TW201247870A - Cell culture media for UVC exposure and methods related thereto - Google Patents

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201247870 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於針對曝露於C波段紫外線（UVC)光曝射而 最佳化之細胞培養基及其相關方法。 本申請案主張2011年2月23曰申請之美國臨時申請案第 61/445，988號之權益’該案以引用的方式併入本文中。 【先前技術】 將用於製造醫藥產品之細胞培養基的滅菌為作為用以產 生尚品質醫藥產品之製程之一部分的重要步驟以防止發生 生物負荷。此通常藉由滅菌級過滤（0.2或〇· 1微米絕對等級 過濾器）來達成。細胞培養基及上清液之黴漿菌及病毒污 染亦對全世界生物醫藥製造商造成巨大挑戰。已採用若干 方法來不活化及/或移除溶液中之較大或較小、包膜或非 包膜（或「裸」）DNA或RN Α病毒粒子。此等方法之實力包 括過據（奈米、病毒或0.1微米）、層析、分批熱處理、流通 式高溫短時（HTST)、γ照射、低pH值及化學不活化（溶劑、 清潔劑）、及分批或流通式C波段紫外光（UVC)。HTST為用 於控制病毒之經驗證方法，然而’其對含有諸如血清之蛋 白質性組分之細胞培養基具有不利作用。另外，已使用不 活化病毒粒子之化學處理，不過此等化學品之常見毒性性 質限制其在醫藥製造中之使用。此外，HTST需要工廠中 專用且整合之基礎結構，此可能成為預期製造醫藥劑及治 療劑時的考慮因素。 除上述技術以外，已使用UVC技術以在自細胞上清液純 162282.doc 201247870 化大規模蛋白質製劑之前處理此等蛋白質9參見例如美國 專利申請公開案第20100203610A1號。UVC技術依賴於光 譜紫外波長範圍内之光的特性以破壞非想要有機體之 DNA/RNA。UVC處理之強度（視為UVC劑量）係由光通量之 強度及液體曝露於UVC光源之時間來規定$雖然所提供之 UVC劑量需要足以有效地不活化所要有機體，但必須不會 過高以致破壞溶液中對於包括目標蛋白質產生及品質之穩 固製程而言所必需之組分。儘管培養基之uvc處理為病毒 不活化之有效方式’但本發明發明者已發現，與未曝露於 UVC光之培養基相比’使用在培育前已曝露於uvc光之培 養基培育之細胞所產生的蛋白質效價減小。 因此’在此項技術中需要UVC可處理細胞培養基，及用 於醫藥製造中之使用UVC處理細胞培養基之方法。該等方 法可尤其適用於保護有價值之細胞株免受病毒污染，節約 因受污染且不可用之培養基而損失之成本，及增加該等細 胞株之蛋白質產生效率。因此，該等方法之開發可廣泛應 用於生物醫藥之製造中。 【發明内容】 本文提供一種細胞培養基，其包含（a)曝露於uvc光之基 礎培養基；及（b)包含UV敏感性培養基組分之添加劑包， 其在UVC曝射後添加至該基礎培養基中。在一個實施例 中’基礎培養基不包含至少一種、兩種、三種、四種、五 種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或 十三種選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、苯 162282.doc 201247870 丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、β比令酿、0比 哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤（methotrexate)及維生素 B12。在另一實施例中’添加劑包包含至少一種、兩種、 三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十 一種、十二種或十三種選自由以下組成之群的組分：硫辛 酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、於驗醜 胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生 素B12。在另一實施例中，基礎培養基呈粉末或液體形 式，且添加劑包呈粉末或液體形式。在另一實施例中，培 養基適於培養哺乳動物細胞；而在另一實施例中，培養基 適於培養昆蟲細胞。 本文亦提供一種用於製造經UVC曝射之細胞培養基調配 物之方法，該方法包含以下步驟：（a)使基礎培養基曝露於 UVC光；及（b)將包含uv敏感性組分之添加劑包添加至該 經UVC曝射之基礎培養基中。在一個實施例中，基礎培養 基不匕3至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七 種、八種、九種、十種、十一種、十二種或十三種選自由 以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺 酸路胺k、葉酸、於驗酿胺、β比哆酸·、U比哆醇、核黃 素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12。在另一實施例中， 添加劑G包含至少一種、兩種、三種、四種、五種、六 種 種人種、九種、十種、十一種、十二種或十三種 選自由以下組成之群的組分：梳辛酸、組胺酸、*** 1色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆 162282.doc 201247870 醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12»在另一實 施例中，UVC光之波長為約254 nm。在另一實施例中，基 礎培養基曝露於能量密度為約25 mJ/cm2至約350 mJ/cm2之 UVC光。在另一實施例中’基礎培養基曝露於能量密度為 約125 mJ/cm2之UVC光；而在另一實施例中，基礎培養基 曝露於能量密度為約175 mJ/cm2之11¥(：光〇在另一實施例 中’使基礎培養基曝露於UVC光之步驟足以破壞基礎培養 基中任何非包膜病毒之核酸。在另一實施例中，UVC光係 使用薄膜UVC反應器傳遞；而在另一實施例中，uvc光係 使用螺旋狀UVC反應器傳遞。 本文亦提供一種用於產生蛋白質之方法，該方法包含以 下步驟：（a)使基礎培養基曝露於uVC光；（b)將包含…敏 感性培養基組分之添加劑包添加至該經uvc曝射之基礎培 養基中；及（c)在經UVC處理之培養基中培養細胞以產生所 要蛋白質。在一個實施例中，基礎培養基不包含至少一 種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九 種、十種、十一種、十二種或十三種選自由以下組成之群 的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、路胺酸、 葉酸、終驗醯胺…比吟酸、。比„多醇、核黃素、硫胺素、曱 胺嗓呤及維生素812。在另-實施例中，添加劑包包含至 少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、 九種、十種、十一種、十二種或十三種選自由以下組成之 群的組分：硫辛酸、組胺酸、笨丙胺酸、色胺酸、酪胺 酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛'吡哆醇、核黃素、硫胺 162282.doc -6- 201247870 素、甲胺碟吟及維生素B 12。在另一實施例中，UVC光之 波長為約254 nm。在另一實施例中，基礎培養基曝露於能 量密度為約25 mJ/cm2至約350 mJ/cm2之UVC光。在另一實 施例中’基礎培養基曝露於能量密度為約125 mJ/cm2之 UVC光；而在另一實施例中，基礎培養基曝露於能量密度 為約175 mJ/cm2之UVC光。在另一實施例中，使基礎培養 基曝露於UVC光之步驟足以破壞基礎培養基中任何非包膜 病毒之核酸。在另一實施例中，UVC光係使用薄膜UVC反 應器傳遞；而在另一實施例中，UVC光係使用螺旋狀UVC 反應器傳遞。在一個實施例中，細胞為CHO細胞。在另一 實施例中，蛋白質為重組人類紅血球生成素。 【實施方式】 本文所用之章節標題僅為達成組織目的，且不應解釋為 限制其中所述之主題。本申請案中所引用之所有參考文獻 皆以引用的方式明確併入本文中》除非本文另有定義，否 則與本發明相關聯使用之科學及技術術語應具有一般技術 者通常所理解之含義。此外，除非上下文另有要求，否則 單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。 本發明解決此項技術中對於UVC可處理細胞培養基之需 要。在開發本發明之新穎調配物及方法中須克服若干障 礙。以原始培養基為起始材料，藉由自原始培養基中移除 UV敏感性組分來嘗試調配穩定的新基礎培養基》相當意 外的是，然而’發現自原始培養基中移除UV敏感性組分 導致不包含UV敏感性組分之新基礎培養基與包含UV敏感 162282.doc 201247870 性組分之添加劑包中均出現某些不穩定性及溶解度問題。 不能對經分離混合物之行為進行預測係源於混合物内眾 多組分之間及兩者間的化學相互作用。更特定言之，添加 劑包之溶解度問題據信源於自缓衝系統中質子之相互作 用。此外，新基礎培養基及添加劑包之不穩定性問題亦可 能源於其他相互作用，諸如經由可能因曝露於uvc輻射而 產生之反應性氧物質。 意外的是，發現添加劑包不穩定。添加劑包當自原始基 礎培養基中移除時最初不為可溶或熱穩定的。為重新獲得 類似於原始培養基之穩定性，必需藉由添加滴定劑來調整 混合物之pH值以使其可溶且穩定。 另一意外觀測結果與當用UV處理時不包含1)¥敏感性組 分之新基礎培養基中的相互作用相關，該相互作用使得基 礎培養基之關鍵組分受破壞。此破壞將不可預測，此係由 於添加劑包中之組分最初淬滅原始培養蓦中之反應性物 質’藉此保護其免於遭受UV之故。因置放於添加劑包中 而不存在於新基礎培養基中之潛在淬滅劑的非限制性實例 包括吡哆醛及吡哆醇。保留於新基礎培養基中之可能已因 不存在額外淬滅劑而受破壞之淬滅劑的非限制性實例包括 丙酮酸鹽。保留於新基礎培養基中之可能已因不存在額外 淬滅劑而受破壞之關鍵組分的非限制性實例包括胎牛血清 蛋白。 令人驚訝的是，然而’添加劑包在某些態樣中如複雜混 合物（例如原始基礎培養基）一般自穩定《添加劑包之天然

162282.doc 201247870 pH值為約6.7，與基礎培養基大致相同β 另一意外效果與UVC反應器之類型及相關劑量分佈有 關。例如層狀或薄膜反應器之若干製程1;¥(:反應器產生寬 劑量分佈，其通常具有高劑量尾部。雖然新培養基接收此 寬分佈（及過度曝射），但令人驚訝的是未顯著受破壞，如 效價校正所證實。先前研究使用螺旋狀UVC反應器，其相 較於薄膜反應器產生緊密劑量分佈。此等研究顯示uvc處 理使得效價（產物濃度）降低。當原始培養基經薄膜uvc處 理時，結果為總製程失效，亦即完全不發生細胞附著於滾 瓶且不發生細胞生長。 因此，在一個態樣中，本發明提供一種適於曝射之 細胞培養基，其中該培養基包含基礎培養基及包含。、敏 感性培養基組分之添加劑包，該添加劑包在uvc曝射後添 加至基礎培養基中。在另一態樣中，本發明另外提供一種 用於製造經UVC曝射之細胞培養基調配物之方法，該方法 包含以下步驟：調配基礎培養基，使基礎培養基曝露於 uvc光，及將包含uv敏感性組分之添加劑包添加至經 UVC曝射之基礎培養基中。在另一態樣中，本發明另外提 供種用於產生蛋白質之方法，該方法包含以下步驟：使 基礎培養基曝露於UVCS，將包含uv敏感性培養基組分 之添加劑包添加至經uvc曝射之基礎培養基中，及在經 uvc處理之培養基中培養細胞以產生所要蛋白質。 UV敏感性培養基组分 如下文進-步論述，細胞培養基包含許多支持細胞在活 162282.doc 201247870 體外環境中增殖之不同組分。已發現某些培養基組分對 UVC光敏感且當曝露於uvc光時降解。此繼而導致自細胞 培養物中產生之蛋白質減少。為克服細胞培養基經處 理時所觀測之對蛋自質產物效㈣此有㈣響，需要適於 UVC曝射之新基礎培養基。因此，本發明之—目的在於提 供不包含UV敏感性組分之基礎培養基及包含1；乂敏感性組 分之添加劑包。如本文所用t「基礎培養基」係指不包含 某些UV敏感性組分之液體、粉末或其他形式之細胞培養 基。如本文所用之「添加劑包」係指欲在基礎培養基已曝 露於UVC光之後添加至基礎培養基中之液體、粉末或其他 形式之UV敏感性組分。 在一個實施例中，基礎培養基呈粉末形式且添加劑包呈 粉末形式。在另一實施例中，基礎培養基呈粉末形式且添 加劑包呈液體形式。在另一實施例中，基礎培養基呈液體 形式且添加劑包呈粉末形式。在另一實施例中，基礎培養 基呈液體形式且添加劑包呈液體形式。 在一個實施例中，適於UVC曝射之基礎培養基為不包含 至少一種選自由以下組成之群之組分的液體培養基：硫辛 酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸驗酿 胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生 素B12(氰姑胺素（cyanac〇balamin))。在另—實施例中，適 於UVC曝射之基礎培養基為不包含至少兩種選自由以下組 成之群之組分的液體培養基：硫辛酸、組胺酸、*** 酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、。比〇多 162282.doc 201247870 醇、核黃素、硫胺素、曱胺喋呤及維生素B12。在一個實 施例中，適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至少三種選 自由以下組成之群之組分的液體培養基：硫辛酸、組胺 酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、終驗醯胺、吡哆 醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺喋呤及維生素B12。 在另一實施例中，適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至 少四種選自由以下組成之群之組分的液體培養基：硫辛 酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯 胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生 素B 12。在另一實施例中，適於UVC曝射之基礎培養基為 不包含至少五種選自由以下組成之群之組分的液體培養 基：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉 酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺 喋呤及維生素B12。在另一實施例中，適於uvC曝射之基 礎培養基為不包含至少六種選自由以下組成之群之組分的 液體培養基.硫辛酸、組胺酸、笨丙胺酸、色胺酸、路胺 酸、葉酸、於驗酿胺、β比哆裕、》比哆醇、核黃素、硫胺 素、甲胺嗓吟及維生素Β12。在一個實施例中，適於uvc 曝射之基礎培養基為不包含至少七種選自由以下組成之群 之組分的液體培養基：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺 酸、酷胺酸、葉酸、於驗醢胺、ο比哆路、β比哆醇、核黃 素、硫胺素、曱胺喋呤及維生素Β12。在另一實施例中， 適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至少八種選自由以下 組成之群之組分的液體培養基：硫辛酸、組胺酸、*** 162282.doc -I!- 201247870 酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆 醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12»在另一實 施例中，適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至少九種選 自由以下組成之群之組分的液體培養基：硫辛酸、組胺 酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆 醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素 '甲胺喋呤及維生素Β12。 在另一實施例中，適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至 少十種選自由以下組成之群之組分的液體培養基：硫辛 酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯 胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生 素Β12。在另一實施例中，適於uvc曝射之基礎培養基為 不包含至少十一種選自由以下組成之群之組分的液體培養 基：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺醆、酪胺酸、葉 酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺 喋呤及維生素B 12。在一個實施例中，適於uvc曝射之基 礎培養基為不包含至少十二種選自由以下組成之群之組分 的液體培養基：硫辛酸、組胺酸、***酸、色_酸、酪 胺酸、葉酸、於驗酿胺、η比哆酿、β比哆醇、核黃素、硫胺 素、甲胺碟吟及維生素Β12。在另一實施例中，適於uvc 曝射之基礎培養基為不包含硫辛酸、組胺酸、***酸、 色胺酸、路胺酸、葉酸 '终驗醢胺、β比哆酿、。比哆醇、核 黃素、疏胺素、曱胺喋呤及維生素Β12之液體培養基。 在一個實施例中，適於UVC曝射之基礎培養基為不包含 至少一種選自由以下組成之群之組分的粉末培養基：硫辛 162282.doc -12· 201247870 酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、終驗酿 胺、吡哆醛、β比哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生 素Β12。在另一實施例中，適於UVC曝射之基礎培養基為 不包含至少兩種選自由以下組成之群之組分的粉末培養 基：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、路胺酸、葉 酸、菸鹼醢胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺 喋呤及維生素Β12。在另一實施例中，適於UVC曝射之基 礎培養基為不包含至少三種選自由以下組成之群之組分的 粉末培養基：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、赂胺 酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺 素、曱胺喋呤及維生素Β 12。在另一實施例中，適於uVC 曝射之基礎培養基為不包含至少四種選自由以下組成之群 之組分的粉末培養基：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺 酸、酷·胺酸、葉酸、於驗酿胺、他哆酿、咕哆醇、核黃 素、硫胺素、甲胺嗓呤及維生素Β12。在另一實施例中， 適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至少五種選自由以下 組成之群之組分的粉末培養基：硫辛酸、組胺酸、*** 酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼.醢胺、吡哆醛、吡哆 醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12。在另一實 施例中，適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至少六種選 自由以下組成之群之組分的粉末培養基：硫辛酸、組胺 酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、於驗醯胺、吡。多 路、°比哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺喋呤及維生素Β12。 在另一實施例中’適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至 162282.doc •13- 201247870 少七種選自由以下組成之群之組分的粉末培養基：硫辛 酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯 胺、吡吟醛、吡吟si '核黃素、硫胺素 '甲胺喋呤及維生 素B12。在另一實施例中，適於uvc曝射之基礎培養基為 不包含至少八種選自自以下組成之群之組分的粉末培養 基：硫辛酸、組胺酸、笨丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、葉 酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺 喋呤及維生素B 12 »在另一實施例中，適於uvc曝射之基 礎培養基為不包含至少九種選自由以下組成之群之組分的 粉末培養基：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺 酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇核黃素、硫胺 素 '甲胺。禁吟及維生素B12。在另一實施例中，適於uvc 曝射之基礎培養基為不包含至少十種選自由以下組成之群 之組分的粉末培養基：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺 酸、路胺酸、葉酸、於驗醯胺、β比哆路> D比哆醇、核黃 素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素B12。在另一實施例中， 適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至少--種選自由以 下組成之群之組分的粉末培養基：硫辛酸、組胺酸、苯丙 胺酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡„多 醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12»在另一實 施例中’適於UVC曝射之基礎培養基為不包含至少十二種 選自由以下組成之群之組分的粉末培養基：硫辛酸、組胺 酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸'菸鹼醯胺、吡哆 搭、》比哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素B12。 162282.doc • 14· 201247870 在另一實施例中，適於uvc曝射之基礎培養基為不包含硫 辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼 醯胺、°比哆路、吡哆醇、核黃素、硫胺素' 曱胺喋呤及維 生素B12之粉末培養基。 在一個實施例中’添加劑包為包含至少一種選自由以下 組成之群之組分的液體：硫辛酸、組胺酸、***酸、色 胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃 素、硫胺素、曱胺喋呤及維生素B12。在另一實施例中， 添加劑包為包含至少兩種選自由以下組成之群之組分的液 體：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉 酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺 喋呤及維生素Β12»在另一實施例中，添加劑包為包含至 少二種選自由以下組成之群之組分的液體：硫辛酸、組胺 酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆 路、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素B12。 在另一實施例中’添加劑包為包含至少四種選自由以下組 成之群之組分的液體：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺 酸、酪胺酸、葉酸、菸驗醯胺、β比哆醛、β比哆醇、核黃 素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12。在另一實施例中， 添加劑包為包含至少五種選自由以下組成之群之組分的液 體：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酷·胺酸、葉 酸、终驗醯胺、吡哆酸、吡哆醇、核黃素' 硫胺素、曱胺 喋呤及維生素Β12。在另一實施例中，添加劑包為包含至 少六種選自由以下組成之群之組分的液體：硫辛酸、組胺 162282.doc •15- 201247870 心、***酸、色胺酸、路胺酸、葉酸'於驗酿胺、β比吟 醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Βΐ2。 在另一實施例中，添加劑包為包含至少七種選自由以下組 成之群之組分的液體：硫辛酸、組胺酸'笨丙胺酸、色胺 酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃 素、硫胺素、曱胺喋呤及維生素Β12 ^在—個實施例中’ 添加劑包為包含至少八種選自由以下組成之群之組分的液 體.硫辛酸、組私酸、***酸、色胺酸、路胺酸、葉 ^終驗酿胺、°比哆越、°比哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺 喋呤及維生素Β12。在另一實施例中，添加劑包為包含至 少九種選自由以下組成之群之組分的液體：硫辛酸、組胺 酸、笨丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆 路' °比°多醇、核黃素、硫胺素 '曱胺喋呤及維生素β12。 在另一實施例中’添加劑包為包含至少十種選自由以下組 成之群之組分的液體：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺 酸、酪胺酸、葉酸 '菸鹼醯胺、吡哆醛，吡哆醇、核黃 素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12。在另一實施例中， 添加劑包為包含至少十一種選自由以下組成之群之組分的 液體：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉 酸、终鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺 蝶及維生素Β12。在另一實施例中，添加劑包為包含至 少十二種選自由以下組成之群之組分的液體：硫辛酸、組 胺酸、***酸、色胺酸'酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡 今路、。比哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素 162282.doc

S •16· 201247870 B 12 °在另一實施例中，添加劑包為包含硫辛酸、組胺 酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆 酿、°比Π多醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素B12之 液體。 在一個實施例中，添加劑包呈粉末狀且包含至少一種選 自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、 色胺酸、路胺酸、葉酸、於驗醯胺、》比哆酿、η比哆醇、核 黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12。在另一實施例 中’添加劑包呈粉末狀且包含至少兩種選自由以下組成之 群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺 酸、葉酸、菸鹼酿胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺 素、甲胺喋呤及維生素Β 1 2。在一個實施例中，添加劑包 呈粉末狀且包含至少三種選自由以下組成之群的組分：硫 辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼 醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺喋呤及維 生素Β12。在另一實施例中，添加劑包呈粉末狀且包含至 四種選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、笨 丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡 今醇、核黃素' 硫胺素、曱胺喋呤及維生素Β12β在另— 實施例中，添加劑包呈粉末狀且包含至少五種選自由以下 組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、 酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺' 吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫 胺素、曱胺喋呤及維生素Β12。在另一實施例中，添加劑 包呈粉末狀且包含至少六種選自由以下組成之群的組分· 162282.doc •17- 201247870 硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、终 驗醯胺、°比啤路、比哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺喋呤及 維生素B12。在另一實施例中，添加劑包呈粉末狀且包含 至少七種選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、 ***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、 。比啤醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素b12。在另 一實施例中’添加劑包呈粉末狀且包含至少八種選自由以 下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺 酸、酷胺酸、葉酸、终驗酿胺、。比。多路、β比哆醇、核黃 素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12β在另一實施例中， 添加劑包呈粉末狀且包含至少九種選自由以下組成之群的 組分：硫辛酸、組胺酸、笨丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、葉 酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺 嗓呤及維生素Β12。在另-實施例中，添加劑包呈粉末狀 且包s至J十種選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組 胺酸、***酸、色胺酸、赂胺酸、帛酸、錢酿胺、他 多醛吡哆醇、核黃素、硫胺素、曱胺喋呤及維生素 B12。在另一實施例中，添加劑包呈粉末狀且包含至少十 -種選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、苯丙 胺酸色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆 醇、核黃^

施例中， 組成之群 酪胺酸、 162282.doc 201247870 胺素、曱胺喋呤及維生素B12。在另一實施例中，添加劑 包呈粉末狀且包含硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、 赂胺s*·、葉酸、终驗醯胺、β比β多路、吼0多醇、核黃素、硫 胺素、甲胺喋呤及維生素Β12。 在另一實施例中，本發明係關於一種套組，其包含適於 UVC曝射之基礎培養基及添加劑包。 在一個實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步 包含至少一種選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺 酸、笨丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、於驗醯胺、吡哆 越、°比°多醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12, 其添加至經UVC曝射之基礎培養基中。在另一實施例中， 已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含至少兩種選自由 以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺 酸、路胺酸、葉酸、於驗酿胺、β比哆酿 '吼哆醇、核黃 素、硫胺素、曱胺喋呤及維生素Β12，其添加至經uvc曝 射之基礎培養基中》在另一實施例中，已曝露於uvc光之 基礎培養基進一步包含至少四種選自由以下組成之群的組 为·硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉 酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺 喋呤及維生素B12,其添加至經uvc曝射之基礎培養基 中。在另一實施例中，已曝露於uvc光之基礎培養基進一 步包含至少五種選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組 胺酸、***酸、色胺酸、路胺酸、葉酸、於驗酿胺、吡 哆醛'吡哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素 162282.doc • 19- 201247870 B12,其添加至經UVC曝射之基礎培養基中。在另一實施 例中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含至少六種 選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、*** 酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆 醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12，其添加至 經UVC曝射之基礎培養基中。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含至少七種選自由以下組成 之群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺 酸、葉酸、菸驗醯胺、α比哆搭、吡哆醇、核黃素、硫胺 素、曱胺喋呤及維生素Β12，其添加至經IJVC曝射之基礎 培養基中。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養 基進一步包含至少八種選自由以下組成之群的組分：硫辛 酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯 胺、°比哆路、°比哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生 素Β12，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中。在另一實 施例中’已曝露於UVC光之基礎培養基進—步包含至少九 種選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、组胺酸、*** 酸、色胺酸、赂胺酸、葉酸、於驗酿胺、^比!!多酿、啦今 醇 '核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12,其添加至 經UVC曝射之基礎培養基中。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含至少十種選自由以下組成 之群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸 '酪胺 心、葉酸、於驗酿胺、β比n多路、β比β多醇、核黃素、硫胺 素、甲胺喋呤及維生素Β12，其添加至經XJVC曝射之基礎 162282.doc •20· 201247870 培養基中。在另—實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養 基進-步包含至少十一種選自由以下組成之群的組分：硫 辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、赂胺酸、帛酸、於驗 醯胺、吡吟醛、吡。多醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維 生素B12，其添加至經uvc曝射之基礎培養基中。在另一 實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含至少 十一種選自由以下組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、苯 丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醢胺、吡哆醛、吡 哆醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素B12，其添加 至經UVC曝射之基礎培養基中。在另一實施例中，已曝露 於UVC光之基礎培養基進一步包含硫辛酸、組胺酸、苯丙 胺酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆 醇、核黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素b12，其添加至 經UVC曝射之基礎培養基中。 在以下關於UV敏感性組分之濃度的描述中，特定濃度 及濃度範圍為lx培養基之最終濃度。熟練從業者應輕易地 預見2x培養基溶液所必需之濃度（亦即既定濃度及範圍之 兩倍）、3 X培養基溶液所必需之濃度（亦即既定濃度之三 倍），及其類似情況。 在一個實施例中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步 包含葉酸’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 〇·1至約10.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含葉酸，其添加至經uvc曝 射之基礎培養基中，得到約〇.5至約5.0 mg/L之濃度。在另 162282.doc -21 - 201247870 一實施例中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含葉 酸’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約1 ·〇至 約3 ·0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之 基礎培養基進一步包含葉酸’其添加至經UVC曝射之基礎 培養基中’得到約2.0至約3.0 mg/L之濃度。在另一實施例 中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含葉酸，其添 加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約2 〇 mg/]L之濃 度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一 步包含葉酸’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到 約2 · 5 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之 基礎培養基進一步包含葉酸，其添加至經UVC曝射之基礎 培養基中，得到約3.0 mg/L之濃度。 在一個實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步 包含組胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到 約1.0至約100.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含組胺酸，其添加至經uvc 曝射之基礎培養基中，得到約10.0至約90.0 mg/L之濃度。 在另一實施例_，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含組胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 10.0至約80.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 uvc光之基礎培養基進一步包含組胺酸，其添加至經uvc 曝射之基礎培養基中，得到約10.0至約70.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含組胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 . 162282.doc •22· 201247870 15.0至約55.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含組胺酸，其添加至經UVC 曝射之基礎培養基中，得到約20.0至約50.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含組胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 25.0至約40.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含組胺酸，其添加至經UVC 曝射之基礎培養基中，得到約25.0至約35.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含組胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 30.0至約35.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含組胺酸，其添加至經UVC 曝射之基礎培養基中，得到約30.0至約33.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含組胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 3 1.0至約32.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含組胺酸，其添加至經uvc 曝射之基礎培養基中，得到約31.0 mg/L之濃度。在另一實 施例中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含組胺 酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約32.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之基礎培 養基進一步包含組胺酸，其添加至經uvc曝射之基礎培養 基中，得到約31.5 mg/L之濃度。 在一個實施例中，已曝露於XJVC光之基礎培養基進一步 162282.doc -23- 201247870 包含***酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得 到約1.0至約1 00.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露 於UVC光之基礎培養基進一步包含***酸，其添加至經 UVC曝射之基礎培養基中，得到約1〇.〇至約9〇〇 mg/L之浪 度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之暴礎培養基進一 步包含***酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中， 得到約10.0至約80.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝 露於UVC光之基礎培養基進一步包含***酸，其添加至 經UVC曝射之基礎培養基中，得到約1〇〇至約70 0 mg/L之 濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進 一步包含***酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基 中，得到約15.0至約55.0 mg/L之濃度。在另一實施例中， 已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含笨丙胺酸，其添 加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約20 0至約50 0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之基礎培 養基進一步包含***酸，其添加至經UVC曝射之基礎培 養基中，得到約25.0至約40.0 mg/L之濃度。在另一實施例 中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含***酸， 其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約3〇 〇至約 40.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uve光之基 礎培養基進一步包含***酸，其添加至經UVC曝射之基 礎培養基中，得到約32.0至約38.0 mg/L之濃度。在另一實 施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含*** 酸’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約34.0至 162282.doc •24· 201247870 約3 6_0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之 基礎培養基進一步包含***酸，其添加至經UVC曝射之 基礎培養基中’得到約35.0 mg/L之濃度。在另一實施例 中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含***酸， 其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約36.〇 mg/L之 濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進 一步包含***酸’其添加至經UVC曝射之基礎培養基 中，得到約35.5 mg/L之濃度。 在一個實施例中，已曝露於uvc光之基礎培養基進一步 包含色胺酸’其添加至經uvc曝射之基礎培養基中，得到 約0.1至約50.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含色胺酸，其添加至經uvc 曝射之基礎培養基中，得到約1.0至約2〇 〇 mg/L之濃度》 在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含色胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 5.0至約15.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含色胺酸，其添加至經UVC 曝射之基礎培養基中，得到約8.0至約12.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含色胺酸’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 8.〇至約10.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含色胺酸，其添加至經UVC 曝射之基礎培養基中，得到約8.0 mg/L之濃度。在另一實 施例中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含色胺 162282.doc -25- 201247870 酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約8.5 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之基礎培 養基進一步包含色胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養 基中’得到約9.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露 於UVC光之基礎培養基進一步包含色胺醆，其添加至經 UVC曝射之基礎培養基中，得到約9.5 mg/L之濃度。 在一個實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步 包含酪胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到 約1 ·0至約1 〇〇·〇 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含酪胺酸，其添加至經UVC 曝射之基礎培養基中，得到約10.0至約90.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含酪胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 20_0至約80.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含酪胺酸，其添加至經UVC 曝射之基礎培養基中，得到約30.0至約70.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含酪胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 40.0至約60.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含酪胺酸，其添加至經UVC 曝射之基礎培養基中，得到約50.0至約60.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含酪胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 53.0至約57.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於

162282.doc -26- S 201247870 UVC光之基礎培養基進一步包含酪胺酸，其添加至經uvc 曝射之基礎培養基中’得到約54,0至約56.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含酪胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 5 5.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基 礎培養基進一步包含酪胺酸，其添加至經UVC曝射之基礎 培養基中，得到約55.5 mg/L之濃度。在另一實施例中，已 曝露於UVC光之基礎培養基進一步包含酪胺酸，其添加至 經UVC曝射之基礎培養基中，得到約60.0 mg/L之濃度。 在一個實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基進一步 包含硫辛酸’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，.得到 約0.01至約10.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基進一步包含硫辛酸，其添加至經uvc 曝射之基礎培養基中，得到約0.05至約5.0 mg/L之濃度。 在另一實施例中’已曝露於UVC光之基礎培養基進一步包 含硫辛酸’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 0.08至約0.12 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 uvc光之基礎培養基進一步包含硫辛酸，其添加至經uvc 曝射之基礎培養基中’得到約0.100至約〇 11() mg/L之漢 度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含 硫辛酸’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 0.101至約0.107 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 uvc光之基礎培養基包含硫辛酸，其添加至經uvc曝射之 基礎培養基中，得到約〇·102至約0.104 mg/L之濃度。在另 162282.doc -27· 201247870

一實施例中’已曝露於uvc光之基礎培養基包含硫辛酸， 其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約〇 1〇2 mg/L 之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之基礎培養基 包含硫辛酸，其添加至經uvc曝射之基礎培養基中，得到 約0.103 mg/L之濃度。在另一實施例中，己曝露於uvc光 之基礎培養基包含硫辛酸，其添加至經uvc曝射之基礎培 養基中’得到約0.104 mg/L之濃度。 在一個實施例t，已曝露於UVC光之基礎培養基包含菸 鹼醯胺’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 〇·1至約10.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基包含菸鹼醯胺，其添加至經曝射 之基礎培養基中，得到約0.5至約5_0 mg/L之濃度。在另一 實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含菸鹼醯胺， 其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約1〇至約3〇 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之基礎培 養基包含菸鹼醯胺，其添加至經UVC曝射之基礎培養基 中’得到約1.5至約2.5 mg/L之濃度。在另實施例中，已 曝露於UVC光之基礎培養基包含菸鹼醯胺，其添加至經 UVC曝射之基礎培養基中，得到約丨$ mg/L之濃度。在另 一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含菸鹼醯 胺，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約2 〇 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之基礎培 養基包含菸鹼醯胺，其添加至經UVC曝射之基礎培養基 中’得到約2.5 mg/L之濃度。 162282.doc -28- 201247870 在一個實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含吡 °多路’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約〇.! 至約10.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC光 之基礎培養基包含吡哆醛，其添加至經uvc曝射之基礎培 養基中，得到約0.5至約5.0 mg/L之濃度。在另一實施例 中’已曝露於UVC光之基礎培養基包含吡哆醛，其添加至 經UVC曝射之基礎培養基中，得到約1.0至約3.0 mg/L之濃 度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含 。比°多路’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 1.5至約2.5 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc 光之基礎培養基包含吡哆醛，其添加至經UVC曝射之基礎 培養基中，得到約丨.5 mg/L之濃度。在另一實施例中，已 曝露於UVC光之基礎培養基包含

吡哆醛，其添加至經UVC 曝射之基礎培養基中，得到約2.0 mg/L之濃度。在另一實 施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含吡哆醛，其添 加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約2.5 mg/L之濃 度。 在一個實施例中，已曝露於uvc光之基礎培養基包含吡 °多醇，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 0-0001至約1 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 uvc光之基礎培養基包含°比哆醇，其添加至經UVC曝射之 基礎培養基中，得到約0_001至約0.1 mg/L之濃度。在另一 實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含。比哆醇，其 添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約0.01 0至約 162282.doc •29· 201247870 0.050 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之 基礎培養基包含》比哆醇，其添加至經UVC曝射之基礎培養 基中’得到約0.020至約0.040 mg/L之濃度。在另一實施例 中’已曝露於UVC光之基礎培養基包含吡哆醇，其添加至 經UVC曝射之基礎培養基中，得到約0 025至約0.035 mg/L 之濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基 包含吡哆醇’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到 約0.03 0至約0.03 5 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露 於UVC光之基礎培養基包含n比哆醇，其添加至經uvc曝射 之基礎培養基中’得到約0.030至約0.032 mg/L之濃度。在 另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含吡。多 醇，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約〇.〇3〇 mg/L·之濃度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之基礎培 養基包含°比哆醇，其添加至經UVC曝射之棊礎培養基中， 得到約0.031 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基包含吡哆醇，其添加至經uvc曝射之 基礎培養基中，得到約0.032 mg/L之濃度。 在一個實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含核 黃素’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約001 至約10.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於光 之基礎培養基包含核黃素’其添加至經UVC曝射之基礎培 養基中’得到約0.05至約5.0 mg/L之濃度。在另一實施例 中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含核黃素，其添加至 經uvc曝射之基礎培養基中，得到約〇丨至約丨〇 mg/L之濃 162282.doc •30· 201247870 度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之基礎培養基包含 核黃素，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 0.1至約0.5 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC 光之基礎培養基包含核黃素，其添加至經UVC曝射之基礎 培養基中，得到約〇· 1至約〇·3 mg/L之濃度。在另一實施例 中’已曝露於UVC光之基礎培養基包含核黃素，其添加至 經UVC曝射之基礎培養基中，得到約0.15至約0.25 mg/L之 濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包 含核黃素，其添加至經Uvc曝射之基礎培養基中，得到約 0.20至約〇.：23 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基包含核黃素，其添加至經uvc曝射之 基礎培養基中，得到約0.21至約〇·22 mg/L之濃度。在另一 實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含核黃素，其 添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約021〇 mg/L之 濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包 含核黃素，其添加至經uvc曝射之基礎培養基中，得到約 0.213 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於UVc光之 基礎培養基包含核黃素，其添加至經UVC曝射之基礎培養 基中’得到約0,216 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝 露於UVC光之基礎培養基包含核黃素，其添加至經uvc曝 射之基礎培養基中，得到約0.219 mg/L之濃度。 在一個實施例中，已曝露於UVC：光之基礎培養基包含硫 胺素，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 至約10.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露kUVC光 162282.doc -31 - 201247870 之基礎培養基包含硫胺素，其添加至經uvc曝射之基礎培 養基令，得到約0.5至約5.0 mg/L之濃度。在另一實施例 中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含硫胺素，其添加至 經uvc曝射之基礎培養基中，得到約丨〇至約3 〇 mg/L之濃 度。在另一實施例中，已曝露於UV(：光之基礎培養基包含 硫胺素，其添加至經uvc曝射之基礎培養基中，得到約 1.5至約2 · 5 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於UVc 光之基礎培養基包含硫胺素，其添加至經uvc曝射之基礎 培養基中，得到約2.0至約2.3 mg/L之濃度。在另一實施例 中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含硫胺素，其添加至 經UVC曝射之基礎培養基中，得到約2丨至約2 2 mg/L之濃 度。在另一實施例中，已曝光之棊礎培養基包含 硫胺素，其添加至經uvc曝射之基礎培養基中，得到約 2.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於11¥€：光之基 礎培養基包含硫胺素，其添加至經uvc曝射之基礎培養基 中，得到約2.1 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 UVC光之基礎培養基包含硫胺素，其添加至經uvc曝射之 基礎培養基中，得到約2.2 mg/L之濃度。 在一個實施例中，已曝SMUV<：光之基礎培養基包含甲 胺喋呤，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 〇.〇〇〇〇〇〇1至約0.001 g/L之濃度。在另一實施例中，已曝 露於UVC光之基礎培養基包含甲胺喋呤，其添加至經 曝射之基礎培養基中’得到約0.000001至約〇〇〇〇1 g/L2 濃度。在另一實施例中，已曝露於Uvc光之基礎培養基包 162282.doc -32- 201247870 含甲胺喋呤，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到 約0.00001至約0.0001 g/L之濃度。在另一實施例中，已爆 露於UVC光之基礎培養基包含曱胺嗓吟，其添加至經uvc 曝射之基礎培養基中，得到約0.00001至約0.00005 g/L之 濃度。在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包 含曱胺喋呤’其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到 約0.00002至約0.00004 g/L之濃度。 在另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含曱 胺喋呤，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 0.00003 g/L之濃度。 在一個實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含維 生素B12，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約 0.01至約10.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 uvc光之基礎培養基包含維生素B12，其添加至經uvc曝 射之基礎培養基中，得到約〇·〇5至約5 〇 mg/L之濃度。在 另一實施例中，已曝露於UVC光之基礎培養基包含維生素 B12，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到約〇」至 約1.0 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於UVc光之 基礎培養基包含維生素B12,其添加至經11¥(：曝射之基礎 培養基中，知到約0.3至約〇.8 mg/L之濃度。在另一實施例 中，已曝露於uvc光之基礎培養基包含維生素B12，其添 加至經uvc曝射之基礎培養基中，得到約〇 5至約〇 75 mg/L之濃度》在另一實施例中，已曝露於光之基礎培 養基包含維生素B12,其添加至經uvc曝射之基礎培養基 162282.doc 33 201247870 中，得到約0·6至約0‘7 mg/L之濃度。在另—實施例中，已 曝露於uvc光之基礎培養基包含維生素Β12，其添加至經 UVC曝射之基礎培養基中，得到約〇 65至約〇 7〇 之濃 度。在另一實施例中，已曝露於uvc光之棊礎培養基包含 維生素B12，其添加至經UVC曝射之基礎培養基中，得到 約0.67至約〇.69 mg/L之濃度。在另一實施例中，已曝露於 uvc光之基礎培養基包含維生素B12，其添加至經uvc曝 射之基礎培養基中，得到約0.67 mg/L之濃度。在另一實施 例中，已曝露於uvc光之基礎培養基包含維生素B12，其 添加至經uvc曝射之基礎培養基中，得到約0 68 mg/L之濃 度。在另一實施例中’已曝露於UVC光之基礎培養基包含 維生素B12，其添加至經UVC曝射之基礎垮養基中，得到 約0.69 mg/L之濃度。 細胞、蛋白質及細胞培養物 一般而言，細胞培養基含有基礎溶液或「基本培養 基j’本文中可互換地稱作「基礎培養基」，向其中添加所 有所要組分。在本發明之情形中，「基礎培養基」係指不 包含某些UV敏感性組分之細胞培養基。應瞭解，雖然下 文所述之基礎培養基一般可包含UV敏感性組分，但可視 情況調配成不包含某些UV敏感性組分。舉例而言，若 RPMI 1640揭示為本文中之基礎培養基，則應瞭解，其可 視情況不包含某些UV敏感性組分，而該等UV敏感性組分 在其他情況下通常存在於RPMI 1640中。 通常，「細胞培養基（cell culturing me<|ium)」（亦稱為 -34- 162282.doc s 201247870 培養基」、「細胞培養基（eell culture media)」或「組織 培養基」）為習此相關技藝之人士所理解之術語且已知指 代細胞（例如動物或哺乳動物細胞）生長於其中且一般提供 至y 或多種來自以下之袓分的營養素溶液：能源（通常 至碳水化合物形式，諸如葡萄糖）；所有必需胺基酸及一 奴一十種基本胺基酸，以及半胱胺酸；通常要求處於低濃 度下之維生素及/或其他有機化合物；脂質或游離脂肪 酸，例如亞麻油酸；及痕量元素，例如通常要求處於通常 在微莫耳濃度範圍内之極低濃度下之無機化合物或天然存 在之70素。細胞培養基亦可經補充以含有多種視情況選用 之組分，諸如激素及其他生長因子，例如胰島素、轉鐵蛋 白表皮生長因子、金清及其類似物；鹽例如弼鹽、鎖 鹽及璘酸鹽；及緩衝液’例如腑Es;核努及驗基，例如 腺苦胸皆、_人黃嗓吟；及蛋白質及組織水解產物，例如 經水解之動物蛋白（蛋㈣或蛋白腺混合物，其可獲自動 物d產物、經純化明膠或植物物質）；抗生素，例如健大 '·素（gentamycin)，及、細胞保護齊丨，例如普洛尼克多元醇 (Phm>nie P〇ly〇1)(普洛尼克 F68(Pluronic F68))。在某些實 ，例中’細胞培養基不含血清且不含來源於動物之產物 成分。 如從業者所瞭解， 特定細胞且可由熟習 定之培養基中培養。 限於）伊思考夫改良 動物或哺礼動物細胞在適於所培養之 此項技術者在無不當實驗之情況下確 可利用市售培養基，且其包括（但不 達爾伯克培養基（jscove，s Modified I62282.doc -35- 201247870

Dulbecco's Medium)、RPMI 1640、最低必需培養基-α(ΜΕΜ-α)、達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium，DMEM)、DME/F12、α MEM、含歐氏BSS之伊格爾基本培養基（Basal Medium Eagle with Earle's BSS)、含麵醯胺酸之高葡萄糖DMEM、 不含麩醢胺酸之高葡萄糖DMEM、不含麩釅胺酸之低葡萄 糖DMEM、含麩醯胺酸之DMEM:F12 1:1、GMEM(格拉斯 科氏MEM(Glasgow's MEM))、含麵酿胺酸之GMEM、格雷 氏完全昆蟲培養基（Grace's Complete Insect Medium)、不 含FBS之格雷氏昆蟲培養基（Grace's Insect Medium)、含麵 醯胺酸之漢姆氏F-10(Ham's F-10)、含麩酶胺酸之漢姆氏 F-12(Ham's F-12)、含 HEPES 及麩醯胺酸之 IMDM、含 HEPES且不含麩醯胺酸之IMDM、IP41昆蟲培養基、不含 麩醯胺酸或酚紅之15(萊伯維茨（Leibovitz))(2x)、不含麩醯 胺酸之15(萊伯維茨）、麥科伊氏5A改良培養基（McCoy、 5A Modified Medium)、培養基199、不含魏酿胺酸或齡紅 之伊格爾MEM(MEM Eagle)(2x)、含麵醯胺酸之MEM伊格 爾-歐氏BSS(MEM Eagle-Earle's BSS)、不含麩醯胺酸之 MEM伊格爾-歐氏BSS、不含麩醯胺酸之M£M伊格爾-漢克 氏 BSS(MEM Eagle-Hanks BSS)、含麩釀胺酸之 ΝΟΤΟΙ 09、 含麩醯胺 酸之里 克特氏 CM 培養基 （Richter’s CM Medium)、含HEPES、麩醯胺酸及/或青微素-鏈黴素之 RPMI 1640、含麩醯胺酸之RPMI 1640、不含麩醯胺酸之 RPMI 1640、施对德氏昆蟲培養基（Schneider's Insect 162282.doc • 36- 201247870

Medium)或熟習此項技術者已知之任何 Ί J再他培養基，其係 針對特定細胞類型進行調配。必需時或φ ' 一凡禺要時’且如孰習 此項技術者所知及使用常規技所實施，可 … J问則逃例示性培 養基中添加補充組分或成分’包括適當濃度或量之視情^ 選用之組分。 β / 另外，適於本發明方法之細胞培養條件為分批培養、補 給分批培養或連續培養細胞通常所採用或已知之條件，其 中關注pH值、溶解氧（〇2)及二氧化碳（c〇2)、攪動及濕 度、及溫度。 本發明組合物可用於培養多種細胞。在一個實施例中， 培養基用於培養真核細胞’諸如植物及/或動物細胞。細 胞可為哺乳動物細胞、魚類細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細 胞或禽類細胞。培養基可用於培養以下細胞，包括（但不 限於）MK2.7細胞.、PER-C6細胞、CHO細胞、HEK 293細 胞、COS細胞及Sp2/0細胞、5L8融合瘤細胞、達烏迪細胞 (Daudi cell)、EL4 細胞、海拉細胞（HeLa cell)、HL-60 細 胞、K562細胞、尤卡特細胞（Jurkat cell)、THP-1細胞、 Sp2/0細胞、初級上皮細胞（例如角質化細胞、子宮頸上皮 細胞、支氣管上皮細胞、氣管上皮細胞、腎上皮細胞及視 網膜上皮細胞）及培養之細胞株及其品系（例如293胚腎細 胞、BHK細胞、海拉子宮頸上皮細胞及PER-C6視網膜細 胞、MDBK(NBL-l)細胞、911細胞、CRFK細胞、MDCK細 胞、貝歐細胞（BeWo cell)、張氏細胞（Chang cell)、底特律 562細胞（Detroit 562 cell)、海拉229細胞、海拉S3細胞、 162282.doc -37- 201247870

Hep-2細胞、KB細胞、LS 180細胞、LS 174T細胞、NCI-H-548細胞、RPMI 2650細胞、SW-13細胞、T24細胞、WI-28 VA13、2RA細胞、WISH細胞、BS-C-I細胞、LLC-MK2 細胞、克隆M-3細胞（Clone M-3 cell)、1·10細胞、RAG細 胞、TCMK-1細胞、Y-l細胞、LLC-PK丨細胞、PK(15)細 胞、GH,細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC-RC 256細胞、 MH^Ci細胞' XC細胞、MDOK細胞、VSW細胞及TH-I、B1 細胞、或其衍生物）、來自任何組織或器官之纖維母細胞 (包括（但不限於）心、肝、腎、結腸、腸、食道、胃、神經 組織（腦、脊髓）、肺、血管組織（動脈、靜脈、毛細管）、 淋巴組織（淋巴腺、腺樣增殖體、扁桃體、骨髓及血液）、 脾）及纖維母細胞及纖維母細胞樣細胞株（例如TRG-2細 胞、IMR-3 3細胞、Don細胞、GHK-21細膨、瓜胺酸jk症 細胞（citrullinemia cell)、德姆西細胞（Dempsey cell)、底 特律551細胞、底特律510細胞、底特律525細胞、底特律 529細胞、底特律532細胞、底特律539細胞、底特律548細 胞、底特律573細胞、HEL 299細胞、IMR-90細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、WI-26、細胞、MiCl!細胞、CV-1細胞、 COS-1細胞、COS-3細胞、COS-7細胞、Vero細胞、DBS-FrhL-2細胞、BALB/3T3細月包、F9細胞、SV-T2細胞、M-MSV-BALB/3T3細胞、K-BALB細胞、BLO-11細胞、NOR-10 細胞、C3H/IOTI/2 細胞、HSDM,C3 細胞、KLN205 細 胞、McCoy細胞、小鼠L細胞、品系2071(小鼠L)細胞、L-M品系（小鼠L)細胞、L-MTK(小鼠L)細胞、NCTC純系2472 162282.doc -38 · 201247870 及2555、SCC-PSA1細胞、Swiss/3T3細胞、印度莫塔克細 胞（Indian muntac cell)、SIRC細胞、C丨丨細胞及詹森細胞 (Jensen cell)或其衍生物）、或熟習此項技術者已知之任何 其他細胞類型。 本文所揭示之培養基可用於培養懸浮細胞或黏附細胞。 本發明組合物適於細胞之黏附式、單層式或懸浮式培養、 轉染及培育，且適於在單層式或懸浮式培養之細胞中表現 蛋白質或抗體。 由本發明培養基支持之細胞可來源於任何動物，諸如小 鼠或倉鼠或人類。在本發明培養基中培育之細胞可為正常 細胞或異常細胞（亦即轉化之細胞、培養之細胞，或來源 於患病組織樣本之細胞）。 動物細胞、哺乳動物細胞、培養之細胞、動物或哺乳動 物宿主細胞、宿主細胞、重組細胞、重組宿主細胞及其類 似細胞為可根據本發明製程培養之細胞的所有術語。該等 細胞通常為獲自或來源於哺乳動物之細胞株且當在含有適 當營養素及/或生長因子之培養基中置於單層式培養或懸 浮式培養時能夠生長並存活。特定細胞培養之生長及維持 所必需之生長因子及營養素能夠由熟習相關技術者根據經 驗輕易地確定’諸如例如Barnes及Sato (1980，Ce//， 22:649) ; Mammalian Cell Culture，J. P. Mather編，Plenum Press, NY，1984中；及美國專利第5,721，121號中所述e 眾多類型之細胞可根據本發明方法培養β該等細胞通常 為動物或哺乳動物細胞，其可表現及分泌、或可經分子工 162282.doc -39- 201247870 程改造以表現及分泌大量特定蛋白質（更特定言之為相關 醣蛋白）至培養基中。應瞭解，由宿主細聦產生之醣蛋白 對該宿主細胞而言可為内源或同源的。或者，醣蛋白對宿 主細胞而言為異源（亦即外來）的，例如，由中國倉鼠卵Z (CHO)宿主細胞產生及分泌之人類醣蛋白。另外，哺乳動 物醣蛋白，亦即最初獲自或來源於哺乳動物有機體之醣蛋 白，係由本發明方法獲得且可由細胞分泌|培養基中。 且由本發明方法產生之哺乳動物醣蛋白之非限制性實例 包括細胞激素、細胞激素受體、生長因子（例如EGF ' HER-2'FGF-a、FGF-p、TGF-a、TGF-p、PDGF、IGF- 1、IGF-2、NGF、NGF-β);生長因子受體，包括融合蛋白 或喪合蛋白。其他非限制性實例包括生長激素（例如人類 生長激素、牛生長激素）；胰島素（例如胰島素A鏈及胰島 素B鏈）、胰島素原（proinsulin);紅也球生成素（epo);達 貝泊汀（darbepoetin) '群落刺激因子（例如G-CSF、GM-CSF、M-CSF);介白素（例如IL-1至IL-12);血管内皮生長 因子（VEGF)及其受體（VEGF-R);干擾素（例如iFN-α、IFN-β或IFN-γ);腫瘤壞死因子（例如TNF-α及TNF-β)及其受體 TNFR-1 及 TNFR-2 ;血小板生成素（th.rombopoietin， TP0);凝血酶；腦利鈉肽（BNP);凝血因子（例如因子 VIII、因子IX、；馬威利布蘭德氏因子（von Willebrands factor)及其類似因子）；抗凝血因子；組織纖維蛋白溶酶原 活化因子（TPA)，例如尿激酶或人類尿液或組織型TPA ;促 濾泡激素（FSH);促黃體激素（LH);降鈣素；CD蛋白質（例 162282.doc -40-

201247870 如 CD3、CD4、CD8、CD28、CD19 等）；CTLA蛋白質（例 如CTLA4) ; T細胞及B細胞受體蛋白；骨形態形成蛋白 (BNP，例如BMP-1、BMP-2、BMP-3等）；神經營養因子， 例如骨源性神經營養因子（BDNF);神經營養素 (neurotrophin)，例如 3-6 ;腎素（renin);類風濕因子； RANTES ;白蛋白；鬆弛素；巨噬細胞抑制蛋白（例如MIP· 1、MIP-2);病毒蛋白或抗原；表面膜蛋白；離子通道蛋 白；酶；調控蛋白；抗體；免疫調節蛋白（例如HLA、 MHC、B7家族）；導向受體；轉運蛋白；超氧化歧化酶 (SOD) ; G蛋白偶聯受體蛋白（GPCR);神經調節蛋白；阿 茲海默氏病（Alzheimer's Disease)相關之蛋白質及狀（例如 Α-β);及此項技術中已知之其他者。融合蛋白及多肽、嵌 合蛋白及多肽，以及任一上述蛋白質及多肽之片段或部 分、或突變體、變異體或類似物亦包括於可由本發明方法 產生之適合蛋白質、多肽及肽中。 適於容納、表現及產生蛋白質供後續分離及/或純化之 動物或哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括中國倉鼠卵 巢細胞（CHO)，諸如 CH0-K1(ATCC CCL-61)、 DG44(Chasin等人，1986，Sow. Cell Molec. Genet., 12:555-556 ; Kolkekar等人，1997，Si.oc/iewbiry，36:10901-10909 ; 及WO 01/92337 A2)、二氫葉酸還原酶陰性CHO細胞 (CHO/-DHFR，Urlaub 及 Chasin， 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216)，及 dpl2.CHO 細胞（美國專利第 5,721，121號）；由SV40轉化之猴腎CV1細胞（COS細胞， 162282.doc 41 201247870 COS-7，ATCC CRL-l651);人類胚腎細胞（例如293細胞， 或經次選殖以在懸浮式培養中生長之293細胞，Graham等 人，1977，·/. ，36:59);幼倉鼠腎細胞（BHK， ATCC CCL-10);猴腎細胞（CV1，ATCC CCL-70);非洲綠 猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587 ； VERO，ATCC CCL-81);小鼠塞特利氏細胞（mouse sertpli cell)(TM4， Mather，1980，5ζ·ο/. 23:243-251);人類子宮頸癌 細胞（HELA，ATCC CCL-2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL-34)；人肺細胞（W138，ATCC CCL-75);人類肝癌細 胞（HEP-G2，HB 8065);小鼠***腫瘤細胞（MMT 060562，ATCC CCL-51);布法羅大鼠肝細胞（buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL-1442) ; TRI細胞（Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68) ； MCR m ； FS4 細胞。 適於使用本發明方法及製程培養之細胞可含有例如經由 轉化、轉染、感染或注射而引入之表現載體（構築體），諸 如容納編碼序列或其部分之質體及其類似物，該等編碼序 列或其部分編碼用於在培養製程中表現及產生之蛋白質。 該等表現載體含有***之編碼序列之轉錄及轉譯所必需之 元件。熟習此項技術者熟知並實施之方法可用於構築含有 編碼所產生之蛋白質及多肽之序列以及適當的轉錄及轉譯 控制元件的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技 術、合成技術及活體内基因重組。該等技術描述於J· Sambrook等人，1989, Molecular Cloning, A Laboratory 162282.doc -42- 201247870

Manual，C〇ld Spring Harbor press，Plainview，nuf M Ausubel 等人，1989，Current Pr〇t〇e〇|s & M〇Ucu|ar Biology’ John Wiley & Sons, New York，Ν γ中，該等文獻 皆出於任何目的併入本文中β 除以懸浮式培養或單層式培養培育哺乳動物細胞以外， 本發明培養基及方法亦可用於自哺乳動物細胞產生病毒之 方法中。根據本發明之此態樣之該等方法包括⑷獲得用於 病毒感染之哺乳動物細胞；(b)使該細胞與病毒在適於促進 病毒感染細胞之條件下接觸；及（〇)在本發明培養基中在適 於促進細胞產生病毒之條件下培育細胞。根據本發明，可 在於本發明培養基中培育細胞之前、期間或之後使細胞與 病毒接觸；用病毒感染哺乳動物細胞之最佳方法在此項技 術中為熟知的且將為一般技術者所熟悉。可預期在本發明 培養基中懸浮培育的經病毒感染之哺乳動物細胞所產生之 病毒效價高於（例如2倍、3倍、5倍、1〇倍、2〇倍、25倍、 5〇倍、100倍、250倍、500倍或1〇〇〇倍高效價）未在本發明 培養基中懸浮培育之細胞。此等方法可用於產生多種哺乳 動物病毒及病毒載體’包括（但不限於）腺病#、腺相關病 毒、反轉錄病毒、流感病毒及用於疫苗製造及其類似方面 之其他病毒。在本發明培養基中培育經感染細胞之後，包 含病毒、病毒載體、病毒粒子或其組分（蛋白質及/或核酸 (DNA及/或RNA))之所用培養基可用於達成多種目的，包 括產生疫苗、產生用於細胞轉染或基因療法之病毒載體、 感染動物或細胞培養物、研究病毒蛋白及/或核酸及其類 162282.doc -43- 201247870 f方面或者可根據應為一般技術者所熟悉之蛋白質及/ 或核&C刀離技術，使病毒、病毒載體、病毒粒子或其组分 視情況自所用培養基令分離。 細胞培養類型 出於理解而非限制之目的，熟練從業者庳瞭解，用於蛋 白質產生之細胞培養及培養操作可包括三種一般類型；亦 即連續培養、分批培養及補給分批培養H續培養中， 舉例而言，在培養㈣向細胞提供新鮮培養基補充物（亦 即補給培養基同時每天移除舊培養基且例如每天或連 續收集產物。在連續培養中，補給培養基可每天添加且可 連續添加，亦即以滴液或輸注形式。對於連續培養，細胞 可在培養物中保持所要時長，只要細胞保持存活且維持環 境及培養條件即可。 在分批培養中，最初在培養基中培養細胞且不移除、置 換或補充此培養基，亦即在培養操作期間或結束之前不給 細胞「補給」冑培養基。在培養操作結束時收集所要產 物。 對於補給分批培養’藉由在操作期間每天一或多次（或 連續）給培養基補充新鮮培養基來增加培養操作時間，亦 即在培養期間給細胞「補給」新培養基（「補給培養 基」）。補給分批培養可包括如上文所述之各種補給方案 及時間’例如每天、每隔-天、每兩天等，每天一次以上 或每天夕於-次等。此外，補給分批培養可連續補給補給 培養基。接著在培養/產生操作結束時收集所要產物。 162282.doc • 44 · 201247870 根據本發明’可使用動物或哺乳動物細胞培養慣常採用 之培養容器及/或培養設備，在大規模或小規模產生蛋白 質之條件下’進行細胞培養及由細胞產生醣蛋白。如熟習 此項技術者所瞭解，在實驗室規模下通常使用組織培養 班、T燒瓶及旋轉燒瓶。對於在較大規模（例如5〇〇 [、 1000 L、2000 L、5000 L、10000 L及其類似規模）下培 養’可使用以下程序，包括（但不限於）醱酵槽型槽式培養 裝置、氣升型培養裝置、流體化床生物反應器、中空纖維 生物反應器、滾瓶培養、攪拌槽生物反應器系統、填充床 型培養裝置’或熟習此項技術者已知之任何其他適合設 §十。微運載體可能與或可能不與滾瓶或揽拌槽生物反應器 系統一起使用。該等系統可以分批、連續或補給分批模式 操作。另外’培養設備或系統可能配備有或可能不配備有 使用過濾器、重力、離心力及其類似者之細胞分離器。 在一個實施例中，使細胞培養基礎培養基曝露於UVc 光，接著儲存直至需要時，屆時，在用於細胞培養之前將 添加劑包添加至經UVC曝射之基礎培養基中。在另一實施 例中’作為自動化製程之一部分處理細胞培養基礎培養 基，其中作為逐步製程之一部分將添加劑包添加至經uvc 曝射之基礎培養基中，不間斷地儲存。熟練從業者應輕易 地預見可進行此UVC曝射製程之許多方式，其中必需步驟 為基礎培養基之UVC曝射，繼而在某一時間點添加添加劑 包。 UV光 162282.doc 45- 201247870 術語「紫外光」係指自X射線區（100 nm)延伸至可見區 (400 nm)之光之電磁波譜的區段。詳言之，紫外光一般分 成四個部分：（1)真空紫外光--波長為100至200 nm，（2)C 波段紫外線（UVC)--波長為200至280 nm，（3)B波段紫外線 (UVB)--波長為280至315 nm，及（4) A波段紫外線（UVA)·-波長為3 15至400 nm。在一個實施例中，在將細胞培養基 引入培養設備（例如生物反應器）中之前，使細胞培養基礎 培養基曝露於UVC光。 在本發明之一個實施例中，在將細胞培養基引入生物反 應器中之前，使細胞培養基曝露於波長介於200 nm與280 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝露於 波長介於200 nm與275 nm之間的UVC光。在另一實施例 中，使細胞培養基曝露於波長介於200 nm與270 nm之間的 UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介於 200 nm與265 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞 培養基曝露於波長介於200 nm與260 nm之間的UVC光。在 另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介於200 nm與 25 5 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝 露於波長介於200 nm與250 nm之間的UVC光。在另一實施 例中，使細胞培養基曝露於波長介於200 nm與245 nm之間 的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介 於200 nm與240 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細 胞培養基曝露於波長介於200 nm與23 5 nm之間的UVC光。 在一個實施例中，使細胞培養基曝露於波長介於200 nm與 162282.doc -46-

201247870 230 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝 露於波長介於200 nm與225 nm之間的UVC光。在另一實施 例中，使細胞培養基曝露於波長介於200 nm與220 nm之間 的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介 於200 nm與215 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細 胞培養基曝露於波長介於200 nm與210 nm之間的UVC光。 在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介於2 00 nm與 205 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝 露於波長介於205 nm與280 nm之間的UVC光。在另一實施 例中，使細胞培養基曝露於波長介於210 nm與280 nm之間 的UVC光《在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介 於21 5 nm與280 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細 胞培養基曝露於波長介於220 nm與280 nm之間的UVC光。 在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介於225 nm與 280 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝 露於波長介於230 nm與280 nm之間的UVC光。在另一實施 例中，使細胞培養基曝露於波長介於235 nm與280 nm之間 的UVC光《在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介 於240 nm與280 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細 胞培養基曝露於波長介於245 nm與280 nm之間的UVC光。 在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介於2 5 0 nm與 280 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝 露於波長介於255 nm與280 nm之間的UVC光。在另一實施 例中，使細胞培養基曝露於波長介於260 nm與280 nm之間 162282.doc • 47· 201247870 的UVC光。在一個實施例中，使細胞培養暴曝露於波長介 於265 nm與280 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細 胞培養基曝露於波長介於270 nm與280 nm之間的UVC光。 在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介於2 75 nm與 280 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝 露於波長介於205 nm與275 nm之間的UVC光。在另一實施 例中，使細胞培養基曝露於波長介於210 nm與270 nm之間 的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介 於215 nm與265 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細 胞培養基曝露於波長介於220 nm與260 nm之間的UVC光。 在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介於225 nm與 25 5 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝 露於波長介於230 nm與250 nm之間的UVC光。在另一實施 例中，使細胞培養基曝露於波長介於235 ntn與245 nm之間 的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介 於245 nm與265 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細 胞培養基曝露於波長介於248 nm與260 nm之間的UVC光。 在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介於249 nm與 259 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝 露於波長介於250 nm與258 nm之間的UVC光。在另一實施 例中，使細胞培養基曝露於波長介於25 1 nm與257 nm之間 的UVC光。在另一實施例中，使細胞培養基曝露於波長介 於252 nm與256 nm之間的UVC光。在另一實施例中，使細 胞培養基曝露於波長介於253 nm與255 nm之間的UVC光。 162282.doc • 48·

S 201247870 在本發明之另一實施例中，在將細胞培養基引入生物反 應器中之前，使細胞培養基曝露於波長為254 nm之UVC 光。在本發明之其他實施例中，細胞培養基曝露之UVC光 的波長為254 nm +/- 1 nm，或波長為254 nm +/- 2 nm，或 波長為254 nm +/- 3 nm，或波長為254 nm +/- 4 nm，或波 長為254 nm +/- 5 nm，或波長為254 nm +/- 6 nm，或波長 為254 nm +/- 7 nm，或波長為254 nm +/- 8 nm，或波長為 254 nm +/- 9 nm，或波長為 254 nm +/- 10 nm，或波長為 254 nm +/- 1 5 nm，或波長為 254 nm +/- 20 nm，或波長為 254 nm +/- 25 nm 〇 如本文所用之術語「能量」係指曝射所處理之細胞培養 基之紫外輻射的量，以毫焦耳/平方公分或焦耳/平方公尺 為單位。在本發明之一個實施例中，在將細胞培養基引入 生物反應器中之前，使細胞培養基曝露於能量密度為25-350 mJ/cm2、更佳能量密度為60-250 mJ/cm2且最佳能量密 度為100-15 0 mJ/cm2之UVC光。在另一實施例中，在將細 胞培養基引入生物反應器中之前，使細胞培養基曝露於能 量密度為125 mJ/cm2之UVC光。在本發明之其他實施例 中，細胞培養基曝露之UVC光的能量密度為125 mJ/cm2 +/- 1 mJ/cm2，或能量密度為 125 mJ/cm2 +/- 2 mJ/cm2，或 能量密度為125 mJ/cm2 +/- 3 mJ/cm2，或能量密度為125 mJ/cm2 +/- 4 mJ/cm2，或能量密度為 125 mJ/cm2 +/- 5 mJ/cm2，或能量密度為 125 mJ/cm2 +/- 10 mJ/cm2，或能量 密度為125 mJ/cm2 +/- 15 mJ/cm2，或能量密度為125 162282.doc -49· 201247870 mJ/cm2 +/- 20 mJ/cm2’ 或能量密度為 125 mJ/cm2 +/_ 25 mJ/cm2，或能量密度為 125 mJ/cm2 +/_ 3〇 mJ/cm2，或能量 密度為125 mJ/cm2 +/- 40 mJ/cm2，或能量密度為125 mJ/cm2 +/- 50 mJ/cm2’ 或能量密度為 125 mJ/cm2 +/· 6〇 mJ/cm2，或能量密度為 125 mJ/cm2 +/· 7〇 mJ/cm2，或能量 密度為125 mJ/cm2 +/- 80 mJ/cm2，或能量密度為125 mJ/cm2 +/- 90 mJ/cm2 ’ 或能量密度為 125 mJ/cm2 +Λ 1〇〇 mJ/cm2，或能量密度為 125 mJ/cm2 +/- iiq mj/cm2，或能 量密度為125 mJ/cm2 +/- 120 mJ/cm2。在本發明之其他實 施例中’細胞培養基曝露之uvc光的能量密度為i 75 mJ/cm2 +/_ 1 mj/cm2，或能量密度為 175 mJ/cm2 +/_ 2 mJ/cm2,或能量密度為175 mJ/cm2 +/_ 3 mJ/cm2,或能量 密度為 175 mJ/cm2 +/- 4 mJ/cm2 ’ 或能量密度為 175 mj/cm2 +/- 5 mJ/cm2 ’ 或能量密度為 175 mJ/cm2 +/> 10 mJ/Cm2 ,或 能量密度為175 mJ/cm2 +/- 15 mJ/cm2，或能量密度為175 mJ/cm2 +/- 20 mJ/cm2，或能量密度為 175 mJ/cm2 +Λ 25 mJ/cm2 ’或能量密度為i75 mj/cm2 +/_ 3〇职J/cm2，或能量 密度為175 mJ/cm2 +/_ 40 mJ/cm2，或能量密度為175 mJ/cm2 +/· 50 mJ/cm2，或能量密度為 ns mj/cm2 +/· 6〇 mJ/cm ’或能量密度為I?〗 mJ/cm2 +/- 70 mJ/cm2，或能量 密度為175 mJ/cm2 +/_ 80 mj/cm2，或能量密度為ι75 mJ/cm2 +/_ 9〇 mJ/cm2’ 或能量密度為 175 mJ/cm2 +/1〇〇 mJ/cm ’ 或能量密度為 175 mJ/cm2 +/- 11〇 mJ/cm2，或能 量密度為175 mJ/cm2 +/_ 12〇 mJ/cm2，或能量密度為ι75 162282.doc -50-

S 201247870 mJ/cm2 +/- 130 mJ/cm2，或能量密度為 175 mJ/cm2 +/- 140 mj/cm2，或能量密度為 175 mJ/cm2 +/- 150 mJ/cm2，或能 量密度為175 mJ/cm2 +/- 160 mJ/cm2，或能量密度為175 mJ/cm2 +/- 170 mJ/cm2。 儘管已提供能量密度之特定實例，但應注意，可在本文 所揭示之方法中使用之UVC源傳遞目標能量密度左右一定 範圍之能量密度；此能量密度範圍亦稱作「劑量分佈」。 能量密度分佈之一個特徵為能量密度擴展之不對稱性，其 具有「高劑量尾部」。分佈可使用P10、P50、P90及平均值 之機率量度來歸納。P#值描述處理流體（例如培養基）之 劑量值。因此，P10值為60 mJ/cm2意謂10%流體接收小於 60 mJ/cm2之能量密度。此方法適於UVC曝射裝置，諸如 本文所述之螺旋狀UVC反應器。 在所揭示方法之另一實施例中，可採用層狀UVC曝射裝 置（例如薄膜UVC反應器）來傳遞UVC光。當採用層狀或薄 膜UVC曝射裝置時，分佈可近似如下：ρ1〇=1/2χ平均值， Ρ90=2χ平均值。因此，若欲在本文所述之條件下採用層狀 或薄臈UVC曝射裝置，則分佈將為：Ρ10為約6〇 mj/cm2， 平均值= 125 mJ/cm2，及P90為約 250 mJ/cm2。 與以上論述一致’應注意，當在本發明中提供UVC光之 目標能量密度時，其暗指目標能量密度體現由上文所提供 之劑量分佈規則所述之一定範圍之劑量。更特定言之，在 一個實施例中，目標UVC能量密度包括處於能量密度之 P6〇为佈内之所有能量密度；在另一實施例中，目標 162282.doc -51· 201247870 UVC能量密度包括處於能量密度之P65分佈内之所有能量 密度；在另一實施例中，目標UVC能量密度包括處於能量 密度之P70分佈内之所有能量密度；在另一實施例中，目 標UVC能量密度包括處於劑量之P75分佈内之所有能量密 度；在另一實施例中，目標UVC能量密度包括處於能量密 度之P80分佈内之所有能量密度；在另一實施例中，目標 UVC劑量包括處於能量密度之P85分佈内之所有能量密 度；在另一實施例中，目標UVC能量密度包括處於能量密 度之P90分佈内之所有能量密度；在另一實施例中，目標 UVC能量密度包括處於能量密度之P95分佈内之所有能量 密度。 在本發明之情形中，應瞭解，UVC能量密度可使用所提 供之標量範圍來描述（例如125 mJ/cm2 +/- 1 mJ/cm2之能量 密度、或125 mJ/cm2 +/- 2 mJ/cm2之能量密度、或125 mJ/cm2 +/- 3 mJ/cm2之能量密度、或125 mJ/cjm2 +/- 4 mJ/cm2 之能量密度、或125 mJ/cm2 +/- 5 mJ/cm2之能量密度、或 125 mJ/cm2 +/- 10 mJ/cm2之能量密度、或 125 mJ/cm2 +/-1 5 mJ/cm2之能量密度、或 125 mJ/cm2 +/- 20 mJ/cm2之能量 密度 '或125 mJ/cm2 +/- 25 mJ/cm2之能量密度、或125 mJ/cm2 +/- 30 mJ/cm2之能量密度、或 125 mJ/cm2 +/- 40 mJ/cm2之能量密度、或125 mJ/cm2 +/- 50 mJ/cm2之能量密 度、或 125 mJ/cm2 +/- 60 mJ/cm2 之能量密度、或 125 mJ/cm2 +/- 70 mJ/cm2之能量密度、或 125 mJ/cm2 +/- 80 mJ/cm2之能量密度、或125 mJ/cm2 +/- 90 tnJ/cm2之能量密 162282.doc -52- 201247870 度、或 125 mJ/cm2 +/- 100 mJ/cm2 之能量密度、或 125 mJ/cm2 +/- 110 mJ/cm2之能量密度、或 125 mJ/cm2 +/- 120 mJ/cm2，或在本發明之其他情形中，175 mJ'/cm2 +/- 1 mJ/cm2之能量密度、或175. mJ/cm2 +/- 2 mJ/cm2之能量密 度、或 1 75 mJ/cm2 +/- 3 mJ/cm2之能量密度、或 1 75 mJ/cm2 +/- 4 mJ/cm2之能量密度、或 175 mJ/cm2 +/- 5 mJ/cm2之能 量密度、或175 mJ/cm2 +/- 10 mJ/cm2之能量密度、或175 mJ/cm2 +/- 15 mJ/cm2之能量密度、或 175 mJ/cm2 +/- 20 mJ/cm2之能量密度、或175 mJ/cm2 +/- 25 mJ/cm2之能量密 度、或 175 mJ/cm2 +/- 30 mJ/cm2 之能量密度、或 175 mJ/cm2 +/- 40 mJ/cm2之能量密度、或175 mJ/cm2 +/- 50 mJ/cm2之能量密度、或175 mJ/cm2 +/- 60 mJ/cm2之能量密 度、或 175 mJ/cm2 +/- 70 mJ/cm2 之能量密度、或 175 mJ/cm2 +/- 80 mJ/cm2之能量密度、或 175 mJ/cm2 +/- 90 mJ/cm2之能量密度、或 175 mJ/cm2 +/- 100 mJ/cm2之能量 密度、或175 mJ/cm2 +/- 110 mJ/cm2之能量密度、或175 mJ/cm2 +/- 120 mJ/cm2之能量密度、或 175 mJ/cm2 +/- 130 mJ/cm2之能量密度、或 175 mJ/cm2 +/- 140 mJ/cm2之能量 密度、或175 mJ/cm2 +/- 150 mJ/cm2之能量密度、或175 mJ/cm2 +/- 160 mJ/cm2之能量密度、或 175 mJ/cm2 +/- 170 mJ/cm2之能量密度），或其可使用所述之劑量分佈函數來 描述（例如處於目標能量密度之P10-60、P65、P70、P75、 P80、P85、P90及P95範圍内之能量密度）。 UVC曝射裝置 162282.doc -53- 201247870 本發明之細胞培養基及方法可與用以使細胞培養基礎培 養基曝露於UVC之任何裝置、系統、設備或方法一起使 用。裝置之非限制性實例可見於美國專利第7,65丨，660號、 美國專利第6,773,608號、美國專利第6 596 23〇號、美國專 利第5,725,757號、美國專利第5,7〇7,594號及美國專利申請 公開案第20040245 164A1號中。在一個實施例中，本發明 之細胞培養基及方法與螺旋狀UV反應器—起使用。在另 一實施例中，本發明之細胞培養基及方法與層狀流式（或 薄膜）UV反應器一起使用。 其他培養基處理 預期本文所提供之細胞培養基及方法可與除UVC曝射以 外之處理方法或裝置一起使用，以在細胞培養之前對培養 基進行滅菌或消毒。在一個實施例中，HTST與本發明之 培養基及方法組合使用（參見例如美國專利第7,420,183 號）。在另一實施例中，pH值調整（例如調整至4以下）與本 發明之培養基及方法組合使用。 在一個實施例中，在曝露於UVC光之後對細胞培養基進 行過渡步驟。如本文所用之術語「無菌過濾」及「無菌過 渡器」係指藉由使用標準生物無菌過濾器自細胞培養基中 移除黴漿菌及其他潛在污染物β在本發明之一個實施例 中’在將細胞培養基引入生物反應器中之前，使細胞培養 基通過具有最大尺寸為200 nm之孔隙的無菌過濾器。 在另一實施例中，在曝露於UVC光之前或之後，使細胞 培養基通過深度過濾器（depth filter)。術語「深度過濾 162282.doc -54-

201247870 器」係指具有多個過濾層之過濾器，各層負責過濾不同尺 寸及密度之微粒物質。此類型之過濾製程類似於尺寸排 阻· ° I里物質在濾床頂部分離。培養基在下層中逐漸變得較 、細車交密。在上層中移除較大懸浮粒子，而由下層移除較 小粒子。 在另一實施例中，細胞培養基用不活化病毒之化學品處 理’諸如溶劑、清潔劑、補骨脂素（psoralen)或β-丙内酯。 其他實施例 在一個實施例中，本發明提供一種提供病毒不活化培養 基之方法’其係藉由給培養基補充過量已知或疑似對UVC 光敏感之培養基組分’例如硫辛酸、組胺酸、***酸、 色胺酸、路胺酸、葉酸、終驗酿胺、吨哆酿、η比哆醇、核 黃素、硫胺素、甲胺喋呤及維生素Β12(氰鈷胺素），以補 償其經UVC光處理後之部分破壞來達成。 如本文所述，多種常用培養基組分在曝露於UVC光之後 降解或變得生物學上無活性。為補償此降解，可將易發生 UVC介導之降解的培養基組分以過剩量添加至培養基配方 中’該等過剩量在曝露於UVC光之後提供足量之此等化合 物。換言之，因UVC曝射而不活化之既定培養基組分之量 可藉由添加不活化組分之量來補充以使培養基具有所需量 之組分。在一個實施例中’可在UVC曝射之前作為培養基 之補充物添加組分；而在另一實施例中，可在UVC曝射之 後作為培養基之補充物添加組分。 在一特定實例中’鑑別已知或疑似由UVC光不活化之培 162282.doc -55- 201247870 養基組分。接著鑑別培養基中組分之初始暈。獨立地，基 於預定UVC劑量根據經驗癌定降解之組分的量。或者，可 藉由使用組分之已知特性作為指導（例如吸光度、濃度、UVC 劑量等）進行計算來確定。接著將預測會降解之組分的量 以無菌添加方式（例如包含適當濃度之組分的無菌溶液）添 加至培養基中。隨後’使經補充之培養基曝露於UVC光。 在另一特定實例中，鑑別已知或疑似由UVC光不活化之 培養基組分。接著鑑別培養基中組分之初始量。獨立地， 基於預定UVC劑量根據經驗確定降解之組分的量《或者’ 可藉由使用組分之已知特性作為指導（例如吸光度、濃 度、UVC劑量等）進行計算來確定。接著使經補充之培養 基曝露於UVC光。隨後，將預測會降解之組分的量以無菌 添加方式（例如包含適當濃度之組分的無議溶液）接著添加 至培養基中。 在已描述本發明之情況下，提供以下實例以作說明而非 限制。 實例 所有實例之材料及方法 重組人類紅血球生成素係由在包含以卞UV敏感性組分 之DMEM/F12基礎培養基中培養之CHO細胞株產生：硫辛 酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醢 胺、咐•哆搭、吡哆醇、核黃素、硫胺素及維生素Β12及甲 胺喋呤。 使此等實驗之經UVC處理培養基及對照培養基通過滅菌 I62282.doc -56-

201247870 級過濾器。自小瓶中解凍細胞且在擴大體積滾瓶中實現按 比例放大，繼而接種至一系列生物反應器中用於製程之生 產期。 此等實驗在以下時間間隔下進行三次收集：收集1，8 天；收集2 ’7天；收集3 ’7天。在37.0°c之設定.點下操作 製程之滾瓶按比例放大部分。在36.0°C之設定點下操作製 程之滾瓶接種及生產部分。 使用螺旋狀流式UVC反應器（在254 nm下）完成UVC處 理，照射強度為60 W/m2，流動速率介於5公升/小時（1|>扣 與2〇公升/小時之間。用對於所要條件正確之uvc劑量處 理培養基。 實例1 表1 :實驗條件-實例1 條件 UVC劑量 (mJ/cm2) UVC處理座 對照 N/A N/A — UVC 125 125 按比例放天^ 接種，生產 在所有階段對1X培養基 uvc處理 在所有階段對2.5X培養 行UVC4理 UVC [2.5χ] 125 125 按比例放; 接種，生產 UVC 175 175 按比例放大， 接種，生產 在所有階段對IX培養基進行 UVC處理 在按比例放大期間對 養基進行UVC處理，在接種 時對lx培養基進行UVC處 理，且在生產期間對2.5χ培 養基進行UVC處理 UVC 125(2.5x > lx > 2.5χ) 125 按比例放大， 接種，生產 UVC 125(1χ > 1χ > 2.5χ) 125 按比例放大， 接種，生產 在按比例放大期間對1X培養 基進行UVC處理，在接種時 對1χ培養基進行UVC處理， 且在生產期間對2.5χ培養基 進行UVC處理 162282.doc •57· 201247870 添加若干其他條件以評估特定製程需求且測試製程對 UVC培養基處理之穩固性。製造設施製備按比例放大培養 基及呈濃狀態之增濃生產培養基（Enriched pr〇ducti〇n Medium)且在轉移至供應槽期間進行在線過濾。使用通過 在線過濾器之WFI沖洗液使培養基達到其最終丨x體積。在 此實驗中測試濃經UVC處理培養基與1 x經uvc處理培養基 的各種組合〇 結果 在按比例放大製程之任何階段用於細胞生長或群體倍增 之經UVC處理條件與對照之間不存在差異p在生產之所有 收集中，UVC條件之代謝資料類似於對照。對於所有UVc 條件，收集3之細胞附著類似於對照。雖然2 5 X uVC 125 mJ/cm2條件展示相較於其他條件附著稍有減少但預期在 全規模生產中觀測時此不會出現問題。 所有uvc培養基處理之條件展示效價降低。175 條件展示在整個收集中效價始終較低。雖然培養基在濃時 處理似乎對收集3之效價具有較大影響，但將需要更多研 究來證實此舉。 僅自小瓶解凍處理對照及已經UVC處理之25χ濃按比例 放大培養基之重複培養基《其他uvc條件在接種時開始處 理，持續至生產。在此點處開始之處理代表自小瓶解凍之 處理。產物效價資料概述於圖1及圖2中。 實例2 -58 · 162282.doc

S 201247870 表2 :實驗條件-實例2 條件 UVC 劑量(mJ/cm2) UVC處理階段 註解 對照 N/A N/A UVC2.5X 125 125 按比例放大 僅在按比例放大時經 UVC處理2.5X濃度之 培養基以供生長比較 UVC50 [lx] 50 接種，生產 UVC 75 [1χ] 75 接種，生產 操作此實驗以重複使用2.5 X濃經UVC處理培養基之製程 的按比例放大部分且在製程之接種及生產部分中評估較低 UVC劑量。因先前實驗表明產物效價與UVC劑量相關聯， 故測試75 mJ/cm2及50 mJ/cm2之較低劑量。 結果 所有UVC處理條件在轉換時及在生產之各收集時之代謝 資料均與對照類似。產物效價展示兩種UVC處理均出現劑 量依賴性降低。產物效價資料概述於圖3及圖4中。 實例3 在此紅血球生成素a(Epoetin alfa)培養基處理實驗中研 究多種細胞培養基處理條件。所研究之培養基處理技術包 括高溫短時（HTST)、C波段紫外光（UVC)及病毒過濾 (VF)。在滚瓶（RB)接種時開始施加處理直至生產。收集各 條件且純化。所有新UVC處理條件均矯正關於當前培養基 之UVC處理（條件2)所觀測之效價降低。所有處理條件當與 對照條件（條件1及10)相比時在轉換時亦展現類似細胞生長 及生存力。觀測到一些產物品質差異，諸如相對於對照 SE-HPLC單體％較低。 162282.doc -59· 201247870 培養基處理條件 表3展示施加於生產期間所用之各種溶液的培養基處理 條件。在表格之處理欄下之合併細胞指示處理技術應用於 調配在一起之兩種組分；在表格之處理攔下之各別細胞指 示處理技術各別地應用於各組分。 表3.所評估之實驗條件之概述 條件 處理 當前DMEM FBS 1及10 對照-無處理 2 UVC(Bayer) 3 HTST UVC($ayer)-4x 稀 FBS 4 VF UVC(^ayer)-4x 稀 FBS 條件 DMEM_S DMEM_B FBS 5 對照-無處理 6 VF UVC(Bayer) 7 VF UVC(Atlantic) 8 HTST UVC(Bayer) 9 HTST UVC(Atlantic) DMEM=當前培養基 DMEM_S =含UVC敏感性組分之添加劑包 DMEMLB =不含UVC敏感性組分之新基礎培養基 UVC=C波段紫外光 HTST=高溫短時 VF =病毒過渡 FBS =胎牛血清 條件6-9使用新基礎培養基，其經UVC處理，繼而添加 添加劑包，該添加劑包包含硫辛酸、組胺酸、***酸、 色胺酸、酪胺酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核 黃素、硫胺素、曱胺喋呤及維生素B12。

162282.doc -60- S 201247870 未精確達成對於各條件之丨25 mJ/cm2目標平均uvc劑 量。此係由於原始平均劑量模型中螢光強度可變之故。隨 後已開發出更精確之劑量分佈模型且用於報導平均劑量及 百分比（10、50及90)劑量。由螺旋狀!^^^反應器單元傳遞 之平均劑量低於目標值。當前培養基之劑量不足(條件2)仍 導致效價降低，與展示對低至5〇至75 mJ/cm2之劑量之效 價影響的先前研究一致。 生產力結果提供於圖5中。處理條件3、4及6至9在處置 界限内具有類似生產力，由此矯正關於當前培養基之uvc 處理（條件2)所觀測之效價降低，該效價比收集2及3之所有 其他條件低約15-20% ’且與先前研究一致。新培養基對照 (條件5)之結果與現有培養基對照1及1〇一致。 【圖式簡單說明】 囷1·圖1描述實例1之HPLC效價結果。展示未經處理之 對照培養基及各種經UVC處理之培養基組的結果β γ轴代 表重組人類紅血球生成素’以mg/L計，且X軸代表3種不 同收集週期以及總產量。 囫2.圖2描述實例1之Bradford分析結果。展示未經處理 之對照培養基及各種經UVC處理之培養基組的結果。γ轴 代表重組蛋白質’以mg/L計’且X軸代表3種不同收集週 期以及總產量。 囷3.圖3描述實例2之HPLC效價結果。展示未經處理之 對照培養基及各種經UVC處理之培養基組的結果。γ轴代 表重組人類紅血球生成素，以mg/L計，且X軸代表3種不 162282.doc 201247870 同收集。 圓4.圖4描述實例2之Bradford分析結果。展示未經處理 之對照培養基及各種經UVC處理之培養基組的結果。Y軸 代表重組蛋白質，以mg/L計，且X軸代表3種不同收集週 期。 圓5·圖5描述實例3之HPLC效價結果。展示未經處理之 對照培養基及各種經UVC處理之培養基組的結果。Y軸代 表重組人類紅血球生成素，以mg/RB計，且X軸代表3種不 同收集週期及該等收集週期之總和。

162282.doc -62- S

Claims (1)

1. 201247870 七、申請專利範圍： 1. 一種細胞培養基，其包含： a. 曝露於UVC光之基礎培養基；及 b. 包含UV敏感性培養基組分之添加劑包，其在UVC曝射 後添加至該基礎培養基中。 2. 如請求項1之細胞培養基，其中該基礎培養基不包含至 少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八 種、九種、十種、十一種、十二種或十三種選自由以下 組成之群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺 酸、路胺酸、葉酸、於驗酿胺、β比哆酿、β比哆醇、核黃 素硫胺素、甲胺嗓吟（methotrexate)及維生素β 12。 3. 如請求項1之細胞培養基，其中該添加劑包包含至少一 種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九 種、十種、十一種、十二種或十三種選自由以下組成之 群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺 酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺 素、曱胺喋呤及維生素B12。 4·如請求項⑴中任-項之細胞培養基，其中該基礎培養 基呈粉末或液體形式，且該添加劑包呈粉末或液體形 式。 5.如請求項1之細胞培養基， 動物細胞。 6·如請求項1之細胞培養基， 細胞。 其中該培養基適於培養哺乳 其中該培養基較培養尾蟲 162282.doc 201247870 7. —種用於製造經UVC曝射之細胞培養基調配物之方法， 該方法包括以下步驟： a. 使基礎培養基曝露於UVC光； b. 將包含UV敏感性組分之添加劑包添加至該經UVC曝射 之基礎培養基中。 8·如請求項7之方法，其中該基礎培養基不包含至少一 種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九 種、十種、十一種、十二種或十三種選自由以下組成之 群的組分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺 酸、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺 素、曱胺喋呤及維生素B12。 9. 如凊求項7之方法，其中該添加劑包包含至少一種、兩 種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十 種、十一種、十二種或十三種選自由以下組成之群的組 分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉 酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、曱 胺喋呤及維生素B12。 10. 如請求項7至9中任一項之方法，其中該uvc：光之波長為 約 254 nm。 U.如請求項10之方法，其中該基礎培養基係曝露於能量密 度為約25 mJ/cm2至約350 mJ/cm2之UVC米。 12·如凊求項丨丨之方法，其中該基礎培養基係曝露於能量密 度為約125 mj/cm2之UVC光。 13·如請求項11之彳法，其中該基礎培養基係曝露於能量密 162282.doc•2· S 201247870 度為約175 mJ/cm2之UVC光。 14. 15. 16. 17. 18. 19. 如凊求項7之方法’其中該使該基礎培養基曝露於UVC 光之步驟足以破壞該基礎培養基中任何非包膜病毒之核 酸。 如吻求項7之方法’其中該UVC光係使用薄膜UVC反應 器傳遞β 如凊求項7之方法，其中該uvc光係使用螺旋狀uvc反 應器傳遞。 種用於產生蛋白質之方法，該方法包括以下步驟： a.使基礎培養基曝露於UVC光； 將匕3 UV敏感性培養基組分之添加劑包添加至該經 UVC曝射之基礎培養基中；及 c.在該經UVC處理之培養基中培養細胞，以產生所要蛋 白質。 如請求項17之方法，其中該基礎培養基不包含至少一 種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九 種、十種、十一種、十二種或十三種選自由以下組成之 群的纟且分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺 酸葉馱、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺 素、甲胺喋呤及維生素B12。 如凊求項17之方法，其中該添加劑包包含至少一種 '兩 種—種'四種、五種、六種、七種、八種、九種、十 種十種、十二種或十三種選自由以下組成之群的組 分：硫辛酸、組胺酸、***酸、色胺酸、酪胺酸、葉 162282.doc 201247870 酸、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素、曱 胺喋呤及維生素B12。 20. 如請求項17至19中任一項之方法，其中該uvc光之波長 為約254 nm。 21. 如請求項20之方法，其中該培養基係曝蕗於能量密度為 約 25 mJ/cm2至約 350 mJ/cm2之 UVC 光。 22. 如請求項21之方法，其中該基礎培養基係曝露於能量密 度為約125 mj/cm2之UVC光。 23·如請求項21之方法’其中該基礎培養基係曝露於能量密 度為約1 75 mj/cm2之UVC光。 如凊求項17之方法，其中該使該基礎培養基曝露於 光之步驟足以破壞該基礎培養基中任何非包膜病毒之核 酸。 25. 26. 如請求項17之方法， 如請求項17之方法， 成素。 其中該等細胞為CHO細胞。 其中該蛋白質為重組人類紅血球生 2 7.如請求項17之方 π 万去’其中該UVC光係使用薄膜uvc反應 器傳遞β 28·如請求項方 <力在’其中該UVC光係使用螺旋狀UVC反 應器傳遞。 162282.doc