특이성이 기존의 방법과 비교하여 다소 떨어질 수 있지만, 대량의 샘플을 신속하게 스크리닝해야 하는 응용분야에서는 매우 편리하게 이용될 수 있다.
이에 한 양태에서 본원은 제1온도에서 수행되는 변성 단계 및 제 2 온도에서 수행되는 교잡/신장 반응 단계를 포함하며, 이들 단계가 수 회 반복되는 핵산 증폭 반응에서 온도 조절방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 방법은 상기 핵산 증폭 반응에 사용되는 용기를 상기 제 1 온도가 일정하게 유지되는 가열 블록과 소정의 시간 동안 접촉하여 상기 용기의 온도를 상기 제 1 온도로 가열하는 제 1 단계; 및 상기 용기와 상기 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기가 소정의 시간 동안 인위적 공기 흐름에 노출되도록 하여, 상기 용기를 제 2 온도로 냉각하는 제 2 단계를 포함하며, 상기 제 2 온도로 냉각된 용기에 대하여 상기 제 1 및 제 2 단계가 수회 반복된다.
대안적으로 또 다른 양태에서 본원은 3 단계의 PCR 반응의 온도조절, 즉, 제 1 온도에서 수행되는 변성 단계, 제 2’온도에서 수행되는 교잡 단계 및 제 2 온도에서 수행되는 신장 단계를 한 사이클 한다.
일 구현예에서 상기 방법은 상기 핵산 증폭 반응에 사용되는 용기를 상기 제 1 온도가 일정하게 유지되는 가열 블록과 소정의 시간 동안 접촉하여 상기 용기의 온도를 상기 제 1 온도로 가열하는 제 1 단계; 및 상기 용기와 상기 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기가 소정의 시간 동안 공기에 노출되도록 하여, 상기 용기를 제 2’온도로 냉각하는 제 2 단계; 및 상기 노출된 용기를 소정의 시간 동안 공기 흐름에 노출되도록 하여, 상기 용기를 제 3 온도로 냉각하는 제 3 단계를 포함한다.
최근 스크리닝 목적을 위해 대량의 샘플이 사용되며, 이를 위해 신속한 반응이 필수적이다. 그런데 PCR 반응에서는 가열-냉각 과정에서 온도 조절이 신속한 반응을 달성하는데 핵심적인 요소이다.
본원에 따른 방법은 제 1 단계에서 반응 용액이 담긴 반응 용기는 일정 시간 동안 특정 온도로 유지되는 가열 블록과 접촉하여 반응 용액이 목적하는 변성온도에 도달할 수 있을 소정의 시간 동안 가열하고, 이어 제 2 단계에서 용기를 가열블록으로부터 분리하고 소정의 방향으로 이동한 후, 송풍 팬으로부터 발생한 인위적 공기흐름과 목적하는 냉각온도에 도달할 수 있는 소정의 시간 동안 접촉하여 반응 용액을 냉각한다. 이 때 가열 블록과의 접촉 또는 송풍 팬으로부터 발생한 바람과의 접촉 시간을 조절하여, 반응 용액의 온도가 다양한 목표 온도에 도달할 수 있도록 제어할 수 있다. 이 과정을 반복하면, 반응 용액의 온도가 특정 범위의 온도 구간을 반복하도록 조절할 수 있다.
일 구현예에서 송풍팬으로부터 발생하는 인위적 공기 흐름 즉, 바람은 상온이다. 상온의 온도가 환경마다 다소 차이가 날 수 있지만, 장치에 외기온도 측정 온도계를 부착해서 바람을 생성하는 팬의 RPM을 통해 바람의 속도를 통해 제어할 수 있다. 또한 실내에서 사용되는 경우, PCR의 온도 조건을 고려하면, 상온의 온도가 20도의 바람이나 30도의 바람이나 35도의 바람이나 PCR 온도 범위인 95도에서 55~65도까지 냉각하는 시간에 차이가 거의 없다. 반면 바람의 속도는 냉각 시간에 영향을 미칠 수 있다.
핵산 변성을 위해 98℃로 가열된 반응 용액을 일반적인 교잡/신장 온도인 65℃까지 냉각시키는데 소요되는 시간 즉 인위적 공기 흐름에 노출되는 소정의 시간은 반응 용기를 향해 분사한 바람의 속도와 관계가 있으며, 일 구현예에서 다음 식: t = 4 + 2 * e-(v-7.4)/6.2 을 통해 냉각 시간을 결정할 수 있다.
일례로 일반적인 PCR을 위한 규격 PCR 튜브를 반응용기로 사용하고, 20 uL의 반응용액을 사용하여, 도 11과 같이 98 -> 65℃로 냉각하는 경우 소요되는 시간(t)은 냉각 바람의 풍속(v)에 따라 위의 식으로부터 결정될 수 있다.
본원에서 온도는 반응용기에 담긴, 반응 용액 또는 반응물을 기준으로 한다. 하지만, 본원에 따른 방법이 사용되는 PCR의 특성상, 그 부피가 약 1 내지 50 ul로 극미량이고, 열전달이 우수한 일반적 PCR 튜브의 재질을 고려하면, 용기 온도가 용액의 온도는 차이가 없다고 할 수 있다. 따라서 본원에서 특별한 언급이 없는 한, 반응 용기의 온도는 반응물 또는 반응 용액의 온도를 칭하는 것이다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 도 1 또는 도 2에 도시된 것과 같은 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로 반응 용기(1)의 밑 부분이 가열 블록과 완전히 접촉할 수 있도록 반응 용기의 모양대로 홀이 형성된 금속재의 고온으로 가열 유지되는 가열 블록(2), 그리고 바람(4)을 불어줄 수 있도록 고안된 송풍 팬(3) 이 가열 블록 위쪽에 위치한 장치가 사용될 수 있다. 반응 용액이 담긴 반응 용기(1)가 제 1 단계에서 가열 블록(2)과 접촉하여 가열된 후에 위로 이동하여, 송풍 팬(3)으로부터 발생한 바람(4)과 각각 접촉하여 냉각된다. 이 경우 반응물의 가열 및 냉각이 매우 간단한 동작으로 달성될 수 있다. 즉, 가열시에는 반응 용기가 가열 블록에 장착되어 신속한 가열을 수행함과 동시에, 개폐 블록이 송풍 노즐을 막아서 냉각용 바람에 의한 냉각을 차단하거나, 필요한 경우, 지속적으로 바람이 생성될 수도 있다. 아울러, 냉각시에는 가열 블록이 용기로부터 이격되어 가열을 중단시킴과 동시에, 개폐 블록이 송풍 노즐로부터 이격되어 송풍 노즐이 개방됨으로써, 냉각용 바람에 의한 신속한 냉각이 이루어질 수 있다.
본원에 따른 방법의 제 1 단계는 반응 용기의 반응물의 온도를 제 1 온도로 가열하는 것을 포함한다.
본원에 따른 방법에서 반응물은 일정한 반응 용기에서 수행되며, 반응 용기는 본원에 따른 방법이 구현되는 구체적 장치의 구성에 따라 상이할 수 있으나, 예를 들면 일반적으로 PCR에 사용되는 예를 들면 100μL, 200μL 용량의 튜브, 모세관 튜브, 미세유체 채널, 박막 챔버 등이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 방법의 제 1 단계에서 제 1 온도는 핵산증폭 반응에서 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 분리하는데 충분한 온도를 의미하는 것으로, 제 1 온도는 DNA를 구성하는 염기의 조성 예를 들면 G/C 조성비, 전체 길이, 버퍼에 포함된 염의 농도 등과 같은 다양한 요인에 의해 결정될 수 있으며, 당업자라면, 반응조건 등을 고려하여 적절한 온도를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 90℃ 이상, 약 95℃이나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 방법의 제 1 단계에서 반응물의 가열은 가열블록을 사용하여 수행될 수 있으며, 특히 가열블록은 제 1 온도로 고정되어 있으며, 온도 변화를 필요로 하지 않기 때문에, 신속한 반응을 가능하게 한다. 가열블록은 앞서 언급한 바와 같이 효율적 열전달이 능하도록 예를 들면 도 1 에 도시된 바와 같은 구조로 형성된다. 블록의 가열은 당업계의 공지된 방식을 이용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면, 열전소자(peltier), 저항막 히터(resistive heater), 열선 코일(heating coil), 특정 온도의 바람, 또는 고온 또는 저온의 액체 등이 사용될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 방법에서 온도변화의 기준은 반응용액으로, 본원에 따른 방법이 사용되는 PCR의 경우, 일반적인 PCR 수행 부피인 20 uL 기준으로, 일반적으로 사용되는 폴리프로필렌 재질의 반응 용기를 사용하여, 현재 PCR을 수행하는 일반적인 조건(튜브, 부피)을 동일하게 적용하였을 때 기존의 일반적인 PCR 보다 빠르게 PCR이 가능하다. 또한, 다른 재질의 반응 용기, 또는 다른 형태(microfluics device 같은)의 반응용기, 또는 20 uL가 아닌 다른 부피의 반응용액이 적용된 경우에도 본 발명의 방법을 적용할 수 있으며, 이 경우도 기존의 가열/냉각 소스가 한 개인 펠티어 기반 온도 조절 방법과 비교하여 신속하게 진행될 수 있다.
이와 같이 다른 용기, 다른 부피가 적용되었을 경우에는 본 발명의 방법 특성 상 ramping rate(초당 온도 변화 정도)이 달라질 수 있는데, 이는 실험을 통해 부피변화 또는 재질 특성에 따른 ramping rate을 획득하여 가열/냉각 시간을 결정할 수 있다.
본원에 따른 방법의 제 1 단계에서 반응 용기는 약 100℃ 내외, 예를 들면 핵산의 변성에 필요한 온도 약 95℃ 온도로 유지되는 가열블록과 소정의 시간 동안 접촉된다. 본원에서 소정의 시간이란, 일반적인 PCR 반응에서 널리 사용되는 규격 예를 들면 폴리프로필렌 재질의 thin-wall tube (예를 들면 Thermofisher의 MicroAmp® PCR tube)의 PCR 튜브에 담긴 반응물의 온도가 가열 블록과 접촉하여 반응 용액의 이중가닥 DNA의 변성에 충분한 온도에 도달하는 시간을 지칭하는 것으로 반응용액의 부피를 반영하여 결정될 수 있으며, 당업자라면 구체적 반응조건을 고려하여 적절한 시간을 선택할 수 있을 것이다. 반응 용액의 부피 20 uL를 사용한 일 구현예에서 접촉시간은 1~15초일 수 있다.
본원에 따른 방법에서 제 1 단계 후에 반응 용기와 가열블록은 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리된다. 이 과정에서 가열블록 및/또는 반응 용기가 이동을 할 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이 가열블록이 하강하거나, 또는 가열블록은 고정되고, 반응 용기가 상방향으로 이동할 수 있다.
이격되는 간격은 특별히 제한되는 것은 아니며, 이동에 소요되는 시간으로 인해 총 반응시간에 미치는 시간은 최소화되며, 송풍기의 위치에 따라 노출에 적절한 간격이다. 가열블록의 온도가 반응 용기에 영향을 미치지 않도록 예를 들면 가열블록으로 인해 가열된 가열블록 주변의 공기로부터 충분히 이격되고, 냉각을 위해 분사되는 바람이 가열블록에 직접 도달/접촉하여 가열블록의 온도 유지에 영향을 주지 않는 간격이다. 일 구현예에서는 0.5cm 내지 2cm가 될 수 있다.
가열블록과 반응 용기가 서로 분리된 후, 반응 용기기는 제 2 단계로 냉각을 위해 인위적 바람에 소정의 시간 동안 노출되거나, 또는 대안적으로, 공기 중에 소정의 시간 동안 정치될 수 있으며, 전자는 교잡/신장을 하나의 단계로 수행하는 총 2단계의 반응, 후자는 교잡 및 신장을 분리하는 3단계의 반응에 사용된다.
본원에 따른 일 구현예에서는 교잡/신장이 하나의 단계에서 수행되며, 가열블록과 분리된 반응 용기는 인위적 공기흐름에 소정의 시간 동안 노출된다. 인위적 공기 흐름은 상온의 바람으로 모터를 구비한 팬 타입의 장치 예를 들면, 일반 냉각 팬(cooling fan), 송풍 팬(blower fan), 크로스 팬(cross fan), 압축 분사기(air compressor) 등을 통해 제공될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원의 따른 교잡/신장이 하나의 단계로 수행되는 방법의 제 2 단계에서 소정의 접촉시간은 목적하는 제 2 온도, 예를 들면 55 내지 70℃에 따라 결정된다. 본원에서 제 2 단계에서 소정의 시간이란, 반응물이 교잡/신장 반응 온도에 도달하기 위해 바람과 접촉하는 시간을 지칭하는 것으로 반응용액의 부피를 반영하여 결정될 수 있으며, 당업자라면 구체적 반응조건을 고려하여 적절한 시간을 선택할 수 있을 것이다. 반응 용액의 부피 20 uL를 사용한 일 구현예에서 접촉시간은 1~15초일 수 있다.
대안적으로 본원의 따른 다른 구현예에서는 변성, 교잡 및 신장이 개별적 반응으로 수행된다. 이 경우, 제 1 온도에서 수행되는 변성 단계 후에, 가열블록 및 반응 용기가 서로 분리된 후에, 반응 용기를 제 2’교잡 온도까지 냉각한 후, 다시 가열하여 제 2의 신장 온도까지 올린 후 반응 용기를 상온에서 일정 시간 정치키는 제 3 단계를 수행할 수 있다.
이 경우, 본원에 따른 방법은 제1온도에서 수행되는 변성 단계, 제 2’온도에서 수행되는 교잡 단계, 및 제 2 온도에서 수행되는 신장 반응으로 구성되는 하나의 사이클이 수회 반복되는 핵산 증폭 반응에서 온도 조절방법으로, 상기 핵산 증폭 반응에 사용되는 용기를 상기 제 1 온도가 일정하게 유지되는 가열 블록과 소정의 시간 동안 접촉하여 상기 용기의 온도를 상기 제 1 온도로 가열하는 제 1 단계; 상기 용기와 상기 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기가 소정의 시간 동안 인위적 공기 흐름에 노출되도록 하여, 상기 용기를 제 2’온도로 냉각하는 제 2 단계; 및 상기 용기를 상기 가열 블록과 소정의 시간동안 접촉하여 제 2 온도로 가열 후, 상기 가열 블록과 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기를 소정의 시간 동안 공기 중에 정치하는 제 3 단계를 포함한다.
상기 제 3 단계에서는 가열 블록에서 반응 용기의 온도를 신장 온도 예를 들면 72℃까지 올린 후, 가열블록과 분리하여 반응 용기를 공기 중에서 정치시키며, 교잡/신장이 하나의 단계로 수행되는 경우와 비교하여, 반응 용기는 가열블록과 2회 접촉하며, 반응 용기의 온도는 접촉시간의 변경으로 조절할 수 있다. 예를 들면 20ul를 기준으로 제 1 단계에서는 변성 온도 예를 들면 91℃를 위해, 가열 블록과 약 10초 접촉되고, 제 3 단계에서는 신장 온도 예를 들면 72℃ 가열 블록과 약 3초 접촉될 수 있다.
상기 단계에서 가열블록과 반응 용기가 서로 분리되는 단계에서 가열블록 또는 반응 용기가 이동하여, 반응 용기가 노출될 수 있으며, 이는 앞서 설명한 바와 같다. 그 외 상기 단계의 설명은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
실시예 1: 가열블록과 반응 용기의 접촉 시간 조절에 따른 반응 용액의 온도 제어
본 발명에 의한 고속 온도 조절 방법은, 반응 용액이 담긴 반응 용기를 가열 블록 또는 송풍 팬으로부터 발생한 바람과 접촉하는 시간의 조절을 통해 온도를 제어하는 것으로, 이 방법을 통해 반응 용액의 온도가 빠르게 목표 온도에 도달할 수 있도록 조절할 수 있다.
본 실시 예에서는 반응 용액이 담긴 반응 용기에 온도 측정 장치를 부착하고, 반응 용기를 가열 블록 또는 송풍 팬 앞으로 반복적으로 이동하여 각각 일정 시간 동안 가열 블록 또는 송풍 팬으로부터의 바람과 접촉하였다. 각각 접촉 시간에 따른 반응 용액의 온도 변화를 측정하였으며, 사용된 장치는 반응 용액의 조성, 반응 용기, 가열블록은 다음과 같다.
온도 측정 장치: Pico technology (UK) TC-08 thermocouple data logger + thermocouple (K type). 반응 용액: 20μL PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3 + 50 mM KCl + 2 mM MgCl2). 반응 용기: Bio-rad 0.2 mL tube strip (low profile), 가열 블록: Bio-rad c1000 thermal cycler (98℃ incubation setting), 송풍 팬: 3D Manufacture 12 V, 0.15 A, 1.8 W blower fan
그 결과 도 3과 같이 가열블록 및 냉각 매체와의 접촉 시간을 조절함으로써, 다양한 구간에서 목적하는 온도로 조절이 가능하다.
또한 도 4에 나타난 바와 같이 반복적인 온도 제어도 가능하다. 본 실시예에서는 반응 용액의 온도 변화 구간을 65~90℃로 설정하고 반응 용액이 담긴 반응 용기를 가열 블록과 8초 접촉하고, 곧바로 송풍 팬으로부터 발생한 바람과 7초 접촉하는 과정을 반복하여 반복적인 온도 제어가 가능하였다. 이때 반응 용액의 실제 온도 측정 결과는 63~89℃로 나타났다. 이때 반응 용액의 온도가 63℃에서 89℃에 도달하였다가, 다시 63℃로 돌아오는 데에 15초가 소요되며, 이를 30회 반복할 경우 7분 30초밖에 소요되지 않는다. 이와 대조적으로, 반응 용기를 한 개의 블록에 고정하고, 블록의 온도를 변화시켜 반응 용기에 담긴 시료의 가열과 냉각을 유도하는 경우, 성능이 우수한 열전소자를 사용한 장치(Bio-rad c1000)라 하더라도 같은 온도 구간을 30회 반복하는 데에 약 16분 이상, 두 배의 시간이 소요되었다.
본원에 따른 방법은, 가열 매체와 냉각 매체 사이를 반응 용기가 빠르게 이동하는 방법이기 때문에, 짧지 않은 시간이 소요되는 가열 또는 냉각 매체의 우선적인 온도 변화 시간이 필요 없어 반응 용기 내의 시료의 온도 변화를 빠르게 유도할 수 있어, 신속한 반응을 가능하게 하다.
또한, 가열 블록 및 바람과의 접촉 사이에 반응 용액이 담긴 튜브를 가열 블록으로부터 분리하되 바람과 접촉하지 않는 정지 단계를 두면, 세 단계의 온도 변화도 가능하다. 도 5는 반응 용액이 담긴 튜브를 가열 블록과 3초 접촉 후, 가열 블록으로부터 분리하여 공기 중에서 5초간 유지하고, 다시 가열 블록과 10초간 접촉하는 방식으로 가열한 경우이다. 냉각은 송풍 팬으로부터의 바람과 9초간 접촉하였다. 이와 같은 방법으로 반응 용액은 56℃(교잡), 72℃(신장), 그리고 91℃(변성)의 세 온도에 도달할 수 있다.
실시예 2. 본원에 따른 방법을 이용한 고속 PCR을 통한 표적 핵산 검출
2-1 Mycoplasma pneumonia 검출
Mycoplasma pneumonia 서열의 증폭을 위한 PCR mixture 20μL를 반응 용기에 담고, 가열 블록과 접촉 8초, 송풍 팬으로부터의 바람과 접촉 7초를 30회 반복하였으며, 반응 장치, 반응 조건, 반응물의 조성비는 다음과 같다.
반응 용기: Bio-rad 0.2 mL tube strip (low profile)
가열 블록: Bio-rad c1000 thermal cycler (98℃ incubation setting)
송풍 팬: 3D Manufacture 12 V, 0.15 A, 1.8 W blower fan
PCR mixture 조성: forward and reverse primer, dNTP, PCR buffer (iNtRon), Taq polymerase (iNtRon), target DNA (Mycoplasma pneumonia cloned vector), enhancer, evaGreen dye (Jena bioscience)
Primer 서열: 5’-CAACCTCCATGTAGCTGATAG (forward), 5’-GGTGATATCGCCAGGTAAA (reverse)
고속 PCR 조건: predenaturation 1분 (98℃), 가열 블록 (98℃) 접촉 8초 + 바람 접촉 7초, 30회 반복
Mycoplasma pneumonia target DNA는 105 ~ 101 copy를 각각 반응 튜브에 첨가하였으며, target DNA를 첨가하지 않은 NC(negative control)도 함께 테스트하였다. 고속 PCR 후, 증폭 산물은 melting curve 분석과, 전기영동으로 확인하였으며, 결과는 각각 도 6과 도 7에 있다.
도 6은 Mycoplasma pneumonia 고속 PCR의 melting curve 분석 그래프이다. Target이 들어있지 않은 NC 튜브에서는 증폭 산물이 검출되지 않았고, target의 양 10 copy부터 peak가 발생하여 104과 105 copy에서 증폭이 saturation 되었다. 도 7의 전기영동 젤 사진에서도 일치하는 결과를 얻었다.
본 실시예의 PCR을 위한 열 변환 30회에 소요된 시간은 7분 30초였으며, PCR 진행 전 predenaturation 시간 1분을 포함하여 전체 PCR에 소요된 시간은 8분 30초였다. 이는 통상의 PCR 장비를 이용한 PCR 방법이 30분 이상의 시간이 소요되는 것과 비교했을 때, 매우 빠른 시간이다.
2-2 HBV 검출
실제 HBV 환자로부터 채취한 혈청을 희석하여 다양한 농도의 HBV 혈청을 제조한 후, 각각으로부터 viral DNA를 추출하여 PCR 반응 용액과 혼합하였다. 각각 다른 농도의 viral DNA가 첨가된 PCR 반응 용액 20μL를 여러 개의 PCR 튜브가 연결된 반응 튜브 스트립에 각각 가하고 튜브 뚜껑을 닫은 후, 98℃로 가열된 가열 블록에서 1분간 predenaturation 단계를 진행하였다. 이어서 가열 블록과 접촉 8초, 송풍 팬으로부터의 바람과 접촉 7초를 35회 반복하여 HBV 진단을 위한 고속 PCR을 수행하였으며, 반응 장치, 반응 조건, 반응물의 조성비는 다음과 같다.
HBV gDNA 추출: Gene All Exgene viral DNA/RNA mini kit (128-150)
반응 튜브: Bio-rad 0.2 mL tube strip (low profile)
가열 블록: Bio-rad c1000 thermal cycler (98℃ incubation setting)
송풍 팬: 3D Manufacture 12 V, 0.15 A, 1.8 W blower fan 4개 연결 + 송풍 노즐
PCR mixture 조성: forward and reverse primer, dNTP, PCR buffer (iNtRon), Taq polymerase (iNtRon), target DNA (extracted Mycoplasma pneumonia gDNA), enhancer, evaGreen dye (Jena bioscience)
Primer 서열: 5’-GATGT’K’TCTGCGGCGTTTTATC (forward, ‘K’ = G or T), 5’-CA’M’ACGGGCAACATACCTTG (reverse, ‘M’ = A or C).
고속 PCR: predenaturation 1분 (98℃), 가열 블록 (98℃) 접촉 8초 + 바람 접촉 7초, 35회 반복
고속 PCR 후, 증폭 산물은 melting curve 분석과, 전기영동으로 확인하였으며, 결과는 각각 도 8 및 도 9에 있다.
도 8은 HBV 감염 여부를 진단하기 위한 고속 PCR 증폭 산물의 melting curve 분석 그래프이다. HBV에 감염되지 않은 정상인 시료를 추출과정을 거쳐 준비한 시료가 첨가된 NTC 튜브에서는 예상대로 HBV가 검출되지 않았다. 실제 HBV 환자로부터 채취한 시료를 희석하여 각각 viral DNA 추출 과정을 거친 시료에서는, target의 양 104 copy에서 뚜렷한 증폭 산물의 peak가 발생하였고, 시료 희석 배수가 증가함에 따라 peak 높이는 점점 낮아져서 100 copy의 HBV viral DNA를 검출할 수 있었다. 도 9의 전기영동 젤 사진에서도 일치하는 결과를 얻었다.
본 실시예의 HBV 감염 진단을 위한 고속 PCR에 소요된 시간은 8분 45초였으며, PCR 진행 전 predenaturation 시간 1분을 포함하여 전체 PCR에 소요된 시간은 9분 45초였다. 이는 통상의 thermal cycler를 이용한 HBV 검출 키트 (Abbott Realtime HBV amplification reagent)가 제안하는 일반적인 PCR 기반의 방법이 1 시간 50분 소요되는 것과 비교했을 때, 매우 빠른 시간이다.
1: 반응 용액이 담긴 conical 튜브
2: 고온으로 유지된 가열 블록
3: 송풍 팬 (blower fan)
4: 송풍 노즐
5: 바람 (인위적 공기 흐름)

Claims (14)

  1. 제 1 온도에서 수행되는 변성 단계 및 제 2 온도에서 수행되는 교잡/신장 반응이 수 회 반복되는 핵산 증폭 반응의 온도 조절방법으로,
    상기 핵산 증폭 반응에 사용되는 반응물을 포함하는 반응 용기를 상기 제 1 온도가 일정하게 유지되는 가열 블록과 소정의 시간 동안 접촉하여 상기 반응 용기의 온도를 상기 제 1 온도로 가열하는 제 1 단계; 및
    상기 제 1 단계에서 상기 반응 용기의 온도가 상기 제 1 온도에 도달됨과 동시에, 상기 용기와 상기 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기가 소정의 시간 동안 인위적 공기 흐름에 노출되도록 하여, 상기 용기를 제 2 온도로 냉각하는 제 2 단계를 포함하며,
    상기 제 2 단계에서 상기 반응 용기의 온도가 상기 제 2 온도에 도달됨과 동시에, 상기 제 2 온도로 냉각된 용기에 대하여 상기 제 1 및 제 2 단계가 수회 반복되며,
    상기 제 2 단계에서 상기 가열 블록의 위치는 고정되고, 상기 용기가 상기 소정의 간격이 되도록 일정 위치까지 상기 가열 블록의 위 방향으로 이동하며, 이 경우 상기 인위적 공기 흐름은 지속적으로 제공되며,
    또는 대안적으로 상기 제 2 단계에서, 상기 용기의 위치는 고정되고, 상기 가열 블록이 상기 소정의 간격이 되도록 일정 위치까지 상기 용기의 아래 방향으로 이동하며, 이 경우 상기 인위적 공기 흐름은 상기 가열 블록이 상기 용기로부터 소정의 간격으로 이격되었을때만 제공되는 것인, 핵산 증폭 반응에서 온도 제어 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에서,
    상기 제 2 온도에서는 55도씨 내지 70도씨이며, 그 결과 교잡과 신장이 중첩적으로 일어나는 것인, 핵산 증폭 반응에서 온도 제어 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 제 2 단계에서 소정의 시간은 t = 4 + 2 * e-(v-7.4)/6.2 으로 결정되며, 상기 t는 소정의 시간, v는 인위적 바람의 속도인, 핵산 증폭 반응에서 온도 제어 방법.
  8. 제 1 온도에서 수행되는 변성 단계, 제 2’온도에서 수행되는 교잡 단계, 및 제 2 온도에서 수행되는 신장 반응으로 구성되는 하나의 사이클이 수회 반복되는 핵산 증폭 반응에서 온도 조절방법으로,
    상기 핵산 증폭 반응에 사용되는 용기를 상기 제 1 온도가 일정하게 유지되는 가열 블록과 소정의 시간 동안 접촉하여 상기 용기의 온도를 상기 제 1 온도로 가열하는 제 1 단계;
    상기 제 1 단계에서 상기 반응 용기의 온도가 상기 제 1 온도에 도달됨과 동시에, 상기 용기와 상기 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기가 소정의 시간 동안 인위적 공기 흐름에 노출되도록 하여, 상기 용기를 제 2’온도로 냉각하는 제 2 단계; 및
    상기 제 2 단계에서 상기 반응 용기의 온도가 상기 제 2' 온도에 도달됨과 동시에, 상기 용기를 상기 가열 블록과 소정의 시간 동안 접촉하여 제 2 온도로 가열 후, 상기 반응 용기가 상기 제 2 온도에 도달됨과 동시에, 상기 가열 블록과 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리하여, 상기 분리된 용기를 소정의 시간 동안 공기 중에 정치하는 제 3 단계를 포함하며,
    상기 제 1 내지 제 3 단계가 수회 반복되고,
    상기 제 2 단계 및 제 3 단계에서 상기 용기와 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리되는 단계에서, 상기 가열 블록의 위치는 고정되고, 상기 용기가 상기 소정의 간격이 되도록 일정 위치까지 상기 가열 블록의 위 방향으로 이동하며, 이 경우 상기 인위적 공기 흐름은 지속적으로 제공되며,
    또는 대안적으로 상기 제 2 단계 및 제 3 단계에서 상기 용기와 가열 블록이 소정의 간격으로 이격되도록 서로 분리되는 단계에서, 상기 용기의 위치는 고정되고, 상기 가열 블록이 상기 소정의 간격이 되도록 일정 위치까지 상기 용기의 아래 방향으로 이동하며, 이 경우 상기 인위적 공기 흐름은 상기 가열 블록이 상기 용기로부터 소정의 간격으로 이격되었을때만 제공되는 것인, 핵산 증폭 반응에서 온도 제어 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 2 단계에서 소정의 시간은 t = 4 + 2 * e-(v-7.4)/6.2 으로 결정되며, 상기 t는 소정의 시간, v는 인위적 바람의 속도인, 핵산 증폭 반응에서 온도 제어 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 제 2 단계의 소정의 간격은 0.5 내지 2cm인, 핵산 증폭 반응에서 온도 제어 방법.
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