TW201307387A - ＴＮＦ－α結合蛋白 - Google Patents

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TW201307387A
TW201307387A TW100145384A TW100145384A TW201307387A TW 201307387 A TW201307387 A TW 201307387A TW 100145384 A TW100145384 A TW 100145384A TW 100145384 A TW100145384 A TW 100145384A TW 201307387 A TW201307387 A TW 201307387A
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TW
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seq
tnf
antibody
binding protein
human
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TW100145384A
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Chung-Ming Hsieh
Carrie Goodreau
Sahana Bose
Achim Moeller
Tariq Ghayur
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Abbott Lab
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Publication date
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Abstract

本發明提供TNF-α結合蛋白，包括結合TNF-α之嵌合抗體、CDR移植抗體及人類化抗體。結合蛋白對TNF-α具有高親和力且中和TNF-α活性。結合蛋白可為全長抗體或其TNF-α結合部分。亦描述該等結合蛋白之製備方法及使用方法。TNF-α結合蛋白適用於偵測TNF-α及抑制TNF-α活性，包括在罹患因TNF-α活性而受害之疾病或病症的人類個體中。

Description

TNF-α結合蛋白
提供TNF-α結合蛋白及其預防及/或治療諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、牛皮癬、多發性硬化及其他自體免疫疾病之急性及慢性免疫疾病的用途。
本申請案主張2010年12月8日申請之美國臨時申請案第61/420,999號的優先權。
此項技術中需要能夠結合TNF-α之改良抗體。
提供能夠結合TNF-α、能夠以高親和力結合TNF-α及能夠結合並中和TNF-α的結合蛋白、CDR移植抗體、人類化抗體及其片段之新穎家族。亦提供包含SEQ ID NO: 31-46中之任一者之胺基酸序列的能夠結合TNF-α之抗體及其抗原結合部分。
提供TNF-α結合蛋白，例如，結合TNF-α之抗體或其抗原結合部分。各種態樣係關於抗體及抗體片段，及其醫藥組合物，以及用於製備該等抗體及其片段之核酸、重組表現載體及宿主細胞。亦涵蓋使用該等結合蛋白在活體外或活體內偵測人類TNF-α、抑制人類TNF-α以及調控基因表現的方法。
除非本文另外定義，否則本文所用之科學及技術術語應具有一般技術者通常所理解之含義。術語之含義及範疇應為明確的，然而，若存在任何潛在的歧義，則本文所提供之定義優先於任何詞典或外來定義。此外，除非情形另有需要，否則單數術語應包括其複數且複數術語應包括其單數。除非另有說明，否則術語「或」包括「及/或」。術語「包括」之使用不具限制性。又，除非另有具體說明，否則諸如「要素」或「組分」之術語涵蓋包含一個單元之要素及組分與包含一個以上次單元之要素及組分。
方法及技術一般根據細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、蛋白質及核酸化學及雜交、分析化學、合成有機化學、醫學及藥物化學、藥物製備、調配以及患者之傳遞及治療技術中所熟知之習知方法進行。該等技術亦描述於本文引用之參考文獻中。如此項技術中通常已知或如本文另外描述，酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書進行。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用，意謂胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋天然或人工蛋白質、蛋白質片段，及蛋白質序列之類似物。多肽可為單體或聚合體。
術語「經分離之蛋白質」或「經分離之多肽」意謂如下蛋白質或多肽：其不與在其天然狀態中伴隨其之組分相締合，例如，其實質上不含來自相同物種之其他蛋白質或細胞組分，由來自不同物種之細胞表現，或不在自然界中出現。因此，經化學合成或在不同於天然起源之細胞的細胞系統中合成之多肽將與其天然締合組分「分離」。亦可藉由使用此項技術中所熟知之蛋白質純化技術進行分離而使蛋白實質上不含天然締合組分。
術語「回收」係指藉由例如使用此項技術中所熟知之蛋白質純化技術進行分離而使化學物質(諸如多肽)實質上不含天然締合組分之過程。
術語「人類TNF-α」(本文中縮寫為hTNF-α)包括二聚體細胞激素蛋白質。該術語包括包含三個17.5 kD TNF-α蛋白之均三聚體蛋白質。該均三聚體蛋白質稱為「TNF-α蛋白」。術語人類「TNF-α」意欲包括可由標準重組表現方法製備之重組人類TNF-α(TNF-α)。人類TNF-α之序列展示於表1中。
表1：人類TNF-α之序列
術語「生物活性」係指分子之所有固有生物性質。TNF-α之生物性質包括(但不限於)結合TNF受體。
關於抗體、蛋白質或肽與第二化學物質之相互作用的術語「特異性結合」或「特異性地結合」意謂相互作用視化學物質上特定結構(例如抗原決定子或抗原決定基)之存在而定；舉例而言，抗體識別且結合至特異性蛋白質結構而非一般蛋白質。若抗體對抗原決定基「A」具特異性，則在含有經標記「A」及抗體之反應中，含有抗原決定基A(或游離、未經標記之A)之分子的存在將減少結合於抗體之經標記A的量。
術語「結合蛋白」包括(但不限於)任何抗體或其抗原結合部分。結合蛋白亦包括保持與標靶之結合親和力的其他構築體。在一些情況下，彼等結合蛋白可具有與抗體或其抗原結合部分之結構相似性，且其亦可具有將使其與抗體或其抗原結合部分相區別之結構差異。
術語「抗體」廣泛地指包含四條多肽鏈(兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈)之任何免疫球蛋白(Ig)分子，或保留Ig分子之基本抗原決定基結合特徵之其任何功能性片段、突變體、變異體或衍生物。該等突變體、變異體或衍生物抗體型式為此項技術中所知，其非限制性實施例論述於下文。
在全長抗體中，每一重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域CL。VH區及VL區可進一步再分為高變區(稱為互補決定區(CDR))，其間穿插有較保守區(稱為構架區(FR))。每一VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、種類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。
術語抗體之「抗原結合部分」係指保留與抗原(例如hTNFα)特異性結合之能力的一或多個抗體片段。可由全長抗體之片段執行抗體之抗原結合功能。該等抗體實施例亦可為雙特異性、雙重特異性或多特異性型式；其特異性結合於兩種或兩種以上不同抗原。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段的實例包括(i)Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，其為包含由鉸鏈區處之二硫橋鍵鍵聯之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v)包含單一可變域之dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546；Winter等人，PCT公開案第WO 90/05144號)；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域(VL及VH)由獨立基因編碼，但其可使用重組方法由合成連接子接合，該連接子能夠使其呈VL區與VH區配對形成單價分子之單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，(1988) Science 242:423-426；及Huston等人，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。該等單鏈抗體(scFv)亦欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」中。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL域在單一多肽鏈上表現，但使用過短而無法使同一鏈上之兩個結構域之間配對的連接子，進而迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人，(1994) Structure 2:1121-1123)。該等抗體結合部分在此項技術中為已知的(Kontermann及Dubel編，Antibody Engineering(2001) Springer-Verlag. New York.第790頁(ISBN 3-540-41354-5))。
術語「抗體構築體」係指包含一或多個與連接子多肽或免疫球蛋白恆定域連接之抗原結合部分的多肽。連接子多肽包含兩個或兩個以上由肽鍵接合之胺基酸殘基且用於連接一或多個抗原結合部分。該等連接子多肽在此項技術中為熟知的(參見例如Holliger等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人，(1994) Structure 2:1121-1123)。免疫球蛋白恆定域係指重鏈(γ)或輕鏈(κ及δ)恆定域。人類IgG重鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列在此項技術中為已知的且呈現於表2中。
表2：人類IgG重鏈恆定域及輕鏈恆定域之序列
此外，抗體或其抗原結合部分可為藉由抗體或抗原結合部分與一或多個其他蛋白質或肽共價或非共價締合而形成之較大免疫黏附分子的一部分。該等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區來產生四聚scFv分子(Kipriyanov等人，(1995) Human Antibod. Hybridom. 6:93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C端聚組胺酸標籤來產生二價且經生物素標記之scFv分子(Kipriyanov等人，(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)。可使用習知技術自完整抗體製備諸如Fab及F(ab')2片段之抗體的抗原結合部分，諸如分別對完整抗體進行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，如本文所述，可使用標準重組DNA技術獲得抗體、其抗原結合部分及免疫黏附分子。
術語「經分離抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合hTNFα之經分離抗體實質上不含特異性結合非hTNFα之抗原的抗體)。然而，特異性結合hTNFα之經分離抗體可對其他抗原(諸如來自其他物種之TNFα分子)具有交叉反應性。此外，經分離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
術語「人類抗體」包括具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如由活體外隨機或位點特異性突變誘發或由活體內體細胞突變引入之突變)，例如在CDR中且尤其在CDR3中。然而，術語「人類抗體」不欲包括來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序列上之抗體。
術語「重組人類抗體」意欲包括由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體(進一步描述於以下章節II C中)、自重組性組合人類抗體文庫分離之抗體(Hoogenboom(1997) TIB Tech. 15:62-70；Azzazy及Highsmith(2002) Clin. Biochem. 35:425-445；Gavilondo及Larrick(2002) BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom及Chames(2000) Immunol. Today 21:371-378)、自針對人類免疫球蛋白基因進行基因轉殖之動物(例如小鼠)分離之抗體(參見例如Taylor等人，(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295；Kellermann及Green(2002) Current Opin. Biotechnol. 13:593-597；Little等人，(2000) Immunol. Today 21:364-370)，或由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體經受活體外突變誘發(或當使用針對人類Ig序列進行基因轉殖之動物時，則經受活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為儘管來源於人類生殖系VH及VL序列且與之相關，但可能天然不存在於活體內人類抗體生殖系譜系內的序列。
術語「嵌合抗體」係指包含來自一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列及來自另一物種之恆定區序列的抗體，諸如具有與人類恆定區連接之鼠類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
術語「CDR移植抗體」係指包含來自一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列，但VH及/或VL區之一或多個CDR區之序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有人類重鏈及輕鏈可變區之抗體，其中一或多個人類CDR(例如CDR3)已經鼠類CDR序列置換。
術語「CDR」係指抗體可變序列內之互補決定區。在重鏈及輕鏈之各可變區中存在三個CDR，對於各可變區指定為CDR1、CDR2及CDR3。術語「CDR集合」係指出現於抗原結合位點之單一可變區(亦即VH或VL)中之三個CDR的群組。已根據不同系統來不同地定義此等CDR之精確邊界。Kabat所述之系統(Kabat等人，(1987,1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health,Bethesda,Maryland))不僅提供適用於抗體之任何可變區之明確殘基編號系統，而且提供界定三個CDR之精確殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及同事(Chothia及Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；及Chothia等人，(1989) Nature 342:877-883)發現，Kabat CDR內之某些子部分儘管在胺基酸序列層面上具有極大差異，但採用幾乎相同之肽骨架構形。此等子部分指定為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈區及重鏈區。此等區域可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR的其他邊界已由以下描述：Padlan等人，(1995) FASEB J. 9:133-139；及MacCallum(1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-745。其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述系統之一，但仍然將與Kabat CDR重疊，惟鑒於特定殘基或殘基群組或甚至整個CDR不會顯著影響抗原結合之預測或實驗發現而可將其縮短或延長。雖然某些實施例使用Kabat或Chothia定義之CDR，但本文所用之方法可利用根據任何此等系統定義之CDR。
術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「kabat標記」在本文中可互換使用。此等術語係指對抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中相較於其他胺基酸殘基更加可變(亦即高變)之胺基酸殘基進行編號的系統(Kabat等人，(1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391；及Kabat等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)。對於重鏈可變區，高變區之範圍為CDR1之胺基酸位置31至35、CDR2之胺基酸位置50至65，及CDR3之胺基酸位置95至102。對於輕鏈可變區，高變區之範圍為CDR1之胺基酸位置24至34、CDR2之胺基酸位置50至56，及CDR3之胺基酸位置89至97。
在過去二十年間關於可變重鏈及輕鏈區之胺基酸序列之廣泛公共資料庫的成長及分析使得可瞭解可變區序列內構架區(FR)與CDR序列之間的典型邊界且使得熟習此項技術者能夠根據Kabat編號、Chothia編號或其他系統精確確定CDR。參見例如Martin,Kontermann及Dbel編，Antibody Engineering(Springer-Verlag,Berlin,2001),第31章，第432-433頁。下文提供測定可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)區之胺基酸序列內Kabat CDR之胺基酸序列的有用方法：為鑑別CDR-L1胺基酸序列：自VL區之胺基末端起始約24個胺基酸殘基；CDR-L1序列前之殘基常常為半胱胺酸(C)；CDR-L1序列後之殘基常常為色胺酸(W)殘基，通常為Trp-Tyr-Gln(W-Y-Q)，但亦可為Trp-Leu-Gln(W-L-Q)、Trp-Phe-Gln(W-F-Q)及Trp-Tyr-Leu(W-Y-L)；長度通常為10至17個胺基酸殘基。
為鑑別CDR-L2胺基酸序列：在CDR-L1末端後常常起始16個殘基；CDR-L2序列前之殘基一般為Ile-Tyr(I-Y)，但亦可為Val-Tyr(V-Y)、Ile-Lys(I-K)及Ile-Phe(I-F)；長度通常為7個胺基酸殘基。
為鑑別CDR-L3胺基酸序列：在CDR-L2末端後常常起始33個胺基酸；CDR-L3胺基酸序列前之殘基常常為半胱胺酸(C)；CDR-L3序列後之殘基常常為Phe-Gly-X-Gly(F-G-X-G)(SEQ ID NO:6)，其中X為任何胺基酸；長度通常為7至11個胺基酸殘基。
為鑑別CDR-H1胺基酸序列：自VH區之胺基末端起始約31個胺基酸殘基且半胱胺酸(C)後常常為9個殘基；CDR-H1序列前之殘基常常為Cys-X-X-X-X-X-X-X-X(SEQ ID NO:7)，其中X為任何胺基酸；CDR-H1序列後之殘基常常為Trp(W)，通常為Trp-Val(W-V)，但亦可為Trp-Ile(W-I)及Trp-Ala(W-A)；長度通常為5至7個胺基酸殘基。
為鑑別CDR-H2胺基酸序列：在CDR-H1末端後常常起始15個胺基酸殘基；CDR-H2序列前之殘基通常為Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(L-E-W-I-G)(SEQ ID NO:8)，但亦可為其他變化形式；CDR-H2序列後之殘基為Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala(K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A)；長度通常為16至19個胺基酸殘基。
為鑑別CDR-H3胺基酸序列：在CDR-H2末端後常常起始33個胺基酸殘基且在半胱胺酸(C)'後常常為3個胺基酸殘基；CDR-H3序列前之殘基常常為Cys-X-X(C-X-X)，其中X為任何胺基酸，通常為Cys-Ala-Arg(C-A-R)；CDR-H3序列後之殘基常常為Trp-Gly-X-Gly(W-G-X-G)(SEQ ID NO:9)，其中X為任何胺基酸；長度通常為3至25個胺基酸殘基。
術語「接受體」及「接受體抗體」係指提供或編碼一或多個構架區之至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或100%之胺基酸序列的抗體或核酸序列。在一些實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在另一實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼構架區及恆定區中之一或多者的抗體胺基酸或核酸序列。在一特定實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼一或多個構架區之至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或100%之胺基酸序列的人類抗體胺基酸或核酸序列。根據此實施例，接受體可含有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少10個不會出現於人類抗體之一或多個特定位置處的胺基酸殘基。接受體構架區及/或接受體恆定區可例如來源於或獲自生殖系抗體基因、成熟抗體基因、功能抗體(例如此項技術中所熟知之抗體、開發中之抗體或可購得之抗體)。
術語「典型」殘基係指CDR或構架中界定如Chothia等人，(1987) J. Mol. Biol. 196:901-907及Chothia等人，(1992) J. Mol. Biol. 227:799所定義之特定典型CDR結構的殘基。根據Chothia等人，許多抗體之CDR之關鍵部分儘管在胺基酸序列層面上具有極大差異，但具有幾乎相同之肽骨架構形。各典型結構主要指定一組使胺基酸殘基之相連區段形成環之肽骨架扭轉角。
術語「供體」及「供體抗體」係指提供一或多個CDR之抗體。在一特定實施例中，供體抗體為來自某一物種之不同於構架區所獲自或源自之抗體的抗體。在人類化抗體之情形中，術語「供體抗體」係指提供一或多個CDR之非人類抗體。
術語「構架」或「構架序列」係指可變區減去CDR之剩餘序列。因為CDR序列之準確定義可由不同系統確定，所以可相應不同地解釋構架序列之含義。六個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3以及重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區在各鏈上分成四個子區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在不指定特定子區為FR1、FR2、FR3或FR4的情況下，如其他所提及之構架區表示單一天然產生之免疫球蛋白鏈之可變區內的組合FR。FR表示四個子區之一，且FRs表示構成構架區之四個子區中之兩者或兩者以上。
此項技術中已知人類重鏈及輕鏈接受體序列。在一個實施例中，人類重鏈及輕鏈接受體序列係選自V-base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或IMGT(international ImMunoGeneTics information system)(http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/)所列出之序列。在另一實施例中，人類重鏈及輕鏈接受體序列係選自表3及表4中所述之序列。
表3：重鏈接受體序列
表4：輕鏈接受體序列
術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」係指由未經歷引起遺傳重排及突變以供特定免疫球蛋白表現之成熟過程的非淋巴樣細胞編碼之免疫球蛋白序列。(參見例如Shapiro等人，(2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200；Marchalonis等人，(2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30(2001))。各種實施例所提供之優勢之一係源於以下認識：生殖系抗體基因與成熟抗體基因相比更可能使物種中之個體所特有之基本胺基酸序列結構保守，因此當治療性地用於該物種中時不太可能被認為來自外來來源。
術語「關鍵」殘基係指可變區內對抗體、尤其人類化抗體之結合特異性及/或親和力具有較大影響之某些殘基。關鍵殘基包括(但不限於)以下一或多者：與CDR相鄰之殘基、潛在糖基化位點(可為N-糖基化位點或O-糖基化位點)、稀有殘基、能夠與抗原相互作用之殘基、能夠與CDR相互作用之殘基、典型殘基、介於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、維尼爾區(Vernier zone)內之殘基，及在可變重鏈CDR1之Chothia定義與第一重鏈構架之Kabat定義之間重疊的區域中之殘基。
術語「人類化抗體」係指包含來自非人類物種(例如小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列但其中VH及/或VL序列中之至少一部分已改變為更「類人類」，亦即與人類生殖系可變序列更相似的抗體。一類人類化抗體為CDR移植抗體，其中非人類CDR序列經引入人類VH及VL序列中以置換相應非人類構架(FR)序列。舉例而言，「人類化抗體」為抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段，其免疫特異性地結合於相關抗原且其包含實質上具有人類抗體之胺基酸序列之構架(FR)區及實質上具有非人類抗體之胺基酸序列之互補決定區(CDR)。在CDR情形中之術語「實質上」係指胺基酸序列與非人類抗體CDR之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%一致的CDR。人類化抗體包含實質上所有至少一個且通常兩個可變域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白(亦即供體抗體)之彼等CDR區且所有或實質上所有構架區為人類免疫球蛋白共同序列之彼等構架區。在一實施例中，人類化抗體亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)、通常人類免疫球蛋白之恆定區的至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變域。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈及/或人類化重鏈之人類化可變域。
人類化抗體可選自任何種類之免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE；及任何同型，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。人類化抗體可包含來自一種以上種類或同型之序列，且特定恆定域可經選擇以使用此項技術中所熟知之技術使所要效應功能最佳化。
人類化抗體之構架區及CDR區無需與親本序列精確對應，例如可藉由至少約一個胺基酸殘基之取代、***及/或缺失對供體抗體CDR或共同構架進行誘變處理，使得彼位點處之CDR或構架殘基不對應於供體抗體或共同構架。然而，在一特定實施例中，該等突變並不廣泛。通常，至少約80%、至少約85%、至少約90%及至少約95%之人類化抗體殘基將對應於親本FR及CDR序列之彼等殘基。術語「共同構架」係指共同免疫球蛋白序列中之構架區。術語「共同免疫球蛋白序列」係指由相關免疫球蛋白序列家族中最頻繁出現之胺基酸(或核苷酸)所形成之序列(參見例如Winnaker,(1987) From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany)。「共同免疫球蛋白序列」因此可包含「共同可變域」及/或「共同恆定域」。「共同可變域」又可包含一或多個「共同構架區」及/或一或多個「共同CDR」。在免疫球蛋白家族中，共同序列中之各位置係由在家族中之彼位置處最頻繁出現之胺基酸佔據。若兩個胺基酸出現頻率相同，則任一者可包括於共同序列中。
術語「維尼爾」區係指可調整CDR結構且微調與抗原之配合的構架殘基子集，如Foote及Winter(1992) J. Mol. Biol. 224:487-499所述。維尼爾區殘基形成CDR下方之層且可對CDR結構及抗體親和力產生影響。
術語「多價結合蛋白」在本說明書中用於表示包含兩個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白。在一實施例中，多價結合蛋白經工程改造以具有三個或三個以上抗原結合位點，且一般不為天然產生之抗體。術語「多特異性結合蛋白」係指能夠結合兩個或兩個以上相關或無關標靶之結合蛋白。雙重可變域(DVD)結合蛋白為包含兩個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白且為四價或多價結合蛋白。該等DVD結合蛋白可為單特異性，亦即能夠結合一種抗原；或為多特異性，亦即能夠結合兩種或兩種以上抗原。包含兩個重鏈DVD多肽及兩個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白稱為DVD-IgTM分子。DVD Ig之每一半包含重鏈DVD多肽及輕鏈DVD多肽以及兩個抗原結合位點。各結合位點包含重鏈可變域及輕鏈可變域，每個抗原結合位點總共有6個CDR與抗原結合有關。DVD結合蛋白及製備DVD結合蛋白之方法揭示於美國專利第7,612,181號中。
一個態樣係關於一種包含能夠結合TNFα之結合蛋白的DVD結合蛋白。在一實施例中,DVD結合蛋白能夠結合TNF-α及第二標靶。
術語「中和」係指當結合蛋白特異性結合細胞激素時，中和細胞激素之生物活性。在一實施例中，中和性結合蛋白為中和性抗體，其與hTNF-α之結合會抑制hTNF-α之生物活性。在一實施例中，中和性結合蛋白結合hTNF-α且使hTNF-α之生物活性降低至少約20%、至少約40%、至少約60%、至少約80%、至少約85%或85%以上。中和性結合蛋白對hTNFα生物活性之抑制可藉由量測此項技術中所熟知的hTNF-α生物活性之一或多個指標來評估。例如L929細胞上TNFα之細胞毒性的中和。
術語「活性」包括抗體對抗原之諸如結合特異性/親和力之活性，例如，結合TNF-α抗原之抗hTNF-α抗體及/或抗體之中和效能，例如抗hTNF-α抗體與hTNF-α結合會抑制hTNF-α之生物活性，例如L929細胞上TNFα之細胞毒性的中和。
術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合免疫球蛋白或T細胞受體之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基之分子的化學活性表面基團，且在某些實施例中可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。抗原決定基為抗原中由抗體結合之區域。抗原決定基因此由抗原(或其片段)中已知結合至特定結合搭配物上互補位點之區域的胺基酸殘基組成。抗原片段可含有一個以上抗原決定基。在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中優先識別其標靶抗原時，稱其特異性結合該抗原。抗原決定基因此由抗原(或其片段)中已知結合至特定結合搭配物上互補位點之區域的胺基酸殘基組成。抗原片段可含有一個以上抗原決定基。
術語「表面電漿子共振」係指藉由使用例如BIACORE系統(Biacore International AB,GE Healthcare公司(Uppsala,Sweden及Piscataway,New Jersey))偵測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化來分析即時生物特異性相互作用的光學現象。關於進一步描述，參見Jnsson等人，(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26；Jnsson等人，(1991) Biotechniques 11:620-627；Johnsson等人，(1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131；及Johnnson等人，(1991) Anal. Biochem. 198:268-277。
術語「Kon」係指如在此項技術中已知之結合蛋白(例如抗體)與抗原締合以形成例如抗體/抗原複合物之締合速率常數。「Kon」亦稱為術語「締合速率常數」或「ka」，其在本文中可互換使用。此值指示抗體與其標靶抗原之結合速率或抗體與抗原之間形成複合物之速率，亦由以下方程式所示：
抗體(「Ab」)+抗原(「Ag」)→Ab-Ag。
術語「Koff」係指如在此項技術中已知之結合蛋白(例如抗體)自例如抗體/抗原複合物解離之解離速率常數。「Koff」亦稱為術語「解離速率常數」或「kd」，其在本文中可互換使用。此值指示抗體自其標靶抗原解離或Ab-Ag複合物隨著時間流逝而分離為游離抗體及抗原之解離速率，如由以下方程式所示：
Ab+Ag←Ab-Ag。
術語「平衡解離常數」或「KD」在本文中可互換使用，係指在滴定量測中在平衡狀態下獲得之值，或藉由將解離速率常數(koff)除以締合速率常數(kon)獲得之值。締合速率常數、解離速率常數及平衡解離常數用以表示抗體對抗原之結合親和力。測定締合及解離速率常數之方法為此項技術中所熟知。使用基於螢光之技術提供高靈敏度及檢查在生理緩衝液中處在平衡狀態下之樣本的能力。可使用其他實驗方法及儀器，諸如BIACORE(生物分子相互作用分析)分析法(例如可獲自Biacore International AB,GE Healthcare公司(Uppsala,Sweden)之儀器)。另外，亦可使用KinExA(動態排除分析法(Kinetic Exclusion Assay))分析法，其可獲自Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)。
術語「經標記之結合蛋白」係指具有標記以鑑別結合蛋白之蛋白質。在一實施例中，標記為可偵測標記物，例如併入經放射性標記之胺基酸或使可由經標記之抗生蛋白偵測之生物素基部分(例如含有螢光標記物或可由光學或比色方法偵測之酶活性之抗生蛋白鏈菌素)連接至多肽。多肽之標記的實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或及153Sm)；螢光標記(例如FITC、若丹明(rhodamine)及鑭系元素磷光體)、酶標記(例如辣根過氧化酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光標記物；生物素基；由二級報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域及抗原決定基標籤)；及磁性劑，諸如釓螯合物。
術語「抗體結合物」係指與第二化學部分(諸如治療劑或細胞毒性劑)化學連接之結合蛋白(諸如抗體)。術語「劑」表示化合物、化合物之混合物、生物大分子或由生物材料製成之提取物。在一實施例中，治療劑或細胞毒性劑包括(但不限於)百日咳毒素(pertussis toxin)、紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、小紅莓(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。
術語「晶體」及「結晶化」係指以晶體形式存在之抗體或其抗原結合部分。晶體為固態物質之一種形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶體由原子、離子、分子(例如蛋白質，諸如抗體)或分子組裝體(例如抗原/抗體複合物)之規則、重複、三維陣列構成。此等三維陣列係根據在此領域中充分瞭解之特定數學關係來排列。在晶體中重複之基本單元或構建組塊稱為不對稱單元。不對稱單元以符合既定的經明確定義之晶體學對稱的排列方式重複將提供晶體之「單位晶胞」。單位晶胞藉由在所有三維中規則變換(regular translation)而重複將提供晶體。參見Giege及Ducruix(1999) Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach,第2版，第201-16頁,Oxford University Press,New York,New York。
術語「聚核苷酸」意謂兩個或兩個以上核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型之核苷酸的經修飾形式)之聚合形式。該術語包括單股及雙股形式之DNA或RNA。
術語「經分離之聚核苷酸」意謂如下聚核苷酸(例如源於基因組、cDNA或合成來源，或其組合)，其不與在自然界中與其相締合之聚核苷酸；在自然界中與其以操作方式連接之聚核苷酸；或作為較大序列之一部分存在於自然界中之聚核苷酸的全部或一部分締合。
術語「載體」係指能夠轉運已連接之另一核酸的核酸分子。一類載體為「質體」，其係指可接合其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中其他DNA區段可接合於病毒基因組中。某些載體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中之後即可整合於宿主細胞之基因組中，且藉此與宿主基因組一起被複製。此外，某些載體能夠引導其以操作方式連接之基因的表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)。一般而言，應用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，因為質體為載體之最常用形式，所以「質體」及「載體」可互換使用。然而，該等實施例意欲包括該等提供相等功能之其他形式的表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「以操作方式連接」係指組分之位置安排可以使其依其預定方式發揮作用。「以操作方式連接」至編碼序列之控制序列係在與控制序列相容之條件下達成編碼序列之表現的接合方式。「以操作方式連接」之序列包括與相關核酸鄰接之表現控制序列及具反式作用(亦即位於與相關核酸不同之核酸分子上但仍可控制相關核酸)之表現控制序列，及位於與相關核酸相同之核酸分子上但仍相隔一段距離之表現控制序列。術語「表現控制序列」係指為實現所接合編碼序列之表現及處理時所必需之聚核苷酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始序列、終止序列、啟動子序列及強化子序列；有效RNA處理信號，諸如剪接信號及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；增強轉譯效率之序列(亦即Kozak共同序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及當需要時增強蛋白質分泌之序列。該等控制序列之性質視宿主生物體而不同；在原核生物中，該等控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，該等控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括對於表現及處理必需存在的組分；且亦可包括利於其存在之其他組分，例如前導序列及融合搭配物序列。
如本文所定義之「轉型」係指外源DNA進入宿主細胞之任何過程。可使用此項技術中所熟知之各種方法，在天然或人工條件下進行轉型，例如將外來核酸序列***原核或真核宿主細胞中。該方法係基於所轉型之宿主細胞來選擇，且可包括(但不限於)病毒感染、電穿孔、脂質體轉染及粒子轟擊。該等「經轉型」細胞包括所***之DNA能夠以自主複製質體形式或作為宿主染色體之一部分而複製的經穩定轉型細胞。其亦包括在有限時間內過渡表現所***DNA或RNA的細胞。
術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)係指已引入有外源DNA之細胞。應瞭解，該等術語意欲不僅指特定個體細胞，而且指此類細胞之子代。因為某些修飾可能由於突變或環境影響而出現在繼代中，所以該子代實際上可能不與母細胞相同，但仍包括於術語「宿主細胞」之範疇內。在一實施例中，宿主細胞包括選自生物界中之任一者的原核及真核細胞。在一實施例中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。在一實施例中，宿主細胞包括(但不限於)原核細胞株大腸桿菌(E.coli)；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293及COS；昆蟲細胞株Sf9；及真菌細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
可採用標準技術進行重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養與轉型(例如電穿孔、脂質體轉染)。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書或如此項技術中通常實現或如本文所述來進行。以上技術及程序一般可根據此項技術中所熟知且如本說明書通篇引用且討論之各種一般及更特定參考文獻中所述之習知方法來進行。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。
術語「轉殖基因生物體」係指具有含轉殖基因之細胞的生物體，其中引入生物體(或生物體之祖先)中之轉殖基因表現不會於生物體中天然表現之多肽。「轉殖基因」為DNA構築體，其以穩定且可操作方式整合至可發育成轉殖基因生物體之細胞之基因組中，從而引導所編碼之基因產物在轉殖基因生物體之一或多個細胞類型或組織中表現。
術語「調控」與「調節」可互換使用，且係指相關分子之活性(例如hTNF-α之生物活性)的改變或變化。調節作用可為使相關分子之某種活性或功能之量值增大或減小。分子之例示性活性及功能包括(但不限於)結合特性、酶促活性、細胞受體活化及信號轉導。
相應地，術語「調節劑」為能夠使相關分子之活性或功能(例如hTNF-α之生物活性)改變或變化之化合物。舉例而言，與在不存在調節劑之情況下所觀察到的活性或功能之量值相比，調節劑可使分子之某種活性或功能之量值增大或減小。在某些實施例中，調節劑為抑制劑，其使分子之至少一種活性或功能之量值減小。例示性抑制劑包括(但不限於)蛋白質、肽、抗體、肽體(peptibodies)、碳水化合物或小的有機分子。肽體描述於例如WO01/83525中。
術語「促效劑」係指當與相關分子接觸時，與不存在促效劑之情況下所觀察到的活性或功能之量值相比，使分子之某種活性或功能之量值增大的調節劑。特定相關促效劑可包括(但不限於)TNF-α多肽，或與hTNF-α結合之多肽、核酸、碳水化合物或任何其他分子。
術語「拮抗劑」或「抑制劑」係指當與相關分子接觸時，與不存在拮抗劑之情況下所觀察到的活性或功能之量值相比，使分子之某種活性或功能之量值減小的調節劑。特定相關拮抗劑包括阻斷或調節人類hTNF-α之生物或免疫活性之拮抗劑。hTNF-α之拮抗劑及抑制劑可包括(但不限於)與hTNF-α結合之蛋白質、核酸、碳水化合物或任何其他分子。
術語「有效量」係指足以降低或改善病症或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；阻止病症進展；促使病症消退；阻止與病症相關之一或多種症狀復發、發展、發作或進展；偵測病症；或增強或改善另一療法(例如預防劑或治療劑)之預防或治療作用的療法之量。
術語「生物樣本」包括(但不限於)任何量之來自生物或原先為生物之物質。該等生物包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、猴、犬、兔及其他動物。該等物質包括(但不限於)血液、血清、尿液、滑液、細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾臟。
I.　結合人類TNF-α之抗體
一個態樣提供以高親和力、較慢解離速率及高中和能力與TNF結合之經分離鼠類單株抗體或其抗原結合部分。第二態樣提供結合TNF-α之嵌合抗體。第三態樣提供結合TNF-α之CDR移植抗體或其抗原結合部分。第四態樣提供結合TNF-α之人類化抗體或其抗原結合部分。在一實施例中，抗體或其部分為經分離抗體。在一實施例中，抗體為中和性人類抗TNF-α抗體。
A.　製備抗TNF-α抗體之方法
抗體可由此項技術中所知之許多技術中之任一者製備。
1.　使用融合瘤技術產生抗TNF-α單株抗體
單株抗體可使用此項技術中所知之多種技術製備，包括使用融合瘤技術、重組技術及噬菌體呈現技術或其組合。舉例而言，單株抗體可使用融合瘤技術產生，包括此項技術中已知且在例如以下參考文獻中教示之彼等技術：Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual,第2版，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1988)；Hammerling等人編，「Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas」,Research Monographs in Immunology,第3卷(J.L. Turk總編輯)(Elsevier,N.Y.,1981)。術語「單株抗體」並不限於經由融合瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指來源於單一純系(包括任何真核、原核或噬菌體純系)之抗體，而與產生其之方法無關。
使用融合瘤技術產生及篩選特定抗體之方法為常規方法且在此項技術中已為熟知。一個實施例提供產生單株抗體之方法以及由此方法產生之抗體，該方法包含培養分泌抗體之融合瘤細胞，其中，在一實施例中，融合瘤係藉由使自經抗原免疫之小鼠分離之脾細胞與骨髓瘤細胞融合且隨後在由融合產生之融合瘤中篩選分泌能夠結合多肽之抗體的融合瘤純系而產生。簡言之，可用TNF-α抗原使小鼠免疫。在一實施例中，將TNF-α抗原與佐劑一起投與以刺激免疫反應。該等佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、RIBI(胞壁醯二肽)或ISCOM(免疫刺激複合物)。該等佐劑可藉由將多肽螯合於局部沈積物中而保護其免於快速分散，或其可含有刺激宿主分泌對巨噬細胞及免疫系統之其他組分具有趨化性之因子的物質。在一實施例中，若投與多肽，則免疫時程將涉及分兩次或兩次以上投與多肽，為期數週。
用TNF-α抗原使動物免疫之後，可自動物獲得抗體及/或產生抗體之細胞。藉由將動物放血或處死而自動物獲得含有抗TNFα抗體之血清。可如自動物獲得時之原樣來使用血清，可自血清獲得免疫球蛋白部分，或可自血清純化抗TNF-α抗體。以此方式獲得之血清或免疫球蛋白為多株的，因此具有一系列不同性質。
一旦偵測到免疫反應，例如在小鼠血清中偵測到對抗原TNF-α具特異性之抗體，即採集小鼠脾臟且分離脾細胞。隨後藉由熟知技術使脾細胞與任何適合之骨髓瘤細胞(例如來自可自ATCC獲得之細胞株SP20之細胞)融合。由限制稀釋法(limited dilution)選擇及選殖融合瘤。隨後針對分泌能夠結合TNF-α之抗體的細胞，藉由此項技術中已知之方法分析融合瘤純系。可藉由用陽性融合瘤純系使小鼠免疫來產生一般含有高含量抗體之腹水。
在另一實施例中，可由經免疫之動物製備產生抗體之永生化融合瘤。免疫之後，將動物處死且如此項技術中所熟知使脾B細胞與永生化骨髓瘤細胞融合。參見例如Harlow 及Lane,同上。在一實施例中，骨髓瘤細胞不會分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性細胞株)。融合及抗生素選擇之後，使用TNF-α或其部分或表現TNF-α之細胞來篩選融合瘤。在一實施例中，使用酶聯免疫分析法(ELISA)或放射免疫分析法(RIA)來進行初始篩選。ELISA篩選之一實例提供於PCT公開案第WO 00/37504號中。
選擇產生抗TNF-α抗體之融合瘤，進行選殖，且針對所需特徵(包括穩固融合瘤生長、高抗體產量及如以下進一步討論之所需抗體特徵)進一步篩選。融合瘤可在活體內於同基因型動物中、缺乏免疫系統之動物(例如裸小鼠)中培養及擴增，或在活體外於細胞培養物中培養及擴增。選擇、選殖及擴增融合瘤之方法為一般技術者所熟知。
在一實施例中，融合瘤為如上所述之小鼠融合瘤。在另一實施例中，融合瘤係在非人類、非小鼠物種(諸如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬)中產生。在另一實施例中，融合瘤為人類融合瘤，其中人類非分泌性骨髓瘤與表現抗TNF-α抗體之人類細胞融合。
可由已知技術產生識別特異性抗原決定基之抗體片段。舉例而言，可藉由使用諸如木瓜蛋白酶(以產生Fab片段)或胃蛋白酶(以產生F(ab')2片段)之酶使免疫球蛋白分子發生蛋白水解裂解來產生Fab及F(ab')2片段。F(ab')2片段含有可變區、輕鏈恆定區及重鏈CH1域。
2.　使用SLAM產生抗TNF-α單株抗體
在另一態樣中，使用如美國專利第5,627,052號、PCT公開案第WO 92/02551號及Babcook等人，(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848中所述之在此項技術中稱為選擇淋巴細胞抗體方法(selected lymphocyte antibody method，SLAM)之程序自單一、經分離之淋巴細胞產生重組抗體。在此方法中，使用抗原特異性溶血空斑分析法來篩選分泌相關抗體之單一細胞，例如來源於經免疫動物之淋巴細胞，其中抗原TNF-α、TNF-α之次單元或其片段係使用諸如生物素之連接子與綿羊紅血球偶合且用於鑑別分泌對TNF-α具特異性之抗體的單一細胞。在鑑別相關抗體分泌細胞之後，藉由反轉錄酶-PCR自細胞取出重鏈及輕鏈可變區cDNA，且隨後可在適當免疫球蛋白恆定區(例如人類恆定區)之情形中，於哺乳動物宿主細胞(諸如COS或CHO細胞)中表現此等可變區。隨後用來源於活體內選擇之淋巴細胞之經擴增免疫球蛋白序列轉染的宿主細胞可進行進一步活體外分析及選擇(例如藉由淘選經轉染之細胞)以分離表現針對TNF-α之抗體的細胞。可諸如藉由活體外親和力成熟方法(諸如PCT公開案第WO 97/29131號及第WO 00/56772號中所述之方法)於活體外進一步處理經擴增之免疫球蛋白序列。
3.　使用轉殖基因動物產生抗TNF-α單株抗體
在另一實施例中，藉由用TNF-α抗原使包含一些或全部人類免疫球蛋白基因座之非人類動物免疫來產生抗體。在一實施例中，非人類動物為XENOMOUSE轉殖基因小鼠，其為包含人類免疫球蛋白基因座之較大片段且缺乏小鼠抗體產生之經工程改造小鼠品系。參見例如Green等人，(1994) Nature Genet. 7:13-21；及美國專利第5,916,771號；第5,939,598號；第5,985,615號；第5,998,209號；第6,075,181號；第6,091,001號；第6,114,598號及第6,130,364號。亦參見PCT公開案第WO 91/10741號；第WO 94/02602號；第WO 96/34096號；第WO 96/33735號；第WO 98/16654號；第WO 98/24893號；第WO 98/50433號；第WO 99/45031號；第WO 99/53049號；第WO 00/09560號；及第WO 00/37504號。XENOMOUSE轉殖基因小鼠產生完全人類抗體之擬似成人人類譜系，且生成抗原特異性人類單株抗體。XENOMOUSE轉殖基因小鼠經由引入人類重鏈基因座及x輕鏈基因座之百萬鹼基(megabase)大小的生殖系組態YAC片段而含有約80%之人類抗體譜系。參見Mendez等人，(1997) Nature Genet. 15:146-156；及Green及Jakobovits(1998) J. Exp. Med. 188:483-495。
4.使用重組抗體文庫產生抗TNF-α單株抗體
亦可使用活體外方法製備抗體，其中抗體文庫經篩選以鑑別具有所要結合特異性之抗體。該重組抗體文庫篩選之方法在此項技術中已為熟知且包括例如以下文獻中所述之方法：美國專利第5,223,409號；PCT公開案第WO 92/18619號、第WO 91/17271號、第WO 92/20791號、第WO 92/15679號、第WO 93/01288號、第WO 92/01047號、第WO 92/09690號、第WO 97/29131號；Fuchs等人，(1991) Bio/Technology 9:1369-1372；Hay等人，(1992)Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse等人，(1989)Science 246:1275-1281；McCafferty等人，(1990) Nature 348:552-554；Griffiths等人，(1993) EMBO J. 12:725-734；Hawkins等人，(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896；Clackson等人，(1991) Nature 352:624-628；Gram等人，(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580；Garrard等人，(1991) Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等人，(1991) Nucl. Acids Res. 19:4133-4137；及Barbas等人，(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982；及美國專利公開案第2003/0186374號。
重組抗體文庫可來自經TNF-α或TNF-α之一部分免疫之個體。或者，重組抗體文庫可來自未經處理之個體，亦即未經TNF-α免疫之個體，諸如來自未經人類TNF-α免疫之人類個體的人類抗體文庫。藉由用包含人類TNF-α之肽篩選重組抗體文庫以藉此選擇識別TNF-α之彼等抗體來選擇抗體。進行該篩選及選擇之方法在此項技術中已為熟知，諸如前一段落之參考文獻中所述。為選擇對hTNF-α具有特定結合親和力之抗體，諸如以特定koff速率常數自人類TNF-α解離之抗體，可使用此項技術所知之表面電漿子共振方法來選擇具有所要koff速率常數之抗體。為選擇對hTNF-α具有特定中和活性之抗體，諸如具有特定IC50之抗體，可使用此項技術中已知用於評估對hTNF-α活性之抑制的標準方法。
一個態樣係關於一種結合人類TNF-α之經分離抗體或其抗原結合部分。在一實施例中，抗體為中和性抗體。在多種實施例中，抗體為重組抗體或單株抗體。
舉例而言，亦可使用此項技術中所知之各種噬菌體呈現方法來產生抗體。在噬菌體呈現方法中，使功能抗體域呈現於帶有編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體粒子的表面上。詳言之，可利用該噬菌體呈現自譜系或組合抗體文庫(例如人類或鼠類)表現之抗原結合域。可利用抗原，例如使用經標記抗原或結合或捕捉於固體表面或珠粒之抗原來選擇或鑑別表現結合相關抗原之抗原結合域的噬菌體。此等方法中所用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，其包括自Fab、Fv或二硫鍵穩定之Fv抗體域與噬菌體基因III或基因VIII蛋白質重組融合之噬菌體表現的fd及M13結合域。可用於製備抗體之噬菌體呈現方法之實例包括以下文獻中所揭示之方法：Brinkmann等人，(1995) J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames等人，(1995) J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough等人，(1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic等人，(1997) Gene 1879-18；Burton等人，(1994) Adv. Immunol. 57:191-280；PCT申請案第PCT/GB91/01134號；PCT公開案第WO 90/02809號；第WO 91/10737號；第WO 92/01047號；第WO 92/18619號；第WO 93/11236號；第WO 95/15982號；第WO 95/20401號；及美國專利第5,698,426號；第5,223,409號；第5,403,484號；第5,580,717號；第5,427,908號；第5,750,753號；第5,821,047號；第5,571,698號；第5,427,908號；第5,516,637號；第5,780,225號；第5,658,727號；第5,733,743號及第5,969,108號。
在噬菌體選擇之後，可自噬菌體分離抗體編碼區且將其用於產生包括人類抗體或任何其他所要抗原結合片段之完整抗體，且於任何所要宿主(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌)中表現，如例如本文中所詳述。舉例而言，亦可使用此項技術中所知之方法來利用重組產生Fab、Fab'及F(ab')2片段之技術，諸如PCT公開案第WO 92/22324號；Mullinax等人，(1992) BioTechniques 12(6):864-869；Sawai等人，(1995) Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34；及Better等人，(1988) Science 240:1041-1043中所揭示之方法。可用於產生單鏈Fv及抗體之技術的實例包括美國專利第4,946,778號及第5,258,498號；Huston等人，(1991) Methods Enzymol. 203:46-88；Shu等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999；及Skerra等人，(1988) Science 240:1038-1041中所述之技術。
替代藉由噬菌體呈現來篩選重組抗體文庫，可應用此項技術中已知用於篩選較大組合文庫之其他方法來鑑別本發明之雙重特異性抗體。如PCT公開案第WO 98/31700號及Roberts及Szostak(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302中所述，一類替代表現系統為重組抗體文庫表現為RNA-蛋白質融合體之表現系統。在此系統中，藉由在活體外轉譯於3'末端處帶有嘌呤黴素、肽基接受體抗生素之合成mRNA而在mRNA與其編碼之肽或蛋白質之間形成共價融合體。因此，可基於所編碼之肽或蛋白質(例如抗體或其部分)之性質(諸如抗體或其部分與雙重特異性抗原之結合)，自mRNA之複雜混合物(例如組合文庫)增濃特異性mRNA。可由如上所述之重組方式(例如在哺乳動物宿主細胞中)表現自篩選該等文庫所回收之編碼抗體或其部分之核酸序列，且此外可藉由對向最初選擇之序列中引入突變之mRNA-肽融合體進行更多輪篩選或藉由如上所述之用於重組抗體之活體外親和力成熟之其他方法來進行進一步親和力成熟。
在另一方法中，亦可使用此項技術中所知之酵母呈現方法來產生抗體。在酵母呈現方法中，使用遺傳方法將抗體域繫栓(tether)至酵母細胞壁且使其呈現於酵母表面上。詳言之，可利用該酵母呈現自譜系或組合抗體文庫(例如人類或鼠類)表現之抗原結合域。可用於製備抗體之酵母呈現方法之實例包括美國專利第6,699,658號中所揭示之方法。
B.　產生重組TNF-α抗體
可由此項技術中所知之許多技術中之任一者來產生該等抗體。舉例而言，自宿主細胞表現，其中藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。各種形式之術語「轉染」意欲涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。儘管有可能在原核或真核宿主細胞中表現該等抗體，但在一實施例中，因為該等真核細胞(且尤其哺乳動物細胞)與原核細胞相比更可能組裝且分泌經適當摺疊且具免疫活性之抗體，所以於哺乳動物宿主細胞中表現抗體。
表現重組抗體之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括Urlaub及Chasin(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中所述之dhfr-CHO細胞，其與DHFR可選擇標記物一起使用，如例如Kaufman及Sharp(1982) J. Mol. Biol. 159:601-621中所述)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞持續足以允許抗體在宿主細胞中表現或允許抗體分泌至宿主細胞所生長之培養基中之時段來產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基中回收抗體。
亦可使用宿主細胞產生功能抗體片段，諸如Fab片段或scFv分子。應瞭解，上述程序之變更處於實施例之範疇內。舉例而言，可能需要用編碼抗體之輕鏈及/或重鏈之功能片段的DNA轉染宿主細胞。亦可使用重組DNA技術移除一些或全部編碼並非結合相關抗原所必需之輕鏈及重鏈中之一或兩者的DNA。該等抗體亦涵蓋自該等截短之DNA分子表現之分子。另外，可藉由標準化學交聯方法使抗體與第二抗體交聯來產生雙官能抗體，其中一個重鏈及一個輕鏈為抗體且另一重鏈及另一輕鏈對非相關抗原之抗原具特異性。
在重組表現本發明之抗體或其抗原結合部分之例示性系統中，藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼抗體重鏈與抗體輕鏈之重組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體內，使抗體重鏈及輕鏈基因各自以操作方式連接至CMV強化子/AdMLP啟動子調控元件以驅動基因以高程度轉錄。重組表現載體亦帶有DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤(methotrexate)選擇/擴增來選擇已經載體轉染之CHO細胞。培養所選轉型體宿主細胞以允許表現抗體重鏈及輕鏈且自培養基中回收完整抗體。使用標準分子生物學技術製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉型體，培養宿主細胞且自培養基中回收抗體。此外提供一種藉由在適合之培養基中培養宿主細胞直至合成重組抗體來合成重組抗體之方法。該方法可進一步包含自培養基中分離該重組抗體。
1.抗hTNF-α抗體
表5為鼠類抗hTNF-α抗體之VH及VL區之胺基酸序列清單。
表5：鼠類抗hTNF-α抗體VH及VL區之胺基酸序列清單
2.　抗hTNF-α嵌合抗體
嵌合抗體為抗體之不同部分來源於不同動物物種之分子，諸如具有來源於鼠類單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區之抗體。產生嵌合抗體之方法在此項技術中為已知的且於實例部分中詳細討論。參見例如Morrison(1985) Science 229:1202；Oi等人，(1986) BioTechniques 4:214；Gillies等人，(1989) J. Immunol. Methods 125:191-202；及美國專利第5,807,715號；第4,816,567號；及第4,816,397號。另外，可使用經開發用於藉由將來自具有適當抗原特異性之小鼠抗體分子之基因與來自具有適當生物活性之人類抗體分子之基因剪接在一起來產生「嵌合抗體」之技術(Morrison等人，(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855；Neuberger等人，(1984) Nature 312:604-608；Takeda等人，(1985) Nature 314:452-454)。
在一實施例中，嵌合抗體係藉由用人類IgG1恆定區置換章節1中所述之鼠類單株抗人類TNF-α抗體之重鏈恆定區而產生。
3.　抗TNF-α CDR移植抗體
CDR移植抗體包含來自人類抗體之重鏈及輕鏈可變區序列，其中VH及/或VL之一或多個CDR區經鼠類抗體之CDR序列置換。來自任何人類抗體之構架序列可充當CDR移植之模板。然而，此類構架上之直接鏈置換通常導致與抗原之結合親和力有一定損失。人類抗體與初始鼠類抗體之同源性愈高，鼠類CDR與人類構架之組合向CDR中引入可降低親和力之畸變的可能性會愈小。因此，在一實施例中，經選擇以置換除CDR以外之鼠類可變構架之人類可變構架與鼠類抗體可變區構架具有至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、約100%之序列一致性。產生CDR移植抗體之方法在此項技術中為已知的且與該等CDR移植抗體之人類化一起詳細描述於實例部分中(亦參見歐洲專利第EP 0 239 400號；PCT公開案第WO 91/09967號；美國專利第5,225,539號；第5,530,101號；及第5,585,089號)；鑲飾(veneering)或重塑(resurfacing)(歐洲專利第EP 0 592 106號及第EP 0 519 596號；Padlan(1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等人，(1994) Protein Eng. 7(6):805-814；Roguska等人，(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973)，及鏈改組(美國專利第5,565,352號)。
特定實施例提供具有如表6中所述之VH及/或VL鏈的CDR移植抗體。
表6：CDR移植抗體
4.抗hTNF-α人類化抗體
人類化抗體為具有來自非人類物種抗體之一或多個互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架架區的抗體分子。已知人類Ig序列揭示於例如：www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm；www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html；www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-logy.html.www.immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html；www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html-；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；www.isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html；www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr:8104/；www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html；www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S. Dept. Health(1983)。該等輸入序列可用於降低免疫原性，或降低、增強或改變結合性、親和力、締合速率、解離速率、親合性(avidity)、特異性、半衰期或如此項技術中所知之任何其他適合特徵。
人類構架區中之構架殘基可經來自CDR供體抗體之相應殘基取代以改變、改良抗原結合。此等構架取代係由此項技術中所熟知之方法鑑別，例如藉由建立CDR與構架殘基之相互作用模型來鑑別對抗原結合重要之構架殘基且進行序列比較以鑑別特定位置處之異常構架殘基。參見例如美國專利第5,585,089號；Riechmann等人，(1988) Nature 332:323-327。三維免疫球蛋白模型通常可獲得且為熟習此項技術者所熟知。可獲得說明及呈現選定候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。對此等呈現之檢視得以分析殘基在候選免疫球蛋白序列發揮功能方面可能起到的作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合之能力的殘基。以此方式，可自共同及輸入序列選擇並組合FR殘基以達成所要抗體特徵，諸如對標靶抗原增加之親和力。一般而言，CDR殘基直接且最實質性地涉及影響抗原結合。可使用此項技術中所知之多種技術對抗體進行人類化，諸如(但不限於)以下文獻中所述之技術：Jones等人，(1986) Nature 321:522-525；Verhoeyen等人，(1988) Science 239:1534-1536；Sims等人，(1993) J. Immunol. 151: 2296-2308；Chothia及Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Carter等人，(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289；Presta等人，(1993) J. Immunol. 151:2623-2632；Padlan(1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等人，(1994) Protein Eng. 7(6):805-814；Roguska.等人，(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973；PCT公開案第WO 91/09967號、第WO 99/06834號(PCT/US98/16280)、第WO 97/20032號(PCT/US96/18978)、第WO 92/11272號(PCT/US91/09630)、第WO 92/03461號(PCT/US91/05939)、第WO 94/18219號(PCT/US94/01234)、第WO 92/01047號(PCT/GB91/01134)、第WO 93/06213號(PCT/GB92/01755)、第WO 90/14443號、第WO 90/14424號及第WO 90/14430號；歐洲公開案第EP 0592106號、第EP 0519596號及第EP 0239400號；美國專利第5,565,332號、第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5,814,476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號及第4,816,567號。
C.抗體及產生抗體之細胞株的製備
在一實施例中，抗TNF-α抗體展現降低或中和TNF-α活性之較高能力，例如，如此項技術中所知之若干活體外及活體內分析法中之任一者所評估。在另一實施例中，抗TNF-α抗體較佳亦展現降低或中和TNF-α活性之較高能力。
在特定實施例中，經分離抗體或其抗原結合部分結合人類TNF-α，其中抗體或其抗原結合部分以約0.1 s-1或0.1 s-1以下之koff速率常數(如表面電漿子共振所測定)自人類TNF-α解離，或以約1×10-6 M或1×10-6 M以下之IC50抑制人類TNF-α活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以約1×10-2 s-1或1×10-2 s-1以下之koff速率常數(如表面電漿子共振所測定)自人類TNF-α解離，或可以約1×10-7 M或1×10-7 M以下之IC50抑制人類TNF-α活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以約1×10-3 s-1或1×10-3 s-1以下之koff速率常數(如表面電漿子共振所測定)自人類TNF-α解離，或可以約1×10-8 M或1×10-8 M以下之IC50抑制人類TNF-α。或者，抗體或其抗原結合部分可以約1×10-4 s-1或1×10-4 s-1以下之koff速率常數(如表面電漿子共振所測定)自人類TNF-α解離，或可以約1×10-9 M或1×10-9 M以下之IC50抑制人類TNF-α活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以約1×10-5 s-1或1×10-5 s-1以下之koff速率常數(如表面電漿子共振所測定)自人類TNF-α解離，或可以約1×10-10 M或1×10-10 M以下之IC50抑制人類TNF-α活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以約1×10-5 s-1或1×10-5 s-1以下之koff速率常數(如表面電漿子共振所測定)自人類TNF-α解離，或可以約1×10-11 M或1×10-11 M以下之IC50抑制人類TNF-α活性。
在某些實施例中，抗體包含重鏈恆定區，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM 或IgD恆定區。在一實施例中，重鏈恆定區為IgG1重鏈恆定區或IgG4重鏈恆定區。此外，抗體可包含輕鏈恆定區(κ輕鏈恆定區或λ輕鏈恆定區)。在另一實施例中，抗體包含κ輕鏈恆定區。或者，抗原結合部分可為例如Fab片段或單鏈Fv片段。
置換Fc部分中之胺基酸殘基以改變抗體效應功能在此項技術中為已知的(美國專利第5,648,260號及第5,624,821號)。抗體之Fc部分介導若干重要的效應功能，例如細胞激素誘導、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。視治療目標而定，此等效應功能在一些情況下為治療性抗體所需，但在其他情況下可能不必要或甚至有害。某些人類IgG同型、尤其IgG1及IgG3經由分別與FcγR及補體Clq結合而介導ADCC及CDC。新生兒Fc受體(FcRn)為決定抗體之循環半衰期之關鍵組分。在另一實施例中，置換抗體之恆定區(例如抗體之Fc區)中之至少一個胺基酸殘基，以使抗體之效應功能改變。
一實施例提供一種經標記之結合蛋白，其中抗體或抗體部分經衍生處理或與另一功能分子(例如另一肽或蛋白質)連接。舉例而言，經標記結合蛋白可藉由使抗體或其抗原結合部分(藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以其他方式)與一或多個其他分子實體功能性連接來進行衍生處理，該或該等分子實體為諸如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙功能抗體)、可偵測劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或可介導抗體或其抗原結合部分與另一分子(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標籤)締合之蛋白質或肽。
適用於對抗體或抗原結合部分進行衍生處理之可偵測劑包括螢光化合物。例示性螢光可偵測劑包括螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素(phycoerythrin)及其類似物。亦可用可偵測酶(諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶及其類似物)對抗體進行衍生處理。當用可偵測酶對抗體進行衍生處理時，其係藉由添加使該酶用於產生可偵測反應產物之其他試劑來偵測。舉例而言，當存在可偵測劑辣根過氧化酶時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺產生有色反應產物，其為可偵測的。亦可用生物素對抗體進行衍生處理，且經由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素之結合來偵測。
另外提供一種結晶化結合蛋白。另一實施例係關於如本文所揭示之完整抗TNF-α抗體及其片段之晶體，以及包含該等晶體之調配物及組合物。在一個實施例中，結晶化結合蛋白具有與該結合蛋白之可溶性對應物相比較長之活體內半衰期。在另一實施例中，結合蛋白在結晶後保留生物活性。
結晶化結合蛋白可根據此項技術中已知且如PCT公開案第WO 02/72636號中所揭示之方法製備。
另一實施例提供一種糖基化結合蛋白，其中抗體或其抗原結合部分包含一或多個碳水化合物殘基。初期活體內蛋白質產生可經歷稱為轉譯後修飾之進一步處理。詳言之，可以酶促方式添加糖(糖基)殘基，此為一種稱為糖基化之方法。帶有共價連接之寡醣側鏈之所得蛋白質稱為糖基化蛋白或醣蛋白。蛋白質糖基化視相關蛋白質之胺基酸序列以及表現蛋白質之宿主細胞而定。不同生物體可產生不同糖基化酶(例如糖基轉移酶及糖苷酶)，且具有不同可用受質(例如核苷酸糖)。歸因於該等因素，蛋白質糖基化模式及糖基殘基之組成可視表現特定蛋白質之宿主系統而不同。適用之糖基殘基包括(但不限於)葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙醯葡糖胺及唾液酸。在一實施例中，糖基化結合蛋白包含使糖基化模式為人類模式之糖基殘基。
熟習此項技術者已知不同蛋白質糖基化可產生不同蛋白質特徵。舉例而言，在微生物宿主(諸如酵母)中產生且利用酵母內源性路徑進行糖基化之治療性蛋白質的功效與在哺乳動物細胞(諸如CHO細胞株)中表現之相同蛋白質相比可能降低。該等醣蛋白亦可在人類中具有免疫原性且在投與之後展示縮短之活體內半衰期。人類及其他動物中之特異性受體可識別特異性糖基殘基且促進蛋白質自血流快速清除。其他不良作用可包括蛋白質摺疊、溶解性、對蛋白酶之敏感度、運輸、轉運、區室化、分泌、由其他蛋白質或因子識別、抗原性或過敏原性之變化。因此，專業人員可能偏好具有特定糖基化組成及模式之治療性蛋白質，例如與在人類細胞中或在預定個體動物之物種特異性細胞中所產生者相同或至少類似之糖基化組成及模式。
表現與宿主細胞之糖基化蛋白質不同之糖基化蛋白質可藉由對宿主細胞進行遺傳修飾以表現異源糖基化酶來達成。使用此項技術中所知之技術，專業人員可生成展現人類蛋白質糖基化之抗體或其抗原結合部分。舉例而言，已對酵母菌株進行遺傳修飾以表現非天然產生之糖基化酶，使得在此等酵母菌株中產生之糖基化蛋白質(醣蛋白)展現與動物細胞、尤其人類細胞相同之蛋白質糖基化(美國專利第7,449,308號及第7,029,872號)。
此外，熟習此項技術者應瞭解，可使用經遺傳工程改造以表現各種糖基化酶之宿主細胞文庫來表現相關蛋白質，使得該文庫之成員宿主細胞產生具有變異型糖基化模式之相關蛋白質。專業人員可隨後選擇及分離具有特定新穎糖基化模式之相關蛋白質。在一實施例中，具有經特定選擇之新穎糖基化模式之蛋白質展現改良或改變之生物性質。
D.　抗TNF-α抗體之用途
倘若結合蛋白(例如抗人類TNF-α抗體或其抗原結合部分)具有結合人類TNF-α之能力，則其可用於使用此項技術中可用之一系列基於抗體之免疫偵測系統中的任一者來偵測TNF-α(例如在諸如全血、血清、血漿、尿液、唾液或組織樣本之生物樣本中)。該等免疫偵測系統包括(但不限於)免疫沈澱、免疫墨點法(西方墨點法(Western blot))、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、組織免疫組織化學、表面電漿子共振(SPR)、夾心免疫分析法、基於抗體之親和法(例如親和珠粒、親和管柱)、免疫競爭分析法、免疫晶片分析法(連接至矽晶片之結合蛋白)及螢光活化細胞分選(FACS)。對於一些免疫偵測系統，TNF-α結合蛋白(或其結合部分)(或其部分)與固體基質係使用此項技術中可用於使抗體分子連接至相同固體基質之方法連接，以使得所連接之結合蛋白在特定免疫偵測系統中使用期間保留其結合人類TNF-α之能力。該等固體基質包括(但不限於)基於纖維素之濾紙(例如纖維素、硝基纖維素、乙酸纖維素)、耐綸過濾器、塑膠表面(例如微量滴定盤、抗體浸漬棒)、玻璃基質(例如過濾器、珠粒、載片、玻璃絲)、聚合粒子(例如瓊脂糖、聚丙烯醯胺)及矽晶片。舉例而言，免疫偵測系統可用於偵測活體外樣本(例如生物樣本，諸如全血、血清、血漿、組織、尿液、唾液、組織生物檢體)中TNF-α之存在的方法中。該方法可用於診斷疾病或病症，例如免疫細胞相關病症。該方法包括：(i)使測試樣本或對照樣本與如本文所述之TNF-α結合蛋白或其TNF-α結合部分接觸；及(ii)偵測該測試樣本或該對照樣本中抗TNF-α結合蛋白(或其結合部分)與TNF-α之間複合物之形成，其中測試樣本中之複合物形成相對於對照樣本(或相對於在早先時間點所取之另一測試樣本中之複合物形成)的統計學上顯著變化指示樣本中存在TNF-α。
作為另一實例，一種方法可用於偵測活體內人類TNF-α之存在(例如，在個體內活體內顯影)。該方法可用於診斷疾病或病症，例如TNF-α相關病症。該方法包括：(i)在允許結合蛋白或其TNF-α結合部分與TNF-α結合之條件下向測試個體或對照個體投與如本文所述之TNF-α結合蛋白或其TNF-α結合部分；及(ii)偵測結合蛋白或其結合部分與TNF-α之間複合物之形成，其中測試個體中之複合物形成相對於對照個體或相對於在早先時間點測試個體中之複合物形成的統計學上顯著變化指示存在TNF-α。
偵測樣本(例如生物樣本)中之TNF-α的方法包含使樣本與本文所述之TNF-α結合蛋白(或其TNF-α結合部分)接觸及偵測與TNF-α結合之結合蛋白(或其結合部分)或未經結合之結合蛋白(或未經結合之其結合部分)，藉此偵測該樣本中之TNF-α。結合蛋白(或其部分)直接或間接經可偵測物質標記以有助於偵測經結合或未經結合之結合蛋白(或其部分)。該等可偵測物質在此項技術中為已知的，且作為非限制性實例包括各種酶、輔基(prosthetic groups)、螢光物質、發光物質及放射性物質。適合之酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、b-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶。適合之輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素。適合之螢光物質之實例包括傘酮(umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素。發光物質之實例包括魯米諾(luminol)。適合之放射性物質之實例包括放射性同位素3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho及153Sm。
替代對結合蛋白進行標記，可藉由利用經可偵測物質標記之重組人類(rh)TNF-α標準物及未經標記之TNF-α結合蛋白的競爭免疫分析法來分析樣本(例如生物流體)中之人類TNF-α。在此分析法中，將樣本、經標記之rh TNF-α標準物及TNF-α結合蛋白組合且測定與未經標記之結合蛋白結合的經標記rh TNF-α標準物的量。樣本中人類TNF-α之量與結合於抗TNF-α結合蛋白之經標記rh TNF-α標準物的量成反比。類似地，亦可藉由利用經可偵測物質標記之rhTNF-α標準物及未經標記之抗TNF-α結合蛋白的競爭免疫分析法來分析樣本中之人類TNF-α。
在一實施例中，抗體及抗原結合部分能夠在活體外及在活體內中和人類TNF-α活性。因此，該等結合蛋白可用於例如在含有hTNF-α之細胞培養物中、在人類個體中或在具有TNF-α與抗體交叉反應之其他哺乳動物個體中抑制TNF-α活性。一個實施例提供抑制hTNF-α活性之方法，其包含使hTNF-α與抗體或抗原結合部分接觸以使hTNF-α活性得以抑制。舉例而言，在含有或疑似含有hTNF-α之細胞培養物中，可將抗體或抗原結合部分添加至培養基中以抑制培養物中之hTNF-α活性。
另一實施例提供降低個體(宜來自罹患因TNF-α活性而受害之疾病或病症之個體)中hTNF-α活性的方法。提供降低罹患該疾病或病症之個體中之TNF-α活性的方法，該方法包含向該個體投與抗體或抗原結合部分以使個體中之TNF-α活性得以降低。在另一實施例中,TNF-α為人類TNF-α，且個體為人類個體。或者，個體可為表現抗體所能夠結合之TNF-α的哺乳動物。此外，個體可為已引入TNF-α之哺乳動物(例如，藉由投與TNF-α或藉由表現TNF-α轉殖基因)。結合蛋白可投與至人類個體以用於治療目的。此外，結合蛋白可投與至表現該結合蛋白所能夠結合之TNF-α的非人類哺乳動物以用於獸醫目的或用作人類疾病之動物模型。關於後者，該等動物模型可用於評估抗體之治療功效(例如，測試投藥劑量及時程)。
術語「因TNF-α活性而受害的病症」意欲包括罹患病症之個體中之TNF-α的存在已展示或疑似造成病症之病理生理異常或為促成病症惡化之因素的疾病及其他病症。因此，因TNF-α活性而受害的病症為其中降低TNF-α活性預期會減輕病症之症狀及/或進程的病症。該等病症可例如藉由罹患病症之個體之生物流體中的TNF-α濃度增加(例如個體之血清、血漿、滑液等中之TNF-α濃度增加)證實，該增加可例如使用如本文所述之抗TNF-α結合蛋白來偵測。可用該等抗體治療之病症的非限制性實例包括下文關於結合蛋白之醫藥組合物之章節中所討論的彼等病症。
E.　醫藥組合物
提供包含結合蛋白(例如抗體或其抗原結合部分)及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。包含抗體之醫藥組合物係用於(但不限於)診斷、偵測、監測、預防、抑制、治療、控制或改善病症或其一或多種症狀，及/或用於研究。在一特定實施例中，組合物包含一或多種結合蛋白。在另一實施例中，醫藥組合物包含一或多種結合蛋白及除抗體以外用於治療因TNF-α活性而受害之病症的一或多種預防劑或治療劑。在另一實施例中，預防劑或治療劑已知適用於或已用於或當前用於預防、治療、控制或改善病症或其一或多種症狀。根據此等實施例，組合物可進一步包含載劑、稀釋劑或賦形劑。
結合蛋白可併入適於投與至個體之醫藥組合物中。通常，醫藥組合物包含結合蛋白(例如抗體或其抗原結合部分)及醫藥學上可接受之載劑。術語「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上可相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。醫藥學上可接受之載劑的實例包括水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物中之一或多者，以及其組合。組合物中可較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含微量的增強抗體或其抗原結合部分之存放期或有效性之輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑。
各種傳遞系統為已知的且可用於投與一或多種結合蛋白、或一或多種抗體與適用於預防、控制、治療或改善病症或其一或多種症狀之預防劑或治療劑的組合，例如囊封於脂質體、微粒、微膠囊中；能夠表現抗體或抗體片段之重組細胞；受體介導之內飲作用(參見例如Wu及Wu(1987)J. Biol. Chem. 262:4429-4432)；作為反轉錄病毒或其他載體之一部分來構築核酸等。投與預防劑或治療劑之方法包括(但不限於)非經腸投與(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外投與、瘤內投與及黏膜投與。美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號。在一個實施例中，使用Alkermes AIR肺部藥物傳遞技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Massachusetts)來投與結合蛋白、組合療法或組合物。預防劑或治療劑可由任何適宜途徑投與，例如藉由輸注或快速注射，藉由經上皮或黏膜皮膚襯層(例如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收，且可與其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身性或局部投藥。
在一特定實施例中，可能需要將預防劑或治療劑局部投與至有治療需要之區域，此可例如藉由局部輸注、藉由注射或藉助於植入物來達成。植入物可為多孔或無孔材料，包括膜及基質，諸如賽萊膜(sialastic membrane)、聚合物、纖維基質(例如Tissuel)或膠原蛋白基質。在一個實施例中，將有效量之一或多種抗體局部投與至個體之受侵襲區域以預防、治療、控制及/或改善病症或其症狀。在另一實施例中，將有效量之一或多種抗體以及有效量之除結合蛋白以外之一或多種療法(例如一或多種預防劑或治療劑)局部投與至個體之受侵襲區域以預防、治療、控制及/或改善病症或其一或多種症狀。
在另一實施例中，可用控制釋放或持續釋放系統來傳遞預防劑或治療劑。在一個實施例中，可使用泵達成控制釋放或持續釋放(參見Langer(1990) Science 249:1527-1533；Sefton(1987) CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240；Buchwald等人，(1980) Surgery 88:507-516；Saudek等人，(1989) N. Engl. J. Med. 321:574-579)。在另一實施例中，可使用聚合材料達成療法之控制釋放或持續釋放(參見例如Medical Applications of Controlled Release,(Langer及Wise編)(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1984)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,(Smolen及Ball編)(Wiley,New York,1984)；Langer及Peppas(1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys. C23:61-126；亦參見Levy等人，(1985) Science 228:190-192；During等人，(1989) Ann. Neurol. 25:351-356；Howard等人，(1989) J. Neurosurg. 71:105-112；美國專利第5,679,377號、第5,916,597號、第5,912,015號、第5,989,463號及第5,128,326號；及PCT公開案第WO 99/15154號及第WO 99/20253號)。持續釋放調配物中所用之聚合物的實例包括(但不限於)聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一實施例中，持續釋放調配物中所用之聚合物呈惰性，不含可浸出雜質，儲存時穩定，無菌且生物可降解。在另一實施例中，控制釋放或持續釋放系統可鄰近預防性或治療性標靶置放，由此僅需要全身劑量之一部分(參見例如Goodson,J.M.,第6章，Medical Applications of Controlled Release,第II卷，Applications and Evaluation,(Langer及Wise編)(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1984),第115-138頁)。
在Langer(1990) Science 249:1527-1533之評述中討論控制釋放系統。可使用熟習此項技術者所知之任何技術來產生包含一或多種治療劑之持續釋放調配物。參見例如美國專利第4,526,938號；及PCT公開案第WO 91/05548號及第WO 96/20698號；及Ning等人，(1996) Radiother. Oncol. 39:179-189；Song等人，(1996) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50:372-377；Cleek等人，(1997) Proceed Int'1. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；及Lam等人，(1997) Proceed. Int'1. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760。
在組合物為編碼預防劑或治療劑之核酸之一特定實施例中，可藉由作為適當核酸表現載體之一部分來構築核酸且投與其以使得其變成細胞內核酸來活體內投與該核酸以促進其所編碼之預防劑或治療劑的表現，此舉之實現係例如藉由使用反轉錄病毒載體(參見美國專利第4,980,286號)，或藉由直接注射，或藉由使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic,Dupont)，或以脂質或細胞表面受體或轉染劑包覆，或藉由將其與已知進入細胞核之同源盒樣肽(homeobox-like peptide)連接而投與(參見例如Joliot等人，(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868)。或者，可將核酸引入細胞內且併入宿主細胞DNA內以便藉由同源重組表現。
醫藥組合物經調配以與其預定投藥途徑可相容。投藥途徑之實例包括(但不限於)非經腸(例如靜脈內、皮內、皮下)、經口、鼻內(例如吸入)、經皮(例如局部)、經黏膜及經直腸投藥。在一特定實施例中，根據常規程序將組合物調配成適於靜脈內、皮下、肌肉內、經口、鼻內或局部投與至人類之醫藥組合物。通常，供靜脈內投與之組合物為於無菌等張水性緩衝劑中之溶液。必要時，組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑(諸如利多卡因(lignocamne))以減輕注射部位之疼痛。
若欲局部投與組合物，則可將組合物可調配成軟膏、乳膏、經皮貼片、洗劑、凝膠、洗髮精、噴霧劑、氣霧劑、溶液、乳液之形式或熟習此項技術者所熟知之其他形式。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,第19版,(Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,1995)。對於不可噴霧之局部劑型，通常採用包含與局部施用可相容之載劑或一或多種賦形劑且動態黏度較佳大於水之黏性至半固體或固體形式。其他適合之調配物包括(但不限於)懸浮液、散劑、搽劑、油膏及其類似物。在一實施例中，該等調配物經滅菌或與助劑(例如防腐劑、穩定劑、濕潤劑、緩衝劑或鹽)混合以影響各種性質(例如滲透壓)。其他適合之局部劑型包括可噴霧氣霧劑製劑，其中例如與固體或液體惰性載劑組合之活性成分與加壓揮發性物質(例如氣態推進劑，諸如FREON)混合封裝或封裝於擠壓瓶中。必要時，亦可將增濕劑或保濕劑添加至醫藥組合物及劑型中。該等其他成分之實例在此項技術中已為熟知。
若該方法包含鼻內投與組合物，則可將組合物調配成氣霧劑形式、噴霧劑、霧狀物或滴劑形式。詳言之，預防劑或治療劑宜藉由使用適合之推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合氣體)以來自加壓包裝或噴霧器之氣霧劑噴霧呈現形式傳遞。在加壓氣霧劑之情況下，劑量單位可藉由提供閥門以傳遞經計量之量來確定。用於吸入器或吹入器中之膠囊及藥筒(由例如明膠構成)可經調配以含有化合物與適合粉末基劑(諸如乳糖或澱粉)的粉末混合物。
若該方法包含經口投藥，則可將組合物調配成口服錠劑、膠囊、扁囊劑、膠囊錠(gelcap)、溶液、懸浮液形式及其類似形式。錠劑或膠囊可由習知方式用醫藥學上可接受之賦形劑製備，該等賦形劑為諸如黏合劑(例如預膠凝化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化矽)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或乙醇酸澱粉鈉)；或濕潤劑(例如月桂基硫酸鈉)。錠劑可由此項技術中所熟知之方法包覆。供經口投與之液體製劑可採用(但不限於)溶液、糖漿或懸浮液之形式，或其可呈使用前用水或其他適合媒劑復原之乾燥產品形式。該等液體製劑可由習知方式用醫藥學上可接受之添加劑製備，該等添加劑為諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或***膠)；非水性媒劑(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)；及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。適當時，該等製劑亦可含有緩衝鹽、調味劑、著色劑及甜味劑。供經口投與之製劑宜經調配以供緩慢釋放、控制釋放或持續釋放預防劑或治療劑。
該方法可包含例如藉由使用吸入器或噴霧器來肺部投與用霧化劑調配之組合物。參見例如美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號。在一特定實施例中，使用Alkermes AIR肺部藥物傳遞技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Massachusetts)來投與抗體、組合療法及/或組合物。
該方法可包含藉由注射(例如藉由快速注射或連續輸注)投與經調配用於非經腸投與之組合物。注射用調配物可呈添加有防腐劑之單位劑型(例如於安瓿中或多劑量容器中)。組合物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，活性成分可呈使用前用適合之媒劑(例如無菌無熱原質水)復原之粉末形式。
該等方法可另外包含投與調配成儲槽式製劑之組合物。該等長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射而投與。因此，舉例而言，組合物可用適合之聚合材料或疏水性材料(例如以於可接受之油中之乳液形式)或離子交換樹脂來調配，或調配成微溶性衍生物(例如微溶性鹽)。
該等方法涵蓋投與調配成中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成之鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等之鹽。一般而言，組合物之成分各別或以混合在一起之單位劑型(例如以乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式)於指示活性劑之量的密閉容器(諸如安瓿或藥囊)中提供。當投藥模式為輸注時，組合物可用含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸注瓶分配。當投藥模式為注射時，可提供注射用無菌水或生理食鹽水之安瓿以便可在投藥前混合各成分。
在一個實施例中，將一或多種預防劑或治療劑或醫藥組合物封裝於指示藥劑之量的密閉容器(諸如安瓿或藥囊)中。在一個實施例中，一或多種預防劑或治療劑或醫藥組合物係以乾燥滅菌凍乾粉末或無水濃縮物形式提供於密閉容器中且可復原(例如用水或生理食鹽水)至適於投與至個體之濃度。在一實施例中，一或多種預防劑或治療劑或醫藥組合物係以至少約5 mg、至少約10 mg、至少約15 mg、至少約25 mg、至少約35 mg、至少約45 mg、至少約50 mg、至少約75 mg或至少約100 mg之單位劑量，以乾燥無菌凍乾粉末形式提供於密閉容器中。該等凍乾預防劑或治療劑或醫藥組合物應在2℃與8℃之間儲存於其初始容器中，且預防劑或治療劑或醫藥組合物應在復原後約1週內、約5天內、約72小時內、約48小時內、約24小時內、約12小時內、約6小時內、約5小時內、約3小時內或約1小時內投與。在一替代實施例中，一或多種預防劑或治療劑或醫藥組合物係以液體形式提供於指示藥劑之量及濃度的密閉容器中。在一實施例中，液體形式之所投與組合物係以至少約0.25 mg/ml、至少約0.5 mg/ml、至少約1 mg/ml、至少約2.5 mg/ml、至少約5 mg/ml、至少約8 mg/ml、至少約10 mg/ml、至少約15 mg/kg、至少約25 mg/ml、至少約50 mg/ml、至少約75 mg/ml或至少約100 mg/ml提供於密閉容器中。液體形式應在2℃與8℃之間儲存於其初始容器中。
結合蛋白可併入適於非經腸投與之醫藥組合物中。在一個態樣中，將結合蛋白製成含有約0.1 mg/ml至約250 mg/ml抗體之可注射溶液。該可注射溶液可由於硬質或琥珀小瓶、安瓿或預填充注射器中之液體或凍乾劑型組成。緩衝劑可為L-組胺酸(約1 mM至約50 mM)，視情況約5 mM至約10 mM，pH值為5.0至7.0(最佳約pH 6.0)。其他適合之緩衝劑包括(但不限於)丁二酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可使用濃度為約0 mM至約300 mM(例如，對於液體劑型為約150 mM)之氯化鈉來改變溶液之滲透壓。對於凍乾劑型，可包括低溫保護劑，主要為約0%至約10%蔗糖(例如約0.5%至約1.0%)。其他適合之低溫保護劑包括海藻糖及乳糖。對於凍乾劑型，可包括增積劑，主要為約1%至約10%甘露糖醇(例如約2%至約4%)。液體劑型與凍乾劑型中均可使用穩定劑，主要為約1 mM至約50 mM L-甲硫胺酸(最佳為約5 mM至約10 mM)。其他適合之增積劑包括甘胺酸、精胺酸，可以約0%至約0.05%聚山梨醇酯-80(最佳為約0.005%至約0.01%)形式包括在內。其他界面活性劑包括(但不限於)聚山梨醇酯20及BRIJ界面活性劑。
組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及栓劑。形式視預定投藥模式及治療應用而定。典型的組合物呈可注射溶液或可輸注溶液形式，諸如類似於用於以其他抗體使人類被動免疫之組合物的組合物。在一實施例中，投藥模式為非經腸(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)。在一實施例中，藉由靜脈內輸注或注射投與抗體。在另一實施例中，藉由肌肉內或皮下注射投與抗體。
治療組合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。可將組合物調配成溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於較高藥物濃度之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將活性化合物(亦即抗體或其抗原結合部分)以所需量與以上列舉之成分之一或其組合一起併入適當溶劑中，視需要繼之以過濾滅菌來製備。分散液一般係藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質及以上所列舉之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌凍乾粉末的情況下，例示性製備方法為真空乾燥及噴霧乾燥，其得到活性成分加上來自其先前經無菌過濾溶液之任何其他所要成分的粉末。可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可藉由將延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)包括於可注射組合物中來實現組合物之延長吸收。
抗體及抗原結合部分可由此項技術中所知之多種方法投與，但對於許多治療應用，例示性投藥途徑/模式為皮下注射、靜脈內注射或輸注。如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或模式視所要結果而變化。在某些實施例中，活性化合物可與保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之許多方法已取得專利或一般為熟習此項技術者所知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R. Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分可例如與惰性稀釋劑或可同化之可食用載劑一起經口投與。化合物(必要時與其他成分)亦可封裝於硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓製成錠劑，或直接併入個體之膳食中。對於經口治療性投藥，化合物可與賦形劑合併且以可攝取錠劑、經頰錠劑、糖衣錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片(wafer)及其類似物形式使用。為藉由除非經腸投藥以外之方式投與化合物，可能必需用防止化合物失活之物質包覆化合物，或將化合物與防止化合物失活之物質一起共同投與。
補充活性化合物亦可併入組合物中。在某些實施例中，結合蛋白(例如抗體或其抗原結合部分)與一或多種適用於治療因TNF-α活性而受害之病症的其他治療劑共同調配及/或共同投與。舉例而言，抗hTNF-α抗體或抗原結合部分可與一或多種結合其他標靶之其他抗體(例如結合其他細胞激素或結合細胞表面分子之抗體)一起共同調配及/或共同投與。此外，一或多種抗體可與兩種或兩種以上前述治療劑組合使用。該等組合療法宜利用較低劑量之所投與治療劑，由此避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。
在某些實施例中，針對TNF-α之抗體或其片段與此項技術中所知之半衰期延長媒劑有關聯。該等媒劑包括(但不限於)Fc域、聚乙二醇及聚葡萄糖。該等媒劑描述於例如美國專利第6,660,843號及已公開PCT公開案第WO 99/25044號中。
在一特定實施例中，投與包含編碼結合蛋白或另一預防劑或治療劑之一或多種多肽之核苷酸序列的核酸分子以經由基因療法治療、預防、控制或改善病症或其一或多種症狀。基因療法係指藉由向個體投與已表現或可表現之核酸而進行之療法。在此實施例中，核酸產生其所編碼之介導預防或治療作用之結合蛋白或預防劑或治療劑的結合多肽。
可使用此項技術中可用之任何關於基因療法之方法。關於基因療法之方法的一般評述，參見Goldspiel等人，(1993) Clin. Pharm. 12:488-505；Wu及Wu(1991) Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev(1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan(1993) Science 260:926-932；及Morgan及Anderson(1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；Robinson,C.(1993) Trends Biotechnol. 11(5):155。此項技術中通常所知之可使用重組DNA技術之方法描述於Ausubel等人(編),Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,New York,1993)；及Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,(Stockton Press,New York,1990)中。基因療法之各種方法的詳細描述揭示於US 2005/0042664中。
TNF-α在與涉及免疫及發炎要素之多種疾病相關之病理學方面起作用，該等疾病諸如自體免疫疾病，尤其與發炎相關之自體免疫疾病，包括克羅恩氏病(Crohn's disease)、牛皮癬(包括斑塊牛皮癬)、關節炎(包括類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、骨關節炎或青少年特發性關節炎)、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、僵直性脊椎炎、糖尿病(包括胰島素依賴性糖尿病或自體免疫糖尿病)、過敏症及自體免疫葡萄膜炎。因此，本文之結合蛋白可用於治療此等病症。在另一實施例中，該病症為呼吸道病症；哮喘；過敏性及非過敏性哮喘；由於感染引起之哮喘；由於感染呼吸道融合性病毒(respiratory syncytial virus，RSV)引起之哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及氣管發炎之病狀；嗜伊紅血球增多症(eosinophilia)；纖維化及過量黏液產生；囊腫性纖維化；肺纖維化；異位性病症；異位性皮炎；蕁麻疹；濕疹；過敏性鼻炎；過敏性腸胃炎；皮膚之發炎性及/或自體免疫病狀；胃腸器官之發炎性及/或自體免疫病狀；發炎性腸病(IBD)；潰瘍性結腸炎；肝臟之發炎性及/或自體免疫病狀；肝硬化；肝纖維化；由B型肝炎及/或C型肝炎病毒所引起之肝纖維化；硬皮病；腫瘤或癌症；肝細胞癌；神經膠母細胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；病毒感染；細菌感染；寄生蟲感染；HTLV-1感染；保護性第1型免疫反應之表現的抑制、在疫苗接種期間保護性第1型免疫反應之表現的抑制、神經退化性疾病、神經元再生及脊髓損傷。
TNF-α亦可在與涉及免疫及發炎要素之多種疾病相關之病理學方面起作用。此等疾病包括(但不限於)後天性免疫缺乏疾病症候群；後天性免疫缺乏相關疾病；後天性惡性貧血；急性冠狀動脈症候群；急性及慢性疼痛(不同形式之疼痛)；急性特發性多發性神經炎；與器官移植相關之急性免疫疾病；與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病；急性發炎性髓鞘脫失多神經根神經病；急性局部缺血；急性肝病；急性風濕熱；急性橫貫性脊髓炎；阿狄森氏病(Addison's disease)；成人(急性)呼吸窘迫症候群；成人斯蒂爾氏病(Still's disease)；酒精性肝硬化；酒精誘發性肝損傷；過敏性疾病；過敏症；脫髮；斑形脫髮；阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)；全身性過敏反應(anaphylaxis)；強直性脊椎炎；強直性脊椎炎相關肺病；抗磷脂抗體症候群；再生不全性貧血；動脈硬化；關節病；哮喘；動脈粥樣化疾病/動脈硬化；動脈粥樣硬化；異位性過敏症；異位性濕疹；異位性皮炎；萎縮性自體免疫甲狀腺低能症；自體免疫大皰性疾病；自體免疫皮炎；自體免疫糖尿病；與鏈球菌感染相關之自體免疫病症；自體免疫腸病；自體免疫溶血性貧血；自體免疫肝炎；自體免疫聽力喪失；自體免疫淋巴增生症候群(ALPS)；自體免疫介導性低血糖；自體免疫心肌炎；自體免疫嗜中性白血球減少症；自體免疫早發性卵巢衰竭；自體免疫血小板減少症(AITP)；自體免疫甲狀腺疾病；自體免疫葡萄膜炎；阻塞性細支氣管炎；貝西氏病(Behet's disease)；眼瞼炎；支氣管擴張症；大皰性類天疱瘡；惡病質；心血管疾病；災難性抗磷脂症候群；乳糜瀉；頸椎關節黏連；衣原體疾病(chlamydia)；膽汁鬱積；慢性活動性肝炎；慢性嗜伊紅血球性肺炎；慢性疲勞症候群；與器官移植相關之慢性免疫疾病；慢性局部缺血；慢性肝病；慢性皮膚黏膜念珠菌病；瘢痕性類天疱瘡；具有多發性硬化風險之臨床單一症候群(clinically isolated syndrome，CIS)；一般變異型免疫缺乏症(一般變異型低γ球蛋白血症)；結締組織疾病相關之間質性肺病；結膜炎；庫姆陽性溶血性貧血(Coombs positive haemolytic anaemia)；兒童期發作型精神病症；慢性阻塞性肺病(COPD)；克羅恩氏病；隱源性自體免疫肝炎；隱源性纖維性肺泡炎；淚囊炎；抑鬱症；皮炎硬皮病；皮肌炎；皮肌炎/多發性肌炎相關肺病；糖尿病性視網膜病；糖尿病；擴張型心肌病；盤狀紅斑狼瘡；椎間盤突出；椎間盤脫出；散播性血管內凝血；藥物誘發性肝炎；藥物誘發性間質性肺病；藥物誘發性免疫溶血性貧血；心內膜炎；子宮內膜異位症；內眼炎；腸病性滑膜炎；上鞏膜炎；多形性紅斑；重度多形性紅斑；女性***症；纖維化；纖維變性肺病；妊娠期類天疱瘡；巨細胞動脈炎(GCA)；絲球體腎炎；甲狀腺腫性自體免疫甲狀腺低能症(橋本氏病(Hashimoto's disease))；古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)；痛風性關節炎；移植物抗宿主疾病(GVHD)；格雷夫氏病(Grave's disease)；B群鏈球菌(group B streptococci，BGS)感染；格林-巴利症候群(Guillain-Barr syndrome，BGS)；含鐵血黃素沉著症(haemosiderosis)相關之肺病；枯草熱；心臟衰竭；溶血性貧血；亨偌-絲奇恩賴紫癜(Henoch-Schoenlein purpura)；B型肝炎；C型肝炎；休斯症候群(Hughes syndrome)；亨廷頓氏舞蹈病(Huntington's chorea)；甲狀腺機能亢進；副甲狀腺低能症；特發性白血球減少症；特發性血小板減少症；特發性帕金森氏病(Parkinson's disease)；特發性間質性肺炎；特異體質性肝病；IgE介導性過敏症；免疫溶血性貧血；包涵體肌炎；感染性疾病；感染性眼部發炎性疾病；發炎性腸病；發炎性髓鞘脫失病；發炎性心臟病；發炎性腎病；胰島素依賴性糖尿病；間質性肺炎；IPF/UIP；虹膜炎；青少年慢性關節炎；青少年惡性貧血；青少年類風濕性關節炎(JRA)；川崎氏病(Kawasaki's disease)；角膜炎；乾躁性角膜結膜炎；庫斯毛耳氏病(Kussmaul disease)或庫斯毛耳-邁爾氏病(Kussmaul-Meier disease)；蘭德里氏麻痹(Landry's paralysis)；蘭氏細胞組織球增多症(Langerhan's cell histiocytosis)；線性IgA疾病；網狀青斑；萊姆關節炎(Lyme arthritis)；淋巴細胞浸潤性肺病；黃斑變性；特發性***或NOS；惡性疾病；腎顯微性血管炎；顯微性多血管炎；混合結締組織病相關之肺病；白赫鐵列夫症(Morbus Bechterev)；運動神經元病症；黏膜類天疱瘡；多發性硬化(所有亞型：原發性進行性、繼發性進行性、復發緩解型等)；多重器官衰竭；肌痛性腦炎/皇家自由疾病(royal free disease)；重症肌無力；骨髓發育不良症候群；心肌梗塞；心肌炎；腎病症候群；神經根病症；神經病；非酒精性脂肪肝；非A非B型肝炎；視神經炎；器官移植排斥反應；骨關節炎；骨質溶解；卵巢癌；卵巢衰竭；胰腺炎；寄生蟲病；帕金森氏病；少關節型JRA；類天疱瘡；落葉型天疱瘡；尋常天疱瘡；周邊動脈閉塞性疾病(PAOD)；周邊血管疾病(PVD)；周邊動脈疾病(PAD)；晶狀體源性葡萄膜炎；靜脈炎；結節性多動脈炎(或結節性動脈周圍炎)；多軟骨炎；風濕性多肌痛；白髮症；多關節型JRA；多發性內分泌缺乏症候群；多發性肌炎；I型多腺體分泌不足症及II型多腺體分泌不足症；風濕性多肌痛(PMR)；感染後間質性肺病；發炎後間質性肺病；泵後症候群(post-pump syndrome)；早發性卵巢衰竭；原發性膽汁性肝硬化；原發性黏液水腫；原發性帕金森氏症(primary Parkinsonism)；原發性硬化性膽管炎；原發性硬化性肝炎；原發性血管炎；***及直腸癌及造血性惡性疾病(白血病及淋巴瘤)；***炎；牛皮癬；1型牛皮癬；2型牛皮癬；牛皮癬性關節炎；牛皮癬性關節病；因結締組織疾病繼發之肺高血壓；結節性多動脈炎之肺部表現；純紅血球發育不全；原發性腎上腺機能不全；放射性纖維化；反應性關節炎；萊特爾氏病(Reiter's disease)；復發性視神經脊髓炎；NOS腎病；再狹窄；類風濕性關節炎；類風濕性關節炎相關之間質性肺病；風濕性心臟病；SAPHO(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥大及骨炎)；類肉瘤病；精神***症；施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)；硬皮病；繼發性澱粉樣變性；休克肺；鞏膜炎；坐骨神經痛；繼發性腎上腺機能不全；敗血症候群；敗血性關節炎；敗血性休克；血清反應陰性關節病；聚矽氧相關之結締組織疾病；休格連氏病(Sjgren's disease)相關之肺病；休格連氏症候群(Sjrgren's syndrome)；斯納登-威爾金松氏皮膚病(Sneddon-Wilkinson dermatosis)；***自體免疫；脊柱關節病；僵直性脊椎炎；史蒂芬-瓊森症候群(Stevens-Johnson syndrome，SJS)；斯蒂爾氏病；中風；交感性眼炎；全身性發炎反應症候群；全身性紅斑狼瘡；全身性紅斑狼瘡相關之肺病；全身性硬化；全身性硬化相關之間質性肺病；高安氏病(Takayasu's disease)/動脈炎；顳動脈炎；Th2型及Th1型介導性疾病；甲狀腺炎；中毒性休克症候群；弓形蟲視網膜炎；中毒性表皮壞死溶解；橫貫性脊髓炎；TRAPS(1型腫瘤壞死因子受體(TNFR)相關之週期性症候群)；伴有黑棘皮病之B型胰島素抗性；1型過敏反應；1型自體免疫肝炎(典型自體免疫肝炎或類狼瘡肝炎)；2型自體免疫肝炎(抗LKM抗體肝炎)；II型糖尿病；潰瘍性結腸關節病；潰瘍性結腸炎；蕁麻疹；普通型間質性肺炎(UIP)；葡萄膜炎；血管炎彌漫性肺病；血管炎；春季結膜炎；病毒性視網膜炎；白斑病；伏格特-小柳-原田症候群(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)(VKH症候群)；韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)；濕性黃斑變性；創傷癒合；耶氏桿菌(yersinia)及沙門氏菌(salmonella)相關之關節病。
TNF-α結合蛋白或其抗原結合部分可單獨或組合用於治療該等疾病，包括與適用於治療自體免疫及發炎性疾病之其他治療劑組合。應瞭解，結合蛋白或其抗原結合部分可單獨或與其他藥劑(例如治療劑)組合使用，該其他藥劑係由熟習此項技術者出於其預定目的而選擇。舉例而言，其他藥劑可為技術上公認為適用於治療可由抗體治療之疾病或病狀的治療劑。其他藥劑亦可為將有利屬性賦予治療組合物之藥劑，例如影響組合物黏度之藥劑。
該等組合包括本文所述之TNF-α結合蛋白或其抗原結合片段及至少一種下文所列之其他藥劑。該組合亦可包括一種以上其他藥劑，例如兩種或三種其他藥劑，只要該組合使得所形成之組合物可執行其預定功能即可。
在一個實施例中，組合包括TNF-α結合蛋白或其抗原結合片段，及能夠結合以下各物之抗體或其片段：人類IL-12；PGE2；LPA；NGF；CGRP；SubP；RAGE；組織胺；組織胺受體阻斷劑；緩激肽(bradykinin)；IL-1α；IL-1β；VEGF；PLGF；甲胺喋呤；皮質類固醇、糖皮質激素受體調節劑；環孢靈(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、FK506或非類固醇消炎劑。
在另一實施例中，例示性組合包括本文所述之TNF-α結合蛋白或其抗原結合片段及非類固醇消炎藥(NSAID)，諸如布洛芬(ibuprofen)。其他例示性組合包含本文所述之抗體或其抗原結合片段及皮質類固醇(包括潑尼松龍(prednisolone))。可藉由逐漸減少在與TNF-α結合蛋白組合治療患者時所需之類固醇劑量來降低或消除使用類固醇之副作用。可與抗體或抗體部分組合的用於類風濕性關節炎之治療劑的非限制性實例包括以下：細胞激素抑制性消炎藥(CSAID)；其他人類細胞激素或生長因子之抗體或拮抗劑，該等人類細胞激素或生長因子為例如TNF、LT、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、干擾素、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF，諸如TRAIL、FASL、APRIL等之TNF家族成員；及疾病脂質介體之抗體，諸如***素，例如PGE2、SlP、LPA等。其他疾病介體包括硬骨素(sclerostin)、NGF、物質P、CGRP及其他疼痛介體。抗體或其抗原結合部分可與細胞表面分子之抗體組合，該等細胞表面分子諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA或其配體，包括CD154(gp39或CD40L)。
用於與TNF-α結合蛋白或其抗原結合片段組合之例示性治療劑在自體免疫及後續發炎級聯中之不同點處進行干擾，例如TNF拮抗劑，如嵌合、人類化或人類TNF抗體、D2E7(PCT公開案第WO 97/29131號)、CA2()、CDP 571及可溶性p55或p75 TNF受體、其衍生物p75TNFR1gG()或p55TNFR1gG(來那西普(Lenercept))，以及TNF-α轉化酶(TACE)抑制劑，及其他IL-1抑制劑(介白素-1轉化酶抑制劑、IL-1RA等)。用於與抗體及其抗原結合片段組合之其他藥劑包括介白素11，其為與TNF-α功能平行起作用、視TNF-α功能而定起作用或與TNF-α功能協同起作用之藥劑，諸如IL-18拮抗劑(例如IL-18結合蛋白，諸如抗體或可溶性IL-18受體或其抗原結合片段)。用於與抗體及其抗原結合片段組合之其他藥劑包括非消耗性抗CD4抑制劑、共同刺激路徑CD80(B7.1)或CD86(B7.2)之拮抗劑，包括抗體、可溶性受體、拮抗性配體或其抗原結合片段。
結合蛋白或其抗原結合部分亦可與用於治療類風濕性關節炎之藥劑組合，例如甲胺喋呤、6-MP、硫唑嘌呤(azathioprine)、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazine)、美沙拉嗪(mesalazine)、奧沙拉嗪(olsalazine)、氯喹(chloroquinine)/羥氯喹(hydroxychloroquine)、青黴胺(pencillamine)、金硫蘋果酸鹽(aurothiomalate)(肌肉內及經口)、硫唑嘌呤、秋水仙鹼(colchicine)、皮質類固醇(經口、吸入及局部注射)、β-2腎上腺素受體促效劑(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeteral))、黃嘌呤(茶鹼(theophylline)、胺茶鹼(aminophylline))、色甘酸鹽(cromoglycate)、奈多羅米(nedocromil)、酮替酚(ketotifen)、 異丙托銨(ipratropium)及氧托銨(oxitropium)、環孢靈、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)、來氟米特(leflunomide)、NSAID(例如布洛芬)、皮質類固醇(諸如潑尼松龍)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾諸如TNF-α或IL-1之促發炎性細胞激素進行信號傳導之藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38及MAP激酶抑制劑)、IL-1β轉化酶抑制劑、TNF-α轉化酶(TACE)抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑(諸如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞激素受體及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受體及衍生物p75TNFRIgG(ENBRELTM)及p55TNFRIgG(來那西普)、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗發炎細胞激素(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13及TGFβ)、塞來昔布(celecoxib)、葉酸、硫酸羥氯喹、羅非昔布(rofecoxib)、依那西普(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)、萘普生(naproxen)、伐地昔布(valdecoxib)、柳氮磺胺吡啶、甲潑尼龍(methylprednisolone)、美洛昔康(meloxicam)、乙酸甲潑尼龍、硫代蘋果酸金鈉(gold sodium thiomalate)、阿司匹靈(aspirin)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、萘磺酸丙氧芬(propoxyphene napsylate)/apap、葉酸鹽、萘丁美酮(nabumetone)、雙氯芬酸(diclofenac)、吡羅昔康(piroxicam)、依託度酸(etodolac)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、奧沙普嗪(oxaprozin)、鹽酸羥考酮(oxycodone hcl)、重酒石酸二氫可待因酮(hydrocodone bitartrate)/apap、雙氯芬酸鈉/米索前列醇(misoprostol)、芬太尼(fentanyl)、人類重組阿那白滯素(anakinra)、鹽酸曲馬多(tramadol hcl)、雙水楊酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、氰鈷胺素(cyanocobalamin)/fa/吡哆醇(pyridoxine)、乙醯胺苯酚(acetaminophen)、阿侖膦酸鈉(alendronate sodium)、潑尼松龍、硫酸嗎啡(morphine sulfate)、鹽酸利哆卡因(lidocaine hydrochloride)、吲哚美辛(indomethacin)、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/軟骨素(chondroitin)、鹽酸阿米替林(amitriptyline hcl)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚、鹽酸奧洛他定(olopatadine hcl)、米索前列醇、萘普生鈉(naproxen sodium)、奧美拉唑(omeprazole)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、利妥昔單抗(rituximab)、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、羅氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801及美索普蘭(Mesopram)。
可與TNF-α結合蛋白(例如抗體)或其抗原結合部分組合的用於發炎性腸病之治療劑的非限制性實例包括以下：布替耐德(budenoside)；表皮生長因子、皮質類固醇、環孢靈、柳氮磺胺吡啶、胺基水楊酸鹽、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、甲硝噠唑(metronidazole)、脂肪加氧酶抑制劑、美沙拉嗪(mesalamine)、奧沙拉嗪、巴柳氮(balsalazide)、抗氧化劑、血栓素(thromboxane)抑制劑、IL-1受體拮抗劑、抗IL-1單株抗體、抗IL-6單株抗體、生長因子、彈性蛋白酶抑制劑、吡啶基-咪唑化合物、其他人類細胞激素或生長因子(例如TNF、LT、IL-1α、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。抗體或其抗原結合部分可與細胞表面分子(諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90及其配體)之抗體組合。結合蛋白或其抗原結合部分亦可與諸如以下藥劑組合：甲胺喋呤、環孢靈、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬)、皮質類固醇(諸如潑尼松龍)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾諸如TNF-α或IL-1之促發炎性細胞激素進行信號傳導之藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1α轉化酶抑制劑、TNF-α轉化酶抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑(諸如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞激素受體及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受體、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)及抗發炎細胞激素(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13及TGFβ)。
可與如本文所述之TNF-α結合蛋白或其抗原結合部分組合的用於克羅恩氏病之治療劑的例示性實例包括以下：TNF拮抗劑，例如抗TNF抗體、D2E7(PCT公開案第WO 97/29131號；)、CA2()、CDP 571、TNFR-Ig構築體(p75TNFRIgG()及p55TNFRIgG(來那西普))抑制劑、其他TNF拮抗劑(諸如戈利木單抗(Golimumab)(Simponi))及PDE4抑制劑。結合蛋白或其抗原結合部分可與皮質類固醇(例如布替耐德及***(dexamethasone))組合。結合蛋白或其抗原結合部分亦可與諸如以下藥劑組合：柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、5-胺基水楊酸及奧沙拉嗪，及干擾諸如IL-1之促發炎性細胞激素之合成或作用的藥劑，例如IL-1α轉化酶抑制劑及IL-1RA。結合蛋白或其抗原結合部分亦可與T細胞信號傳導抑制劑(例如酪胺酸激酶抑制劑6-巰基嘌呤)一起使用。結合蛋白或其抗原結合部分可與IL-11組合。結合蛋白或其抗原結合部分可與以下物質組合：美沙拉嗪、潑尼松(prednisone)、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、英利昔單抗、甲潑尼龍丁二酸鈉、苯乙哌啶(diphenoxylate)/硫酸阿托品(atrop sulfate)、鹽酸洛哌丁胺(loperamide hydrochloride)、甲胺喋呤、奧美拉唑、葉酸鹽、環丙沙星(ciprofloxacin)/右旋糖-水、重酒石酸二氫可待因酮(hydrocodone bitartrate)/apap、鹽酸四環素(tetracycline hydrochloride)、氟欣諾能(fluocinonide)、甲硝噠唑、硫柳汞(thimerosal)/硼酸、消膽胺(cholestyramine)/蔗糖、鹽酸環丙沙星、硫酸莨菪鹼(hyoscyamine sulfate)、鹽酸哌替啶(meperidine hydrochloride)、鹽酸咪達唑侖(midazolam hydrochloride)、鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚、鹽酸普敏太定(promethazine hydrochloride)、磷酸鈉、磺胺甲異噁唑(sulfamethoxazole)/甲氧苄啶(trimethoprim)、塞來昔布、聚卡波非(polycarbophil)、萘磺酸丙氧芬、氫化可的松(hydrocortisone)、綜合維生素(multivitamin)、巴柳氮二鈉(balsalazide disodium)、磷酸可待因(codeine phosphate)/apap、鹽酸考來維侖(colesevelam hcl)、氰鈷胺素、葉酸、左氧氟沙星(levofloxacin)、甲潑尼龍、那他珠單抗(natalizumab)及干擾素γ。
可與TNFα結合蛋白或抗原結合部分組合的用於多發性硬化之治療劑的非限制性實例包括以下：皮質類固醇、潑尼松龍、甲潑尼龍、硫唑嘌呤、環磷醯胺、環孢靈、甲胺喋呤、4-胺基吡啶、替紮尼定(tizanidine)、干擾素-β1a(AVONEX；Biogen)、干擾素-β1b(BETASERON；Chiron/Berlex)、干擾素α-n3(Interferon Sciences/Fujimoto)、干擾素-α(Alfa Wassermann/J&J)、干擾素β 1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)、聚乙二醇化干擾素α2b(Enzon/Schering-Plough)、共聚物1(Cop-1；COPAXONE；Teva Pharmaceutical Industries,Inc.)、高壓氧、靜脈內免疫球蛋白、克拉屈濱(clabribine)、其他人類細胞激素或生長因子及其受體(例如TNF、LT、IL-1 β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-1A、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑或抑制劑。抗體或其抗原結合部分可與細胞表面分子之抗體組合，該等細胞表面分子諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配體。抗體或其抗原結合部分亦可與諸如以下藥劑組合：FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾促發炎性細胞激素(諸如TNFα或IL-1)信號傳導之藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1β轉化酶抑制劑、TACE抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑(諸如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞激素受體及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受體、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗發炎細胞激素(例如IL-4、IL-10、IL-13及TGFβ)、COPAXONE及卡斯蛋白酶(caspase)抑制劑(例如卡斯蛋白酶-1之抑制劑)。
TNF-α結合蛋白或其抗原結合部分亦可與諸如以下藥劑組合：阿倫單抗(alemtuzumab)、屈***酚(dronabinol)、Unimed、達利珠單抗(daclizumab)、米托蒽醌、鹽酸紮利羅登(xaliproden hydrochloride)、胺吡啶(fampridine)、乙酸格拉替美(glatiramer acetate)、那他珠單抗、辛那比多(sinnabidol)、a-免疫因子NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趨化因子受體拮抗劑、BBR-2778、卡勒胍素(calagualine)、CPI-1189、LEM(脂質體囊封之米托蒽醌)、THC.CBD(類***酚促效劑)、MBP-8298、美索普蘭(PDE4抑制劑)、MNA-715、抗IL-6受體抗體、紐若華(neurovax)、吡非尼酮阿羅卓普(pirfenidone allotrap)1258(RDP-1258)、sTNF-R1、他侖帕奈(talampanel)、特立氟胺(teriflunomide)、TGF-β2、替利莫肽(tiplimotide)、VLA-4拮抗劑(例如TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干擾素γ拮抗劑、IL-4促效劑。
可與TNFa結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防心絞痛之治療劑的非限制性實例包括以下：阿司匹靈、***、單硝酸異山梨酯(isosorbide mononitrate)、丁二酸美托洛爾(metoprolol succinate)、阿替洛爾(atenolol)、酒石酸美托洛爾(metoprolol tartrate)、苄磺酸胺氯地平(amlodipine besylate)、鹽酸地爾硫卓(diltiazem hydrochloride)、二硝酸異山梨酯、氯吡格雷硫酸氫鹽(clopidogrel bisulfate)、硝苯地平(nifedipine)、阿托伐他汀鈣(atorvastatin calciu m)、氯化鉀、呋喃苯胺酸(furosemide)、辛伐他汀(simvastatin)、鹽酸維拉帕米(verapamil hcl)、地高辛(digoxin)、鹽酸普萘洛爾(propranolol hydrochloride)、卡維地洛(carvedilol)、賴諾普利(lisinopril)、螺內酯(spironolactone)、氫***(hydrochlorothiazide)、順丁烯二酸依那普利(enalapril maleate)、納多洛爾(nadolol)、雷米普利(ramipril)、依諾肝素鈉(enoxaparin sodium)、肝素鈉(heparin sodium)、纈沙坦(valsartan)、鹽酸索他洛爾(sotalol hydrochloride)、非諾貝特(fenofibrate)、依澤替米貝(ezetimibe)、布美他尼(bumetanide)、洛沙坦鉀(losartan potassium)、賴諾普利/氫***、非洛地平(felodipine)、卡托普利(captopril)及反丁烯二酸比索洛爾(bisoprolol fumarate)。
可與結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防僵直性脊椎炎之治療劑的非限制性實例包括以下：布洛芬、雙氯芬酸及米索前列醇、萘普生、美洛昔康、吲哚美辛、雙氯芬酸、塞來昔布、羅非昔布、柳氮磺胺吡啶、甲胺喋呤、硫唑嘌呤、米諾環素(minocyclin)、潑尼松、依那西普及英利昔單抗。
可與TNF-α結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防哮喘之治療劑的非限制性實例包括以下：阿布特羅(albuterol)、沙美特羅(salmeterol)/氟替卡松(fluticasone)、孟魯司特鈉(montelukast sodium)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、布***(budesonide)、潑尼松、羥萘甲酸沙美特羅、鹽酸左阿布特羅(levalbuterol hcl)、硫酸阿布特羅/異丙托銨、潑尼松龍磷酸鈉、曲安奈德、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、異丙托溴銨(ipratropium bromide)、阿奇黴素(azithromycin)、乙酸吡布特羅(pirbuterol acetate)、潑尼松龍、無水茶鹼、甲潑尼龍丁二酸鈉、克拉黴素(clarithromycin)、紮魯司特(zafirlukast)、反丁烯二酸福莫特羅(formoterol fumarate)、流感病毒疫苗、甲潑尼龍、三水合阿莫西林(amoxicillin trihydrate)、氟尼縮松(flunisolide)、過敏症注射液、色甘酸鈉、鹽酸菲索特非那定(fexofenadine hydrochloride)、氟尼縮松/薄荷腦(menthol)、阿莫西林(amoxicillin)/棒酸鹽(clavulanate)、左氧氟沙星(levofloxacin)、吸入器輔助裝置、愈創甘油醚(guaifenesin)、***磷酸鈉、鹽酸莫西沙星(moxifloxacin hcl)、鹽酸強力黴素(doxycycline hyclate)、愈創甘油醚/d-美沙芬(d-methorphan)、p-麻黃素/cod/氯芬尼(chlorphenir)、加替沙星(gatifloxacin)、鹽酸西替利嗪(cetirizine hydrochloride)、糠酸莫美他松(mometasone furoate)、羥萘甲酸沙美特羅、苯佐那酯(benzonatate)、頭孢胺苄(cephalexin)、pe/氫可酮/氯芬尼、鹽酸西替利嗪/假麻黃素(pseudoephed)、苯腎上腺素/cod/普敏太定(promethazine)、可待因/普敏太定、頭孢丙烯(cefprozil)、***、愈創甘油醚/假麻黃素、氯芬尼拉明(chlorpheniramine)/氫可酮、奈多羅米鈉(nedocromil sodium)、硫酸特布他林、腎上腺素、甲潑尼龍及硫酸間羥異丙腎上腺素(metaproterenol sulfate)。
可與TNF-α結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防COPD之治療劑的非限制性實例包括以下：硫酸阿布特羅/異丙托銨、異丙托溴銨、沙美特羅/氟替卡松、阿布特羅、羥萘甲酸沙美特羅、丙酸氟替卡松、潑尼松、無水茶鹼、甲潑尼龍丁二酸鈉、孟魯司特鈉、布***、反丁烯二酸福莫特羅、曲安奈德、左氧氟沙星、愈創甘油醚、阿奇黴素、二丙酸倍氯米松、鹽酸左阿布特羅、氟尼縮松、頭孢曲松鈉(ceftriaxone sodium)、三水合阿莫西林、加替沙星、紮魯司特、阿莫西林/棒酸鹽、氟尼縮松/薄荷腦、氯芬尼拉明/氫可酮、硫酸間羥異丙腎上腺素、甲潑尼龍、糠酸莫美他松、p-麻黃素/cod/氯芬尼、乙酸吡布特羅、p-麻黃素/氯雷他定(loratadine)、硫酸特布他林、噻托溴銨(tiotropium bromide)、(R,R)-福莫特羅、TgA AT、西洛司特(cilomilast)及羅氟司特。
可與TNF-α結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防HCV之治療劑的非限制性實例包括以下：干擾素-α-2a、干擾素-α-2b、干擾素-α con1、干擾素-α-n1、聚乙二醇化干擾素-α-2a、聚乙二醇化干擾素-α-2b、病毒唑(ribavirin)、聚乙二醇化干擾素α-2b+病毒唑、熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、胸腺法新(thymalfasin)、邁克瑟敏(maxamine)、VX-497及用以經由介入以下標靶治療HCV之任何化合物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解螺旋酶、HCV IRES(內部核糖體入口位點)。
可與結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防特發性肺纖維化之治療劑的非限制性實例包括以下：潑尼松、硫唑嘌呤、阿布特羅、秋水仙鹼、硫酸阿布特羅、地高辛、γ干擾素、甲潑尼龍丁二酸鈉、勞拉西泮(lorazepam)、呋喃苯胺酸(furosemide)、賴諾普利、***、螺內酯、環磷醯胺、異丙托溴銨、放線菌素d、阿替普酶(alteplase)、丙酸氟替卡松、左氧氟沙星、硫酸間羥異丙腎上腺素、硫酸嗎啡、鹽酸羥考酮、氯化鉀、曲安奈德、無水他克莫司、鈣、干擾素-α、甲胺喋呤、黴酚酸嗎啉乙酯及干擾素-γ-1b。
可與TNFα結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防心肌梗塞之治療劑的非限制性實例包括以下：阿司匹靈、***、酒石酸美托洛爾、依諾肝素鈉、肝素鈉、氯吡格雷硫酸氫鹽、卡維地洛、阿替洛爾、硫酸嗎啡、丁二酸美托洛爾、華法林鈉(warfarin sodium)、賴諾普利、單硝酸異山梨酯、地高辛、呋喃苯胺酸、辛伐他汀、雷米普利、替奈普酶、順丁烯二酸依那普利、托西邁(torsemide)、瑞替普酶(retavase)、洛沙坦鉀、鹽酸喹那普利/碳酸鎂(magcarb)、布美他尼、阿替普酶、依那普利拉(enalaprilat)、鹽酸胺碘酮(amiodarone hydrochloride)、單水合鹽酸替羅非班(tirofiban hcl m-hydrate)、鹽酸地爾硫卓、卡托普利、厄貝沙坦(irbesartan)、纈沙坦、鹽酸普萘洛爾、福辛普利鈉(fosinopril sodium)、鹽酸利多卡因、埃替菲巴肽(eptifibatide)、頭孢唑林鈉(cefazolin sodium)、硫酸阿托平(atropine sulfate)、胺基己酸(aminocaproic acid)、螺內酯、干擾素、鹽酸索他洛爾、氯化鉀、多庫酯鈉(docusate sodium)、鹽酸多巴酚丁胺(dobutamine hcl)、阿普唑侖(alprazolam)、普伐他汀鈉(pravastatin sodium)、阿托伐他汀鈣、鹽酸咪達唑侖(midazolam hydrochloride)、鹽酸哌替啶、二硝酸異山梨酯、腎上腺素、鹽酸多巴胺(dopamine hydrochloride)、比伐盧定(bivalirudin)、羅素他汀(rosuvastatin)、依澤替米貝/辛伐他汀、阿伐麥布(avasimibe)及卡立泊來德(cariporide)。
可與TNFα結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防牛皮癬之治療劑的非限制性實例包括以下：鈣泊三醇(calcipotriene)、丙酸氯氟美松(clobetasol propionate)、曲安奈德、丙酸鹵貝他索(halobetasolpropionate)、他紮羅汀(tazarotene)、甲胺喋呤、氟欣諾能、加強型二丙酸倍他米松、氟西奈德(fluocinolone acetonide)、阿曲汀(acitretin)、焦油洗髮精、戊酸倍他米松(betamethasone valerate)、糠酸莫美他松、酮康唑(ketoconazole)、普莫卡因(pramoxine)/氟新龍(fluocinolone)、戊酸氫化可的松、氟氫縮松(flurandrenolide)、尿素、倍他米松(betamethasone)、丙酸氯倍他索(clobetasol propionate)/潤膚劑(emoll)、丙酸氟替卡松、阿奇黴素、氫化可的松、增濕配方、葉酸、***(desonide)、吡美莫司(pimecrolimus)、煤焦油、二乙酸二氟拉松(diflorasone diacetate)、葉酸依那西普、乳酸、甲氧沙林(methoxsalen)、hc/次沒食子酸鉍/znox/resor、乙酸甲潑尼龍、潑尼松、防曬劑、哈西奈德(halcinonide)、水楊酸、蒽三酚(anthralin)、特戊酸氯可托龍(clocortolone pivalate)、煤萃取物、煤焦油/水楊酸、煤焦油/水楊酸/硫、去羥米松(desoximetasone)、安定(diazepam)、潤膚劑、氟欣諾能/潤膚劑、礦物油/蓖麻油/乳酸鈉(nalact)、礦物油/花生油、石油/十四烷酸異丙酯、補骨脂素(psoralen)、水楊酸、皂/三溴沙侖(tribromsalan)、硫柳汞/硼酸、塞來昔布、英利昔單抗、環孢靈、阿法賽特(alefacept)、依法珠單抗(efalizumab)、他克莫司、吡美莫司、PUVA、UVB及柳氮磺胺吡啶。
可與TNFα結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防牛皮癬性關節炎之治療劑的非限制性實例包括以下：甲胺喋呤、依那西普、羅非昔布、塞來昔布、葉酸、柳氮磺胺吡啶、萘普生、來氟米特、乙酸甲潑尼龍、吲哚美辛、硫酸羥氯喹、潑尼松、舒林酸、加強型二丙酸倍他米松、英利昔單抗、甲胺喋呤、葉酸鹽、曲安奈德、雙氯芬酸、二甲亞碸、吡羅昔康、雙氯芬酸鈉、酮洛芬(ketoprofen)、美洛昔康、甲潑尼龍、萘丁美酮、托美丁鈉(tolmetin sodium)、鈣泊三醇、環孢靈、雙氯芬酸鈉/米索前列醇、氟欣諾能、硫酸葡糖胺、硫代蘋果酸金鈉、重酒石酸二氫可待因酮/apap、布洛芬、利塞膦酸鈉(risedronate sodium)、磺胺嘧啶、硫鳥嘌呤、伐地昔布、阿法賽特及依法珠單抗。
可與TNFα結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防再狹窄之治療劑的非限制性實例包括以下：西羅莫司、太平洋紫杉醇、依維莫司(everolimus)、他克莫司、ABT-578及乙醯胺苯酚。
可與TNFα結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防坐骨神經痛之治療劑的非限制性實例包括以下：重酒石酸二氫可待因酮/apap、羅非昔布、鹽酸環苯紮平(cyclobenzaprine hcl)、甲潑尼龍、萘普生、布洛芬、鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚、塞來昔布、伐地昔布、乙酸甲潑尼龍、潑尼松、磷酸可待因/apap、鹽酸曲馬多/乙醯胺苯酚、美他沙酮、美洛昔康、美索巴莫(methocarbamol)、鹽酸利多卡因、雙氯芬酸鈉、加巴噴丁(gabapentin)、***、肌安寧(carisoprodol)、酮咯酸緩血酸胺(ketorolac tromethamine)、吲哚美辛、乙醯胺苯酚、安定、萘丁美酮、鹽酸羥考酮、鹽酸替紮尼定、雙氯芬酸鈉/米索前列醇、萘磺酸丙氧芬/apap、asa/羥考酮/羥考酮ter(oxycodone ter)、布洛芬/重酒石酸二氫可待因酮、鹽酸曲馬多、依託度酸、鹽酸丙氧芬、鹽酸阿米替林、肌安寧/磷酸可待因/asa、硫酸嗎啡、綜合維生素、萘普生鈉、檸檬酸奧芬那君(orphenadrine citrate)及替馬西泮(temazepam)。
可與TNFα結合蛋白或其抗原結合部分組合用於治療或預防全身性紅斑狼瘡(SLE)之治療劑的非限制性實例包括以下：NSAID，例如雙氯芬酸、萘普生、布洛芬、吡羅昔康、吲哚美辛；COX2抑制劑，例如塞來昔布、羅非昔布、伐地昔布；抗瘧疾劑，例如羥氯喹；類固醇，例如潑尼松、潑尼松龍、布替耐德、***；細胞毒素，例如硫唑嘌呤、環磷醯胺、黴酚酸嗎啉乙酯、甲胺喋呤；PDE4抑制劑或嘌呤合成抑制劑，例如CELLCEPT。結合蛋白或其抗原結合部分亦可與諸如以下藥劑組合：柳氮磺胺吡啶、5-胺基水楊酸、奧沙拉嗪、移護寧(Imuran)及干擾促發炎性細胞激素(諸如IL-1)之合成、產生或作用之藥劑，例如卡斯蛋白酶抑制劑，如IL-1β轉化酶抑制劑及IL-1ra。結合蛋白或其抗原結合部分亦可與T細胞信號傳導抑制劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)或靶向T細胞活化分子之分子(例如CTLA-4-IgG或抗B7家族抗體，及抗PD-1家族抗體)一起使用。結合蛋白或其抗原結合部分可與IL-11或抗細胞激素抗體(例如芳妥珠單抗(fonotolizumab)(抗IFNg抗體))或抗受體受體抗體(例如抗IL-6受體抗體)及B細胞表面分子之抗體組合。結合蛋白或其抗原結合部分亦可與LJP 394(阿貝莫司(abetimus))、消耗或不活化B細胞之藥劑(例如利妥昔單抗(抗CD20抗體))、lymphostat-B(抗BlyS抗體)、TNF拮抗劑(例如抗TNF抗體D2E7(PCT公開案第WO 97/29131號；HUMIRA))、CA2(REMICADE)、CDP 571、TNFR-Ig構築體(p75TNFRIgG(ENBREL)及p55TNFRIgG(來那西普))一起使用。
醫藥組合物可包括「治療有效量」或「預防有效量」之TNFα結合蛋白或其抗原結合部分。「治療有效量」係指在必要劑量及時段下有效達成所需治療結果之量。本文所述之結合蛋白或其抗原結合部分之治療有效量可由熟習此項技術者確定且可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重以及抗體或其抗原結合部分在個體中引起所需反應之能力等因素而變化。治療有效量亦為治療有利作用超過抗體或其抗原結合部分之任何毒性或有害作用之量。「預防有效量」係指在必要劑量及時段下有效達成所需預防結果之量。通常，因為預防劑量係在疾病之前或在疾病早期用於個體中，所以預防有效量將小於治療有效量。
可調整給藥方案以提供最佳所要反應(例如治療或預防反應)。舉例而言，可投與單次劑量(single bolus)，可隨時間投與若干分次劑量或可依治療情況之緊急性所指示，按比例減少或增加劑量。尤其宜將非經腸組合物調配成單位劑型以方便投藥及達到劑量均一性。單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之哺乳動物個體的物理個別單元；各單元含有經計算以產生所需治療作用之預定量活性化合物與所需醫藥載劑。單位劑型的規格由以下因素規定且直接視其而定：(a)活性化合物之獨特特徵及待達成之特定治療或預防作用，及(b)相關技術中混配該活性化合物用於治療個體之敏感性的固有限制。
TNFα結合蛋白或其抗原結合部分之治療或預防有效量之例示性、非限制性範圍為約0.1 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg。劑量值可隨待減輕之病狀的類型及嚴重程度而變化。對於任何特定個體，特定給藥方案應根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與之人士的專業判斷而隨時間作出調整。本文所述之劑量範圍僅為例示性且不欲限制所主張之組合物的範疇或實施。
熟習此項技術者顯而易知，本文所述之組合物及方法之其他適合修改及改適為明顯的且可在不悖離本發明或本文所揭示之實施例之範疇的情況下使用適合之相等物來進行。參考以下實例將更清楚地理解本發明之實施例，該等實例僅出於說明目的包括在內且不欲具限制性。
實例 實例1：抗人類TNF-α單株抗體之產生
小鼠抗人類TNF-α單株抗體係如下獲得：
實例1.1：用人類TNF-α抗原使小鼠免疫
在第1天將與完全弗氏佐劑或Immunoeasy佐劑(Qiagen,Valencia,CA)混合之20微克重組純化人類TNF-α(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)經皮下注射至5隻6-8週齡Balb/C小鼠、5隻C57B/6小鼠及5隻AJ小鼠中。在第24天、第38天及第49天，將與不完全弗氏佐劑或Immunoeasy佐劑混合之20微克重組純化人類TNF-α抗原經皮下注射至相同小鼠中。在第84天或第112天或第144天，向小鼠靜脈內注射1 μg重組純化人類TNF-α抗原。
實例1.2：融合瘤之產生
根據Kohler及Milstein(1975) Nature 256:495中所述之已確立方法將獲自實例1.1中所述之經免疫小鼠之脾細胞與SP2/O-Ag-14細胞以5:1之比率融合以產生融合瘤。以每孔2.5×106個脾細胞的密度將融合產物接種於96孔盤中含有偶氮絲胺酸及次黃嘌呤之選擇培養基中。融合後7至10天，觀測到肉眼可見之融合瘤群落。藉由ELISA對含有融合瘤群落之來自各孔之上清液測試TNF-α之抗體的存在。隨後在L929生物分析法(如實例2.7中所述)中對顯示TNF-α特異性活性之上清液測試其中和TNF-α之能力。
實例1.3：抗人類TNF-α單株抗體之鑑別及表徵
將結合TNF-α且能夠特異性結合TNF-α之產生融合瘤之抗體且特定言之在L929生物分析法中具有5 nM或小於5 nM之IC50值的產生融合瘤之抗體按比例增加且藉由限制稀釋法選殖。
將融合瘤細胞在含有10%低IgG胎牛血清之培養基(Hyclone #SH30151,Logan,UT)中擴增。平均而言，利用標準方法，每一融合瘤採集250 mL上清液(源自純系群體)，濃縮且藉由蛋白質A親和層析純化。使用如實例2.7中所述之L929生物分析法測定經純化mAb抑制TNF-α活性的能力。
實例1.4：測定各鼠類抗人類TNF-α單株抗體之可變區的胺基酸序列
對於各胺基酸序列測定，藉由離心分離約10×106個融合瘤細胞，且按照製造商之說明書，用Trizol(Gibco BRL/Invitrogen,Carlsbad,CA.)處理以分離總RNA。根據製造商之說明書使用SuperScript第一股合成系統(Invitrogen,Carlsbad,CA)對總RNA進行第一股DNA合成。使用寡(dT)引發第一股合成以選擇聚(A)+RNA。接著藉由PCR使用經設計用於擴增鼠類免疫球蛋白可變區之引子(Ig-Primer Sets,Novagen,Madison,WI)來擴增第一股cDNA產物。於瓊脂糖凝膠上解析PCR產物、切下、純化且接著以TOPO選殖套組次選殖至pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，且轉型至TOP10化學勝任型大腸桿菌(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。對轉型體進行群落PCR以鑑別含有***物之純系。使用QIAprep Miniprep套組(Qiagen,Valencia,CA)自含有***物之純系分離質體DNA。使用M13正向引子及M13反向引子(Fermentas Life Sciences,Hanover MD)對質體中之***物之兩股進行定序以確定可變重鏈DNA序列或可變輕鏈DNA序列。抗TNF-α單株抗體之可變重鏈序列及可變輕鏈序列展示於表5中。
實例2：重組抗人類TNF-α抗體 實例2.1：重組嵌合抗人類TNF-α抗體之構築及表現
藉由在細菌中同源重組使編碼鼠類抗人類TNF-α單株抗體MAK199之重鏈恆定區的DNA經編碼含有2個鉸鏈區胺基酸突變之人類IgG1恆定區的cDNA片段置換。此等突變為位置234(EU編號)處白胺酸變為丙胺酸及位置235處白胺酸變為丙胺酸(Lund等人，(1991) J. Immunol. 147:2657)。此等抗體中之每一者之輕鏈恆定區經人類κ恆定區置換。藉由使接合至pHybE表現質體中之嵌合重鏈及輕鏈cDNA共轉染，使全長嵌合抗體在HEK293-6E細胞中短暫表現(美國專利公開案第US 20090239259號)。藉由蛋白質A瓊脂糖凝膠層析法(Protein A Sepharose chromatography)純化含有重組嵌合抗體之細胞上清液且藉由添加酸緩衝液溶離已結合抗體。將抗體中和且透析至PBS中。
隨後藉由ELISA對經純化嵌合抗人類TNF-α單株抗體測試其結合hTNF-α蛋白質之能力以證實抗原結合。
實例2.2：CDR移植抗人類TNF-α抗體之構築
藉由應用此項技術中熟知之標準方法，將單株抗體MAK199之VH及VL鏈之CDR序列(參見上文表5)移植至不同人類重鏈及輕鏈接受體序列中。
基於與單株抗體MAK199之VH及VL序列進行VH及VL序列比對，選擇以下已知人類序列：
a)用於構築重鏈接受體序列之VH1-18(IGHV1-18)及VH7-4.1(IGHV7-4-1)及接合序列hJH6
b)用於構築輕鏈接受體序列之1-39/O12及6-D1/A14以及hJK2
藉由將MAK199之相應VH及VL CDR移植至該等接受體序列中，製備CDR移植、人類化及經修飾VH及VL序列(亦參見上文表6)。
實例2.3：在CDR移植抗體中構築構架回復突變
為產生人類化抗體構架回復突變，藉由可變域之重新合成及/或使用突變誘發引子及PCR以及此項技術中熟知之方法，將突變引入如根據實例2.2所製備之CDR移植抗體序列中。對於各CDR移植物如下構築回復突變及其他突變之不同組合。此等突變之殘基編號係基於Kabat編號系統。
對於重鏈hMAK199VH.1z，以下維尼爾及VH/VL交界殘基中之一或多者經如下回復突變：V2→I，Y91→F。
其他突變包括以下：Q1→E。
對於重鏈hMAK199VH.2z，以下維尼爾及VH/VL交界殘基中之一或多者經如下回復突變：V2→I，V67→F，M69→F，T71→L，Y91→F。
其他突變包括以下：Q1→E，R82→S，D85→E。
對於輕鏈hMAK199Vk.1，以下維尼爾及VH/VL交界殘基中之一或多者經如下回復突變：A43→T，P44→V，F71→Y，及Y87→F。
對於輕鏈hMAK199Vk.2，以下維尼爾及VH/VL交界殘基中之一或多者經如下回復突變：V2→I，A43→T，P44→V，K49→Y，F71→Y，及Y87→F。
實例2.4：在CDR移植抗體中含有構架回復突變之人類化抗HTNFα抗體的產生
可使用該等序列藉由使用標準DNA合成或擴增技術且使用標準重組DNA技術將所要抗體片段組裝至表現載體中來合成核酸以供於細胞中表現。舉例而言，自胺基酸序列測定核酸密碼子，且藉由Blue Heron Biotechnology,Inc.(www.blueheronbio.com)Bothell,WA USA合成寡核苷酸DNA。將寡核苷酸組裝至300-2,000個鹼基對之雙股DNA片段中，選殖至質體載體中且進行序列檢驗。使用酶促方法組裝所選殖之片段以得到完整基因且次選殖至表現載體中。(參見7,306,914；7,297,541；7,279,159；7,150,969；20080115243；20080102475；20080081379；20080075690；20080063780；20080050506；20080038777；20080022422；20070289033；20070287170；20070254338；20070243194；20070225227；20070207171；20070150976；20070135620；20070128190；20070104722；20070092484；20070037196；20070028321；20060172404；20060162026；20060153791；20030215458；及20030157643)。
舉例而言，可將上述電腦模擬(in silico)構築之人類化抗體***pHybE載體之多選殖位點中(US專利公開案第US 2009/0239259號)。分離細菌群落且提取質體DNA；對整個cDNA***物進行測序。將對應於各抗體之恰當人類化重鏈及輕鏈共同轉染至HEK 293-6E細胞中以短暫地產生全長人類化抗人類TNF-α抗體。將含有重鏈移植cDNA及輕鏈移植cDNA之pHybE載體共同轉染至HEK 293-6E細胞中。藉由蛋白質A瓊脂糖凝膠層析法純化含有重組嵌合抗體之細胞上清液，且藉由添加酸緩衝液溶離已結合抗體。將抗體中和且透析至PBS中。人類化抗體描述於表7中。
表7：人類化抗TNFα抗體
實例2.5：人類化抗hTNFα hMAK199抗體VH/VL配對
實例2.6：使用BIACORE技術進行親和力測定
表8：Biacore分析中所用之試劑
BIACORE方法：
BIACORE分析法(Biacore,Inc,Piscataway,NJ)利用締合速率常數及解離速率常數之動力學量測來測定抗體之親和力。藉由利用Biacore 1000或3000儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)在25℃下使用流動之HBS-EP(10 mM HEPES[pH 7.4]、150 mM NaCl、3 mM EDTA及0.005%界面活性劑P20)進行基於表面電漿子共振之量測來測定抗體與標靶抗原(例如經純化重組標靶抗原)之結合。所有化學物質皆獲自Biacore AB(Uppsala,Sweden)或另外獲自如上所述之不同來源。舉例而言，根據製造商之說明書及程序使用標準胺偶合套組將25 μg/ml於10 mM乙酸鈉(pH 4.5)中稀釋之約5000 RU山羊抗小鼠IgG(Fcγ)片段特異性多株抗體(Pierce Biotechnology Inc,Rockford,IL)直接固定於CM5研究級生物感測器晶片上。以乙醇胺阻斷該生物感測器表面上之未反應部分。流槽2及4中之經修飾羧甲基聚葡萄糖表面用作反應表面。流槽1及3中不具有山羊抗小鼠IgG之未經修飾之羧甲基聚葡萄糖用作參考表面。為進行動力學分析，使用Biaevaluation 4.0.1軟體將自1:1朗繆爾結合模型(1:1 Langmuir binding model)導出之速率方程式同時與所有8次注射之締合相及解離相擬合(使用整體擬合分析)。將經純化抗體稀釋於HEPES緩衝生理食鹽水中以捕捉山羊抗小鼠IgG特異性反應表面。將待捕捉作為配體之抗體(25 μg/ml)以5 μl/min之流動速率注射於反應基質上。在25 μl/min之連續流動速率下測定締合速率常數kon(M-1s-1)及解離速率常數koff(s-1)。藉由在10-200 nM範圍內之不同抗原濃度下進行動力學結合量測來獲得速率常數。隨後藉由下式自動力學速率常數計算抗體與標靶抗原之間之反應的平衡解離常數(M)：KD=koff/kon。隨時間變化記錄結合且計算動力學速率常數。在此分析法中，可量測快至106 M-1s-1之締合速率常數及慢至10-6 s-1之解離速率常數。
表9：抗hTNFα抗體之BIACORE分析
維持藉由Biacore技術表徵之所有人類化構築體之結合且與鼠類親本抗體之結合類似。
實例2.7：人類TNFα之中和
使L929細胞生長至半匯合密度且使用0.25%胰蛋白酶(Gibco#25300)收集。用PBS洗滌細胞，計數且以1E6個細胞/毫升再懸浮於含有4 μg/mL放線菌素D之分析培養基中。將細胞以100 μL之體積及以5E4個細胞/孔接種於96孔培養盤(Costar#3599)中。將抗體及對照IgG於分析培養基中稀釋至4×濃度且進行連續1:4稀釋。在分析培養基中將huTNFα稀釋至400 pg/mL。在1:2稀釋方案中將抗體樣本(200 μL)添加至huTNFα(200 μL)中且使其在室溫下培育0.5小時。
將100 μL抗體/人類TNFα溶液添加至經接種細胞中以得到最終濃度為100 pg/mL之huTNFα及150 nM-0.0001 nM之抗體。在37℃、5% CO2下將盤培育20小時。為了定量存活力，自各孔移除100 μL，且添加10 μL WST-1試劑(Roche目錄號11644807001)。在分析條件下將盤培育3.5小時。利用Spectromax 190 ELISA盤式讀取器在OD 420-600 nm下對盤讀數。來自若干分析法之平均EC50包括於表10中。
表10：利用人類化抗hTNFα抗體進行人類TNFα中和分析法
所有抗hTNFα抗體在TNFα中和分析法中皆展示中和。
實例2.8：人類化單株抗體之物理化學及活體外穩定性分析
尺寸排阻層析法
用水將抗體稀釋至2.5 mg/mL且利用Shimadzu HPLC系統使用TSK凝膠G3000 SWXL管柱(Tosoh Bioscience，目錄號k5539-05k)分析20 mL樣本。利用211 mM硫酸鈉、92 mM磷酸鈉(pH 7.0)以0.3 mL/min之流動速率自管柱溶離樣本。HPLC系統操作條件如下：
移動相：211 mM Na2SO4、92 mM Na2HPO4*7H2O(pH 7.0)
梯度：同溶劑
流動速率：0.3 mL/min
偵測器波長：280 nm
自動取樣器冷卻器溫度：4℃
管柱爐溫：環境溫度
操作時間：50分鐘
表11含有如藉由上述方案所測定的以單體(預期分子量之未聚集蛋白質)百分比表示之抗體構築體的純度數據。
表11：如藉由尺寸排阻層析法所測定之抗hTNFα抗體的純度
抗hTNFα抗體展示大多數顯示>95%單體之優良SEC分佈。
SDS-PAGE
在還原性條件及非還原性條件下藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析抗體。使用阿達木單抗(Adalimumab)(批號AFP04C)作為對照物。對於還原性條件，1：1混合樣本與具有100 mM DTT之2X tris甘胺酸SDS-PAGE樣本緩衝液(Invitrogen，目錄號LC2676，批號1323208)，且在60℃下加熱30分鐘。對於非還原性條件，1:1混合樣本與樣本緩衝液且在100℃下加熱5分鐘。將經還原樣本(每個泳道10 mg)裝載於12%預製tris甘胺酸凝膠(Invitrogen，目錄號EC6005box，批號6111021)上，且將未經還原之樣本(每個泳道10 mg)裝載至8%-16%預製tris甘胺酸凝膠(Invitrogen，目錄號EC6045box，批號6111021)上。使用SeeBlue Plus2(Invitrogen，目錄號LC5925，批號1351542)作為分子量標記物。在XCell SureLock小單元凝膠盒(Invitrogen，目錄號EI0001)中操作凝膠，且藉由首先施加電壓75使樣本堆疊於凝膠中，隨後施加恆定電壓125直至染料前沿到達凝膠底部來分離蛋白質。所用之電泳緩衝液為自10X tris甘胺酸SDS緩衝液(ABC，MPS-79-080106)製備的1X tris甘胺酸SDS緩衝液。用膠體藍染色劑(Invitrogen目錄號46-7015、46-7016)對凝膠染色隔夜，且用Milli-Q水脫色直至背景透明。接著使用Epson Expression掃描儀(型號1680，S/N DASX003641)掃描經染色凝膠。
沈降速度分析
將抗體裝載至三個標準雙區碳環氧樹脂(epon)中心件中之每一者的樣本腔室中。此等中心件具有1.2 cm之光徑長度且經建造有藍寶石窗。使用PBS作為參考緩衝液且各腔室含有140 μL PBS。在Beckman ProteomeLab XL-I分析型超離心機(序號PL106C01)中使用4孔(AN-60Ti)轉子同時檢查所有樣本。
操作條件經程式化，且使用ProteomeLab(5.6版)進行離心對照。在分析之前，使樣本及轉子熱平衡1小時(20.0±0.1℃)。在3000 rpm下進行適當單元負載之確認且記錄各單元之單一掃描。沈降速度條件如下：
樣本單元體積：420 mL
參考單元體積：420 mL
溫度：20℃
轉子速度：35,000 rpm
時間：8:00小時
紫外光波長：280 nm
徑向步長：0.003 cm
數據收集：在無信號平均化情況下每步一個數據點
掃描總數：100
完整抗體之LC-MS分子量量測
藉由LC-MS分析完整抗體之分子量。用水將各抗體稀釋至約1 mg/mL。使用具有蛋白質微捕集器(Michrom Bioresources,Inc，目錄號004/25109/03)之1100 HPLC(Agilent)系統脫鹽，且將5 mg樣本引入API Qstar pulsari質譜儀(Applied Biosystems)中。使用短梯度溶離樣本。用移動相A(HPLC水中0.08% FA、0.02% TFA)及移動相B(乙腈中0.08% FA及0.02% TFA)以50 mL/min之流動速率操作梯度。質譜儀在4.5千伏噴霧電壓下操作，掃描範圍為2000至3500質荷比。
抗體輕鏈及重鏈之LC-MS分子量量測
藉由LC-MS分析抗體輕鏈(LC)、重鏈(HC)及經去糖基化之HC的分子量量測。用水將抗體稀釋至1 mg/mL且在37℃下用最終濃度為10 mM之DTT將樣本還原為LC及HC持續30分鐘。為使抗體去糖基化，在37℃下用2 mL PNGase F、5 mL 10% N-辛基葡糖苷於100 mL總體積中培育100 mg抗體隔夜。去糖基化之後，在37℃下用最終濃度為10 mM之DTT還原樣本30分鐘。使用具有C4管柱(Vydac,目錄號214TP5115，S/N 060206537204069)之Agilent 1100 HPLC系統脫鹽，且將樣本(5 mg)引入API Qstar pulsar i質譜儀(Applied Biosystems)中。使用短梯度溶離樣本。用移動相A(HPLC水中0.08% FA、0.02% TFA)及移動相B(乙腈中0.08% FA及0.02% TFA)以50 mL/min之流動速率操作梯度。質譜儀在4.5千伏噴霧電壓下操作，掃描範圍為800至3500質荷比。
肽圖譜
在室溫下在75 mM碳酸氫銨中用最終濃度為6 M之鹽酸胍使抗體變性15分鐘。在37℃下以最終濃度為10 mM之DTT還原變性樣本60分鐘，隨後在37℃下在黑暗中以50 mM碘乙酸(IAA)使其烷基化30分鐘。烷基化之後，在4℃下使樣本針對4公升10 mM碳酸氫銨透析隔夜。用10 mM碳酸氫銨(pH 7.8)將經透析樣本稀釋至1 mg/mL，且在37℃下用胰蛋白酶(Promega,目錄號V5111)或Lys-C(Roche,目錄號11047825001)以1:20(w/w)之胰蛋白酶/Lys-C：抗體比率消化100 mg抗體4小時。用1 mL 1 N HCl淬滅消化物。對於用質譜儀偵測肽圖譜，使用Agilent 1100 HPLC系統在C18管柱(Vydac,目錄號218TP51，S/N NE9606 10.3.5)上藉由逆相高效液相層析(RPHPLC)分離40 mL消化物。以使用移動相A(HPLC級水中0.02% TFA及0.08% FA)及移動相B(乙腈中0.02% TFA及0.08% FA)之梯度以50 mL/min之流動速率下進行肽分離。API QSTAR Pulsar i質譜儀在4.5千伏噴霧電壓下及800至2500質荷比之掃描範圍內以正離子模式操作。
二硫鍵定位
為了使抗體變性，將100 mL抗體與300 mL含8 M鹽酸胍之100 mM碳酸氫銨混合。檢驗pH值以確保其在7與8之間，且使樣本在室溫下在最終濃度為6 M之鹽酸胍中變性15分鐘。用Milli-Q水將一部分變性樣本(100 mL)稀釋至600 mL以得到1 M之最終鹽酸胍濃度。在37℃下用胰蛋白酶(Promega，目錄號V5111，批號22265901)或Lys-C(Roche，目錄號11047825001，批號12808000)以1:50胰蛋白酶或1:50 Lys-C：抗體(w/w)比率(4.4 mg酶：220 mg樣本)消化樣本(220 mg)約16小時。將另外5 mg胰蛋白酶或Lys-C添加至樣本中且在37℃下再進行消化2小時。藉由添加1 mL TFA至各樣本中來終止消化。在Agilent HPLC系統上使用C18管柱(Vydac，目錄號218TP51 S/N NE020630-4-1A)藉由RPHPLC分離經消化樣本。以與用於肽圖譜之梯度相同之梯度使用移動相A(HPLC級水中0.02% TFA及0.08% FA)及移動相B(乙腈中0.02% TFA及0.08% FA)以50 mL/min之流動速率進行分離。HPLC操作條件與肽圖譜所用之操作條件相同。API QSTAR Pulsar i質譜儀在4.5千伏噴霧電壓及800至2500質荷比之掃描範圍內以正離子模式操作。藉由匹配所觀測之肽MW與經二硫鍵連接之胰蛋白酶肽或Lys-C肽的預測MW來指定二硫鍵。
游離硫氫基之測定
用於定量抗體中之游離半胱胺酸的方法係基於愛耳門試劑(Ellman's reagent)(5,5￠-二硫基-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB))與硫氫基(SH)之反應，該反應產生特徵性發色產物5-硫基-(2-硝基苯甲酸)(TNB)。反應以下式說明：
DTNB+RSH RS-TNB+TNB-+H+
使用Cary 50分光光度計量測TNB-在412 nm下之吸光度。使用2-巰基乙醇(b-ME)稀釋液作為游離SH標準物繪製吸光度曲線，且自樣本於412 nm下之吸光度測定蛋白質中之游離硫氫基的濃度。
藉由用HPLC級水連續稀釋14.2 M b-ME至最終濃度為0.142 mM來製備b-ME標準儲備溶液。隨後一式三份製備各濃度之標準物。使用amicon ultra 10,000 MWCO離心過濾器(Millipore，目錄號UFC801096，批號L3KN5251)將抗體濃縮至10 mg/mL，且將緩衝液換為用於阿達木單抗之調配緩衝液(5.57 mM磷酸二氫鈉、8.69 mM磷酸氫二鈉、106.69 mM NaCl、1.07 mM檸檬酸鈉、6.45 mM檸檬酸、66.68 mM甘露糖醇(pH 5.2)、0.1%(w/v)Tween)。在室溫下在震盪器上混合樣本20分鐘。接著，向各樣本及標準物中添加180 mL 100 mM Tris緩衝液(pH 8.1)，隨後添加300 mL含2 mM DTNB之10 mM磷酸鹽緩衝液(pH 8.1)。在充分混合之後，在Cary 50分光光度計上在412 nm下量測樣本及標準物之吸光度。藉由繪製游離SH之量與b-ME標準物之OD412 nm之曲線獲得標準曲線。在減去空白後，基於此曲線計算樣本之游離SH含量。
弱陽離子交換層析
以10 mM磷酸鈉(pH 6.0)稀釋抗體至1 mg/mL。使用Shimadzu HPLC系統用WCX-10 ProPac分析型管柱(Dionex，目錄號054993，S/N 02722)分析電荷異質性。將樣本裝載於管柱上(80%移動相A(10 mM磷酸鈉，pH 6.0)及20%移動相B(10 mM磷酸鈉、500 mM NaCl，pH 6.0))，且以1.0 mL/min之流動速率溶離。
寡醣分佈
以2-胺基苯甲醯胺(2-AB)標記試劑衍生經PNGase F處理抗體後釋放之寡醣。藉由正相高效液相層析(NPHPLC)分離螢光標記之寡醣，且基於與已知標準物的滯留時間比較表徵寡醣之不同形式。
首先以PNGaseF消化抗體，以自重鏈之Fc部***解N連接之寡醣。將抗體(200 mg)與2 mL PNGaseF及3 mL 10% N-辛基糖苷一起置於500 mL Eppendorf管中。添加磷酸鹽緩衝生理食鹽水使最終體積達到60 mL。將樣本在37℃下在設定為700 RPM之Eppendorf熱混合器中培育隔夜。作為對照，亦使用PNGase F消化批號為AFP04C之阿達木單抗。
在PNGase F處理之後，將樣本在95℃下在設定為750 RPM之Eppendorf熱混合器中培育5分鐘以沈澱出蛋白質，接著將樣本置於10,000 RPM下之Eppendorf離心機中持續2分鐘，以短暫離心沈澱之蛋白質。將含有寡醣之上清液轉移至500 mL Eppendorf管中且在65℃下在speed-vac中乾燥。
使用購自Prozyme之2AB標記套組(目錄號GKK-404，批號132026)以2AB標記寡醣。根據製造商之說明書製備標記試劑。將乙酸(150 mL，於套組中提供)添加至DMSO小瓶(於套組中提供)中，且藉由將溶液上下抽吸若干次來混合。將乙酸/DMSO混合物(100 mL)轉移至2-AB染料小瓶中(使用前即刻)且混合直至染料完全溶解。接著將染料溶液添加至還原劑小瓶(於套組中提供)中且充分混合(標記試劑)。向各乾燥寡醣樣本小瓶中添加標記試劑(5 mL)，且充分混合。將反應小瓶置於設定為65℃及700-800 RPM之Eppendorf熱混合器中以反應2小時。
在標記反應之後，使用來自Prozyme之GlycoClean S濾筒(目錄號GKI-4726)移除過量螢光染料。在添加樣本之前，將該等濾筒以1 mL milli-Q水洗滌，隨後以1 mL 30%乙酸溶液洗滌5次。在即將添加樣本之前，向濾筒中添加1 mL乙腈(Burdick及Jackson，目錄號AH015-4)。
在所有乙腈均已通過濾筒之後，將樣本點樣至剛洗滌之圓盤中央，且使其吸附於圓盤上持續10分鐘。用1 mL乙腈洗滌圓盤，隨後以1 mL 96%乙腈洗滌5次。將濾筒置於1.5 mL Eppendorf管上，且以milli Q水洗滌3次(每次洗滌400 mL)來溶離2-AB標記之寡醣。
使用連接於Shimadzu HPLC系統之Glycosep N HPLC(目錄號GKI-4728)管柱分離寡醣。Shimadzu HPLC系統由系統控制器、脫氣器、二元泵、具有樣本冷卻器之自動取樣器及螢光偵測器組成。
高溫下之穩定性
用適當緩衝液、界面活性劑、穩定劑及/或糖將抗體之最終濃度調節至2 mg/mL。接著將抗體溶液過濾滅菌，且在無菌條件下製備0.25 mL等分試樣。將等分試樣留置於-80℃、5℃、25℃或40℃下持續1週、2週或3週。在培育期結束時，藉由尺寸排阻層析法及SDS-PAGE分析樣本。
藉由SDS-PAGE在還原性及非還原性條件下分析穩定性樣本。所用程序與本文所述相同。用膠體藍染色劑(Invitrogen目錄號46-7015，46-7016)對凝膠染色隔夜，且用Milli-Q水脫色直至背景透明。接著使用Epson Expression掃描儀(型號1680，S/N DASX003641)掃描經染色凝膠。為了獲得更高靈敏度，使用銀染色套組(Owl Scientific)對相同凝膠進行銀染色，且使用製造商提供之推薦程序。
實例2.9：在HEK 293-6E細胞中轉染及表現
將抗hTNFα抗體載體構築體轉染至293細胞中以產生蛋白質。所用293短暫轉染程序為Durocher等人，(2002) Nucleic acids Res. 30(2):E9及Pham等人，(2005) Biotech. Bioengineering 90(3):332-44中所公開之方法的修改形式。轉染中所用之試劑包括：
‧　在拋棄式錐形瓶(Erlenmeyer flask)中在設定為130 rpm、37℃及5% CO2之含濕氣培育箱中培養之HEK293-6E細胞(穩定表現EBNA1之人類胚胎腎細胞株；自National Research Council Canada獲得)。
‧　培養基：FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen 12338-018)+25 μg/mL遺傳黴素(G418)(Invitrogen 10131-027)及0.1% Pluronic F-68(Invitrogen 24040-032)。
‧　轉染培養基：FreeStyle 293表現培養基+ 10 mM HEPES(Invitrogen 15630-080)。
‧　聚伸乙基亞胺(PEI)儲備溶液：1 mg/mL無菌儲備溶液(pH 7.0)，用線性25 kDa PEI(Polysciences)製備且儲存於低於-15℃下。
‧　胰化蛋白饋料培養基：胰化蛋白N1(Organotechnie，19554)於FreeStyle 293表現培養基中之5% w/v無菌儲備溶液。
用於轉染之細胞製備：在轉染之前約2-4小時，藉由離心收集HEK 293-6E細胞且以約1百萬個活細胞/毫升之細胞密度再懸浮於培養基中。對於各次轉染，將40 mL細胞懸浮液轉移至拋棄式250 mL錐形瓶中且培育2-4小時。
轉染：將轉染培養基及PEI儲備溶液預溫至室溫(RT)。對於各次轉染，將25 μg質體DNA及50 μg聚伸乙基亞胺(PEI)組合於5 mL轉染培養基中且在室溫下培育15-20分鐘以允許形成DNA:PEI複合物。對於BR3-Ig轉染，每次轉染使用25 μg BR3-Ig質體。將各5 mL DNA:PEI複合物混合物添加至40 mL先前製備之培養物中且置回設定為130 rpm、37℃及5% CO2之含濕氣培育箱中。20-28小時後，將5 mL胰化蛋白饋料培養基添加至各轉染中且繼續培養六天。
表12含有在HEK 293-6E細胞中親本抗體的產率數據(以毫克/公升表示)。
表12：在HEK 293-6E細胞中抗hTNFα抗體之產率的短暫表現
所有抗體在HEK 293-6E細胞中皆表現良好。在大多數情況下，可自HEK 293-6E細胞之上清液容易地獲得>50 mg/L經純化抗體。
本發明以全文引用的方式併有分子生物學領域中所熟知之技術。此等技術包括(但不限於)以下公開案中所述之技術：
Ausubel等人編，Short Protocols In Molecular Biology (第4版，1999) John Wiley & Sons,NY(ISBN 0-471-32938-X)。
Lu及Weiner編，Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis(2001) BioTechniques Press,Westborough,MA,第298頁(ISBN 1-881299-21-X)。
Kontermann及Dbel編，Antibody Engineering(2001) Springer-Verlag,NY,第790頁(ISBN 3-540-41354-5)。
Old及Primrose,Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering(第3版，1985)Blackwell Scientific Publications,Boston,MA. Studies in Microbiology；第2卷：第409頁(ISBN 0-632-01318-4)。
Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),第1-3卷(ISBN 0-87969-309-6)。
Winnacker,From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology(1987) VCH Publishers,NY(Horst Ibelgaufts翻譯)，第634頁(ISBN 0-89573-614-4)。
以引用的方式併入
可能在本申請案全文中引用之所有引用之參考文獻(包括文獻參考、專利、專利申請案及網站)的內容係出於任何目的明確地以全文引用的方式併入本文中，其中所引用之參考文獻亦如此。除非另外指示，否則本發明實施例之實踐將採用於此項技術中所熟知之免疫學、分子生物學及細胞生物學的習知技術。
相等物
該等實施例可在不悖離其精神或基本特徵的情況下以其他特定形式實施。因此前述實施例應視為在所有方面具說明性而非限制性。因此範疇係由隨附申請專利範圍而非前述描述所指示，且因此在申請專利範圍之含義及相等範圍內的所有變化意欲涵蓋於本文中。
<110>　美商亞培公司
<120>　TNF-α結合蛋白
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<141>　2001-12-08
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<170>　PatentIn version 3.5
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Claims (55)

  1. 一種抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 46。
  2. 一種能夠結合TNF-α之抗體或其抗原結合部分，其包含至少一個CDR，該CDR包含SEQ ID NO:31之殘基31-35(CDR-H1)、SEQ ID NO:31之殘基50-66(CDR-H2)、SEQ ID NO:31之殘基99-113(CDR-H3)、SEQ ID NO:32之殘基24-34(CDR-L1)、SEQ ID NO:32之殘基50-56(CDR-L2)或SEQ ID NO:32之殘基89-97(CDR-L3)。
  3. 如請求項2之結合蛋白，其中該結合蛋白包含至少三個CDR。
  4. 如請求項3之結合蛋白，其中該至少三個CDR包含以下可變域CDR組：(a) SEQ ID NO:31之殘基31-35(CDR-H1)、SEQ ID NO:31之殘基50-66(CDR-H2)及SEQ ID NO:31之殘基99-113(CDR-H3)；或(b) SEQ ID NO:32之殘基24-34(CDR-L1)、SEQ ID NO:32之殘基50-56(CDR-L2)及SEQ ID NO:32之殘基89-97(CDR-L3)。
  5. 如請求項4之結合蛋白，其包含至少兩個可變域CDR組。
  6. 如請求項5之結合蛋白，其中該結合蛋白包含以下兩者：(a)　SEQ ID NO:31之殘基31-35(CDR-H1)、SEQ ID NO:31之殘基50-66(CDR-H2)及SEQ ID NO:31之殘基99-113(CDR-H3)；及(b)　SEQ ID NO:32之殘基24-34(CDR-L1)、SEQ ID NO:32之殘基50-56(CDR-L2)及SEQ ID NO:32之殘基89-97(CDR-L3)。
  7. 如請求項6之結合蛋白，其進一步包含人類接受體構架。
  8. 如請求項7之結合蛋白，其中該人類接受體構架包含SEQ ID NOS:10-19或SEQ ID NOS:20-30中之任一者。
  9. 如請求項7或8之結合蛋白，其中該人類接受體構架包含至少一個構架區胺基酸取代，其中該構架之胺基酸序列與該人類接受體構架之序列至少65%一致且包含至少70個與該人類接受體構架一致之胺基酸殘基。
  10. 如請求項8之結合蛋白，其中該人類接受體構架在與CDR相鄰之殘基、糖基化位點殘基、稀有殘基、能夠與人類TNF-α相互作用之殘基、能夠與CDR相互作用之殘基、典型殘基、重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、維尼爾區(Vernier zone)內之殘基及在Chothia定義之可變重鏈CDR1與Kabat定義之第一重鏈構架之間重疊的區域中之殘基處包含至少一個構架區胺基酸取代。
  11. 如請求項10之結合蛋白，其中該殘基為1H、2H、67H、69H、71H、82H、85H、91H，及2L、43L、44L、49L、71L或87L。
  12. 如請求項11之結合蛋白，其中該結合蛋白包含共同人類接受體。
  13. 如請求項1之結合蛋白，其包含：(a)　可變重鏈多肽，其包含SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42；及(b)　可變輕鏈多肽，其包含SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45及SEQ ID NO: 46。
  14. 如請求項13之結合蛋白，其中該結合蛋白包含可變重鏈多肽及可變輕鏈多肽，其包含個別胺基酸序列：SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 32；SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 43；SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 44；SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 36；SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 45；SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 46；SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 43；SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 44；SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 36；SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 45；SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 46；SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 43；SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 44；SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 36；SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 45；SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 46；SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 43；SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 44；SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 36；SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 45；SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 46；SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 43；SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 44；SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 36；SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 45；SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 46；SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 43；SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 44；SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 36；SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 45；SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 46；SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 43；SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 44；SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 36；SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 45；SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 46；SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 43；SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 44；SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 36；SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 45；或SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 46。
  15. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白為：免疫球蛋白分子、二硫鍵連接之Fv、單株抗體、scFv、嵌合抗體、單域抗體、CDR移植抗體、雙功能抗體、人類化抗體、多特異性抗體、Fab、雙重特異性抗體、DVD-Ig蛋白質、Fab'、雙特異性抗體、F(ab')2或Fv。
  16. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白包含人類IgM恆定域、人類IgG4恆定域、人類IgG1恆定域、人類IgE恆定域、人類IgG2恆定域、人類IgG3恆定域或人類IgA恆定域。
  17. 如請求項1之結合蛋白，其進一步包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3之重鏈恆定區。
  18. 如請求項1之結合蛋白，其進一步包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之輕鏈恆定區。
  19. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白能夠中和人類TNF-α。
  20. 如請求項1之結合蛋白，其中如由表面電漿子共振所量測，該結合蛋白與該標靶之締合速率常數(Kon)為至少約102 M-1s-1；至少約103 M-1s-1；至少約104 M-1s-1；至少約105 M-1s-1；或至少約106 M-1s-1。
  21. 如請求項1之結合蛋白，其中如由表面電漿子共振所量測，該結合蛋白與該標靶之解離速率常數(Koff)為至多約10-3 s-1；至多約10-4 s-1；至多約10-5 s-1；或至多約10-6 s-1。
  22. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白與該標靶之解離常數(KD)為至多約10-7 M；至多約10-8 M；至多約10-9 M；至多約10-10 M；至多約10-11 M；至多約10-12 M；或至多10-13 M。
  23. 如請求項22之結合蛋白，其中該結合蛋白與TNF-α之解離常數(KD)為約至多約10-7 M；至多約10-8 M；至多約10-9 M；至多約10-10 M；至多約10-11 M；至多約10-12 M；或至多10-13 M。
  24. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白進一步包含免疫黏附分子、顯影劑、治療劑或細胞毒性劑。
  25. 如請求項24之結合蛋白，其中該顯影劑為放射性標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記或生物素。
  26. 如請求項25之結合蛋白，其中該放射性標記為：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
  27. 如請求項24之結合蛋白，其中該治療劑或細胞毒性劑為抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲***劑、蒽環黴素(anthracycline)、毒素及細胞凋亡劑。
  28. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白具有人類糖基化模式。
  29. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白為結晶化結合蛋白。
  30. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1之結合蛋白胺基酸序列。
  31. 一種載體，其包含編碼如請求項1之結合蛋白胺基酸序列的經分離核酸。
  32. 如請求項31之載體，其中該載體為pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE或pBJ。
  33. 一種宿主細胞，其包含如請求項31之載體。
  34. 如請求項32之宿主細胞，其中該宿主細胞為原核細胞。
  35. 如請求項32之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。
  36. 如請求項34之宿主細胞，其中該真核細胞為原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞或昆蟲細胞。
  37. 如請求項35之宿主細胞，其中該真核細胞為釀酒酵母(S. cerevisiae)、CHO細胞、COS細胞或SF9細胞。
  38. 一種產生能夠結合TNF-α之蛋白質的方法，該方法包含在足以產生能夠結合TNF-α之結合蛋白的條件下，於培養基中培養如請求項32之宿主細胞的步驟。
  39. 一種蛋白質，其係根據如請求項37之方法產生。
  40. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1或37之結合蛋白，及醫藥學上可接受之載劑。
  41. 如請求項39之醫藥組合物，其進一步包含至少一種用於治療因TNF-α活性而受害之病症的其他藥劑。
  42. 如請求項40之醫藥組合物，其中該其他藥劑為：治療劑；顯影劑；細胞毒性劑；血管生成抑制劑；激酶抑制劑；共同刺激分子阻斷劑；黏附分子阻斷劑；抗細胞激素抗體或其功能片段；甲胺喋呤(methotrexate)；環孢靈(cyclosporin)；雷帕黴素(rapamycin)；FK506；可偵測標記或報導體；TNF拮抗劑；抗風濕劑；肌肉鬆弛劑；鎮靜劑(narcotic)；非類固醇消炎藥(NSAID)；止痛劑；麻醉劑(anesthetic)；鎮定劑(sedative)；局部麻醉劑；神經肌肉阻斷劑；抗微生物劑；抗牛皮癬劑；皮質類固醇；同化類固醇(anabolic steroid)；紅血球生成素(erythropoietin)；免疫接種；免疫球蛋白；免疫抑制劑；生長激素；激素替代藥物；放射性藥物；抗抑鬱劑；抗精神病藥；刺激劑；哮喘藥物；β促效劑；吸入型類固醇；口服型類固醇；腎上腺素或其類似物；細胞激素；或細胞激素拮抗劑。
  43. 一種治療哺乳動物之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之如請求項39之組合物的步驟。
  44. 一種降低人類TNF-α活性之方法，其包括使人類TNF-α與如請求項1之結合蛋白接觸，以便降低人類TNF-α活性。
  45. 一種在罹患因TNF-α活性而受害之病症的人類個體中降低人類TNF-α活性的方法，其包括向該人類個體投與如請求項1之結合蛋白，以降低該人類個體中之人類TNF-α活性。
  46. 一種治療個體中因TNF-α活性而受害之疾病或病症的方法，其係向該個體投與如請求項1之結合蛋白而達成治療。
  47. 如請求項45之方法，其中該病症為自體免疫病症及/或發炎性病症。
  48. 如請求項45之方法，其中該病症為克羅恩氏病(Crohn's disease)、斑塊牛皮癬、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、骨關節炎、青少年特發性關節炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、僵直性脊椎炎、胰島素依賴性糖尿病、自體免疫糖尿病、過敏症及自體免疫葡萄膜炎。
  49. 如請求項46之方法，其中該病症為呼吸道病症；哮喘；過敏性及非過敏性哮喘；由於感染引起之哮喘；由於感染呼吸道融合性病毒(respiratory syncytial virus，RSV)引起之哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及氣管發炎之病狀；嗜伊紅血球增多症(eosinophilia)；纖維化及過量黏液產生；囊腫性纖維化；肺纖維化；異位性病症；異位性皮炎；蕁麻疹；濕疹；過敏性鼻炎；過敏性腸胃炎；皮膚之發炎性及/或自體免疫病狀；胃腸器官之發炎性及/或自體免疫病狀；發炎性腸病(IBD)；潰瘍性結腸炎；克羅恩氏病；肝臟之發炎性及/或自體免疫病狀；肝硬化；肝纖維化；由B型肝炎及/或C型肝炎病毒所引起之肝纖維化；硬皮病；腫瘤或癌症；肝細胞癌；神經膠母細胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；病毒感染；細菌感染；寄生蟲感染；HTLV-1感染；保護性第1型免疫反應之表現的抑制，及在疫苗接種期間保護性第1型免疫反應之表現的抑制。
  50. 一種治療罹患因TNF-α活性而受害之病症之患者的方法，其包括在投與第二藥劑之前、同時或之後投與如請求項1之結合蛋白，其中該第二藥劑為能夠結合人類IL-12之抗體或其片段；PGE2；LPA；NGF；CGRP；SubP；RAGE；組織胺；組織胺受體阻斷劑；緩激肽(bradykinin)；IL-1α；IL-1β；VEGF；PLGF；甲胺喋呤；皮質類固醇、糖皮質激素受體調節劑；環孢靈、雷帕黴素、FK506或非類固醇消炎劑。
  51. 一種治療罹患因TNF-α活性而受害之病症之患者的方法，該方法包括在投與第二藥劑之前、同時或之後投與如請求項1之結合蛋白的步驟，其中該第二藥劑選自：TNF拮抗劑；TNF受體之可溶性片段；ENBREL；TNF酶拮抗劑；TNF轉化酶(TACE)抑制劑；蕈毒鹼受體拮抗劑；TGF-β拮抗劑；干擾素γ；吡非尼酮(perfenidone)；化學治療劑、甲胺喋呤；來氟米特(leflunomide)；西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素)或其類似物CCI-779；COX2或cPLA2抑制劑；NSAID；免疫調節劑；p38抑制劑；TPL-2、MK-2及NFkB抑制劑；布替耐德(budenoside)；表皮生長因子；皮質類固醇；環孢靈；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；胺基水楊酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤(azathioprine)；甲硝噠唑(metronidazole)；脂肪加氧酶抑制劑；美沙拉嗪(mesalamine)；奧沙拉嗪(olsalazine)；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化劑；血栓素(thromboxane)抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1b抗體；抗IL-6抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF之抗體或促效劑；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配體之抗體；FK506；雷帕黴素；黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)；布洛芬(ibuprofen)；潑尼松龍(prednisolone)；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷促效劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上腺素激導劑；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑；IL-1β轉化酶抑制劑；TNFa轉化酶抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；6-巰基嘌呤；血管緊張素轉化酶抑制劑；可溶性細胞激素受體；可溶性p55 TNF受體；可溶性p75 TNF受體；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗發炎細胞激素；及TGFb。
  52. 如請求項40至48之方法，其中該向該個體之投藥法係至少藉由非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內(intracavitary)、體腔內(intracelial)、小腦內、腦室內、結腸內(intracolic)、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、***內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸腔內、子宮內、膀胱內、快速注射、經***、經直腸、經頰、舌下、鼻內或穿皮式投藥。
  53. 一種偵測樣本中之人類TNF-α的方法，其包括：(i)　使該樣本與如請求項1之TNF-α結合蛋白或其TNF-α結合部分接觸；及(ii)　偵測該樣本中該TNF-α結合蛋白或其結合部分與TNF-α之間複合物之形成，其中相對於對照樣本中之該複合物形成或相對於該樣本中之TNF-α，該樣本中該複合物之形成具有統計學上顯著之變化。
  54. 如請求項51之方法，其中該樣本為全血、血漿、血清、尿液、唾液或組織生物檢體。
  55. 一種偵測人類個體中之人類TNF-α的方法，其包括：(i)　在允許如請求項1之TNF-α結合蛋白或其TNF-α結合部分與人類TNF-α結合之條件下，向測試個體或對照個體投與該TNF-α結合蛋白或其TNF-α結合部分；及(ii)　偵測該結合蛋白或其結合部分與TNF-α之間複合物之形成，其中相對於該對照個體或相對於在早先時間點該測試個體中之該複合物形成，該測試個體中該複合物之形成具有統計學上顯著之變化時，表示其中存在TNF-α。
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